CZ287298B6 - Humanizovaná protilátka, způsob její výroby, její použití a farmaceutické prostředky na její bázi - Google Patents

Abstract

Humanizovaná protilátka nebo její vazebný protein mající aminokyselinovou sekvenci, která zahrnuje všechny oblasti CDR nebo část oblastí CDR v podstatě odvozených z monoklonální protilátky, vykazující specificitu vůči vybrané subpopulaci T-buněk exprimujících variabilní oblast .beta. řetězce receptoru antigenu T-buňky V.beta.8.1, ve spojení s vybranými zbytky variabilní základní struktury rovněž odvozenými z této monoklonální protilátky, přičemž tato humanizovaná protilátka nebo její vazebný protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci TM29 Vk 1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVNYTYWYQQTPGKAPLLIYYT 50 51 SNLAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQG 100 101 TKLQIT 106, a dále obsahuje aminokyselinovou sekvenci zvolenou ze souboru zahrnujícího aminokyselinovou sekvenci TM29 VH 1 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY 50 51 ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG 100 101 EGAMDYWGQGTPVTVSS 117, sekvenci TM29 VH, kde aminokyselinové zbytky 23ŕ

Description

Humanizovaná protilátka, způsob její výroby, její použití a farmaceutické prostředky na její bázi

Oblast techniky

Vynález se týká humanizovaných protilátek a jejich vazebných proteinů, které jsou schopny se navázat na T-buňky vykazující specifické variabilní β-řetězce, zejména subpopulací exprimujících humánní Vp8.1. Vynález se také týká způsobu výroby těchto protilátek, farmaceutických prostředků, které je obsahují a terapeutických aplikací těchto protilátek, zejména při autoimunitních chorobách.

Dosavadní stav techniky

T-buňky mají klíčovou úlohu při diferenciaci a regulaci efektorových mechanismů v imunitním systému (Paul et al., (1987) Science, 195: 1293 až 1300). Korekognice antigenu a hlavní molekuly pro histokompatibilitu musí být u T-buňky specificky a přesně regulovány, poněvadž nesprávná imunitní regulace vyvolává autoimunitu. Několik laboratoří studovalo choroby, při nichž se zdá být imunitní regulace nesprávná, jako je tomu v případě autoimunity, a také některé formy imunodeficience, a došlo k závěru, že na patogenezi těchto chorob se podílejí T-buňky.

Existuje několik situací, při nichž bylo oznámeno, že dochází ke klonování nebo oligoklonální expanzi konkrétního složení receptorů T-buněk. Jako nejzřejmější příklady je možno uvést maligní stavy vyvolávající leukémii nebo lymfomy, na nichž se podílejí T-buňky. Při Tbuněčných leukémiích nebo lymfomech receptor T-buněk funguje jako jedinečný nádorový markér, poněvadž je stabilně přesmyknut a je přítomen na povrchu této buňky. Z jiných situací, při nichž je implikováno složení receptorů T-buňky je možno uvést situaci příjemce tranplantovaného orgánu, jehož T-lymfocyty obsahují T-buněčné receptory, které je činí agresivními proti MHC molekulám donomího subjektu, jako je tomu například v případě dárce kostní dřeně.

Důležitější je. mnohé skupiny oznámily využití selektivního genu s oblastí V pro receptor antigenu T-buňky při určitých autoimunitních situacích. Tak například Grunwald et al. pozorovali přednostní expresi Va 2.3 genového produktu v CD4+ T-buňkách v broncheoalveolámím výplachu ve srovnání s lymfocyty periferní krve pacientů se sarcoidosis (Grunwald et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22: 129). U Kawasakiho choroby byla na počátku pozorována přednostní expanze νβ 2 a νβ 8 T-buněk (Abe et al. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4066).

V této souvislosti byla také široce studována rheumatoidní artritis. Několik vědců si všimlo přednostní expanze podsouborů T-buněk, jako například: DerSimonian et al. (1993). J. Exp. Med. 177: 1623 (přednostní expanze T-buněk nesoucích Va 12.1 v CD8+ T-lymfocytech periferní krve); Stamenkovic et al. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 1179 (T-buňky infiltrující do synoviální membrány pěstované v IL-2 jsou podle analýzy Southem-blot oligoklonální); Paliard et al. (1991) Science 235: 34 (autoři uvádějí hypotézu, že Superantigen aktivuje v β 14+ T-buňky, včetně autoreaktivních T-buněk, které expandují klonálně a migrují do synoviální tekutiny pacientů postižených rheumatoidní artritis; Howell et al. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 88: 10921 (autoři si zejména povšimli využití genu s V oblastí νβ 3, 14 a 17 Tbuňky v IL-2R+ buňkách ze synoviální tekutiny pacientů postižených rheumatoidní artritis); Uematsu et al. Proč. Nati. Acd. Sci. USA 88: 8534 (autoři poukázali na využití genu s V oblastí oligoklonální T-buňky v T-buňkách v synoviální tekutině jednoho pacienta postiženého rheumatoidní artritis; mezinárodní patentová přihláška PCT W090/06758 (v této publikaci je implikován νβ 3, 9 a 10 při rheumatoidní artritis.

-1 CZ 287298 B6

Také byla rozsáhle studována inflamatomí choroba střev. Několik skupin vědců si povšimlo expandovaných populací T-buněk nebo přednostního využití genu s V oblastí receptorů Tbuňky, a to v těchto případech: Posnett et al., (1990) J. clin. Invest. 85:1770; Spencer et al., (1991) J. Clin. Pathol. 44:915; Trejjdosiewicz et al., (1991) Clin. Exp. Immunol. 84:440 a Van 5 Kerckhove et al., (1992) J. Exp. Med. 175:57. Ještě další vědci oznámili přednostní využití

V genu T-buňky v Mycobacterium leprae (van Shooten et al. (1992) Proč. Nat. Acad. Sci. USA 89:11244; Want et al., (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:188).

U člověka byla expanze νβ8.1 T-buněk v inflamatomí tkáni nalezena ve spojení s různými 10 antoimunitními chorobami, jako je Crohnova chroba (Posnett et al. (1990) J. Clin. Invest.,

85:1770 až 1776), Kawasakiho choroba (Abe et al. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 4066 až 4070 a Abe et al. (1993) J. Exp. Med. 177: 791 až 796) a rheumatoidní artritis (Brennan et al. (1988) Clin. Exp. Immunol. 73: 1417 až 1423).

Další autoimunitní chorobou, která byla rozsáhle studována je roztroušená skleróza. Roztroušená skleróza je choroba zprostředkovaná imunitou, která je charakterizovaná infiltrací a demyelinací jednojademých buněk centrálního nervového systému. Přestože je patogeneze roztroušené sklerózy neznámá, jsou při tomto chorobném procesu implikovány jak genetické faktory, tak faktory prostředí. Hlavní prvky genetické predispozice zahrnují asociaci této choroby s určitou 20 třídou II haplotypů hlavního histokompatibilitního komplexu (MHC) a zejména HLA-DR21 a DQwl (Terasaid et al. (1976) Science 1933: 1245 až 1247; Ho et al. (1982) Immonogenetics 15: 509 až 517; Spielman et al. (1982) Epidemiol Rev. 4: 45 až 65; Francis et al. (1986) Lancet 1: 211; Elien et al. (1987) Disease Markers 5: 89 až 99; Urban et al. (1988) Cell 54: 577 až 592; Vandenbarket al. (1989) Nátuře, 341: 541 až 544; Howell et al. (1989) Science 246: 668 až 670).

Bylo ukázáno, že T-buňky izolované z cererospinální tekutiny pacientů postižených roztroušenou sklerózou utilizují omezený souboru genů s V oblastí. Okolnost, že byly u pacientů s roztroušenou sklerózou zjištěny in vivo aktivované myelinový protein specifické T-buňky naznačuje podíl MBP reaktivních T-buněk při patogenezi této choroby (Wucherpfennig et al. 30 (1992) Science 248: 1016 až 1019). Když se TCB νβ využití MBP reaktivních T-buněčných linií stanovuje prostřednictvím aplifikace cDNA s T-buněčnými receptorovými νβ primery řetězovou reakcí s polymerasou (PCR), je pozorováno přednostní využití omezeného počtu νβ genů (Wucherpfennig et al., výše uvedená citace z roku 1990) - νβ 17 a v menším rozsahu νβ 12 se často používá při rozpoznávání imunodominantní oblasti humánního antigenového MBP); 35 Oksenberg et al. (1993) Nátuře 362: 68. Výsledky některých studií také ukazují, že v mozkových lezích pacientů s roztroušenou sklerózou dochází k omezené expresi receptorového Va genu Tbuňky (Oksenberg et al. (1990) Nátuře 345: 344 až 346). Analýza repertoáru T-buněk za použití kvantitativní PCR a barvení monoklonální protilátky (mAb) ukázaly, že MBT (protein na bázi myelinu) specifické T-buňky izolované od pacientů s roztroušenou sklerózou utilizují převážně 40 νβ 5.2 a/nebo 5.3 ve srovnání s kontrolou (Oksenberg et al. (1993), výše uvedená citace) (přesmyknutý gen νβ 5.2 byl detegován v mozku pacientů s určitým HLA fenotypem) a Kotzin et al. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 9196 (sklon k využití β řetězec variabilní oblasti 5.2 a v menším rozsahu νβ 6.1 byl pozorován mezi MBP specifickými klony od pacientů s roztroušenou sklerózou.

V současné době neexistuje žádné účinné léčení roztroušené sklerózy (Harrison's Principles of Intemal Mecicine, 12. vydání, ed. Wilson et al., McGraw Hill lne. 1991). Terapeutické úsilí je zaměřeno na zlepšení akutní epizody, prevenci remisí nebo progrese choroby a úlevu od symptomů.

Bylo však zjištěno, že exprese myší β řetězce variabilní oblasti genu νβ 8.2 koreluje s experimentální alergickou encephalomyelitis (EAE), což je myší model humánní roztroušené sklerózy. Bylo ukázáno, že léčení myší νβ 8.2 specifickým mAb může této chorobě jak předejít, tak snížit její rozsah (Acha-Orbea et al. (1988) Cell 54: 263 a Urban et al. (1988) Cell. 54: 577).

-2CZ 287298 B6

Existuje tedy velká potřeba vyvinout protilátku nebo molekulu „podobající se protilátce“, která by byla vhodná pro léčení této choroby.

Protilátky obvykle obsahují dva těžké řetězce, které jsou spolu spojeny disulfidovými vazbami a lehký řetězec připojený k N-konci každého z těžkých řetězců. Každý těžký řetězec obsahuje u svého N-konce variabilní doménu, po níž následuje konstantní doména u jeho druhého konce. Každý lehký řetězec také obsahuje u N-konce variabilní doménu, po níž následuje konstantní doména. Variabilní doména každé dvojice lehkého a těžkého řetězce vytvářejí vazebné místo proti antigen. Variabilní domény v lehkém a těžkém řetězci mají stejnou obecnou strukturu a každá doména zahrnuje základní strukturu skládající se ze čtyř oblastí, jejíž sekvence jsou relativně konzervované, které jsou spojeny třemi oblastmi určujícími komplementaritu (CDR). Rámec čtyř oblastí poněkud nabývá konformace β-listu a CDR vytvářejí smyčky spojující konstrukci β-listu. CDR jsou udržovány v těsné blízkosti oblastí základní struktury a přispívají k vytvoření vazebného místo pro antigen. Jednotlivé oblasti CDR a základní struktury protilátek je možno stanovit za použití Kabatova počítacího systému (Kabat et a. (1987) „Sequences of Proteins of Immunological Interest“, US Dept. of Health and Human Services, US Govemment Printing Office) ve spojení s rentgenovou krystalografií popsanou v WO 91/09967.

Pro produkci protilátky, která může být zaměřena na specifický antigen, se obvykle používá postupu popsaného Kohlerem a Milsteinem (Kohler et al., (1976) Nátuře 256: 495 až 497). Tento postup obecně zahrnuje imunizaci myši antigenem, fúzi slezinných buněk imunizované myši s buňkami myšího myelomu a selekci takto vzniklých hybridomů, při níž se hledá jeden nebo více hydridomů vylučujících monoklonální protilátku specifickou na cílový antigen.

Bylo by žádoucí využívat takových monoklonálních protilátek (mAb) při léčení. Takové mAb jsou však v podstatě myšího původu a jsou proto samy o sobě v člověku antigenní. Pokud se takové mAb opakovaně podávají člověku, imunitní systém člověka vytvoří na myší mAb odpověď, která ji desaktivuje.

Proto bylo navrženo (původně Winterem a jeho spolupracovníky) (viz Například Reichmann et al. (1988), Nátuře, 332: 323 až 327 a Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534 až 1536), že oblasti CDR myší mAb by měly být naroubovány na humánní základní strukturu za účelem získání CDR-roubované protilátky vykazující vazebné vlastnosti donomí myší mAb a humánní kompatibilitu akceptoru humánní základní struktury.

Funkce molekuly protilátky je však závislá na její trojrozměrné struktuře, a tato struktura je závislá na její primární aminokyselinové sekvenci. Změny aminokyselinové sekvence protilátky mohou nepříznivě ovlivnit její aktivitu. Podobně, fragmenty protilátky si nemusí zachovat vhodnou trojrozměrnou strukturu, která je zapotřebí proti stimulaci vazebné aktivity. Kromě toho, změna sekvence DNA kódující protilátku může ovlivnit schopnost buňky obsahující tuto sekvenci DNA exprimovat, vylučovat nebo shromažďovat protilátky. Přesné zbytky zahrnující oblasti CDR je obtížné definovat a nemusí nutně odpovídat všem zbytkům hypervariabilních oblastí podle definice za použití Kabatova systému číslování. Také existují rozhodující zbytky základní struktury, které jsou důležité pro umístění oblastí CDR při interakci s antigenem nebo také se podílejí na interakcích mezi těžkým a lehkým řetězcem. Může být zapotřebí určité zbytky základní struktury změnit tak, aby odpovídaly donomím zbytkům v určitých polohách, čímž se CDR-roubované protilátce dodá „méně humánní charakter“.

Byly publikovány různé návrhy pro identifikaci zbytků CDR a základní struktury, které je zapotřebí změnit na donomí zbytky, aby se získala užitečná CDR-roubovaná protilátka (viz například Quenn et al., WO 90/07861; Kurrle et al., EP-A-0 403 156; Adair et atl. WO 91/09967, Quenn et al. WO/82/11018 a Bendig et al. WO 92/01568). Z těchto dokumentů vyplývá, že produkce užitečné CDR-roubované protilátky není v žádném konkrétním případě nijak jednoduchá.

Přes problémy, které jsou vlastní pokusům o produkci specifické CDR-roubované protilátky se původcům podařilo získat CDR-roubovanou protilátku založenou na oblastech humánní základní struktury, která obsahuje vazebné místo pro antigen, které je specifické pro variabilní oblasti βřetězce, jež jsou zvláštní pro určité subpopulace T-buněk. S překvapením se zjistilo, že humanizované protilátky podle vynálezu vykazují stejně dobrou nebo lepší vazebnou afinitu k cílovým T-buňkám ve srovnání s jejich myšími prototypy. Protilátky nárokované v tomto dokumentu nebo jejich části poskytují další výhodu ve snížené imunogenicitě ve srovnání s myšími prototypy, což se projevuje snížením nepříznivých reakcí pacienta při použití v terapii.

Podstata vynálezu

Vynález je zaměřen na humanizované protilátky vykazující selektivní vazebnou specificitu pro určité subpopulace T-buněk. Při vazbě k těmto subpopulacím jsou tyto protilátky vysoce citlivé a specificita a afinita při této vazbě je srovnatelná nebo lepší ve srovnání s prototypovými monoklonálními protilátkami (mAb), z nichž je odvozena podstatná část jejich CDR oblastí. Vynález je zaměřen také na způsoby výroby takových humanizovaných protilátek za použití nové cDNA kódující určité hypervariabilní zbytky a zbytky základní struktury, která je naroubována do základní struktury humánního těžkého řetězce a humánního lehkého řetězce. Dále je vynález také zaměřen na farmaceutické prostředky a způsoby léčby za použití těchto protilátek.

Podle jednoho provedení vynálezu, kterému se dává obzvláštní přednost, byla myší monoklonální protilátka 16G8, která rozpoznává humánní variabilní β řetězec νβδ.Ι, humanizována CDR naroubováním určité CDR a vybraných zbytků základní struktury z myší mAb do základní struktury těžkého řetězce KOL a lehkého řetězce REI. cDNA kódující humanizovaný těžký řetězec (IgGI) a lehký řetězec (K) ve vektorech pro expresi v savčích buňkách se selekčními markéry Neo a DHFR byly transfekovány do buněčné linie DHFR-fibroblastů čínského křečka (CHO), načež následovala selekce a amplifikace. Vyloučená humanizovaná mAb, označená názvem „TM29“ si zachovává specificitu vůči humánním TCR νβδ.Ι s afinitou srovnatelnou s afinitou prototypové myší mAb (16G8). Protilátky podle vynálezu ukázaly, že humanizace anti-TCR je možno dosáhnout při zachování správné specificity a afinity charakteristické pro tuto podmnožinu.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je použití těchto humanizovaných protilátek jako terapeutického činidla pro léčení humánních autoimunitních chorob, zejména Crohnovy choroby.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 jsou znázorněny různé variabilní sekvence lehkého řetězce a sekvence těžkého řetězce TM27.

Na obr. 2 jsou znázorněny různé variabilní sekvence lehkého řetězce a sekvence těžkého řetězce MT29.

Obr. 3 ukazuje výsledky kompetitivní zkoušky, při níž se porovnává TM27L/NSO a TM27L/CHOs4Hll.

Na obr. 4 je znázorněn Scatchardův graf experimentu vztahující se k experimentu znázorněnému na obr. 3.

Následuje podrobný popis tohoto vynálezu, přičemž nejprve jsou uvedeny definice některých pojmů, kterých se v tomto popisu používá.

-4CZ 287298 B6

Pod pojmem „protilátka“ se rozumí imunoglobuliny (Ig) nebo jejich fragmenty, monomery nebo dimery lehkých řetězců nebo těžkých řetězců a jednořetězcové protilátky, jako je jednořetězcový Fvs, v němž jsou domény lehkého a těžkého řetězce spojeny peptidovým linkerem. Může se jednat o přírodní protilátky nebo o protilátky získané technologií rekombinace DNA nebo jinými způsoby. Protilátka musí obsahovat alespoň jedno vazebné místo pro antigen. Zbytek protilátky nemusí obsahovat pouze proteinové sekvence odvozené od Ig. Tak například může být zkonstruován gen, v němž je sekvence DNA kódující část humánního Ig řetězce fúzována k sekvenci DNA kódující aminokyselinovou sekvenci molekuly polypeptidového efektoru nebo reportéru. Do rozsahu pojmu „protilátka“ tedy spadají i hybridní protilátky (viz dále).

Pojmu „vazebný protein“ se používá pro konstrukt s určitou aminokyselinovou sekvencí odvozenou z protilátky nebo kombinace protilátek, přičemž tato sekvence má takovou sterickou konfiguraci, že vytváří přinejmenším jedno vazebné místo pro antigen.

Zkratky „mAb“ se používá pro označení monoklonální protilátky produkované hybridomální nebo derivátovou buněčnou linií.

Pod označením „rekombinantní protilátka“ se rozumí protilátka získaná způsobem, při němž se používá rekombinantní DNA technologie.

Označením „CDR“ nebo „oblast určující komplementaritu“ se vztahuje k částem variabilních oblastí těžkého a lehkého řetězce protilátky, které jsou umístěny nad sebou v trojrozměrném prostoru za vzniku povrchu vázajícího antigen.

Pod označením „chimérická protilátka“ se rozumí protilátka, v níž jsou variabilní domény, jako celek, odvozeny od protilátky z jednoho savčího druhu a jsou fúzovány k alespoň jedné konstantní doméně z protilátky z jiného savčího druhu.

Označení „CDR roubovaný“ se používá pro popis protilátky nebo její části, v níž jsou oblasti CDR v podstatě odvozené z protilátky z prvního savčího druhu naroubovány na variabilní oblasti základní struktury v podstatě odvozené z druhého savčího druhu. Některé vybrané aminokyseliny v těchto oblastech základní struktury mohou být také odvozeny z prvního savčího druhu.

Označení „hybridní protilátka“ se používá pro popis proteinu obsahujícího přinejmenším vazebnou část Ig připojenou peptidovou vazbou k alespoň části jiného proteinu. Někteří odborníci mohou pro popis takových konstruktů užívat též přívlastku „chimérický“, ale v tomto popisu jsou výše uvedené konstrukty označovány názvem „hybridní protilátky“ a termínu „chimérické protilátky“ se používá ve výše definovaném smyslu.

Označení „humanizovaná protilátka“ se používá pro popis protilátky, v níž je alespoň jedna, a přednostně dvě nebo tři oblasti CDR jedné nebo dvou variabilních domén, odvozena z protilátky z prvního druhu (přičemž se rozumí, že zde mohou být zahrnuty určité vybrané aminokyseliny základní struktury ve spojení s určitými hypervariabilními aminokyselinovými sekvencemi). Zbývající části protilátky odvozené z Ig jsou odvozeny z jedné nebo více různých protilátek. Variabilní domény mohou být zkonstruovány za použití rekombinantní DNA technologie nebo peptidovou syntézou.

