PL180157B1

PL180157B1 - Humanised antibodies and their application

Info

Publication number: PL180157B1
Application number: PL94314908A
Authority: PL
Inventors: Augustine Yeetharn Lin
Original assignee: Astra Ab
Priority date: 1993-12-08
Filing date: 1996-08-07
Publication date: 2000-12-29
Also published as: UA29494C2; BR9408278A; WO1995016038A3; NZ276170A; HU9601574D0; PL314908A1; US5861155A; FI962377A7; FI962377L; RU2139934C1; CZ162896A3; AU1033395A; JPH09509307A; IL111926A0; WO1995016038A2; HUT75553A; EP0737250A1; CZ287347B6; CN1063792C; SG48420A1

Description

Przedmiotem wynalazku są humanizowane przeciwciała i ich białka wiążące, zdolne do wiązania się z komórkami T wykazującymi określone zmienne łańcuchy β, zwłaszcza z tymi subpopulacjami, które wytwarzają w wyniku ekspresji ludzki Υβ 5.2 i/lub 5.3 oraz Υβ 8.1.

180 157

Przedmiotem wynalazku są ponadto preparaty takich przeciwciał, zawierające je kompozycje farmaceutyczne oraz terapeutyczne wykorzystanie przeciwciał, zwłaszcza w chorobach autoimmunologicznych.

Komórki T odgrywają kluczową rolę w różnicowaniu się i regulacji mechanizmów efektorowych w układzie odpornościowym (Paul i inni, (1987), Science 195: 1293-1300). Współrozpoznawanie antygenu i głównych komórek zgodności tkankowej przez komórki T musi być specyficznie i precyzyjnie regulowana, gdyż niewłaściwa regulacja odporności sprzyja autoimmunizacji. W szeregu laboratoriach badano choroby, w których, jak się okazało, występuje niewłaściwa regulacja odporności, takie jak autoimmunizacja oraz pewne formy niedoboru odporności, stwierdzając rolę komórek T w patogenezie takich chorób.

Doniesiono o szeregu sytuacjach, w których występuje klonalna lub oligoklonalna ekspansja składu receptorów komórek T. Do najbardziej oczywistych przykładów należą stany złośliwe występujące w czasie białaczki i chłoniaku komórek T. W przypadku białaczek lub chłoniaków komórek T receptor komórek T działa jako unikatowy marker nowotworu, gdyż receptor komórki T ulega na trwałe przegrupowaniu i znajduje się na powierzchni komórki. Inną sytuację, w której skład receptora określonej komórki T odgrywa rolę, stanowi przeszczep narządu u biorcy, którego limfocyty T zawierają receptory komórek T i działają agresywnie w stosunku do cząsteczek MHC dawcy, np. dawcy przeszczepu szpiku kostnego.

Co jest jeszcze ważniejsze, szereg grup doniosło o selektywnym wykorzystaniu genu obszaru V receptora antygenu przez komórki T w pewnych sytuacjach autoimmunizacyjnych. Tak np. Grunwald i inni zaobserwowali wybiórczą ekspresję produktu genowego Va 2.3 w komórkach CD4+ T przy przemywaniu układu oskrzelowo-pęcherzykowego w porównaniu z limfocytami krwi obwodowej u pacjentów z sarkoidozą (Grunwald i inni, (1992), Eur. J. Immunol. 22: 129). W chorobie Kawasaki’ego zaobserwowano przy ujawnianiu się choroby wybiórczą ekspansję komórek T νβ 2 i νβ 8 (Abe i inni, (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4066).

W tym aspekcie dokładnie przebadano reumatoidalne zapalenie stawów. Szereg badaczy zaobserwowało wybiórczą ekspansję podzestawów komórek T, np. DerSimonian i inni, (1993) J. Exp. Med. 177: 1623 (wybiórcza ekspansja komórek T zawierających Va 12.1 w limfocytach CD8+ T krwi obwodowej); Stamenkovic i inni (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1179 (metodą blottingu Southema stwierdzono, że maziówkowe komórki T przenikające przez błonę, hodowane w IL2 są poliklonalne); Palliard i inni (1991), Science 253: 34 (założyli, że w przypadku komórek νβ 14+ T uaktywnionych superantygenem zachodzi klonalna ekspansja i migracja da płynu maziówkowego pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów); Howell i inni(1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10921 (zaobserwowali w szczególności wykorzystanie genu obszaru V komórek Τνβ3, 14 i 17 przez komórki IL 2R+ z płynu maziówkowego pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów); Uematsu i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8534 (wykazali wykorzystanie genu obszaru V oligoklonalnych komórek T przez komórki T płynu maziówkowego u jego pacjenta z reumatoidalnym zapaleniem stawów); oraz międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO90/06758 Irola νβ 3, 9 i 10 w reumatoidalnym zapaleniu stawów).

Obszernie zbadano także zapalenie jelita grubego. Szereg grup zaobserwowała zwiększenie populacji komórek T lub wybiórcze wykorzystanie genu obszaru V komórek T, np.: Posnett i inni, (1990) J. Clin. Invest. 85: 1770; Spencer i inni, (1991) J. Clin. Pathol. 44: 915; Trejjdosiewicz i inni (1991) Clin. Exp. Immunol. 84: 440; oraz Van Kerckhove i inni, (1992) J. Exp. Med 175: 57. Jeszcze inni donieśli o wybiórczym wykorzystaniu genu V komórek T przez Mycobacterium leprae (van Schooten i inni, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11244; Wang i inni, (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 188.

U ludzi ekspansję νβ 8.1 komórek T w tkance zapalnej zaobserwowano w szeregu chorobach autoimmunologicznych, takich jak choroba Crohna (Posnett i inni, (1990) J. Clin. Invest. 85: 1770-1776), choroba Kawasaki’ego (Abe i inni, (1992) Proc. Natl. Acad.

180 157

Sci. USA 89: 4066-4070 oraz Abe i inni, (1993) J. Exp. Med. 177: 791-796) oraz reumatoidalne zapalenie stawów (Brennan i inni, (1988), Clin Exp. Immunol. 73: 417- 423.

Stwardnienie rozsiane SM stanowi kolejną chorobę autoimmunologiczną, która została dokładnie przebadana. SM jest przebiegającą z udziałem układu odpornościowego chorobą charakteryzującą się infiltracją i demielinacją komórek ośrodkowego układu nerwowego. Jakkolwiek patogeneza SM nie jest znana, w procesie chorobowym odgrywają rolę zarówno czynniki genetyczne jak i środowiskowe. Do głównych elementów skłonności genetycznej należy związek choroby z określonymi haplotypami głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy II, a zwłaszcza HLA-DR21 i DQW1 (Terasaid i inni, (1976), Science 1933: 1245-1247; Ho i inni, (1982) Immunogenetics 15: 509-517; Spielman i inni, (1982) Epidomiol. Rev. 4: 45-65: Francis i inni, (1986) Lancet 1: 211; Elias i inni, (1987) Disease Markers 5: 89-99; Urban i inni (1988), 54: 577-592; Vanderbark i inni (1989), Naturę 341: 541-544; Howell i inni (1989), Science 246: 668-670).

Stwierdzono, że komórki T wydzielone z płynu mózgowo-rdzeniowego pacjentów z SM wykorzystują ograniczony zestaw genów obszaru V. Wykazanie in vivo występowania komórek T specyficznych względem uaktywnionego podstawowego białka mielinowego (MBP) u pacjentów z SM doprowadziło do wniosku, że komórki T specyficzne względem MBS odgrywają rolę w patogenezie choroby (Wucherpfennig i inni (1990), Science 248: 1016-1019). Gdy badano wykorzystywanie TCR νβ linii komórek T reagujących z MCB poprzez amplifikację cDNA ze starterami νβ receptora komórki T na drodze łańcuchowej reakcji polimerazowej (PCR), stwierdzono wybiórcze wykorzystywanie ograniczonej liczby genów νβ (Wucherpfennig i inni, (1990) (supra) - νβ17 i w mniejszym stopniu νβ 12 często wykorzystuje się w rozpoznawaniu immunodominującego obszaru ludzkiego antygenu MBP); Oksenberg i inni (1993), Naturę 362: 68. Wyniki pewnych badań prowadzą również do wniosku, że ograniczona ekspresja genu Va receptora komórek T zachodzi w zmianach chorobowych w mózgu osobników z SM (Oksenberg i inni (1990), Naturę 345: 344-346). Analiza repertuaru komórek T z wykorzystaniem ilościowej PCR i barwienia monoklonalnych przeciwciał (mAb) wykazała, że νβ 5.2 i/lub 5.3 są wybiórczo wykorzystywane przez komórki T specyficzne względem podstawowego białka mielinowego (MBP), wydzielone z pacjentów z SM w porównaniu z osobnikami kontrolnymi (Oksenberg i inni (1993) (supra) (przegrupowane geny νβ 5.2 wykryto w mózgach pacjentów z pewnym fenotypem HLA) oraz Kotzin i inni (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9196 (zaobserwowano tendencję do wykorzystywania łańcucha β zmiennego obszaru 5.2 i w mniejszym stopniu νβ 5.3 wśród specyficznych względem MBP klonów od pacjentów z SM.

Obecnie brak jest skutecznego sposobu leczenia SM. (Harrison’s Principles of Intemal Medicine, 12 wyd., Wilson i inni, McGraw Hill, Inc., 1991). Usiłowania terapeutyczne kieruje się na łagodzenie stanów ostrych, zapobieganie nawrotom lub postępowi choroby oraz łagodzenie objawów.

Jednakże stwierdzono korelację między ekspresją genu zmiennego obszaru νβ 82. myszy i doświadczalnym uczuleniowym zapaleniem mózgu i rdzenia (EAE), mysiego modelu SM. Wykazano, że leczenie mysim mAb specyficznym względem νβ 8.2 może zarówno zapobiec chorobie jak i złagodzić jej przebieg (AchaOrbea i inni (1988), Celi 54: 263 oraz Urban i inni (1988), Celi 54: 577). W związku z tym istnieje znaczne zapotrzebowanie na opracowanie przeciwciała lub cząsteczki „przeciwciało-podobnej” przydatnej w leczeniu tej choroby.

Przeciwciała zawierają zazwyczaj dwa ciężkie łańcuchy połączone ze sobą wiązaniami disulfidowymi oraz lekkie łańcuchy zasocjowane z N-końcowym końcem każdego z ciężkich łańcuchów. Każdy ciężki łańcuch zawiera na N-końcowym końcu zmienną domenę, po której następuje stała domena na jego drugim końcu. Każdy lekki łańcuch również zawiera na N-końcowym końcu zmienną domenę, po której następuje stała domena. Zmienne domeny każdej pary lekkiego i ciężkiego łańcucha tworzą miejsce wiązania antygenu. Zmienne domeny na lekkich i ciężkich łańcuchach mają zasadniczo taką samą budowę, przy czym każda z domen

180 157 obejmuje szkielet z 4 obszarów, których sekwencje są względnie zachowane, połączonych z 3 obszarami określającymi komplementamość (CDR). 4 obszary szkieletu przyjmują swego rodzaju konformację arkusza β, a CDR tworzą pętle łączące konstrukcję łańcucha β. CDR utrzymywane są w bliskim sąsiedztwie przez obszary szkieletu i przyczyniają się do tworzenia miejsca wiązania antygenu. CDR i obszary szkieletowe przeciwciał można określić przyjmując system numerowania Kabata (Kabat i inni (1987), „Seąuences of Proteins of Immunologie Interest”, US Dept. of Health i Humań Services, US Goverment Printing Office) w połączeniu z krystalografią rentgenowską jak to przedstawiono w WO91/09967.

W celu wytworzenia przeciwciała, które może ukierunkowywać się na określony antygen zazwyczaj wykorzystuje się procedurę Kohlera i Milsteina (Kohler i inni (1976), Naturę 256:495-497). Obejmuje ona zazwyczaj immunizację myszy antygenem, po czym wykonuje się fuzję komórek śledziony immunizowanych myszy z komórkami szpiczakowymi myszy i spośród powstałych w ten sposób hybrydom wybiera się jedną lub więcej hybrydom wydzielających monoklonalne przeciwciało specyficzne względem docelowego antygenu.

Pożądane byłoby zastosowanie takich mAb w terapii. Jednakże są to zasadniczo mAb pochodzenia mysiego i z tego względu stanowią antygeny u ludzi. Gdy takie mAb podaje się szereg razy ludziom, ludzki układ odpornościowy wytwarza reakcję na mysie mAb, tak że stają się one nieskuteczne.

W związku z tym Winter i współpracownicy (patrz np. Reichmann i inni (1988), Naturę 332: 323-327 oraz Verhoyen i inni (1988), Science 239: 1534-1536) zaproponowali, że należy CDR mysiego mAb szczepić na ludzkim szkielecie uzyskując przeciwciało szczepione mAb o właściwościach wiązania donorowego mysiego mAb oraz kompatybilności względem człowieka wynikającej z akceptorowego ludzkiego szkieletu.

Jednakie działanie cząsteczki przeciwciała zależy od jego struktury trójwymiarowej, która z kolei zależy od jego podstawowej sekwencji aminokwasów. Zmiana sekwencji aminokwasów przeciwciała może niekorzystnie wpłynąć na jego aktywność. Także fragmenty przeciwciała mogą nie zachować odpowiedniej struktury trójwymiarowej niezbędnej do podtrzymywania jego zdolności wiązania. Ponadto zmiana w sekwencji DNA kodującej przeciwciało może wpływać na zdolność komórki zawierającej sekwencję DNA do ekspresji, wydzielania i składania przeciwciała. Właściwe reszty obejmujące CDR są trudne do ustalenia i nie muszą odpowiadać wszystkim resztom w obszarach hiperzmiennych określonych przez system numerowania Kabata. Istnieją także krytyczne reszty szkieletu odgrywające ważną rolę w ustawianiu CDR do oddziaływania z antygenem lub w oddziaływaniach między ciężkimi i lekkimi łańcuchami. Konieczna może okazać się zmiana pewnych reszt szkieletu, tak aby odpowiadały one resztom donora w pewnych pozycjach, co spowoduje, że przeciwciało szczepione CDR będzie wykazywać mniej „ludzki” charakter.

Opublikowano różne propozycje odnośnie identyfikacji reszt CDR i szkieletu , które muszą zostać zamienione na reszty donorowe, aby uzyskać użyteczne przeciwciało szczepione CDR (patrz np. Queen i inni, WO90/07861; Kurrle i inni, EP-A-0 403 156; Adair i inni, WO91/09967; Queen i inni, WO92/11018; oraz Bendig i inni, WO92/01568). Z dokumentów tych wynika, że wytwarzanie użytecznego przeciwciała szczepionego CDR w każdym przypadku nie przebiega bezpośrednio.

Pomimo problemów typowych dla prób wytworzenia specyficznego przeciwciała szczepionego CDR w korzystnym wykonaniu wynalazku twórcom udało się wytworzyć przeciwciało szczepione CDR w oparciu o obszary ludzkiego szkieletu, zawierające miejsce wiązania antygenu specyficzne względem zmiennych obszarów łańcucha β właściwych pewnym subpopulacjom komórek T. Nieoczekiwanie humanizowane przeciwciała według wynalazku wykazują dobre lub lepsze powinowactwo wiązania względem docelowych komórek T niż ich mysie prototypy. Zaletą zastrzeżonych przeciwciał lub ich części jest również to, że są one mniej immunogeniczne niż ich mysie prototypy, w związku z tym zmniejszają się reakcje obronne u pacjentów po zastosowaniu w terapii.

180 157

Przedmiotem wynalazku jest humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące posiadające sekwencję aminokwasów obejmującą całość lub część CDR pochodzących zasadniczo od monoklonalnego przeciwciała wykazującego specyficzność względem wybranej subpopulacji komórek T ekspresjonujących region zmienny Ϋβ5.2 lub νβ5.3 łańcucha beta receptora antygenowego komórek T, w połączeniu z wybranymi resztami zmiennego szkieletu również pochodzącymi od tego monoklonalnego przeciwciała, przy czym to humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zdolne jest do wiązania się z wybranymi subpopulacjami komórek T z powinowactwem wiązania co najmniej porównywalnym z powinowactwem wykazywanym przez to monoklonalne przeciwciało i korzystnie redukuje liczbę komórek T w subpopulacji reagującej z tym humanizowanym przeciwciałem lub jego białkiem wiążącym, przy czym takie humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zawiera sekwencję aminokwasową TM27Vł:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQTPGKAPKLLIYY 50 51 TSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPRTFGQ 100

101 GTKLQIT 107, i zawiera ponadto sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z: sekwencji aminokwasowej TM27 VH:

QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVROPPGRGLEWLGM 50 51 IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNQKSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV 100 101 TATLYAMDYWGQGSLVTVSS 120, sekwencji TM27 VH, w której resztę aminokwasową 48 zastąpiono izoleucyną (I), sekwencji TM27 VH, w której reszty aminokwasowe 78 i 79 są wahną (V) i fenyloalaniną (F), sekwencji TM27 VH, w której reszty aminokwasowe 67 do 70 posiadające sekwencję VTML zostały zastąpione LSIS, odpowiednio, a resztą aminokwasową 73 jest asparagina (N), oraz sekwencji TM27 VH, w której resztą aminokwasową 92 jest arginina (R).

Korzystnie przeciwciało według wynalazku stanowi izotyp IgG2a.

Przedmiotem wynalazku jest także humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące, posiadające sekwencję aminokwasów obejmującą całość lub część CDR pochodzących zasadniczo od monoklonalnego przeciwciała wykazującego specyficzność względem wybranej subpopulacji komórek T ekspresjonujących region zmienny νβ8.1 łańcucha beta receptora antygenowego komórek T, w połączeniu z wybranymi resztami zmiennego szkieletu również pochodzącymi od tego monoklonalnego przeciwciała, przy czym to humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zdolne jest do wiązania się z wybranymi subpopulacjami komórek T z powinowactwem wiązania co najmniej porównywalnym z powinowactwem wykazywanym przez to monoklonalne przeciwciało i korzystnie redukuje liczbę komórek T w subpopulacji reagującej z tym humanizowanym przeciwciałem lub jego białkiem wiążącym, przy czym takie humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zawiera sekwencję aminokwasową TM29Vk:

DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVNYIYWYQQTPGKAPKLLIYYT 50 51 SNLAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQG 100

101 TKLQIT 106, i zawiera ponadto sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji aminokwasowej TM29 VH:

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFTF SNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY

ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG 101 EGAMD YWGQGTPVTVSS 117, sekwencji TM29 VH, w której obydwie reszty aminokwasowe 23 i 24 zostały zastąpione resztami alaniny (A), sekwencji TM29 VH, w której reszta aminokwasowa 75 została zastąpiona proliną (P), oraz

180 157 sekwencji TM29 VH, w której reszty aminokwasowe 92 i 93 zostały zastąpione alaniną (A) i metioniną (M), odpowiednio, a resztą aminokwasową 73 jest asparagina (N), a reszta aminokwasowa 95 została zastąpiona tyrozyną (Y).

