JPH09509307A

JPH09509307A - ヒト化抗体及びそれらの使用

Info

Publication number: JPH09509307A
Application number: JP7516077A
Authority: JP
Inventors: オーガスティンイー−サーンリン、
Original assignee: ティーセルサイエンスィズインコーポレイテッド
Priority date: 1993-12-08
Filing date: 1994-11-21
Publication date: 1997-09-22
Also published as: UA29494C2; BR9408278A; WO1995016038A3; NZ276170A; HU9601574D0; PL314908A1; US5861155A; FI962377A7; FI962377L; RU2139934C1; PL180157B1; CZ162896A3; AU1033395A; IL111926A0; WO1995016038A2; HUT75553A; EP0737250A1; CZ287347B6; CN1063792C; SG48420A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、特定の可変β鎖を表出するＴ細胞、特にはヒトＶβ５．２及び／又は５．３、及びＶβ８．１を発現するそれらのサブ集団に結合することが可能なヒト化抗体又はそれらの結合タンパク質に関する。また、本発明は、そのような抗体の調製、それらを含有する医薬組成物、及び、特には自己免疫疾患における、抗体の治療的利用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト化抗体及びそれらの使用本発明は、特定の可変β鎖を示すＴ細胞、特には、ヒトＶβ５．２及び／又は５．３、並びにＶβ８．１を発現するそれらのサブ集団に結合することが可能なヒト化（humanized）抗体及びそれらの結合タンパク質に関する。また、本発明は、そのような抗体の調製、それらを含有する医薬組成物、及びそれらの抗体の、特に自己免疫疾患における、治療上の利用にも関する。Ｔ細胞は、免疫系内のエフェクター機構の分化及び調節において中心的な役割を果たす（Ｐａｕｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ１９５：１２９３−１３００（１９８７））。正しくない免疫調節は自己免疫を助長するため、Ｔ細胞による抗原と主要組織適合分子の相互認識（co-recognition）は特異的であり、かつ正確に調節されていなければならない。幾つかの研究所では、自己免疫及び幾つかの形態の免疫不全のような正しくない免疫調節であることが明らかな疾患が研究され、Ｔ細胞がそれらの疾患の病因に関連付けられている。特定のＴ細胞受容体組成のクローン性もしくはオリゴクローン性拡大が報告されている幾つかの状況が存在する。最も明白な例は、Ｔ細胞白血病又はリンパ腫を生じる悪性の状態におけるものである。Ｔ細胞白血病又はリンパ腫の状況においては、Ｔ細胞受容体は安定に再配列を受けて細胞表面に現れるため、Ｔ細胞受容体が唯一の腫瘍マーカーとして作用する。特定のＴ細胞受容体組成が関与する別の状況は臓器移植の受容者においてであり、受容者のＴリンパ球はドナー個人、例えば骨髄移植片のドナーのＭＨＣ分子に対してＴリンパ球を攻撃的にするＴ細胞受容体を有している。さらに重要なことには、幾つかのグループが、特定の自己免疫状況における選択的Ｔ細胞抗原受容体Ｖ領域遺伝子の使用を報告している。例えば、Ｇｒｕｎｗａｌｄらは、サルコイドーシスに罹患した患者の末梢血リンパ球と比較した場合の、気管支槽洗浄（broncheoalveolar lavage）におけるＣＤ４＋Ｔ細胞でのＶα２．３遺伝子産物の選択的な発現に注目している（Ｇｒｕｎｗａｌｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１２９（１９９２））。川崎病においては、発病時のＶβ２及びＶβ８Ｔ細胞の選択的な拡大が注目された（Ａｂｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４０６６（１９９２））。リューマチ様関節炎もまた、この関連において、広く研究されている。幾つかの研究では、Ｔ細胞のサブセットの選択的な拡大が注目されている。例えば、ＤｅｒＳｉｍｏｎｉａｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１６２３（１９９３）（ＣＤ８＋末梢血Ｔリンパ球におけるＶα１２．１保有Ｔ細胞の選択的な拡大）；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：１１７９（１９８８）（サザーン・ブロット分析によると、ＩＬ２において増殖した滑膜浸潤Ｔ細胞はオリゴクローンであった）；Ｐａｌｉａｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３：３４（１９９１）（スーパー抗原が、クローン様に拡大し、リューマチ様関節炎患者の滑液に移動する、自己反応性Ｔ細胞を含むＶβ１４＋Ｔ細胞を活性化するという仮説を立てた）；Ｈｏｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０９２１（１９９１）（特に、リューマチ様関節炎患者の滑液に由来するＩＬ２Ｒ＋細胞におけるＶ β３、１４、及び１７Ｔ細胞Ｖ領域遺伝子の使用に注目した）；Ｕｅｍａｔｓｕら、ＰｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８５３４（一人のＲＡ患者の滑液Ｔ細胞におけるオリゴクローナルＴ細胞Ｖ領域遺伝子の使用を示した）；及び国際特許出願ＷＯ９０／０６７５８（ＲＡにおけるＶβ３、９、及び１０を含む）。炎症性腸疾患もまた、広く研究されている。幾つかのグループが拡大Ｔ細胞集団又は選択的Ｔ細胞受容体Ｖ領域遺伝子の使用に注目している。例えば、Ｐｏｓｎｅｔｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：１７７０（１９９０）；Ｓｐｅｎｃｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．４４：９１５（１９９１）；Ｔｒｅｊｊｄｏｓｉｅｗｉｃｚら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８４：４４０（１９９１）；及びＶａｎＫｅｒｃｋｈｏｖら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：５７（１９９２）。さらに別の者が、ミコバクテリア・レプラ（Mycobacterium leprae）における選択的Ｔ細胞Ｖ遺伝子の使用を報告している（ｖａｎＳｈｏｏｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１１２４４（１９９２）；Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１８８（１９９３））。ヒトにおいては、幾つかの自己免疫疾患に関連して、炎症組織におけるＶβ８．１Ｔ細胞の拡大が見出されている。これらの自己免疫疾患には、クローン病（Ｐｏｓｎｅｔｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：１７７０−１７７６（１９９０））、川崎病（Ａｂｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４０６６−４０７０（１９９２）およびＡｂｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：７９１−７９６（１９９３））及びリューマチ様関節炎（Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７３：４１７−４２３（１９８８））が含まれる。多発性硬化症（ＭＳ）は、深く研究されている別の自己免疫疾患である。ＭＳは、中枢神経系単核細胞浸潤及び脱髄によって特徴付けられる免疫介在疾患である。ＭＳの病因は知られていないが、遺伝的及び環境的因子の両者が疾患の過程に関連付けられている。遺伝的素因の主要素には、特定のクラスＩＩ主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプ、特にＨＬＡ−ＤＲ２１及びＤＱＷ１と疾患との関わりが含まれる（Ｔｅｒａｓａｉｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ１９３３：１２４５− １２４７（１９７６）；Ｈｏら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ１５：５０９ −５１７（１９８２）；Ｓｐｉｅｌｍａｎら、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｒｅｖ．４：４５−６５（１９８２）；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｌａｎｃｅｔ１：２１１（１９８６）；Ｅｌｉａｎら、ＤｉｓｅａｓｅＭａｒｋｅｒｓ５：８９−９９（１９８７）；Ｕｒｂａｎら、Ｃｅｌｌ５４：５７７−５９２（１９８８）；Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋら、Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４１−５４４（１９８９）；Ｈｏｗｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：６６８−６７０（１９８９））。ＭＳを患う患者の髄液から単離されたＴ細胞が用いるＶ領域遺伝子の組は限定されていることが示されている。ＭＳ患者において生体内で活性化されたミエリン塩基性タンパク特異性Ｔ細胞が表出することは、疾患の原因にＭＢＰ反応性Ｔ細胞が関与していることを示唆している（Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４８：１０１６−１０１９（１９９０））。Ｔ細胞受容体Ｖβプライマーを用いるｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞系統のＴＣＲＶβ使用を測定したときに、限られた数のＶβ遺伝子の優先的な使用が見出されている（Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇら、（前出（１９９０））−ヒト自己抗原ＭＢＰの免疫優性領域の認識において、Ｖβ１７と、それよりは少ない頻度ではあるが、Ｖβ１２が頻繁に用いられている；Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ３６２：６８（１９９３））。幾つかの研究の結果もまた、ＭＳ脳病巣において限られたＴ細胞受容体Ｖα遺伝子しか発現しないことを示唆している（Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ３４５：３４４−３４６（１９９０））。定量的ＰＣＲ及びモノクローナル抗体（ｍＡｂ）染色を用いるＴ細胞のレパートリー（repertoire）解析では、対照と比較して、ＭＳ患者から単離されたミエリン塩基性タンパク（ＭＢＰ）特異性Ｔ細胞ではＶβ５．２及び／又は５．３が優先的に用いられることが示されている（Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇら、（前出（１９９３））（特定のＨＬＡ表現型を有する患者の脳において、再配置されたＶβ５．２遺伝子が検出された）及びＫｏｔｚｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：９１９６（１９９１）（β鎖可変領域５．２及び、それより少ない頻度ではあるが、Ｖβ６．１の使用に対する偏向がＭＳ患者に由来するＭＢＰ特異性クローンに見られた））。現時点では、ＭＳの有効な治療法は知られていない（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，１２版、Ｗｉｌｓｏｎら、ＭｃＧｒａｗＨｉｌｌ，Ｉｎｃ．１９９１）。治療上の努力は、急激な発症の改善、再発又は疾患の進行の防止、及び症状の軽減に向けられている。しかしながら、マウスＶβ８．２可変領域遺伝子の発現が、ヒトのＭＳのマウスモデルにおける実験的なアレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に相関することが見出されている。マウスＶβ８．２特異性ｍＡｂを用いる治療により、疾患を予防し、かつ軽減することが可能であることが示されている（Ａｃｈａ−Ｏｒｂｅａら、Ｃｅｌｌ５４：２６３（１９８８）及びＵｒｂａｎら、Ｃｅｌｌ５４：５７７（１９８８））。したがって、この疾患の治療に適した抗体又は“抗体様 ”分子の開発が強く求められている。抗体は、典型的には、ジスルフィド結合によって互いに連結する２本の重鎖と、各重鎖のＮ−末端に結合する軽鎖とを含む。各重鎖は、そのＮ−末端に可変ドメインを、それに続いて他端に定常ドメインを有する。また、各軽鎖もＮ−末端の可変ドメインとそれに続く定常ドメインを有する。軽鎖及び重鎖各対の可変ドメインは、抗原結合部位を形成する。軽鎖及び重鎖上の可変ドメインは同じ一般構造を有し、各ドメインは、配列が比較的保存されている４つの領域からなるフレームワークとこれに接続する３つの相補性決定領域（ＣＤＳ）を有している。４つのフレームワーク領域は幾らかのβ−シート構造をとり、ＣＤＳはこのβ− シート構造体に接続するループを形成する。これらのＣＤＲはフレームワーク領域によって非常に接近した状態に保たれ、抗原結合部位の形成に寄与している。抗体のＣＤＲ及びフレームワーク領域は、ＷＯ９１／０９９６７に説明されているように、Ｘ線結晶学と関連したカバット（Kabat）・ナンバリング・システム（Ｋａｂａｔら、”免疫学的に興味を有するタンパク質の配列（Sequences of Protein of Immunological Interest）”，ＵＳＤｅｐｔ．ｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，ＵＳＧｏｖｅｒｎｍｅｎｔＰｒｉｎｔｉｎｇＯｆｆｉｃｅ（１９８７））を参照することにより決定することができる。特定の抗原を標的とすることが可能な抗体を作製するためには、通常、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７（１９７６））が用いられる。これには、一般的には、マウスを抗原で免疫し、免疫マウス由来の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマから選択することにより、標的抗原に特異的なモノクローナル抗体を分泌する１以上のハイブリドーマを作製することを包含する。治療には、そのようなｍＡｂを用いることが好ましい。しかしながら、そのようなｍＡｂは本質的にはネズミ起源のものであり、したがってヒトにおいてはそれら自身が抗原性である。そのようなｍＡｂをヒトに繰り返し投与した場合には、ヒトの免疫システムはマウスｍＡｂに対する応答を開始し、それを無効にしてしまう。したがって、マウスｍＡｂのＣＤＲをヒトのフレームワークに移植し、ドナー・マウスｍＡｂの結合能力を有し、かつ受容体のヒトのフレームワークのヒト適合性を有するＣＤＲグラフト化抗体を作製することが、元々はＷｉｎｔｅｒ及び彼の共同研究者によって提唱されている（例えば、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２７（１９８８）及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）を参照のこと）。しかしながら、抗体の機能はその３次元構造に依存しており、３次元構造はその１次アミノ酸配列に依存している。抗体のアミノ酸配列を変えることは、その活性に悪影響を及ぼす可能性がある。同様に、抗体断片は、結合活性の助成に必要な適正な３次元構造を保持していない可能性がある。さらに、抗体をコードするＤＮＡ配列を変えることは、そのＤＮＡ配列を有する細胞の発現、分泌及び抗体組立ての能力に影響を及ぼす可能性がある。ＣＤＲを含む正確な残基は定義することが困難であり、カバット・ナンバリング・システムによって定義される超可変領域の全ての残基には必ずしも対応するものではない。抗原と相互作用するＣＤＲの位置決めに重要であり、又は重鎖及び軽鎖の相互作用に関与する重要なフレームワーク残基も存在する。特定のフレームワーク残基をそれらが特定の位置でドナーの残基に対応するように変更し、それによってＣＤＲグラフト化抗体の性質からより“ヒト”らしさをなくす必要があることもある。有用なＣＤＲグラフト化抗体を作製するためにドナーの残基に変更することが必要なＣＤＲ及びフレームワーク残基を同定するための様々な提唱が公開されている（例えば、Ｑｕｅｅｎら、ＷＯ９０／０７８６１；Ｋｕｒｒｌｅら、ＥＰ− Ａ−０４０３１５６；Ａｄａｉｒら、ＷＯ９１／０９９６７；Ｑｕｅｅｎら、ＷＯ９２／１１０１８；及びＢｅｎｄｉｇら、ＷＯ９２／０１５６８を参照のこと）。あらゆる特定のケースにおける有用なＣＤＲグラフト化抗体の作製が簡単ではないことは、これらの文献から明らかである。特定のＣＤＲグラフト化抗体を作製する試みの固有の問題にもかかわらず、本発明者らは、好ましい態様において、ヒトフレームワーク領域をベースとし、かつ特定のＴ細胞サブ集団に特有の可変β鎖領域に特異的な抗原結合部位を有するＣＤＲグラフト化抗体を作製することに成功した。驚くべきことに、本発明のヒト化抗体は、それらのネズミのプロトタイプと比較した場合、良好な、もしくはより良い標的Ｔ細胞に対する結合親和性を示す。さらに、ここにクレームされた抗体又はそれらの一部は、それらのネズミのプロトタイプよりも免疫原性が少なく、そのため治療に用いられる場合に患者に不利な反応を低減させるという利点を提供する。発明の要約本発明は、特定のＴ細胞サブ集団に対する選択的結合特異性を有するヒト化抗体に向けられている。この抗体は、前記サブ集団への結合において高感度であり、その結合に関して、それらのＣＤＲ領域の実質的な部分が誘導されるプロタイプ（protype）ｍＡｂよりも優れたものでないとしても、それに匹敵する特異性及び親和性を示す。また、本発明は、特定の超可変及びフレームワーク残基をコードし、かつこれらをヒト重鎖及びヒト軽鎖フレームワークに移植する新規なｃＤＮＡを用いる、前記ヒト化抗体の調製方法に向けられている。更に、態様にはこの抗体を用いる薬学的成分及び治療法とがを含まれる。特に好ましい態様の１つにおいて、ヒトＶβ８．１を認識するマウスｍＡｂである１６Ｇ８を、特定のＣＤＲ及びネズミｍＡｂ由来の選択フレームワーク残基とをＫＯＬ重鎖及びＲＥＩ軽鎖フレームワークにグラフト化したＣＤＲによりヒト化した。各々、Ｎｅｏ及びＤＨＦＲ選別マーカーを有する哺乳動物細胞発現ベクター中のヒト化重鎖（ＩｇＧ１）及び軽鎖（Ｋ）をコードするｃＤＮＡを、ＤＨＦＲ−のチャイニーズ・ハムスター線維芽（ＣＨＯ）細胞系にトランスフェクトし、続いて選別し、増殖を行った。“ＴＭ２９”と命名された分泌ヒト化ｍＡｂは、プロトタイプ・マウスｍＡｂ（１６Ｇ８）に匹敵する親和性を備え、ヒトのＴＣＲＶβ８．１に対する特異性を維持する。本発明の抗体は、正しいサブセット特異性及び親和性を維持しながら、抗−ＴＣＲ抗体のヒト化を達成し得ることを示している。本発明の他の態様には、ヒト自己免疫疾患、特にクローン病の治療へのこれらのヒト化抗体の治療薬としての使用が含まれる。本発明の別の特に好ましい態様においては、ヒトＶβ５．２及び５．３を認識するマウスｍＡｂであるＴＭ２３を、ＮＥＷＭ重鎖及びＲＥＩ軽鎖フレームワークへのグラフト化したＣＤＲによりヒト化した。各々、Ｎｅｏ及びＤＨＦＲ選別マーカーを有する哺乳動物細胞発現ベクター中のヒト化重鎖（ＩｇＧ１）及び軽鎖（Ｋ）をコードするｃＤＮＡを、ＤＨＦＲ−のチャイニーズ・ハムスター線維芽（ＣＨＯ）細胞系にトランスフェクトし、次いで選別し、増殖を行った。分泌されたヒト化ｍＡｂは“ＴＭ２７”と命名され、プロトタイプ・マウスｍＡｂ（ＴＭ２３）より優れてはいないとしても、それに匹敵する親和性を備えた、ヒトＶβ５．２及び５．３に対する特異性を維持する。本発明の他の態様には、ヒトＭＳの治療へのＴＭ２７の治療薬としての使用が含まれる。図面の簡単な説明図１は、ＴＭ２７の様々な可変軽鎖配列及び重鎖配列を示している。図２は、ＴＭ２９の様々な可変軽鎖配列及び重鎖配列を示している。図３は、４Ｈ１１に対するＴＭ２７Ｌ／ＮＳＯ及びＴＭ２７Ｌ／ＣＨＯの競合アッセイの結果を示している。図４は、図３に示される実験のスキャッチャードプロットを示す。発明の詳細な説明この発明の説明の文脈において用いられる定義を以下に説明する。