Pod označením „expresní vektor“ se rozumí vektor, který je schopen exprimovat sekvence DNA v němž obsažené, tj. v němž jsou kódující sekvence operabilně připojeny k jiným sekvencím, které jsou schopny je exprimovat. Užitečnou, ale ne vždy nutnou (například u hmyzích buněk) částí efektivního expresního vektoru je sekvence kódující markér, tj. sekvence kódující sekvenci vektoru mající za následek vznik určité fenotypové vlastnosti (například rezistence vůči neomycinu, rezistence vůči methioninsulfoximinu nebo tryptofanové prototrofie) buněk obsahujících tento protein, což umožňuje snadnou identifikaci takových buněk. Souhrnně lze říci, že pojem „expresní vektor“ představuje funkční definici, a do jeho rozsahu spadá jakákoliv sekvence DNA,

-5CZ 287298 B6 která je schopna zajistit expresi specificky obsaženého DNA kódu. V současné době jsou takové vektory často ve formě plazmidu. Označení „plazmid“ a „expresní vektor“ se často používá zaměnitelně. Do rozsahu tohoto vynálezu však spadají i jiné formy expresních vektorů než plazmidy, které slouží ke stejným funkcím a které jsou někdy v tomto oboru známy, jako jsou 5 retroviry, adenoviry, in vitro systémy (Baranov et al. (1989), Gene 84: 2: 463) apod.

Jak již bylo uvedeno výše, sekvence DNA budou exprimovány v hostitelských buňkách, poté co budou operabilně připojeny (tj. umístěny tak, aby se zajistila jejich funkce) k sekvenci řídící expresi. Tyto expresní vektory jsou obvykle replikovatelné v hostitelských organismech buď jako 10 episomy, nebo jako integrální část hostitelské chromosomální DNA.

Pod označením „rekombinantní hostitelské buňky“ se rozumějí buňky transformované vektory zkonstruovanými za použití rekombinantních DNA technologií. Díky takové transformaci jsou hostitelské buňky schopny produkovat požadovaný produkt v užitečných množstvích, a nikoliv 15 v příliš nízkých množstvích, nebo - obvykleji - v množstvích pod hranicí detegovatelnosti, jako by bylo možno očekávat při produkci v netransformovaném hostiteli. Protilátku a vazebné proteiny podle vynálezu mohou rekombinantní hostitelské buňky produkovat v množstvích umožňujících další experimenty nebo v obchodně vhodných množstvích, jako je asi 100 g nebo více.

Při popisu způsobů izolace protilátek nebo jejich vazebných proteinů z rekombinantních hostitelů se pojmů „buňka“ a „buněčná kultura“ používá zaměnitelně pro značení zdroje protilátky, pokud není jasně uvedeno jinak. Jinými slovy, izolace z „buněk“ může znamenat buď izolaci z celých odstředěných buněk, nebo z buněčné kultury, která obsahuje médium se suspendovanými 25 buňkami nebo též přídavně, jako je tomu v případě myelomových buněčných linií, z kultury ascites.

Humanizované protilátky nebo jejich vazebné proteiny podle tohoto vynálezu obsahují aminokyselinové sekvence zahrnující všechny CDR nebo část CDR v podstatě odvozených 30 z monoklonální protilátky vykazující specificitu pro vybranou subpopulaci T-buněk a zejména pro subpopulaci Vp8.1. V přednostním provedení je tato monoklonální protilátka myšího původu. Aminokyselinové sekvence základní struktury variabilních domén protilátek nebo jejich částí jsou v přednostních provedeních v podstatě humánního původu, a proto se používá pro tyto protilátky označení „humanizované protilátky“. Předpokládá se, že „humanizace“ je užitečný 35 prostředek pro snížení imunogenicity protilátky při terapeutickém podávání humánním pacientům. Přednostně se v tomto případě používá oblastí humánní základní struktury NEWM nebo KOL, v případě těžkého řetězce v oblasti humánní základní struktury REI, v případě lehkého řetězce. Určité zvolené zbytky v základní struktuře jsou zachovány z myši a nepocházejí tedy z člověka. Předpokládá se, že je to nutné pro dosažení vhodné trojrozměrné struktury molekuly 40 a tedy pro zvýšení vazebné specificity a afinity pro specifickou podmnožinu T-buněk.

Do rozsahu tohoto vynálezu spadají jakékoliv části humanizovaných protilátek (proto je definice termínu „protilátka“ tak široká) získaných na základě těchto poznatků, pokud je u nich zachována vazebná specificita a afinita pro vybrané subpopulace T-buněk. Do rozsahu tohoto vynálezu tedy 45 samozřejmě spadají vazebné proteiny pocházející z těchto protilátek, stejně tak jako jiné fragmenty, které si uchovávají tyto schopnosti, přinejmenším ve stupni postačujícím pro terapeutické použití, jak je to popsáno dále.

Odborníci v tomto oboru mohou vyzkoušet vazebné parametry různých konstruktů zhotovených 50 na základě zde popsaných poznatků za požití konvenčních vazebných zkoušek provedených se specifickými T-buňkami nebo receptorovými proteiny T-buněk vykazujícími zvolenou variabilní oblast, představující terč. Tak například je možno provést kompetitivní vazebné zkoušky s prototypovými mAb vázajícími se k různým buněčným liniím, Scatehardovy analýzy apod. a výsledky srovnat s výsledky získanými za použití prototypových mAb. Pro zjištění terapeutické účinnosti 55 konstruktů zhotovených podle vynálezu se alternativně lze uchýlit k různým zvířecím

-6CZ 287298 B6 modelovým systémům (které jsou popsány dále) nebo klinickým studiím. Je samozřejmé, že konstrukt může být velmi vhodným terapeutickým činidlem, i když se jeho vazebný profil k cílovému antigenu odlišuje od vazebného profilu prototypové mAB. V přednostních provedeních zahrnuje aminokyselinová sekvence humanizované protilátky nebo jejího vazebného proteinu celý variabilní lehký řetězec nebo jeho část zvolenou ze souboru zahrnujícího:

lehký řetězec TM 29

DIQMTQSPSSLSASVGDVTITCRASSSVNYIYWYQQTOGJAOJKKUYYT50

SNLAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQG100

101 TKLQIT106 a jeho části;

samotné nebo v kombinaci s celým variabilním těžkým řetězcem nebo jeho částí zvolenou ze souboru zahrnujícího:

těžký řetězec TM29

EVQLVESGGGWGPGRSLRLSCSSSGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY 50

ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG 100

101 EGAMDYWGQGTPVTVSS 117 a jeho části.

Zvolené zbytky základní struktury v sousedství jednotlivých CDR jsou důležité pro podepření trojrozměrné konformace těchto CDR (FOOte a Winter (1992) J. Mol. Biol. 224: 487 až 499).

V některých přednostních provedeních byly tedy zkonstruovány modifikované těžké řetězce.

V prvním takovém případě byly zbytky 66 až 69, včetně a 73 myšího původu, tj. myší sekvence Leu-Ser-Ule-Ser (66 až 69) a Asp (73), zavedeny místo odpovídajících humánních zbytků.

V jiných přednostních provedeních byly zavedeny myší zbytky valinu a fenylalaninu do poloh 78 a 79 nebo myší argininový zbytek do polohy 92.

Jiné přednostní protilátky a jejich vazebné proteiny podle vynálezu vznikají modifikací těžkých řetězců ve zbytcích 23 a 24. Do těchto poloh se zavádí myší sekvence Ala-. V jiných konstruktech může být zbytkem 75 myší proíinový zbytek nebo zbytky 88, 89 a 91 mohou být myší zbytky alaninu, methioninu a tyrosinu. Tyto protilátkové konstrukty a jejich vazebné proteiny vážou T-buňky νβ8.1 a jsou podrobněji znázorněny na obr.

Pro použití podle vynálezu se dává přednost zejména CDR roubovaným protilátkám, které se v podstatě skládají z lehkého řetězce TM29 ve spojení s těžkým řetězcem TM29.

Humanizované protilátky nebo jejich vazebné proteiny podle vynálezu je možno získat různými technologiemi, přičemž největší přednost se dává expresi v transfekovaných buňkách, jako například kvasinkových buňkách, hmyzích buňkách, buňkách CHO nebo myelomových buňkách. Nejvhodnější hostitelskou buňkou je buňka CHO.

Při konstrukci CDR roubované protilátky nebo jejího vazebného proteinu podle vynálezu je nejprve nutno zjistit sekvenci variabilní domény protilátky, která má požadované vazebné vlastnosti. Vhodnými zdroji buněk pro takové sekvence DNA jsou ptáci, savci nebo jiní obratlovci, jako kuřata, myši, krysy a králíci, přednostně myši. Sekvence variabilních domén (V_H a V_L) je možno stanovit z cDNA těžkého a lehkého řetězce syntetizovaných z příslušných mRNA technologiemi známými v tomto oboru. Kabátovou metodou (viz výše) je potom možno určit hypervariabilní oblasti. Oblast CDR je možno určit strukturní analýzou za použití rentgenové

-7CZ 287298 B6 krystalografie nebo technikami molekulárního modelování. Potom lze zkonstruovat kompozitní CDR obsahující všechny zbytky odpovídající hypervariabilním oblastem spolu s určitými zvolenými zbytky z oblasti základní struktury. Výsledné kompozitní CDR je možno potom přenést jako „vazebné místo pro antigen“, zatímco zbytek protilátky (je-li žádoucí, aby byl zkonstruován úplný Ig) bude zahrnovat konstantní domény těžkého a lehkého řetězce a zbývající zbytky základní struktury. Posledně uvedené části mohou být založeny na humánních protilátkách z různých tříd.

Konstantní domény mohou být zvoleny tak, aby měly požadované efektorové funkce vhodné pro zamýšlené použití takto zkonstruovaných protilátek. Tak například humánní IgG isotypy IgG] a IgG₃ jsou účinné pro úplnou fixaci a lýzu zprostředkovanou buňkami. Pro jiné účely mohou být vhodnější jiné isotypy, jako například IgG₂ a IgG₄ nebo jiných tříd, jako IgM a IgE.

Pro humánní terapii se obzvláště hodí humánní isotypy, aby se minimalizovala antiglobulinová odpověď během léčení. Sekvence DNA humánní konstantní domény, přednostně ve spojení s jinými oblastmi základní struktury variabilní domény, je možno připravit obecně známými postupy. Jako příklad je možno uvést CAMPATH 1H, který je dostupný od firmy Burroughs Wellcome Ltd.

Při přednostních provedeních tohoto vynálezu se připravují určité CDR roubované protilátky, které obsahují zvolené alterace v oblasti humánní základní struktury (jinými slovy vně oblastí CDR variabilních domén), což vede kCDR roubovaným protilátkám s uspokojivou vazebnou afinitou. Tato vazebná afinita přednostně leží v rozmezí od asi ΗΓ’.Μ do asi 10‘¹².M a přednostně je alespoň asi 10'⁸.M. Vazebná afinita je přednostně přibližně stejná nebo vyšší než vazebná afinita prototypové protilátky (v přednostních případech je touto prototypovou protilátkou myší protilátka).

Při konstrukci CDR roubovaných protilátek podle vynálezu se mohou V_H a/nebo Vl genové segmenty alterovat mutagenezí. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že podobným způsobem lze také alterovat různé jiné nukleotidy kódující aminokyselinové zbytky nebo sekvence obsažené v části Fc nebo jiných oblastech protilátky (viz například PCT/US89/00297).

Jako příklady vhodných technik je možno uvést adici, deleci nebo nekonzervativní substituci omezeného počtu různých nukleotidů nebo konzervativní substituci mnoha nukleotidů, za předpokladu, že se zachová správný čtecí rámec.

Ke konečnému konstruktu se tedy může dospět substitucemi, delecemi, isercemi nebo jakýmikoliv kombinacemi těchto postupů. Vzhledem k tomu, že existuje 64 možných sekvenci kodonu, ale jen 20 známých aminokyselin, je genetický kód degenerován vtom smyslu, že odlišné kodony mohou poskytnout stejnou aminokyselinu. Kód je však přesný pro každou aminokyselinu. Existuje tedy přinejmenším jeden kodon pro každou aminokyselinu, tj. každý kodon poskytuje jednu určitou aminokyselinu a žádnou jinou. Je zřejmé, že během translace se musí zachovat správný čtecí rámec, aby se získala správná aminokyselinová sekvence ve výsledném polypeptidu.

Techniky adice, delece nebo substituce v předem určených aminokyselinových místech majících známou sekvenci jsou dobře známy. Jako příklady takových technik je možno uvést oligonukleotidem mediovanou místně orientovanou mutagenezi a PCR.

Oligonukleotidová místně orientovaná mutageneze zahrnuje v podstatě hybridizaci oligonukleotidu kódujícího požadovanou mutaci sjednořetězcovou DNA obsahující oblast, která má být mutována, přičemž tohoto jednoho řetězce se použije jako templátu pro prodloužení oligonukleotidu, za účelem získání vlákna obsahujícího danou mutaci. Různá provedení této techniky jsou popsána vZoller a Smith (1982) Nuc. Acids. Res. 10: 6487, Norris et al. (1993)

-8CZ 287298 B6

Nuc. Acid. Res. 11: 5103, Zoller a Smith (1984) DNA 3: 479 a Kramer et al. (1983) Nuc. Acids. Res. 10: 6475.

PCR v podstatě zahrnuje exponenciální amplifíkaci DNA in vitro za použití sekvenčně specifických oligonukleotidů. Tyto ligonukleotidy mohou popřípadě zavádět alterace sekvence. PCR technika je popsána v publikace Mullis a Foloona (1987) Meth. Enz. 155: 335. Příklady mutageneze za použití PCR jsou popsány v Higuchi et al. 1988, Nuc. Acids. Res. 16: 7351, Ho et al., (1989) Gene, 77: 51, Ho et al., Engineering Hybridization Restriction Genes without the Use of Restriction Enzymes: Gene Splicing by Overlap Extension; Horton et al. (1989) Gene 77: 61.

Nukleotidové sekvence podle vynálezu, které jsou schopny exprimovat požadované protilátky nebo jejich vazebné proteiny, je možno vytvořit z různých odlišných polynukleotidů (genomové DNA, cDNA, RNA nebo syntetických oligonukleotidů). V současné době se dává přednost tomu, aby polynukleotidová sekvence obsahovala produkt fúze cDNA a genomové DNA. Polynukleotidová sekvence může kódovat různé složky Ig (například domény V, J, D a C). Pro konstrukci lze použít různých odlišných technik. V současné době nejobvyklejší způsob zahrnuje spojení vhodných genomových a cDNA sekvencí. Může se však použít i sekvencí cDNA (viz EPA0 239 400 a Reichmann et al. (1988) Nátuře 332: 323).

Různé vhodné expresní vektory a hostitelské buňky jsou popsány v US-A-4 816 567.

Vektory a způsoby, které jsou zde zveřejněny, se hodí pro použití v hostitelských buňkách zahrnujících široký rozsah prokaryontních a eukaryontních organismů.

Obecně se samozřejmě při klonování sekvencí DNA za účelem konstrukce vektorů vhodných pro použití podle vynálezu dává přednost prokaryontním organismům. Zvláště užitečné jsou například různé plazmidové klonovací vektory z E. coli, jako například vektory Bluescript M13 od firmy Stratagene, San Diego, Kalifornie, USA; pUC19c, přírůstkové číslo genové banky VB 0026, pBR322 (popis viz dále) apod. Výše uvedené příklady jsou samozřejmě pouze ilustrativní a vynález jimi není omezen.

Pro expresi se také může používat prokaryotních organismů, jako jsou výše uvedené kmeny E. coli a kmeny Bacillus, jako je Bacillus subtilis, jakož i jiné enterobakterie, jako je Salmonela typhimurium nebo Serratia marcescens a různé druhy Pseudomonas.

Ve spojení s těmito hostiteli se obecně používá plazmidových vektorů obsahujících replikovanou a kontrolní sekvenci odvozenou z druhu kompatibilního s hostitelskou buňkou. Vektor obvykle nese replikační místo, jakož i markerové sekvence, které jsou schopny umožnit fenotypovou selekci v transformovaných buňkách. Tak například E. coli se obvykle transformuje za použití některého z mnoha derivátů pBR322, což je plazmid odvozený z druhu E. coli (Bolivar et al. (1977) Gene: 95). pBR322 obsahuje geny pro rezistenci vůči ampicilinu a tetracyklinu, což představuje jednoduchý prostředek pro identifikaci transformovaných buněk. Plazmid pBR322, jeho potomci nebo jiné mikrobiální plazmidy, mohou také obsahovat nebo mohou být modifikovány tak, aby obsahovaly, promotory, jichž může mikrobiální organismus použít pro expresi rekombinantních proteinů. Protony, kteiých se běžně používá při konstrukci rekombinantní DNA, zahrnují laktosové promotorové systémy (Chang et al. (1978) Nátuře 275: 615; Itakura et al. (1978) Science 198: 1056; Goedell et al. (1979) Nátuře 281: 544) a tryptofanové (trp) promotorové systémy (Goedell et al. (1980) Nuc. Acids Res. 8: 4057) a ΕΡ-Α-Ό 036 776. Těchto promotorů se sice používá nejčastěji, ale byly objeveny a použity i jiné mikrobiální promotory, přičemž byly také publikovány podrobnosti vztahující se kjejich nukleotidové sekvenci, což umožňuje odborníkům v tomto oboru ligovat jen funkčně do plazmidových vektorů (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269).

Kromě prokaryotů se také může použít eukaryontních mikrobů, jako například kvasinkových kultur. Nejčastěji používaným eukaryontním mikroorganismem jsou kvasinky Saccharamyces

-9CZ 287298 B6 cerevisiae nebo běžné kvasnice, přestože je dostupná řada jiných kmenů. Pro expresi v Saccharomyces se například běžně používá plazmidu YRp7 (stinchromb et al., (1979) Nátuře 282:39; Kingsman et al., (1979) Gene 87:141; tschemper et al., (1980) Gene 19: 157). Tento plazmid již obsahuje gen trpí, který poskytuje selekční markér pro mutantní kmen kvasinky postrádající schopnost růstu na tryptofanu, jako je například ATCC č. 44076 nebo PEP4-1 (Jones (1977), Genetics 8: 85:12). Přítomnost léze trpí, jakožto vlastnost genomu kvasinkové hostitelské buňky potom zajišťuje efektivní prostředek pro detekci transformace růstu za nepřítomnosti tryptofanu.

Vhodné promotující sekvence v kvasinkových vektorech zahrnují promotory pro 3-fosfoglycdrát kinasu nebo jiné glykolytické enzymy, jako je enolasa, glyceraldehyd, 3-fosfát dehydrogenasa, hexokinasa, pyruvát dekarboxylasa, fosfofruktokinasa, glukosa-6-fosfát isomerasa, 3-fosforlycerát mutasa, puryvát kinasa, triosefosfát isomerasa, fosfoglukosa isomerasa a glukokinasa (Hess et al. (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149; Holland et al. (1978) Biochemistry 17: 4900). Při konstrukci vhodných expresních plazmidů se terminační sekvence spojené s těmito geny také ligují do expresního vektoru ve směsi k 3' od sekvence, jež má být exprimována, čímž se zajistí polyadenylace mRNA a terminace. Jinými promotory, které vykazují přídavnou výhodu transkripce kontrolované růstovými podmínkami, jsou promotorové oblasti pro alkohol dehydrogenasu 2, isocytochrom C, kyselina fosfatasa, degradační enzymy spojené s dusíkovým metabolismem a výše uvedená glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa, což je enzym zodpovědný za utilizaci maltosy a galaktosy. Vhodný je jakýkoliv plazmidový vektor obsahující promotor kompatibilní s kvasinkou, počátek replikace a terminační sekvenci.

Kromě mikroorganismů se jako hostitelů může také použít buněčných kultur získaných z vícebuněčných organismů. Obecně se může pracovat s jakoukoliv takovou buněčnou kulturou, ať již pochází od obratlovců nebo bezobratlých. Až dosud však byl největší zájem zaměřen na buňky bezobratlých. Až dosud však byl největší zájem zaměřen na buňky obratlovců a propagace buněk obratlovců v kulturách se stala vpodlesní době rutinním postupem (Kruše a Patterson (1973) Tissue Culture, Academie Press). Jako příklady takových užitečných hostitelských buněčných linií je možno uvést buněčné linie VĚRO, HeLa, buňky ovárií čínského křečka (CHO), W138, BHK, COS-7, MDCK a buněčné linie myelomu a gsmyelomu (k dispozici od firmy Celltech, Slough, Velká Británie). Expresní vektory pro takové buňky mohou popřípadě zahrnovat vhodný počátek replikace, jakož i promotor umístěný před genem, který má být exprimová, spolu sjakýmikoliv potřebnými ribosomálními vazebnými místy, místa RNA sestřihu, polyadenylačními místy a terminačními sekvencemi transkripce.

U savčích buněk zajišťuje kontrolní funkce expresních vektorů často virový materiál. Tak například běžně používané promotory jsou odvozeny z humánního cytomegaloviru (HCMV), polyomaviru, adenoviru 2 a nejčastěji z opičího viru 40 (SV40). Obzvláště užitečné jsou časné a pozdní promotory viru SV40, poněvadž oba se z viru snadno získávají v podobě fragmentu, který také obsahuje virový počátek replikace z SV40 (Fers et al. (1978) Nátuře 273: 113). Dále je také možné, a často žádoucí, používat promotory nebo kontrolních sekvencí, které jsou normálně asociovány s požadovanou genovou sekvencí, za předpokladu, že takové kontrolní sekvence jsou kompatibilní se systémem hostitelských buněk.