Korzystnie humanizowane przeciwciało według wynalazku charakteryzuje się tym, że stanowi izotyp IgG2a.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania humanizowanego przeciwciała lub jego białka wiążącego zawierającego co najmniej jeden CDR, pochodzący zasadniczo z mysiego monoklonalnego przeciwciała anty-V35.2/Vp5.3 o specyficzności względem wybranej subpopulacji komórek T, przy czym humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące posiada sekwencję aminokwasową TM27 Vł:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQTPGKAPKLLIYY 50

TSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPRTFGQ 100

101 GTKLQIT 107, i zawiera ponadto sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji aminokwasowej TM27 VH:

QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVROPPGRGLEWLGM 50 51 IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNQKSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV 100 101 TATLYAMDYWGQGSLVTVSS 120, przy czym wspomniany CDR jest kodowany przez pierwszą sekwencję DNA, charakteryzujący się tym, że w trakcie tego sposobu:

a) klonuje się wspomnianą pierwszą sekwencję DNA w odpowiednim wektorze;

b) wprowadza się na drodze mutagenezy wybrany ludzki szkielet aminokwasów tworząc konstrukt kodujący szczepiony CDR zawierający sekwencję wybraną z grupy składającej się z:

sekwencji TM27 VH, w której resztę aminokwasową48 zastąpiono izoleucyną (I), sekwencji TM27 VH, w której reszty aminokwasowe 78 i 79 są waliną (V) i fenyloalaniną (F), sekwencji TM27 VH, w której reszty aminokwasowe 67 do 70 posiadające sekwencję VTML zostały zastąpione LSIS, odpowiednio, a resztą aminokwasową 73 jest asparagina (N), oraz sekwencji TM27 VH, w której resztą aminokwasową 92 jest arginina (R);

c) transformuje się komórkę gospodarza konstruktem z etapu b); oraz

d) hoduje się tak transformowaną komórkę gospodarza w celu wytworzenia humanizowainego przeciwciała lub jego białka wiążącego.

Korzystnie komórkę gospodarza stanowi komórka CHO.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania humanizowanego przeciwciała lub jego białka wiążącego zawierającego co najmniej jeden CDR, pochodzący zasadniczo z mysiego monoklonalnego przeciwciała zawierającego co najmniej jeden CDR pochodzący zasadniczo z mysiego monoklonalnego przeciwciała anty-Vp8.1 o specyficzności względem wybranej subpopulacji komórek T, przy czym humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące posiada sekwencję aminokwasową TM29 Vk:

DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVNYIYWYQQTPGKAPKLLIYYT 50

SNLAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQG 100

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY

ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGV YFCARRG

101 EGAMDYWGQGTPVTVSS 117, przy czym wspomniany CDR jest kodowany przez pierwszą sekwencję DNA, charakteryzujący się tym, że w trakcie tego sposobu:

a) klonuje się pierwszą sekwencję DNA w odpowiednim wektorze;

180 157

b) wprowadza się wybrany ludzki szkielet aminokwasów na drodze mutagenezy, uzyskując konstrukt kodujący szczepiony CDR zawierający sekwencję wybraną z grupy składającej się z:

sekwencji TM29 VH, w której obydwie reszty aminokwasowe 23 i 24 zostały zastąpione resztami alaniny (A), sekwencji TM29 VH, w której reszta aminokwasowa 75 została zastąpiona proliną (P), oraz sekwencji TM29 VH, w której reszty aminokwasowe 92 i 93 zostały zastąpione alaniną (A) i metioniną (M), odpowiednio, a resztą aminokwasową 73 jest asparagina (N), a reszta aminokwasowa 95 została zastąpiona tyrozyną (Y),

c) transformuje się komórkę gospodarza konstruktem z etapu b); oraz

d) hoduje się tak transformowaną komórkę gospodarza w celu wytworzenia humanizowanego przeciwciała lub jego białka wiążącego.

Korzystnie komórkę gospodarza stanowi komórka CHO.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące posiadające sekwencję aminokwasów obejmującą całość lub część CDR pochodzących zasadniczo od monoklonalnego przeciwciała wykazującego specyficzność względem wybranej subpopulacji komórek T ekspresjonujących region zmienny Vp5.2 lub Vp5.3 łańcucha beta receptora antygenowego komórek T, w połączeniu z wybranymi resztami zmiennego szkieletu również pochodzącymi od tego monoklonalnego przeciwciała, przy czym to humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zdolne jest do wiązania się z wybranymi subpopulacjami komórek T z powinowactwem wiązania co najmniej porównywalnym z powinowactwem wykazywanym przez to monoklonalne przeciwciało i korzystnie redukuje liczbę komórek T w subpopulacji reagującej z tym humanizowanym przeciwciałem lub jego białkiem wiążącym, przy czym takie humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zawiera sekwencję aminokwasową TM27V£:

QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVROPPGRGLEWLGM 50 51 IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNQKSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV 100 101 TATLYAMDYWGQGSLVTVSS 120, sekwencji TM27 VH, w której resztę aminokwasową 48 zastąpiono izoleucyną (I), sekwencji TM27 VH, w której reszty aminokwasowe 78 i 79 sąwaliną(V) i fenyloalaniną (F), sekwencji TM27 VH, w której reszty aminokwasowe 67 do 70 posiadające sekwencję VTML zostały zastąpione LSIS, odpowiednio, a resztą aminokwasową 73 jest asparagina (N), oraz sekwencji TM27 VH, w której resztą aminokwasową 92 jest arginina (R), w kombinacji z farmaceutycznie dopuszczalnym wypełniaczem.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące posiadające sekwencję aminokwasów obejmującą całość lub część CDR pochodzących zasadniczo od monoklonalnego przeciwciała wykazującego specyficzność względem wybranej subpopulacji komórek T ekspresjonujących region zmienny νβ8.1 łańcucha beta receptora antygenowego komórek T, w połączeniu z wybranymi resztami zmiennego szkieletu również pochodzącymi od tego monoklonalnego przeciwciała, przy czym to humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zdolne jest do wiązania się z wybranymi subpopulacjami komórek T z powinowactwem wiązania co najmniej porównywalnym z powinowactwem wykazywanym przez to monoklonalne przeciwciało i korzystnie redukuje liczbę komórek T w subpopulacji reagującej

180 157 z tym humanizowanym przeciwciałem lub jego białkiem wiążącym, przy czym takie humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zawiera sekwencję aminokwasową TM29Vk:

101 TKLQIT 106, i zawiera ponadto sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z: sekwencji aminokwasowej TM29 VH

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFTF SNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY 51 ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG

101 EGAMDYWGQGTPVTVSS 117, sekwencji TM29 VH, w której obydwie reszty aminokwasowe 23 i 24 zostały zastąpione resztami alaniny (A), sekwencji TM29 VH, w której reszta aminokwasowa 75 została zastąpiona proliną (P), oraz sekwencji TM29 VH, w której reszty aminokwasowe 92 i 93 zostały zastąpione alaniną (A) i metioniną (M), odpowiednio, a resztą aminokwasową 73 jest asparagina (N), a reszta aminokwasowa 95 została zastąpiona tyrozyną (Y), w kombinacji z farmaceutycznie dopuszczalnym wypełniaczem.

Przedmiotem wynalazku jest także środek farmaceutyczny służący do co najmniej jednego z następujących celów: redukowania zapalenia w tkankach zapalnych; redukowania infiltracji monocytów do centralnego układu nerwowego; redukowania demielinacji układu nerwowego; inhibicji, supresji, modulacji i/lub zabijania populacji komórek; wzmocnienia, inaktywacji, zabijania i/lub usuwania wybranej populacji komórek T u ssaków; eliminowania wybranej i/lub niepożądanych limfocytów T z krwi obwodowej, leczenia choroby Crohna, leczenia stwardnienia rozsianego, zawierający czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzujący się tym, że jako czynnik aktywny zawiera humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące posiadające sekwencję aminokwasów obejmującą całość lub część CDR pochodzących zasadniczo od monoklonalnego przeciwciała wykazującego specyficzność względem wybranej subpopulacji komórek T ekspresjonujących region zmienny νβ5.2 lub νβ5.3 łańcucha beta receptora antygenowego komórek T, w połączeniu z wybranymi resztami zmiennego szkieletu również pochodzącymi od tego monoklonalnego przeciwciała, i korzystnie redukuje liczbę komórek T w subpopulacji reagującej z tym humanizowanym przeciwciałem lub jego białkiem wiążącym, przy czym to humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zdolne jest do wiązania się z wybranymi subpopulacjami komórek T z powinowactwem wiązania co najmniej porównywalnym z powinowactwem wykazywanym przez to monoklonalne przeciwciało, przy czym takie humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zawiera sekwencję aminokwasową TM27V#:

QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVROPPGRGLEWLGM 50 51 IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNQKSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV 100 101 TATLYAMD YWGQGSLVTVSS 120, sekwencji TM27 VH, w której resztę aminokwasową 48 zastąpiono izoleucyną (I), sekwencji TM27 VH, w której reszty aminokwasowe 78 i 79 sąwaliną(V) i fenyloalaniną (F), sekwencji TM27 VH, w której reszty aminokwasowe 67 do 70 posiadające sekwencję VTML zostały zastąpione LSIS, odpowiednio, a resztą aminokwasową 73 jest asparagina (N), oraz sekwencji TM27 VH, w której resztą aminokwasową 92 jest arginina (R).

180 157

Przedmiotem wynalazku jest także środek farmaceutyczny służący do co najmniej jednego z następujących celów: redukowania zapalenia w tkankach zapalnych; redukowania infiltracji monocytów do centralnego układu nerwowego; redukowania demielinacji układu nerwowego; inhibicji, supresji, modulacji i/lub zabijania populacji komórek; wzmocnienia, inaktywacji, zabijania i/lub usuwania wybranej populacji komórek T u ssaków; eliminowania wybranej i/lub niepożądanych limfocytów T z krwi obwodowej, leczenia choroby Crohna, leczenia stwardnienia rozsianego zawierający czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzujący się tym, że jako czynnik aktywny zawiera humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące posiadające sekwencję aminokwasów obejmującą całość lub część CDR pochodzących zasadniczo od monoklonalnego przeciwciała wykazującego specyficzność względem wybranej subpopulacji komórek T ekspresjonujących region zmienny νβ8.1 łańcucha beta receptora antygenowego komórek T, w połączeniu z wybranymi resztami zmiennego szkieletu również pochodzącymi od tego monoklonalnego przeciwciała, przy czym to humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zdolne jest do wiązania się z wybranymi subpopulacjami komórek T z powinowactwem wiązania co najmniej porównywalnym z powinowactwem wykazywanym przez to monoklonalne przeciwciało i korzystnie redukuje liczbę komórek T w subpopulacji reagującej z tym humanizowanym przeciwciałem lub jego białkiem wiążącym, przy czym takie humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zawiera sekwencję aminokwasową TM29VŁ

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY 51 ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGV YFCARRG

101 EGAMDYWGQGTPVTVSS 117, sekwencji TM29 VH, w której obydwie reszty aminokwasowe 23 i 24 zostały zastąpione resztami alaniny (A), sekwencji TM29 VH, w której reszta aminokwasowa 75 została zastąpiona proliną (P), oraz sekwencji TM29 VH, w której reszty aminokwasowe 92 i 93 zostały zastąpione alaniną (A) i metioniną (M), odpowiednio, a resztą aminokwasową 73 jest asparagina (N), a reszta aminokwasowa 95 została zastąpiona tyrozyną (Y).

Przedmiotem wynalazku jest także sposób ograniczania w populacji komórek T liczby komórek T ekspresjonujących łańcuch β receptora komórek T charakteryzujący się tym, że poddaje się takie komórki T ekspresjonujące łańcuch β działaniu skutecznego stężenia humanizowanego przeciwciała posiadającego sekwencję aminokwasów obejmującą całość lub część CDR pochodzących zasadniczo od monoklonalnego przeciwciała wykazującego specyficzność względem wybranej subpopulacji komórek T ekspresjonujących region zmienny νβ5.2 lub νβ5.3 łańcucha beta receptora antygenowego komórek T, w połączeniu z wybranymi resztami zmiennego szkieletu również pochodzącymi od tego monoklonalnego przeciwciała, przy czym to humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zdolne jest do wiązania się z wybranymi subpopulacjami komórek T z powinowactwem wiązania co najmniej porównywalnym z powinowactwem wykazywanym przez to monoklonalne przeciwciało i korzystnie redukuje liczbę komórek.T w subpopulacji reagującej z tym humanizowanym przeciwciałem lub jego białkiem wiążącym, przy czym takie humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zawiera sekwencję aminokwasową TM27Vł:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQTPGKAPKLLIYY 50

TSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPRTFGQ 100

101 GTKLQIT 107,

180 157 i zawiera ponadto sekwencję aminokwasową wy braną z grupy składającej się z: sekwencji aminokwasowej TM27 VH:

QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVROPPGRGLEWLGM 50 51 IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNQKSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV 100 101 TATLYAMDYWGQGSLVTVSS 120, sekwencji TM27 VH, w której resztę aminokwasową 48 zastąpiono izoleucyną (I), sekwencji TM27 VH, w której reszty aminokwasowe 78 i 79 sąwaliną(V) i fenyloalaniną (F), sekwencji TM27 VH, w której reszty aminokwasowe 67 do 70 posiadające sekwencję VTML zostały zastąpione LSIS, odpowiednio, a resztą aminokwasową 73 jest asparagina (N), oraz sekwencji TM27 VH, w której resztą aminokwasową 92 jest arginina (R).

Przedmiotem wynalazku jest także sposób ograniczania w populacji komórek T liczby komórek T ekspresjonujących łańcuch β receptora komórek T charakteryzujący się tym, że poddaje się takie komórki T ekspresjonujące łańcuch β działaniu skutecznego stężenia humanizowanego przeciwciała posiadającego sekwencję aminokwasów obejmującą całość lub część CDR pochodzących zasadniczo od monoklonalnego przeciwciała wykazującego specyficzność względem wybranej subpopulacji komórek T ekspresjonujących region zmienny νβ8.1 łańcucha beta receptora antygenowego komórek T, w połączeniu z wybranymi resztami zmiennego szkieletu również pochodzącymi od tego monoklonalnego przeciwciała, przy czym to humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zdolne jest do wiązania się z wybranymi subpopulacjami komórek T z powinowactwem wiązania co najmniej porównywalnym z powinowactwem wykazywanym przez to monoklonalne przeciwciało i korzystnie redukuje liczbę komórek T w subpopulacji reagującej z tym humanizowanym przeciwciałem lub jego białkiem wiążącym, przy czym takie humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zawiera sekwencję aminokwasową TM29VŁ

DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVNYIYWYQQTPGKAPKLLIYYT 50

SNLAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQG 100

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY 51 ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG

Ujawnienie dotyczy humanizowanych przeciwciał wykazujących selektywną specyficzność wiązania względem pewnych subpopulacji komórek T, przy czym przeciwciała te są bardzo wrażliwe w wiązaniu z tymi subpopulacjami oraz wykazują specyficzność i powinowactwo w takim wiązaniu, takie same lub lepsze niż prototyp mAb, z którego pochodzi znacząca część ich obszarów CDR. Ujawnienie dotyczy także sposobów wytwarzania takich humanizowanych przeciwciał, wykorzystania nowego cDNA kodującego reszty części hiperzmiennych i szkieletu oraz ich szczepienia na ludzkich szkieletach ciężkiego łańcucha i ludzkich szkieletach lekkiego łańcucha. Dodatkowo przedmiotem ujawnienia są kompozycje farmaceutyczne i terapeutyczne sposoby zastosowania takich przeciwciał.

W jednym konkretnym wykonaniu przeprowadzono humanizację mysiego mAb, 16G8, który rozpoznaje ludzki Ϋβ 8.1, przez CDR-szczepienie pewnych CDR i wybranych reszt szkieletu z mysiego mAb na szkieletach ciężkiego łańcucha KOL i lekkiego łańcucha REI.

180 157 cDNA kodującym humanizowane ciężkie (IgGl) i lekkie (K) łańcuchy w wektorach ekspresji w ludzkich komórkach, odpowiednio z markerami selekcji Neo i DHFR transfekowano linię komórek DHFR-flibroblastu (CHO) chomika chińskiego, po czym przeprowadzono selekcję i amplifikację. Wydzielone humanizowane mAb oznaczone jako „TM29” zachowuje specyficzność względem ludzkiego TCR νβ 8.1 z powinowactwem porównywalnym do prototypu, mysiego mAb (16G8). Ujawnione przeciwciała wykazują, że humanizowanie przeciwciał przeciw-TCR jest możliwe do przeprowadzenia przy zachowaniu właściwej specyficzności i powinowactwa względem danego podzbioru.

W innym wykonaniu prezentowane jest zastosowanie takich humanizowanych przeciwciał jako środka terapeutycznego w leczeniu chorób autoimmunologicznych u ludzi, zwłaszcza choroby Crohna.

W innym konkretnym wykonaniu wynalazku przeprowadzono humanizację mysiego mAb, TM23, który rozpoznaje ludzkie νβ 5.2 i 5.3, przez CDR-szczepienie CDR na szkieletach ciężkiego łańcucha NEWN i lekkiego łańcucha REI. cDNA kodującym humanizowane ciężkie (IgGl) i lekkie (K) łańcuchy w wektorach ekspresji w komórkach ssaków, odpowiednio transfekowano linię komórek DHFR-fibroblastu (CHO) chomika chińskiego, po czym przeprowadzono selekcję i amplifikację. Wydzielone humanizowane mAb oznaczone jako „TM27” zachowuje specyficzność względem ludzkich TCR νβ 5.2 i 5.3 z powinowactwem porównywalnym do prototypu, mysiego mAb (TM23). W innym wykonaniu ujawnione jest zastosowanie TM27 jako środka terapeutycznego do leczenia SM u ludzi.

Na figurze 1 przedstawiono różne zmienne sekwencje lekkich łańcuchów i sekwencje ciężkich łańcuchów' w TM27.

Na figurze 2 przedstawiono różne zmienne sekwencje lekkich łańcuchów i sekwencje ciężkich łańcuchów w TM29.

Na figurze 3 pokazano wyniki testu konkurencji, w którym porównano TM27/NSO i TM27L/CHO z 4H11.

Na figurze 4 przedstawiono wykres Scatcharda dla doświadczenia pokazanego na fig. 3.

Poniżej podano definicje pewnych terminów wykorzystanych w opisie wynalazku.

W opisie określenie „przeciwciało” stosuje się w odniesieniu do Ig lub jego dowolnego fragmentu, monomerów lub dimerów lekkich łańcuchów lub ciężkich łańcuchów, oraz jednołańcuchowych przeciwciał, takich jak jednołańcuchowe Fvs, w którym zmienne domeny ciężkiego i lekkiego łańcucha połączone są łącznikiem peptydowym, naturalnym lub wytworzonym techniką rekombinacji DNA lub w inny sposób, z tym że przeciwciało zawiera co najmniej jedno miejsce wiązania antygenu. Reszta przeciwciała nie musi zawierać wyłącznie sekwencje białkowe pochodzące od Ig. Tak np. można skonstruować gen, w którym sekwencja DNA kodująca ludzki łańcuch Ig jest połączona z sekwencją DNA kodującą sekwencję aminokwasów polipeptydowej cząsteczki efektorowej lub reporterowej. W związku z tym określenie „przeciwciało” obejmuje przeciwciała hybrydowe (patrz niżej).

Określenie „białko wiążące” odnosi się do konstruktu zawierającego określoną sekwencję aminokwasów pochodzącą z przeciwciała lub z kombinacji przeciwciał, przy czym sekwencja ta jest tak ukształtowana sterycznie, że tworzy co najmniej jedno miejsce wiązania antygenu.