本出願において、“抗体”という用語は、それが天然のものであろうと、組換えＤＮＡ技術もしくは他の方法で作製されたものであろうと、この抗体が少なくとも１つの抗原結合部位を含むという条件の下で、Ｉｇもしくはそれらのあらゆる断片、軽鎖もしくは重鎖モノマーもしくはダイマー、及び、例えば重鎖及び軽鎖可変ドメインがペプチドリンカーによって結合している一本鎖Ｆｖのような一本鎖抗体を記述するのに用いられる。抗体の残りの部分には、Ｉｇ起源のタンパク配列のみが含まれる必要はない。例えば、ヒトＩｇ鎖をコードするＤＮＡ配列がポリペプチド・エフェクターもしくはレポーター分子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列と融合している遺伝子を構築することができる。したがって、“ 抗体”にはハイブリッド抗体（下記参照）も含まれる。ここで用いられる“結合タンパク質”という用語は、抗体もしくは抗体の組合せから誘導される特定のアミノ酸配列を有する構造であって、この配列が少なくとも１つの抗原結合部位を形成するような様式で立体的に配置されているものを指す。 “ｍＡｂ”という略語は、ハイブリドーマまたは誘導細胞系によって産生されるようなモノクローナル抗体を示すのに用いられる。 “組換え抗体”という用語は、組換えＤＮＡ技術の使用を含む方法によって産生される抗体の記述に用いられる。 “ＣＤＲ”もしくは“相補性決定領域”という用語は、３次元空間に並置されて抗原結合表面を形成する、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の部分を指す。 “キメラ抗体”という用語は、可変ドメインが、全体として第１の哺乳動物種由来の抗体から誘導されたものであり、かつ異なる哺乳動物種に由来する抗体からの少なくとも１つの定常ドメインに融合されている抗体を記述するのに用いられる。 “ＣＤＲグラフト化”という用語は、ＣＤＲが実質的に第１の哺乳動物種に由来する抗体から誘導されたものであり、これが実質的に第２の哺乳動物種から誘導される可変フレームワーク領域に移植されている、抗体もしくはそれらの一部の記述に用いられる。また、前記フレームワーク領域の特定の選択アミノ酸が前記第１の哺乳動物種から誘導されたものであってもよい。 “ハイブリッド抗体”という用語は、ペプチド結合によって別のタンパク質の最小限の部分に結合している少なくとも１つのＩｇの結合部分を含むタンパク質の記述に用いられる。熟練した研究者がこのような構造体を記述するのに“キメラ”という単語を用いることもあることは認められるが、本明細書においてはこのような構造体をハイブリッド抗体と呼び、キメラ抗体という用語は上に定義される意味に用いる。 “ヒト化抗体”という用語は、第１の種に由来する抗体から誘導される可変ドメインの一方もしくは両者中のＣＤＲを少なくとも１つ、好ましくは２つもしくは３つ有する抗体の記述に用いられる。これには、特定の超可変アミノ酸配列に関連して特定の選択フレームワークアミノ酸も含まれ得るものと理解される。抗体の残りのＩｇ起源部分は、１以上の異なる抗体から誘導される。可変ドメインは、組換えＤＮＡ技術を使用することにより、又はペプチド合成により作製することができる。 “発現ベクター”には、それに含まれるＤＮＡ配列を発現することが可能である、すなわちコーディング配列がそれらの発現を行うことが可能な他の配列に作用的に結合しているベクターが含まれる。有効な発現ベクターの有用ではあるが常に必要とされるものではない（すなわち、昆虫細胞）要素は、マーカー・コーディング配列、すなわち、細胞を容易に同定することが可能なタンパク質を含む細胞の表現型特性（例えば、ネオマイシン耐性、メチオニンスルホキシミン耐性もしくはトリプトファン原栄養性）を結果として生じるベクター配列をコードする配列である。要するに、“発現ベクター”は機能的な定義が与えられたものであり、特定の配列に適用された場合にその特定の含有ＤＮＡコードを発現させることが可能なあらゆるＤＮＡ配列がこの用語に含まれる。現時点では、そのようなベクターはたいていプラスミドの形態にある。したがって、“プラスミド”と “発現ベクター”とはしばしば互換性を持って用いられる。しかしながら、本発明は、同等の機能を提供し、かつ当該分野において時折周知になりつつある、レトロウイルス類、アデノウイルス類、生体外系（Ｂａｒａｎｏｖら、Ｇｅｎｅ８４：２：４６３（１９８９））等を含む他の形態の発現ベクターをも含むことを意図している。以前から述べられているように、ＤＮＡ配列は、この配列が発現制御配列に作用的に結合した（すなわち、発現制御配列が確実に機能するように位置した）後に、宿主細胞中で発現する。これらの発現ベクターは、典型的には、エピソーム又は宿主染色体ＤＮＡの組込まれた部分のいずれかとして、宿主生物において複製可能となる。 “組換え宿主細胞”は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターでトランスフォームされている細胞を指す。このトランスフォームにより、宿主細胞は、トランスフォームされていない宿主によって産生されることが期待されるようなより少ない量ではなく、より一般的には検出可能な量を下回る量でではなく、有用な量で所望の産生物を産生することが可能となる。本発明の抗体及び結合タンパク質は、組換え宿主細胞によって、さらなる実験を実施するのに有用な量、又は商業的に受け容れられる量、例えば約１００ｇ以上を作製することができる。組換え宿主から抗体又はそれらの結合タンパク質を単離する方法の記述において、“細胞”及び“細胞培養物”という用語は、明確に他の事項を指定していない限り、抗体の源を示すのに互換性を持って用いられる。換言すると、“細胞” からの回収は、遠心沈降全細胞（spun down whole cells）又は培地及び懸濁細胞の両者を含む細胞培養物のいずれかから、あるいは、さらにミエローマ細胞系の場合にあり得るように、腹水培養物からの回収を意味する。本発明のヒト化抗体又はそれらの結合タンパク質は、Ｔ細胞の選択サブ集団、特にＶβ８．１サブ集団又はＶβ５．２／５．３サブ集団に対する特異性を有するモノクローナル抗体から実質的に誘導されるそのＣＤＲの全て又は一部を含むアミノ酸配列を有している。好ましい態様において、このモノクローナル抗体の起源はネズミである。抗体及びそれらの一部の可変ドメインのフレームワーク・アミノ酸配列の起源は、好ましい態様において実質的にヒトであり、これが“ヒト化抗体”の由来である。この“ヒト化”は、ヒト患者に治療上投与される場合に、抗体の免疫原性の低減に有用であると信じられている。ここでの使用では、重鎖にはＮＥＷＭもしくはＫＯＬヒト・フレームワーク領域が、軽鎖にはＲＥＩヒト・フレームワーク領域が好ましい。特定の選択フレームワーク残基は、ヒトよりもむしろネズミとして維持される。これは、分子の適正な３次元構造を達成し、それにより特定のＴ細胞サブセットに対する結合特異性及び親和性を増大させるのに必要であると信じられている。本発明の技術に従って作製されるヒト化抗体のあらゆる部分（すなわち、抗体という用語の広い定義）は、Ｔ細胞の選択サブ集団に対する結合特異性及び親和性を維持する限りにおいて、本発明の意図の範囲内にある。したがって、前記抗体から誘導される結合タンパク質は、以下に記述されるように、少なくとも治療用途に適する程度にこれらの能力を維持する他の断片と同様に、明らかに本発明の範囲内にある。当該技術分野の熟練者は、ここでの教示に従って作製される様々な構築体の結合パラメータを、標的とされる選択可変領域を表出する特定のＴ細胞又はＴ細胞受容体タンパク質を用いて実施される従来の結合アッセイを用いることにより、試験することができる。例えば、プロトタイプｍＡｂを用いる競合結合アッセイ、様々な細胞系への結合、スキャッチャード分析等を実施し、得られた結果をプロトタイプｍＡｂと比較することができる。あるいは、以下に記述されるような様々な動物モデル系、又は臨床試験研究に頼って、本発明に従って作製される構築体の治療効果を評価することができる。ここで、構築体は、たとえ標的抗原に対するその結合パターンがプロトタイプｍＡｂのものと異なっていても、非常に適切な治療薬であり得ることが理解される。特に好ましい態様において、ヒト化抗体又はそれらの結合タンパク質のアミノ酸配列は、以下の群：ＴＭ２９軽鎖ＴＭ２７軽鎖より選択される可変軽鎖の全てもしくは一部が単独で、もしくは以下の群：ＴＭ２９重鎖ＴＭ２７重鎖より選択される可変重鎖の全てもしくは一部と組み合わされたものである。個々のＣＤＲ近傍の選択フレームワーク残基は、ＣＤＲの３次元配座の支持に重要である（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９（１９９２））。このため、特定の好ましい態様においては、修飾重鎖が設計された。第一に、残基６６ないし６９の全て、及び７３において、ネズミの配列Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ（６６−６９）及びＡｓｐ（７３）がヒトの対応する部分で置換される。別の好ましい態様においては、ネズミの残基バリン及びフェニルアラニンがそれぞれ７８及び７９位に、又はネズミのアルギニンが９２位に据えられる。図１は、これらの置換を例示するものであり、ＣＤＲをボールド体及び下線で示している。これらの好ましい抗体構築物（それらの結合タンパク質を含む）は、Ｖβ５．２／５．３に結合する。他の好ましい抗体及びそれらの結合タンパク質は、重鎖を残基２３及び２４で修飾することにより、ここに提供される。これらの位置では、ネズミの対応する配列Ａｌａ−が置換される。別の構築体は、残基７５がネズミのプロリン残基であってもよく、又は残基８８、８９及び９１がそれぞれアラニン、メチオニンもしくはチロシンであってもよいことを示している。これらの抗体構築物及びそれらの結合タンパク質は、Ｖβ８．１Ｔ細胞に結合し、図２により完全に示されている。ＴＭ２７重鎖と共にＴＭ２７軽鎖から本質的になり、残基４８がネズミのロイシン又はイソロイシンのいずれかであるＣＤＲグラフト化抗体が、ここでの使用に特に好ましい。また、ＴＭ２９重鎖と共にＴＭ２９軽鎖から本質的になるＣＤＲグラフト化抗体も特に好ましい抗体である。本発明のヒト化抗体又はそれらの結合タンパク質は様々な技術によって作製することができ、例えば酵母、昆虫、ＣＨＯもしくはミエローマ細胞のようなトランスフェクトされた細胞で発現するのが好ましい。最も好ましくは、宿主細胞はＣＨＯ宿主細胞である。本発明によるＣＤＲグラフト化抗体又はそれらの結合タンパク質を設計するためには、所望の結合特性を有する抗体の可変ドメイン配列を突き止める必要がある。そのようなＤＮＡ配列決定のための適切なソース細胞には、鳥類、哺乳動物又は他の脊椎動物ソース、例えば、ニワトリ、マウス、ラット及びウサギがあり、好ましくはマウスである。可変ドメイン配列（Ｖ_H及びＶ_L）は、当該技術分野において一般的に周知の技術によって各々のｍＲＮＡから合成される重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡから決定することができる。その後、カバット法（前出）を用いて、超可変領域を決定することができる。ＣＤＲはＸ線結晶学又は分子モデリング技術を用いる構造解析により決定することができる。次いで、フレームワーク領域に由来する特定の選択残基と共に、超可変領域に対応する全ての残基を含む複合ＣＤＲを構築することができる。次に、得られた複合ＣＤＲを“抗原結合部位”として転移させることができる一方、完全なＩｇを構築することを望むのであれば抗体の残りに重鎖及び軽鎖定常ドメイン並びに残りのフレームワーク残基を含めるようにすることもできる。抗体の残りの部分は、異なるクラスのヒト抗体をベースとしてもよい。定常ドメインは、構築される抗体が意図する用途に適した所望のエフェクター機能を有するように選択することができる。例えば、ヒトＩｇＧのイソタイプであるＩｇＧ₁及びＩｇＧ₃は、補体の固定及び細胞介在溶解に有用である。別の目的については、ＩｇＧ₂及びＩｇＧ₄のような他のイソタイプ、又はＩｇＭ及びＩｇＥのような他のクラスがより適切であり得る。ヒトの治療に対しては、治療中での抗グロブリン応答を最小にするために、ヒトのイソタイプを用いることが特に望ましい。ヒト定常ドメインＤＮＡ配列は、好ましくはそれらの可変ドメイン・フレームワーク領域と共に、周知の手順に従って調製することができる。その一例が、バロースウエルカム社（Burroughs We llcome Ltd．）から入手可能なＣＡＭＰＡＴＨ１Ｈである。本発明の好ましい態様によると、結果として充分な結合親和性を有するＣＤＲグラフト化抗体を生じるヒト様フレームワーク領域（換言すると、ＣＤＲ以外の可変ドメイン）への選択的変更を含むＣＤＲグラフト化抗体が得られる。このような結合親和性は、好ましくは約１０⁵ Ｍ^-1ないし約１０¹²Ｍ^-1であり、より好ましくは少なくとも約１０⁸Ｍ^-1である。最も好ましくは、結合親和性は、プロトタイプ抗体とほぼ同等かもしくは大きいものである（好ましい例においては、このプロトタイプ抗体はネズミである）。本発明のＣＤＲグラフト化抗体の構築において、Ｖ_H及び／又はＶ_L遺伝子セグメントを変異誘発により変更することができる。当該技術分野における熟練者は、抗体のＦｃ部分もしくは他の領域に含まれるアミノ酸残基もしくは配列をコードする様々な他のヌクレオチドを同様の方法で変更し得ることも理解するであろう（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ８９／００２９７を参照）。典型的な技法には、適正なリーディング・フレームワークが維持されるという条件の下で、付加、欠失又は限られた数の種々のヌクレオチドの非保存置換もしくは多くのヌクレオチドの保存置換が含まれる。最終構築物に到達するために、置換、欠失、挿入又はあらゆる準組合せ（subc ombination）を用いることができる。６４通りの可能なコドン配列が存在するものの公知のアミノ酸は僅か２０であるので、遺伝コードは異なるコドンが同じアミノ酸を生じ得るという意味において縮重する。しかし、コードは各アミノ酸に対して正確なものである。したがって、各アミノ酸に対して少なくとも１つのコドンが存在し、すなわち、各コドンは単一のアミノ酸を生成し、他は生成しない。最終的に産生されるポリペプチドにおいて適正なアミノ酸配列を得るために、翻訳の間、適正なリーディング・フレームが維持されなければならないことは明らかである。周知の配列を有する予め決定されたアミノ酸部位での付加、欠失または置換の技術は公知である。典型的な技法には、オリゴヌクレオチド介在部位指向性変異誘発（ｏligonucleotide-mediated site-directed mutagenesis）及びＰＣＲが含まれる。オリゴヌクレオチド部位指向性変異誘発は、本質的に、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドを変異を誘発しようとする領域を含む一本鎖のＤＮＡとハイブリダイズさせ、この一本鎖をオリゴヌクレオチド伸長の鋳型として用いて変異を含む鎖を生成させることを包含する。この技術は、様々な形で、ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１０：６４８７（１９８２）、Ｎｏｒｒｉｓら、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１１：５１０３（１９８３）、ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、ＤＮＡ３：４７９（１９８４）、Ｋｒａｍｅｒら、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１０：６４７５（１９８２）に記述されている。ＰＣＲは、本質的に、配列特異的オリゴヌクレオチドを用いてインビトロでＤＮＡを指数的に増幅させることを包含する。オリゴヌクレオチドは、もし望むなら配列変更と一体化することができる。ＰＣＲ技法は、ＭｕｌｌｉｓおよびＦｏｌｏｏｎａ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１５５：３３５（１９８７）に記述されている。ＰＣＲを用いる変異誘発の例は、Ｈｉｇｕｃｈｉら、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：７３５１（１９８８）、Ｈｏら、Ｇｅｎe，７７：５１（１９８９）、Ｈｏら、Engineering Hybridlzaio n Restriction Genes without the Use of Restriction Enzyme：Gene Splicing by Overlap Extention；Ｈｏｒｔｏｎら、Ｇｅｎｅ７７：６１（１９８９）に記述されている。最終的に所望の抗体を発現することが可能な本発明のヌクレオチド配列、又はそれらの結合タンパク質は、多くの異なるポリヌクレオチド（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ又は合成オリゴヌクレオチド）から形成することができる。現時点では、ポリヌクレオチドにはｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの融合体が含まれることが好ましい。これらのポリヌクレオチド配列は、様々なＩｇ成分（例えば、Ｖ、Ｊ、Ｄ、及びＣドメイン）をコードすることが可能である。これらは、多くの異なる技術によって構築することができる。適正なゲノム及びｃＤＮＡ配列を結合させることが現時点で最も一般的な方法であるが、ｃＤＮＡ配列を利用することもできる（ＥＰ−Ａ−０２３９４００及びＲｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３（１９８８）を参照）。適切な発現ベクター及び宿主細胞はＵＳ−Ａ−４８１６５６７に記述されている。ここに開示されるベクター及び方法は、原核及び真核生物の広い範囲にわたる宿主細胞での使用に適している。もちろん、一般には、本発明に有用なベクターを構築するためのＤＮＡ配列をクローニングするには原核細胞が好ましい。例えば、カリフォルニア州サン・ディエゴのストラタジーン（Stratagene）社から入手可能なブルースクリプト（Bl uescript）Ｍ１３ベクター、ｐＵＣ１９ｃ、ジーンバンク受付＃ＶＢ００２６、ｐＢＲ３２２（下記）のような様々な大腸菌（E．coli）プラスミドクローニングベクターが特に有用である。もちろん、これらの例は、限定ではなく説明を意図するものである。原核細胞はまた、発現にも用いることができる。前述の大腸菌株、バシルスズブチルス（Baci1lus subtills）のようなバチルス属、及びサルモレラチフムリウム（Salmonella typhimurium）もしくはセルチアマルセセン（Serratia marce scens）のような他の腸内細菌、並びに様々なシュードモナス（Pseudomonas）種を用いることができる。一般に、宿主細胞に適合する種から誘導されるレプリコン及び制御配列を有するプラスミドベクターがこれらの宿主に関連して用いられる。このベクターは、通常、トランスフォームされた細胞に表現型選択を付与することが可能なマーキング配列の他に、複製部位を担持する。例えば、大腸菌（E．coli）は、典型的には、大腸菌（E．coli）種から誘導されるプラスミドであるｐＢＲ３２２の多くの誘導体のうちの１つを用いてトランスフォームされる（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ２；９５（１９７７））。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を有しており、それ故に、トランスフォームされた細胞を同定するための手軽な手段を提供する。また、ｐＢＲ３２２プラスミド、その子孫又は他の微生物プラスミドは、組換えタンパク質の発現にその微生物が用いることが可能なプロモーターを含んでいてもよく、含むように変性されていてもよい。組換えＤＮＡ構築体に通常用いられるこれらのプロモーターには、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ２７５：６１５（１９７８）；Ｉｔａｋｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８：１０５６（１９７８）；Ｇｏｅｄｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ２８１：５４４（１９７９））及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｅｌｌら、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．８：４０５７（１９８０））及びＥＰ− Ａ−００３６７７６が含まれる。これらが最も一般的に用いられるのであるが、他の微生物プロモーターも発見、利用されており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細が公開され、熟練研究者がプラスミドベクター中でそれらを機能的に結合することが可能となっている（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ２０：２６９（１９８０））。