Počátek replikace se může zajistit buď tím, že se zkonstruuje vektor, který obsahuje exogenní počátek, jako například počátek odvozený z SV40, nebo jiného virového zdroje (například polyomaviru, adenoviru, VSV nebo BPV) nebo se může počátek dodat prostřednictvím mechanismu replikace chromosomů hostitelské buňky. Je-li vektor integrován do chromosomu hostitelské buňky, posledně uvedené řešení často postačuje.

Vektory obsahující segmenty DNA, které jsou předmětem zájmu (například sekvence kódující těžký a lehký řetězec a sekvence pro kontrolu exprese) je možno přenést do hostitelské buňky dobře známými metodami, které se liší v závislosti na typu buněčného hostitele. Tak například u prokaryontních buněk se obvykle používá transfekce za použití chloridu vápenatého, zatímco

-10CZ 287298 B6 u jiných buněčných hostitelů se může použít zpracování fosforečnanem vápenatým, lipofekce nebo elektroporace (Maniatis et al. (1990) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, II. vydání, Cold Spring Harbor Press).

Po expresi je možno konstrukty podle vynálezu purifikovat standardními metodami známými v tomto oboru, jako je srážení síranem amonným, čištění na afinitních sloupcích, sloupcová chromatografie a gelová elektroforéza (Scopes (1982) Protein Purification, Springer Verlag, N. Y.). Vazebná afinita takto exprimovaných konstruktů se může zjistit technikami známými v tomto oboru, které jsou plně objasněny v příkladové části tohoto popisu.

Dává se přednost v podstatě čistým CDR-roubovaným protilátkám nebo jejich vazebným proteinům s homogenitou alespoň 90 až 95 %. Pro farmaceutická použití se největší přednost dává preparátům s homogenitou 98 až 99 %. Po purifikaci, částečné, nebo až do dosažení požadovaného stupně homogenity se CDR-roubovaných protilátek může použít k diagnostickým nebo terapeutickým účelům (včetně extrakorporálního použití) nebo při vývoji a provádění zkušebních postupů imunofluorescentním barvením apod. (Lefkovité a Pemis (1979 a 1981) Immunological Methods, sv. I a II, Academie Press N.Y).

CDR-roubované protilátky nebo jejich vazebné proteiny podle tohoto vynálezu budou nalézat použití při léčení chorob zprostředkovaných T-buňkami. Jako příklad typických chorobných stavů, které je možno léčit těmito látkami, je možno uvést autoimunitní choroby, jako je diabetes typu I, roztroušená skleróza, rheumatoidní artritis, systemický lupus erythrematosus, Crohnova choroba a myasthenia gravis.

Terapeutické použití T-buněčných protilátek podle vynálezu je založeno na korelaci mezi specifickou chorobou mající vztah k imunitě a preferenční expresí určitého produktu genu oblasti receptoru V antigenu T-buňky nebo rozšířeného využití určitého genu receptoru V antigenu Tbuňky. Oblasti receptoru V antigenu T-buňky jsou zčásti užitečné, poněvadž je možno regulovat imunitní odpověď u individua specifickou terapeutickou intervencí za použití receptoru antigenu T-buněk. Konkrétně se ukázalo, že přítomnost exprese určitého místa variabilní oblasti koreluje s určitými imunitně zprostředkovanými poruchami. Stanovením určitých míst oblasti V, která jsou spojena s určitou poruchou imunity, je možno dospět k léčení individua inhibicí napadení Tbuňkami nesoucími určitou oblast V.

Pod označením „léčení“ se podle vynálezu rozumějí situace jinak označované termíny „prevence“, „potlačování“ nebo vlastní „léčení“ choroby. Prevence zahrnuje podávání protektivního prostředku před indukcí choroby. Tak například u zvířecího modelu „EAE“ se úspěšné podání protektivního prostředku před vstříknutím encefalitogenu indukujícího chorobu projeví prevencí této choroby.

Potlačení zahrnuje podání prostředku po indukci, ale před klinickým projevem choroby. Za použití EAE, jako příkladu, úspěšné podání protektivního prostředku po injekci encefalitogenu, ale před vznikem neurologických symptomů, zahrnuje potlačení této choroby.

Léčení zahrnuje podání protektivního prostředku po manifestaci choroby. Za použití příkladu sEAE, úspěšné podání protektivního prostředku po injekci encefalitogenu a po výskytu klinických známek představuje léčení choroby.

Pro zajišťování účinnosti protilátek nebo jejich vazebným proteinů při ochraně proti chorobám nebo při jejich léčení jsou k dispozici zvířecí modelové systémy. Systemický lupus erythematosus (SLE) se zkouší na susceptibilních myších způsobem popsaným vKnight et al., (1978) J. Exp. Med. 147:1653 a Reinersten et al., (1978) New Eng. J. Med. 299:515. Myasthenia gravis (MG) se zkouší na samicích myši SJL/J indukcí choroby rozpustným AChR proteinem od jiného druhu způsobem popsaným vLindsrom et al., (1988) Adv. Immunol. 42:233-284. Artritis se indukuje susceptíbilnímu kmeni myší injekcí kolagenu typu II způsobem popsaným v Stuart et

-11CZ 287298 B6 al., (1984) Ann. Rev. Immunol. 43:233-284. Adjuvantní artritis se indukuje susceptibilním krysám injekcí mykobakteriálního proteinu tepelného šoku způsobem popsaným v Van Eden et al., (1988) Nátuře 331: 171-173. Thyroiditis se myší indukuje podáním thyroglobulinu, jak je to popsáno vMaron et al., (1980) J. Exp. Med. 152:1115-1120. U inzulín dependentní diabetes mellitus (IDDM) se používá spontánně se vyskytnuvších případů nebo se tato choroba indukuje určitým kmenům myší, které jsou například popsány v Kanasawa et al., (1984) Diabetologie 27:113. EAE u myší a krys slouží jako model pro roztroušenou sklerózu u člověka. U tohoto modelu se demyelinační choroba indukuje podáním proteinu na bázi myelinu způsobem popsaným vPaterson (1986) Textbook of Immunopathology (Mischer et al., Eds.) Grune a Stratton, New York, str. 179-214; McFarlin et al. (1973) Science 179: 478—480 a Satoh et al. (1987) J. Immunol. 138:179-184.

CDR-roubovaných protilátek nebo jejich vazebných proteinů podle vynálezu se také může používat v kombinaci s jinými protilátkami, zejména protilátkami mAb, které jsou reaktivní s jinými markéry na humánních buňkách, jež jsou zodpovědné za tyto choroby. Tak například vhodné T-buněčné markéry mohou zahrnovat markéry seskupené do tzv. diferenciačních shluků („Clusters of Differenctiation“), jak byly nazvány na First Intemational Leukocyte Differentitation Workshop (Bemhard et al., (1984) Leukocyte Typing, Springer Verlag, NY). CDRroubovaných protilátek nebo jejich vazebných proteinů se bude obvykle používat v purifíkované formě spolu s farmakologicky vhodnými nosiči. Jako obvyklé nosiče je možno uvést vodné a vodně-alkoholické roztoky, emulze nebo suspenze, včetně solných a pufrovaných médií. Parenteriální nosiče zahrnují roztok chloridu sodného, Ringerův roztok dextrózy a směsi dextrózy a chloridu sodného, jakož i laktátové Ringerovy roztoky. Případné fyziologicky vhodné pomocné látky pro udržení komplexu v suspenzi je možno uvolit ze souboru zahušťovadel, jako jsou karboxymethylcelulóza, polyvinylpyrrolidon, želatina a algináty.

Intravenózní vehikula zahrnují doplňky tekutiny, živin a elektrolytů a jedná se například o vehikula na bázi Ringerova roztoku dextroxy. Přítomna mohou být i taková činidla, jako jsou konzervační látka a jiné přísady, například antimikrobiální látky, antioxidanty, chelatační činidla a inertní plyny (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. vydání).

Konstruktů podle vynálezu se může používat ve formě separátně podávaných prostředků nebo ve formě kombinací s jinými činidly. Tyto kombinace mohou zahrnovat různá imunoterapeutická léčiva, jako je cyklosporin, methothrexate, adriamycin a cisplatinum a dále též imunotoxiny. Farmaceutické prostředky mohou zahrnovat „koktejly“ různých cytotoxických nebo jiných činidel ve spojení s CDR-roubovanými protilátkami nebo jejich vazebnými proteiny podle tohoto vynálezu. Může se jednat dokonce i o kombinace konstruktů podle vynálezu a CDRroubovaných protilátek s různými specificitami.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou podávat různými způsoby, které jsou obecně známy odborníkům v tomto oboru. Při léčení, jako jehož neomezující příklad je možno uvést imunoterapii, se CDR-roubované protilátky nebo jejich vazebné proteiny podle vynálezu mohou podávat jakýmkoliv pacientům v souladu se standardními technikami. Podávání může být jakoukoliv vhodnou cestou a může se tedy jednat o podávání parenterální, intravenózní, instramuskulámí, intraperitoneální a nebo také o podávání přímou infuzí pomocí katétru. Poslední způsob podávání je zvláště vhodný. Dávkování a frekvence podávání budou záviset na věku, pohlaví a stavu pacienta, souběžném podávání jiných léčiv, kontraindikacích a jiných parametrech, které bude muset vzít lékař v úvahu.

Konstrukty podle vynálezu je možno lyofilizovat pro usnadnění skladování a před použitím rekonstituovat pomocí vhodného nosiče. Tato technika se ukázala účinnou u konvenčních imunoglobulinů a může se při ní použít o sobě známých lyofilizačních a rekonstitučních postupů. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že lyofilizace a rekonstituce mohou vést k různému stupni deaktivace protilátek (u konvenčních imunoglobulinů mají například IgM protilátky sklon

-12CZ 287298 B6 k vyššímu poklesu aktivity než IgG protilátky) a může být nutno kompenzovat tyto ztráty přizpůsobením dávkování.

Prostředky obsahující CDR-roubované protilátky nebo jejich koktejl je možno podávat při profylaktickém a/nebo kurativním léčení. Při určitých terapeutických aplikacích se jako „terapeuticky účinná dávka“ označuje množství, které je vhodné pro dosažení alespoň částečné inhibice, potlačení, modulace, usmrcení nebo jiného měřitelného parametru u populace zvolených buněk. Množství potřebná pro dosažení této dávky budou závislá na závažnosti choroby a celkovém stavu vlastního imunitního systému pacienta, ale obvykle budou ležet v rozmezí od 0,005 do 5,0 mg CDR-roubované protilátky nebo jejího vazebného proteinu, počítáno na kg tělesné hmotnosti. Obvykle se bude používat dávek v rozmezí od 0,05 do 2,0 mg/kg/dávka. Pro profylaktické aplikace se mohou prostředky obsahující konstrukty podle vynálezu nebo jejich koktejly podávat v podobných nebo mírně snížených dávkách.

Prostředků obsahujících konstrukt podle vynálezu se může používat profylakticky nebo terapeuticky pro umožnění alterace, inaktivace, usmrcení nebo odstranění zvolené cílové populace Τ’buněk savce.

Při jiném provedení tohoto vynálezu se konstruktů popsaných výše může používat mimo tělo nebo in vitro k selektivnímu usmrcení, vyčerpání nebo jinému efektivnímu odstranění cílové populace buněk z heterogenní sbírky buněk. Krev savce se může mimo tělo uvést do styku s CDR-roubovanými protilátkami nebo jejich vazebnými proteiny, přičemž dojde k usmrcení nebo jinému odstranění nežádoucích buněk z krve a poté se takto zpracovaná krev může standardními technikami savci vrátit.

Kromě terapeutických použití se konstruktů podle vynálezu může použít i v jiných souvislostech. Podle jednoho provedení tohoto vynálezu se protilátka podle vynálezu nebo jejich vazebných proteinů může používat při výzkumu. Proteiny vázající receptor T-buněk nebo protilátky podle vynálezu jsou také užitečné při strukturních a funkčních studiích týkajících se receptoru Tbuněk. Kromě toho, že slouží jako substráty nebo vazebné domény pro specifické formy receptorů T-buněk, mohou tyto protilátkové konstrukty sloužit jako prostředek pro výzkum konformačních studií za účelem aproximace nativních konfigurací různých částí receptury Tbuňky. Při ještě dalším provedení tohoto vynálezu se T-buněčných protilátek nebo jejich vazebných proteinů může použít jako diagnostických prób. Při jednom specifickém provedení tohoto vynálezu se může konstruktů podle vynálezu použít při stanovení množství nebo přítomnosti určité podčeledi oblasti V T-buněk v biologickém vzorku. Jedno takové stanovení je popsáno v Ritterhasu-WO 92/08981 (přihláška publikovaná 26. května 1992 pod názvem „Therapeutic and Diagnostic Methods Usig Total Leucocyte Surface Antigens“). Předmětem vynálezu jsou tedy také způsoby diagnostikace chorob majících vztah k imunitě, jako je roztroušená skleróza, jejichž podstatou je detekce specifického podsouboru receptoru antigenu T-buňky v biologickém vzorku.

CDR-roubované protilátky nebo jejich vazebné proteiny je možno značit technologiemi, které jsou známé v tomto oboru. Konstrukty jsou také vhodné pro jiné in vivo účely. Tak například je možno jich použít pro selektivní ošetření buněk periferní krve, kde je žádoucí eliminovat pouze cílové T-lymfocyty nebo k jiným podobným účelům, když je zapotřebí v buněčných kulturách eliminovat nežádoucí T-lymfocyty.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

-13CZ 287298 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

MT27 - přehled operací

1. Myši BALB/c byly imunizovány leukemickou buněčnou linií T-buněk HPB-A11 (jednou intraperitoneálně a dvakrát intravenózně).

2. Buňky sleziny od těchto myší byly shromážděny a fúzovány s myší myelomovou imortalizační buněčnou linií P3X53AG8.653.

3. Byla provedena selekce vhodných klonů v médiu HAT.

4. Byl proveden screening takto vybraných klonů na příslušnou vazbu pomocí imunoprecipitace radioizotopem značené buněčné linie HPB-A11.

5. Bylo provedeno subklonování za použití techniky limitního ředění.

6. PBL stimulační a CD3 modulační studiemi byla provedena zkouška specificity.

7. Hybridom vylučující příslušnou protilátku byl označením zkratkou 4H11.

8. Z tohoto klonu byla získána RNA a poté izolována mRNA. Byla připravena cDNA pro tuto mRNA.

9. cDNA byla sekvenována a byla provedena zkouška přesnosti.

10. Izolované cDNA (H a K) byly klonovány do vektorů M13.

11. Mutagenezí, jejíž příklad je uveden v příkladu 2, byly zavedeny zvolené oblasti humánní základní struktury.

12. Humanizované protilátky (vždy asi 1 mg) byly purifikovány zNSO transfektantů pro předběžné hodnocení.

Bylo vytvořeno 5 různých MT27:

MT27L: s leucinem v poloze 48 těžkého řetězce

TM27I: s isoleucinem v poloze 48 těžkého řetězce

TM27.1: s FS až VF (78-79) změnami

MT27.2: s VTML/T až LSIS/N (67-70/73) změnami

MT27.3: s V až R (92) změnami

Podrobný popis experimentu

Shrnutí

Cílem tohoto projektu bylo humanizovat myší antihumánní TCR (receptor T-buňky) νβ 5.2/5.3 monoklonální protilátku (TM23) a vytvořit buněčnou linii exprimující humanizovanou protilátku, která by byla vhodná pro další výzkum. Touto humanizovanou anti-TCR νβ 5.2/5.3 monoklonální protilátkou je TM27.

-14CZ 287298 B6

Myší protilátka

Hybridom 4H11 byl vyvinut fúzí myší myelomové buněčné linie P3X63AG8.653 s slezinnými buňkami myší BALB/c imunizovaných leukemickou buněčnou linií T-buněk HPB-ALL. Tento hybridom exprimuje monoklonální protilátku TM23 se specifícitou vůči νβ 5.2 a 5.3 humánního receptoru T-buněk (TCR). Tento isotyp byl označen zkratkou IgG2a/kappa.

Humanizace cDNA kódující těžký a lehký řetězec MT23 se izoluje z knihovny cDNA 4H11 zkonstruované za použití myšího IgG2a a kappa specifických 3' koncových primerů. Izolované cDNA klony byly potvrzeny sekvenováním DNA a vnitřním sekvenováním aminokyselin. Oblasti CDR (oblasti určující komplementaritu) těžkého a lehkého řetězce byly identifikovány na základě zákrytu konzervovaných sekvencí myší základní struktury. DNA fragmenty, L, V, (D), J (L - vedoucí; V = variabilní; D = diverzitní a J = spojující) byly izolovány pomocí PCR a klonovány do CHO buněčných expresních vektorů pTCSLCkappaDHFR a pTCSLCglNeoAp’ nesoucích humánní cDNA kappa a IgGl konstantní oblasti, za účelem exprese myší V/humánní C chimérické protilátky.

Na základě porovnání sekvencí aminokyselin dedukovaných z těchto klonů cDNA bylo zjištěno, že těžký řetězec TM23 náleží do Kabatovy podskupiny IB. Dále se zjistilo že sekvence V_kappa náleží do Kabatovy podskupiny V_kappa V. Proto byly pro humanizaci těžkého a lehkého řetězce vybrány humánní základní struktury NEWM (těžký řetězec) a REI (lehký řetězec). Přesmyknuté fragmenty V(D)J (s výjimkou části 5' V a 3' J) byly klonovány do vektorů M13 nesoucích vedoucí a intonovou sekvenci v genomové konfiguraci, za účelem vytvoření úplných genomových konstruktů L-V(D)J.

Exprese myelomu

Po konstrukci CDR-roubovaných oblastí V(D)J mutagenezí byly fragmenty DNA klonovány do myelomových expresních vektorů nesoucích konstantní oblast buď humánního kappa, nebo IgGl, bylo zkonstruováno pět humanizovaných těžkých řetězců s různými mutacemi. Každý z těchto pěti konstruktů těžkého řetězce byl kotransfekován s humanizovaným lehkým řetězcem do buněčné linie myelomu NSO. Humanizované protilátky byly purifikovány ze supematantů kultur expandovaných humánních IgGl/kappa pozitivních transfektantů za účelem vyhodnocení. Výsledky ukázaly, že TM27L s nejméně myšími aminokyselinovými sekvencemi barví νβ 5.3 T-buňky stejně tak, jako ostatní humanizované verze, pokud ne lépe. Proto byly MT27L zvoleny pro další vývoj a byly označeny jako TM27.

Exprese v buňkách CHO

Vedoucí oblast a oblast V těžkého a lehkého řetězce TM27 byly izolovány z myelomových konstruktů pomocí PCR za účelem klonování v cDNA konfiguraci do expresních systémů s buňkami CHO, pTCSLCglNeoAp’ (těžký) a pTCSLCkappaDHFR (lehký), jak to bylo popsáno výše. Byly selektovány transfektanty buněk CHO a humánní IgGl/kappa pozitivní buňky byly klonovány. Jeden z největších producentů, TM27L-662-35 byl expandován pro „cell banking“ a přípravu humanizované Ab v malém měřítku. Protilátka TM27 exprimovaná v CHO byla charakterizována v průběhu postupu tohoto projektu a zjistilo se, že je srovnatelná s protilátkou z myelomové buněčné linie a rodičovskou TM23. Souběžně byly klony buněk CHO podrobeny amplifíkaci a klonování za účelem zvýšení exprese protilátky a demonstrace vhodnosti tohoto kmene pro zlepšení produktivity.

-15CZ 287298 B6

Podrobný popis

Imunizace myší BALB/c pomocí HPB-ALL β F1 (antihumánní monoklonální protilátka na bázi konstantní oblasti receptorů β řetězce receptorů T-buňky) a imunoprecipitát leukemických humánních T-buněk HPB-ALL (3 x 10⁷) od dr. Michaela Brennera (Harvard Medical School) byly smíseny s úplným Freundovým adjuvantem a intraperitoneální injekcí podány myším BALB/c. Po pěti týdnech se provokace zintenzivnila podáním posilovači dávky 3 x 10⁷ těchto buněk v solném roztoku po dobu tří po sobě jdoucích dnů, přičemž první podání bylo intraperitoneální a následující dvě podání byla intravenózní.

Fúze slezinných buněk s P3X63AG8.653

Fúze byla provedena zavedenými technikami tři dny po závěrečné intravenózní posilovači dávce. Slezinné buňky v pětinásobném nadbytku byly fúzovány s buňkami P3X63AG8.653 (buňky myšího myelomu, linie nevylučující Ig, pocházející z myši BALB/c, ATCC, CRL 1580) za použití 50% polyethylenglykolu 1 500 (BDH, Dorset, Velká Británie).

Selekce fúzovaných buněk pomocí HAT

Fúzované buňky byly naneseny do 96-jamkových misek 2 x 10⁵ BALB/c thymocytů na jamku, jako zdroj živin. Selekce se provádí v médiu RPMI-1640 s obsahem 15 % FBS (fetální telecí sérum) a HAT (6mM hypoxanthin, 50mM aminopterin a 2mM thymidin). Buňky byly inkubovány ve vlhkém vzduchu s obsahem 5 % oxidu uhličitého při 37 °C.