Skrót „mAb” stosowany jest do określania monoklonalnego przeciwciała wytwarzanego przez hybrydomę lub pochodną linię komórek.

Określenie „zrekombinowane przeciwciało” używane jest do opisu przeciwciała wytwarzanego sposobem obejmującym wykorzystanie technologii rekombinacji DNA.

Określenie „CDR” lub „obszar określający komplementamość” odnosi się do tych części zmiennych obszarów ciężkiego łańcucha lub lekkiego łańcucha przeciwciała, które ułożone są w przestrzeni trójwymiarowej tak, że tworzą powierzchnię wiązania antygenu.

Określenie „chimeiyczne przeciwciało” używane jest do opisu przeciwciała, w którym zmienne domeny jako całość pochodzą z przeciwciała pierwszego gatunku ssaka i są połączone z co najmniej jedną stałą domeną z przeciwciała innego gatunku ssaka.

180 157

Określenie „szczepiony CDR” używane jest do opisu przeciwciała lub jego części, w którym CDR pochodzą zasadniczo z przeciwciała pierwszego gatunku ssaka i są szczepione na zmiennych obszarach szkieletu zasadniczo pochodzących z drugiego gatunku ssaka. Pewne wybrane aminokwasy w tych obszarach szkieletu mogą także pochodzić od pierwszego gatunku ssaka.

Określenie „przeciwciało hybrydowe” stosowane jest do opisu białka zawierającego co najmniej część wiążącą IG połączoną wiązaniem peptydowym z co najmniej częścią innego białka. Należy zdawać sobie sprawę, że pewni specjaliści mogą również używać określenia „chimeryczny” do opisu takich konstruktów, z tym że w opisie wynalazku takie konstrukty określa się jako przeciwciała hybrydowe, a określenie przeciwciała chimeryczne stosuje się w znaczeniu podanym wyżej.

Określenie „przeciwciało humanizowane” używane jest do opisu przeciwciała zawierającego co najmniej jeden, a korzystnie 2 lub 3 spośród CDR w jednej lub obydwu zmiennych domenach pochodzące od przeciwciała pierwszego gatunku, przy czym zrozumiałe jest, że może ono obejmować pewne wybrane aminokwasy szkieletowe w połączeniu z pewnymi hiperzmiennymi sekwencjami aminokwasów. Pozostałe części pochodzące z Ig w przeciwciele pochodzą od jednego lub więcej innych przeciwciał. Zmienne domeny wytwarzać można techniką rekombinacji DNA lub na drodze syntezy peptydowej.

„Wektor ekspresji” obejmuje wektory, które są zdolne do ekspresji zawartych w nich sekwencji DNA, tak że sekwencje kodujące są połączone funkcjonalnie z innymi sekwencjami zdolnymi do przeprowadzania takiej ekspresji. Przydatnym, choć nie zawsze koniecznym (np. w komórkach owadów) elementem skutecznego wektora ekspresji jest sekwencja kodująca marker, np. sekwencja kodująca sekwencję wektora zapewniającą właściwość fenotypową (np. odporność na neomycynę, odporność na sulfoksyminę metioniny lub prototrofię tryptofanową) komórek zawierających białko umożliwiające łatwą ich identyfikację. W sumie „wektor ekspresji” stanowi funkcjonalną definicję, tak że dowolna sekwencja DNA zdolna do skutecznej ekspresji określonego zawartego kodu DNA jest objęta tym terminem, podobnie jak to jest w przypadku określonej sekwencji. Obecnie takie wektory często określa się jako „plazmidy”. W związku z tym określenia „wektor ekspresji” i „plazmid” często stosuje się wymiennie. Jednakże wynalazek obejmuje również inne formy wektorów ekspresji, które spełniają równoważne funkcje i które mogą od czasu do czasu stać się znane, takie jak retrowirusy, adenowirusy, układy in vitro (Baranov i inni (1989), Gene 84: 2: 463) itp.

Jak to zaznaczono poprzednio, sekwencje DNA będą wykonywać ekspresję w komórkach gospodarza wtedy, gdy sekwencje zostaną funkcjonalnie połączone (to znaczy ustawione tak, aby zapewnić ich funkcjonowanie) z sekwencją kontrolującą ekspresję. Takie wektory ekspresji ulegają zazwyczaj replikacji w organizmach gospodarza jako episomy lub jego integralna część chromosomowego DNA gospodarza.

„Zrekombinowane komórki gospodarza” oznaczają komórki transformowane wektorami skonstruowanymi technikami rekombinacji DNA. Dzięki takiej transformacji komórka gospodarza jest zdolna do wytwarzania pożądanego produktu w użytecznych ilościach, a nie w mniejszych ilościach lub jeszcze częściej, w ilościach poniżej progu wykrywalności, czego możnaby oczekiwać w przypadku gospodarza nietransfbrmowanego. Przeciwciała i białka wiążące według wynalazku mogą być produkowane przez transformowane komórki gospodarza w użytecznych ilościach umożliwiających prowadzenie dodatkowych doświadczeń lub w ilościach handlowych, np. około 100 g lub więcej.

W opisie sposobów wydzielania przeciwciał lub ich białek wiążących ze zrekombinowanych komórek określenia „komórka” i „hodowla komórek” stosowane są wymiennie do określania źródła przeciwciał, o ile wyraźnie nie zaznaczono tego inaczej. Innymi słowy wydzielanie z „komórek” może oznaczać wydzielanie z odwirowanych całych komórek lub z hodowli komórek obejmującej zarówno ośrodek jak i zawieszone komórki, albo dodatkowo, jak to jest możliwe w przypadku linii komórek szpiczakowych, z hodowli puchlin.

180 157

Humanizowane przeciwciała lub ich białka wiążące objęte zakresem wynalazku zawierają sekwencję aminokwasów, które obejmują całość lub część CDR zasadniczo pochodzących od monoklonalnego przeciwciała wykazującego specyficzność względem wybranej subpopulacji komórek T, zwłaszcza subpopulacj i Vβ 8.1 lub subpopulacj i V β 5.2/5.3. W korzystnych wykonaniach monoklonalne przeciwciało jest pochodzenia mysiego. Szkielet sekwencji aminokwasów zmiennych domen przeciwciał lub ich części jest zasadniczo w korzystnych rozwiązaniach pochodzenia ludzkiego - stąd określenie „humanizowane przeciwciało”. Uważa się, że taka „humanizacja” jest przydatna w zmniejszaniu immunogeniczności przeciwciała po podaniu pacjentom w celach leczniczych. Według wynalazku korzystne są ludzkie obszary szkieletowe NEWM lub KOL w odniesieniu do ciężkiego łańcucha oraz ludzkie obszary szkieletowe REI w odniesieniu do lekkiego łańcucha. Jednakże utrzymuje się mysie, a nie ludzkie, pochodzenie pewnych wybranych reszt szkieletowych. Uważa się, że jest to niezbędne do osiągnięcia odpowiedniej trójwymiarowej struktury cząsteczki, a tym samym do zwiększenia specyficzności wiązania i powinowactwa względem określonego podzestawu komórek T.

Dowolna część humanizowanych przeciwciał (patrz szeroka definicja określenia przeciwciała) wytworzona sposobem według wynalazku objęta jest zakresem wynalazku, jeśli utrzymana zostaje specyficzność wiązania i powinowactwo względem wybranych subpopulacji komórek T. W związku z tym białka wiążące uzyskane z tych przeciwciał są wyraźne objęte zakresem wynalazku, podobnie jak to jest w przypadku innych fragmentów utrzymujących te zdolności, co najmniej w stopniu umożliwiającym zastosowanie terapeutyczne, jak to zostanie opisane poniżej.

Specjalista może zbadać parametry wiązania różnych konstruktów wytworzonych w podany sposób stosując znane testy wiązania prowadzone z określonymi komórkami T lub białkami receptorowymi komórek T zawierającymi docelowy określony zmienny obszar. Tak np. przeprowadzić można testy wiązania konkurencyjnego z prototypowymi mAb, wiązanie z różnymi liniami komórek, analizę Scatcharda itp., porównując uzyskane wyniki z wynikami otrzymanymi dla prototypowych mAb. Można także wybrać różne modelowe układy zwierzęce, takie jak opisane poniżej, lub przeprowadzić próby kliniczne w celu dokonania oceny terapeutycznej skuteczności konstruktów wytworzonych sposobem według wynalazku, przy czym należy zdawać sobie sprawę, że konstrukt może być bardzo odpowiednim środkiem terapeutycznym nawet jeśli pod względem charakteru wiązania względem docelowego antygenu różni się od prototypowego mAb.

W szczególnie korzystnych rozwiązaniach sekwencja aminokwasów humanizowanego przeciwciała lub jego białko wiążące obejmuje całość lub część zmiennego łańcucha lekkiego wybranego z następującej grupy:

Lekki łańcuch TM 29

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVNYIYWYQQTPGKAPKLLIYYT 50 51 SNLAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQG 100 101 TKLQIT 106

Lekki łańcuch TM 27

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQTPGKAPKLLIYY 50 51 TSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPRTFGQ 100 101 GTKLQIT 107 sam lub w kombinacji z całością lub częścią zmiennego ciężkiego łańcucha wybranego z grupy obejmującej:

Ciężki łańcuch TM 29

EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCSSSGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY 50 51 ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG 100 101 EGAMDYWGQGTPVTVSS 117

Ciężki łańcuch TM 27

QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVRQPPGRGLEWLGM 50 51 IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV100 101 TATLYAMDYWGQGSLVTVSS 120.

180 157

Wybrane reszty szkieletowe w sąsiedztwie poszczególnych CDR są istotne, gdyż podtrzymują trójwymiarową konformację CDR (Foote i Winter, (1992) J. Mol. Biol. 224:487 - 499). W związku z tym w pewnych korzystnych rozwiązaniach skonstruowano zmodyfikowane ciężkie łańcuchy. W pierwszej z reszt od 66 do 69 oraz 73 mysią sekwencję Leu-Ser-Ile-Ser (66-69) i Asp (73) zastąpiono odpowiednikami ludzkimi.

W innych korzystnych rozwiązaniach mysie reszty walina i fenyloalanina znajdują się odpowiednio w pozycjach 78 i 79, albo mysia arginina znajduje się w pozycji 92.

Na figurze 1 pokazano przykłady tych podstawień, przedstawiając CDR pogrubionym pismem i podkreśleniami. Takie korzystne konstrukty przeciwciał (objemujące ich białka wiążące) wiążąsię z νβ 5.2/5.3.

Inne korzystne przeciwciała i ich białka wiążące uzyskuje się w wyniku modyfikacji ciężkich łańcuchów przy resztach 23 i 24. W pozycjach w odpowiedniej mysiej sekwencji znajdują się Ala. Inne konstrukty wykazują, że resztą 75 może być mysia reszta - prolina, a reszty 88, 89 i 91 może stanowić odpowiednio alanina, metionina lub tyrozyna.Takie konstrukcje przeciwciała i ich białka wiążące, które wiążąsię z komórkami V(3 8.1 przedstawiono dokładniej na fig. 2.

Szczególnie korzystne do stosowania są przeciwciała szczepione CDR, zawierające zasadniczo lekki łańcuch TM27 w połączeniu z ciężkim łańcuchem TM27, w którym resztę 48 stanowi mysia leucyna albo izoleucyna. Szczególnie korzystne są także przeciwciała szczepione CDR, zawierające zasadniczo lekki łańcuch TM29 w połączeniu z ciężkim łańcuchem TM29.

Humanizowane przeciwciała lub ich białka wiążące według wynalazku wytwarzać można różnymi sposobami, a korzystnie na drodze ekspresji w transfekowanych komórkach, takich jak komórki drożdżowe, owadzie, CHO łub szpiczakowe. Najkorzystniej jako komórkę gospodarza wykorzystuje się komórkę CHO.

W celu skonstruowania przeciwciała szczepionego CDR lub jego białka wiążącego według wynalazku najpierw należy znaleźć sekwencję zmiennej domeny przeciwciała wykazującą pożądaną zdolność wiązania. Odpowiednimi komórkami źródłowymi takich sekwencji DNA są komórki ptaków, ssaków i innych kręgowców, np. kurczaków, myszy, szczurów i królików, a korzystnie myszy. Sekwencje zmiennych domen (V_H i V_L) wyznaczyć można z cDNA ciężkich i lekkich łańcuchów, syntetyzowanego z odpowiedniego mRNA ogólnie znanymi sposobami. Następnie przy wykorzystaniu metody Kabata (supra) określić można obszary, CDR na podstawie analizy strukturalnej z wykorzystaniem krystalografii rentgenowskiej lub technikami modelowania cząsteczek. Następnie skonstruować można złożone CDR zawierające wszystkie reszty odpowiadające obszarom hiperzmiennym oraz pewne wybrane reszty z obszarów szkieletowych. Uzyskane złożone CDR można następnie, przenieść jako „miejsce wiązania antygenu”, a reszta przeciwciała, gdy pożądane jest skonstruowanie pełnego Ig, będzie obejmować stałe domeny ciężkich i lekkich łańcuchów oraz pozostałe reszty szkieletowe. Ta ostatnia część może być oparta na ludzkich przeciwciałach różnych typów.

Stałe domeny można tak dobrać, aby zawierały one pożądane funkcje efektorowe odpowiednie do stosowania konstruowanego przeciwciała. Tak np. ludzkie izotypy IgG, IgG] i IgG₃ są skuteczne w przypadku utrwalania komplementacji oraz uczestniczenia w lizie komórek. W innych przypadkach bardziej odpowiednie mogą być inne izotypy, takie jak IgG_p i IgG4 lub inne klasy takie jak IgM oraz IgE.

W przypadku leczenia ludzi szczególnie pożądane jest stosowanie ludzkich izotypów, aby zminimalizować reakcje antyglobulinowe w czasie terapii. Ludzkie sekwencje stałych domen DNA, korzystnie w połączeniu z ich obszarami szkieletowymi zmiennych domen wytwarzać można znanymi sposobami. Przykład stanowi CAMPATH 1H dostępny z Burroughs Wellcome Ltd.

Zgodnie z korzystnymi wariantami wynalazku stosuje się pewne przeciwciała szczepione CDR, zawierające wybrane modyfikacje w ludzko-podobnym obszarze szkieletowym (czyli poza CDR zmiennych domen), dzięki czemu uzyskuje się przeciwciało szczepione

180 157

CDR o zadowalającym powinowactwie wiązania. Takie powinowactwo wiązania wynosi korzystnie od około 10'⁵ M do około 10‘¹² M, a jeszcze korzystniej co najmniej około ΙΟ'⁸ M. Najkorzystniej powinowactwo wiązania jest zbliżone lub wyższe od powinowactwa prototypowego przeciwciała (w korzystnych przypadkach takim prototypowym przeciwciałem będzie przeciwciało mysie).

Przy konstruowaniu przeciwciał szczepionych CDR według wynalazku segmenty genów V_H i/lub V_L można zmienić na drodze mutagenezy. Dla specjalisty zrozumiałe jest również, że różne inne nukleotydy kodujące reszty aminokwasów lub sekwencje zawarte w części Fc lub w innych obszarach przeciwciała można zmienić w podobny sposób (patrz np. PCT/US89/00297).

Do przykładowych technik należy addycja, delecja lub niekonserwatywne podstawianie ograniczonej liczby różnych nukleotydów albo konserwatywne podstawianie wielu nukleotydów, pod warunkiem utrzymania właściwej ramki odczytu.

Podstawienia, delecje, insercje lub dowolne ich kombinacje można zastosować, aby dojść do ostatecznego konstruktu. Ponieważ istnieją 64 możliwe sekwencje kodonów, ale znanych jest tylko 20 aminokwasów, kod genetyczny jest zdegenerowany w tym sensie, że różne kodony mogą odpowiadać temu samemu aminokwasowi. Jednakże kod jest precyzyjny w odniesieniu do każdego aminokwasu. Oznacza to, że każdemu aminokwasowi odpowiada co najmniej jeden kodon, czyli każdy kodon odwzorowuje tylko jeden pojedynczy aminokwas. Zrozumiałe jest, że w czasie translacji odpowiednia ramka odczytu musi zostać zachowana, aby uzyskać właściwą sekwencję w wytwarzanym polipeptydzie.

Techniki addycji, delecji lub podstawień przy miejscach określonych aminokwasów w znanych sekwencjach są dobrze znane. Do przykładowych technik należy ukierunkowana mutageneza z udziałem oligonukleotydu oraz PCR.

Ukierunkowana mutageneza z udziałem oligonukleotydu w zasadzie obejmuje hybrydyzację oligonukleotydu kodującego pożądaną mutację z pojedynczą nicią DNA zawierającą obszar, który ma ulec mutacji, oraz stosując pojedynczą nić jako matrycę do wydłużania oligonukleotydu, tak aby uzyskać nić zawierającą mutację. Technikę tą w różnych formach opisali Zoller i Smith (1982), Nuci. Acids Res., 10: 6487; Norris i inni (1983) Nuci. Acids Res., 11: 5103; Zoller i Smith (1984), DNA 3: 479; oraz Kramer i inni (1982), Nuci. Acids Res., 10: 6475.

PCR w zasadzie obejmuje wykładniczą amplifikację DNA in vitro z wykorzystaniem oligonukleotydów specyficznych względem sekwencji. W razie potrzeby oligonukleotydy mogą wprowadzać zmiany. Technikę PCR opisali Mullis i Foloona (1987), Meth. Enz. 155: 335. Przykłady mutagenezy z wykorzystaniem PCR opisali Higuchi i inni (1988), Nuci. Acids Res., 16: 7351; Ho i inni (1989), Gene 77: 51; Ho i inni, Engineering Hybridization Restriction Genes without the Use of Restriction Enzymes: Gene Splicing by Overlap Extension; Horton i inni (1989), Gene 77: 61.

Sekwencje nukleotydowe według wynalazku, zdolne do ekspresji pożądanych przeciwciał lub ich białek wiążących, wytwarzać można z szeregu różnych polinukleotydów (genomowy DNA, cDNA, RNA lub syntetyczne oligonukleotydy). Obecnie korzystnie sekwencja polinukleotydowa obejmuje fuzję cDNA i genomowego DNA. Sekwencja polinukleotydowa może kodować różne składniki Ig (np. domeny V, J, D i C). Możnaje skonstruować różnymi sposobami. Łączenie odpowiednich sekwencji genomowych i cDNA stanowi obecnie najczęściej stosowany sposób, z tym że można także wykorzystywać sekwencje cDNA (patrz EP-A-0 239 400 oraz Reichmann i inni (1988) Naturę 332: 323).

Pewne odpowiednie wektory ekspresji i komórki gospodarza opisano w patencie US-A-4 816 567.

Wektory i sposoby ujawnione w opisie nadają się do wykorzystania w komórkach gospodarzy szeregu różnych organizmów prokariotycznych i eukariotycznych.

Oczywiście do klonowania sekwencji DNA przy konstruowaniu wektorów przydatnych w sposobie według wynalazku korzystnie wykorzystuje się prokarionty. Tak np. szczególnie

180 157 przydatne są różne plazmidowe wektory klonujące z E. coli, takie jak wektory Bluescript Ml 3 dostępne ze Stratagene, San Diego, Califomia; pUC19c, Genbank Accession nr VB0026, pBR322 (opisany poniżej) itp. Przykłady te należy oczywiście traktować jako ilustrujące, a nie ograniczające.