原核細胞に加えて、酵母培養物のような真核微生物も用いることができる。多くの他の株を普通に利用することが可能ではあるが、サッカロミセスセレビシアエ（Saccharomyces Cerebisiae ）、すなわち普通のパン酵母が、真核微生物の中でも最も一般的に用いられている。サッカラオミセス（Saccharomyces）の発現に対しては、例えばプラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ１９：１５７（１９８０））が通常用いられる。このプラスミドは、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母の変異株、例えばＡＴＣＣＮｏ．４４０７６もしくはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ８：８５：１２（１９７７））に選別マーカーを付与するｔｒｐｌ遺伝子を既に含んでいる。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐｌ損傷の存在は、トリプトファン非存在下での成長によってトランスフォーメーションを検出するのに効果的な環境を提供する。酵母ベクターにおける適切なプロモーター配列には、３−ホスホグリセレートキナーゼ又は、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスホフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼのような他の解糖系酵素（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．ＥｎｚｙｍｅＲｅｇ，７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１７：４９００（１９７８））が含まれる。適切な発現プラスミドの構築において、これらの遺伝子に関連する終止配列を発現ベクター中で発現させようとする配列の３′ に結合し、ｍＲＮＡのポリアデニル化及び終止を与える。成長状態によって転写が制御されるというさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝及び前述のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼに関連する減成酵素、マルトース及びガラクトース利用に応答する酵素のプロモーター領域である。酵母適合性プロモーター、複製の起点及び終止配列を有するあらゆるプラスミドベタターが適している。微生物に加えて、多細胞生物から誘導される細胞の培養物も宿主として用いることができる。脊椎動物由来であろうと、非脊椎動物由来であろうと、原理的には、いかなる細胞培養物も加工可能である。しかしながら、現在のところ、脊椎動物細胞に対する関心が最も高く、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖は、近年、型通りの手順となっている（ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ、，ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９７３））。有用な宿主細胞系の例は、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、ＭＤＣＫ並びにミエローマ及びｇｓミエローマ（セルテック（Celltech）社、Ｓｌｏｕｇｈ，Ｕ．Ｋ．より入手可能）細胞系である。このような細胞の発現ベクターは、発現させようとする遺伝子の前に位置するプロモーターの他に（必要であれば）適正な複製の起点を、必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終止配列と共に含んでいてもよい。哺乳動物細胞における使用では、発現ベクターに対する制御機能はしばしばウイルス性の物質によって与えられる。例えば、通常用いられるプロモーターは、ヒトのサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２及び、最も頻繁にはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）から誘導される。ＳＶ４０の早期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点をも含む断片としてこの両者がウイルスから容易に得られることから、特に有用である（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ２７３：１１３（１９７８））。さらに、所望の遺伝子配列に通常関連するプロモーターまたは制御配列を、そのような制御配列が宿主細胞系に適合するという条件の下で利用することも可能であり、これはしばしば望ましいものである。複製の起点は、ＳＶ４０又は他のウイルス性（例えば、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＶＳＶもしくはＢＰＶ）ソースから誘導することができるような外来の起点を含むようにベクターを構築することにより、あるいは宿主細胞の染色体複製機構のいずれかにより与えられる。ベクターを宿主細胞染色体に組込む場合には、後者で十分なことが多い。関心のあるＤＮＡセグメント（例えば、重鎖及び軽鎖をコードする配列及び発現制御配列）を含むベクターは公知の方法によって宿主細胞に移入することができ、これらの方法は細胞性宿主のタイプによって変わる。例えば、原核細胞には塩化カルシウムトランスフェクションが、通常利用される他の細胞性宿主にはリン酸カルシウム処理、リポフェクション（lipofection）又はエレクトロポレーション（electroporation）が用いられる（Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ（１９９０））。一度発現すれば、本発明の構築体は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー及びゲル電気泳動を含む当該技術分野における標準手段で精製することができる（Ｓｃｏｐｅｓ、ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ，ＮＹ（１９８２））。発現した構築体の結合親和性は、本明細書の実施例部分により十分に例示されるように、当該技術分野において周知の技術により確認することができる。医薬用途には、少なくとも均一性が９０ないし９５％の実質的に純粋なＣＤＲグラフト化抗体又はそれらの結合タンパク質が好ましく、９８ないし９９％以上の均一性が最も好ましい。部分的に、もしくは所望の均一性に一度精製されれば、そのＣＤＲグラフト化抗体を診断もしくは治療（体外を含む）、又はアッセイ方法の開発及び実施、免疫蛍光染色等に用いることができる（ＬｅｆｋｏｖｉｔｅおよびＰｅｒｎｉｓ、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄs，ＶｏｌｕｍｅｓＩおよびＩＩ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮＹ（１９７９および１９８１））。本発明のＣＤＲグラフト化抗体又はそれらの結合タンパク質は、典型的には、Ｔ細胞介在疾患の治療にその用途が見出される。例えば、治療に適する典型的な状態には、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、リューマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、クローン病及び重症筋無力症のような自己免疫疾患が含まれる。本発明のＴ細胞抗体の治療への使用は、特定の免疫関連疾患と、特定のＴ細胞抗原受容体Ｖ領域遺伝子産生物の発現又は特定のＴ細胞抗原受容体Ｖ遺伝子の拡張使用との相関を前提としている。Ｔ細胞抗原受容体Ｖ領域は、Ｔ細胞抗原受容体を用いる特定の治療介入により個人の免疫応答を調節することが可能であるため、部分的には有用である。特に、特定の可変領域遺伝子座の存在及び発現が特定の免疫関連疾患と相関することが示されている。特定の免疫疾患に関連する特定のＶ領域遺伝子座を決定することにより、特定のＶ領域を担持するＴ細胞による攻撃を阻害することで個人を治療することが可能である。本発明において、治療という用語は、疾患の“予防”、“抑制”又は“処置” を含むことを意味する。“予防”には、疾患の誘発以前に、保護組成物を投与することが含まれる。したがって、例えば、動物モデル、ＥＡＥにおいて、疾患を引き起こす脳炎惹起物質を注射する前に保護組成物を成功裡に投与することは、結果として疾患の“予防”となる。 “抑制”には、疾患の誘発の後ではあるが臨床的な発症以前に組成物を投与することが含まれる。再びＥＡＥの例を用いると、脳炎惹起物質の注射後ではあるが、神経学的症状の出現以前に保護組成物を成功裡に投与することには、疾患の “抑制”が含まれる。 “処置”には、疾患の発症後に保護組成物を投与することが含まれる。ＥＡＥの例のおいては、脳炎惹起物質を注射した後であって臨床的な兆候が出現した後に保護組成物を成功裡に投与することには、疾患の“処置”が含まれる。疾患の予防または処置における抗体又はそれらの結合タンパク質の有効性のスクリーニングに用いることができる動物モデル系が利用可能である。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、Ｋｎｉｇｈｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：１６５３（１９７８）及びＲｅｉｎｅｒｓｔｅｎら、ＮｅｗＥｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．２９９：５１５（１９７８）に開示される感受性マウスにおいて試験する。重症筋無力症（ＭＧ）は、Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２：２３３−２８４（１９８８）に記述されるように、他種に由来する可溶性ＡＣｈＲタンパク質で疾患を誘発することによりＳＪＬ／Ｊ雌マウスにおいて試験する。関節炎は、Ｓｔｕａｒｔら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２：２３３−２８４（１９８４）に記述されるように、ＩＩ型コラーゲンの注射に感受性系統のマウスに誘発させる。アジュバント関節炎は、ＶａｎＥｄｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３１：１７１−１７３（１９８８）に記述されるように、ミコバクテリア熱ショックタンパク質を注射することにより感受性ラットに誘発させる。甲状腺炎は、Ｍａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ１５２：１１１５−１１２０（１９８０）に記述されるように、チログロブリンを投与することによりマウスに誘発させる。インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は自然に発生するか、もしくはＫａｎａｓａｗａら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ２７：１１３（１９８４）に記述されるもののような特定の系統のマウスに誘発させることができる。マウス及びラットにおけるＥＡＥは、ヒトにおけるＭＳのモデルとして役立つ。このモデルにおいて、Ｐａｔｅｒｓｏｎ，ＴｅｘｔｂｏｏｋｏｆＩｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（Ｍｉｓｃｈｅｒら編、）ＧｒｕｎｅａｎｄＳｔｒａｔｔｏｎ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ１７９−２１３（１９８６）；ＭｃＦａｒｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ１７９：４７８−４８０（１９７３）；及びＳａｔｏｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：１７９−１８４（１９８７）に記述されるように、ミエリン塩基性タンパク質を投与することにより脱髄疾患が誘発される。本発明のＣＤＲグラフト化抗体又は結合タンパク質は、他の抗体、特に疾患に応答し得るヒト細胞上の他のマーカーに反応するｍＡｂ、と組み合わせて用いることもできる。例えば、適切なＴ細胞マーカーには、第１回国際白血球分化ワークショップ（First International Leukocyte Differentiation Workshop）によって命名された、いわゆる“分化のクラスター”に集められるものを含めることができる（Ｂｅｒｎｈａｒｄら、ＬｅｕｋｏｃｙｔｅＴｙｐｉｎｇ，ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ，ＮＹ（１９８４））。一般に、このＣＤＲグラフト化抗体又は結合タンパク質は、精製された形態で、薬理学的に許容し得る担体と共に利用される。典型的には、これらの担体には、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水性もしくはアルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲル・デキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム並びに乳酸加リンゲル液が含まれる。複合体を懸濁液中に保持する必要があるならば、適切な生理学的に許容し得るアジュバントを、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン及びアルギン酸塩のような増粘剤から選択することができる。静脈内ビヒクルには、リンゲル・デキストロースに基づくもののような体液及び栄養素補液及び電解質補液が含まれる。防腐剤及び他の添加物、例えば、抗微生物剤、酸化防止剤、キレート剤及び不活性ガスが存在していてもよい（Ｍａｃｋ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，１６版（１９８２））。本発明の構築物は、分割して投与される組成物として、又は他の薬剤と共に用いることができる。これらには、シクロスポリン、メトトレキセート、アドリアマイシンもしくはシスプラチンのような免疫療法薬、及び免疫毒素が含まれ得る。医薬組成物には、本発明のＣＤＲグラフト化抗体又はそれらの結合タンパク質と様々な細胞毒性剤もしくは他の薬剤との“カクテル”を含み、本発明による構築物と、異なる特異性を有するＣＤＲグラフト化抗体との組合せさえも含んでいる。本発明による医薬組成物の投与経路は、当該技術分野における熟練者に一般に周知のあらゆるものであり得る。限定免疫療法（limitation immunotherapy）を用いないものを含む治療については、本発明のＣＤＲグラフト化抗体又はそれらの結合タンパク質は、標準技術に従って、あらゆる患者に投与することができる。この投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内を含むあらゆる適切な方式によるものであっても、あるいは適切にカテーテルを用いる直接輸液によるものであってもよい。投与の用量及び頻度は、患者の年齢、性別及び状態、他の薬物の同時投与、逆徴候（counter indication）及び臨床医によって考慮される他のパラメーターに依存する。本発明の構築物は、保存のために凍結乾燥し、使用前に適切な担体中で戻すことができる。この技術は従来の免疫グロブリンで有効であることが示されており、当該技術分野において周知の凍結乾燥及び戻しの技術を用いることができる。凍結乾燥及び戻しが様々な程度の抗体活性の損失（例えば、従来の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも活性損失が大きい傾向にある）に繋がり、使用レベルを調整して補う必要があり得ることは、当該技術分野における熟練者には明らかである。本発明のＣＤＲグラフト化抗体又はそれらのカクテルを含む組成物を、予防及び／又は治療処置のために投与することができる。特定の治療用途においては、選択された細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、転形（modulation）、殺傷、もしくは他の測定可能なパラメータを達成するに十分な量を、“治療上有効な用量”と定義する。この用量を達成するために必要な量は、疾患の重篤性及び患者自身の免疫系の一般的な状態に依存するが、一般に、体重ｋｇ当りＣＤＲグラフト化抗体又は結合タンパク質０．００５ないし５．０ｍｇの範囲をとり、０．０５ないし２．０ｍｇ／ｋｇ／投与の投与量がより一般に用いられる。予防用途に対しても、本発明の構築物及びそれらのカクテルを含有する組成物を、同様の、もしくは僅かに低い投与量で投与することができる。本発明による構築物を含有する組成物は、哺乳動物における選択Ｔ細胞標的集団の変更、不活性化、殺傷または除去を助成する予防及び治療環境において利用することができる。別の態様においては、ここに記述される構築物が、細胞の不均質な集合から標的細胞集団を生体外もしくはイン・ビトロで選択的に殺傷し、枯渇させ、又は他の方法で効果的に除去するために用いられ得る。哺乳動物に由来する血液を生体外でＣＤＲグラフト化抗体又はそれらの結合タンパタ質と一緒にし、それにより望まざる細胞を殺傷し、又は他の方法で血液から除去し、標準技術により哺乳動物に戻してやることができる。治療上の使用に加えて、この構築物には他の用途が見出される。態様の１つにおいては、本発明の抗体又は結合タンパク質は研究調査において有用である。本発明のＴ細胞受容体結合タンパク質または抗体は、Ｔ細胞受容体に関する構造的及び機能的研究にも有用である。特定の形態のＴ細胞受容体の基質もしくは結合ドメインとして役立つことに加えて、これらの抗体構築物は、Ｔ細胞受容体の様々な部分の本来の配置を概算するための立体配座研究の調査の道具として役立ち得る。さらに別の態様においては、Ｔ細胞抗体又はそれらの結合タンパク質を診断プローブとして用いることができる。特定の態様の１つにおいては、本発明の構築物を、生物学的試料中の特定のＴ細胞Ｖ領域サブファミリーの量もしくはその存在について決定するのに用いることができる。そのようなアッセイの１つが、Ｒｉｔｔｅｒｓｈａｕｓ−“全白血球表面抗原を用いる治療及び診断方法”と題する１９９２年５月２６日発行のＷＯ９２／０８９８１に記述されている。同様に、本発明は、生物学的試料中のＴ細胞抗原受容体の特定のサブセットの検出に基づく、ＭＳのような免疫関連疾患の診断方法を提供する。ＣＤＲグラフト化抗体又はそれらの結合タンパク質は、当該技術分野において周知の技術に従って、標識することができる。この構築物は、他のインビボおける用途にも適している。例えば、標的Ｔリンパ細胞のみを排除することが望まれる末梢血液細胞の選択的な細胞処理、又は、同様に、細胞培養物における望まざるＴリンパ細胞の排除に用いることができる。以下の例は、本発明の特定の側面をより詳細に記述することを意図するものであるが、限定的に考えられるものではない。実施例１ＴＭ２７−作業の概要１．ＢＡＬＢ／ｃマウスをＴ細胞白血病細胞株ＨＰＢ−Ａｌｌで（腹腔内投与１回、静脈内投与２回）免疫した。２．このマウスから脾臓細胞を採取し、不死化マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ５３ＡＧ８．６５３と融合した。３．ＨＡＴ培地中にて適正なクローンを選択した。４．適正に結合した被選択クローンのスクリーニングは、放射活性物質で標識したＨＰＢ−ＡＬＬを免疫沈降法にかけることにより行った。５．限界希釈法にてサブクローニングを行った。６．特異性については、ＰＢＬ刺激法およびＣＤ３モジュレーション（modulati on）法の研究によってチェックした。７．適正な抗体を産生しているハイブリドーマを４Ｈ１１と命名した。８．このクローンからＲＮＡを入手し、ｍＲＮＡを単離した。このｍＲＮＡに対するｃＤＮＡを調製した。９．ｃＤＮＡの塩基配列を行い、精度を確認した。１０．単離したｃＤＮＡ（ＨおよびＫ）をＭ１３ベクター中でクローニングした。１１．実施例２に例示したように、選択したヒト・フレームワーク領域を、突然変異によって導入した。１２．ヒト化抗体（各−１ｍｇ）を、予備評価のためＮＳＯ突然変異体（トランスフェクト体）から精製した。異なる５種類のＴＭ２７を作成した。ＴＭ２７Ｌ：重鎖の４８番の部位にロイシンを導入。ＴＭ２７Ｉ：重鎖の４８番の部位にイソロイシンを導入。ＴＭ２７．１：ＫＳをＶＦ（７８−７９）に変更。ＴＭ２７．２：ＶＴＭＬ／ＴをＬＳＩＳ／Ｎ（６６−６９／７３）に変更。ＴＭ２７．３：ＶをＲ（９２）に変更。実験の詳細な説明要約このプロジェクトの狙いは、マウスの抗−ヒトＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）Ｖβ ５．