Screening hybridomů

Po 13 až 14 dnech byl proveden screening jamek, jednak za použití zkoušky ELISA a jednak za použití imunoprecipitace buněk HPB-ALL označených radioizotopem ¹²⁵I. Za podmínek imunoprecipitace dochází k disociaci molekul CD3 od a a β řetězce TCR. Hybridomy, které zreagovaly s HPB-ALL byly expandovány do nádob T-75 pro další klonování.

Klonování hybridomů, které jsou předmětem zájmu

Hybridomy se specifícitou pro HPB-ALL TCAR (receptor antigenu T-buňky) byly klonovány za použití techniky limitního ředění. Buňky byly naneseny na 96-jamkové kultivační misky s dvojnásobným sériovým ředěním hustoty buněk v rozmezí od 2 do 0,015 buňky/jamka. Nejlépe rostoucí kolonie s nejvyšší produktivitou byla vybrána pro opakování výše uvedeného postupu (dvakrát). Po těchto dvou přídavných kolech selekce byla identifikována jedna z výsledných kolonií, a ta byla označena zkratkou 4H11. mAb exprimovaná klonem 4H11 vysrážela při imunoprecipitaci molekuly identické s a a β řetězcem TCR vysrážením s β F1 mAb, která reaguje s konstantní oblastí β řetězce TCR. Tento výsledek ukazuje, že tato mAb vykazovala specifícitu vůči β řetězci TCR exprimovanému na T-buňkách HPB-ALL. Získaná protilátka byla označena smluveným označením TM23.

Charakterizace monoklonální protilátky TM23 z hybridomů 4H11

Isotypování TM23 mAb bylo provedeno za použití obchodně dostupné soupravy (Zymed, South San Francisco, Kalifornie, USA). Výsledky ukázaly, že se jedná o isotyp myší IgG2a/kappa.

Pro potvrzení anti-TCR reaktivity TM23 mAb byl proveden screening získané protilátky na schopnost komodulovat molekulu CD3 z povrchu buněk HPB-ALL. Dřívější studie ukázaly, že protilátky mAb k a nebo β řetězci TCR jsou schopny komodulovat CD3 z povrchu buňky, pokud

-16CZ 287298 B6 jsou buňky preinkubovány s anti-TCR mAb. Když byly buňky HPB-ALL předběžně inkubovány s TM23 byl pozorován významný pokles jejich reaktivity s anti-CD3 mAb Leu—4 ve srovnání s Leu-4 reaktivitou pozorovanou u neošetřených buněk.

Normální humánní PBL (periferní krevní lymfocyty) byly zkoušeny na reaktivitu sTM23. S TM23 reagovalo 1,6 až 3,0% studovaných T-buněk PBL. Tento výsledek je typický pro výsledky získané s několika jinými mAb, u nichž bylo ukázáno, že reagují se specifickými determinanty oblasti V.

Pro stanovení, zda se TM23 váže ke stejnému epitopu jako 1C1, mAb, která reaguje s humánní Vp 5.2 a 5.3 podtřídou (Boylston et al., 1986, J. Immunol. 137: 741), byla studována schopnost jedné mAb blokovat vazbu jiné mAb. Pokud byly buňky HPB-ALL nejprve inkubovány s TM23, vazba 1C1 konjugovaného s fluoresceinem byla inhibována. Také, když byly buňky inkubovány nejprve s 1C1 byla vazba k TM 12 inhibována. Tyto výsledky ukazují, že se TM23 a 1C1 vážou ke stejným nebo blízkým sousedním epitopům.

Pro další zjištění, zda v TM23 a 1C1 vykazují podobnou reaktivitu, byly připraveny linie PBL pomocí stimulace jinými mAb. Každá linie byla potom zkoušena na reaktivitu s každou mAb. Když byla PBL linie získána stimulací TM23, jak 1C1, tak 4H11 zreagoval s podobným procentickým podílem buněk. Totéž platí o PBL linie stimulované 1C1.

Pěstování kultury buněk 4H11

Klon 4H11, TM23.1 7-31-91 byl pěstován a expandován do média DMEM/F12 (1+1 s 1 % fetálního telecího séra, 100 μ/ml penicilinu, 100 μ/ml streptomycinu a 12,5mM glutaminu).

Příprava cDNA kódující těžký a lehký řetězec TM23

Asi 10⁸ buněk 4H11 bylo izolováno centrifugací a jednou promyto ledově chladným PBS. Celá RNA byla připravena za použití soupravy Promega RNAagents Total RNA Isolation Kit (Promega, katalogové číslo Z5110). Póly (A)⁺ RNA byla připravena za použití soupravy Promega PolyATract mRNA Isolaiton Systém (Promega, katalogové číslo Z5200). Myší IgG2a a kapa-specifická cDNA knihovna byla připravena za použití soupravy BRL SuperScript Kit (BRL, katalogové číslo 82Y8SA) s IgG2a primerem

5' ATATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTTAGT 3' a kappa primerem

5' ATATGCGGCCGCTTAACACTGATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAAT 3'

Tyto dva primery obsahují místa pro restrikční enzym Xho I a sekvence komplementární k 3' konci myší oblasti IgG2a a kappa-kódující oblasti. cDNA byla klonována do plazmidu pSPORT, dodaného v soupravě a transformována do E.coli DH5a kompetentních buněk elektroporací. Klony plazmidu nesoucí inserty o správné velikosti byly selektovány pro sekvenování.

Identifikace cDNA klonů kódujících těžkých a lehkých řetězec TM23 „Mini-prep“ plazmidová DNA s inserty o správné velikosti (klony lehkého řetězce č. 1,6, 19,20, 25 a 26 a klony těžkého řetězce č. 4, 9, 11, 15, 22 a 34) byly podrobeny sekvenování dvouřetězcovou DNA za použití sekvenační soupravy Sequencing Kit (USB, katalogové číslo 70770) s T7 primerem 5' vzhledem k DNA insertům. Sekvence klonů lehkého řetězce číslo 6, 20 a 25 a klonů těžkého řetězce č. 34 ukázaly, že se jedná o myší Ig klony. Klony lehkého řetězce č. 6, 20 a 25 měly identifické sekvence a klon č. 6 obsahoval bodovou mutaci; jednalo se o nefunkční klon. Klony č. 20 a 34 byly sekvenovány za použití primerů specifických vůči konstantní oblasti kappa

-17CZ 287298 B6

5' GACATTGATGTCTTTGGGGTAGAAGTTGTT 3' a IgG2a

5' GGTCACTGGCTCAGGGAAATAACCCTTGAG 3'

Výsledky opět ukázaly, že klon č. 6 byl nefunkční a klony č. 20 a 34 byly správné klony pro lehký a těžký řetězec. cDNA a aminokyselinová sekvence dedukovaná z těchto dvou klonů je uvedena na obr. 1.

V důsledku N-terminálního blokování bylo mikrosekvenování aminokyselin provedeno na bromkyanem vyštěpených peptidových fragmentech isolovaných z polyakrylamidových gelů. Aminokyselinové sekvence vnitřní oblasti V získané při tomto postupu byly konzistentní se sekvencemi dedukovanými z cDNA sekvencí. Tyto výsledky potvrdily, že izolované cDNA klony byly klony kódující těžký a lehký řetězec TM23.

Metodou, kterou popsali Kabat a Wu (viz výše uvedená citace) byly identifikovány oblasti CDR těžkého a lehkého řetězce (tyto oblasti jsou v obr. 1 zdůrazněny a podtrženy).

PCR izolace DNA oblasti V těžkého a lehkého řetězce a sekvenování DNA

Produkce chimérické protilátky TM23

Izolace myší VH DNA a NK DNA

Variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce MT23 byly upraveny pro inserci do expresních vektorů. Sekvence DNA kódující myší VH TM23 byly amplifíkovány z TM23MuVH.MuIgG2a pomocí PCR za použití oligonukleotidového primer VH1BACK (5' AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG 3') obsahujícího místo pro restrikční enzym Pst I a primer VH1FOR

5' TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG 3' který podobně obsahuje místo BstEII. M představuje C nebo A, S představuje C nebo G, R představuje A nebo G a W představuje A nebo T. Tato místa tím byla zavedena k 5' a 3' konci TM23VH DNA. Amplifíkovaná DNA byla rozštěpena Pstl a BstEII a ligována do Pstl a BstEII míst dvouřetězcové replikativní formy (RF) dna vektoru M13 VHPCR1, rozštěpeného stejnými enzymy.

Vektor M13 VHPCR1 je M13 fágovým vektorem odvozeným od M13-HuVHNP (Joned et al. (1986) Nátuře 321: 522 až 525) a obsahuje imunoglobulinový promotor, signální sekvenci a vhodná místa sestřihu (Orlandi et al. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 3833 až 3837). Ligovaná DNA byla transformována do kompetentního kmene E. coli TG1 (K12, delta(lac-pro), supE, thi, hsd D5 [F' tra D36, pro^{A B+}, lacO^q, lacZ Ml5]. Ze získaných rekombinantních fágových plaků byla připravena jednořetězcová DNA.

Sekvence DNA kódující myší VK TM23 byla amplifikována z TM23MuVK.MuCK pomocí PCR za použití oligonukleotidového primeru VK1BACK

5' GACATCCAGCTGACCCAGTCTCCA 3', který obsahuje místo PvuII a primeru VK1FOR

-18CZ 287298 B6

5' GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC 3' který obsahuje místo BglII ve spojení se dvěma překrývajícími se vnitřními primery sestrojenými za účelem odstranění místa HindlII v CDR3, oligo 943

5' CCGAGGAAGTTTAGTATACTG 3' a oligo 944

5' CAGTATAGTAAACTTCTTCGG 3' (Horton et al., 1990). Tím byla místa PvuII a BglII zavedena k 5' a 3' konci TM23 VK DNA. Amplifikovaná DNA byla rozštěpena pomocí PvuII a BglII a ligována do M13 VKPCR1 rozštěpeného PvuII a Bell. Enzymy BglII a Bell rozštěpily DNA za vzniku kompatibilních lepivých konců, které lze spolu ligovat.

M13VKPCR1 obsahuje stejný promotor, signální sekvenci a místa sestřihu jako M13 VHPCR1 (Orlandi et al. (1989)).

Ligovaná DNA byla transformována do E. coli TG1 a ze získaných rekombinantních fágových plaků byla získána jednořetězcová DNA.

Byly získány PCR produkty o správné velikosti (359 bp pro VH a 288 bp pro VK). VH DNA byla vložena do vektoru M13VHPCR1 za vzniku M13 MT23MuVH. VK DNA byla vložena do vektoru M13VKPCR1 za vzniku M13 TM23MuVK.

Potvrzena sekvencí DNA

Bylo potvrzeno, že byly klonovány správné sekvence DNA a že pomocí PCR nebyly zavedeny žádné nesprávné mutace. Dideoxymetodou (Sanger et al., 1977) za použití T7 DNA polymerasy nebo Sequenase byla získána sekvence jednořetězcové M13 fágové DNA úplné 823bp VH oblasti včetně promotoru, signální sekvence, místa sestřihu a 5' a 3' nepřeložené sekvence.

Dideoxymetodou popsanou výše byla získána sekvence jednořetězcové Ml3 fágové DNA úplné 630bp VK oblasti včetně signální sekvence, míst sestřihu a 5' a 3' nepřeložené sekvence.

Byly identifikovány klony DNA s požadovanou sekvencí pro TM23 VH přizpůsobenou pro inserci do expresního vektoru. Jeden z těchto klonů, č. 2, byl zvolen pro další práci. Zavedení požadovaných restřikčních míst, kterých bylo zapotřebí pro vložení VH do expresního vektoru, si vyžádalo jednu změnu aminokyseliny u N-konce; lysinu (K) v poloze 5 na glutamin (G) a jednu změnu u C-konce, tj. změnu šeřinu (S) v poloze 108 na threonin (T).

Byly identifikovány klony DNA s požadovanou sekvencí pro TM23 VK přizpůsobenou pro inserci do expresního vektoru. Jeden z těchto klonů, č. 4, byl zvolen pro další práci. Aminokyselinová sekvence CDR3 nebyla změna odstraněním místa HindlII, ale zavedení požadovaných restrikčních míst potřebných pro inserci VK do expresního vektoru mělo za následek tří aminokyselinové změny u N-konce: methioninu (M) v poloze 4 na leucin (L), threoninu (T) v poloze 7 na serin (S) a threoninu (T) v poloze 8 na prolin (P), jakož i jednu změnu u konce, tj. valinu (V) v poloze 105 na glutamin (E), v důsledku použitých primerů.

Klonování fragmentů DNA oblasti V do vektoru Ml3

Byl proveden přenos klonované myší variabilní oblasti do expresních vektorů obsahujících geny s humánní konstantní oblastí pro následující expresi protilátky v savčích buňkách.

-19CZ 287298 B6

Selekce IgG isotypu pro humanizaci

Isotyp humánní IgGl byl zvolen pro TM27 z následujících důvodů.

1) IgGl má schopnost zprostředkovat jak ADCC (cytotoxicitu vůči buňkám závislou na protilátce), tak CDC (cytotoxicitu závislou na komplementu). Proto může být účinnější při regulaci T-buněk νβ 5.2/5.3 směrem dolů; a

2) IgGl bylo při AB humanizaci používáno častěji.

Selekce humánní základní struktury pro CDR roub

Produkce humanizované protilátky TM23

Sestrojení sekvencí variabilní oblasti humanizované TM3

Byla provedena selekce sekvencí humánní základní struktury pro obdržení oblastí CDR TM23 a stanovení esenciálních myších zbytků, které musí být záměnou zavedeny do humánní základní oblasti. Za pomoci počítače byla provedena srovnání aminokyselinových sekvencí VH a VK TM23, a to jak se známými sekvencemi jiných myších protilátek, tak s VH a VK sekvencí humánní protilátky.

Bylo použito programu ALLIGN od firmy DNASTAR Ltd., Londýn, W139BL Velká Británie. Jako počítače bylo použito procesoru Compaq 386. Program AALIGN zkoumá přiřazení dvou proteinových sekveních za použití Lipman-Pearsonovy metody a Needleman-Wunschovy metody. Nejprve byly Liman-Pearsonovou metodou stanoveny nejlepší oblasti homologie. Potom bylo Needlemann-Wunschovou metodou zjištěno finální přiřazení sekvencí.

Zjištěné přiřazení bylo potom vyzkoušeno, přičemž obzvláště pozornost byla věnována takovým faktorům, jako jsou délka oblastí CDR a zbytky považované za kritické pro podepření konformace těchto oblasti CDR, jako jsou například polohy 71 a 94 a zbytky v blízkosti oblastí CDR (Tramontano et al. (1990); Foote a Winter (1992)).

Na základě porovnání s konsensuálními sekvencemi pro Kabatovy podskupiny byla myší VHTM23 přidělena do Kabatovy podskupiny VK V. V základních strukturách TM23 nejsou přítomny žádné aminokyselinové sekvence, které by byly pro tyto podskupiny neobvyklé.

Humánní protilátky NEWM a REI poskytly sekvence základní struktury pro VH a VK. V případě VH bylo kromě oblasti CDR použito myších zbytků 27 až 30 včetně a 71. Tyto zbytky základní struktury jsou považovány za důležité pro podepření konformace oblastí CDR (Foote a Winter (1992)). Zbytek 71 může fixovat relativní dispozice CDR1 a CDR2 podle toho, zdaje přítomen objemný postranní řetězec (lysin nebo arginin) nebo menší postranní řetězec (valin nebo alanin) (Tramontano et al. 1990). V NEWM VH byl tedy valinový zbytek v poloze 71 nahrazen lysinovým zbytkem, tak jako v TM23 VH. Zbytky 27 až 30 tvoří část strukturní, spíše než hypervariabilní, smyčky vázající antigen, jak ji definovali Chothia a Lesk (1987). Zbytky základní struktury 47 až 49 mohou být také důležité pro strukturu protilátky (Foote a Winter (1992)). Proto byly zkonstruovány dva alternativní humanizované těžké řetězce: jeden s isoleucinem (I) v poloze 48, tak jako v NEWM a jeden s leucinem v poloze 48, aby mohly být zachovány zbytky 47 až 49 z myší VH. Porovnání myší VH sekvence s humanizovanou verzí je ukázáno v příkladu 2.

Nebyly provedeny žádné změny v humánní základní struktuře REI zvolené pro TM23VK. Také porovnání myší VK sekvence s humanizovanou verzí je ukázáno v příkladu 2.

-20CZ 287298 B6

Popis savčího expresní vektor pTCSNeo

Plazmid pTCSNeo obsahuje jedinečné kolonovací místo Xhol, do něhož se vkládají geny, které jsou předmětem zájmu. Transkripce vloženého genu je poháněna regulačními sekvencemi, které se skládají zenhanceru SV40 umístěného před hlavním pozdním promotorem adenovirů 2 (Ad2 MLP). AD2 MLP je umístěna před tripartitní vedoucí sekvencí adenovirů. Vložený gen je lemován polyadenylačním signálem myšího imunoglobulinu kappa (Igk_apa) « 3' konce. Savčí selektovatelnost byla udělena genem rezistence vůči neomycinu (Neo^r). Tento plazmid také obsahuje bakteriální počátek replikace a β-laktamasový gen (Amp^r).

Konstrukce expresního vektoru pTCSLNeo

Dva komplementární aligonukleotidy se sekvencemi:

pozitivní,

5' CGACATCGATGATATCGAATTCGCGGCCGCCAGCTGGGGCCCTCTAGAC 3' a negativní,

5' CGAGTCTAGAGGGCCCCAGCTGGCGGCCGCGAATTCGATATCATCGATG 3' byla znovu teplotně hybridizány a ligovány do pTCRNeo rozštěpeného Xhol a vyplněného dT. Výsledný plazmid pTCSLNeo s polylinkerem, který sestává z většího počtu míst pro restrikční enzymy v následující orientaci:

5' XhoI/Xbal/Apal/PvuII/Notl/EcoRI/EcoRV/Clai 3' je vhodný pro vložení genu, který je předmětem zájmu, za účelem exprese. Gen neo^r může být stejně dobře změněn na jiné selekční markerové geny.

Konstrukce expresního vektoru pTCSLDHFR

Gen neo^r v pTCSLNeo se odstraní štěpením restrikčním enzymem HindlII a BamHI a religuje s fragmentem genu myší mutantní DHFR (dihydrofolát reduktasou) (DHFR.) vytvořeným štěpením HindlII a BamHI plazmidu pSV2-DHFR., získaného od Dr. Paula Berga (Department of Biochemistry, Stanford University Medical School).

Popis plazmidu pSV184 H-Neo/DNS-Vk_appaC_kap_pa

Plazmid pSV184 deltaH-Neo/DNS-VkappaCkappa (získaný od Dr. lee Herzenberga, Standford University Medical School - viz diplomová práce Jefferyho Dangla, str. 48 až 67) představuje myší V a humánní C chimérický konstrukt, v němž byl přesmyknutý genový segment oblasti V-J kappa řetězce izolovaný z myšího hybridomu specifického vůči Dansylchloridu fúzován k humánnímu genomovému Ck_appa fragmentu (pSV184 deltaH-Neo-Ckappa)Izolace konstantní oblasti humánního kappa řetězce PCR metodou

Za použití nerozštěpeného plazmidu pSV184deltaH-Neo/DNS-VkappaCkappa (pSVHuk), který obsahuje konstantní oblast humánního kappa řetězce, se provede PCR se dvěma primery (jedním forward a jedním reverzním) za účelem izolace konstantní oblasti. Oligomer (primery) byly získány od firmy Operon. Jako reakčních činidel pro PCR reakci bylo použito činidel ze soupravy GeneAmp DNA Amplification Reagent Kit s AmplyTaq (Perkin-Elmer Cetus). Reakce PCR byly prováděny při těch různých koncentracích hořečnatých iontů. Alikvoty PCR produktů byly analyzovány na 1% agarosovém gelu. Byl vybrán PCR produkt z prvního vzorku (koncentrace hořečnatých iontů l,5mM). Primery lemující C oblast byly navrženy tak, aby obsahovaly místa pro restrikční enzymy pro účely klonování. Amplifikovaná DNA byla tedy

-21CZ 287298 B6 rozštěpena EcoRI (u 3' konce). Místo u 5' konce (PvuII) rozštěpeného nebylo. Rozštěpený fragment DNA byl potom rozdělen na 1% agarosovém gelu a byl vyříznut 300bp pás. DNA bylo extrahováno z gelu a malý alikvot byl analyzován na 1% agarosovém gelu pro kvalitativní analýzu a kvantitativní odhad. 300bp pás se zdál být čistý a odhadnuté celkové množství DNA bylo asi 140 ng.