Prokarionty można także wykorzystywać do ekspresji. Stosować można wspomniane szczepy E. coli, bakterie takie jak Bacillus subtilis i inne enterobakterie, takie jak Salmonella typhimurium lub Serratia marcescens oraz różne gatunki Pseudomonas.

Zazwyczaj wektory plazmidowe zawierające sekwencje replikonu i regulujące, pochodzące z gatunków kompatybilnych z komórką gospodarzem, stosuje się w połączeniu z tymi gospodarzami. Wektor zazwyczaj przenosi miejsce replikacji oraz sekwencje markerowe zdolne do zapewnienia selekcji fenotypowej w komórkach, w których przeprowadzono translację. Tak np. E. coli transformuje się zazwyczaj stosując jedną z wielu pochodnych pBR322, plazmid pochodzącego z gatunków E. coli (Bolivar i inni (1977) Gene 2: 95). pBR322 zawiera geny odporności na ampicylinę i tetracyklinę, co umożliwia łatwą identyfikację transformowanych komórek. Plazmid pBR322, jego potomkowie lub inne plazmidy drobnoustrojowe mogą zawierać lub mogą być tak zmodyfikowane, aby zawierały promotory, które mogą być wykorzystane przez organizm drobnoustrojowy do ekspresji zrekombinowanych białek. Do promotorów powszechnie stosowanych w konstrukcji zrekombinowanego DNA należą układy promotorowe laktozy (Chang i inni (1978) Naturę 275: 615; Itakura i inni (1978) Science 198: 1056; Goedell i inni (1979) Naturę 281: 544) i układy promotorowe tryptofanu (trp) (Goedell i inni (1980) Nuc. Acids Res. 8: 4057) i EP-A-0 036 776. Jakkolwiek są one najbardziej znane, odkryto również i wykorzystano inne promotory, a szczegóły dotyczące ich sekwencji nukleotydowych opublikowano, co umożliwia specjalistom ich funkcyjne zligowanie w wektorach plazmidowych (Siebenlist i inni (1980) Celi 20: 269).

Oprócz prokariontów zastosować można także drobnoustroje eukariotyczne, takie jak drożdże. Do najczęściej stosowanych drobnoustrojów eukariotycznych należy Saccharomyces cerevisiae lub zwykłe drożdże piekarnicze, choć dostępnych jest wiele innych szczepów. Do ekspresji w Saccharomyces zwykle stosuje się np. plazmid YRp7 (Stinchcomb i inni (1979) Naturę 282:39;Kingsmaniinni(1979)Gene7:141;Tschemperiinni(1980)Gene 19:157).Plazmid ten zawiera już gen trpl stanowiąc marker selekcyjny dla szczepu mutantowego drożdży nie wykazujących zdolności wzrostu na tryptofanie, np. ATCC nr 44076 lub PEP4-1 (Jones, (1977) Genetics 8: 85: 12). Obecność defektu trpl jako charakterystycznej cechy genomu drożdżowej komórki gospodarza zapewnia następnie skuteczne otoczenie do wykrywania transformacji poprzez hodowlę bez tryptofanu.

Do odpowiednich sekwencji promotorowych w wektorach drożdżowych należąpromotory kinazy 3-fosfoglicerynianu oraz innych enzymów glikolitycznych, takich jak enolaza, dehydrogenaza 3-fosforanu aldehydu glicerynowego, heksokinaza, dekarboksylaza pirogronianowa, fosfofruktokinaza, izomeraza 6-fosfbranu glukozy, mutaza fosfoglicerynianowa, kinaza pirogronianowa, izomeraza triozofosforanowa, izomeraza fosfoglukozowa i glukokonaza (Hess i inni, (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149; Holland i inni, (1978) Biochemistry 17: 4900). Przy konstruowaniu odpowiednich plazmidów ekspresji sekwencje terminacyjne zasocjowane z tymi genami często liguje się w miejscu 3' sekwencji, której ekspresja jest pożądana, aby zapewnić poliadenylowanie mRNA i terminację. Do innych promotorów, które wykazują dodatkową zaletę transkrypcji kontrolowanej przez warunki wzrostu należą obszary promotorowe dehydrogenazy alkoholowej 2, izocytochromu C, fosfatazy kwasowej, anzymów degradacyjnych związanych z metabolizmem azotu oraz wyżej wspomnianej dehydrogenazy 3-fosforanu aldehydu glicerynowego, enzymu odpowiedzialnego za wykorzystanie maltozy i galaktozy. Zastosować można dowolny wektor plazmidowy zawierający promotor kompatybilny z drożdżami, pochodzenie sekwencji replikacji terminacji.

Oprócz drobnoustrojów jako gospodarzy wykorzystać można hodowle komórek pochodzących od organizmów wielokomórkowych. Zasadniczo użyteczna jest dowolna hodowla komórek, z organizmu kręgowca lub bezkręgowca. Jednakże do tej pory największe zainteresowanie wzbudzają komórki kręgowców, a rozwój komórek kręgowców w hodowli (hodowli

180 157 tkankowej) stanowi w ostatnich latach rutynową procedurę (Kruse i Patterson, (1973), Tissue Culture, Academic Press). Do przykładowych użytecznych linii takich komórek należą linie komórek VERO, HeLa, jajniki chomika chińskiego (CHO), W138, BHK, COS-7, MDCR i szpiczak oraz szpiczak gs (dostępne z Celltech, Slough, U.K.). Wektory ekspresji dla takich komórek mogą zawierać ( w razie potrzeby) odpowiednie pochodzenie replikacji, a także promotor zlokalizowany na początku genu, który ulega ekspresji, wraz z ewentualnymi niezbędnymi miejscami wiązania rybosomów, miejscami rozszczepiania RNA, miejscami poliadenylowania i sekwencjami terminatora transkrypcyjnego.

W przypadku stosowania w komórkach ssaków funkcje kontrolne na wektorach ekspresji często zapewnia materiał wirusowy. Tak np. powszechnie stosowane promotory pochodzą od wirusa cytomegalii człowieka (HMCV), wirusa poliomy, adenowirusa 2 oraz najczęściej, wirusa małpiego 40 (SV40). Wczesne i późne promotory wirusa SV40 są szczególnie przydatne, gdyż łatwo uzyskuje się je z wirusa w postaci fragmentu, który zawiera również pochodzenie replikacji pochodzące od wirusa SV40 (Fiers i inni (1978) Naturę 273: 113). Ponadto możliwe jest, a często również pożądane, wykorzystywanie promotora lub sekwencji kontrolnej normalnie zasocjowanej z sekwencją pożądanego genu, pod warunkiem, że takie sekwencje kontrolne są kompatybilne z układem komórek gospodarza.

Pochodzenie replikacji może być zapewniane przez konstrukcję wektora, tak aby stanowiło pochodzenie egzogenne, przy czym może ono pochodzić od SV40 lub innego źródła wirusowego (np. wirusa poliomy, adenowirusa, VSV lub BPV). albo też może być ono dostarczane przez mechanizm replikacji chromosomowej komórki gospodarza. Jeśli wektor jest zintegrowany w chromosomie komórki gospodarza, to ostatnie rozwiązanie zazwyczaj wystarcza.

Wektory zawierające istotne sekwencje DNA (np. sekwencje kodujące ciężki i lekki łańcuch oraz sekwencje kontrolujące ekspresję) można przenosić do komórki gospodarza znanymi sposobami, które różnią się w zależności od typu komórki gospodarza. Tak np. transfekcję z chlorkiem wapnia powszechnie wykorzystuje się w przypadku komórek prokariotycznych, podczas gdy obróbkę fosforanem wapnia, lipofekcję lub elektroporację można zastosować w przypadku innych komórek gospodarzy (Maniatis i inni, (1990) Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, 2 wydanie, Cold Spring Harbor Press).

Po ekspresji konstrukty według wynalazku można oczyszczać znanymi sposobami, takimi jak strącanie siarczanem amonowym, kolumny powinowactwa, chromatografia kolumnowa i elektroforeza na żelu (Scopes, (1982) Protein Purification, Springer Verlag, NY). Powinowactwa wiązania uzyskanych w wyniku ekspresji można ocenić technikami znanymi specjalistom, jak to zostanie dokładniej przedstawione w części opisu obejmującej przykłady.

Korzystne są zasadniczo czyste przeciwciała szczepione CDR lub ich białka wiążące o homogeniczności co najmniej 90-95%, z tym że do zastosowań farmaceutycznych najkorzystniejsza jest homogeniczność 98-99% lub powyżej. Po oczyszczeniu, zależnie od potrzeb częściowym lub do homogeniczności, przeciwciała szczepione CDR można zastosować do celów diagnostycznych lub terapeutycznych (w tym pozaustrojowo) albo do opracowywania i przeprowadzania testów, barwienia immunofluorescencyjnego itp. (Lefkovite i Pernis, (1979 i 1981) Immunological Methods, Vol. I i II, Academic Press, NY).

Przeciwciała szczepione CDR lub ich białka wiążące według wynalazku znajdą zazwyczaj zastosowanie w leczeniu zaburzeń przebiegających z udziałem komórek T. Tak np. do typowych stanów chorobowych, które można leczyć, należą choroby autoimmunologiczne takie jak cukrzyca typu I, stwardnienie rozsiane, reumatoidalńe zapalenie stawów, liszaj rumieniowaty układowy, choroba Crohna i miastenia.

Terapeutyczne zastosowanie przeciwciał komórek T według wynalazku wynika z korelacji między określoną chorobą związaną z odpornością oraz wybiórczą ekspresją produktu genu receptora obszaru V antygenu komórki T lub zwiększonego wykorzystywania konkretnego genu receptora V antygenu komórki T. Obszary receptora V antygenu komórki T są częściowo przydatne, gdyż mogą one regulować reakcję odpornościową u osobnika poprzez

180 157 specyficzne terapeutyczne wykorzystywanie receptora antygenu komórki T. W szczególności stwierdzono, że istnieje korelacja między obecnością lub ekspresją określonego locus zmiennego obszaru i określonymi zaburzeniami związanymi z odpornością. Ustalając konkretne loci obszaru V związane z określonym zaburzeniem odporności leczyć można osobnika poprzez hamowanie ataku za pomocą komórek T przenoszących określony obszar V.

Użyte w opisie określenie leczenie obejmuje sytuacje „zapobiegania”, „hamowania” lub „leczenia” choroby. „Zapobieganie” obejmuje podawanie kompozycji ochronnej przed wystąpieniem choroby. Tak np. w przypadku modelu zwierzęcego, EAE podawanie ochronnej kompozycji przed wstrzyknięciem encefalitogenu wywołującego chorobę z powodzeniem „zapobiega” chorobie.

„Zahamowanie” obejmuje podawanie kompozycji po wywołaniu choroby, ale przed wystąpieniem jej objawów klinicznych. Podając jako przykład EAE powodzenie przy podawaniu kompozycji ochronnej po wstrzyknięciu encefalitogenu, ale przed pojawieniem się objawów neurologicznych oznacza „zahamowanie” choroby.

„Leczenie” obejmuje podawanie kompozycji ochronnej po ujawnieniu się choroby. W przykładzie z EAE powodzenie przy podawaniu kompozycji ochronnej po wstrzyknięciu encefalitogenu i po ujawnieniu się objawów klinicznych obejmuje „leczenie” choroby.

Dostępne są modelowe układy zwierzęce, które można wykorzystać do selekcjonowania skuteczności przeciwciał lub ich białek wiążących w ochronie przed chorobą lub jej leczeniu. Liszaj rumieniowaty układowy (SLE) bada się na podatnych myszach w sposób opisany przez Knighta i innych, (1978) J. Exp. Med. 147: 1653 i Reinerstena i innych, (1978) New Eng. J. Med. 299: 515. Miastenię (MG) bada się na samicach myszy SJL/J wywołując chorobę rozpuszczalnym białkiem AChR uzyskanym z innych gatunków, jak to opisali Lindstrom i inni (1988) Adv. Immunol. 42: 233-284. Zapalenie stawów wywołuje się u podatnego szczepu myszy przez wstrzyknięcie kolagenu typu II, jak to opisali Stuart i inni, (1984) Ann. Rev. Immunol. 42: 233-284. Prowokowane zapalenie stawów wywołuje się u podatnych szczurów przez wstrzyknięcie białka mikrobakteryjnego poddanego szokowi termicznemu, jak to opisali Van Eden i inni, (1988) Naturę 331: 171-173. Zapalenie gruczołu tarczycznego wywołuje się u myszy podając im tyroglobulinę, jak to opisali Maron i inni (1980) J. Exp. Med. 152: 1115-1120. Cukrzyca insulinozależna (IDDM) występuje jako choroba naturalna lub może być wywołana u pewnych szczepów myszy, jak to opisali Kanasawa i inni (1984) Diabetologia 27: 113. EAE u myszy i szczurów służy jako model SM u ludzi. W modelu tym chorobę demielinacyjną wywołuje się podając podstawowe białko szpiczakowe, jak to opisał Paterson, (1986) Textbook of Immunopathology (Mischer i inni, red.) Grune i Stratton, New York, str. 179-213; McFarlin i inni, (1973) Science 179: 478-480: oraz Satoh i inni (1987) J. Immunol. 138: 179-184.

Przeciwciała szczepione CDR lub ich białka wiążące według wynalazku można także zastosować w kombinacji z innymi przeciwciałami, zwłaszcza z mAb reagującymi z innymi markerami na ludzkich komórkach odpowiedzialnych za choroby. Tak np. włączyć można odpowiednie markery komórek T, wchodzące w skład „skupień różnicowania (Clusters of differenciation), nazwy wprowadzonej przez First International Leukocyte Differentiation Workshop (Bernhard i inni (1984) Leukocyte Typing, Springer Verlag, NY.

Zasadniczo przeciwciała szczepione CDR według wynalazku lub ich białka wiążące będą wykorzystywane w oczyszczonej formie wraz z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami. Do typowych nośników należą wodne lub wodno-alkoholowe roztwory, zawiesiny lub emulsje, w tym roztwory soli i buforowane ośrodki. Do nośników do stosowania pozajelitowego należy roztwór chlorku sodowego, dekstroza Ringera, dekstroza i chlorek sodowy oraz mleczanowany roztwór Ringera. W razie potrzeby utrzymania kompleksu w zawiesinie odpowiednie fizjologicznie tolerowane dodatki wybrać można spośród środków zagęszczających, takich jak karboksymetyloceluloza, poliwinylopirolidon, żelatyna i alginiany.

Do nośników dożylnych należą środki uzupełniające płyny i odżywki oraz środki uzupełniające elektrolity, takie jak środki oparte na dekstrozie Ringera. Stosować można także

180 157 środki konserwujące oraz inne dodatki takie jak środki przeciwdrobnoustrojowe, antyutleniacze, środki chelatujące i gazy obojętne (Mack, (1982) Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16 wydanie).

Konstrukty według wynalazku stosować można jako osobno podawane kompozycje lub w połączeniu z innymi środkami. Należeć mogą do nich różne leki immunoterapeutyczne takie jak cyklosporyna, metotreksan, adriamycyna lub cisplatynum, oraz immunotoksyny. Kompozycje farmaceutyczne mogą być w postaci „koktajli” różnych środków cytotoksycznych lub innych w połączeniu z przeciwciałami szczepionymi CDR lub ich białkami wiążącymi według wynalazku, a nawet kombinacji konstruktów według wynalazku i przeciwciał szczepionych CDR o różnych specyficznościach.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku podawać można dowolnym ze znanych sposobów. W terapii, obejmującej bez żadnych ograniczeń immunoterapię, przeciwciała szczepione CDR lub ich białka wiążące według wynalazku podawać można znanymi sposobami dowolnemu pacjentowi. Podawanie można wykonać w dowolny odpowiedni sposób, w tym pozajelitowo, dożylnie, domięśniowo, dootrzewnowe, a także, gdy jest to wskazane, na drodze bezpośredniej infuzji przez cewnik. Dawka i częstotliwość podawania zależeć będzie od wieku, płci i stanu pacjenta, równoczesnego podawania innych leków, przeciwskazań oraz innych parametrów branych pod uwagę przez lekarza.

Konstrukty według wynalazku można liofilizować w celu przechowywania, a następnie odtwarzać w odpowiednim nośniku przed użyciem. Stwierdzono, że jest to skuteczny sposób w przypadku immunoglobulin, tak że wykorzystać można znane techniki liofilizacji i odtwarzania. Dla specjalistów zrozumiałe jest, że liofilizacja i odtwarzanie mogą doprowadzić do utraty w różnym stopniu aktywności (tak np. w przypadku zwykłych immunoglobulin przeciwciała IgM tracą silniej aktywność niż przeciwciała IgG), oraz że konieczne może okazać się odpowiednie nastawienie poziomu w celu skompensowania tego ubytku.

Kompozycje zawierające przeciwciała szczepione CDR lub ich koktajl podawać można profilaktycznie i/lub w celach leczniczych. W pewnych zastosowaniach leczniczych dokładną ilość zapewniającą co najmniej częściowe inhibitowanie, zahamowanie, modulowanie, uśmiercanie lub inny mierzalny parametr, w odniesieniu do populacji wybranych komórek, określa się jako „terapeutycznie skuteczną dawkę”. Ilości niezbędne do osiągnięcia takiej dawki zależeć będą od ostrości choroby i ogólnego stanu układu odpornościowego pacjenta, z tym że zazwyczaj wynoszą one od 0,005 do 5,0 mg przeciwciała szczepionego CDR lub jego białka wiążącego według wynalazku, a jeszcze częściej od 0,05 do 2,0 mg/kg. W celach profilaktycznych kompozycje zawierające konstrukty według wynalazku lub ich koktajle można również podawać w podobnych lub nieznacznie mniejszych ilościach.

Kompozycję zawierającą konstrukt według wynalazku można stosować w profilaktycznych lub terapeutycznych zestawach ułatwiających zmienianie, dezaktywację, zabijanie lub usuwanie wybranych populacji docelowych komórek T u ssaków.

W innym wykonaniu konstrukty ujawnione w opisie wykorzystać można pozaustrojowo lub in vitro do selektywnego zabijania, zmniejszania ilości lub innego skutecznego usuwania docelowych populacji komórek z heterogenicznej kolekcji komórkowej. Krew ssaka można łączyć poza ustrojem z przeciwciałami szczepionymi CDR lub ich białkami wiążącymi, dzięki czemu niepożądane komórki zostają zabite lub w innym sposób usunięte z krwi, którą zawraca się do ssaka w znany sposób.

Oprócz wykorzystywania w terapii konstrukty znajdą zastosowanie w innych zestawach. Zgodnie z jednym rozwiązaniem przeciwciała według wynalazku lub białka wiążące wykorzystuje się jako zestawy do badań. Białka wiążące receptor komórek T lub przeciwciała według wynalazku są również przydatne w badaniach struktury i działania receptora komórki T. Służąc jako substraty lub domeny wiążące w odniesieniu do określonych form receptorów komórek T takie konstrukty przeciwciał mogą także służyć jako narzędzia w badaniu konformacji przy określaniu przybliżonych konfiguracji różnych części receptora komórki T. W jeszcze innym wykonaniu przeciwciała komórki T lub ich białka wiążące można wykorzystać jako

180 157 sondy diagnostyczne. W konkretnym wykonaniu konstrukty według wynalazku można wykorzystywać do oznaczania ilości lub obecności podrodziny obszaru V pewnych komórek T w próbce biologicznej. Jeden z takich testów opisał Rittershaus w WO92/089810, opublikowanym 26 maja 1992, zatytułowanym „Therapeutic i Diagnostic Methods Using Total Leukocyte Surface Antigens”. W związku z tym wynalazek dostarcza sposobów diagnozowania choroby związanej z odpornością, takiej jak SM, przez wykrywanie określonego podzestawu receptora antygenu komórki T w próbce biologicznej.