２／５．３モノクローナル抗体（ＴＭ２３）をヒト化し、適正なプロセス開発に向けて抗体発現細胞株を得ることにある。ヒト化抗−ＴＣＲＶβ５．２／５．３モノクローナル抗体はＴＭ２７である。マウス抗体４Ｈ１１ハイブリドーマは、マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８．６５３を、Ｔ細胞白血病細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬで免疫したＢａｌｂ／ｃマウスから採取した脾臓細胞と融合させることによって得た。このハイブリドーマは、ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖβ５．２および５．３に特異的なモノクローナル抗体ＴＭ２３を発現する。イソタイプはＩｇＧ２ａ／κである。ヒト化ＴＭ２３の重鎖および軽鎖をコードしているｃＤＮＡを、マウスのＩｇＧ２ａおよびκに特異的な３’末端プライマーを用いて構成された４Ｈ１１ｃＤＮＡライブラリーから単離した。単離されたｃＤＮＡクローンを、ＤＮＡの配列決定および内部アミノ酸配列決定によって確認した。重鎖および軽鎖のＣＤＲ（相補性決定領域）を、マウスのフレームワーク配列の保存されたアライメントに従って同定した。Ｌ，Ｖ，（Ｄ），Ｊ（Ｌ：リーダー、Ｖ：可変部、Ｄ：多様性、Ｊ：連結）ＤＮＡ断片を、ＰＣＲ法によって単離し、ＣＨＯ細胞発現ベクターｐＴＣＳＬＣκＤＨＦＲおよびｐＴＣＳＬＣｇ１ＮｅＯＡｐ中でクローニングする。二つのベクターは、マウスＶ／ヒトＣキメラ抗体の発現のため、それぞれヒトκおよびＩｇＧ１定常領域のｃＤＮＡを保持している。ｃＤＮＡクローンから演繹したアミノ酸配列の比較に基づき、ＴＭ２３重鎖はカバット（Kabat）サブグループＩＢに属することが分かった。Ｖκ配列は、カバットＶκＶに属することが分かった。よって、ヒトのＮＥＷＭおよびＲＥＩフレームワークを、重鎖および軽鎖のヒト化にそれぞれ選択した。再編成したＶ（Ｄ）Ｊ断片（５’Ｖおよび３’Ｖを除いて）を、ゲノム配置のリーダー配列およびイントロン配列を保持しているＭ１３ベクターでクローニングし、完全なゲノムＬ−Ｖ（Ｄ）Ｊ構築体を得た。骨髄腫の発現ＣＤＲグラフト化（Ｄ）Ｊ領域を突然変異によって構築した後、ヒトκおよびＩｇＧ１の定常領域をそれぞれ保持しているＤＮＡクローンを骨髄腫発現ベクターでクローニングした。さまざまな突然変異を起こした５種類のヒト化重鎖を構築した。これら５つの重鎖各々を、ヒト化軽鎖とともにＮＳＯ骨髄腫細胞系へコトランスフェクトした。拡張したヒトＩｇＧ１／κ陽性トランスフェクト体の培養上清から、評価用にヒト化抗体を精製した。得られた結果は、さほど良好でなかった場合でもＴＭ２７Ｌは最小量のアミノ酸配列を伴い、その他のヒト化バージョン体と同様に、Ｖβ５．３Ｔ細胞が染色されていた。よって、以後の開発用にＴＭ２７Ｌを選択し、ＴＭ２７と命名した。ＣＨＯ細胞の発現前述のように、ＴＭ２７の重鎖および軽鎖のリーダーおよびＶ領域を、ＣＨＯ細胞発現システム、ｐＴＣＳＬＣｇ１ＮｅＯＡＰ（重鎖）およびｐＴＣＳＬＣκ ＤＨＦＲ（軽鎖）中でｃＤＮＡ配置をクローニングするため、ＰＣＲ法によって骨髄腫の構築体から単離した。ＣＨＯ細胞トランスフェクト体を選択し、ヒトのＩｇＧ１／κ陽性細胞をクローニングした。一番高かったもの、ＴＭ２７Ｌ−６６２−３５を、セルバンク用および小規模のヒト化Ａｂ調製のために拡張した。ＴＭ２７抗体を発現しているＣＨＯは、プロジェクト全体を通して特徴付けられており、骨髄腫細胞系および親株のＴＭ２３とほぼ同等であった。同時に、ＣＨＯ細胞クローンを増幅させ、クローニングして、抗体発現を増大させて、生産性の向上にとってこの細胞株が適正であることを示した。詳細な説明ＨＰＢ−ＡＬＬによるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫ミカエルブレナー（Michael Brenner）博士（ハーバード医学校）から譲渡されたヒトＴ細胞白血病ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞（３×１０⁷）から得たβＦ１（抗ヒトβ鎖Ｔ細胞受容体の定常領域に対するモノクローナル抗体）免疫沈降物を、完全フロイントアジュバントと混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。５週間後、マウスを３日連続して生理的食塩水中の３×１０⁷個の細胞で、１回目は腹腔内投与、２、３回目は静脈内投与（ｉ．ｖ．）より追加免役した。脾臓細胞とＰ３Ｘ６３ＡＧ８．６５３との融合最終のｉ．ｖ．による追加免疫から３日後、確立された技術を使用して融合を行った。５倍過剰の脾臓細胞を、５０％ポリエチレングリコール１５００（ＢＤＨ、Ｄｏｒｓｅｔ，英国）を使用してＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（マウス骨髄腫、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＩｇ非分泌細胞株、ＡＴＣＣＣＲＬ１５８０）と融合した。融合細胞におけるＨＡＴ選択フィーダーとして１ウェルあたり２×１０⁵ＢＡＬＢ／Ｃの胸腺細胞を播いた９６ウェルのプレートに融合細胞を播種し、１５％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）とＨＡＴ（ヒポキサンチン６ｍＭ、アミノプテリン５０ｍＭ、およびチミジン２ｍＭ）を含有するＰＲＭＩ−１６４０培地にて選択した。細胞を５％ＣＯ₂含む加湿した空気で３７℃にてインキュベートした。ハイブリドーマのスクリーニング１３−１４日後、成長した細胞を含有するウエルをＥＬＩＳＡ法および¹²⁵Ｉ −放射性物質で標識したＨＰＢ−ＡＬＬ細胞の免疫沈降法とを用いてスクリーニングした。免疫沈降法の条件において、ＣＤ３分子がＴＣＲα鎖およびβ鎖から解離した。以後のクローニング用に、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞と反応したハイブリドーマをＴ−７５フラスコ中で拡張した。関心のあるハイブリドーマのクローニングＨＰＢ−ＡＬＬＴＣＡＲ（Ｔ細胞抗原受容体）に対して特異性を示すハイブリドーマを、限界希釈法によってクローニングした。細胞密度を２〜０．０１５細胞／ウェルの範囲となるよう、連続する２倍希釈法によって９６ウエルプレート上で細胞をプレートアウト（plate out）した。最高の産生能を有する生育の最良なコロニーを、前述の過程を２回反復して選択した。さらに２回の選択を行った後、最終コロニーの一つ４Ｈ１１を同定した。４Ｈ１１クローンによって発現されるｍＡｂは、β Ｆ１ｍＡｂで沈殿するＴＣＲα鎖およびβ鎖であると同定される分子を免疫沈降し、ＴＣＲ βの定常領域と反応していた。結果からは、このｍＡｂが、ＨＰＢ−ＡＬＬＴ細胞上で発現するＴＣＲ β鎖に対して特異性を有したことが示唆された。この抗体を、便宜上ＴＭ２３と名付けた。ハイブリドーマ４Ｈ１１、ＴＭ２３由来モノクローナル抗体の定性市販のキット（Ｚｙｍｅｄ，ＳｏｕｔｈＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を使ってＴＭ２３のイソタイプを調べた。その結果、これがマウスＩｇＧ２ａ／κイソタイプであることが示めされた。ＴＭ２３ｍＡｂの抗−ＴＣＲ反応性を確認するため、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞の表面由来のＣＤ３分子をコモジュレート（comodulate）する能力についてスクリーニングを実施した。過去の実験から、細胞を抗−ｍＡｂで前もってインキュベートした場合、ＴＣＲのα鎖またはβ鎖のいずれかに対するｍＡｂが細胞表面におけるＣＤ３をコモジュレートすることが示唆されている。ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞をＴＭ２３と共に前もってインキュベートした場合、未処理細胞に認められたＬｅｕ−４反応性と比較て、抗−ＣＤ３ｍＡｂＬｅｕ−４の反応性が有意に低下していた。正常のヒトＰＢＬ（末梢血リンパ球）を、ＴＭ２３との反応性試験に使用した。試験対象としたＰＢＬＴ細胞の１．６−３．０％がＴＭ２３と反応した。この結果は、特異的Ｖ領域の決定基と反応することが知られているその他のｍＡｂについて得られている結果と同じである。ＴＭ２３が、ヒトＶβ５．２および５．３サブファミリー（Ｂｏｙｌｓｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：７４１（１９８６））と反応するｍＡｂである１Ｃ１として、同一のエピトープに結合するか否かを決めるため、一つのｍＡｂが別のｍＡｂの結合を阻害する能力を有するかについて検討した。まず、ＴＭ２３とＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を共にインキュベートしたところ、蛍光色素を結合した１Ｃ１の結合が阻害された。また、最初に細胞を１Ｃ１と共にインキュベートした場合にも、ＴＭ２３への結合が阻害された。この結果から、ＴＭ２３と１Ｃ１とが同一または近接したエピトープに結合することが示唆されている。ＴＭ２３と１Ｃ１とが類似の反応性を呈するかについて詳細に検討するために、別のｍＡｂで刺激することによりＰＢＬ細胞株を複数誘導した。各々の細胞株について、各々のｍＡｂとの反応性を検討した。ＴＭ２３で刺激することによってＰＢＬ細胞株を確立した場合、１Ｃ１および４Ｈ１１は共に類似したパーセントの細胞と反応した。１Ｃ１で刺激したＰＢＬ細胞株についても同様の結果を得た。４Ｈ１１培養細胞の生育４Ｈ１１クローンＴＭ２３．１７−３１−９１をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（１：１）に１％ウシ胎仔血清、１００μ／ｍｌペニシリン、１００μ／ｍｌストレプトマイシンおよび１２．５ｍＭグルタミンを添加した培地中で生育し、拡張した。ＴＭ２３の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡの調製約１０⁸の４Ｈ１１細胞を遠心分離によって単離し、氷冷ＰＢＳで１回洗浄した。総ＲＮＡ量は、ＰｒｏｍｅｇａＲＮＡｇｅｎｔｓＴｏｔａｌＲＮＡ単離キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ♯ Ｚ５１１０）を使用して調製した。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡは、ＰｒｏｍｅｇａＰｏｌｙＡＴｒａｃｔｍＲＮＡ単離システム（ＰｒｏｍｅｇａＣａｔＺ５２００）を用いて調製した。マウスのＩｇＧ２ａおよびκ特異性ｃＤＮＡライブラリーは、ＢＲＬＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔキット（ＢＲＬＣａｔ＃８２Ｙ８ＳＡ）とＩｇＧ２ａプライマー５’ＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＴＣＣＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＴＴＡＧＴ３’ およびκプライマー５’ＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡＡＴ３’ を使用して調製した。二つのプライマーは、制限酵素ＸｈｏＩの切断部位と、マウスＩｇＧ２ａおよびκコード領域の３’末端部に相補的な配列とをそれぞれ含む。ｃＤＮＡを、キット中に含まれているプラスミドｐＳＰＯＲＴ中でクローニングし、受容能を有する大腸菌（E.coli）ＤＨ５α細胞中へエレクトロポレーションによってトランスフォームした。正しいサイズの挿入部分を保持しているプラスミドクローンを、塩基配列決定のために選択した。ＴＭ２３の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡクローンの同定正しいサイズの挿入部分を有するミニプレップ（mini-prep）プラスミドＤＮＡ（軽鎖クローン番号＃１、６、１９、２０、２５および２６、重鎖クローン番号＃４、９、１１、１５、２２および３４）を、ＤＮＡ挿入部分に対しＴ７プライマー５’部を有するシーケンス用キット（ＵＳＢＣａｔ＃７０７７０）を使用して、二重鎖ＤＮＡシーケンスにかけた。軽鎖クローン番号＃６、２０および２５、ならびに重鎖クローン番号＃３４の配列は、マウスのＩｇクローンであること示していた。軽鎖クローン＃６、２０および２５は同一の塩基配列を有し、＃６には点突然変異が一カ所存在し、機能しないクローンであった。クローン＃２０および３４を、κ ５’ＧＡＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＧＧＴＡＧＡＡＧＴＴＧＴＴ３’ およびＩｇＧ２ａ５’ＧＧＴＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＡＡＴＡＡＣＣＣＴＴＧＡＣ３’ なる定常領域特異的プライマーを使って塩基配列決定を行った。結果からは再度、＃６のクローンが機能しないクローンであることと、＃２０および３４Ｇがそれぞれ軽鎖、重鎖の正しいクローンであることが分かった。この二つのクローンから演繹したｃＤＮＡとアミノ酸配列を図１に示す。Ｎ−末端部のブロッキングによるミクロアミノ酸配列を、ポリアクリルアミドゲルから単離したＣＮＢｒ開裂ペプチド断片から配列決定した。この過程で得られた内部Ｖ領域のアミノ酸配列は、ｃＤＮＡ配列から演繹したアミノ酸配列と一致していた。この結果より、ｃＤＮＡ単離されたクローンはＴＭ２３の重鎖と軽鎖をコードするクローンであることが確認された。重鎖および系鎖のＣＤＲは、ＫａｂａｔとＷｕ（上掲）の方法に従って同定し、図１においてハイライトおよび下線をつけた。Ｈ鎖およびＬ鎖のＶ領域ＤＮＡのＰＣＲ法を用いた単離、およびＤＮＡ塩基配列の決定キメラＴＭ２３抗体の産生マウスのＶＨＤＮＡおよびＮＫＤＮＡの単離ＴＭ２３の重鎖および軽鎖可変領域を発現ベクターへ挿入のため調製した。ＴＭ２３マウスＶＨをコードするＤＮＡ配列を、ＴＭ２３ＭｕＶＨ．ＭｕＩｇＧ２ａからオリゴヌクレオチド・プライマーＶＨ１ＢＡＣＫ５’ＡＧＧＴＳＭＡＲＣＴＧＣＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ３’ および、ＶＨ１ＦＯＲ５’ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＧＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧ３’ を使用するＰＣＲ法によって増幅した。ＶＨ１ＢＡＣＫは制限酵素ＰｓｔＩによる切断部位を、およびＶＨ１ＦＯＲは同様に制限酵素ＢｓｔＥＩＩによる切断部位を含有している。ＭはＣまたはＡ、ＳはＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、ＷはＡまたはＴを表す。従って、以上の切断部位は、ＴＭ２３ＶＨＤＮＡの５’末端および３’末端部へそれぞれ導入される。増幅されたＤＮＡをｐｓｔＩおよびＢｓｔＥＩＩで切断し、同一酵素で切断したベクターＭ１３ＶＨＰＣＲ１の二重鎖複製（ＲＦ）型ＤＮＡのＰｓｔＩおよびＢｓｔＥＩＩ切断部位に結合する。Ｍ１３ＶＨＰＣＲ１は、Ｍ１３−ＨｕＶＨＮＰ（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５（１９８６））から誘導したＭ１３ファージベクターであり、免疫グロブリン・プロモーター、シグナル配列および適正なスプライシング部位を含んでいる（Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：３８３３−３８３７（１９８９））。結合されたＤＮＡを、受容能のある大腸菌（E.coli）ＴＧ１株（Ｋ１２、△（ｌａｃ−ｐｒｏ）、ｓｕｐＥ、ｔｈｉ、ｈｓｄＤ５［Ｆ’ ｔｒａＤ３６、ｐｒｏ^A+B+、ｌａｃＯ⁴，ｌａｃＺＭ１５］）にトランスフォームした。得られた組み換えファージ・プラークから、一本鎖ＤＮＡを調製した。ＴＭ２３マウスＶＫをコードするＤＮＡ配列を、ＴＭ２３ＭｕＶＫ．ＭｕＣＫからＰＣＲ法により、オリゴヌクレオチド・プライマーＶＫ１ＢＡＣＫ５’ ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ３’ と、ＶＫ１ＦＯＲ５’ ＧＴＴＡＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣ３’ を用いて増幅した。ＶＫ１ＢＡＣＫは制限酵素ＰｖｕＩＩの切断部位を含む。ＶＫ１ＦＯＲは、ＤＣＲ３中のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位で除去されるように設計された２つの重複する内部プライマーと結合したＢｇｌＩＩ切断部位を含んでおり、２つの内部プライマーは、オリゴ９４３５’ ＣＣＧＡＧＧＡＡＧＴＴＴＡＣＴＡＴＡＣＴＧ３’ オリゴ９４４５’ ＣＡＧＴＡＴＡＧＴＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＧＧ３’ である（Ｈｏｒｔｏｎら、（１９９０））。ＰｖｕＩＩおよびＢｂｌＩＩ部位を、このようにしてＴＭ２３のＶＫＤＮＡの５’および３’末端へ導入した。増幅されたこのＤＮＡをＰｖｕＩＩとＢｇｌＩＩで消化し、ＰｖｕＩＩおよびＢｃＩＩで切断したＭ１３ＶＫＰＣＲ１に結合した。酵素ＢｇｌＩＩおよびＢｃｌＩはＤＮＡを切断して、たがいに結合可能な適合付着末端を作り出す。Ｍ１３ＶＫＰＣＲ１はＭ１３ＶＨＰＣＲ１と同一のプロモーター、シグナル配列、およびスプライシング部位を有する（Ｏｒｌａｎｄｉら、（１９８９））。結合されたＤＮＡを、大腸菌（E.colil）ＴＧ１にトランスフォームし、組み換えファージ・プラークより調製された一本鎖ＤＮＡを得た。ＶＨについては３５９塩基対（ｂｐ）、ＶＫについては２８８ｂｐの正確なサイズのＰＣＲ産物を得た。ＶＨＤＮＡをベクターＭ１３ＶＨＰＣＲ１に挿入してＭ１３ＴＭ２３ＭｕＶＨを得た。ＶＫＤＮＡをベクターＭ１３ＶＫＰＣＲ１に挿入してＭ１３ＴＭ２３ＭｕＶＫを得た。ＤＮＡ配列の確認ＰＣＲによって正確なＤＮＡ配列がクローニングされ、重大な突然変異は生じていないことが確認された。プロモーター、シグナル配列、スプライシング部位および翻訳されない５’末端部配列および３’末端部配列を含有する全体で８２３塩基対（ｂｐ）のＶＨ領域を有する、一本鎖Ｍ１３ファージＤＮＡ配列を、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼまたはシークエナーゼを使用してジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７）によって得た。シグナル配列、スプライシング部位および翻訳されない５’末端部配列および３’末端部配列を含有する全体で６３０塩基対（ｂｐ）のＶＫ領域を有する一本鎖Ｍ１３ファージＤＮＡ配列を、前述のごとくジデオキシ法によって得た。発現ベクター中への挿入に適応したＴＭ２３の所望配列を有するＤＮＡクローンを同定した。これらクローンの一つである＃２を、詳細な研究用に選択した。ＶＨを発現ベクターに挿入するために必要な、必須制限部位を導入した結果、Ｎ −末端部において１個のアミノ酸、５の位置のリジン（Ｋ）が、グルタミン（Ｇ）に変更され、Ｃ−末端部において、１０８の位置でセリン（Ｓ）がスレオニン（Ｔ）に変更されていた。発現ベクター中への挿入に適応したＴＭ２３ＶＫの所望配列を有するＤＮＡクローンを同定した。これらのクローンの一つである＃４を、詳細な検討のために選択した。ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を除去しても変化しなかったが、ＶＫを発現ベクターに挿入するために必要な必須制限部位を導入した結果、Ｎ−末端部で３つのアミノ酸が変化していた。すなわち、使用するプライマーによって、４の位置においてメチオニン（Ｍ）がロイシン（Ｌ）に、７の位置においてスレオニン（Ｔ）がセリン（Ｓ）に、８の位置においてスレオニン（Ｔ）がプロリン（Ｐ）に変化しており、またＣ−末端部においては１０５の位置でバリン（Ｖ）がグルタミン（Ｅ）に一カ所変化していた。Ｖ領域ＤＮＡ断片のＭ１３ベクターでのクローニング哺乳動物細胞中で抗体を継続的に発現させるために、クローン化されたマウス可変領域を、ヒト定常領域遺伝子を含有する発現ベクターへ転移させた。ヒト化用のＩｇ１イソタイプの選択以下の理由により、ヒトのＩｇＧ１イソタイプをＴＭ２７用に選択した。１．ＩｇＧ１はＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害性）およびＣＤＣ（補体依存性細胞障害性）の両者を媒介する能力を有する。従って、それらは下流を調節しているＶβ５．２／５．３Ｔ細胞により有効となる。２．Ａｂのヒト化において、ＩｇＧ１が頻繁に使用されている。ＣＤＲグラフト化のためのヒトのフレームワーク選択ヒト化ＴＭ２３抗体の産生ヒト化ＴＭ２３可変領域の配列の設計ＴＭ２３ＣＤＲを受容するためのヒトのフレームワーク配列の選択と、ヒトのフレームワーク中で置換される必須のネズミ残基の決定を行った。