Klonování konstantní oblasti humánního kappa řetězce do vektoru pBS KS⁺ a sekvenování

Fragment DNA konstantní oblasti humánního kappa řetězce vyštěpený EcoRI byl vložen do vektoru pBS KS⁺, který byl rozštěpen Smál a EcoRI za použití T4 DNA ligasy. Této liganční směsi bylo použito pro transformaci E. coli DH5a kompetentních buněk. Byly odebrány jednotlivé kolonie, a poté jich bylo použito pro inokulaci 24 kapalných kultur. Z každé z těchto kultur byla připravena DNA. Každý vzorek DNA byl štěpen PvuII (5' konec C_kappa) EcoRI (3' konec C_kappa) a analyzován na 2% agarosovém gelu. V důsledku obtíží při separaci nižších pásů (300 bp) byly vzorky DNA štěpeny pouze PvuII. Po analýze na 2% agarosovém gelu vykazovalo 19 z 24 vzorků správný C_kappa insert. Pro sekvenování byly zvoleny vzorky č. 1 až 5 (z 19 správných vzorků). Sekvenování bylo provedeno za použití T7 a T3 primerů (sekvence ve vektoru lemující insert). Jiná reakční činidla pro sekvenování pocházela ze soupravy Sequense Version 2.0 Kit (USB). Vzorek č. 5 vykázal správnou sekvenci konstantní oblasti humánního kappa řetězce.

Klonování konstantní oblasti humánního kappa řetězce do savčího expresního vektoru pTCSLDHFR* za vzniku pTCSLC_kappaDHFR*

Z vektoru pBS KS (vzorek č. 5) byla za použití restrikčních enzymů PvuII a EcoRI izolována konstantní oblast humánního kappa řetězce. S ohledem na výše uvedené problémy s oddělováním pásů bylo však druhé štěpení provedeno s konstruktem pBS/Humánní C_kappa. Druhé štěpení zahrnovalo EcoRI a Xbal (byly umístěny ve směru 5' vzhledem k místu PvuII) a tak byl získán asi 300bp fragment. Tento fragment byl potom purifíkován na gelu a podroben štěpení PvuII, aby došlo k odstranění zbývajícího malého fragmentu vektoru u 5' konce Ck_appa. Tento výsledný fragment byl purifíkován na gelu a potom analyzován na 1% agarosovém gelu za účelem kvalitativního posouzení a odhadu množství. Ukázalo se, že Ck_appa DNA představuje čistý pás (asi 280bp) a jeho celkové množství bylo odhadnuto na asi 135 ng.

V důsledku přítomnosti tří míst EcoRI v expresním vektoru pTCSLDHFR* bylo rozhodnuto, že nejlepší bude klonování pouze do místa PvuII. Jelikož byla Cka_ppa DNA připravena štěpením pomocí PvuII-EcoRI, byl EcoRI konec opraven (za vytvoření tupého konce) s použitím Klenowova fragmentu. Opravená Ck_appa DNA s tupým koncem byla ligována do vektoru pTCSLDHFR*, který byl štěpen PvuII a zpracován fosfatasou (za použití fosfatasy ze střev telete). Této ligační směsi bylo použito pro transformaci E. coli DH5a kompetentních buněk. Byly odebrány jednotlivé kolonie, a poté jich bylo použito pro inokulaci 24 kapalných kultur. Z každé z těchto kultur byla připravena DNA. Každý vzorek DNA byl štěpen PvuII a HindlII a analyzován na 1% agarosovém gelu. Bylo zjištěno, že 5 vzorků z 24 obsahovalo C_kappa invest ve správné orientaci. Pro další pokračování bylo použito vzorku č. 7.

Nahrazení mutantního genu DHFR* genem DHFR divokého typu

Pro expresi vektoru pTCSLC_kappaDHFR* v buňkách CHO (dhfr.)DUX Bil byl gen DHFR* nahrazen genem DHFR. DNA zpTCSLC_kappa DHFR* (vzorek č. 7), jakož i zpSV2-DHFR (plazmid získaný od Dr. Paula Berga z Department of Biochemistry, Stanford University Medical School) byl štěpen restrikčními enzymy HindUI a BglII za účelem izolace příslušných genových fragmentů. Po analýze bylo zjištěno, že případné místo BglII ve vektoru pTCSLCkappaDHFR* odstranilo také část místa polyA, což by mohlo interferovat s funkcí vektoru. Proto byla štěpení opakována za použití Hindm a BamHI. Část (DHFR*)pTCSLC_kappa tohoto vektoru byla

-22CZ 287298 B6 zpracována fosfatasou. Potom byly oba izolované fragmenty (pTCSLC_kappa a DHFR) puntíkovány na gelu a analyzovány na 1% agarosovém gelu (kvalitativně a pro odhad kvantity). Oba pásy se zdály být čisté a jejich odhadnutá koncentrace je podobná, tj. asi 40 a asi 50 ng/ml. Gen DHFR byl ligován do vektoru pTCSLC_kappa za použití T4 DNA ligasy. Této ligační směsi bylo použito pro transformaci E. coli DH5a kompetentních buněk. Byly odebrány jednotlivé kolonie, a poté jich bylo použito pro inokulaci 24 kapalných kultur. Z každé z těchto kultur byla připravena DNA. Každý vzorek DNA byl analyzován štěpením restrikčními enzymy HindlII a BamHI. Bylo zjištěno, že 23 vzorků z 24 obsahovalo správný pás ukazující vložení genu DHFR do vektoru pTCSLC_kappa. Pro další pokračování bylo použito vzorku č. 22.

In vitro mutageneze na konstruktu CDR roubovaných oblastí V s humánní základní strukturou

Konstrukce humanizovaných variabilních genů

Humanizovaný gen VH byl zkonstruován místně orientovanou mutagenezí templátů Ml3 VHPCR1, který obsahuje syntetický gen VH s oblastmi základní struktury proteinu NEWM humánního myelomu (viz Jones et al., 1986). Jednořetězcová templátová DNA byla připravena z Ml3 VHPCR1 pěstovaného v duť, ung’ E.coli kmene RZI 032, aby templátová DNA obsahovala uracin místo phyminu. Byly syntetizovány mutagenní oligonukleotidové primery pro kódování oblastí CDR TM23 a přibližně 15 bp perfektně odpovídají lemovací sekvence na každé straně. Pokud sekvence CDR MT23 odpovídala templátové sekvenci, bylo použito kratších oligonukleotidových primerů. Bylo použito těchto primerů:

CDR1

5' TGGCTGTCTCACCCAGTTTACACCATAGGCGGTTAATGAGAAGCCAGACACGG 3'

CDR2

5' TGCTGGTGTCCTTTCAGCATTGTCACTCTGGATTTGAGAGCTGAATTATAGTCT GTATTTCCATCACCCCATATCATTCCAA^t/_gCCACTCAAGACC 3', aCDR3

5' CCAGTAGTCCATAGCATAGAGGGTAGCCGTAACCCTATCTCTTG CACAATAATAG 3'.

Oligonukleotidový primer pro CDR byl prodloužen u 3' konce, aby zahrnoval požadované zbytky v polohách 27 až 30. Byl vytvořen směsný oligonukleotid pro CDR2 a tento byl u 3' konce CDR prodloužen buď G, nebo T v poloze báze 402 VH za vzniku dvou alternativních kodonů, takže poloha 48 VH byla změněna na L nebo I. Oligonukleotidy (vždy 10 pmol) byly fosforylovány 5 jednotkami T4 polynukleotidy kinasy v celkovém objemu 50 μΐ při 37 °C po dobu 1 hodiny. Jeden pmol každého mutagenního primerů a pmol M13 sekvenčního primerů 3' vzhledem ke genu V bylo teplotě hybridizováno k 0,5 pg templátů v celkovém objemu 20 μΐ 30sekundovým zahříváním na 90 °C, rychlým ochlazením na 70 °C a pomalým zahřátím na 37 °C. Teplotně hybridizované primery byly potom prodlouženy a ligovány s přídavkem T7 DNA polymerasy a T4 DNA ligasy a inkubovány jednu hodinu při teplotě místnosti. Templátová DNA obsahující uráčil byla odstraněna zpracováním DNA jednou jednotkou uráčil DNA glykosylasy při 37 °C po dobu 1 hodiny, přičemž byl získán neporušený mutovaný řetězec. Tato DNA byla amplifikována PCR a potom analyzována elektroforézou na agarosovém gelu pro potvrzení, že byla vytvořena DNA o správné velikosti. Tato DNA byla rozštěpena HindUI a BamHI a ligována do míst HindlII a BamHI M13mpl9.

Podobně byl zkonstruován přetvořený gen TM23 VK (TM23HuVK) mutagenezí M13 fágového templátů obsahujícího sekvenci DNA genu VK s oblastmi základní struktury humánního BenceJonesova proteinu REI. Ten byl získán zM13 VKPCR1, kterého bylo použito při konstrukci

-23CZ 287298 B6 chimérického lehkého řetězce s odstraněnými místy pro restrikční enzymy PvuII a Bell použitými pro klonování. Bylo použito následujících primerů:

CDR1

5'TCTGCTTGGTACCAGTTTAAATAATTGCTAATGCCCTGACTTGCACTACAG GTGATGGTC 3'

CDR2

5' TCTGCTTGGCACACCTGAGTGTAAACTTGATGTGTAGTAGATCAGCAGCTT3', aCDR3

5' CCCTTGGCCGAACGTCCGAGGAAGTTTACTATACTGCTGGCAGTAGTAG 3'.

Byly získány PCR produkty očekávané velikosti, 823 pb pro oba VH a 620 bp pro VK a klonovány do vektoru M14mpl9.

Ověření sekvencí DNA humanizované variabilní oblasti

Bylo potvrzeno, že byly vloženy požadované oblasti CDR a že nedošlo k žádným nesprávným změnám a že byly zkonstruovány správné humanizované VH a VK geny. Úplné variabilní oblasti byly sekvenovány didooxymetodou za použití T7 DNA polymerasy nebo Sequenase. Klony poskytující očekávanou sekvenci dvou VH byly selektovány a označeny názvy M13 TM23NMVH a M13 TM23NMVHL. Byl selektován klon č. 11 poskytující očekávanou sekvenci přetvořeného VK a tento klon byl označen názvem Ml3 MT23HuVK.

Klonováním přesmyknutých oblasti V myelomových expresních vektorů (Klonování humanizovaných variabilních oblasti MT23 do expresních vektorů)

Klonované humanizované variabilní oblasti byly přeneseny do expresních vektorů obsahujících geny humánní konstantní oblasti pro následující expresi protilátky v savčích buňkách. Z Ml3 TM23NMVH a M13TM23NMVHL byly izolovány dva humanizované VH geny jako fragmenty HindlII až BamHI a tyto fragmenty byly ligovány do HindUI a BamHI míst expresního vektoru těžkého řetězce, pSVGPT.HulgGI.

Z M13 TM23Hu VK byl izolován humanizovaný VK gen jako fragment HindUI až BamHI a tento fragment byl ligován do míst HindUI a BamHI expresního vektoru lehkého řetězce, pSVhvg.HuCK.

Analýza restrikčním enzymem ukázala, že dva alternativní humanizované VH byly správně vloženy do vektoru těžkého řetězce za vzniku plazmidů pSVgptTM23NMVH.HuIgGl a pSV gptNMVHL.HulgG 1.

Podobně byl humanizovaný VK správně vložen do vektoru lehkého řetězce za vzniku plazmidu pSVhygTM23HuVK.HuCK.

Kotransfekce konstruktů H a L řetězce do buněk NSO

Kotransfekce genů humanizovaného těžkého a lehkého řetězce

Humanizované expresní plazmidy byly přeneseny do linií savčích buněk NSO a P3-8.653F8879.

Humanizované expresní plazmidy byly kontrasfekovány do buněk NSO a P3-8.6538879 za použití stejných postupů, jakých bylo použito u chimérických expresních plazmidů. Dva plazmidy s humanizovaným těžkým řetězcem pSVgptTM23NMVH.HuIgGl a

-24CZ 287298 B6 pSVgptNMVHL.HulgGI byly kontransfekovány splazmidem humanizovaného lehkého řetězce pSVhygTM23HuVK.HuCK za vzniku buněčných linií exprimujících dvě alternativní humanizované protilátky, tj. TM23HuVH/HuVK a TM23HuVHL/HuVK. Tyto expresní plazmidy byly také kontrasfekovány v kombinaci s chimérickými expresními plazmidy za vzniku buněčných linií exprimujících hybridní protilátky TM23HuVH/MuVK, TM23HuVHL/MuVK a TM23MuVHL/HuVK. Tyto hybridní protilátky představovaly důležitý prostředek pro zjištění příčiny jakýchkoliv vazebných defektů jak k těžkému, tak k lehkému řetězci v humanizované protilátce.

Po 14 dnech po transfekci byly kolonie NSO buněk pozorovatelné u všech různých plazmidových kombinací. Ze všech zaočkovaných misek byla získána pouze jedna jediná kolonie buněk P3-8.653F8879, a tyto byly tedy vyhozeny.

Selekce pozitivních klonů humánního IgGl/kappa

Selekce buněk produkujících humánní protilátku

Byly izolovány buněčné linie NSO produkující humanizovanou a hybridní chimérickou/humanizovanou protilátku. Vzorky supematantu z jamek obsahujících buněčné kolonie byly podrobeny zkoušce ELISA.

TM23HuVH/HuVK:

Byly selektovány buňky NSO ze 4 jamek, v nichž supematant kultury poskytl nejvyšší hodnotu při stanovení ELISA; D5, D10, C6 a El 1. Jamka D5 obsahovala dvě viditelné kolonie, ostatní jamky po jedné. Buněčné linie produkované z těchto kolonií však nutně nemusely být klonální. Buněčné linie z těchto jamek byly kultivovány a zmrazený v kapalném dusíku a označeny MT23HuVH/HuVKD5, D10, C6 aEll.

TM23HuVHL/HuVK:

Byly selektovány buňky NSO ze 40 jamek, v nichž supematant kultury poskytl nejvyšší hodnotu při stanovení ELISA; B2, B7, D8 a E9. Jamka E9 obsahovala dvě viditelné kolonie, ostatní jamky po jedné. Buněčné linie produkované z těchto kolonií však nutně nemusely být klonální. Buněčné linie z těchto jamek byly kultivovány a zmrazený v kapalném dusíku a označeny TM23HuVHL/HuVK B2, B7, D8 a E9.

TM23HuVH/MuVK:

Byly selektovány buňky NSO ze 4 jamek, v nichž supematant kultury poskytl nejvyšší hodnotu při stanovení ELISA; D9, E6, F10 a G10. Jamky F10 a G10 obsahovaly dvě viditelné kolonie, ostatní jamky po jedné. Buněčné linie produkované z těchto kolonií však nutně nemusely být klonální. Buněčné linie z těchto jamek byly kultivovány a zmrazený v kapalném dusíku a označeny MT23HuVH/MuVK D9, E6, F10 a G10.

TM23HuVHL/MuVK:

Byly selektovány buňky NSO ze 4 jamek, v nichž supematant kultury poskytl nejvyšší hodnotu při stanovení ELISA; B8, C6, D2 a D8. Jamky C6 a D8 obsahovaly dvě viditelné kolonie, ostatní jamky po jedné. Buněčné linie produkované z těchto kolonií však nutně nemusely být klonální. Buněčné linie z těchto jamek byly kultivovány a zmrazený v kapalném dusíku a označeny TM23HuVHL/MuVK B8, C6, D2 a D8.

-25CZ 287298 B6

TM23MuVH/HuVK:

Byly selektovány buňky NSO ze 4 jamek, v nichž supematant kultury poskytl nejvyšší hodnotu při stanovení ELISA; B9, G4, G6 a Gll. Všechny jamky obsahovaly přinejmenším 4 viditelné kolonie. Buněčné linie produkované z těchto kolonií však nutně nemusely být klonální. Buněčné linie z těchto jamek byly kultivovány a zmrazený v kapalném dusíku a označeny TM23MuVH/HuVK B9, G4, G6 a G11.

Syntéza prvního řetězce cDNA pro expresi buněk CHO

Příprava cytoplazmatická RNA

Byla připravena RNA pro reverzní transkripci. Nádoba s buňkami NSO TM23 HuVHL/HUVK byla vyjmuta z kapalného dusíku a buňky byly ponechány rychle roztát při 37 °C. Potom byly buňky postupně zředěny 10 ml Dulbeccem modifikovaného Eagleova média/Ham F12 (DMEM/F12) doplněného antibiotiky a 5 % fetálního telecího séra neobsahujícího gammaglobulin (GG-prosté FBS). Buňky byly odstraněny při frekvenci otáčení 1 500 min'¹ (5 minut), médium bylo odstraněno a buňky byly resuspendovány ve 20 ml čerstvého média v nádobě 75 cm². Poté byla kultura expandována na 30 ml v nádobě 175 cm². Aktivně rostoucí buňky byly sklizeny centrifugací a třikrát promyty chladným roztokem chloridu sodného pudrovaným fosforečnanem (PBS). Cytoplazmatická RNA byla z buněk připravena způsobem, kteiý popsali Favoloro et al. (1980). Celkem bylo získáno 350 pg cytoplazmatické RNA.

Syntéza cDNA

První řetězec cDNA byl připraven pro oblast VH a VK. cDNA variabilní oblasti prvního řetězce byly syntetizovány reakcemi za použití 5 pg RNA, 250pM deoxynukleotidtrifosfátů (dNTP), 15 jednotek inhibitoru ribonukleasy (Pharmacie RNAguard) a 25 pmol oligonukleotidového primeru.

Pro VH byl jako primer použit oligo 1109

5' GGGGAAGACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACC 3' a pro VK byl jako primer použit oligo 1095

5' AGATTTCAGCTGCTCATCAGATGGCGGGAAGATGAAGACAGATGG 3'

Reakční směs byla zahřívána na 70 °C po dobu 10 minut a potom pomalu ochlazena na 37 °C. Bylo přidáno 100 jednotek reverzní transkriptasy z viru myší leukemie Moloney a reakční směsi byly inkubovány 30 minut při 37 °C.

cDNA byly amplifikovány pomocí PCR za použití výše uvedených primerů ve spojení s oligo 1096 proVH

5' GCCGCTCGAGCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAG 3' a oligo 1094 pro VK

5'GCCGCTCGAGCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTT GGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGACATCCAGATGACCCAGAG 3'.

Produkty PCR byly podrobeny zkoušení elektroforézou na agarosovém gelu a bylo zjištěno, že mají očekávanou velikost (přibližně 450 bp). Pásy DNA byly purifikovány z gelu.

-26CZ 287298 B6

Štěpení restrikčními enzymy

Produkty PCR byly štěpeny za účelem klonování do vektorů CHO. VH PCR produkt byl štěpen Xhol a Apal. VK PCR produkt byl štěpen Xhol a PvuII. Vzorky rozštěpených DNA byly podrobeny elektroforéze na 0,8% agarosovém gelu. Byly pozorovány pásy s očekávanou velikostí 450 bp.

Izolace oblastí V [V_H (TCS a S) a V_kappa (S)] z cDNA pCR amplifikací V_H (TCS)

Byly získány vzorce cDNA prvního řetězce TM27 V_kappa a TM27 V_H, jakož i oligonukleotidové primery použité pro amplifíkaci těchto molekul pomocí PCR. PCR za použití TM27 Vh cDNA a vhodných primerů byla provedena za pomoci Taq polymerasy. Produkt byl zpracován na agarosovém gelu a purifikován za použití soupravy Geneclean II (BiolOl). Získané množství bylo odhadnuto na 1,5 ng/ml.

Transfekce buněk CHO pomocí pSRlNeo4Hll (lehký) a pBJ14Hll (těžký) pro izolaci cDNA oblasti C

Savčí expresní vektory pSRÍNeo a pBJl jsou deriváty pcDL-SRa296 (Takeba et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 466), jak je to popsáno vLin et al. (1990) Science 249: 677, přičemž místo Xhol ležící mezi promotorem SRa a polyadenylačním místem SV40 bylo za účelem snadnějšího klonování genu na nahrazeno polylinkem obsahujícím následující restrikční místa:

5' Xhol/Xbal/Sfil/Notl/EcoRI/EcoRV/HindlII/Clal 3'

Do pSRÍNeo byl vložen gen rezistence vůči neomycinu mezi gen rezistence vůči ampicilinu a promotor SRa. cDNA kódující vedoucí sekvenci a oblast V-D-J těžkého řetězce TM23 byla nejprve fúzována ke konstantní oblasti těžkého řetězce genomu, načež následovalo vložení do vektoru pBJl rozštěpeného Xhol a Notl, za vzniku pBJ14Hll (těžký). Podobně byla cDNA kódující vedoucí sekvenci a oblast V-J lehkého řetězce nejprve fúzována ke genomovému fragmentu kappa, načež následovalo vložení do vektoru pSRÍNeo rozštěpeného Xhol a Notl, za vzniku pSRlNeo4Hll (lehký). Tyto dva plazmidy, pBJ14Hll (těžký) a pSRlNeo4Hll (lehký), byly potom kotransfekovány do buněk COS-7 (buněčná linie z ledvin opice Cercopithecus aethiops sabaues transformovaná SV40, ATCC CRL 1651) pro tranzientní expresi.

Izolace konstantní oblasti humánního IgGl cDNA konstantní oblasti humánního IgGl byla připravena zpoly(A)⁺RNA izolované z transfektovaných buněk COS pomocí PCR za použití primerů konstantní oblasti IgGl:

forward primer:

5' GCGTGACAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTC 3' a reverzní primer:

5' GCGTGACAAGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTT 3'.

PCR fragment DNA konstantní oblasti s místem EcoRI u 3' konce (lemujícím kódující oblast) a místem Apal u 5' konce (v kódující oblasti) byl klonován do plazmidu pBS KS⁺ za účelem subklonování a sekvenování. Celá konstantní oblast byla sekvenována za použití primerů T3 a T7 doplněných interními primeiy konstantní oblasti. Klon se správnou sekvencí byl potom subklonován do plazmidu pTCSLNeo za vzniku plazmidu pTCSLCglNeo.