Przeciwciała szczepione CDR lub ich białka wiążące można znakować znanymi sposobami. Konstrukty są również przydatne w innych celach in vivo. Tak np. można je stosować do selektywnej obróbki komórek krwi obwodowej, gdy pożądane jest usunięcie jedynie docelowych limfocytów T, albo w podobnych celach w hodowli komórek, aby usunąć niepożądane limfocyty T.

Poniższe przykłady dokładniej opisują pewne aspekty wynalazku, z tym że nie stanowią jego ograniczenia.

Przykład 1. TM27 - Zestawienie prac

1. Myszy BALB/c immunizowano linią HPB-A11 komórek białaczki T4 (raz dootrzewnowe i dwa razy dożylnie).

2. Komórki śledziony zebrano od myszy, wykonano fuzję z uwieczniającą linią komórek P3X53AG8.653. mysiej mielomy.

3. Przeprowadzono selekcję odpowiednich klonów w ośrodku HAT.

4. Przeprowadzono selekcję wybranych klonów względem odpowiedniego wiązania przez immunoprecypitację z radioznaczonym HPB-ALL.

5. Subklonowanie przeprowadzono przez ograniczone rozcieńczanie.

6. Specyficzność zbadano przez badanie pobudzania PBL i modulacji CD3.

7. Hybrydomę wydzielającą odpowiednie przeciwciała oznaczono jako 4H11.

8. Z klonu tego otrzymano RNA, z którego wydzielono mRNA. Wytworzono cDNA względem mRNA.

9. Przeprowadzono sekwencjonowanie cDNA i sprawdzono dokładność.

10. Wydzielone cDNA (H i K) sklonowano w wektorach Ml3.

11. Wybrane obszary szkieletowe człowieka wprowadzono na drodze mutagenezy, co podano w przykładzie 2.

12. Humanizowane przeciwciała (po ~ 1 mg) oczyszczono od transfektantów NSO do przeprowadzenia wstępnych badań.

Wykonano 5 różnych TM27:

TM27L: z leucyną w pozycji 48 ciężkiego łańcucha.

TM27I: z izoleucyną w pozycji 48 ciężkiego łańcucha.

TM27.1: zmieniono FS na VF (78-79).

TM27.2: zmieniono VTML/T na LSIS/N (67-70/73).

TM27.3: zmieniono V na R (92).

Szczegółowy opis doświadczeń Streszczenie

Celem tego projektu było zhumanizowanie mysiego, przeciwludzkiego monoklonalnego przeciwciała TCR (receptora komórki T) νβ 5.2/5.3 oraz wytworzenie linii komórek wytwarzających w wyniku ekspresji humanizowane przeciwciała, przydatnych w opracowaniu procesu.

Przeciwciała mysie

Hybrydomę 4H11 uzyskano w wyniku ftizji mysiej linii komórek szpiczaka, P3X63AG8.653 z komórkami śledziony myszy Bałb/c immunizowanych linią komórek białaczki T, HPB-ALL. Hybrydoma wytwarza w wyniku ekspresji monoklonalne przeciwciało TM23 o specyficzności względem ludzkiego receptora komórki T (TCR) νβ 5.2 i 5.3. Jest to izotyp IgG2a /k.

180 157

Humanizacja cDNA kodując ciężkie i lekkie łańcuchy TM23 wydzielono z biblioteki cDNA 4H11 skonstruowanej z wykorzystaniem mysiego IgG2aź -specyficznych starterów końca 31. Budowę wydzielonych klony cDNA potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA i sekwencjonowanie wewnętrznych aminokwasów. CDR (obszary określające komplementamość CDR ciężkich i lekkich łańcuchów zidentyfikowano na podstawie ułożenia zachowanych mysich sekwencji szkieletowych Fragmenty L, V, (D), J (L, lider; V, zmienna; D, różnorodność; J. łączące) DNA wydzielono metodą PCR i sklonowano w wektorach ekspresji CHO, PTCSLCADHFR i pTCSLCglNeoAp’, przenoszących odpowiednio stały obszar ludzkiego cDNA, k i IgGl, tak aby nastąpiła ekspresja chimerycznego przeciwciała mysi V/ludzki C.

Na podstawie porównania sekwencji aminokwasów wydedukowanych z klonów cDNA ustalono, że ciężki łańcuch TM23 należy do podgrupy Kabata IB. Ustalono, że sekwencja Nk należy do grupy Kabata Nk V. Z tego względu ludzkie szkielety NEWM i REI wybrano do humanizowania odpowiednio ciężkiego i lekkiego łańcucha. Przegrupowane fragmenty V(D)J (z wyjątkiem części 5Ύ i 3'J) sklonowano do wektorów Ml3, które przenoszą sekwencje lidera i intronu w konfiguracji genomowej, tak aby wytworzyć pełne genomowe konstrukty L-V(D)J.

Ekspresja szpiczaka

Po wytworzeniu obszarów V(D)J szczepionych CDR na drodze mutagenezy fragmenty DNA sklonowano do szpiczakowych wektorów ekspresji, które przenoszą odpowiednio stały region ludzkiego k i IgGl. Skonstruowano 5 humanizowanych ciężkich łańcuchów z różnymi mutacjami. Każdy z 5 konstruktów ciężkich łańcuchów współtransfekowano z humanizowanym lekkim łańcuchem w linię komórek szpiczaka NSO. Humanizowane przeciwciała oczyszczono z supematantów hodowli rozwiniętych ludzkich dodatnich transfektantów IgGl/k w celu dokonania oceny. Wyniki wskazują że TM27L z końcowymi mysimi sekwencjami aminokwasów barwi komórki T νβ 5.3 oraz inne humanizowane wersje. Z tego względu TM27L wybrano do dalszych badań i określono jako TM27.

Ekspresja w komórkach CHO

Lider ciężkich i lekkich łańcuchów oraz obszary V z TM27 wydzielono z konstruktów szpiczakowych na drodze PCR i przeprowadzono klonowanie w konfiguracji cDNA do układów ekspresji w komórkach CHO, pTCSLCglNeoAp’ (ciężki) i PTCSLCA DHFR (lekki) w sposób opisany powyżej. Przeprowadzono selekcję transfektantów komórek CHO i komórki dodatnie względem ludzkiego IgGl/k sklonowano. Jednego z najsilniejszych producentów, TM27L-662-35, rozwinięto w celu założenia banku komórek i wytworzenia w małej skali humanizowanego Ab. Przeciwciało wytworzone w wyniku ekspresji dokładnie scharakteryzowano w miarę rozwoju projektu stwierdzając, że jest ono porównywalne z przeciwciałem z linii komórek szpiczaka oraz z macierzystym TM23. Równocześnie klony komórek CHO poddano amplifikacji i klonowaniu w celu zwiększenia ekspresji przeciwciała i wykazania przydatności szczepu do uzyskiwania większej produkcji.

Immunizacja myszy BALB/c za pomocą HPB-ALL β FI (przeciwludzkie monoklonalne przeciwciało łańcucha β stałego obszaru receptora komórki T), immunoprecypitat komórek HPB-ALL białaczki ludzkich komórek T (3 χ 10⁷) otrzymane od dr Michaela Brennera (Harvard Medical School) wymieszano z pełnym dodatkiem Freunda i wstrzyknięto dootrzewnowe (i. p.) myszy BALB/c. Po 5 tygodniach myszy dopełniono 30 χ 10⁷ komórek w roztworze soli przez 3 kolejne dni, najpierw i. p., a następnie dwukrotnie dożylnie (i. v.).

Fuzja komórek śledziony z P3X63AG8.653

Fuzję wykonano w znany sposób, 3 dni po ostatnim podawaniu i. v. Komórki śledziony w 5-krotnym nadmiarze zlano z komórkami P3X63Ag8.653 (mysia linia szpiczaka nie wydzielająca Ig, pochodząca od myszy BALB/c, ATCC CRL 1580) stosując 50% glikol polietylenowy 1500 (BDH, Dorset, Anglia).

180 157

Selekcja HAT komórek uzyskanych w wyniku fuzji

Komórki po fuzji naniesiono na płytki z 96 studzienkami, zawierającymi po 2 χ 10⁵ tymocytów BALB/c jako pożywkami i przeprowadzono selekcję w ośrodku RPMI-1640 zawierającym 15% FBS (płodowej surowicy bydlęcej) i HAT (6 mM hipoksantyny, 50 mM aminopteryny i 2 mM tymidyny). Komórki inkubowano w wilgotnym powietrzu z 5% CO₂w37°C.

Selekcjonowanie hybrydomy

Po 13 - 14 dniach studzienki z wyrośniętymi koloniami poddano selekcjonowaniu metodą ELISA i przez immunoprecypirację ¹²⁵I-radio-znaczonych komórek HPB-ALL. W warunkach immunoprecypitacji, cząsteczki CD3 odszczepiają się od łańcuchów TCR a i β. Hybrydomy, które reagują z HPB-ALL powiększono w kolbach T-75 do dalszego klonowania.

Klonowanie wybranych hybrydom

Hybrydomy o specyficzności względem HPB-ALL TCAR (receptorem antygenu komórki T) sklonowano przez ograniczone rozcieńczania. Komórki naniesiono na płytki do hodowli z 96 studzienkami, stosując kolejne dwukrotne rozcieńczenia gęstości komórek w zakresie od 2 do 0,015 komórek/studzienkę. Wybrano najlepiej rosnące hodowle o najwyższej produktywności i procedurę tą powtórzono dwukrotnie. Po tych dwóch dodatkowych rundach selekcji wybrano jedną z końcowych hodowli, 4H11. mAb wytworzony przez 4H11 w wyniku ekspresji powodował immunoprecypitację cząsteczek identycznych z łańcuchami a i β TCR strącanymi przez βΡ 1 mAb, które reagują ze stałym obszarem łańcucha β TCR. Wyniki te sugerują że uzyskany mAb wykazuje specyficzność względem łańcucha β wytworzonego w wyniku ekspresji w komórkach HPB-ALL T. Przeciwciało dla wygody określono jako TM23.

Charakteryzowanie monoklonalnego przeciwciała z hybrydomy 4H11, TM23

Izotypowanie mAb z TM23 przeprowadzono stosując dostępny w handlu zestaw, (Zymed, South San Francisco, CA). Wyniki wskazują że jest to mysi izotyp IgG2a/k.

W celu potwierdzenia anty-TCR reaktywności mAb z TM23 przeprowadzono jego selekcjonowanie względem zdolności do współmodulowania cząsteczki CD3 z powierzchni komórek HPB-ALL. Wcześniejsze badania wykazały, że mAb dla łańcucha a lub β z TCR może współmodulować CD3 z powierzchni komórek, gdy komórki te wstępnie inkubuje się z przeciw-TCR mAb. Gdy komórki HPB-ALL, poddano obróbce, zaobserwowano znaczący spadek reaktywności z przeciw-CD3 mAb Leu-4 w porównaniu z reaktywnością z Leu-4 zaobserwowaną dla komórek nie poddanych obróbce.

Zwykłe ludzkie PBL (limfocyty krwi obwodowej) zbadano pod względem reaktywności z TM23. 1,6-3,0% zbadanych komórek T PML reagowało z TM23. Jest to typowy wynik obserwowany dla różnych innych mAb, które reagują z determinantami specyficznego obszaru V.

W celu stwierdzenia czy TM23 wiąże się z tym samym epitopem co 1C1, mAb, który reaguje z ludzkimi podrodzinami VO 5.2 i 5.3 (Boylston, et al., 1986 J. Immunol. 137:741), zbadano zdolność jednego mAb do blokowania wiązania tego drugiego. Gdy komórki HPB-ALL najpierw inkubowano z TM23, wiązanie 1 Cl skoniugowanego z fluoresceiną zostało zahamowane. Również w przypadku gdy komórki najpierw inkubowano z 1C1, wiązanie z TM23 zostało zahamowane. Wynik ten sugeruje, że TM23 i 1C1 wiążą się z tym samym lub bardzo bliskim epitopem.

W celu dokładniejszego sprawdzenia czy TM23 i 1C1 wykazują podobne reaktywności, otrzymano linie PBL przez pobudzanie innym mAb. Każdą linię zbadano następnie pod względem reaktywności z każdym mAb. Gdy linię PBL pobudzono TM23, 1C1 i TM23 reagowały z podobnym procentem komórek. Odnosi się to w równym stopniu do linii PBL pobudzanej przez 1C1.

Hodowla komórek 4H11

Κ1οη4Η11 TM23.1 7-31-91 hodowano i powiększono w ośrodku DMEM/F12 (1:1) + 1% płodowej surowicy bydlęcej, 100 μΐ/ml penicyliny, 100 μ/ml streptomycyny i 12,5 mM glutaminy.

180 157

Wytwarzanie cDNA kodującego ciężkie i lekkie łańcuchy TM23

Około 10* komórek wydzielono przez odwirowanie, po czym przemyto raz PBS schłodzonym w lodzie. Pełny RNA wypreparowano stosując zestaw Promega RNAgents Total RNA Isolation Kit (Promega, Cat nr Z5110). Poły (A) ⁺ RNA wypreparowano stosując układ Promega PolyATract MRNA Isolation System (Promega Cat nr Z5200). Mysią IgG2a i k -specyficzną bibliotekę cDNA wypreparowano stosując zestaw BRL SuperScript Kit (BRL Cat nr 82Y8SA) ze starterem IgG2a ' ATATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTTAGT 3 ¹ starterem k ' ATATGCGGCCGCTTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAAT 3 ' .

Dwa startery zawierają miejsca dla enzymu restrykcyjnego Xho I i sekwencje komplementarne z końcami 3' obszarów kodujących, odpowiednio mysiego IgG2a i k. Przeprowadzono kodowanie w plazmidzie PSPORT dostępnym w zestawie, a następnie przeniesiono do kompetentnych komórek E. coli DH5a przez elektroporację. Klony plazmidów przenoszące inserty o odpowiedniej wielkości wybrano do sekwencjonowania.

Identyfikacja klonów cDNA kodujących ciężkie i lekkie łańcuchy TM23

Minipreparat plazmidowego DNA z insertami o odpowiedniej wielkości (klony lekkich łańcuchów nr 1,6, 19, 20, 25 i 26; klony ciężkich łańcuchów nr 4, 9, 11, 15, 22 i 34) poddano sekwencjonowaniu dwuniciowego DNA wykorzystując zestaw Seąuencing Kit (USB Cat nr 70770), który zawierał starter 5' T7 dla insertów DNA. Stwierdzono, że sekwencje klonów lekkich łańcuchów nr 6, 20 i 25 oraz klonu ciężkiego łańcucha nr 34 są mysimi klonami Ig. Klony lekkich łańcuchów nr 6, 20 i 25 zawierały identyczne sekwencje, a nr 6 miał mutację punktową i był klonem niefunkcjonalnym. Klony nr 20 i 34 sekwencjonowano stosując startery specyficzne względem stałego obszaru

5' GACATTGATGTCTTTGGGGTAGAAGTTQTT 3'

IgG2a

5' GGTCACTGGCTCAGGGAAATAACCCTTGAC 3 ' .

Również te wyniki wykazały, że klon nr 6 jest klonem niefunkcjonalnym, a klony nr 20 i 34 stanowią właściwe klony odpowiedniego lekkiego i ciężkiego łańcucha. cDNA i sekwencje wydedukowane dla tych klonów pokazano na fig. 1.

Z uwagi na N-końcowe blokowanie mikrosekwencjonowanie aminokwasów przeprowadzono od rozszczepionych fragmentów peptydu CNBr wydzielonych z żeli poliakryloamidowych. Uzyskane sekwencje aminokwasów obszaru wewnętrznego były zgodne z wydedukowanymi z sekwencji cDNA. Wyniki potwierdzają że wydzielone klony cDNA były tymi, które kodują ciężki i lekki łańcuch TM23.

CDR ciężkich i lekkich łańcuchów zidentyfikowane metodą Kabata i Wu (supra) wyszczególniono i podkreślono na fig. 1.

Wydzielanie metodą PCR obszaru V DNA łańcuchów H i L oraz sekwencj onowanie DNA

Wytwarzanie chimerycznego przeciwciała TM23 Wydzielanie mysiego VH DNA i NK DNA

Zmienne obszary ciężkiego i lekkiego łańcucha TM23 przystosowano do insercji w wektorach ekspresji. Sekwencje DNA kodujące mysi VH TM23 zamplifikowano z TM23MuVH.MuIgG2a na drodze PCR stosując startery oligonukleotydowe,

VH1BACK (5' AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG 3’ )

180 157 który zawiera miejsce dla enzymu restrykcyjnego Pstl i

VH1FOR

5' TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG 3' który zawiera miejsce BstEII. M oznacza C lub A, S oznacza lub C lub G, R oznacza lub A lub G, a W oznacza lub A lub T. Miejsca te w związku z tym wprowadzono odpowiednio przy końcach 5' i 3' TM23VH DNA. Zamplifikowany DNA pocięto Pstl i BstEII i zligowano w miejscach Pstl i BstEII dwuniciowej replikacyjnej (RF) formy DNA wektora Ml3 VHPCR1 pociętego tymi samymi enzymami.

M13 VHPCR1 jest wektorem fagowym MI 3 pochodzącym z M13HuVHNP (Jones i inni (1986) Naturę 321:522-525) i zawiera promotor immunoglobuliny, sekwencję sygnałową i odpowiednie miejsca odszczepiania (Orlandi i inni (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837).

Zligowany DNA przeniesiono do kompetentnego szczepu TG1 E. coli (K12, Δ (lacpro), supE, thi, hsd D5 [F tra D36, pro-A+B+, lacO^q, lacZ Ml5]. Z uzyskanych łysinek zrekombinowanego faga wypreparowano jednoniciowy DNA.

Sekwencje DNA kodujące mysi VK TM23 zamplifikowano z TM23MuVK.MuCK metodą PCR stosując startery oligonukleotydowe,

VK1BACK

5' 6ACATCCAGCTGACCCAGTCTCCA 3 ' który zawiera miejsce PvuII oraz

VK1FOR

5' GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC 3' który zawiera miejsce Bglll w połączeniu z dwoma nakładającymi się wewnętrznymi starterami przeznaczonymi do usuwania miejsca Hindlll w CDR3, oligo 943

5' CCGAGGAAGTTTACTATACTG 3' i oligo 944

5' CAGTATAGTAAACTTCCTCGG 3' (Horton i inni (1990). Miejsca PvuII i Bglll wprowadzono w ten sposób na końcach 5' i 3' TM23 VK DNA. Zamplifikowany DNA strawiono PvuII i Bglll i zligowano z Ml 3 VKPCR1 przeciętym PvuII i Bell. Enzymy Bglll i Bell rozcinają DNA, tak że uzyskuje się kompatybilne lepkie końce, które można zligować ze sobą.

M13VKPCR1 zawiera ten sam promotor, sekwencję sygnałową i miejsca rozszczepiania co Ml3 VHPCR1 (Orlandi i inni (1989).