コンピュータによるＴＭ２３ＶＨおよびＶＫのアミノ酸配列の比較を、別の既知のネズミ抗体およびヒト抗体のＶＨおよびＶＫ配列の両者について行った。ドナスター社（DNASTAR Ltd,London W139BL,英国）から入手したプログラム、ＡＬＬＩＧＮを使用し、Ｃｏｍｐａｑ３８６プロセッサ上で実行した。ＡＡＬＩＧＮでは、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ法を使用して二つのタンパク質配列を整合する。まず、Ｌｉｐｍａｎ− Ｐｅａｒｓｏｎ法によって相同性を示す最良の領域を決定する。それから、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ法によって、配列の最終的な整合を行う。ついで、得られた整合性は、ＣＤＲの長さや、たとえば７１と９４の位置およびＣＤＲに近接する残基のようなＣＤＲのコンフォメーションを維持する基準になると考えられている残基等の因子に特に注意を払いながら調べられる（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏら、（１９９０）；ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅr、（１９９２））。カバットのサブグループとの共通配列の比較により、ＴＭ２３ネズミＶＨをカバットのサブグループＶＫＶに割り付けた。ＴＭ２３フレームワーク中には、これらのサブグループに普通にあるアミノ酸配列が見あたらない。ヒト抗体ＮＥＷＭおよびＲＥＩは、それぞれＶＨおよびＶＫに対するフレームワーク配列を提供した。ＶＨの場合、ＣＤＲに加えて２７−３０のネズミ残基包括部と７１とを使用した。これらフレームワーク残基は、ＣＤＲのコンフォメーションを維持する上で重要であると考えられている（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ、（１９９２））。残基７１は、かさばった側鎖（リシンまたはアルギニン）または小さな側鎖（バリンまたはアラニン）が存在するか否かにより、ＣＤＲ１とＣＤＲ２の相対的配列を固定すると考えられている（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏら、（１９９０）。よって、ＮＥＷＭＶＨにおけるバリン７１を、ＴＭ２３ＶＨではリジンに置換した。超可変領域よりは、残基２７−３０が、ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）によって定義された抗原結合ループの構造の一部を形成する。フレームワーク残基４７−４９も、抗体の構造にとって重要であると考えられている（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ、（１９９２））。よって、代用となるヒト化重鎖を２つ構築した。一つは、ＮＥＷＭの４８の位置にイソロイシン（Ｉ）を入れたもの、もう一つは、４８の位置にロイシン（Ｌ）を入れ、ネズミのＶＨからの４７−４９残基が保存されているようにした。実施例２には、ネズミのＶＨ配列とヒト化したものとを比較して示した。ＴＭ２３ＶＫのために選択したヒトＲＥＩフレームワークには、変更がなかった。実施例２には、ネズミのＶＫ配列とヒト化したものについての比較を示している。哺乳動物発現ベクターｐＴＣＳＮｅｏの説明プラスミドｐＴＣＳＮｅｏは、独自のＸｈｏＩクローニング部位を含み、関心の対象となった遺伝子がここに挿入されている。挿入された遺伝子の転写は、アデノウイルス２主要遅延（major late）プロモーター（Ａｄ２ＭＬＰ）の上流部のＳＶ４０エンハンサーから構成される制御配列によって操作される。Ａｄ２ＭＬＰ自体は、アデノウイルス３分割式リーダーの上流部に位置している。挿入された遺伝子は、３’末端においてマウス免疫グロブリンκ（Ｉｇκ）からのポリアデニル化シグナルと隣接している。哺乳動物における選択は、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ^r）によって与えられる。また、プラスミドは複製のための細菌性オリジン部とβ−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐ^r）とを提供する。発現ベクターｐＴＣＳＬＮｅｏの構築次の配列を有する２つの相補性オリゴヌクレオチド：アンチセンス５’ＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡＣ３’ と、センス５’ＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧ３’ を再アニーリングし、ＸｈｏＩで消化し、ｄＴで埋めたＰＴＣＳＮｅｏに結合した。得られた、５’ＸｈｏＩ／ＸｂａＩ／ＡｐａＩ／ＰｖｕＩＩ／ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ／ＣＩａＩ３’の配向で多数の制限酵素部位から構成されるポリリンカーを有するプラスミドｐＴＣＳＬＮｅｏは、発現に関心を抱いている遺伝子を挿入する際に便利である。同様にして、ｎｅｏ^r遺伝子をほかの選択用マーカーに変更することもできる。発現ベクターｐＴＣＳＬＤＨＦＲ^*の構築ｐＴＣＳＬＮｅｏ中のｎｅｏ^r遺伝子を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩとで消化して除き、プラスミドｐＳＶ２−ＤＨＦＲ^*（スタンフォード医科大学生化学科のＰａｕｌＢｅｒｇ博士から入手した）のＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ消化によって得たネズミ突然変異ＤＨＦＲ^*（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）（ＤＨＦＲ^*）遺伝子断片と再結合した。プラスミドｐＳＶ１８４Ｈ−Ｎｅｏ／ＤＮＳ−ＶκＣκの説明スタンフォード医科大学のＬｅｅＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ博士から入手したプラスミドｐＳＶ１８４△Ｈ−Ｎｅｏ／ＤＮＳ−ＶκＣκ（ＴｈｅｓｉｓｏｆＪｅｆｆｅｒｙＤａｎｇｌ，４８−６７ページ参照）は、マウスのＶとヒトのＣの決めら構築体であって、その中にダンシルクロライド（Dansyl Chloride）特異性ネズミハイブリドーマから分離され再配列されたκ鎖のＶ−Ｊ領域遺伝子セグメントがヒトゲノムＣ断片（ｐＳＶ１８４△Ｈ−Ｎｅｏ−Ｃκ）と融合されている。ＰＣＲ法によるヒトκ鎖定常領域の単離ヒトκ鎖定常領域を含有する未消化プラスミドｐＳＶ１８４ΔＨ−Ｎｅｏ／ＤＮＳ−ＶκＣκ（ｐＳＶＨｕＫ）を使い、二つのプライマー（一方は正方向、他方は逆方向）を使ってＰＣＲを実施した。オリゴマー（プライマー）をオペロンから入手した。ＰＣＲ試薬は、ＡｍｐｌｉＴａｑとともにＧｅｎｅＡｍｐＤＮＡ増幅用キットにより入手した（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社、Ｃｅｔｕｓ）。ＰＣＲ反応は、異なる３段階のＭｇ²⁺濃度に設定して行った。ＰＣＲ産物の一部を１％アガロースゲル上で解析した。Ｍｇ²⁺（濃度１．５ｍＭ）の第一サンプルを、ＰＣＲ産物として選択した。Ｃ領域に隣接しているプライマーは、クローニング目的用の制限酵素認識部位を含有するよう設計された。よって、増幅されたＤＮＡは（３’末端において）ＥｃｏＲＩで消化した。５’末端（ＰｖｕＩＩ）は消化しなかった。消化されたＤＮＡ断片を１％アガロースゲルにかけ、３００ｂｐのバンドを切り出した。ＤＮＡをゲルから抽出し、その少量を１％アガロースゲル上で解析して定性を行い、定量した。３００ｂｐのバンドは純粋であり、ＤＮＡの総量は〜１４０ｎｇと推定された。ｐＢＳＫＳ⁺ベクターでクローニングして配列決定されたヒトκ鎖の定常領域ヒトκ鎖定常領域のＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡ断片を、ＳｍａＩとＥｃｏＲＩで消化しておいたベクターｐＢＫＳ⁺に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使って挿入した。結合用混合物を受容能のある大腸菌（E.coli）ＤＨ５α細胞にトランスフォームする目的で使用した。単一のコロニーを拾い、２４の液体培地に播種するために使用した。培地の各々からＤＮＡを調製した。各々のＤＮＡサンプルをＰｖｕＩＩ（Ｃκの５’末端）とＥｃｏＲＩ（Ｃκの３’末端）で消化し、２％アガロースゲルで解析した。低い範囲のバンド（３００ｂｐ）を分離するのが困難であるため、ＤＮＡサンプルをＰｖｕＩＩのみで消化した。２％アガロースゲルで解析後、２４のうち１９が正確なＣκ挿入部位を有していた。Ｔ７およびＴ３プライマー（挿入部に隣接するベクター中の配列）を使い、（正確な１９サンプル中）サンプル＃１−５を配列決定用に選択した。ほかのシーケンス用試薬は、ＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒｓｉｏｎ２．０キット（ＵＳＢ）から入手した。サンプル＃５は、ヒトκ鎖の定常領域に対応する正確な配列を有することが証明された。ｐＴＣＳＬＣκＤＨＦＲ^*となるために哺乳動物発現ベクターｐＴＣＳＬＤＨＦＲ^*でクローニングされたヒトκ鎖定常領域ヒトκ鎖定常領域は、ｐＢＳＫＳベクター（サンプル＃５）からＰｖｕＩＩとＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて単離した。しかし、バンドの分離に関して前述のような問題があるため、構築体ｐＢＳ／ヒトＣκを使用して２回目の消化を行った。２回目の消化では、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩ（５’からＰｖｕＩＩ認識部位に位置する）を用い、〜３００ｂｐの断片を得た。この断片をゲル精製し、ＰｖｕＩＩで消化し、Ｃκの５’末端にあるベクターの残っている小さな断片を除去した。この最終断片をゲル精製し、次いで定性および定量のため１％アガロースゲル上で解析した。ＣκＤＮＡは、〜２８０ｂｐの位置に純粋なバンドを有し、総量は〜１３５ｎｇと推定した。発現ベクターのｐＴＣＳＬＤＨＦＲ^*に３つのＥｃｏＲＩ認識部位が存在するため、ＰｖｕＩＩ認識部位にのみクローニングするのが最良であると決定した。ＣκＤＮＡを、ＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＩの消化によって調製したため、クレノウ断片を使って（平滑末端を形成するために）ＥｃｏＲＩ末端を修復した。修復された平滑末端を有するＣκＤＮＡを、ＰｖｕＩＩで消化し、フォスファターゼ処理された（ウシ小腸フォスファターゼを用いて）ｐＴＣＳＬＤＨＦＲ^*ベクターへ結合した。結合用混合物を使って受容能のある大腸菌（E.coli）ＤＨα細胞をトランスフォームした。単一コロニーを拾い、２４の液体培地へ播種するために使用した。各々からＤＮＡを調製した。すべてのＤＮＡ試料をＰｖｕＩＩとＨｉｎｄＩＩＩとで消化し、１％アガロースゲル上で解析した。２４サンプル中、５個のサンプルが正しい方向にＣκ挿入部を含んでいた。サンプル＃７を実験継続用に使用した。突然変異ＤＨＦＲ^*遺伝子と野生型ＤＨＦＲ遺伝子との置換ベクターｐＴＣＳＬＣκＤＨＦＲ^*を、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ）ＤＵＸＢ１１細胞中で発現させるため、ＤＨＦＲ^*遺伝子をＤＨＦＲ遺伝子と置換した。ｐＴＣＳＬＣκＤＨＦＲ^*サンプル＃７から抽出したＤＮＡを、ｐＳＶ２−ＤＨＦＲ（スタンフォード大学医学部生化学科ＰａｕｌＢｅｒｇ博士から入手したプラスミド）と同様に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢｇｌＩＩとで消化し、各々の遺伝子断片を単離した。解析にあたり、ｐＴＣＳＬＣκＤＨＦＲ^*ベクター中に付加されたＢｇｌＩＩ認識部位が、ポリＡ認識部位の一部を除去し、ベクター機能に干渉することがわかった。よって、ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩを使って反復消化を繰り返して行った。ベクターの（ＤＨＦＲ^*）ｐＴＣＳＬＣκ部位をホスファターゼで処理した。次いで、分離された両者の断片（ｐＴＣＳＬＣκとＤＨＦＲ）をゲル精製し、１％アガロースゲルにて定性および定量のため分析した。両者のバンドは互いに純粋となり、〜４０−５０ｎｇ／ｍｌの同じような濃度であると推定された。ＤＨＦＲ遺伝子を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使ってｐＴＣＳＬＣκベクターに結合した。結合用混合物を使って、受容能のある大腸菌（E.coli）ＤＨ５α細胞にトランスフォームした。単一コロニーを拾い、２４の液体培地へ播種するために使用した。各々からＤＮＡを調製した。すべてのＤＮＡ試料をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩによる制限酵素消化によって分析した。２４の培養物、２３において、ＤＨＦＲ遺伝子がｐＴＣＳＬＣκベクターへ挿入されていることを示す正確なバンドを得た。サンプル＃２２を以後の利用のために選択した。ヒトのフレームワークによるＣＤＲグラフト化Ｖ領域構築体のインビトロでの突然変異体ヒト化可変遺伝子の構築ヒト化ＶＨ遺伝子を、（これはヒト骨髄腫タンパクＮＥＷＭのフレームワーク領域を伴う合成ＶＨ遺伝子から構成されるものであるが）Ｍ１３ＶＨＰＣＲ１の鋳型の部位指向性突然変異によって構築した。（Ｊｏｎｅｓら、１９８６参照）。ｄｕｔ．ｕｎｇ大腸菌（E. coli）ＲＺ１０３２株中で生育したＭ１３ＶＨＰＣＲ１から一本鎖鋳型ＤＮＡを調製し、鋳型ＤＮＡがチミジンの位置にウラシルを含有するように調製した。突然変異型オリゴヌクレオチドプライマーを、ＴＭ２３のＣＤＲとその両端のいずれかに、約１５ｂｐの完全にマッチする隣接配列とをコードするように合成した。ＴＭ２３ＣＤＲ配列が鋳型配列とマッチした場合、より短いオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。用いたプライマーは、ＣＤＲ１５’ ＴＧＧＣＴＧＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＴＴＡＣＡＣＣＡＴＡＧＧＣＧＧＴＴＡＡＴＧＡＧＡＡＧＣＣＡＧＡＣＡＣＧＧ３’ と、ＣＤＲ２５’ ＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＣＴＴＴＣＡＧＣＡＴＴＧＴＣＡＣＴＣＴＧＧＡＴＴＴＧＡＧＡＧＣＴＧＡＡＴＴＡＴＡＧＴＣＴＧＴＡＴＴＴＣＣＡＴＣＡＣＣＣＣＡＴＡＴＣＡＴＴＣＣＡＡ^T／_GＣＣＡＣＴＣＡＡＧＡＣＣ３’ と、ＣＤＲ３５’ ＣＣＡＧＴＡＧＴＣＣＡＴＡＧＣＡＴＡＧＡＧＧＧＴＡＧＣＣＧＴＡＡＣＣＣＴＡＴＣＴＣＴＴＧＣＡＣＡＡＴＡＡＴＡＧ３’ であった。ＣＤＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーを３’末端で拡張し、２７−３０の位置に必要な残基を含有するようにした。オリゴヌクレオチド混合物をＣＤＲ２用に合成し、ＣＤＲの３’末端において、ＶＨの４８の位置がＬまたはＩになるような２つの代用コドンを与えるべく、ＶＨの４０２番目の塩基にＧまたはＴがくるよう拡張した。（各々１０ｐｍｏｌの）オリゴヌクレオチドを、総量５０μｌ中の５ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより３７℃にて１時間、リン酸化した。各々の突然変異原性プライマー１ｐｍｏｌと、Ｖ遺伝子のＭ１３配列３’方向プライマーとを、総量２０μｌ中の０．５μｇの鋳型と９０℃で３０秒アニーリングし、直ちに７０℃に冷却して、徐々に３７℃に下げた。アニーリングされたプライマーを、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼとＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、室温で一時間インキュベートして拡張し、結合した。ウラシル含有鋳型を、１ユニットのウラシルＤＮＡグリコシラーゼで３７℃で１時間処置して除き、突然変異鎖の完全なものとした。このＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、次いでアガロースゲル電気泳動によって分析し、正しい大きさのＤＮＡが得れれていることを確認した＞このＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで切断し、Ｍ１３ｍｐ１９のＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ部位に結合した。同様に、ヒトのベンス・ジョーンズタンパク質ＲＥＩのフレームワーク領域を伴うＶＫ遺伝子のＤＮＡ配列を構成するＭ１３ファージ鋳型の突然変異誘発によって、再編成したＴＭ２３ＶＫ遺伝子（ＴＭ２３ＨｕＶＫ）を構築した。これは、キメラ軽鎖の構成に用いられたＭ１３ＮＫＰＣＲ１から、クローニング除去に使用した制限酵素ＰｖｕＩＩとＢｃｌＩＩの認識部位により誘導したものである。使用したプライマーは、ＣＤＲ１が５’ ＴＣＴＧＣＴＴＧＧＴＡＡＣＣＡＧＴＴＴＡＡＡＴＡＡＴＴＧＣＴＡＡＴＧＣＣＣＴＧＡＣＴＴＧＣＡＣＴＡＣＡＧＧＴＧＡＴＧＧＴＣ３’ ＣＤＲ２が５’ ＴＣＴＧＣＴＴＧＧＣＡＣＡＣＣＴＧＡＧＴＧＴＡＡＡＣＴＴＧＡＴＧＴＧＴＡＧＴＡＧＡＴＣＡＧＣＴＴ３’ ＣＤＲ３が５’ ＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＡＧＧＡＡＧＴＴＴＡＣＴＡＴＡＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＴＡＧＴＡＧ３’ であった。予想されるＰＣＲ産物のサイズは両方のＶＨで８２３ｂｐ、ＶＫで６２０ｂｐとなり、Ｍ１４ｍｐ１９のベクターでクローン化した。ヒト化可変領域のＤＮＡ配列の確認必要なＣＤＲが挿入されたことを確認し、誤った変化もなく正確なヒト化ＶＫおよびＶＫ遺伝子が構成されたことを確認した。完全な可変領域を、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼまたはシーケナーゼを用いたジデオキシ法によって配列決定した。得られた配列は、設計された配列と同等であった。２つのＶＨに対して予想される配列を与えるクローンを選択した。これらのクローンを、Ｍ１３ＴＭ２３ＮＭＶＨとＭ１３ＴＭ２３ＮＭＶＨＬと命名した。再形成したＶＫの予想配列を提供するクローン＃１１を選択して、Ｍ１３ＴＭ２３ＨｕＶＫと命名した。再編成Ｖ領域の骨髄腫発現ベクターでのクローン化（発現ベクターでヒト化ＴＭ２３可変領域のクローン化）クローン化されたヒト可変領域を、哺乳動物細胞での抗体の発現のためのヒトの定常領域遺伝子を含有する発現ベクターへトランスフォームした。２つのヒト化ＶＨ遺伝子を、Ｍ１３ＴＭ２３ＮＭＶＨとＭ１３ＴＭ２３ＮＭＶＨＬから、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩで断片として単離し、重鎖発現ベクターｐＳＶｈｇｐｔ．ＨｕＩｇＧ１のＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ部位の結合した。同様に、ヒト化ＶＫ遺伝子を、Ｍ１３ＴＭ２３ＨｕＶＫとから、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩで断片として単離し、軽鎖発現ベクターｐＳＶｈｖｇ．ＨｕＣＫのＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ部位の結合した。制限酵素分析は２つの代替ヒト化ＶＨが正しく重鎖ベクターに挿入され、プラスミドｐＳＶｇｐｔＴＭ２３ＮＭＶＨ．ふいｇＤＧ１およびｐＳＶｇｐｔＮＭＶＨＬ．ＨｕＩｇＧ１が得られたことを示した。同様に、ヒト化ＶＫは正しく軽鎖ベクターに挿入され、プラスミドｐＳＶｈｙｇＴＭ２３ＨｕＶＫ．ＨｕＣＫが得られた。Ｈ鎖とＬ鎖の構築物のＮＳＯ細胞へのコトランスフェクションヒト化重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子のコトランスフェクションヒト化発現プラスミドを哺乳類細胞株ＮＳＯおよびＰ３−８．６５３Ｆ８８７９に転移した。ヒト化発現プラスミドを、キメラ発現プラスミドの場合と同一の方法を用いて、ＮＳＯおよびＰ３−８．６５３Ｆ８８７９へコトランスフェクトした。二つのヒト化重鎖プラスミドｐＳＶｇｐｔＴＭ２３ＮＭＶＨ．ＨｕＩｇＧ１とｐＳＶｇｐｔＮＭＶＨＬ．ＨｕＩｇＧ１、ヒト化軽鎖プラスミドｐＳＶｈｙｇＴＭ２３ＨｕＶＫ．ＨｕＣＫとともにコトランスフェクトし、２つの代替ヒト化抗体ＴＭ２３ＨｕＶＨ／ＨｕＶＫとＴＭ２３ＨｕＶＨＬ／ＨｕＶＫを発現する細胞系を得た。