-27CL 287298 B6

Konstrukce plazmidu pTCSLCglNeo

Klon IgGICgl se správnou sekvencí VpBS KS⁺ byl rozštěpen za použití restrikčních enzymů EcoRI a Apal a ligován do pTCSNeo rozštěpeného stejnými enzymy. Výsledného plazmidu, 5 pTCSLCglNeo bylo použito pro další modifikaci vedoucí k pTCSLCglNeoApa’.

Eliminace místa Apal v pTCSLC_kappalNeo za vzniku pTCSLC_kappalNeoApa*

Expresní vektor pTCSLC_kappalNeo-CHO obsahuje dvě místa pro restrikční enzym Apal: jedno místo leží v oblasti polylinkeru a tohoto místa bylo použito pro vložení klonovaných fragmentů. Druhé místo leží právě vedle genu neo^r ve směru 3+. Pro zjednodušení následující klonovacích stupňů se místo Apal v blízkosti neo^r eliminuje. Plazmid pTCSLCka_PpalNeO se částečně rozštěpí Apal. Malý alikvot získaného produktu se analyzuje na agarosovém gelu za účelem prověření přítomnosti lineárních molekul (tj. plazmidů rozštěpených pouze v jednom ze dvou míst Apal).

Na rozštěpený materiál se potom působí T4 DNA polymerasou, kterou se selektivně odstraní jednořetězcová prodloužení zanechaná Apal, aniž by došlo k rozštěpení dvouřetězcové DNA. Plazmidy byly potom recirkularizovány ligací a transformovány do HB101 kompetentních buněk E. coli. Bylo izolováno 30 transformantů a těmito transformanty byly inokulovány kapalné kultury. Z každé kultury byla připravena DNA, a po rozštěpení Apal byla podrobena zkoušení na 20 agarosovém gelu. Při těchto štěpeních byla bohužel plazmidová DNA degradována. Štěpení Apal bylo opakováno na 21 z 30 vzorců. Dva izoláty (č. 4 a 12) se zdály být linearizované působením Apal, zatímco všechny ostatní byly rozštěpeny ve dvou místech. Dva kandidáti těchto klonů byly potom rozštěpeny Apal a HindlII, aby se zjistilo, které místo Apal bylo přítomno. Při této zkoušce se zjistilo, že bylo eliminováno (tak, jak bylo požadováno) místo Apal umístěné ve 25 směru 3' k neo^r v pTCSLC_kappalNeoApa. (izolát č. 12). Byla provedena ještě další restrikční štěpení, která potvrdila strukturu tohoto izolátu.

Klonování oblastí V humánního kappa a těžkého řetězce izolovaných PCR do vektorů CHO, pTCSLC_kappaDHFR a pTCSLCglNeoApa*

Klonování fragmentu TM27 V_kappa do pTCSLC_kappaDHFR cDNA oblasti V kappa řetězce pro TM27 byla purifikována na gelu a rozštěpeny příslušnými restrikčními enzymy. Malý alikvot vzorku DNA byl analyzován na 1% agarosovém gelu pro 35 odhad kvantity a ověřený kvality. Případný pás (odpovídající nečistotě) byl pozorován při asi 800 bp a koncentrace byla odhadnuta na 1,25 ng/ml. Oblast V byla ligována do vektoru pTCSLC_kappaDHFR, který byl rozštěpen restrikčními enzymy Xhol a PvuII a zpracován fosfatasou. Ligační směsi bylo použito pro transformaci E. coli DH5a kompetentních buněk. Výtěžek kolonií transformantů byl velmi nízký. Jednotlivé kolonie byly sesbírány a bylo jich 40 použito pro inokulaci 12 kapalných kultur. Z každé z nich byla připravena DNA, a ta byla poté rozštěpena Xhol a PvuII a analyzována na 1% agarosovém gelu. Byly získány dva pozitivní vzorky, vzorek č. 3 a 4. Oba tyto pozitivní vzorky byly sekvenovány.

Klonování fragmentu Vh TM27 do pTCSLC_kappaINeoApa*

PCR produkt odpovídající oblasti Vh TM27 byl purifíkován na gelu a rozštěpen příslušnými restrikčními enzymy (Xhol a Apal). Jelikož však bylo pozorováno, že štěpení Apal zřejmě neproběhlo do konce, toto štěpení bylo opakováno. Malý alikvot byl analyzován na agarosovém gelu za účelem odhadu kvantity a ověření kvality. Koncentrace pásu odpovídajícího oblasti V_H 50 byla odhadnuta na 0,4 ng/ml. Tak jako tomu bylo v případě fragmentu V_kappa, byl i zde pozorován pás o délce asi 800 bp, což ukazuje, že čistota této látky neodpovídala předpokladům. Oblast Vh byla ligována do vektoru pTCSLC_kappalNeoApa*, který byl rozštěpen restrikčními enzymy Xhol a Apal a zpracován fosfatasou. Ligační směsi bylo použito pro transformaci E. coli DH5a kompetentních buněk. Bylo získáno velmi málo transformantů. Bylo sesbíráno 6 kolonií a všech

-28CZ 287298 B6 bylo použito pro inokulaci kapalných kultur. Z každé z nich byl připraven minipreparát DNA, a ten byl štěpen Xhol a EcoRI a poté analyzován na agarosovém gelu. Z první ligace byl získán jeden klon, pTCSLHuV_H4HC_kappaNeoApa* (izolát č. 16). Pro získání většího počtu klonů přicházejících v úvahu (v případě, že by jediný izolát č. 6 neobsahoval správnou sekvenci při následujících zkouškách) byly provedeny další ligace za použití 1) Vh PCR produktu repurifikovaného na agarose s nízkou teplotou tání za účelem odstranění vysokomolekulámího kontaminačního pásu a 2) V_H PCR produktu syntetizovaného za použití cDNA a primerů. Z těchto ligačních reakcí bylo získáno 8 dalších transformantů, které byly analyzovány a z nich bylo vybráno 5 kandidátů, jako klonů pro další postup: izoláty č. 9, 10, 11, 12 a 14.

Sekvenování klonovaných oblastí V v obou řetězcích pro potvrzení očekávané sekvence DNA

Primery navržené pro usnadnění sekvenční analýzy DNA oblastí V vyložených do vektorů pTCSLC_kappalNeoApa’ a pTCSLC_kappaDHFR byly získány od firmy Operon Research. Forward primer byl umístěn do sekvencí vektoru pTCS a bylo ho použito pro sekvenování V insertů jak ve vektoru pTCSLC_kappalNeoApa‘, tak ve vektoru pTCSLC_kappaDHFR. Reverzní primery byly umístěny do sekvence C_kappa nebo C_kappal a bylo jich použito pro sekvenování V_kappa a V_H insertů.

Sekvenování dvouřetězcové DNA oblasti V humánního kappa řetězce

Dva vzorky TM23 (č. 3 a 4) byly sekvenovány v obou řetězcích. Reverzní řetězec byl sekvenován úplně prostřednictvím míst pro restrikční enzymy (3' - 5'; PvuII-XhoI) za použití primeru HUCK5PR. Sekvence forward řetězců byla stanovena za použití dvou různých primerů TPCSFOR a PTCSFWD. Zkombinování sekvencí získaných za použití každého z primerů byla získána sekvence o plné délce (prostřednictvím míst pro restrikční enzymy 5'-3'; XhoI-PvuH). Bylo zjištěno, že ve forward řetězcích existuje malá oblast komprese, která nebyla rozštěpena kterýmkoliv z primerů, ani za použití sekvenační metody, jež takové komprese zmenšuje. Reverzní řetězec všech v této oblasti vykazoval správnou sekvenci. Oba vzorky č. 3 a 4 měly správnou sekvenci. Pro transfekci savčích buněk byl zvolen vzorek č. 4.

Sekvenování dvouřetězcové DNA oblasti V gamma řetězce MT27

Fragmenty V_H pTCSLHuVHC_kappalNeoApa* (izoláty č. 6 a 9) byly úplně sekvenovány v obou řetězcích. Humanizovaný fragment V_H izolátu č. 6 odpovídal očekávané sekvenci v kódující oblasti. Tento fragment obsahoval substituci jednoho bázového páru (C na T v poloze -2, vzhledem k počátečnímu ATG), od níž se neočekávalo ovlivnění exprese. Fragment V_H izolátu č. 9 obsahoval v kódovací oblasti dvě substituce. Další čtyři klony přicházejí v úvahu nebyly sekvenovány.

Kotransfekce buněk COS a CHO TM27 a kontrolními plazmidy

Jako recipientních buněk bylo použito buněk CHO dhfr.DUX Bila COS-1. Buněčná linie CHO DUX Bil byla získána od firmy Biogen inc. Pro transfekci buněk CHO bylo 5 pg plazmidů TM27 pTCSLHuVkapp^HCkapJJHFR (izolát č. 4) a pTCSLHuV_H4HC_kappalNeoApa· (izolát č. 6) linearizováno, a stejně tak byly linearizovány vektory pTCSLDHFRApa* a pTCSLNeoApa’, vždy štěpením restrikčním enzymem AatlI. Plazmidy obsahující TM27 (označené jako „TM27L“) byly koprecipitovány v ethanolu a resuspendovány ve vodě. Podobně také vektorové plazmidy (označené jako „kontrola“) byly koprecipitovány a resuspendovány ve vodě. Každý z koprecipitovaných plazmidů byl elektroporací transfekován do 10⁷ buněk CHO za použití zařízení BioRad Gene Pulser při 250 V a 960 mF. Transfekované buňky byly potom pěstovány v a minimálním esenciálním médiu (aMEM) doplněné thymidinem, adenosinem a deoxydenosinem (neselektivní médium) dva dny před selekcí.

-29CZ 287298 B6

Pro transfekci COS bylo 5 pg nerozštěpených plazmidů TM27L a vektorových plazmidů koprecipitováno v ethanolu a resuspendováno ve vodě. Plazmidy byly elektroporací transfekovány do 4,1 x 10⁶ buněk COS. Transfekované buňky byly pěstovány 3 dny vDulbeccem modifikovaném Eagelově médiu (DMEM) a potom byly supematanty sklizeny pro další zkoušení.

Analýza supematantů transfektů COS humánní IgGl ELISA a barvením

Produkce humánního IgG v buňkách COS byla měřena humánní IgGl ELISA na supematantech buněčných kultur. Mikrotitrové misky byly potaženy myším antihumánním IgGl Fc protilátkou v PBS a blokovány v blokovacím pufru (1% BSA v PBS). Supematanty byly přidány ve 100μ1 vzorcích; vodná ředění blokovacím pufrem byla prováděna podle potřeby. Zachycený IgG byl detegován konjugátem křenové peroxidasy a kozí antihumánní Igka_PPa protilátky a dále OPD (orthofenylendiaminem). Supematanty z TM27L-transfekovaných buněk COS vykazovaly hladinu humánního IgG 95 ng/ml. Humánní IgG z buněk COS transfekovaných kontrolou byl nedetegovatelný. Na supematantech buněk COS transfekovaných TM27L byla provedena průniková cytometrie se šestinásobným zkoncentrováním. Intenzita barvení buněk HPB vyjádřena střední kanálkovou fluorescencí byla přibližně 9x nižší než intenzita dosažená s purifikovanou TM27L (purifikovanou z buněk NSO) při asi 2,5 mg/ml. Barvení Jurkatových buněk odpovídalo hodnotě pozadí.

Selekce transfektantů CHO

Transfektanty CHO byly umístěny pro selekci do média aMEM postrádajícího nukleotidové přísady (pro selekci DHFR⁺ na pTCSLHuVkappa4HCkappaDHFR) a s obsahem Geneticinu (G418: pro selekci neo^r na pTCLSHuVH4HCkappalNeoApa’). Buňky byly umístěny do 24-jamkové misky v koncentraci 2,0 x 10⁵ buněk/ml.

Analýza supematantů transfektantů CHO pomocí humánní IgGl ELISA

Po 12 dnech v selektivním médiu byly supematanty z konfluentních jamek sklizeny a podrobeny zkoušeni ELISA za použití IgGl/kappa. Koncentraci supematantů TM27L ležela v rozmezí od 812 do 236 ng/ml. Většinou byla nad 200 ng/ml. Humánní IgGl/kappa byl nedetegovatelný v supematantech kontroly. Buňky z 12 jamek s vysokými producenty TM27 byly expandovány do buněk T25. Jednotlivé nádoby byly zmrazený jako kultury „backup“ a uskladněny pod kapalným dusíkem. Také buňky ze dvou kontrolních jamek byly expandovány do baněk T25 a zmrazený.

První nanášení transfektantů CHO na misky s limitním ředěním

Čtyři jamky obsahující největší producenty byly zvoleny pro nanášení na 96-jamkové misky za použití limitního ředění: buňky č. 1B1 (232,6 ng/ml), 1D6 (233,3 ng/ml), 2B2 (235,5 ng/ml) a2Cl (236,0 ng/ml). Pro každou jamku bylo použito tří misek se selektivním médiem: 1 při koncentraci 1 buňka/jamka a 2 při koncentraci 0,5 buňky/jamka.

Supematanty z prvního kola klonování byly zkoušeny testem ELISA (IgGl/kappa). Buňky z 90 jamek s vysokými producenty byly expandovány do 24 jamkových misek a nechány růst až do konfluence. Supematanty z 12 z těchto kultur byly zkoušeny testem ELISA (humánní IgGl/kappa) a průtokovou cytometrií. Koncentrace při testu ELISA (IgGl/kappa) ležela v rozmezí od 211 do 1048 ng/ml. Všechny vzorky barvily HPB buňky (střední kanálková fluorescence ležela v rozmezí od 46,5 do 169,9) a nebarvila Jurkatovy buňky. Šest klonů, které byly největšími producenty, bylo expandováno a zmraženo v kapalném dusíku. Žních byly vybrány dva klony (1B1-C7 a 2B2-9H), jakožto největší producenti, pro pokračování v dalších kolech klonování.

-30CZ 287298 B6

Dvě primární kultury kontrolních konstruktů byly také zpracovány v jednom kole nanášením na 96-jamkové misky s limitním ředěním. Pro expanzi byl vybrán vždy jeden klon. Supematanty byly podrobeny zkoušení a zjistilo se, že neposkytují žádný detergovatelný signál při ELISA (humánní IgGl/kappa) (str. 640-83). Buňky byly zmrazený a potom uloženy v kapalném dusíku.

Expanze neklonovaných kultur do měřítka převalovaných lahví za účelem purifikace protilátky

Dvě primární kultury (1B1 a 2B2) byly expandovány za účelem získání dostatečného množství látky pro purifikaci protilátky TM27. Buňky byly expandovány do dvoulitrových převalovaných lahví a adaptovány na nižší sérovou koncentraci (přes T25 v 10% séru, dále T75 v 10% séru, dále 3 x T75 v 5% séru a nakonec 3 x dvoulitrové láhve v 1% séru) (str. 640-24). Dvoulitrové láhve byly naplněny v den 1 a potom v nich bylo v den 2, 5 a 8 nahrazeno vždy půl objemu čerstvým médiem s jedním procentem séra. První sklizeň byla v den 10, druhá v den 12 a třetí v den 15. Sklizené supematanty byly odstředěny až do purifikace uloženy při teplotě -20 °C.

Purifikace protilátky na sloupci s proteinem A

Supematanty z kultur 2B2 byly spojeny (celkový objem 2,7 litru) a přefiltrovány přes nylonovou membránu s otvory póru 0,22 pm. Test ELISA (humánní IgGl) ukázal, že celkové množství výchozí látky bylo 1090 mg. Protilátka byla purifikována na sloupci Prosep-A (protein A), přičemž eluce byla provedena 0,lM citrátem o pH 5,0, 4,0 a 3,0. Eluáty byly dialyovány do PBS. Množství purifikované protilátky v eluovaných frakcích bylo měřeno testem ELISA (humánní IgGl). Frakce o pH 3,0 obsahovala většinu purifikované protilátky. Malé množství protilátky bylo zjištěno ve frakci o pH 4,0. Zkouška ELISA (humánní IgGl) byla opakována, aby se získaly přesnější koncentrační údaje. Celkový výtěžek TM27 (s frakcí o pH 3,0 a 4,0 dohromady) byl 960 mg.

Purifikace protilátek ze supematantu kultury NSO transfektantu na proteinu A

Protilátky ze supematantu kultury transfektantu NSO byly purifíkovány na sloupci s proteinem A v podstatě výše uvedeným způsobem.

Charakterizace protilátky TM27 z NSO myelomových buněčných linií

TM27 mAb purifikované ze supematantů kultury NSO transfektantů za použití chromatografie na sloupci s proteinem A bylo použito pro barvení buněk HPB-ALL (Vp 5.2) a Jurkatových buněk (Vp 8.1), jako negativní kontroly, ve srovnání s myší mAb, TM23, a chimérickou TM27. TM27 barvila HPB-ALL, ale nikoliv Jurkatovy buňky.

Pro stanovení specificity TM27 byly normální PBL T-buňky barveny TM27 ve srovnání s TM23 mAb. Jak TM27, tak TM23 mAb barvila 3,0 % všech humánních PBL T-buněk. Byla provedena kompetitivní zkouška, při níž byla k neznačené 4H11 nebo TM27 mAb (v různé koncentraci) přidána konstantní koncentrace TM23 mAb značené FITC. Pro stanovení, zda TM27 může komodulovat s CD3 antigenem, mohou být buňky HPB-ALL inkubovány s různými koncentracemi TM27 nebo TM23 mAb (přes noc) a potom barveny anti-CD3 mAb. Výsledky ukázaly, že jak TM27, tak TM23 může vyvolat endocytózu komplexu TCR/CD3.

Pro změření vazebné afinity TM27 na HPB-ALL buňky byla provedena Scatchardova analýza. Jak při Scatchardově, tak při kompatitivní zkoušce (s TM23 mAb) výsledky ukázaly, že TM27 si uchovala přibližně stejnou afinitu (Kd = 2,0 x 10'^x M'¹) a byla schopna dobře soutěžit s4Hll mAb.

Bylo také provedeno porovnání TM27L/NSO a TM27L/CHO při kompetitivní zkoušce s 4H11 a výsledky jsou znázorněny na obr. 3. Také byla provedena Schatchardova analýza a její výsledky jsou znázorněny na obr. 4.

-31CZ 287298 B6

Druhé nanášení CHO transfektantů na misky s limitním ředěním

Nanášení na misky s limitním ředěním bylo provedeno výše popsaným způsobem. Jamky byly podrobeny screeningu testem ELISA (humánní IgGl). Buňky ze 6 jamek (1B1 až C7 a 2B2 až 5 H9) byly expandovány do 24 jamkových misek a podrobeny testu ELISA (humánní IgGl). Dva klony, které byly největšími producenty z každé misky, byly expandovány a zmrazený v kapalném dusíku. Klony, které byly největšími producenty z každé série, byly vybrány pro závěrečné kolo subklonování.

Třetí nanášení CHO transfektantů na misky s limitním ředěním

Nanášení na misky s limitním ředěním bylo provedeno výše popsaným způsobem. Jamky byly podrobeny screeningu testem ELISA (humánní IgGl). Buňky ze 6 jamek (1B1 až Cl a 2B2 až H9) byly expandovány do 24 jamkových misek a podrobeny testu ELISA (humánní IgGl). Tři 15 klony, které byly největšími producenty z každé misky, byly expandovány do baněk T25 a zmrazený v kapalném dusíku. Vždy jeden klon byl expandován do banky T75. V tomto okamžiku bylo do baňky přikapáno médium s geneticinem, čímž byla odstraněna selekce na neo^r. Selekce na DHFR byla zachována. Supematanty byly zkoušeny testem ELISA (humánní IgGl). Klon 1B1-C7 produkoval 4,69 mg/10⁶ buněk/den. Klon 2B2-H9 produkoval 2,65 mg/10⁶ 20 buněk/den. Izolát C7 byl tedy vybrán jako konečný klon a izolát H9 byl označen jako klon alternativní.

Příprava zásobních zmrazených buněk

Konečný klon byl expandován do pěti baněk T225, aby se získal dostatečný počet buněk, který by sloužil jako zásoba zmrazených buněk. Buňky byly sklizeny z baněk a spojeny. Spojená suspenze obsahovala 98,3 % životaschopných buněk. Celkový počet životaschopných buněk byl 1,58 x 10^x, což byl počet dostatečný pro přípravu požadovaného počtu 72 baněk při koncentraci buněk 2 x 10⁶/baňka. Buňky byly zmrazený a označeny zkratkou „TM27L-662-35“. Kromě toho 30 byl expandován také alternativní klon H9 do jedné baňky T225, za účelem přípravy malé zásoby zmrazených buněk. Buňky sklizené z této baňky byly životaschopné z 97,3 %. Suspenze obsahovala dostatečný počet buněk pro přípravu 9,7 nádoby při koncentraci 2 x 10⁶ buněk/nádoba (str. 662-89). Buňky byly zmrazený v kapalném dusíku a označeny zkratkou „TM27L-662-89“.