Zligowany DNA przeniesiono do E. coli TG1 i z uzyskanych łysinek zrekombinowanego faga wypreparowano jednoniciowy DNA.

Uzyskano produkty PCR o odpowiedniej wielkości, 359 par zasad (bp) dla VH i 288 bp dla VK. VH DNA wstawiono do wektora M13 VHPCR1 uzyskując M13 TM23MuVH. VK DNA wstawiono do wektora M13VKPCR1 uzyskując Ml 3 TM23MuVK.

Potwierdzanie sekwencji

Potwierdzono, że sklonowano prawidłowe sekwencje oraz że PCR nie wprowadziła fałszywych mutacji. Sekwencję obszaru VH jednoniciowego fagowego DNA z Ml3, o całkowitej długości 823 bp, obejmującą promotor, sekwencję sygnałową, miejsca rozszczepiania oraz sekwencje 5' i 3', które nie uległy translacji, otrzymano metodą didezoksy (Sanger i inni 1977) stosując polimerazę T7 DNA lub Seąuenase.

180 157

W podobny sposób metodą didezoksy otrzymano sekwencję obszaru VK jednoniciowego fagowego DNA z Ml3, o całkowitej długości 630 bp, obejmującą promotor, sekwencję sygnałową miejsca rozszczepiania oraz sekwencje 5' i 3'.

Zidentyfikowano klony DNA z pożądaną sekwencją dla VH TM23, przystosowaną do wstawienia do wektora ekspresji. Spośród nich do dalszych badań wybrano nr 2. Wprowadzenie wymaganych miejsc restrykcyjnych niezbędnych do insercji VH do wektora ekspresji spowodowało zmianę 1 aminokwasu na końcu N: lizyny (K) w pozycji 5 na glutaminę (G) oraz jedną zmianę na końcu C, seryny (S) w pozycji 108 na treoninę (T).

Zidentyfikowano klony DNA z pożądaną sekwencją dla VK TM23, przystosowaną do wstawienia do wektora ekspresji. Spośród nich do dalszych badań wybrano nr 4. Sekwencji aminokwasów w CDR3 nie zmieniano przez usunięcie miejsca HindlH, ale wprowadzenie wymaganych miejsc restrykcyjnych niezbędnych do insercji VK do wektora ekspresji spowodowało zmianę 3 aminokwasów na końcu N: metioniny (M) w pozycji 4 na leucynę (L), treoniny (T) w pozycji 7 na serynę (S) oraz treoniny (T) w pozycji 8 na prolinę (P), a także jedną zmianę na końcu C, waliny (V) w pozycji 105 na glutaminę (E) z uwagi na stosowane startery.

Klonowanie fragmentów obszaru V do wektora Ml 3

Przeprowadzono przeniesienie klonowanego zmiennego obszaru mysiego do wektorów ekspresji zawierających geny stałego obszaru ludzkiego w celu wykonania następnie ekspresji przeciwciała w komórkach ssaka.

Wybór izotypu IgG do humanizowania

Ludzki izotyp IgGl wybrano dla TM27 z następujących powodów:

1. IgGl wykazuje zdolność do uczestniczenia zarówno w ADCC (cytotoksyczności komórek zależnej od przeciwciała) oraz CDC (cytotoksyczności zależnej od dopełnienia). Z tego względu może być on skuteczniejszy w regulacji w dół komórek νβ 5.2/5.3; oraz

2. IgGl jest częściej stosowany w humanizowaniu Ab.

Dobór szkieletu ludzkiego do szczepienia CDR Wytwarzanie humanizowanego przeciwciała TM23 Konstrukcja sekwencji zmiennych obszarów humanizowanego TM23 Przeprowadzono selekcję ludzkich sekwencji szkieletowych w celu uzyskania CDR TM23 oraz ustalenie podstawowych mysich reszt, które muszą być podstawione w szkielecie ludzkim. Wykonano za pomocą komputera porównanie sekwencji aminokwasów VH i VK TM23, zarówno dla znanych sekwencji innych przeciwciał mysich jak i dla sekwencji VH i VK ludzkiego przeciwciała.

Wykorzystano program ALLIGN z DNASTAR Ltd, London W13 9BL, UK, wykonywany przez procesor Compaq 386. ALLIGN dopasowuje dwie sekwencje białkowe z wykorzystaniem metody Lipmana-Pearsona i Needlemana-Wunscha. Pierwsza metoda, Lipmana-Pearsona ustala najlepsze obszary dla homołogii. Następnie metoda NeedlemanaWunscha zapewnia ostateczne dopasowanie sekwencji.

Dopasowane sekwencje zbadano następnie zwracając szczególną uwagę na czynniki takie jak długość CDR oraz reszty uważane za decydujące o podtrzymaniu konformacji CDR, np. pozycje 71 i 94 oraz reszty w sąsiedztwie CDR (Tramontano i inni (1990) Foote i Winter, (1992)).

Porównanie z sekwencjami zgodności dla podgrup Kabata spowodowało przypisanie mysiego VH TM23 do podgrupy Kabata VK V. W szkieletach TM23 nie występują sekwencje aminokwasów niezwykłe dla tych podgrup.

Ludzkie przeciwciała NEWM i REI dostarczyły sekwencji szkieletowych odpowiednio dla VH i VK. W przypadku VH oprócz CDR wykorzystano mysie reszty od 27 do 30 oraz 71. Uważa się, że te reszty szkieletowe są istotne dla podtrzymania konformacji CDR (Foote i Winter, (1992)). Reszta 71 może utrwalać względne rozmieszczenie CDR1 i CDR2, w zależności od tego czy występuje duży łańcuch boczny (lizyna lub arginina), czy też mniejszy łańcuch boczny (walina lub alanina) (Tramontano i inni (1990). Z tego względu walinę 71 w NEWM VH zastąpiono lizyną jak w TM23 VH. Reszty 27 - 30 tworzą raczej część

180 157 strukturalnej, a nie hiperzmiennej pętli wiązania antygenu, jak to stwierdzili Chothia i Lesk (1987). Reszty szkieletowe 47-49 mogą również odgrywać rolę w strukturze przeciwciała (Foote i Winter, (1992)). Z tego względu skonstruowano dwa warianty humanizowanych ciężkich łańcuchów: jeden z izoleucyną (I) w pozycji 48, jak w NEWM, a drugi z leucyną (L) w pozycji 48, tak że zachowano reszty 47-49 z mysiego VK. Porównanie mysiej sekwencji VK z wersją humanizowaną przedstawiono w przykładzie 2.

Nie dokonano zmian w ludzkim szkielecie REI wybranym dla VK TM23. Porównanie mysiej sekwencji VK z wersją humanizowaną przedstawiono również w przykładzie 2.

Opis wektora ekspresji ssaka, pTCSNeo

Plazmid pTCSNeo zawiera unikatowe miejsce klonowania Xho I, w które wstawia się niezbędne geny. Transkrypcja wstawionego genu napędzana jest przez sekwencje regulujące obejmujące enhancer SV40 w górę od głównego późnego promotora adenowirusa 2 (Ad2 MLP) Ad2 MLP jest zlokalizowany w górę od lidera tripartyru adenowirusa. Wstawiony gen jest flankowany przez sygnał poliadenylowania z mysiej immunoglobuliny k (Ig k) na końcu 3'. Selekcja względem ssaka zapewniona jest przez gen odporności na neomycynę (Neo¹). Plazmid dostarcza również bakteryjne pochodzenie replikacji oraz gen β-laktamazy (Amp¹).

Konstrukcja wektora ekspresji pTCSLNeo

Dwa komplementarne oligonukleotydy z sekwencjami:

nonsensowną

5’ CGACATCGATGATATCGAATTCGCGGCCGCCAGCTGGGGCCCTCTAGAC 3’ sensowną ’ CGAGTCTAGAGGGCCCCAGCTGGCGGCCGCGAATTCGATATCATCGATG 3 ' powtórnie zhybrydyzowano i zligowano z pTCSNeo strawionym Xhol i wypełnionym dT. Uzyskany plazmid, pTCSLNeo, z polilinkerem zawierającym szereg miejsc restrykcji enzymatycznej w orientacji 5' Xhol / Xbal / Apal / PvuII / Notl / EcoRI / EcoRV / Clal 3', nadawał się do wstawienia odpowiedniego genu do ekspresji. Gen neo^r można także zamienić na inne geny markerowe selekcji.

Konstrukcja wektora ekspresji pTCSLDHFR*

Gen neo^r w pTCSLNeo usunięto przez trawienie enzymami restrykcyjnymi Hindlll i BamHI, po czym zreligowano ż mysim mutantem fragmentu genu DHFR (reduktazy dihydrofolianowej) (DHFR*) uzyskanym przez trawienie Hindlll i BamHI plazmidu pSV2-DHFR* otrzymano od dr Paula Berga (Department of Biochemistry, Stanford University Medical School).

Opis plazmidu pSV184 R-Neo/DNS-V*C*

Plazmid pSV184 R-Neo/DNS-Yfy^ (otrzymany od dr Lee Herzenberga, Stanford University Medical School - patrz rozprawa doktorska Jeffery’a Dangla, str. 48-67) stanowi mysi V i ludzki C chimeryczny konstrukt, w którym przegrupowany łańcuch k segmentu obszaru V-J genu wydzielonego ze specyficznej względem chlorku dansylu mysiej hybrydomy złączono z ludzkim genomowym fragmentem C_k pSV184ΑΗ-Νεο-Ο^.

Wydzielanie ludzkiego stałego obszaru łańcucha k metodą PCR

Stosując niestrawiony plamizd pSV184AH-Neo/DNS-V_AC_A (pSVHuk), który zawiera ludzki stały obszar łańcucha k, przeprowadzono PCR z dwoma starterami (jednym do przodu i jednym odwrotnym) w celu wydzielenia stałego obszaru. Oligomery (startery) otrzymano z firmy Operon. Zastosowano odczynniki do reakcji PCR z zestawu odczynników do amplifikacji DNA GeneAmp DNA z AmpliTaą (Perkin-Elmer Cetus). Reakcje PCR prowadzono przy 3 różnych stężeniach Mg²⁺. Próbki produktów PCR analizowano na 1% żelu agarozowym.

180 157

Wybrano produkt reakcji PCR z pierwszej próbki Mg²⁺ (stężenie 1,5 mM). Startery flankujące obszar C dobrano tak, aby zawierały miejsca dla enzymów restrykcyjnych, w celu przeprowadzenia klonowania. I tak zamplifikowany DNA strawiono EcoRI (na końcu 3'). Miejsca przy 5' (PvuII) nie trawiono. Strawiony fragment DNA wprowadzono na 1% żel agarozowy i wycięto pasmo 300 bp. DNA wyekstrahowano z żelu i małą próbkę zanalizowano na 1% żelu agarozowym w celu określenia jakości i oszacowania ilości. Okazało się, że pasmo 300 bp jest czyste, a całkowitą ilość DNA oszacowano na ~ 140 ng.

Stały obszar ludzkiego łańcucha k, klonowany w wektorze pBS KS⁺ i sekwencjonowany

Fragment DNA stałego obszaru ludzkiego łańcucha k, strawiony EcoRI, wstawiono do wektora pBS KS⁺, który strawiono Smal i EcoRI, stosując ligazę T4 DNA. Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformowania kompetentnych komórek E. coli DH5a. Pojedyncze kolonie zebrano i zastosowano do zaszczepienia 24 ciekłych hodowli. Z każdej z hodowli wypreparowano DNA. Każdą z próbek DNA strawiono PvuII (5' koniec C/) i EcoRI (3' koniec C_k), a następnie zanalizowano na 2% żelu agarozowym. Z uwagi na trudność w oddzieleniu pasm o niskim zasięgu (300 bp), próbki DNA strawiono tylko PvuII. Po analizie na 2% żelu agarozowym stwierdzono, że 19 spośród 24 próbek zawiera prawidłowy insert Próbki nr 1-5 (spośród 19 właściwych próbek) wybrano do sekwencjonowania z zastosowaniem starterów T7 i T3 (sekwencje w insercie flankującym wektor). Inne odczynniki do sekwencjonowania pochodziły z zestawu Sequenase Version 2.0 (USB). Potwierdzono, że próbka nr 5 zawierała prawidłową sekwencję dla stałego obszaru ludzkiego łańcucha k.

Klonowanie stałego obszaru ludzkiego łańcucha k w wektorze ekspresji pTCSLDHFR* prowadzące do pTCSLC^DHFR*

Stały obszar ludzkiego łańcucha k wydzielono z wektora pBS KS (próbka nr 5) stosując enzymy restrykcyjne PvuII i EcoRI. Jednakże z uwagi na wspomniany problem z rozdzielaniem pasm drugie trawienie przeprowadzono z konstruktem pBS/ludzki C_k. Drugie trawienie z EcoRI i Xbal (5' względem miejsca PvuII) dało fragment o ~ 300 bp. Fragment ten oczyszczono na żelu i strawiono PvuII w celu usunięcia niewielkiego pozostałego fragmentu wektora na końcu 5' C_A. Ten ostatni fragment oczyszczono na żelu, a następnie zanalizowano na 1% żelu agarozowym w celu określenia jakości i ilości. Okazało się, że C^DNA daje czyste pasmo przy około 280 bp, a jego ilość oszacowano na ~ 135 ng.

Z uwagi na obecność 3 miejsc EcoRI w wektorze ekspresji pTCSLDHFR* stwierdzono, że powodzenie może zapewnić jedynie klonowanie w miejscu PvuII. W związku z tym, że C_k DNA otrzymano przez trawienie PvuII - EcoRI, koniec EcoRI naprawiono (do uzyskania tępego końca) stosując fragment Klenowa. Naprawiony C_k DNA z tępym końcem zligowano z wektorem pTCSLDHFR* strawionym PvuII i poddanym obróbce fosfatazą (zastosowano fosfatazę z jelita bydlęcego). Mieszaninę z ligowania zastosowano do transformowania kompetentnych komórek E. coli DH5a. Pojedyncze kolonie zebrano i zastosowano do zaszczepienia 24 ciekłych hodowli. Z każdej z hodowli wypreparowano DNA. Każdą z próbek DNA strawiono PvuII i Hindlll, a następnie zanalizowano na 1% żelu agarozowym. Stwierdzono, że spośród 24 próbek 5 zawiera insert C_k o prawidłowej orientacji. Próbkę nr 7 wybrano do dalszych badań.

Zastępowanie genu mutantowego DHFR* dzikim genem DHFR

W celu przeprowadzenia ekspresji wektora pTCSLC_ADHFR* w komórkach CHO (dhfr ) DUX Bil, gen DHFR* zastąpiono genem DHFR. DNA z próbki nr 7 pTCSLCJJHFR* oraz plazmid pSV2-DHFR (otrzymany od dr Paula Berga, Department of Biochemistry, Stanford University Medical School) strawiono enzymami restrykcyjnymi Hindlll i BgHI w celu wydzielenia odpowiednich fragmentów genu. W wyniku analizy stwierdzono, że dodatkowe miejsce Bglll w wektorze pTCSLC^DHFR* usunęło także część miejsca polyA,, co mogłoby zakłócić działanie wektora. Z tego względu trawienie powtórzono stosując Hindlll i BamHI. Część wektora (DHFR*)pTCSLC_jt potraktowano fosfatazą. Następnie obydwa wydzielone

180 157 fragmenty (PTCSLC^ i DHFR) oczyszczono na żelu i zanalizowano na 1% żelu agarozowym w celu określenia jakości i oszacowania ilości. Okazało się, że obydwa pasma są czyste, a ponadto oszacowano, że ich stężenia są zbliżone, ~ 40-50 ng/ml. Gen DHFR zligowano z wektorem pTCSLC_A stosując ligazę T4 DNA. Mieszaninę z ligowania zastosowano do transformowania kompetentnych komórek E. coli DH5a. Pojedyncze kolonie zebrano i zastosowano do zaszczepienia 24 ciekłych hodowli. Z każdej z hodowli wypreparowano DNA. DNA zanalizowano przez trawienie enzymami restrykcyjnymi Hindlll i BamHI. Spośród 24 hodowli 23 zawierało prawidłowe pasma świadczące o insercji genu DHFR do wektora PTCSLC^. Próbkę nr 22 wybrano do dalszych zastosowań.

Mutageneza in vitro prowadząca do uzyskania obszarów V szczepionych CDR z ludzkim szkieletem

Konstrukcja humanizowanych zmiennych genów

Humanizowany gen VH skonstruowano na drodze ukierunkowanej mutagenezy matrycy Ml3 VHPCR1, która zawierała syntetyczny gen VH z obszarami szkieletowymi ludzkiego białka szpiczakowego NEWM (patrz Jones i inni 1986). Jednoniciowy matrycowy DNA wypreparowano z Ml 3 VHPCR1 hodowanego w szczepie dut', ung' E. coli RZ1032, tak że matrycowy RNA zawierał uracyl zamiast tyminy. Zsyntetyzowano mutageniczne startery oligonukleotydowe do kodowania CDR TM23 i dokładnie dopasowanej sekwencji flankującej o około 15 bp z każdej strony. Zastosowano startery

CDR1 ' TGGCTGTCTCACCCAGTTTACACCATAGGCGGTT7\ATGAGAAGCCAGACACGG 3 ’ ,

CDR2

5' TGCTGGTGTCCTTTCAGCATTGTCACTCTGGATTTGAGAGCTGAATTATAGTCT

GTATTTCCATCACCCCATATCATTCCAAT/ GCCACTCAAGACC 3' oraz CDR3

5' CCAGTAGTCCATAGCATAGAGGGTAGCCGTAACCCTATCTCTTG

CACAATAATAG 3' .

Sondę oligonukleotydu dla CDR wydłużono na końcu 3', tak aby zawierała wymagane reszty w pozycjach 27-30. Mieszany oligonukleotyd wykonano dla CDR 2, wydłużono na końcu 3' CDR stosując G lub T w miejscu zasady 402 w VH, otrzymując 2 alternatywne kodony, tak że w pozycji 48 w VH znajduje się L lub I. Oligonukleotydy (po 10 pmoli) fosforylowano 5 jednostkami kinazy polinukleotydowej T4 w całkowitej objętości 50 μΐ w 37°C przez 1 godzinę. 1 pmol każdego z mutagenicznych starterów i 1 pmol sekwencjonującego startera Ml3, 3' od genu V, zhybrydyzowano z 0,5 pg matrycy w łącznej objętości 20 μΐ, przez ogrzanie do 90°C na 30 s, szybkie schłodzenie do 70°C i powolne schłodzenie do 37°C. Zhybrydyzowane startery wydłużono i zligowano z dodatkiem polimerazy T7 DNA i ligazy T4 DNA, prowadząc inkubację w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Matrycowy DNA zawierający uracyl usunięto przez obróbkę DNA 1 jednostką gligozydazy uracylowego DNA w 37°C przez 1 godzinę, pozostawiając zmutowaną nić w stanie nienaruszonym. Otrzymany DNA zamplifikowano metodą PCR, a następnie zanalizowano metodą elektroforezy na żelu agarozowym w celu sprawdzenia, czy uzyskano DNA o odpowiedniej wielkości. DNA rozcięto Hindlll i BamHI i zligowano z miejsca Hindlll i BamHI w M13mpl9.