これら発現プラスミドもまた、キメラ発現プラスミドと組み合わせてコトランスフェクトし、ハイブリッド抗体ＴＭ２３ＨｕＶＨ／ＨｕＶＫ、ＴＭ２３ＨｕＶＨＬ／ＭｕＶＫとＴＭ２３ＨｕＶＨ／ＨｕＶＨＬ／ＨｕＶＫを発現する細胞系を得た。これらハイブリッド抗体は、ヒト化抗体中の重鎖または軽鎖のいずれかの結合欠損の原因を確認するのに重要なツールとなる。トランスフェクションから１４日後、ＮＳＯ細胞のコロニーが、あらゆる多様なプラスミドの組み合わせによって目視できた。Ｐ３−８８．６５３Ｆ８８７９細胞の１つのコロニーが播種したすべてのプレートから得られ、従ってそれらは廃棄された。ヒトのＩｇＧ１／κ陽性クローンの選択ヒトの抗体を賛成する細胞の選択ヒト化ハイブリッドキメラ／ヒト化抗体を産生するＮＳＯ細胞系を分離した。細胞コロニーを含むウエルから採取した上清サンプルを、ＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングした。ウェルの中の培養上清がＥＬＩＳＡ法で最高値の読みを示した４つのウェル（Ｄ５，Ｄ１０，Ｃ６，Ｅ１１）からＴＭ２３ＨｕＶＨ／ＨｕＶＫ：−ＮＳＯ細胞を選択した。Ｄ５のウエルには目視できるコロニーが二つ認められ、他のウエルには１つ認められた。しかし、これらのウエルから産生した細胞系は必ずしもクローン化されていない。ウエルから得たこれらの細胞系を培養し、液体窒素中でＴＭ２３ＨｕＶＨ／ＨｕＶＫＤ２、Ｄ１０、Ｃ６、Ｅ１１として凍結した。ウェルの中の培養上清がＥＬＩＳＡ法で最高値の読みを示した４つのウェル（Ｂ２，Ｂ７，Ｄ８，Ｅ９）からＴＭ２３ＨｕＶＨＬ／ＨｕＶＫ：−ＮＳＯ細胞を選択した。Ｅ９のウエルには目視できるコロニーが二つ認められ、他のウエルには１つ認められた。しかし、これらのウエルから産生した細胞系は必ずしもクローン化されていない。ウエルから得たこれらの細胞系を培養し、液体窒素中でＴＭ２３ＨｕＶＨＬ／ＨｕＶＫＢ２、Ｂ７、Ｄ８、Ｅ９として凍結した。ウェルの中の培養上清がＥＬＩＳＡ法で最高値の読みを示した４つのウェル（Ｄ９，Ｅ６，Ｆ１０，Ｇ１０）からＴＭ２３ＨｕＶＨ／ＭｕＶＫ：−ＮＳＯ細胞を選択した。Ｆ１９およびＧ１０のウエルには目視できるコロニーが二つ認められ、他のウエルには１つ認められた。しかし、これらのウエルから産生した細胞系は必ずしもクローン化されていない。ウエルから得たこれらの細胞系を培養し、液体窒素中でＴＭ２３ＨｕＶＨ／ＭｕＶＫＤ９、Ｅ６、Ｆ１０、Ｇ１０として凍結した。ウェルの中の培養上清がＥＬＩＳＡ法で最高値の読みを示した４つのウェル（Ｂ８，Ｃ６，Ｄ２，Ｄ８）からＴＭ２３ＨｕＶＨＬ／ＭｕＶＫＬ：−ＮＳＯ細胞を選択した。Ｃ６およびＤ８のウエルには目視できるコロニーが二つ認められ、他のウエルには１つ認められた。しかし、これらのウエルから産生した細胞系は必ずしもクローン化されていない。ウエルから得たこれらの細胞系を培養し、液体窒素中でＴＭ２３ＨｕＶＨＬ／ＨｕＶＫＢ８、Ｃ６、Ｄ２、Ｄ８として凍結した。ウェルの中の培養上清がＥＬＩＳＡ法で最高値の読みを示した４つのウェル（Ｂ９，Ｇ４，Ｇ６，Ｇ１１）からＴＭ２３ＭｕＶＨ／ＨｕＶＫ：−ＮＳＯ細胞を選択した。すべてのウエルには目視できるコロニーが少なくとも４つ認められた。しかし、これらのウエルから産生した細胞系は必ずしもクローン化されていない。ウエルから得たこれらの細胞系を培養し、液体窒素中でＴＭ２３ＭｕＶＨ／ＨｕＶＫＢ９、Ｇ４、Ｇ６、Ｇ１１として凍結した。ＣＨＯ細胞の発現に関する第１鎖ｃＤＮＡの合成細胞質由来ＲＮＡの調製逆転写用にＲＮＡを調製した。液体窒素からＮＳＯＴＭ２３ＨｕＶＨＬ／ＨｕＶＫ細胞の入ったバイアルを取り出し、３７℃で急速に解凍した。細胞をダルベッコ・修正イーグル（Dulbeco's Modified Eagle's）培地／ハム（Ham's）Ｆ１２培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）１０ｍｌに抗生物質と５％無ガンマグロブリンウシ胎仔血清（ＧＣ−ｆｒｅｅＦＢＳ）を添加した培地で漸次希釈した。細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して培地を除き、７５ｃｍ²フラスコ中に新鮮な培地２０ｍｌを添加して細胞を再度懸濁した。この培養液を１７５ｃｍ²フラスコ中で３０ｍｌまで拡張した。勢いよく生育する細胞を遠心分離にて回収し、冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。細胞質由来ＲＮＡを、Ｆａｖｏｌｏら、（１９８０）の方法に従って細胞から調製した。総量で３５０μ ｇの細胞質ＲＮＡを得た。ｃＤＮＡの合成第１鎖ｃＤＮＡを、ＶＨ，ＶＫ領域に対して調製した。第１鎖可変領域のｃＤＮＡを５μｇＲＮＡ、２５０μＭのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、１５ユニットのリボヌクレアーゼ阻害剤（ＰｈａｒｍａｃｉａＲＮＡｇｕａｒｄ）および２５ｐＭのオリゴヌクレオチドプライマーを含む反応で合成した。このプライマーは、ＶＨに対しオリゴ１１０９であり、５’ ＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣ３’ ＶＫに対しオリゴ１０９５である。５’ ＡＧＡＴＴＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧ３’ 反応は７０℃で１０分間加熱した後、徐々に３７℃へ冷却した。モロネイ（Molo ney）ネズミ白血病ウイルス逆転写酵素を１００ユニット添加し、反応液を３７ ℃で３０分間インキュベートした。ｃＤＮＡをＰＣＲによりＶＨに対し下記のオリゴ１０９６とともに、上記プライマーを用いて増幅した。オリゴ１０９６５’ ＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＡＧ３’ ＶＫに対してはオリゴ１０９４を用いた。オリゴ１０９４５’ ＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＡＧＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧ３’ ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によってチェックしたところ、予想されたサイズ（４５０ｂｐ）であり、ゲルからＤＮＡのバンドを精製した。制限酵素による消化ＰＣＲ産物をＣＨＯベクターでクローニングするため消化した。ＶＨＰＣＲ産物をＸｈｏＩとＡｐａＩで消化した。ＶＫＰＣＲ産物をＸｈｏＩとＰｖｕＩＩで消化した。消化ＤＮＡのサンプルを、０．８％アガロースゲル上で電気泳動した。予想された４５０ｂｐのバンドが認められた。ＰＣＲ増幅Ｖ_II［ＴＣＳ］によるｃＤＮＡからのＶ領域（Ｖ_II［ＴＣＳおよびＳ］ならびにＶκ［Ｓ］）の単離これら分子をＰＣＲで増幅するために使用したオリグヌクレオチドプライマー同様、第１鎖ｃＤＮＡサンプルＴＭ２７ＶκとＴＭ２７Ｖ_Hを入手した。Ｔａｑポリメラーゼを使い、ＴＭ２７Ｖ_H ｃＤＮＡを適正なプライマー類とともにＰＣＲにかけた。この産物をアガロースゲルにかけ、ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩキット（Ｂｉｏ１０１）を使って精製した。回収量は１．５ｎｇ／ｍｌと推定された。Ｃ領域のｃＤＮＡ単離に向けたｐＳＲ１Ｎｅｏ４Ｈ１１（Ｌ）とｐＢＪ１４Ｈ１１（Ｈ）を使用したＣＯＳ細胞のトランスフェクション哺乳類発現ベクターであるｐＳＲ１ＮｅｏとＰＢＪ１は、Ｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：６７７（１９９０）に記述されたように、ｐｃＤＬ−ＳＲａ２９６（Ｔａｋｅｂｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６（１９８８））の誘導体である。ここで、ＳＲαプロモーターと、ＳＶ４０ポリアデニル化部位の間に位置するＸｈｏＩ認識部位を、汎用遺伝子クローニングもため、以下の制限部位５’ ＸｈｏＩ／ＸｂａＩ／ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩ３’を含有するポリリンカーによって置換した。ｐＳＲ１Ｎｅｏでは、ネオマイシン耐性遺伝子がアンピシリン耐性遺伝子とＳＲαプロモーターの間に挿入されている。ＴＭ２３重鎖のリーダーとＶ−Ｄ−Ｊ領域をコードするｃＤＮＡは、まずゲノム重鎖定常領域に融合し、次いでＸｈｏＩとＮｏｔＩ切断ｐＢＪ１ベクターに挿入しｐＢＪ１４Ｈ１１（重）を得た。同様に、リーダーとＶ−Ｊをコードする軽鎖は、まずゲノムκ断片に融合し、次いでＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断ｐＳＲ１Ｎｅｏに挿入しｐＳＲ」１ねお４Ｈ１１（軽）を得た。二つのプラスミドｐＢＪ１４１１（重）とｐＳＲ１Ｎｅｏ４Ｈ１１（軽）を、一時的発現のためにＣＯＳ−７細胞（ＳＶ４０でトランスフォームしたアフリカミドリザル腎細胞株、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）にコトランスフェクションした。ヒトＩｇＧ１定常領域の単離ヒトＩｇＧ１定常領域のｃＤＮＡを、前方向プライマーが５’ ＧＣＧＴＧＡＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣ３’ で、逆方向プライマーが５’ ＧＣＧＴＧＡＣＡＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴ３’ からなるＩｇＧ１定常領域プライマーを使い、ＰＣＲによってトランスフェクトされたＣＯＳ細胞から単離したｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡをもとに調製した。３’末端にＥｃｏＲＩ認識部位のある（コード領域に隣接）また、５’末端（コード領域）ＡｐａＩ認識部位のあるＰＣＲ定常領域ＤＮＡ断片をサブクローニングとシーケンス用にｐＢＳＫＳ⁺プラスミドヘクローン化した。全体としての定常領域は５’末端（コード領域）ＡｐａＩ認識部位のあるＴ３，Ｔ７プライマー（定常領域の内部プライマー）を使って配列決定した。正しい配列を伴うクローンを、プラスミドｐＴＣＳＬＮｅｏにサブクローニングし、ｐＴＣＳＬＣｇ１Ｎｅｏを作製した。プラスミドｐＴＣＳＬＣｇ１Ｎｅｏの構築ＰＢＳＫＳ⁺に正確な配列を有するＩｇＧ１Ｃｇ１クローンを、制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩを使って切り出し、同じ酵素で消化したｐＴＣＳＮｅｏと結合した。結果として生じたプラスミドｐＴＣＳＬＣｇＩＮｅｏを、以降の修正用に使い、ｐＴＣＳＬＣｇＮｅｏＡｐａを得た。ｐＴＣＳＬＣκ１ＮｅｏＡｐａを作製するための、ｐＴＣＳＬＣκ１ＮｅｏにおけるＡｐａＩ認識部位の除去ｐＴＣＬＳＣξ１ＮｅｏＣＨＯ発現ベクターは、制限酵素ＡｐａＩによる認識部位を二つ含んでいる：１カ所はクローン化した断片の挿入に使われるポリリンカー領域であり、もう１カ所はｎｅｏ^r遺伝子の３’末端そのものに位置する。あとに続くクローニング段階を簡略化するため、ｎｅｏ^r付近のＡｐａＩ認識部位を除去した。ｐＴＣＳＬＣξ１ＮｅｏをＡｐａＩで部分的に消化した。少量をアガロースゲル上に流して直線分子（２カ所のＡｐａＩ認識部位のうち、１カ所のみを切断されたプラスミドを意味する）であることを確認した。消化された試料をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、二重鎖ＤＮＡを消化せずにＡｐａＩで放置された一本鎖伸展部を選択的に除去した。プラスミドを結合することによって再度環状化し、ＨＢ１０１の受容能のある大腸菌（E.coli）細胞内へトランスフォームした。トランスフォーム体が３０個拾われ、液体培地への注入に供した。各培養基に対してＤＮＡを調製し、ＡｐａＩで消化してアガロースゲルに流した。残念なことに、プラスミドはこの消化によって減成した。３０個のサンプルに対して２１回反復してＡｐａＩ消化を行った。２つの単離体（＃４と＃１２）がＡｐａＩによって直線状になっていたほかは、すべて２カ所で切断されていた。この候補クローン２つをＡｐａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＡｐａＩ認識部位の存在について検討した。この試験において、ｐＴＣＳＬＣξ１ＮｅｏＡｐａ単離体＃１２のｎｅｏ^rに対し３’方向のＡｐａＩ認識部位が希望どおり消化された。続いて制限酵素による消化を行い、この単離体の構造を確認した。ＰＣＲで単離したヒトκ鎖およびＨ鎖のＶ領域を、ＣＨＯベクターｐＴＣＳＬＣ κＤＨＦＲとｐＴＣＳＬＣｇ１ＮｅｏＡｐａへそれぞれクローニングするＴＭ２７Ｖκ断片のｐＴＣＳＬＣκＤＨＦＲのクローニングＴＭ２７のκ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡをゲル精製し、適正な制限酵素で消化した。少量のＤＮＡサンプルを１％アガロースゲル上で解析し、定量して品質を修正した。外部の（混入した）バンドが〜８００ｂｐの位置に認められ、濃度は１．２５ｎｇと推定された。制限酵素ＸｈｏＩとＰｖｕＩＩとで消化し、フォスファターゼ処理したｐＴＣＳＬＣκＤＨＦＲベクターに、Ｖ領域を結合した。結合用混合液を、受容能のある大腸菌（E.coli）ＤＨ５α細胞のトランスフォームに使用した。トランスフォーマントコロニーの収率はきわめて低かった。単一のコロニーを拾い上げ、液体培養基１２本への注入に使用した。各々からＤＮＡを調製し、ＸｈｏＩとＰｖｕＩＩとで消化して１％アガロースゲルで解析した。陽性サンプルは＃３と＃４の２つ認められた。陽性サンプル各々について配列決定した。ＴＭ２７Ｖ_II断片のｐＴＣＳＬＣκ１ＮｅｏＡｐａへのクローニングＴＭ２７のＶ_H領域相当のＰＣＲ産物をゲル精製し、適正な制限酵素（ＸｈｏＩとＡｐａＩ）で消化した。しかし、ＡｐａＩによる消化が不完全である可能性があると留意されていたため、この消化を反復した。少量をアガロースゲル上で解析して定量し、品質を修正した。ＶＨ領域に対応するバンドの濃度は０．４ｎｇ／ｍｌと算定された。外部バンドがＶκ断片の場合のように〜８００ｂｐに認められたため、この物質の精度は予想どおりにはなっていなかった。Ｖ_H領域を、制限酵素ＸｈｏＩとＡｐａＩで消化し、フォスファターゼ処理しておいたｐＴＣＳＬＣκ１ＮｅｏＡｐａベクターに結合した。結合用混合液を、受容能のある大腸菌（E.coli）ＤＨ５α細胞をトランスフォームするために使用した。トランスフォーム体はほとんど回収されなかった。コロニーを６個拾い、液体培地に注入した。ＭｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡを各々から調製し、ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩで消化して、アガロースゲル上で解析した。最初の結合から候補コロニーが１個：（ｐＴＣＳＬＨｕＶ_H４ＨＣκ１ＮｅｏＡｐａ（単離体＃６）が回収された。さらに候補クローンを回収するため、（続く試験で１個の単離体＃６に正しい配列が含まれていなかった場合に備えて）、１）低融点アガロースゲルにて再度精製して高分子のバンドを除去したＶ_HＰＣＲ産物と、２）ｃＤＮＡとプライマーを使って合成したＶ_HＰＣＲ産物とを使って、さらに結合するよう設定した。以上の結合反応から、８つのさらなるトランスフォーム体を得ることができ、５つの候補クローン＃９，１０，１１，１２，１４を得た。予想されたＤＮＡ配列であることを確認するための、両鎖についてＶ領域をクローニングした配列ｐＴＣＳＬＣκ１ＮｅｏＡｐａとｐＴＣＳＬＣκＤＨＦＲベクターに挿入したＶ領域に対するＤＮＡシーケンシングを向上させるよう設計したプライマーを、オペロンの研究所（Operon Research）から入手した。正方向プライマーは、ｐＴＣＳベクター配列中に位置し、ｐＴＣＳＬＣκ１ＮｅｏＡｐａとｐＴＣＳＬＣ κＤＨＦＲベクターの両方に挿入したＶ挿入部の配列決定に使用した。逆方向プライマーは、ＣκまたはＣξ１配列中にあり、それぞれＶκとＶ_H挿入部の配列決定に使用した。ヒトκ鎖のＶ領域における二重鎖の配列決定ＴＭ２３由来の２サンプル（＃３と＃４）を対象に、両鎖の配列決定を行った。プライマーＨＵＣＫ５ＰＲを使用し、制限酵素認識部位（３’−５’；ＰｖｕＩＩ−ＸｈｏＩ）を通じて逆方向の鎖を完全に配列決定した。正方向の配列は、二つの異なるプライマーｐＴＣＳＦＯＲとｐＴＣＳＦＷＤを使って決定した。制限酵素認識部位（５’−３’；ＸｈｏＩ−ＰｖｕＩＩ）を通じた全長の配列を、プライマーの各々から回収した配列を組み合わせて入手した。小さい面積の圧縮部分が、プライマーのいずれにも解像されていない正方向鎖に存在したか、またはこのような圧縮を緩和する配列決定法を使用した場合に存在した。しかし、逆向きの鎖によって、この領域に正しい配列のあることが証明された。＃３と＃４のサンプルには、ともに正しい配列が含まれていることが分かったため、＃４のサンプルを以後の哺乳動物細胞へのトランスフェクションに使用した。Ｔ２７γ鎖のＶ領域における二重鎖の配列決定ｐＴＣＳＬＨｕＶＨ４ＨＣκ１ＮｅｏＡｐａ（単離体＃６と＃９）のＶ_H断片について、両鎖を完全に配列決定した。単離体＃６のヒト化Ｖ_H断片は、コード領域を通して予想していた配列と一致していた。−２の位置（ＡＴＧの開始位置からみた相対的な位置）において、１個の塩基対が（ＣからＴ）へ置換していたが、これは発現に影響しないと予測された。単離体＃９のＶ_H断片では、コード領域において２つの置換が起こっていた。４つのさらなる候補クローンの配列決定については実施しなかった。ＴＭ２７と対照（CONTROL）プラスミドを使ったＣＯＳ細胞とＣＨＯ細胞のコトランスフェクションプラスミドの提供を受ける細胞は、ＣＨＯｄｈｆｒＤＵＸＢ１１とＣＯＳ−１であった。ＣＨＯＤＵＸＢ１１細胞は、ＢｉｏｇｅｎＩｎｃ．から入手した。ＣＨＯのトランスフェクトには、５μｇのＴＭ２７プラスミドｐＴＣＳＨｕＶκ４ＨＣκＤＨＦＲ（単離体＃４）とｐＴＣＳＬＨｕＶ_H４ＨＣξ１ＮｅｏＡｐａ（単離体＃６）、およびベクターｐＴＣＳＬＤＨＦＲＡｐａとｐＴＣＳＮｅｏＡｐａを、制限酵素ＡａｔＩＩで消化して直線化した。ＴＭ２７含有プラスミド（ＴＭ２７Ｌと標識）をエタノール中で沈殿させ、Ｈ₂Ｏ中で再度懸濁した。同様に、ベクタープラスミド（対照と標識）を共沈殿させ、Ｈ₂Ｏに再度懸濁した。共沈殿した各々のプラスミドを、ＢｉｏＲａｄＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒを２５０Ｖ，９６０ｍＦに設定しておき、エッレクトロポレーションによって１０⁷個のＣＨＯ細胞へトランスフェクトした。選択前の２日間にわたってトランスフェクトした細胞をα最小必須培地（αＭＥＭ）にチミジン、アデノシン、デオキシアデノシンを添加して（非選択培地で）生育させた。ＣＯＳのトランスフェクトには、５μｇの未切断ＴＭ２７Ｌプラスミドとベクタープラスミドをエタノール中で共沈殿させてＨ₂Ｏ中に再度懸濁した。プラスミドはエレクトロポレーションによって４．１×１０⁶個のＣＯＳ細胞へトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞をダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）で３日間培養し、上清をアッセイした。ヒトＩｇＧ１ＥＬＩＳＡによるＣＯＳトランスフェクト体上清の解析培養上清を対象として、ＣＯＳ細胞によるヒトＩｇＧ１の産生をＥＬＩＳＡで測定した。マイクロタイタープレートをＰＢＳ中に溶解したマウス抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体でコーティングし、反応停止用緩衝液（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）で反応を停止させた。サンプル１００μｌに上清を添加した。反応停止液中で適宜希釈し、分析した。捕獲されたＩｇＧを、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇκ抗体とＯＰＤ（Ｏ−フェニレンジアミン）とで検出した。ＴＭ２７Ｌで形質転換したＣＯＳ細胞の上清は、ヒトＩｇＧ９５ｎｇ／ｍｌの濃度を示した。対照でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞由来のヒトＩｇＧでは、検出不能であった。ＴＭ２７ＬでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞由来の上清をフローサイトメトリーで測定すると、〜６倍に濃縮されていた。平均蛍光チャンネル値で示されるように、ＨＰＢ細胞に対する染色強度は、精製ＴＭ２７Ｌ（ＮＳ０細胞から精製）が〜２．５ｍｇ／ｍｌであったのに比べ、約９倍低かった。Ｊｕｒｋａｔ細胞では染色の程度がバックグラウンドの水準であった。ＣＨＯトランスフェクト体の選択核酸添加物を含まないαＭＥＭ培地中で（ｐＴＣＳＬＨｕＶκ４ＨＣκＤＨＦＲに関するＤＨＦＲ^*を選択する目的で）、ゲネティシン（geneticin）（Ｇ４１８；ｐＴＣＳＬＨｕＶＨ４ＨＣξ１ＮｅｏＡｐａに関するｎｅｏ^rを選択する目的で）を含む培地にＣＨＯトランスフェクト体を播種した。