Zkoušení buněk revitalizovaných ze zmrazené zásoby

Životaschopnost a mykoplazmatické zkoušení

Jedna nádoba se zmrazenými zásobními buňkami TM27L-662-35 byla nechána roztát a buňky byly regenerovány v aMEM. Barvením trypanovou modří bylo zjištěno, že životaschopnost buněk je 88 %. Konfluentní kultura narostlá z těchto buněk byla zkoušena na mykoplazmatickou kontaminaci za použití soupravy Bionique Testing Laboratories. Při zkoušce nebyla zjištěna žádná kontaminace. Také byla nechána roztát jedna nádoba se zásobními buňkami TM27L-66245 89. Barvením trypanovou modří bylo zjištěno, že životaschopnost buněk je 93,8 %. Konfluentní kultura narostlá z těchto buněk byla zkoušena na mykoplazmatickou kontaminaci výše popsaným způsobem. Při zkoušce nebyla zjištěna žádná kontaminace. Obě kultuiy byly expandovány do baněk T75 a supematanty buněčné kultury byly zkoušeny testem ELISA (humánní IgGl). Klon TM27L-662-35 produkoval 3,24 pg/10⁶ buněk/den a klon TM27L-662-89 produkoval 50 2,52 μg/10⁶ buněk/den. Při druhé zkoušce klon TM27L-662-35 produkoval 3,03 pg/10⁶ buněk/den a klon TM27L-662-89 produkoval 2,74 μg/10⁶ buněk/den.

-32CZ 287298 B6

Exprese TM27L-662-35 na měřítko převalovaných lahví pro purifikace protilátky

Kultura TM27L-662-35 byla expandována za účelem získání dostatečného množství látky pro purifikaci protilátky TM27L. Buňky byly expandovány do dvoulitrových převalovaných lahví a adaptovány na nižší sérovou koncentraci (přes T25 v 10% séru, dále T75 v 10% séru, dále 3 x T75 v 5% séru a nakonec 3 x dvoulitrové láhve v 1% séru). Dvoulitrové láhve byly naplněny v den 1 a potom v nich bylo v den 2, 7 a 9 nahrazeno vždy půl objemu čerstvým médiem s jedním procentem séra. První sklizeň byla v den 12, druhá v den 14 a třetí v den 16. Sklizené supematanty byly odstředěny, přefiltrovány a až do purifikace uloženy při teplotě -70 °C.

Purifikace protilátky na sloupci s proteinem A

Supematanty z kultur TM27L-662-35 byly spojeny (celkový objem 5,1 litru). Protilátka byla navázána na sloupec Prosep-A (protein A), přičemž eluce byla provedena 0,lM citrátem o pH 5,0 a 3,0. Eluát o pH 3,0 byl dialyzován do PBS. Množství purifikované protilátky ve výchozí látce a eluovaných frakcích bylo měřeno testem ELISA (humánní IgGl/kappa). Frakce o pH 3,0 obsahovala přibližně 3,9 mg protilátky ve 25 ml. Tato látka byla zkoncentrována v koncentračním zařízení Centriprep-30 (Amicon) a test ELISA (IgGl/kappa) byl opakován. Celkový výtěžek MT27L byl asi 3,2 mg při koncentraci 1,6 mg/ml.

Primární charakterizace purifikované protilátky.

Průtoková cytometrie byla provedena na asi 2,5 mg vzorku látky jak z frakce o pH 3,0, tak z frakce o pH 4,0 a TM27 purifikované z buněk NSO. Intenzita barvení baněk HPB vyjádřená střední kanálkovou fluorescencí byla: 283,46 (frakce o pH 3,0), 321,98 (frakce o pH 4,0) a 506,79 (TM27 získaná z NSO). Barvení Jurkatových buněk bylo u všech vzorků na úrovni pozadí.

Příklad 2

Porovnání sekvencí CDR-roubováných protilátek TM27 s kazetami humánní základní struktury

ΤΜΡ,.Υ*

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISHYLNWYQQTPGKAPKLLIYY 50

TM23

K-DGTV'

WAL ‘K¹

TSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPRTFGQ IDO

REI A-N-QA’

TM23

SLme«»N«E

WAL

SYSTLT

101 GTKLQIT

TM23 ——-E-K

WAL -R-E-K

107

-33CZ 287298 B6

TM27 VH

1* QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVRQPPGRGLEWLGM 50 HIL “ K-VQA-G-V-Q-GRS-R-S-IA—TFSN—MH— A—K—VAV

NEWM

TM 2 3

HIL

101

NEWM

IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV100 ————————LSIS—N—S«VF»KMN«LQTD—-R’ —YN-J^Y-GDSV-G-F-ISR-N—RTLYMZMN-LRTE TATLYAMDYWGQGSLVTVSS

AGCIDV ......

120

PO

TM23

HIL IL-AFSF—VL— * HuVLH má L u č. 48.

TM27L:	s leucinem v poloze 48 těžkého řetězce
TM27I:	s isoleucinem v poloze 48 těžkého řetězce
TM27.1:	s FS na FV (78-79) změnami
TM27.2:	s VLML/T na LSIS/N (67-70/73) změnami
TM27.3:	s V na R (92) změnami

Poklad 3

Scatchardova analýza TM23

Příklad	Kd	Receptory/buňka
617:096	3,27e-8 M	3,04e5
617:115	2,30e-8 M	3,43e5
617:119	2,46e-8 M	2,46e5

Střed

Kd = 2,52 (± 0,67)e-8 M

Receptory/buňka = 2,64e5

Scatchardova analýza TM27

Příklad	Kd	Receptoiy/buňka
613:78	l,48e-8 M	3,3 le4
613:82	l,14e-8 M	2,47e4

Střed

Kd= 1,31 (± 0,24)e-8M

Receptory/buňka = 2,89e4

-34CZ 287298 B6

Příklad 4

Přehled práce na TM27I

TM27I (48) v buňkách COS/CHO:

* Byla připravena cDNA z CDR-roubovaných oblastí V v produkční linii HSO, tato cDNA byla amplifíkována pomoc PCR a sekvenována.

* Fragmenty DNA byly klonovány do pTCSLNeo v cDNA konfiguraci.

* Plazmid byl kontransfekován s pTCSLDHFRTM27ka_PPa do buněk COS a CHO.

* Pozitivní výsledky při testu ELISA na expresi humánního IgGl/kappa naměřené v supematantu buněk COS ukázaly, že byly získány správné plazmidové konstrukty.

* Byla provedena selekce expanze a klonování transfektantů buněk CHO. Buňky byly po jednom klonování zmrazený v kapalném dusíku.

Příklad 5

Data aminokyselinové sekvence získané z 16G8 cDNA

Těžký	řetězec:
	10	20	30	40	50
	*	A	w	A	A
TTRAP	RSSHS VISTE	HRPLT MDSRL	NLVFL VLILK	GVQCD VQLVE	SGGGL
	60	70	80	90	100
	*	A	A	A	A
VQPGG	SRKLS CAASG	FTFSN FGMHW	VRQAP DKGLE	WVAYI SSGSS	TIYYA
	110	120	130	140	150
	*	A	A	A	*
DTLKG	RFTIS RDNPK	NTLFL QMTSL	RSEDT AMYYC	ARRGE GAMDY	WGQGT

160 170

SVTVS SAKTT PPSVY PLAPG

-35CZ 287298 B6

Lehký řetězec:

	10 *	20 *	30 40 * *	50 *
ISQGT	KFKYT MDFQV QIFSF LLISI	SWMS RGENV LTQSP AIMSA SLGEK
	60	70	80 90	100
	*	A	★ w	*
VTMSC	RASSS VNYIY	WYQQK SDASP	KLWIY YTSNL APGVP TRFSG	SGSGN
	110	120	130 140	150
	*	*	* *	*
SYSLT	ISSME GEDAA	TYYCQ QFTSS	PFTFG SGTKL EIKRA DAAPT VSIFP

153 *

PSS

Sekvenkční data proteinu:

H=DVQLVE?GGGVLQPG

L=ENVLTQ

Příklad 6

Přehled práce na TM29 * Byly připraveny hybridomy v podstatě způsobem popsaným v příkladu 1 a byla izolována cDNA (znázorněná v příkladu 5).

* Izolované cDNA (H a kappa) (z hybridomu 16G8) byly klonovány do vektorů Ml3.

* Mutagenezí byla zavedena humánní základní struktura (VHja>i,/VkREi).

* CDR-roubované oblasti V byly klonovány do myelomových expresních vektorů.

* Humanizované protilátky (vždy asi 1 mg) byly purifikovány z tranfektantů NSO za účelem předběžného vyhodnocení.

Byly vyrobeny 4 různé TM29.

TM29

TM29.1 s SS na AA (23-24) změnami

TM29.2 s S na P (75) změnou

TM29.3 s GV/F na AM/Y (92-93/95) změnami

-36CZ 287298 B6

Podrobný popis experimentů vedoucích k TM29

Izolace konstantní oblasti humánního řetězce kappa metodou PCR

Za použití nerozštěpeného plazmidu pSV184DH-Neo/DNS-V_kappaC_kappa (pSVHuk), který obsahuje konstantní oblast humánního kappa řetězce, se provede PCR se dvěma primery (jedním forward a jedním reverzním) za účelem izolace konstantní oblasti. Oligomery (primery) byly získány od firmy Operon. Jako reakčních činidel pro PCR reakci bylo použito činidel ze soupravy GeneAmp DNA Amplification Reagent kit s AmplyTaq (Perkin-Elmer Cetus). Reakce PCR byly prováděny při třech různých koncentracích konečných iontů. Alikvoty PCR produktů byly analyzovány na 1% agarosovém gelu. Byl vybrán PCR produkt z prvního vzorku (koncentrace hořečnatých iontů l,5mM). Primery lemující C oblast byly navrženy tak, aby obsahovaly místa pro restrikční enzymy pro účely klonování. Amplifikovaná DNA byla tedy rozštěpena EcoRI (u 3' konce). Místo u 5' konce (PvuII) rozštěpeno nebylo. Rozštěpený fragment DNA byl potom rozdělen na 1% agarosovém gelu a byl vyříznut 300 bp pás. DNA byla extrahována z gelu a malý alikvot byl analyzován na 1% agarosovém gelu pro kvalitativní analýzu a kvantitativní odhad. 300 bp pás se zdál být čistý a odhadnuté celkové množství DNA bylo asi 140 ng.

Klonování konstantní oblasti humánního kappa řetězce do vektoru pBS KS⁺ a sekvenování

Fragment DNA konstantní oblasti humánního kappa řetězce vyštěpený EcoRI byl vložen do vektoru pBS KS⁺, který byl rozštěpen Smál a EcoRI za použití T4 DNA ligasy. Této ligační směsi bylo použito pro transformaci E. coli DH5a kompetentních buněk. Byly odebrány jednotlivé kolonie, a poté jich bylo použito pro inokulaci 24 kapalných kultur. Z každé z těchto kultur byla připravena DNA. Každý vzorek DNA byl štěpen PvuII (5' konec Ckapp_a) a EcoRI (3' konec C_kappa) a analyzován na 2% agarosovém gelu. V důsledku obtíží při separaci nižších pásů (300 bp) byly vzorky DNA štěpeny pouze PvuII. Po analýze na 2% agarosovém gelu vykazovalo 19 z 24 vzorků správný C_kappa insert. Pro sekvenování byly zvoleny vzorky č. 1 až 5 (z 19 správných vzorků). Sekvenování bylo provedeno za použití T7 a T3 primerů (sekvence ve vektoru lemující insert). Jiná reakční činidla pro sekvenování pocházela ze soupravy Sequenase Version 2.0 Kit (USB). Vzorek č. 5 vykázal správnou sekvenci konstantní oblasti humánního kappa řetězce.

Klonování konstantní oblasti humánního kappa řetězce do savčího expresního vektoru pTCSLDHFR* za vzniku pTCSLC_kappaDHFR*

Z vektoru pBS KS+ (vzorek č. 5) byla za použití restrikčních enzymů PvuII a EcoRI izolována konstantní oblast humánního kappa řetězce. S ohledem na výše uvedené problémy s oddělováním pásů bylo však druhé štěpení provedeno s konstruktem pBS/Humánní C_kappa. Druhé štěpení zahrnovalo EcoRi a Xbal (byly umístěny ve směru 5' vzhledem k místu PvuII) a tak byl získán asi 300 bp fragment. Tento fragment byl potom purifikován na gelu a podroben štěpení PvuII, aby došlo k odstranění zbývajícího malého fragmentu vektoru u 5' konce C^pa. Tento výsledný fragment byl purifikován na gelu a potom analyzován na 1% agarosovém gelu za účelem kvalitativního posouzení a odhadu množství. Ukázalo se, že C_kappa DNA představuje čistý pás (asi 280 bp) a jeho celkové množství bylo odhadnuto na asi 135 ng.

V důsledku přítomnosti tří míst EcoRi v expresním vektoru pTCSLDHFR* bylo rozhodnuto, že nej lepší bude klonování pouze do místa FÝuII. Jelikož byla C_kappa DNA připravena štěpením pomocí PvuII-EcoRI, byl EcoRi konec opraven (za vytvoření tupého konce) s použitím Klenowova fragmentu. Opravená C_kappa DNA s tupým koncem byla ligována do vektoru pTCSLDHFR*, který byl štěpen PvuII a zpracován fosfatasou (za použití fosfatasy ze střev telete). Této ligační směsi bylo použito pro transformaci E. coli DH5a kompetentních buněk. Byly odebrány jednotlivé kolonie, a poté jich bylo použito pro inokulaci 24 kapalných kultur. Z každé z těchto kultur byla připravena DNA. Každý vzorek DNA byl štěpen PvuII a HinglII

-37CZ 287298 B6 a analyzován na 1% agarosovém gelu. Bylo zjištěno, že 5 vzorků z 24 obsahovalo C_kappa insert ve správné orientaci. Pro další pokračování bylo použito vzorku č. 7.

Nahrazení mutantního genu DHFR* genem DHFR divokého typu

Pro expresi vektoru pTCSLC_kappaDHFR* v buňkách CHO (dhrf.)DUX Bil byl gen DHFR* nahrazen genem DHFR. DNA zpTCSLC_kappa DHFR* (vzorek č. 7) jakož i zpSV2-DHFR (plazmid získaný od Dr. Paula Berga z Department of Biochemistry, Stanford University Medical School) byl štěpen restrikčními enzymy HindlII a BglII za účelem izolace příslušných genových fragmentů. Po analýze bylo zjištěno, že přídavné místo BglII ve vektoru pTCSLC_kappaDHFR* odstranilo také část místa póly A, což by mohlo interferovat s funkcí vektoru. Proto byla štěpení opakována za použití HindlII a BamHI. Část (DHFR*)pTCSLC_kappa tohoto vektoru byla zpracována fosfatasou. Potom byly oba izolované fragmenty (pTCSLČ_kappa a DHFR) purifikovány na gelu a analyzovány na 1% agarosovém gelu (kvalitativně pro odhad kvantity). Oba pásy se zdály být čisté a jejich odhadnutá koncentrace je podobná, tj. asi 40 a asi 50 ng/ml. Gen DHFR byl ligován do vektoru pTCSLC_kapPa za použití T4 DNA ligasy. Této ligační směsi bylo použito pro transformaci E. coli DH5a kompetentních buněk. Byly odebrány jednotlivé kolonie, a poté jich bylo použito pro inokulaci 24 kapalných kultur. Z každé z těchto kultur byla připravena DNA. Každý vzorek DNA byl analyzován štěpením restrikčními enzymy HindlII a BamHI. Bylo zjištěno, že 23 vzorků z 24 obsahovalo správný pás ukazující vložení genu DHFR do vektoru pTCSLC_kappa. Pro další pokračování bylo použito vzorku č. 22.

Klonování oblasti V humánního kappa řetězce izolované PCR do CHO vektoru do pTC SLC_kappaDHFR cDNA oblasti V kappa řetězce pro 16G8 byla purifikována na gelu a rozštěpena příslušnými restrikčními enzymy. Malý alikvot vzorku DNA byl analyzován na 1% agarosovém gelu pro odhad kvantity a ověření kvality. Případný pás (odpovídající nečistotě) byl pozorován při asi 800 bp a koncentrace byla odhadnuta na 1,25 ng/ml. Oblast V byla ligována do vektoru pTCSLC_kappaDHFR, kteiý byl rozštěpen restrikčními enzymy Xhol a PvuII a zpracován fosfatasou. Ligační směsi bylo použito pro transformaci E. coli DH5a kompetentních buněk. Výtěžek kolonií transformantů byl velmi nízký. Jednotlivé kolonie byly sesbírány a bylo jich použito pro inokulaci 12 kapalných kultur. Z každé z nich byla připravena DNA, a ta byla poté rozštěpena Xhol a PvuII a analyzována na 1% agarovém gelu. Byly získány čtyři pozitivní vzorky, vzorky č. 1,4, 7 a 10. Všechny tyto pozitivní vzorky byly sekvenovány. Oblast V gamma řetězce MT29 izolovaná PCR byla klonována do CHO vektoru pTCSLCglNeoApa*.

Sekvenování dvouřetězcové DNA oblasti V humánního kappa řetězce

Čtyři vzorky 16G8 (č. 1, 4, 7 a 10) byly sekvenovány v obou řetězcích. Reverzní řetězec byl sekvenován úplně prostřednictvím míst pro restrikční enzymy (3' - 5'; PvuII-XhoI) za použití primeru HUCK5PR. Ukázalo se, že vzorky č. 1 a 4 mají správnou sekvenci, u vzorku č. 7 nedošlo k sekvenování a vzorek č. 10 měl špatnou sekvenci. Sekvence Forward řetězce u vzorků č. 1 a 4 byla stanovena za použití dvou různých primerů PTCSFOR a PTCSFWD. Zkombinováním sekvencí získaných za použití každého z primerů byla získána sekvence o plné délce (prostřednictvím míst pro restrikční enzymy 5'-3'; XhoI-PvuII). Bylo zjištěno, že ve forward řetězcích existuje malá oblast komprese, která nebyla rozštěpena kterýmkoliv z primerů, ani za použití sekvenční metody, jež takové komprese zmenšuje. Reverzní řetězec však v této oblasti vykazoval správnou sekvenci. Oba vzorky č. 1 a 4 měly správnou sekvenci. Pro transfekci savčích buněk byl zvolen vzorek č. 4.

-38CZ 287298 B6

Kontransfekce buněk COS a CHO plazmidy s lehkým a těžkým řetězcem TM27

Jako recipientních buněk pro kontransfekci plazmidů s lehkým a těžkým řetězcem TM29 bylo použito buněk COS-1 a CHO dhfr. DUX Bil. Buněčná linie CHO DUX Bil byla získána od firmy Biogen lne. a původně byla získána Dr. Lawrencem Chaisinem (Columbia University).

Pro transfekci buněk COS-1 bylo 5 mg každého nerozštěpeného plazmidu TM29 (TM29-4: pTCSLHuV_kappa16GC_kapa-DHRF a TM29-26: pTCSLHuV_H16GC_kapp_alNeoApa’) byly precipitovány v ethanolu a resuspendovány ve vodě na koncentraci 1 mg/ml. Plazmidy byly elektroporací kotransfekovány do 3,8 x 10⁶ buněk za použití zařízení BioRad Gene Pulser při 250 V a 960 mFD. Transfekované buňky byly resuspendovány v Dulbeccem modifikovaném Eagleově médiu (DMEM) a potom kultivovány po dobu 3 dnů. Kontrolní vektorové plazmidy (pTCSLDHFRApa* a pTCSLNeoApa’) byly připraveny a kontransfekovány podobně jako plazmidy TM29. Potom byly transfekované buňky resuspendovány a kultivovány podobně jako buňky COS transfekované TM29.

Pro transfekci buněk CHO DUX Bil bylo 5 mg každého plazmidu TM29 (viz výše) linearizováno vždy štěpením restrikčním enzymem AatlI. Lineární fragmenty byly vysráženy v ethanolu a resuspendovány ve vodě na koncentrací 1 mg/ml. Potom byly plazmidy elektroporací kotransfekovány do 5 x 10⁶ buněk podobným způsobem, jako to bylo uvedeno výše. Transfekované buňky byly resuspendovány v a minimálním esenciálním médiu (aMEM) doplněném thymidinem, adenasinem a deoxyadenosinem (neselektivní médium) a 3 dny kultivovány. Kontrolní vektorové plazmidy (viz výše) byly připraveny a kotransfekovány podobně jako plazmidy TM29. Následně byly transfekované buňky resuspendovány a kultivovány podobně jako buňky CHO transfekované TM29.

Analýza supematantů TM29 transfektantů COS humánní IgGi_kappa ELISA

Po 3 dnech kultivace se zdály být buňky COS transfekované TM29 konfluentní. Proto byl supematant odebrán a buňky byly zahozeny. Produkce humánního IgG buňkami byla stanovena na supematantu kultury za použití testu ELISA s humánním IgGi_kapa. Supematant IgG byl zachycen myší antihumánní IgGj Fc protilátku, kterou byla potažena 96-jamková miska. Detekce byla prováděna konjugátem křenové peroxidasy s kozí antihumánní Ig_kappa protilátkou a barva byla vyvinuta o-fenylendiaminem (OPD). Koncentrace IgG v supematantu byly stanoveny porovnáním měření optické density s křivkou sestrojenou za použití pufirikované humánní IgG_kappa protilátky o známé koncentraci. Supematant buněk COS transfekovaných TM29 poskytl koncentraci humánní IgG 201,3 ng/ml. Supematant z buněk COS transfekovaných kontrolní DNA poskytl koncentraci humánního IgG 0 ng/ml.