Podobnie skonstruowano przemodelowany gen TM23 VK (TM23HuVK) na drodze mutagenezy matrycy faga Ml 3, która zawiera sekwencję DNA genu VK z obszarami szkieletowymi ludzkiego białka Bence-Jonesa, REI. Pochodził on z Ml3 VKPCR1, który zastosowano w konstrukcji chimerycznego lekkiego łańcucha, z miejscami enzymów restrykcyjnych PvuII i Bell stosowanymi do usuwania klonowania. Zastosowano startery

180 157

CDR1

5' TCTGCTTGGTACCAGTTTAAATAATTGCTAATGCCCTGACTTGCACTACAGGTGA

TGGTC 3',

CDR2

5' TCTGCTTGGCACACCTGAGTGTAAACTTGATGTGTAGTAGATCAGCAGCTT 3' oraz CDR3 ' CCCTTGGCCGAACGTCCGAGGAAGTTTACTATACTGCTGGCAGTAGTAG 3 ’ .

Uzyskano produkty PCR o oczekiwanej wielkości, 823 dla obydwu VH i 620 bp dla VK i przeprowadzono ich klonowanie w wektorze M14mpl9.

Weryfikacja humanizowanych sekwencji zmiennego obszaru DNA

Potwierdzono, że wstawiono wymagane CDR, że nie wprowadzono fałszujących zmian oraz że skonstruowano prawidłowe humanizowane geny VH i VK. Sekwencjonowanie pełnych zmiennych obszarów przeprowadzono metodą didezoksy stosując połimerazę T7 DNA Lub Seąuentase. Uzyskane sekwencje porównano z sekwencjami zaprojektowanymi. Wybrano klony zapewniające oczekiwaną sekwencję dla dwóch VH. Klony te określono jako Ml3 TM23NMVH i Ml3 TM23NMVHL. Klon dający oczekiwaną sekwencję dla przemodelowanego VK, nr 11, wybrano i określono jako M13 TM23HuVK.

Klonowanie przegrupowanych obszarów V Regiony szpiczakowych wektorów ekspresji Klonowanie humanizowanych zmiennych obszarów TM23 w wektorach ekspresji

Klonowane humanizowane zmienne obszary przeniesiono do wektorów ekspresji zawierających geny stałego obszaru ludzkiego w celu doprowadzenia do ekspresji przeciwciał w komórkach ssaka. Dwa humanizowane geny wydzielono z Ml3 TM23NMVH i Ml 3 TM23NMVHL jako fragmenty od Hindlll do BamHI i przeprowadzono ligowanie w miejsca Hindlll i BamHI wektora ekspresji ciężkiego łańcucha, pSVgpt.HuIgGl.

Humanizowany gen VK wydzielono z Ml 3 TM23HuVK jako fragment od Hindlll do BamHI i zligowano w miejsca Hindlll i BamHI wektora ekspresji lekkiego łańcucha _PSVhvg.HuCK.

Analiza metodą enzymów restrykcyjnych wykazała, że dwa wariantowe VH zostały prawidłowo wstawione do wektora ciężkiego łańcucha, tak że uzyskano plazmidy pSVgptTM23NMVH.HuIgGl i _PSVgptNMVHL.HuIgGl.

Również humanizowany VK został prawidłowo wstawiony do wektora lekkiego łańcucha, tak że uzyskano plazmid pSVhygTM23HuVK.HuCK.

Współtransfekcja konstruktów łańcuchów H i L w komórkach NSO

W spółtransfekcj a humanizowanych genów ciężkich i lekkich łańcuchów

Humanizowane plazmidy ekspresji przeniesiono do linii komórek ssaków, NSO i P3-8.653F8879.

Współtransfekcję humanizowanych plazmidów ekspresji do komórek NSO i P3-8.653F8879 przeprowadzono w taki sam sposób jak w przypadku chimerycznych plazmidów ekspresji.

Przeprowadzono współtransfekcję każdego z dwóch humanizowanych plazmidów ciężkiego łańcucha, pSVgptTM23NMVH.HuIgGl i pSVgptNMVHL.HuIgGl z humanizowanym

180 157 plazmidem lekkiego łańcucha, pSVhygTM23HuVK.HuCK uzyskując linie komórek wytwarzające w wyniku ekspresji dwa wariantowe humanizowane przeciwciała, TM23HuVH/HuVK i TM23HuVHL/HuVK. Przeprowadzono także współtransfekcję tych plazmidów ekspresji w kombinacji z chimerycznymi plazmidami ekspresji, uzyskując linie komórek wytwarzające w wyniku ekspresji hybrydowe przeciwciała, TM23HuVH/MuVK, TM23HuVHL/MuVK i TM23MuVH/HuVK. Te hybrydowe przeciwciała stanowią cenne narzędzia do lokalizowania przyczyny jakiegokolwiek defektu wiązania z ciężkim łańcuchem lub lekkim łańcuchem w humanizowanym przeciwciele.

W 14 dni po transfekcji dobrze widoczne stały się kolonie komórek NSO dla wszystkich kombinacji różnych plazmidów. Tylko jedną kolonię komórek P3-8.653F8879 otrzymano z posiewu na wszystkich płytkach i z tego względu odrzucono je.

Selekcja ludzkich IgGI/k-dodatnich klonów

Selekcja komórek wytwarzających ludzkie przeciwciała

Wydzielono linie komórek NSO wytwarzające humanizowane i hybrydowe chimeryczne/humanizowane przeciwciała. Próbki supematantu ze studzienek zawierających kolonie komórek zanalizowano metodą ELI SA.

TM23HuVH/HuVK:- Wybrano komórki NSO z 4 studzienek, w których supematant dawał najwyższy odczyt w teście ELISA: D5, D10, C6 i Eli. Studzienka D5 zawierała dwie widoczne kolonie, pozostałe po jednej kolonii. Jednakże uzyskane z nich linie komórek nie musiały zostać sklonowane. Linie komórek z tych studzienek wyhodowano i zamrożono w ciekłym azocie jako TM23HuVH/HuVK D5, D10, C6 i Eli.

TM23HtlVHL/HuVK:- Wybrano komórki NSO z 4 studzienek, w których supematant dawał najwyższy odczyt w teście ELISA: B2, B7, D8 i E9. Studzienka E9 zawierała dwie widoczne kolonie, pozostałe po jednej kolonii. Jednakże uzyskane z nich linie komórek nie muszą być klonalne. Linie komórek z tych studzienek wyhodowano i zamrożono w ciekłym azocie jako TM23HuVHL/HuVK B2, B7, D8 i E9.

TM23HuVH/MuVK:- Przeprowadzono selekcję komórek NSO z 4 studzienek, w których supematant dawał najwyższy odczyt w teście ELISA: D9, E6, F10 i G10. Studzienki F19 i G10 zawierały po 2 widoczne kolonie, pozostałe po jednej. Jednakże uzyskane z nich linie komórek nie muszą być klonalne. Linie komórek z tych studzienek wyhodowano i zamrożono w ciekłym azocie jako TM23HuVH/MuVK D9, E6, F1Ó i G10.

TM23HuVHL/MuVKL:- Przeprowadzono selekcję komórek NSO z 4 studzienek, w których supematant dawał najwyższy odczyt w teście ELISA: B8, C6, D2 i D8. Studzienki C6 i D8 zawierały po 2 widoczne kolonie, pozostałe po jednej. Jednakże uzyskane z nich linie komórek nie muszą być klonalne. Linie komórek z tych studzienek wyhodowano i zamrożono w ciekłym azocie jako TM23HuVHL/MuVK B8, C6, D2 i D8.

TM23MuVH/HuVK:- Przeprowadzono selekcję komórek NSO z 4 studzienek, w których supematant dawał najwyższy odczyt w teście ELISA: B9, G4, G6 i Gil. Wszystkie zawierały co najmniej po 4 widoczne kolonie. Jednakże uzyskane z nich linie komórek nie muszą być klonalne. Linie komórek z tych studzienek wyhodowano i zamrożono w ciekłym azocie jako TM23MuVH/HuVK B9, G4, G6 i Gil.

Synteza pierwszej nici cDNA do ekspresji w komórkach CHO

Wytwarzanie cytoplazmatycznego RNA

Wytworzono RNA do odwrotnej transkrypcji. Fiolkę z komórkami NSO TM23 HuVHL/HuVK wyjęto z ciekłego azotu i szybko odmrożono w 37°C. Komórki stopniowo rozcieńczono 10 ml ośrodka Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F12 (DMEM/F12) uzupełnionego antybiotykami i 5% płodowej surowicy bydlęcej wolnej od γ-globuliny (FBS wolnej od GG). Komórki odwirowano przy 1500 obrotów/minutę przez 5 minut, ośrodek usunięto,

180 157 a pozostałość zawieszono w 20 ml świeżego ośrodka w 75 ml kolbie. Hodowlę powiększono do 30 ml w 175 ml kolbie. Aktywnie rosnące komórki odwirowano i przemyto 3 razy zimnym roztworem soli buforowanym fosforanem (PBS). Cytoplazmatyczny RNA wypreparowano z komórek sposobem Favoloro i innych (1980). W sumie otrzymano 350 pg cytoplazmatycznego RNA.

Synteza cDNA

Przygotowano obszary VH i VK pierwszej nici RNA. Zmienny obszar pierwszej nici cDNA zsyntetyzowano w reakcjach zawierających 5 pg RNA, 250 pM trifosfatazy dezoksynukleotydowej (dNTPs), 15 jednostek inhibitora rybonukleazy (Pharmacia RNA-guard) i 25 pM of startera oligonukleotydowego.

Jako startery zastosowano oligo 1109 dla VH

5' GGGGAAGACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACC 3 ' i oligo 1095 dla VK

5' AGATTTCAGCTGCTCATCAGATGGCGGGAAGATGAAGACAGATGG 3'.

Mieszaniny ogrzano do 70°C na 10 minut, po czym powoli schłodzono do 37°C. Dodano 100 jednostek transkryptazy Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase i mieszaniny inkubowano w 37°C przez 30 minut.

Amplifikację cDNA przeprowadzono metodą PCR stosując powyższe startery w połączeniu z oligo 1096 for VH ’ GCCGCTCGAGCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAG 3 ' i oligo 1094 dla VK

5' GCCGCTCGAGCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTT

GGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGACATCCAGATGACCCAGAG 3 ’ .

Produkty PCR sprawdzone metodą elektroforezy na żelu agarozowym okazały się produktami o oczekiwanej wielkości (około 450 bp). Pasma DNA oczyszczono z żelu.

Trawienie enzymami restrykcyjnymi

Produkty PCR strawiono do klonowania w wektorach CHO. Produkt PCR VH strawiono Xhol i Apal. Produkt PCR VK strawiono Xhol i PvuII. Próbki strawionych DNA poddano elektroforezie na żelu agarozowym. Zaobserwowano pasma o oczekiwanej wielkości, 450 bp.

Izolat obszarów V (Vh [TCS i S] oraz Nk [S]) cDNA na drodze amplifikacji Vh [TCS] metodą PCR

Otrzymano próbki pierwszej nici cDNA, TM27 N_k i TM27 V_H oraz startery oligonukleotydowe zastosowano do amplifikacji tych cząsteczek. PCR z zastosowaniem cDNA TM27 V_H z odpowiednimi starterami przeprowadzono stosując polimerazę Taq. Produkt wprowadzono na żel agarozowy i oczyszczano stosując zestaw Geneclean II (BiolOl). Odzysk oszacowano na 1,5 ng/ml.

Transfekcja komórek COS pSRiNeo4Hl 1 (lekki) i pBJ14Hl 1 (ciężki) do wydzielania obszaru C cDNA

Pochodzące od ssaków wektory ekspresji pSRiNeo i PBJL stanowią pochodne pcDL-SRa296 (Takebe i inni (1988) Mol. Celi. Biol. 8:466), jak to opisali Lin i inni (1990)

180 157

Science 249:677, w którym miejsce Xhol zlokalizowane między promotorem SRa i miejscem poliadenylowania SV40 zastąpiono dla ułatwienia klonowania genu polilinkerem, który zawierał następujące miejsca restrykcyjne: 5' Xhol / Xbal / Sfil / Notl / EcoRI / EcoRV / Hindlll, / Ciał 3'. Do pSRINeo wstawiono gen odporności na neomycynę między gen odporności na ampicylinę i promotor SRa. Najpierw wykonano fuzję lidera kodującego cDNA i obszaru V-D-J ciężkiego łańcucha TM23 uzyskując genomowy stały obszar ciężkiego łańcucha, po czym wstawiono w Xhol i Notl pocięty wektor pBJl uzyskując pBJ14Hl 1 (ciężki). Podobnie najpierw wykonano fuzję lidera kodującego cDNA lekkiego łańcucha i V-J uzyskując genomowy fragment k, po czym wstawiono w pocięty Xhol / Notl pSRINeo otrzymując pSRlNeo4Hll (lekki). Następnie przeprowadzono współtransfekcję dwóch plazmidów, pBJ14Hll (ciężki) i pSRlNeo4Hll (lekki) w komórkach COS-7 (SV40 transformowany linią komórek nerek zielonej małpy afrykańskiej, ATCC CRL 1651) do przejściowej ekspresji.

Wydzielanie stałego obszaru ludzkiego IgGl cDNA stałego obszaru ludzkiego IgGl uzyskano z poly(A)⁺ RN A wydzielonego z transfekowanych komórek COS metodą PCR z zastosowaniem starterów stałego obszaru IgGl:

starter postępowy

5’GCGTGACAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTC 3’ i starter odwrotny

5' GCGTGACAAGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTT 3'.

Przeprowadzono klonowanie fragmentu PCR z cDNA stałego obszaru, z EcoRI na końcu 3' (flankującym obszar kodowania) oraz Apal na końcu 5' (w obszarze kodowania) w plazmidzie pBS Ks⁺ w celu przeprowadzenia subklonowania i sekwencjonowania. Sekwencjonowanie całego obszaru stałego przeprowadzono za pomocą starterów T3 i T7, uzupełniono wewnętrznymi starterami obszaru stałego. Klon z prawidłową sekwencją subklonowano w plazmidzie pTCSLNeo uzyskując pTCSLCglNeo.

Konstrukcja plazmidu pTCSLCglNeo

Klon IgGICgl z prawidłową sekwencją w pBS KS⁺ pocięto enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Apal i zligowano w pTCSNeo strawionym tymi samymi enzymami. Uzyskany plamizd, pTCSLCglNeo, zastosowano do dalszej modyfikacji w celu uzyskania pTCSLCgNeoApa’.

Eliminacja miejsca Apal w PTCSL^lNeo prowadząca do PTCSLCHNeoApa'

Wektor ekspresji pTCSLCglNeo CHO zawiera 2 miejsca dla enzymu restrykcyjnego Apal: jedno miejsce znajduje się w obszarze polilinkera wykorzystywanym do insercji klonowanych fragmentów; drugie znajduje się tuż 3' przy genie neo^r. Aby uprościć prowadzone potem etapy klonowania, miejsce Apal w sąsiedztwie neo^r wyeliminowano; małą próbkę wprowadzono na żel agarozowy w celu sprawdzenia obecności liniowych cząsteczek czyli plazmidów rozciętych w jednym tylko z dwóch miejsc Apal. Strawiony materiał zadano polimeraząT4 DNA, która selektywnie usuwa jednoniciowe wydłużenie na lewo od Apal nie trawiąc dwuniciowego DNA. Plazmidy przywrócono do kolistości przez ligowanie i przeniesiono do kompetentnych komórek E. coli HB101. 30 transformantów zebrano i zastosowano do zaszczepiania ciekłych hodowli. Z każdej hodowli wypreparowano DNA, strawiono Apal i wprowadzono na żele agarozowe. Niestety w czasie trawienia plazmidowy DNA uległ degradacji. Trawienie Apal powtórzono na 21 z 30 próbek. Okazało się, że dwa izolaty (nr 4 i 12) są linearyzowane przez Apal, a pozostałe rozcinane są w dwóch miejscach. Dwa klony kandydackie strawiono Apal i Hindlll w celu sprawdzenia, które z miejsc Apal zacho

180 157 wało się. W teście tym miejsce Apal 3' od neo^r w izolacie pTCSLCglNeoApa nr 12 wyeliminowano, co było pożądane. Przeprowadzono dodatkowe trawienia restrykcyjne, które potwierdziły budowę tego izolatu.

Klonowanie ludzkiego k i obszarów V ciężkiego łańcucha wydzielonych z PCR odpowiednio w wektorach CHO, pTCSLCiDHFR i pTCSLCglNeoApa Klon fragmentu TM27 V^w pTCSLC^DHFR cDNA obszaru V łańcucha k V dla TM27 oczyszczono na żelu i strawiono odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Małą porcję próbki DNA zanalizowano na 1% żelu agarozowym w celu oszacowania ilości i potwierdzenia jakości. Dodatkowe pasmo (zanieczyszczenie) zaobserwowano przy ~ 800 bp, oceniając jego stężenie na 1,25 ng/ml. Obszar V zligowano z wektorem PTCSLC^DHFR, który strawiono enzymami Xhol i PvuII oraz poddano obróbce fosfatazą. Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformowania kompetentnych komórek E. coli DH5a. Wydajność transformowanych kolonii była bardzo niska. Pojedyncze kolonie wybrano i zastosowano do zaszczepiania 12 ciekłych hodowli. Z każdej wypreparowano DNA, strawiono Xhol i PvuII i zanalizowano na 1% żelu agarozowym. Uzyskano 2 dodatnie próbki, nr 2 i nr 4. Każdą z dodatnich próbek poddano sekwencjonowaniu.

Fragment klonu TM27 V_H w pTCSLCRNeoApa

Produkt PCR odpowiadający obszarowi V_H z TM27 oczyszczono na żelu i strawiono odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi (Xhol i Apal). Jednakże w związku z tym, że stwierdzono iż trawienie Apal może nie przebiec do końca, powtórzono je. Małą próbkę zanalizowano na żelu agarozowym w celu oszacowania ilości i potwierdzenia jakości. Stężenie pasma odpowiadającego obszarowi V_H oszacowano na 0,4 ng/ml. Podobnie jak w przypadku fragmentu V*, zaobserwowano dodatkowe pasmo przy ~ 800 bp, co sugeruje, że czystość materiału również nie odpowiadała oczekiwaniom. Obszar V_H zligowano z wektorem pTCSLCglNeoApa’, który strawiono enzymami restrykcyjnymi Xhol i Apal i poddano obróbce fosfatazą. Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformowania kompetentnych komórek E. coli DH5a. Odzyskano bardzo mało transformantów. Wydajność transformowanych kolonii była bardzo niska. 6 kolonii wybrano i zastosowano do zaszczepiania ciekłych hodowli. Z każdej wydzielono minipreparat DNA, strawiono Xhol i EcoRI oraz zanalizowano na żelach agarozowych. Jeden potencjalny klon odzyskano z pierwszego ligo wania, pTCSLHuV_H4HCglNeoApa’ (izolat nr 6). Aby uzyskać więcej potencjalnych klonów (okazało się w późniejszych testach, że izolat nr 6 nie zawierał prawidłowej sekwencji), przeprowadzono dodatkowe ligowanie stosując 1) produkt V_H z PCR oczyszczony ponownie na niskotopliwym żelu agarozowym w celu usunięcia pasma o wysokim ciężarze cząsteczkowym, stanowiącego zanieczyszczenie, oraz 2) produkt V_H z PCR zsyntetyzowany z cDNA i starterów. Z tych reakcji łigowania poddano analizie 8 dodatkowych transformantów i wydzielono 5 potencjalnych klonów: izolaty nr 9, 10, 11, 12 i 14.