細胞を２×１０⁵セル／ｍｌで２４穴プレートに播いた。ヒトＩｇＧ１ＥＬＩＳＡによるＣＨＯトランスフェクト体の上清解析選択培地中に１２日間おいた後、融合状態のウエルから上清を回収して、ヒトＩｇＧ１／κ ＥＬＩＳＡにて分析した。ＴＭ２７Ｌ上清の濃度は１８２−２３６ｎｇ／ｍｌとなった。ほとんどは＞２００ｎｇ／ｍｌであった。ヒトＩｇＧ１／κは、対照上清から検出不能であった。ＴＭ２７ウエル中、高生産性を呈した１２ウエルから回収した細胞を、Ｔ２５フラスコへ拡張した。バックアップ用培養物として、単バイアルを凍結し、液体窒素下で保存した。２つの対照ウエルから回収した細胞もＴ２５フラスコに拡張して凍結した。ＣＨＯトランスフェクタントの第１回限界希釈抗体産生能の高い４つのウエルを選択し、９６穴プレート上で限界希釈プレーティングした。ウエル＃１Ｂ１（２３２．６ｎｇ／ｍｌ），１Ｄ６（２３３．３ｎｇ／ｍｌ），２Ｂ２（２３５．５ｎｇ／ｍｌ），２Ｃ１（２３６．０ｎｇ／ｍｌ）であった。各ウエルに対して３つのプレートを選択培地として決定し、１つを１セル／ウェル、２つを０．５セル／ウェルとした。第１ラウンドのクローニングより得た上清を、ヒトＩｇＧ１／κ ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。抗体産生能の高い９０個のウエルを２４穴プレートへ拡張し、密集状態にまで生育させた。これら培養物のうち１２の上清をヒトＩｇＧ１／κ ＥＬＩＳＡとフローサイトメトリーにてアッセイした。ヒトＩｇＧ１／κ ＥＬＩＳＡの濃度範囲は、２１１−１０４８ｎｇ／ｍｌであった。全サンプルがＨＰＢ細胞を染色し（平均蛍光チャンネルは４６．５−１６９．６）、Ｊｕｒｋａｔ細胞を染色することはなかった。６つの抗体産生能の高いクローンを拡張して、液体窒素中で凍結した。これらのうち、抗体産生能の高いクローン２個（１Ｂ１−Ｃ７と２Ｂ２−Ｈ９）を選択して、続くクローニングラウンドに使用した。対照の構築体の初代培養物２つもまた、９８穴プレート中で１ラウンドの限界希釈プレーティングに供した。各々のうち１個のクローンを選択して拡張した。上清をヒトＩｇＧ１／κ ＥＬＩＳＡ（ページ６４０−８３）にかけたが、検出可能な信号は認められなかった。細胞を回収し、液体窒素下で保存した。非クローン培養物のローラーボトル規模の拡大（抗体産生を目的とする）２つの初代培養物（１Ｂ１と２Ｂ２）を、ＴＭ２７抗体産生の適正材料として産生するために拡張培養した。細胞を２Ｌのローラーボトルに拡張し、低血清濃度（Ｔ２５に１０％血清、→Ｔ７５に１０％血清→３× Ｔ７５に５％血清→３×２Ｌボトルに１％血清の順を介して）（ページ６４０− ２４）に適応させた。１日目に２Ｌボトルを確立し、（１／２容量を１％血清含有新鮮培地で）２日目、５日目、８日目に交換することによって経代培養した。１０日目に最初の回収を行い、１２日目に２回目、１５日目に３回目の回収を行った。回収上清を遠心分離し、精製まで−２０℃で保存した。プロテインＡカラム上での抗体精製２Ｂ２培養物の上清（総容量２．７Ｌ）を回収し、０．２２μのナイロン膜で濾過した。ヒトＩｇＧＥＬＩＳＡからは、精製開始時の試料総量は１０９０ｍｇとなった。Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ（プロテインＡ）カラム上で抗体を精製し、ｐＨ５．０、４．０および３．０で０．１Ｍクエン酸にて溶出した。溶出物をＰＢＳで透析した。溶出画分中の精製抗体を、ヒトＩｇＧＥＬＩＳＡによって測定した。ｐＨ３．０画分に精製抗体の大半が含まれたが、ｐＨ４．０の画分にも少量含まれていた。ヒトＩｇＧ１ＥＬＩＳＡを反復してより精度の高い濃度測定を行い、ＴＭ２７（ｐＨ３．０画分とｐＨ４．０の画分を足したもの）の総収量は９６０ｍｇであった。ＮＳ０トランスフェクト体培養上清由来の抗体のプロテインＡによる精製ＮＳ０トランスフェクタント培養上清由来の抗体を、実質上、前述のごとくプロテインカラムで精製した。ＮＳ０骨髄細胞株からのＴＭ２７抗体の定性プロテインＡカラムクロマトグラフィーを使ったＮＳ０トランスフェクト体培養上清由来の精製Ｔ２７ｍＡｂを使い、陰性対照としてＨＰＢ−ＡＬＬ細胞（Ｖ β５．２）とＪｕｒｋａｔ細胞（Ｖβ８．１）を用い染色して、マウスｍＡｂＴＭ２３とキメラＴＭ２７とを比較した。ＴＭ２７はＨＰＢ−ＡＬＬを陽性に染めたが、Ｊｕｒｋａｔ細胞を染色することはなかった。ＴＭ２７の特異性を検出するために、正常ＰＢＬＴ細胞をＴＭ２７で染色して、ＴＭ２３ｍＡｂと比較した。ＴＭ２７とＴＭ２３ｍＡｂはヒトＰＢＬＴ細胞全体の〜３％を染色した。ＦＩＴＣ標識ＴＭ２３ｍＡｂの濃度を固定し、さまざまな濃度の未標識４Ｈ１１またはＴＭ２７ｍＡｂを添加することによって、競合アッセイを行った。抗体混合液をＨＰＢ−ＡＬＬ細胞の染色に使用した。ＴＭ２７がＣＤ３抗原をコモジュレートできるか否かを測定するため、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞をさまざまな濃度のＴＭ２７またはＴＭ２３ｍＡｂと共に一晩培養し、抗ＣＤ３ｍＡｂで染色した。結果からは、ＴＭ２３同様、ＴＭ２７がＴＣＲ／ＣＤ３複合体のエンドサイトーシスを起こすことが示された。ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞におけるＴＭ２７の結合親和力を測定するため、スキャッチャード解析を実施した。スキャッチャード解析アッセイと（ＴＭ２３ｍＡｂとの）競合アッセイの両者において、結果からは、ＴＭ２７が４Ｈ１１ｍＡｂとほぼ同程度の親和力を保持し（Ｋｄ＝２．０×１０^-8Ｍ^-1）、充分に競合することが分かった。４Ｈ１１との競合アッセイにおいて、ＴＭ２７Ｌ／ＮＳ０とＴＭ２７Ｌ／ＣＨＯも比較した結果を図３に示す。結果についてのスキャッチャード解析を図４に示す。ＣＨＯトランスフェクト体の第２回限界希釈プレーティング前述のように、限界希釈プレーティングを実施した。ウエルをヒトＩｇＧ１ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。６個のコロニーからの各々（１Ｂ１− Ｃ７と２Ｂ２−Ｈ９）を２４穴プレートに拡張し、ヒトＩｇＧＥＬＩＳＡ上でスクリーニングした。各々から抗体産生能の高い２つのクローンを選択して拡張し、液体窒素中で凍結した。各々から抗体産生能の最高であったクローンを選択して、最終サブクローニングに供した。ＣＨＯトランスファクト体の第３回限界希釈プレーティング前述のように、限界希釈プレーティングを設定した。ヒトＩｇＧ１ＥＬＩＳＡにてウエルをスクリーニングした。各々から（１Ｂ１ −Ｃ７および２Ｂ２−Ｈ９）６個づつのウエルを対象として細胞を２４穴プレートに拡張し、ヒトＩｇＧ１ＥＬＩＳＡによってアッセイした。各々から抗体産生能が最高となった３つのクローンをＴ２５フラスコに拡張し、液体窒素中で凍結した。各々から１つのクローンを選んでＴ７５フラスコ１本に拡張した。この時、ゲネティシン（geneticin）を培地からおとし、ｎｅｏ^rに対する選択を除去した。ＤＨＦＲに対する選択は保持した。上清をヒトＩｇＧ１ＥＬＩＳＡによってアッセイした。１Ｂ１−Ｃ７クローンは、４．６９ｍｇ／１０⁶セル／日を産生した。２Ｂ２−Ｈ９クローンは２．６５ｍｇ／１０⁶ｃｅｌｌｓ／日を産生した。単離体Ｃ７は、最終クローンとして選択され、また、Ｈ９単離体を代用クローンとして選択した。凍結ストックの調製前述のごとく選択した最終クローンを５本のＴ２２５フラスコへ拡張し、凍結細胞ストックのバンクを確立した。これらフラスコから回収した細胞をプールした。プールされた懸濁液の９８．３％は生存細胞であった。総細胞数は、１．５８×１０⁸であり、希望する７２バイアルの２×１０⁶セル／ｍｌを調製するに適正であった。細胞を凍結し、「ＴＭ２７Ｌ−６６２−３５」とラベルした。さらに、代用Ｈ９クローンをＴ２２５フラスコ１本に拡張し、小さな凍結細胞バンクを確立した。フラスコから回収した細胞の９７．３％が生存していた。懸濁液は、２×１０⁶セル／バイアル（ページ６６２− ８９）の９．７バイアルを調製するに充分な量であった。細胞を液体窒素で凍結し、「ＴＭ２７Ｌ−６６２−８９」とラベルした。凍結貯蔵物から生還した細胞のテスト生存能力およびマイコプラズマ・テストバイアル１本の凍結細胞貯蔵物ＴＭ２７Ｌ−６６２−３５を解凍し、αＭＥＭ中で回復させた。トリパン・ブルー染色で細胞の生存能力は８８％と決定された。Ｂｉｏｎｉｑｕｅ試験検査室キット（Bionique Testing Laboratories Kit）を使用して、このバイアルから成長した密集培養のマイコプラズマ汚染を検査した。この検査で汚染は検出されなかった。加えて、バイアル１本の細胞貯蔵物ＴＭ２７Ｌ−６６２−８９を解凍した。トリパン・ブルー染色で細胞の生存能力は９３．８％と決定された。上記の通り、このバイアルから成長した密集培養のマイコプラズマ汚染を検査した。この検査で汚染は検出されなかった。両培養をＴ７５フラスコに拡大し、ヒトＩｇＧ１ＥＬＩＳＡで細胞培養上清を分析した。ＴＭ２７Ｌ−６６２−３５クローンは３．２４μｇ／１０⁶細胞／日を産生し、ＴＭ２７Ｌ−６６２−８９クローンは２．５２μｇ／１０⁶細胞／日を産生した。第２回分析で、ＴＭ２７Ｌ−６６２−３５は３．０３μｇ／１０⁶細胞／日を産生し、ＴＭ２７Ｌ−６６２−８９は２．７４μｇ／１０⁶細胞／日を産生した。抗体精製のためのローラービン・スケールへのＴＭ２７Ｌ−６６２−３５の拡大ＴＭ２７Ｌ抗体精製に十分な材料を産生するために、ＴＭ２７Ｌ−６６２−３５培養を拡大した。細胞を２Ｌのローラービンに拡大し、（１０％血清中Ｔ２５ −１０％血清中Ｔ７５−５％血清中３×Ｔ７５−１％血清中３×２Ｌビンを経て）低血清濃度に順応させた。第１日に２Ｌビンが確立され、第２日、第５日、第７日および第９日に（１／２量を、１％血清を含む新鮮な培地と交換することによって）フィーディングを行った。初回収集は第１２日で、第２回収集は第１４日、第３回収集は第１６日であった。収集した上清を回転させ、濾過し、精製まで−７０℃で保存した。プロテインＡカラムによる抗体の精製ＴＭ２７Ｌ−６６２−３５培養の上清をプールし、総量５．１Ｌとした。抗体をＰｒｏｓｅｐ−Ａ（プロテインＡ）カラムに結合させ、ｐＨ５．０およびｐＨ３．０で、０．１Ｍクエン酸塩で溶出させた。ｐＨ３．０の溶出物をＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中に透析した。精製された出発材料中および溶出分画中の抗体量を、ヒトＩｇＧ１／κ ＥＬＩＳＡで測定した。ｐＨ３．０分画は２５ｍｌ中に約３．９ｍｇの抗体を含んでいた。本材料をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０濃縮装置（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮し、ヒトＩｇＧ１／κＥＬＩＳＡを繰り返した。ＴＭ２７Ｌの総収量は１．６ｍｇ／ｍｌで〜３．２ｍｇであった。精製抗体の一次特性化ｐＨ３．０分画およびｐＨ４．０分画の各々からの材料〜２．５ｍｇ、ならびにＮＳＯ細胞から精製したＴＭ２７にフローサイトメトリーを実施した。平均チャネル蛍光で示されるＨＰＢ細胞の染色強度の測定値は次の通りであった。ｐＨ３．０分画、２８３．６；ｐＨ４．０分画、３２１．９８；ＮＳＯ由来のＴＭ２７、５０６．７９。Ｊｕｒｋａｔ細胞では、染色は全ての細胞でバックグラウンド・レベルであった。実施例２ヒト・フレームワーク・カセットと比較した、ＣＤＲグラフト化ＴＭ２７抗体の配列ＴＭ２７Ｖκ ＴＭ２７ＶＨＴＭ２７Ｌ重鎖の４８位にロイシンを含むＴＭ２７Ｉ重鎖の４８位にイソロイシンを含むＴＭ２７．１ＫＳからＶＦ（７８〜７９）への変化を含むＴＭ２７．２ＶＴＭＬ／ＴからＬＳＩＳ／Ｎ（６６−６９／７３）への変化を含むＴＭ２７．３ＶからＲ（９２）への変化を含む実施例３ＴＭ２３のスキャッチャード解析平均Ｋｄ＝２．５２（±０．６７）ｅ−８Ｍ受容体／細胞＝２．６４ｅ５ＴＭ２７のスキャッチャード解析平均Ｋｄ＝１．３１（±０．２４）ｅ−８Ｍ受容体／細胞＝２．８９ｅ４実施例４ＴＭ２７Ｉの研究の概要ＣＯＳ／ＣＨＯのＴＭ２７Ｉ（４８）＊ｃＤＮＡは、ＨＳＯ産生株のＣＤＲ−グラフト化Ｖ領域から調製し、ＰＣＲで増幅し、配列決定した。＊ＤＮＡ断片は、ｃＤＮＡ立体配置のｐＴＣＳＬＮｅＯでクローニングした。＊プラスミドは、ｐＴＣＳＬＤＨＲＴＭ２７κでＣＯＳおよびＣＨＯにコトランスフェクトした。＊ＣＯＳ細胞上清由来のヒトＩｇＧ１／κ発現のＥＬＩＳＡ陽性成績は、プラスミド構造物が良好であることを示した。＊ＣＨＯ細胞トランスフェクト体を選択し、拡張し、クローニングした。細胞は、１クローニング後、液体窒素中で凍結した。実施例５１６Ｇ８ｃＤＮＡ由来のアミノ酸配列データ重鎖軽鎖蛋白配列データ：Ｈ＝ＤＶＱＬＶＥ？ＧＧＧＬＶＱＰＧＬ＝ＥＮＶＬＴＱ実施例６ＴＭ２９の研究の概要＊実質的に実施例１の通りにハイブリドーマを調製し、ｃＤＮＡ（実施例５に示した）を分離した。＊（１６Ｇ８ハイブリドーマから）分離したｃＤＮＡ（Ｈおよびκ）をＭ１３ベクターでクローニングした。＊突然変異誘発によってヒト・フレームワーク（ＶＨ_KOL ／ＶＫ_REI）を導入した。＊ＣＤＲグラフト化Ｖ領域を骨髄腫発現ベクターでクローニングした。＊予備調査的評価のため、ＮＳＯトランスフェクト体からヒト化抗体（各〜１ｍｇ）を精製した。異なる４種類のＴＭ２９が調製された：ＴＭ２９ＴＭ２９．１ＳＳからＡＡ（２３〜２４）への変化を含むＴＭ２９．２ＳからＰ（７５）への変化を含むＴＭ２９．３ＧＶ／ＦからＡＭ／Ｙ（９２〜９３／９５）への変化を含む詳細な実験−ＴＭ２９ＰＣＲ法によるヒトκ鎖定常部の分離非消化プラスミドを使用する方法定常部を分離するために２種類のプライマー（１個は前方向、１個は逆方向）を用いてｐＳＶ１８４ＤＨ−Ｎｅｏ／ＤＮＳ−ＶκＣκ（ヒトκ鎖定常部を含むｐＳＶＨｕｋ）ＰＣＲを実施した。オリゴマー（プライマー）はＯｐｅｒｏｎから入手した。ＰＣＲ反応試薬はＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）を含むＧｅｎｅＡｍｐｄｅ増幅試薬キットに由来する。ＰＣＲ反応は３種類の異なるＭｇ²⁺濃度で行った。ＰＣＲ産物の一部を１％アガロースゲルで分析した。最初のＭｇ²⁺サンプル（濃度１．５ｍＭ）からのＰＣＲ産物を選択した。クローニングのため、Ｃ領域に隣接する、制限酵素部位を含むプライマーをデザインした。このように、増幅したＤＮＡを（３’末端で）ＥｃｏＲＩで消化した。５’末端の部位は消化されなかった。消化されたＤＮＡ断片を１％アガロースゲルにかけ、３００ｂｐのバンドを切り出した。ゲルからＤＮＡを抽出し、質の決定と量の推定のため、その少量を１％アガロースゲルで分析した。３００ｂｐのバンドは純粋と考えられ、ＤＮＡ総量は〜１４０ｎｇと推定された。ヒトκ鎖定常部をＰＢＳＫＳ⁺ベクターでクローニングし、配列を決定した。ＳｍａＩとＥｃｏＲＩで消化しておいた、ヒトκ鎖定常部のＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して、ベクターＰＢＳＫＳ⁺に挿入した。この連結混合物を使用して受容能のある大腸菌（E.coli）ＤＨ５α細胞をトランスフォームした。単一コロニーを採集し、これを２４の液体培地に接種した。各培地からＤＮＡを調製した。各ＤＮＡサンプルをＰｖｕＩＩ（Ｃκの５’ 末端）とＥｃｏＲＩ（Ｃκの３’末端）で消化し、２％アガロースゲルで分析した。低領域バンド（３００ｂｐ）の分離が困難なため、ＰｖｕＩＩのみでＤＮＡサンプルを消化した。２％アガロースゲルで分析後、２４サンプル中１９サンプルはＣκ挿入が正しいものであった。Ｔ７およびＴ３プライマー（挿入物に隣接するベクターの配列）を使用して、（適当なサンプル１９のうち）配列を決定するサンプル＃１〜５を選択した。その他の配列決定試薬はＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒｓｉｏｎ２．０キット（ＵＳＢ）からのものであった。サンプル＃５は、ヒトκ鎖定常部に正しい配列を有していた。ｐＴＣＳＬＣκＤＨＦＲ^*になるｐＴＣＳＬＤＨＦＲ^*哺乳動物発現ベクターにクローンニングされたヒトκ鎖定常部ＰｖｕＩＩと制限酵素を使用して、ｐＢＳＫＳ＋ベクター（サンプル＃５）からヒトκ鎖定常部を分離した。しかし、先のバンド分離の問題があるため、構築体ｐＢＳ／ヒトＣκで第２回消化を実施した。第２回消化ではＥｃｏＲＩとＸｂａＩ（５’からＰｖｕＩＩ部位に位置する）を使用し、断片〜３００ｂｐが得られた。次に、この断片をゲル精製し、ＰｖｕＩＩで消化して、Ｃκの５’末端における残りのベクターの小型断片を除去した。この最終的な断片をゲル精製し、１％アガロースゲルで質を分析し、量を推定した。Ｃκ ＤＮＡは〜２８０ｂｐで純粋なバンドと考えられ、その総量は〜１３５ｎｇと推定された。３個のＥｃｏＲＩ部位が発現ベタターに存在するため、ＰｖｕＩＩ部位にだけクローニングするのが最良であろうと決定された。Ｃκ ＤＮＡは調製されたＰｖｕＩＩであるため、（平滑末端を形成するために）クレノウ断片を使用してＥｃｏＲＩ末端を修復した。修復された、平滑末端を有するＣκ ＤＮＡを、予めＰｖｕＩＩで消化し、（仔ウシ腸管ホスファターゼを使用して）ホスファターゼ処理しておいたｐＴＣＳＬＤＨＦＲ^*ベクターに連結した。この連結混合物を使用して受容能のある大腸菌（E.col i）ＤＨ５α細胞をトランスフォームした。単一コロニーを採集し、これを２４の液体培地に接種した。各培地からＤＮＡを調製した。ＰｖｕＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１％アガロースゲルで分析した。２４サンプル中５サンプルが、正しい方向にＣκ挿入物を含んでいた。サンプル＃７を継続用に選択した。突然変異体ＤＨＦＲ^*遺伝子と野生型ＤＨＦＲ遺伝子との置換ベクターｐＴＣＳＬＣκＤＨＦＲ^*ベクターをＣＨＯ（ｄｈｆｒ）ＤＵＸＢ１１細胞に発現させるため、ＤＨＦＲ^*遺伝子をＤＨＦＲ遺伝子と置換した。ｐＴＣＳＬＣκＤＨＦＲ^*サンプル＃７由来のＤＮＡならびにｐＳＶ２−ＤＨＦＲ（スタンフォード大学医学部生化学部のＰａｕｌＢｅｒｇ博士から入手したプラスミド）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化して、それぞれの遺伝子断片を分離した。分析の際に、ｐＴＣＳＬＣκＤＨＦＲ^*ベクターの、それ以外のＢｇｌＩＩ部位は、ポリＡ部分も除去し、これはベクター機能を妨害することが決定された。したがって、ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩを使用して消化を繰り返した。ベクターの（ＤＨＦＲ^*）ｐＴＣＳＬＣκ部分をホスファターゼで処理した。分離された両断片（ｐＴＣＳＬＣκとＤＨＦＲ^*）をゲル精製し、１％アガロースゲルで質を分析し、量を決定した。両バンドとも純粋と考えられ、〜４０−５０ｎｇと、類似した濃度と推定された。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して、ＤＨＦＲ遺伝子をｐＴＣＳＬＣκベクターに連結した。連結混合物を使用して、受容能のある大腸菌（E.coli）ＤＨ５α細胞をトランスフォームした。単一コロニーを採集し、２４の液体培地に接種した。各々からＤＮＡを調製した。ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩを用いた制限酵素消化によってＤＮＡを分析した。２４の培養のうち、２３の培養が正しいバンドを有し、ＤＨＦＲ遺伝子がｐＴＣＳＬＣκベクターに挿入されたことを示した。更に使用するものとして、＃２２を選択した。分離されたヒトκ鎖Ｖ領域の、ＣＨＯベクターｐＴＣＳＬＣκＤＨＦＲでのクローニング１６Ｇ８のκ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡをゲル精製し、適当な制限酵素で消化しておいた。少量のＤＮＡサンプルを１％アガロースゲルで分析し、量を推定し、質を確認した。〜８００ｂｐに余分な（汚染）バンドが認められ、濃度は１．２５ｎｇ／ｍｌであると推定された。制限酵素ＸｈｏＩとＰｖｕＩＩで消化し、さらにホスファターゼ処理しておいたｐＴＣＳＬＣκＤＨＦＲベクターにＶ領域を連結した。連結混合物を使用して受容能のある大腸菌（E.coli）ＤＨ５α細胞をトランスフォームした。トランスフォーム体コロニーの収率は非常に低かった。単一コロニーを採集し、これを１２の液体培地に接種した。各培地からＤＮＡを調製し、ＸｈｏＩとＰｖｕＩＩで消化し、１％アガロースゲルで分析した。陽性サンプルは、＃１、＃４、＃７および＃１０の４個であった。陽性サンプルの各々の配列を決定した。ＰＣＲ分離したＴＭ２９γ鎖Ｖ領域をＣＨＯベクターｐＴＣＳＬＣｇ１ＮｅｏＡｐａでクローニングした。ヒトκ鎖Ｖ領域の２本鎖配列決定１６Ｇ８由来の４サンプル（＃１、＃４、＃７および＃１０）の両鎖の配列決定を行った。プライマーＨＵＣＫ５ＰＲを使用して、制限酵素部位（３‘−５’ ；ＰｖｕＩＩ−ＸｈｏＩ）の端から端まで、逆鎖が完全に配列決定された。