Selekce buněk CHO transfekovaných TM29

Po 3 dnech kultivace se zdály být buňky CHO transfekované TM29 konfluentní. Proto byl k buňkám přidán 0,25% trypsin (v Hankově vyváženém solném roztoku), aby došlo k jejich oddělení od kultivačních baněk. Buňky byly shromážděny, odstředěny a byl oddělen supematant. Buněčná peleta byla resuspendována v selekčním médiu aMEM na koncentraci 2 x 10⁵ buněk/ml a suspenze byla přenesena do 24—jamkové misky v množství 1 ml/jamka. Selekční médium aMEM vykazovalo dvojí selekční schopnost. Postrádalo přídavky nukleotidů, nahrazovalo FBS dialyzovaným FBS (selekce na DHFR⁺ v pTCSLHuV^ppJóGC^ppaDHFR a přidávalo Genelicin (G-418) (selekce na neo' v pTCSLHuV_H16GC_kappalNeoApa*.

-39CZ 287298 B6

Analýza supematantu buněk CHO transformovaných TM29 zkouškou ELISA (IgG|_kappa) a průtokovou cytometrií

Po 14 dnech v selekčním médiu byl z každé jamky odebrán supematant buněk CHO transfekovaných TM29 a zkoušen za použití ELISA (IgGik_appa)· Koncentrace humánního IgG v supematantech buněk CHO transfekovaných TM29 ležela v rozmezí od 144,6 do 291,9 ng/ml, přičemž průměrná koncentrace činila 240,5 ng/ml. Koncentrace humánního IgG v supematantech buněk CHO transfekovaných kontrolní DNA byla 0 ng/ml.

Supematanty ze tří jamek s buňkami CHO transfekovanými TM29, které byly největšími producenty (2C3, 2C4, 2B6) a z jedné jamky s buňkami CHO transfekovanými kontrolní DNA byly také podrobeny průtokové cytometrii. Tři vzorky TM29 (2C3, 2C4 a 2B6) barvily Jurkatovy buňky pozitivně (střední kanálková fluorescence ležela v rozmezí od 186,61 do 290,01) a nebarvily pozitivně buňky HPB (střední kanálková fluorescence ležela v rozmezí od 11,77 do 13,82). Kontrolní vzorek, 3D4 nebarvil pozitivně Jurkatovy buňky (střední kanálková fluorescence 11,96).

Klonování buněk CHO transfekovaných TM29 metodou limitního ředění

Tři jamky obsahující buňky CHO transfekované TM29, které byly největšími producenty (2C3, 291,9 ng/ml; 2C4, 289,7 ng/ml; 2B6, 289,5 ng/ml) byly zvoleny pro klonování metodou limitního ředění. V průběhu každé jamky byla koncentrace buněk zředěna selekčním médiem aMEM a získané zředěné suspenze o koncentraci 2 buňky/jamka, 1 buňka/jamka a 0,5 buňky/jamka byly naneseny na 96-jamkové misky. 10 dnů po klonování byl růst kolonií pozorován v řadě jamek v každé z misek, kde bylo použito koncentrace 0,5 buňka/jamka u vzorků 2C3, 2C4 a 2B6. Proto byly supematanty ze všech jamek ze všech misek s koncentrací 0,5 buňky/jamka spojeny a podrobeny zkoušce ELISA (IgGi_kappa). Všechny jamky, které vykazovaly růst buněk byly při zkoušce ELISA pozitivní. Celkem 24 jamek s největšími producenty (10 jamek z 2C3 a 14 jamek z 2B6) bylo zvoleno pro expanzi do 24-jamkové misky a tyto buňky byly pěstovány až do konfluence. Z každé z jamek byl odebrán supematant, a ten byl podroben zkoušce ELISA (IgGjkappa). Koncentrace humánního IgG ležela v rozmezí od 0,7 mg/ml do 4,8 mg/ml, přičemž průměrná koncentrace byla 2,9 mg/ml. Supematanty ze 6 jamek s klony CHO transfekovanými MT29, které byly největšími producenty, byly zkoušeny průtokovou cytometrií.

Tři jamky obsahující největší producenty byly zvoleny pro nanášení na 96-jamkové misky za použití limitního ředění: buňky č. 1B1 (232,6 ng/ml), 1D6 (233,3 ng/ml), 2B2 (235,5 ng/ml) a 2C1 (236,0 ng/ml). Pro každou jamku bylo použité tří misek se selektivním médiem: 1 při koncentraci 1 buňka/jamka a 2 při koncentraci 0,5 buňky/jamka. Všech 6 vzorků barvilo Jurkatovy buňky pozitivně (střední kanálková fluorescence v rozmezí od 313,68 do 356,87) a nebarvilo pozitivně buňky HPB (střední kanálková fluorescence v rozmezí od 7,59 do 8,16). Všech šest vzorků bylo expandováno do 25 cm² baňky, zmraženo a uloženo pod kapalným dusíkem. Pro subklonování byly zvoleny tři jamky s největšími producenty (2C3-1G2, 2C32H10 a 2C3-2H2a).

Jedné jamky s buňkami CHO transfekovanými kontrolní DNA (3D4) bylo použito pro klonování metodou limitního zředění, podobně jako to bylo prováděno s jamkami sTM29. Při zředění buněk na koncentraci lOx nižší, než je koncentrace požadovaná, nebyl 10 dnů po klonování pozorován žádný růst kolonií. Proto byla ze zmrazené baňky s 3D4 vytvořena čerstvá kultura. Klonování metodou limitního zředění bylo opakováno za použití této nové kultury. Po 16 dnech od klonování bylo 6 zvíce kofluentních jamek z misky o koncentraci 0,5 buňky/jamka (1B5, 1C11, 1D6, 2E7, 2F3 a 2F9) zvoleno pro expanzi od 24-jamkové misky. Každá jamka byla následně expandována do 25cm² baňky a potom do 75cm² baňky, přičemž v růstu bylo pokračováno až do konfluence. Supematant z každé baňky byl odebrán a zkoušen pomocí igGikapaELISA. Koncentrace humánního IgG byla 0 ng/ml. Každá baňka byla potom zmrazená a uložena pod kapalným dusíkem.

-40CZ 287298 B6

Expanze kultur neklonovaných buněk CHO transfekovaných TM29 do měřítka převalovaných láhví

Tři jamky obsahující buňky CHO transfekované TM29, které byly největšími producenty (2C3, 291,9 ng/ml; 2C4, 289,7 ng/ml; 2B6, 289,5 ng/ml) byly také zvoleny pro expanzi do 25cm² baněk, jako neklonované kultury. Tentokrát byla jedna nádobka s každou z kultur TM29 (stejně tak jako jedna nádobka s kulturou buněk CHO transfekovanou kontrolní DNA) zmrazená a uložena pod kapalný dusík. Každá neklonovaná kultura byla expandována do 75cm² baňky. Z jedné 75cm² baňky od každé kultury byla kultura expandována do tří 75cm² baněk, přičemž se koncentrace séra v aMEM médiu snižovala z 10 na 5 %. Každá ze 75cm² baněk, jak v případě 2C3, tak v případě 2B6, byla expandována do 21itrové převalované láhve. Všechny tři 75cm² baňky pro 2C4 byly zmrazený a uskladněny pod kapalným dusíkem. Když již byly kultury v převalovaných láhvích, byla koncentrace séra v médiu aMEM znovu snížena z 5 % na 1 %. Po 9 dnech v kultuře vykazovaly láhve 2B6 konfluentní nárůst, zatímco láhve 2C3 vykazovaly jen asi 25% konfluenci. Supematanty ze všech láhví 2B6 a 2C3 byly odebrány v den 9, 14 a 16 a poté byly buňky zahozeny. Shromážděné supematanty byly odstředěny a uskladněny při -20 °C. Alikvot každého ze tří sklizených supematantů pro 2B6 a 2C3 byl zkoušen za použití testu ELISA (humánní IgGikappa)· Celkové množství humánní IgG v 2B6 bylo 820 mg v 2C3 1923 mg.

Subklonování klonů buněk CHO transfekovaných TM29 za použití metody limitního ředění

Pro subklonování metodou limitního ředění byly vybrány tři jamky sklony buněk CHO transfekovanými TM29 (2C3-1G2, 4,8 mg/ml; 2C3-2H2A, 4,1 mg/ml; 2C3-2G10, 4,0 mg/ml). 14 dnů po subklonování byl pozorován nárůst kolonií v řadě jamek každé z misek, kde bylo použito koncentrace 0,5 buňka/jamka u vzorků 1G2, 2G10 a 2H2a. Proto byly supematanty z jamek v nichž došlo k růstu kolonií spojeny a podrobeny zkoušce ELISA (humánní IgGikappa)· Všechny jamky, které vykazovaly růst buněk byly při zkoušce ELISA pozitivní, takže účinnost klonování byla 100%. Celkem 24 jamek s největšími producenty (2 jamky z 2H2a, 5 jamek z2G10, 17 jamek z 1G2) bylo zvoleno pro expanzi do 24-jamkové misky a tyto buňky byly pěstovány až do konfluence. Z každé z jamek byl odebrán supematant, a ten byl podroben zkoušce ELISA (humánní IgGi_kapa). Koncentrace humánního IgG ležela v rozmezí od 1,2 mg/ml do 9,2 mg/ml, přičemž průměrná koncentrace byla 4,2 mg/ml. Supematanty ze 4 jamek s subklony CHO transfekovanými TM29, které byla největšími producenty (2G5, 2H12, 1H6, 2E9), byly zkoušeny průtokovou cytometrií. Všechny 4 vzorky barvily Jurkatovy buňky pozitivně (střední kanálková fluorescence v rozmezí od 211,51 do 292,45) a nebarvily pozitivně buňky HPB (střední kanálková fluorescence v rozmezí od 8,67 do 10,25).

Příprava zásobních zmrazených buněk, klonů buněk CHO transfekovaného TM29

Jako klon buněk CHO transfekovaných TM29 pro přípravu zásobních zmrazených buněk byl zvolen klon 2C3-1G2-1H6-2F5. Tento klon byl expandován zjedné 75cm² baňky do pěti 225cm² baněk, aby se získal dostatečný počet buněk, který by sloužil jako zásoba zmrazených buněk pro účely výzkumu. Zásoba zmrazených buněk byla připravena podle SOP TMB1-001.00. Buňky byly ošetřeny trypsinem, odebrány z každé z baněk a spojeny. Spojená buněčná suspenze obsahovala 3,2 x 10* buněk s životaschopností 99 %. Bylo připraveno 72 násobek, z nichž každá obsahovala 2 x 10⁶ buněk v lml objemu. Všechny lahvičky s tímto klonem byly označeny zkratkou TM29-646-132.

-41CZ 287298 B6

Příklad 7

Porovnání sekvencí CDR—roubovaných protilátek TM29 s jinými oblastmi základní struktury

TM29 Vk

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVNYIYWYQQTPGKAPKLLIYYT 50 REI .i riwi.li.··, ·!< ....... ι·-ΐ'ΕΑ

16GB ENVL»-“AIM>^L»EK·—MS«— .....KSDAS—W—«—

HIC E-VL*^-GT-=I^P-ERA-LS>~~Q--ssjylK«~~K“Q~R-“““GA

SNLAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQOFTSSPFTFGQG 100

16G8 •S'

HIC

SR-T-I-D

F-L—_RwE-_-F-V>

•YG—*W'

101 TKLQIT

16G8 —E«K

HIC —VE-K

106

TM29 VH

EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCSSSGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY 50

KOL

I

16G8 «RK-wwAAD<

WEA

Q¹

D·¹.....^t~L*»E¹

A’

AND-R

LSF

ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG 100

KOL -WDDG-DQH—SV«—1'·'··» —.......... upm

WEA <JGSG~*--~SV-~--»~NB-^S-Y-™S’^A—-A-YY-“· “

101 EGAM

DYWGQGTPVTVSS

KOL GHGFCSSASCFGP·

16G8 —

WEA WLL

TM29 se sekvencemi první verze

TM29.1 s SS na AA (23-24) změnami

TM29.2 s S na P (75) změnou

TM29.3 s GV/F na AM/Y (92-93/95) změnami

-42CZ 287298 B6

Příklad 8

Scatchardova analýza TM29 mAb

Scatchardovy analýzy protilátek TM29 a 16G8 byly provedeny ve třech nezávislých experimentech. V dále uvedené tabulce jsou shrnuty hodnoty Kj stanovené při každém z těchto experimentů.

Příklad	TM29 Kj (M)	16G8Ka(M)
1	1,45 x 10'9	2,86 x 10'9
2	1,65 x 10'9	2,65 x 10‘9
3	1,15 x 10‘9	2,44 x 10‘9
Střed	1,42x10’9	2,65 x 10'9

Příklad 9

Přehled práce na chimérické TM29

Chimerika v buňkách COS a CHO * cDNA oblasti V(D)J byly klonovány do expresních vektorů buněk CHO, pTCSLNeo (H) a pTCSLDHFR (k) v cDNA konfiguraci.

* Expresní plazmidy byly kontransfekovány do buněk COS a CHO.

* Koncentrace Ab v supematantu buněk COS byla asi 35 ng/ml.

* Transfektanty buněk CHO byly analyzovány (FACS a ELISA), jednou klonovány a amplifikovány s MTX (20nM, lOOnM a 500nM).

* Koncentrace protilátky z neamplifikovaného klonu buněk CHO byla asi 3 pg/ml; Jurkatovy buňky byly arveny pozitivně. Neamplifikované klony byly zmrazený v kapalném dusíku.

Příklad 10

Exprese chimérické 16G8 v buňkách COS a CHO

Chimérická 16G8

Konstrukty lehkého a těžkého řetězce obsahovaly úplnou myší oblast V s humánní konstantní oblastí ve stejných expresních vektorech použitých pro CDR-roubované konstrukty: pTCSDHRF vazba pTCSNeo vazba - konstrukty vykazovaly dvojí selekční schopnost.

Transfektanty buněk COS - asi 35 ng/ml.

Transfektanty buněk CHO - 16 pozitivních jamek/54 jamek.

-43CZ 287298 B6

	ng/ml		korekce na objem
1A1	151,6
1A6	166,6
1B3	107,2
1B6	179,6
1D2	101,0
1D5	215,1	*	2,2 pg/ml
2A4	199,8
2B1	184,5
2B2	213,8	*	2,1 pg/ml
2B4	130,6
2C2	119,6
2C6	214,4	*	2,1 pg/ml
2D3	216,6	*	2,2 μg/ml
2D6	139,7
3A1	198,7
3A2	172,2

všechny expandovány do 25cm² baněk.

* Provedena průtoková cytometrie.

Příklad 11

Přehled práce na TM29

TM29

TM29 v COS/CHO * Byla připravena cDNA z CDR-roubovaných oblastí V v produkční linii NSO, amplifikována pomocí PCR a sekvenována.

* Fragmenty DNA byly klonovány do pTCSLNeo (H) a pTCSLDHFR (k) v cDNA konfiguraci.

* Plazmidy byl kontransfekovány do COS a CHO.

* Supematant z buněk COS obsahoval si 2 pg/ml Ab.

* Transfektanty buněk CHO vylučovaly asi 3 μg/ml Ab před klonováním a amplifikací, supernatant barvil Jurkantovy buňky pozitivně. Po trojnásobném klonování byla z největšího neamplifikovaného producentu Ab vytvořena zásoba buněk.

* Linie buněk CHO byly amplifikovány při různé koncentraci MTX.

-44CZ 287298 B6

Příklad 12

Porovnání TM27L, TM27I a TM23 při kompetitivní zkoušce 4H11-FITC

Experiment 1:

směrnice TM23

-------------=1,56 směrnice TM27L směrnice TM23

---------------= 2,04 směrnice TM27I

Experiment 2:

směrnice TM23

--------------=1,82 směrnice TM27L směrnice TM23

---------------= 2,44 směrnice TM27I

Ve srovnání s TM23 byly hodnoty jak u TM27L, tak u TM27I méně než trojnásobné.

Příklad 13

TM27 methotrexotová amplifíkace

Produktivita (pg/10⁶ buněk/den)

Koncentrace methotrexatu (nM)

		0	20	100	10-200	20-200
C7	*7/30	27	nd	nd	nd	265,8
	*7/22	3,5	nd	19,2	14,7	34,2
	7/6	2,6	nd	nd	9,1	nd
	6/25	2	4,8	4,5	nd	nd
	6/18	3	8,9	nd	nd	nd
H9	*7/30	22,7	nd	nd	nd	181,9
	&7Z22	3,9	nd	9,4	11,6	34,4
	6/25	1,5	1,8	4,7	3,6	nd
	6/18	1,8	1,5	nd	nd	nd

* neposkytuje srovnání mezi stanoveními.

nd = neměřeno

-45CZ 287298 B6

Relativní hodnota v rámci jednoho stanovení

		0	20	100	20-100	20-200
C7	*7/30	1	nd	nd	nd	9,8
	*7/22	1	nd	5,5	4,2	9,8
	7/6	1	nd	nd	3,5	nd
	6/25	1	2,4	2,3	nd	nd
	6/18	1	3,0	nd	nd	nd
H9	*7/30	1	nd	nd	nd	8,0
	*7/22	1	nd	2,4	3,0	8,8
	6/25	1	1,2	3,1	2,4	nd
	6/18	1	0,8	nd	nd	nd

Status

		0	20	100	20-100	20-200
C7	8/11	fm	fm,s,sf4	fm	fm	fm,s*
H9	8/11	fm	zahozeno	fm,s,fž	fm	fm,s*

Klíč fm = jedna zkumavka se směsnou kulturou byla zmrazená s = subklutura při jednom limitním zředění s* - první limitní ředění probíhalo f# = jedna lahvička z každého počtu # jamek byla zmrazená

Claims (13)

1. Humanizovaná protilátka nebo její vazebný protein mající aminokyselinovou sekvenci, která zahrnuje všechny oblasti CDR nebo část oblastí CDR odvozených z monoklonální protilátky, vykazující specificitu vůči vybrané subpopulaci T-buněk exprimujících variabilní oblast β řetězce receptoru antigenu T-buňky νβδ.Ι, ve spojení s vybranými zbytky variabilní základní struktury rovněž odvozenými z této monoklonální protilátky, přičemž tato humanizovaná protilátka nebo její vazebný protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci TM29 Vk

1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVNYTYWYQQTPGKAPKLLIYYT 50

51 SNLAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQG 100

101 TKLQIT106, a dále obsahuje aminokyselinovou sekvenci zvolenou ze souboru zahrnujícího aminokyselinovou sekvenci TM29 VH

1 EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCSSSGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY 50

51 ISSGSSTTYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG 100

101 EGAMDYWGQGTPVTVSS 117, sekvenci TM29 VH, kde aminokyselinové zbytky 23 a 24 jsou oba nahrazeny alaninovými (A) zbytky,

-46CZ 287298 B6 sekvenci TM29 VH, kde aminokyselinový zbytek 75 je nahrazen prolinem (P) a sekvenci TM29 VH, kde aminokyselinové zbytky 92 a 93 jsou nahrazeny alaninem (A) a methioninem (M) a aminokyselinový zbytek 95 je nahrazen tyrosinem (Y).

2. Humanizovaná protilátka podle nároku 1 vykazující isotyp IgG.

3. Humanizovaná protilátka podle nároku 1, v níž je aminokyselinová sekvence konstantních domén Ig změněna za účelem změny isotypu Ig.

4. Způsob výroby humanizované protilátky nebo jejího vazebného proteinu podle nároku 1, vyznačující se tím, že se

a) izoluje první sekvence DNA kódující alespoň jednu oblast CDR v podstatě odvozenou z antiνβδ.Ι myší monoklonální protilátky mající specificitu pro vybranou subpopulaci T-buněk;

b) tato první sekvence DNA se klonuje do vhodného vektoru;

c) mutagenezí se zavedou aminokyseliny vybrané lidské základní struktury, za vzniku CDR roubovaného konstruktu;

d) hostitelská buňka se transformuje konstruktem ze stupně c) a

e) takto transformovaná hostitelská buňka se kultivuje za účelem produkce humanizované protilátky nebo jejího vazebného proteinu.

5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že hostitelskou buňkou je buňka CHO.

6. Humanizovaná protilátka nebo její vazebný protein podle nároku 1 pro použití jako léčivo.

7. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje humanizovanou protilátku nebo její vazebný protein podle nároku 1 v kombinaci s farmaceuticky vhodným excipientem.

8. Humanizovaná protilátka nebo její vazebný protein podle nároku 1 pro použití jako léčivo Crohnovy choroby.

9. Humanizovaná protilátka nebo její vazebný protein podle nároku 1 pro použití jako léčivo roztroušené sklerózy.

10. Použití humanizované protilátky nebo jejího vazebného proteinu podle nároku 1 při výrobě léčiva pro léčení Crohnovy choroby.

11. Použití humanizované protilátky nebo jejího vazebného proteinu podle nároku 1 při výrobě léčiva pro léčení roztroušené sklerózy.

12. Humanizovaná protilátka podle nároku 2 vykazující isotyp IgGi.

13. Humanizovaná protilátka podle nároku 3, kde isotyp je zvolen ze souboru sestávajícího z IgG_b IgG₂, IgG₃ a IgG₄.