サンプル＃１と＃４の両者は正しい配列を有すると考えられ、サンプル＃７は配列決定されず、サンプル＃１０は間違った配列を有していた。サンプル＃１と＃４の場合、ＰＴＣＳＦＯＲとＰＴＣＳＦＷＤという２種類の異なるプライマーを使用して前進鎖配列を決定した。各々のプライマーから得られた配列を組合せることによって、制限酵素部位（５’−３’；ＸｈｏＩ− ＰｖｕＩＩ）の端から端まで、全長配列が得られた。どちらのプライマーでも、圧縮を解消する配列決定法を使用しても分解されなかった少量域の圧縮が前進鎖に存在すると考えられた。しかし、逆鎖は、この領域に正しい配列を有していた。サンプル＃１と＃４の両者は正しい配列を有すると考えられ、哺乳動物細胞トランスフェクトに使用するのものに、サンプル＃４を選択した。ＴＭ２９軽鎖プラスミドと重鎖プラスミドの、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞へのコトランスフェクションＣＯＳ−１細胞とＣＨＯ（ｄｈｆｒ）ＤＵＸＢ１１細胞の両者を、ＴＭ２９軽鎖プラスミドと重鎖プラスミドのコトランスフェクションに使用した。ＣＨＯＤＵＸＢ１１細胞株はＢｉｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．から入手し、またＬａｗｒｅｎｃｅＣｈａｉｓｉｎ博士（コロンビア大学）が独創的に誘導した。ＣＯＳ−１細胞トランスフェクションの場合、５ｍｇの各非消化ＴＭ２９プラスミド（それぞれｐＴＣＳＬＨｕＶκ１６ＧＣκＤＨＦＲおよびｐＴＣＳＬＨｕＶ_HＩ６ＧＣξ１ＮｅｏＡｐａ；ＴＭ２９−４およびＴＭ２９−２６）をエタノール中で沈殿させ、１ｍｇ／ｍｌの濃度でＨ₂Ｏに再懸濁した。ＢｉｏＲａｄＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒを２５０Ｖ、９６０ｍＦＤで使用し、エレクトロポレーションによって、プラスミドを３．８×１０⁶細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をＤｕｌｂｅｃｏの改良Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）に再懸濁し、３日間、培養した。対照プラスミド（ｐＴＣＳＬＤＨＦＲＡｐａおよびｐＴＣＳＬＮｅｏＡｐａ）を調製し、ＴＭ２９プラスミドと同様にコトランスフェクトした。続いてトランスフェクトされた細胞を再懸濁し、ＴＭ２９トランスフェクトＣＯＳ細胞と同様に培養した。ＣＨＯＤＵＸＢ１１細胞トランスフェクションの場合、ＤＮＡの直線断片を得るため、５ｍｇの各ＴＭ２９プラスミド（上述の通り）を制限酵素ＡａｔＩＩで消化し、エタノール中で沈殿させ、１ｍｇ／ｍｌの濃度でＨ₂Ｏに再懸濁した。上述の通り、エレクトロポレーションによってプラスミドを５×１０⁶細胞にコトランスフェクトした。チミジン、アデノシンおよびデオキシアデノシンを補充したα最小必須培地（αMinimal Essential medium：αＭＥＭ）（非選択的培地）に、トランスフェクトされた細胞を再懸濁し、３日間、培養した。対照プラスミド（上述の通り）を調製し、ＴＭ２９プラスミドと同様にコトランスフェクトした。続いてトランスフェクトされた細胞を再懸濁し、ＴＭ２９トランスフェクトＣＨＯ細胞と同様に培養した。ヒトＩｇＧ₁κ ＥＬＩＳＡによるＴＭ２９トランスフェクトＣＯＳ細胞上清の分析培養３日後、ＴＭ２９トランスフェクトＣＯＳ細胞は密集していると考えられた。そこで、上清を収集し、細胞を捨てた。ヒトＩｇＧ₁ κ ＥＬＩＳＡを使用して、細胞によるヒトＩｇＧ産生を培養上清から決定した。９６ウェル・プレートをコーティングしておいたマウス抗ヒトエｇＧ₁ Ｆｃ抗体で上清ＩｇＧを捕捉し、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ヒトＩｇκ抗体およびＯ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を用いた発色によって検出した。光学密度測定値を、既知濃度の精製ヒトＩｇＧ₁κ抗体で作成した曲線と比較することによって、上清ＩｇＧ濃度を決定した。ＴＭ２９トランスフェクトＣＯＳ細胞上清のヒトＩｇＧ濃度は２０１．３ｎｇ／ｍｌであった。対照ＤＮＡトランスフェクトＣＯＳ細胞上清のヒトＩｇＧ濃度は０ｎｇ／ｍｌであった。ＴＭ２９トランスフェクトＣＨＯ細胞の選択培養の３日後、ＴＭ２９トランスフェクトＣＨＯ細胞は密集していると考えられた。そこで、細胞を０．２５％トリプシン（Ｈａｎｋの平衡塩溶液中）で処理し、培養フラスコから分離した。細胞を採集し、遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットをαＭＥＭ選択培地に２×１０⁵細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、２４ウェル・プレートに１ｍｌ／ウェルでプレーティングした。αＭＥＭ選択培地は二重の選択能力を有し、ヌクレオチド補充物が無く、ｐＴＣＳＬＨｕＶκ１６ＧＣκＤＨＦＲ上のＤＨＦＲ⁺に選択するためにＦＢＳを透析済のＦＢＳと置換し、ＰＴＣＳＬＨｕＶ_H１６ＧＣξ１ＮｅｏＡｐａ上のｎｅｏ^rを選択するためにゲネティシン（Geneticin）（Ｇ−４１８）を加えた。ヒトＩｇＧ₁κ ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによるＴＭ２９トランスフェクトＣＨＯ細胞上清の分析選択培地中で１４日後、ＴＭ２トランスフェクトＣＨＯ細胞上清を各ウェルから採集し、ヒトＩｇＧ₁κ ＥＬＩＳＡを使用して分析した。ＴＭ２９トランスフェクトＣＨＯ細胞上清中のヒトＩｇＧ濃度は１４４．６ｎｇ／ｍｌ〜２９１．９ｎｇ／ｍｌの範囲で、平均濃度は２４０．５ｎｇ／ｍｌであった。対照ＤＮＡトランスフェクトＣＨＯ細胞上清中のヒトＩｇＧ濃度は０ｎｇ／ｍｌであった。ＴＭ２９トランスフェクトＣＨＯ細胞の最高産生ウェル３個（２Ｃ３、２Ｃ４、２Ｂ６）と対照ＤＮＡトランスフェクトＣＨＯ細胞のウェル１個（３Ｄ４）を、フローサイトメトリーでも分析した。３個のＴＭ２９サンプル、２Ｃ３、２Ｃ４、２Ｂ６はＪｕｒｋａｔ細胞を陽性に染色し（平均チャネル蛍光は１８６．６１〜２９０．０１の範囲であった）、ＨＰＢ細胞を陽性に染色しなかった（平均チャネル蛍光は１１．７７〜１３．８２の範囲であった）。対照サンプル３Ｄ４はＪｕｒｋａｔ細胞を陽性に染色しなかった（平均チャネル蛍光は１１．９６であった）。限界希釈によるＴＭ２９トランスフェクトＣＨＯ細胞のクローニングＴＭ２９トランスフェクトＣＨＯ細胞の最高産生ウェル３個（２Ｃ３、２９１．９ｎｇ／ｍｌ；２Ｃ４、２８９．７ｎｇ／ｍｌ；２Ｂ６、２８９．５ｎｇ／ｍｌ）を制限希釈によるクローニング用に選択した。各々のウェルについて、細胞濃度をαＭＥＭ選択培地中で希釈し、２細胞／ウェル、１細胞／ウェル、および０．５細胞／ウェルで９６ウェル・プレートにプレーティングした。クローニングの１０日後、２Ｃ３、２Ｃ４、２Ｂ６の０．５細胞／ウェル・プレートの各々に関して、多数のウェルでコロニー成長が確認された。そこで、０．５細胞／ウェル・プレートの各々から、全てのウェルの上清を収集し、ヒトＩｇＧ₁κＥＬＩＳＡを使用して定量した。細胞増殖を示した全てのウェルがＥＬＩＳＡで陽性であった。２４ウェル・プレートへの拡大に、合計２４の最高産生ウェル（２Ｃ３から１０、２Ｂ６から１４）を選択し、密集まで成長させた。各ウェルから上清を収集し、ヒトＩｇＧ₁κ ＥＬＩＳＡを使用して定量した。ヒトＩｇＧ濃度は０．７〜４．８ｍｇ／ｍｌの範囲で、平均濃度は２．９ｍｇ／ｍｌであった。ＴＭ２９トランスフェクトＣＨＯクローンの最高産生ウェル６個（１Ｃ７、１Ｄ９、１Ｇ２、２Ｇ１、２Ｇ１０、２Ｈ２ａ）の上清をフローサイトメトリーで定量した。６個のサンプルは全て、Ｊｕｒｋａｔ細胞を陽性に染色し（平均チャネル蛍光は３１３．６８〜１３５６．８７の範囲であった）、ＨＰＢ細胞を陽性に染色しなかった（平均チャネル蛍光は７．５９〜８．１６の範囲であった）。６個のサンプル全てを２５ｃｍ²フラスコに拡大し、液体窒素条件下で凍結保存した。サブクローニング用に、最高産生ウェル３個（２Ｃ３−１Ｇ２、２Ｃ３−２Ｇ１０、２Ｃ３−２Ｈ２ａ）を選択した。ＴＭ２９ウェルと同様の制限希釈によって、対照ＤＮＡトランスフェクトＣＨＯ細胞のウェル１個（３Ｄ４）をクローニングした。希望する濃度の１０分の１以下に細胞濃度を希釈することによって、クローニング後１０日に、コロニー成長が認められなかった。そこで、凍結バイアル（３Ｄ４）から新鮮培養を開始した。新しい培養を使用して、制限希釈によるクローニングを繰り返した。クローニングの１６日後、０．５細胞／ウェル・プレートから最も密集したウェル６個（１Ｂ５、１Ｃ１１、１Ｄ６、２Ｅ７、２Ｆ３、２Ｆ９）を２４ウェル・プレートへの拡大用に選択した。続いて、各ウェルを２５ｃｍ²フラスコに拡大し、その後、７５ｃｍ²フラスコに拡大し、密集まで成長させた。各フラスコから上清を収集し、ヒトＩｇＧ₁κ ＥＬＩＳＡを使用して定量した。ヒトＩｇＧ濃度は０ｎｇ／ｍｌであった。各フラスコを液体窒素条件下で凍結保存した。非クローン化ＴＭ２９トランスフェクトＣＨＯ細胞培養のローラービンへの拡大ＴＭ２９トランスフェクトＣＨＯ細胞培養の最高産生ウェル３個（２Ｃ３、２９１．９ｎｇ／ｍｌ；２Ｃ４、２８９．７ｎｇ／ｍｌ；２Ｂ６、２８９．５ｎｇ／ｍｌ）も非クローン化培養として、２５ｃｍ²フラスコへの拡大用に選択した。このとき、各ＴＭ２９のバイアル１本（ならびに対照ＤＮＡトランスフェクトＣＨＯ細胞培養のバイアル１本）を液体窒素条件下で凍結保存した。各非クローン化培養を７５ｃｍ²フラスコに拡大した。７５ｃｍ²フラスコ１個から、各々の培養を３７５ｃｍ²のフラスコに拡大したが、αＭＥＭ培地中の血清濃度は１０〜５０％低下した。２Ｃ３と２Ｂ６の両者について、各７５ｃｍ²フラスコを２Ｌローラービンに拡大した。２Ｃ４の３７５ｃｍ²フラスコ全てを液体窒素条件下で凍結保存した。培養をローラービンに入れるとすぐに、α培地中の血清濃度が５％から１％に再び低下した。培養９日後、２Ｂ６ビンは密集しているようであったが、２Ｃ３ビンは〜２５％密集のようであった。第９日、第１４日および第１６日に全ての２Ｂ６ビンおよび２Ｃ３ビンから上清を収集し、その後、細胞を捨てた。収集した上清を遠心分離し、−２０℃で保存した。２Ｃ３と２Ｂ６の両者について、収集した上清の各々の一部を、ヒトＩｇＧ₁κ ＥＬＩＳＡを使用して定量した。２Ｂ６のヒトＩｇＧ総量は８２０ｍｇであり、２Ｃ３は１９２３ｍｇであると決定された。ＴＭ２９トランスフェクトＣＨＯ細胞クローンの制限希釈によるサブクローニングＴＭ２９トランスフェクトＣＨＯ細胞クローンの最高産生ウェル３個（２Ｃ３ −１Ｇ２、４．８ｍｇ／ｍｌ；２Ｃ３−２Ｈ２ａ、４．１ｍｇ／ｍｌ；２Ｃ３− ２Ｇ１０、４．０ｍｇ／ｍｌ）を、制限希釈によるサブクローニング用に選択した。サブクローニングの１４日後、１Ｇ２、２Ｇ１０および２Ｈ２ａの０．５細胞／ウェル・プレートの各々に関して、多数のウェルでコロニー成長が確認された。そこで、これらのコロニー成長が認められたウェルから上清を収集し、ヒトＩｇＧ₁κ ＥＬＩＳＡを使用して定量した。細胞増殖を示した全てのウェルがＥＬＩＳＡで陽性であり、クローニング効率は１００％であった。合計２４の最高算出ウェル（２Ｈ２ａから２、２Ｇ１０から５、１Ｇ２から１７）を２４ウェル・プレートへの拡大用に選択し、密集まで成長させた。各ウエルから上清を収集し、ヒトＩｇＧ₁κ ＥＬＩＳＡを使用して定量した。ヒトＩｇＧ濃度は１．２〜９．２ｍｇ／ｍｌの範囲で、平均濃度は４．２ｍｇ／ｍｌであった。ＴＭ２９トランスフェクトＣＨＯサブクローンの最高算出ウェル４個（２Ｇ５、２Ｈ１２、１Ｈ６、２Ｅ９）の上清は、フローサイトメトリーでも定量した。４サンプルは全て、Ｊｕｒｋａｔ細胞を陽性に染色し（平均チャネル蛍光は２１１．５１〜２９２．４５の範囲であった）、ＨＰＢ細胞を陽性に染色しなかった（平均チャネル蛍光は８．３６〜８．８０の範囲であった）。４サンプルの各々のを２５ｃｍ²フラスコに拡大した。ＴＭ２９トランスフェクトＣＨＯ細胞クローンの制限希釈による第２回サブクローニングＥＬＩＳＡとフロサイトメトリーの複合成績に基づいて、最も優れたＴＭ２９トランスフェクトＣＨＯ細胞クローン２個（２Ｃ３−１Ｇ２−２Ｇ５と２Ｃ３− １Ｇ２−１Ｈ６）を制限希釈による第２回サブクローニング用に選択した。このとき、各クローンのバイアル１本（ならびに２Ｃ３−１Ｇ２−２Ｈ１２と２Ｃ３ −１Ｇ２−２Ｅ９のバイアル各１本ずつ）を液体窒素条件下で凍結保存した。サブクローニングの１２日後、２Ｇ５および１Ｈ６の０．５細胞／ウェル・プレートの各々に関して、多数のウェルでコロニー成長が確認された。そこで、これらのコロニー成長が認められたウェルから上清を収集し、ヒトＩｇＧ₁κＥＬＩＳＡを使用して定量した。細胞増殖を示した全てのウェルがＥＬＩＳＡで陽性であり、クローニング効率は１００％であった。合計２４の最高算出ウェル（２Ｇ５から２０、１Ｈ６から４）を２４ウェル・プレートへの拡大用に選択し（＃６４６−１０１）、密集まで成長させた。各ウエルから上清を収集し、ヒトＩｇＧ₁ κＥＬＩＳＡを使用して定量した。定量に使用されるヒトＩｇＧ₁κ標準の活性が失われたため、未知のサンプルの濃度を決定することができなかった。そこで、光学密度によって最高産生ウェルを決定した。最高産生ウェル６個（２Ｇ５から６個、１Ｈ６から１個）を、２５ｃｍ²フラスコへの拡大用に、続いて７５ｃｍ²フラスコへの拡大用に選択し、密集まで成長させた。フラスコから上清を収集し、ヒトＩｇＧ₁κＥＬＩＳＡを使用して定量した。ヒトＩｇＧ濃度は１４．６〜２１．２ｍｇ／ｍｌの範囲で、平均濃度は１８．６ｍｇ／ｍｌであった。ＴＭ２９トランスフェクトＣＨＯサブクローンのフラスコ６個（１Ｂ５、１Ｄ１、１Ｆ１１、２Ｂ１０、２Ｆ５、２Ｆ９）の上清をフローサイトメトリーで定量した（＃６４６−１２２）。６サンプルは全て、Ｊｕｒｋａｔ細胞を陽性に染色し（平均チャネル蛍光は３０４．５１〜３８３．００の範囲であった）、ＨＰＢ細胞を陽性に染色しなかった（平均チャネル蛍光は８．６７〜１０．２５の範囲であった）。ＴＭ２９トランスフェクトＣＨＯ細胞クローンの凍結細胞貯蔵物の調製凍結細胞貯蔵物を調製するために選択されたＴＭ２９トランスフェクトＣＨＯ細胞クローンは２Ｃ３−１Ｇ２−１Ｈ６−２Ｆ５であった。調査研究目的の凍結細胞バンクを確立するのに十分な数の細胞を提供するため、このクローンを７５ｃｍ²フラスコ１個から２２５ｃｍ²フラスコ５個に拡大した。凍結細胞バンクは、ＳＯＰＴＭＢ１−００１．００に従って調製した。細胞をトリプシンで処理し、各フラスコから収集し、プールした。プールした細胞懸濁液は３．２×１０⁸細胞を含んでいた。各々、容量１ｍｌ中に２×１０⁶細胞を含む、７２バイアルを調製した。本クローンのバイアル全てに、ＴＭ２９−６４６−１３２のラベルが貼付されている。実施例７他のフレームワーク領域と比較した、ＣＤＲグラフトＴＭ２９抗体の配列ＴＭ２９Ｖκ ＴＭ２９ＶＨＴＭ２９第１バージョンの配列を含むＴＭ２９．１ＳＳからＡＡ（２３〜２４）への変化を含むＴＭ２９．２ＳからＰ（７５）への変化を含むＴＭ２９．３ＧＶ／ＦからＡＭ／Ｙ（９２〜９３／９５）への変化を含む実施例８ＴＭ２９ｍＡｂのスキャッチャード解析独立した３つの実験で、ＴＭ２９抗体および１６Ｇ８抗体のスキャッチャード解析を実施した。下記の表は各実験で決定されたＫｄを示す。実施例９キメラＴＭ２９の研究の概要ＣＯＳおよびＣＨＯにおけるキメラ＊Ｖ（Ｄ）Ｊ領域ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ立体配置のＣＨＯ細胞発現ベクター、ｐＴＣＳＬＭＮｅｏ（Ｈ）およびｐＴＣＳＬＤＨＦＲ（κ）にクローニングした。＊発現プラスミドを、ＣＯＳおよびＣＨＯにコトランスフェクトした。＊ＣＯＳ細胞の上清のＡｂ濃度は〜３５ｎｇ／ｍｌであった。＊ＣＨＯ細胞トランスフェクタントを（ＦＡＣＳおよびＥＬＩＳＡで）分析し、一度クローニングし、ＭＴＸ（２０ｎＭ、１００ｎＭ、および５００ｎＭ）で増幅した。＊非増幅ＣＨＯ細胞クローンの抗体濃度は〜３ｎｇ／ｍｌであり、Ｊｕｒｋａｔ細胞を陽性に染色した。非増幅クローンを液体窒素中で凍結した。実施例１０ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞１６Ｇ８キメラにおけるキメラ１６Ｇ８の発現軽鎖構造物および重鎖構造物は、ＣＤＲグラフト構造物：ｐＴＣＳＤＨＦＲ連結ｐＴＣＳＮｅｏ連結に使用された同一発現ベクター中に、ヒト定常部を含む完全マウスＶ領域含んでおり、本構造物は二重の選択能力を有していた。ＣＯＳ細胞トランスフェクタント−〜３５ｎｇ／ｍｌＣＨＯ細胞トランスフェクタント−１６陽性ウェル／５４ウェル実施例１１ＴＭ２９の研究の概要ＴＭ２９ＣＯＳ／ＣＨＯ中のＴＭ２９＊ｃＤＮＡは、ＮＳＯ産生株のＣＤＲグラフト化Ｖ領域から調製し、ＰＲＣＲで増幅し、配列決定した。＊ＤＮＡ断片は、ｃＤＮＡ立体配置のｐＴＣＳＬＮｅｏ（Ｈ）およびｐＴＣＳＬＤＨＦＲ（κ）にクローニングした。＊プラスミドは、ＣＯＳおよびＣＨＯにコトランスフェクトした。＊ＣＯＳ細胞の上清は、〜２μｇ／ｍｌＡｂを含んでいた。＊ＣＨＯトランスフェクトは、クローニングおよび増幅の前に〜３μｇ／ｍｌＡｂを分泌し、上清はＪｕｒｋａｔ細胞を陽性に染色した。最も優れた非増幅Ａｂ産生細胞由来の細胞バンクは、３回のクローニング後に調製した。＊種々のＭＴＸ濃度下で、ＣＨＯ細胞株を増幅した。実施例１２４Ｈ１１−ＦＩＴＣ競合定量におけるＴＭ２７Ｌ、ＴＭ２７ＩおよびＴＭ２３の比較実験１：勾配ＴＭ２３／勾配ＴＭ２７Ｌ＝１．５６勾配ＴＭ２３／勾配ＴＭ２７Ｉ＝２．０４実験例２：勾配ＴＭ２３／勾配ＴＭ２７Ｌ＝１．８２勾配ＴＭ２３／勾配ＴＭ２７Ｉ＝２．４４ＴＭ２３と比較すると、ＴＭ２７Ｌの値もＴＭ２７Ｉの値も、全て３倍未満である。実施例１３ＴＭ２７メトトレキセート増幅再現性（μｇ／１０⁶細胞／日）メトトレキセート濃度（ｎＭ）アッセイ内相対値状態キーｆｍ＝凍結１チューブ混合培養ｓ＝１制限希釈による継代培養ｓ＊＝第１回制限希釈進行中ｆ＃＝＃ウェルを各１バイアルずつ凍結する

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｔ細胞の選択サブ集団に対する特異性を有するモノクローナル抗体から実質的に誘導されるＣＤＲの全てもしくは一部を、該モノクローナル抗体から同様に誘導される選択可変フレームワーク残基と共に含むアミノ酸配列を有するヒト化抗体又はそれらの結合タンパク質であって、該ヒト化抗体又はそれらの結合タンパク質が、少なくとも該モノクローナル抗体によって示される結合親和性に匹敵する結合親和性をもって、Ｔ細胞の該選択サブ集団と結合することが可能であるヒト化抗体又はそれらの結合タンパク質。２．下記アミノ酸配列の全てもしくは一部を含む請求項１記載のヒト化抗体又はそれらの結合タンパク質。ＴＭ２７Ｖｋ３．下記配列の全てもしくは一部をさらに含む請求項２記載のヒト化抗体又はそれらの結合タンパク質。ＴＭ２７ＶＨ４．下記配列の全てもしくは一部を含む請求項１記載のヒト化抗体又はそれらの結合タンパク質。ＴＭ２９Ｖｋ５．下記配列の全てもしくは一部をさらに含む請求項４記載のヒト化抗体又はそれらの結合タンパク質。ＴＭ２９ＶＨ６．完全なＩｇである請求項１ないし請求項５のいずれか１項に記載のヒト化抗体。７．イソタイプＩｇＧ２ａのものである請求項６記載のヒト化抗体。８．Ｉｇの定常ドメインにおける１以上の残基が、該定常ドメインのエフェクター機能を変えるために変更されている請求項６又は請求項７に記載のヒト化抗体。９．組換えＤＮＡ技術によって製造される請求項１ないし請求項８のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はそれらの結合タンパク質。１０．請求項１ないし請求項９のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はそれらの結合タンパク質の製造方法であって、ａ）Ｔ細胞の選択サブ集団に対する特異性を有するネズミ・モノクローナル抗体から実質的に誘導される少なくとも１つのＣＤＲをコードする第１のＤＮＡ配列を単離し、ｂ）該第１のＤＮＡ配列を適切なベクターにクローニングし、ｃ）変異誘発によって選択ヒトのフレームワーク・アミノ酸を導入し、それによりＣＤＲグラフト化構築体を形成し、ｄ）工程ｃ）の該構築体で宿主細胞をトランスフォームし、かつｅ）トランスフォームされた宿主細胞を培養して、該ヒト化抗体またはそれらの結合タンパク質を製造する、ことを包含する方法。１１．宿主細胞がＣＨＯ細胞である請求項１０記載の方法。１２．治療に用いられる請求項１ないし請求項９のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はそれらの結合タンパク質。１３．請求項１ないし請求項９に記載のヒト化抗体又はそれらの結合タンパク質を薬学的に許容し得る賦形剤と共に含有する医薬組成物。１４．クローン病を治療する方法であって、該治療を必要とする患者に、請求項４ないし請求項７のいずれか１項に記載のヒト化抗体又は結合タンパク質の有効量を投与することを包含する方法。１５．ＭＳを治療する方法であって、該治療を必要とする患者に、請求項２、請求項３、請求項６又は請求項７項のいずれか１項に記載のヒト化抗体又は結合タンパク質の有効量を投与することを包含する方法。