Sekwencjonowanie klonowanych obszarów V na obydwu niciach w celu potwierdzenia oczekiwanej sekwencji DNA

Startery ułatwiające analizę sekwencyjną DNA obszarów V wstawionych do wektorów pTCSLCglNeoApa’ i pTCSLC^DHFR otrzymano z Operon Research. Starter postępowy zlokalizowano w sekwencjach wektora pTCS i zastosowano do sekwencjonowania insertów V w wektorach pTCSLCg lNeoApa’ i pTCSLC^DHFR. Startery odwrotne znajdują się w sekwencjach C_k lub Cgl i stosowane są do sekwencjonowania odpowiednio insertów V_A i V_H.

Sekwencj ono wanie dwuniciowe ludzkiego obszaru V łańcucha k

Dwie próbki TM23 (nr 3 i nr 4) poddano sekwencjonowaniu w obydwu niciach. Nić odwrotną sekwencjonowano w całości poprzez miejsca enzymów restrykcyjnych (3'-5'; PuvII

180 157

Xhol) stosując starter HUCK5PR. Sekwencję nici postępowej określono stosując dwa różne startery, PTCSFOR i PTCSFWD. Sekwencję o pełnej długości otrzymano poprzez miejsca enzymów restrykcyjnych (5' - 3'; Xhol - PvuII) przez połączenie sekwencji otrzymanych z każdego ze starterów. Stwierdzono obecność niewielkiego obszaru kompresji w niciach postępowych, którego nie rozwikłał żaden ze starterów lub poprzez zastosowanie sposobu sekwencjonowania, który łagodzi takie kompresje. Jednakże potwierdzona została prawidłowa sekwencja nici odwrotnej w tym obszarze. Okazało się, że obydwie próbki, nr 3 i 4, zawierają prawidłową sekwencję. Próbkę 4 wybrano do zastosowania w transfekcji komórek ssaków.

*** Dwuniciowe sekwencj onowanie obszaru V łańcucha γ TM27

Fragmenty V_H pTCSLHuV_H4HC_glNeoApa (izolaty nr 6 i 9) poddano całkowitemu sekwencjonowaniu na obydwu niciach. Fragment humanizowanego V_H izolatu nr 6 odpowiadał oczekiwanej sekwencji w obszarze kodowania. Stwierdzono pojedyncze podstawienie pary zasad (C na T) w pozycji -2 (w stosunku do wyjściowego ATG), jednak nie wydaje się, aby wpływało ono na ekspresję. Fragment V_H z izolatu nr 9 zawierał 2 podstawienia w obszarze kodowania. Czterech dodatkowych potencjalnych klonów nie sekwencjonowano.

Kotransfekcja komórek COS i CHO plazmidami TM27 i CONTROL

Jako komórki biorców zastosowano CHO dhfr’ DUX Bil i COS-1. Linię komórek CHO DUX Bil otrzymano z Biogen Inc. Do transfekowania CHO 5 pg plazmidów TM27 pTCSLHuY^HCJJHFR (izolat nr 4), pTCSLHuV_H4HC_glNeoApa’ (izolat nr 6) oraz wektory pTCSLDHFRApa i pTCSLNeoApa zlinwaryzowano przez strawienie enzymem restrykcyjnym Aatll. Plazmidy zawierające TM27 (oznaczone jako „TM27L”) współstrącono w etanolu i ponownie zawieszono w wodzie. Podobnie wektory plazmidowe (oznaczone „CONTROL”) współstrącono i ponownie zawieszono w wodzie. Każdy ze współstrąconych plazmidów zastosowano do transfekowania 10⁷ komórek CHO na drodze elektroporacji, stosując BioRad Gene Pulser przy 250 V i 960 mF. Transfekowane komórki hodowano na pożywce Minimał Essential Medium (aMEM) uzupełnionej o tymidynę, adenozynę i dezoksyadenozynę (ośrodki nieselektywne) przez 2 dni przed selekcją.

W przypadku transfekcji COS 5 pg nie pociętych plazmidów TM27L i wektory plazmidowe współstrącono w etanolu i zawieszono w wodzie. Plazmidy zastosowano do transfekowania 4,1 χ 10⁶ komórek COS na drodze elektroporacji. Transfekowane komórki hodowano w ośrodku Dulbeccols Modified Eagle Medium (DMEM) przez 3 dni, po czym supematanty zebrano i poddano analizie.

Analiza supematantów z transfektantów COS metodąELISA z ludzkim IgGl i barwienia

Wytwarzanie ludzkiego IgG przez komórki COS oznaczono metodą ELISA z ludzkim IgGl dla supematantów hodowli komórkowych. Płytki microtiter powleczono mysim, przeciwludzkim przeciwciałem IgGl Fc w PBS i zablokowano buforem blokującym (1% BSA w PBS). Supematanty dodano w porcjach po 100 pl. W razie potrzeby oceniano odpowiednie rozcieńczenia w buforze blokującym. Wychwycony IgG wykrywano przeciwludzkim przeciwciałem Ig*, skoniugowanym z peroksydazą chrzanową i OPD (ofenylenodiaminą). Supernatanty z komórek COS transfekowanych TM27L wykazywały poziom ludzkiego IgG 95 ng/ml. Ludzkie IgG z komórek COS transfekowanych wektorami CONTROL były nie wy kry walne. Przeprowadzono cytometrię przepływową supematantów z komórek COS transfekowanych TM27L, zatężonych około 6-krotnie. Intensywność barwienia dla komórek HPB, określona na podstawie fluorescencji kanałowej, była około 9 krotnie niższa niż dla oczyszczonych TM27L (oczyszczonych od komórek NS0) przy ~ 2,5 mg/ml. Dla komórek Jurkata barwienie było na poziomie tła.

180 157

Selekcja transfektantów CHO

Transfektanty CHO umieszczono w celu przeprowadzenia selekcji w ośrodku aMEM pozbawionym dodatków nukleotydowych (w celu wyselekcjonowania DHFR⁺ na pTCSLHuVH4HCjE)HFR) i zawierającym gentamycynę (G418: w celu wyselekcjonowania neo^r na pTCSLHuVH4HC_glNeoApa'). Komórki naniesiono w stężeniu 2,0 χ 10⁵ komórek/ml na płytki z 24 studzienkami.

Analiza supematantów transfektantów CHO metodą ELISA z ludzkim IgGl

Po 12 dniach w selektywnym ośrodku supematanty ze zlanych studzienek zebrano i oznaczono metodą IgGl/k ELISA. Stężenia supematantów w TM27L wynosiły 182-236 ng/ml. W większości przypadków wynosiły one > 200 ng/ml. Ludzki IgGl/A jest niewykrywalny w supematantach CONTROL. Komórki z 12 wysokoproduktywnych studzienek z TM27 rozmieszczono w kolbach T25. Pojedyncze fiolki zamrożono jako hodowle zapasowe i przechowywano w ciekłym azocie. Komórki z dwóch studzienek CONRrol również przeniesiono do kolb T25 i zamrożono.

Pierwszy posiew transfektantów CHO z organicznym rozcieńczaniem najsilniej produktywne studzienki wybrano do posiewu z organicznym rozcieńczaniem na płytkach z 96 studzienkami: studzienki nr 1BI (232,6 ng/ml), 1D6 (233,3 ng/ml), 2B2 (235,5 ng/ml) i 2C1 (236,0 ng/ml). Dla każdej studzienki zastosowano po 3 płytki w selektywnych ośrodkach: jedną przy 1 komórce/studzienkę i dwie przy 0,5 komórki/studzienkę.

Selekcję supematantów z pierwszej rundy klonowania przeprowadzono metodą IgGllk ELISA. Komórki z 90 studzienek o wysokiej produktywności przeniesiono na płytki o 24 studzienkach i hodowano do zlania. Supematanty z 12 spośród tych hodowli oceniono metodą ludzkiego IgGl/k ELISA i cytometrii przepływowej. Stężenie w teście ludzkim IgGl/A: ELISA wynosiło 211-1048 pg/ml. Wszystkie próbki barwiły komórki HPB (średnia fluorescencja kanałowa od 46,5 do 169,9), ale nie barwiły komórek Jurkata. Sześć najsilniej produktywnych klonów powiększono i zamrożono (jako zapas) w ciekłym azocie. Spośród nich dwa najsilniej produkujące klony (1B1-C7 i 2B2-H9) wybrano do kontynuowania badań w kolejnych rundach klonowania.

Dwie pierwotne hodowle konstruktów CONTROL również przeprowadzono przez 1 rundę z ograniczonym rozcieńczaniem na płytkach o 96 studzienkach. Po jednym klonie z każdej płytki wybrano i rozszerzono. Supematanty oceniono stwierdzając, że nie dają one wykrywalnego sygnału w teście IgGl/ł ELISA (strona 640-83). Komórki zamrożono i przechowywano w ciekłym azocie.

Rozszerzenie nieklonowanych hodowli do skali w toczonych butelkach w celu oczyszczenia przeciwciał podstawowe hodowle (1B1 i 2B2) poszerzono w celu uzyskania wystarczającej ilości materiału do oczyszczania abq TM27. Hodowle przeniesiono do 2-litrowych butelek przeznaczonych do toczenia i dopasowano do niskich poziomów surowicy (od T25 w 10% surowicy -> T75 w 10% surowicy - > 3 χ T75 w 5% surowicy - > 3 x 2-litrowe butelki w 1% surowicy) (strona 640-24). Hodowlę w 2-litrowych butelkach założono w dniu 1 i dokarmiano (zastępując 1/2 objętości świeżym ośrodkiem z 1% surowicy) w dniach 2, 5 i 8. Pierwszego zbioru dokonano w dniu 10, drugiego w dniu 12, a trzeciego w dniu 15. Zebrane supematanty odwirowano i przechowywano w -20°C do oczyszczania.

Oczyszczanie przeciwciała w kolumnie z białkiem A

Supematanty z hodowli 2B2 zebrano (łączna objętość 2,7 litra) i przesączono przez 0,22 μ nylonową membranę. Analiza ludzki IgGl ELISA wskazywała, że całkowita ilość materiału wyjściowego wynosiła 1090 mg. Przeciwciała oczyszczano w kolumnie Prosep-A (białko A)

180 157 stosując do eluowania cytrynian o pH 5,0, 4,0 i 3,0. Eluaty dializowano do PBS. Ilości oczyszczonego przeciwciała we frakcjach eluatu oznaczano metodą ludzki IgGl ELISA. Frakcja o pH 3,0 zawierała większość oczyszczonego przeciwciała, z tym że niewielkie ilości znaleziono również we frakcji o pH 4,0. Test ludzki IgGl ELISA powtórzono, aby uzyskać dokładniejsze wyniki pomiarów stężeń. Całkowita wydajność TM27 (frakcje pH 3,0 + pH 4,0) wyniosła 960 mg.

Oczyszczanie przeciwciał z supematantu hodowli transfektantu NS0 na białku A

Przeciwciała z supematantów z hodowli transfektantu NS0 oczyszczano w kolumnie z białkiem A w sposób opisany powyżej.

Charakteryzowanie przeciwciała TM27 z linii komórek szpiczaka NS0

TM27 mAb oczyszczony z supematantów hodowli transfektantówNSO metodą chromatografii w kolumnie z białkiem A zastosowano do barwienia komórek HPB-ALL (Ύβ 5.2) i komórek Jurkata (Υβ 8.1) jako ujemnej próby kontrolnej w porównaniu z mysim mAb, TM23 i chimerycznym TM27. TM27 barwił komórki HPB-ALL ale nie Jurkata.

W celu określenia specyficzności TM27 zwykłe komórki T PBL zabarwiono TM27 w porównaniu z TM24 mAb. Zarówno TM27 jak i TM23 mAb barwią 3,0% całości ludzkich komórek T PBL. Przeprowadzono test konkurencji, w którym TM23 mAb znaczony FITC dodawano w ustalonym stężeniu do nieznaczonego 4H11 lub TM27 mAb w różnych stężeniach. Mieszanki przeciwciał zastosowano następnie do barwienia komórek HBP-ALL. Zarówno nieznaczony TM23 jak i TM27 blokują barwienie przez TM23 znaczony FITC. W celu sprawdzenia czy TM27 może współmodulować z antygenem CD3, komórki HPB-ALL inkubowano przez noc z różnymi stężeniami TM27 lub TM23 mAb, po czym zabarwiono przeciw-CD3 mAb. Wyniki wskazują że TM27 oraz TM23 mogą powodować endocytozę kompleksu TCR/CD3.

Przeprowadzono analizę Scatcharda, aby zmierzyć powinowactwo wiązania TM27 na komórkach HPB-ALL. Zarówno w teście Scatcharda jak i konkurencji (z TM23 mAb) wyniki wskazują że TM27 utrzymuje zasadniczo to samo powinowactwo (Kd = 2,0 χ ΙΟ'⁸ M’¹) i może z powodzeniem konkurować z 4H11 mAb.

Przeprowadzono również porównanie TM27L/NS0 i TM27L/CHO w teście konkurencji z 4H11, przedstawiając wyniki na fig. 3. Wykonano analizę Scatcharda, której wyniki pokazano na fig. 4.

Drugi posiew z ograniczonym rozcieńczaniem transfektantów CHO

Posiew z ograniczonym rozcieńczaniem wykonano jak wyżej.

Studzienki selekcjonowano w teście ELISA z ludzkim IgGl. Każdą z komórek z 6 studzienek (1B1-C7 i 2B2-H9) przeniesiono na płytki o 24 studzienkach i oceniono w teście ELISA z ludzkim IgGl. Po 2 najsilniej produktywne klony z każdej płytki rozszerzono i zamrożono w ciekłym azocie. Klony o najwyższej produktywności z każdej płytki wybrano do końcowej rundy subklonowania.

Trzeci posiew z ograniczonym rozcieńczaniem transfektantów CHO

Posiew z ograniczonym rozcieńczaniem wykonano jak wyżej. Studzienki selekcjonowano w teście ELISA z ludzkim IgGl. Każdą z komórek z 6 studzienek (1B1-C7 i 2B2-H9) przeniesiono na płytki o 24 studzienkach i oceniono w teście ELISA z ludzkim IgGl. Po 3 najsilniej produkujące klony z każdej płytki przeniesiono do kolb T25 i zamrożono w ciekłym azocie. Po jednym klonie z każdej kolby przeniesiono do kolby T75. Na tym etapie z ośrodka usunięto gentamycynę eliminując w ten sposób selekcję względem neo^r . Selekcję względem DHFR zachowano. Supematanty oceniano w teście ELISA z ludzkim IgGl. Klon 1B1-C7 produkował 4,69 mg/10⁶ komórek/dzień. Klon 2B2-H9 produkował 2,65 mg/10⁶ komórek/dzień. W związku z tym izolat C7 wybrano jako ostateczny klon, a izolat H9 uznano za klon wariantowy.

180 157

Wytwarzanie bazy zamrożonych komórek

Ostateczny wybrany klon przeniesiono do 5 kolb T225, aby uzyskać odpowiednią ilość komórek do założenia banku baz zamrożonych komórek. Komórki zebrano z kolb i uśredniono. Zebrana zawiesina zawierała 98,3% żywych komórek. Całkowite miano żywych komórek wynosiło 1,58 x 10⁸, co wystarczyło do przygotowania pożądanej ilości 72 fiolek, przy 2 x 10⁶ komórek/fiolkę. Komórki zamrożono i oznaczono jako „TM27L-662-35”. Dodatkowo wariantowy klon H9 również przeniesiono do jednej kolby T225, aby założyć mały bank zamrożonych komórek. Żywotność komórek zebranych z tej kolby wynosiła 97,3%. Zawiesina zawierała wystarczającą ilość komórek, aby przygotować 9,7 fiolek przy 2 χ 10⁶komórek/fiolkę (strona 662-89). Komórki zamrożono w ciekłym azocie i oznaczono jako „TM27L-662-89”.

Testowanie komórek odzyskanych z zamrożonej bazy Żywotność i badanie mikoplazmy

Jedną fiolkę zamrożonej bazy komórek TM27L-662-35 odmrożono i zregenerowano w aMEM. Na podstawie barwienia błękitem trypanowym ustalono, że żywotność wynosi 88%. Hodowlę z tej fiolki doprowadzoną do zlania zbadano na obecność zanieczyszczeń mikoplazmowych wykorzystując zestaw Bioniąue Testing Laboratories. Test nie wykrył zanieczyszczeń. Dodatkowo odmrożono jedną fiolkę zamrożonej bazy komórek TM27L-662-89. Na podstawie barwienia błękitem trypanowym ustalono, że żywotność wynosi 93,8%. Hodowlę z tej fiolki doprowadzoną do zlania zbadano na obecność zanieczyszczeń mikoplazmowych w sposób opisany powyżej. Test nie wykrył zanieczyszczeń. Obydwie hodowle przeniesiono do kolb T75 i supematanty z hodowli komórek oceniono w teście ELISA z IgGl. Klon TM27L-662-35 produkował 3,24 pg/10⁶ komórek/dzień, a klon TM27L-662-89 produkował 2,52 pg/10⁶ komórek/dzień. W drugiej próbie klon TM27L-662-35 produkował 3,03 pg/10⁶komórek/dzień, a klon TM27L-662-89 produkował 2,74 pg/10⁶ komórek/dzień.

Powiększenie skali TM27L-662-35 butelki przeznaczonej do toczenia, w celu oczyszczenia przeciwciał

Hodowlę TM27L-662-35 powiększono, aby uzyskać wystarczającą ilość materiału do oczyszczania przeciwciała TM27L. Hodowle przeniesiono do 2-litrowych butelek przeznaczonych do toczenia i dopasowano do niskich poziomów surowicy (od T25 w 10% surowicy -> T75 w 10% surowicy -> 3 χ T75 w 5% surowicy -> 3 x 2-litrowe butelki w 1% surowicy). Hodowlę w 2-litrowych butelkach założono w dniu 1 i dokarmiano (zastępując 1/2 objętości świeżym ośrodkiem z 1% surowicy) w dniach 2, 5, 7 i 9. Pierwszego zbioru dokonano w dniu 12, drugiego w dniu 14, a trzeciego w dniu 16. Zebrane supematanty odwirowano, przesączono i przechowywano w -70°C do oczyszczania.

Oczyszczanie przeciwciała w kolumnie z białkiem A

Supematanty z hodowli TM27L-662-35 połączono uzyskując łączną objętość 5,1 litra. Przeciwciała związano w kolumnie Prosep-A (białko A) stosując do eluowania O,1M cytrynian o pH 5,0 i 3,0. Eluat o pH 3,0 dializowano do PBS. Ilości oczyszczonego przeciwciała w wyjściowym materiale i we frakcjach eluatu oznaczono w teście ELISA z ludzkim IgGl/A:. Frakcja o pH 3,0 zawierała około 3,9 mg przeciwciała w 25 ml. Materiał zatężono w koncentratorze Centriprep-30 (Amicon) i potworzono test ELISA z ludzkim IgGltk. Całkowita wydajność TM27L wyniosła ~ 3,2 mg przy 1,6 mg/ml.

Wstępna charakterystyka oczyszczonego przeciwciała

Przeprowadzono cytometrię przepływową dla ~ 2,5 mg materiału z frakcji o pH 3,0 i 4,0 oraz dla TM27 oczyszczonego z komórek NS0. Intensywność zabarwienia komórek HPB, oznaczana na podstawie średniej fluorescencji kanału wyniosła odpowiednio: 283,46 dla

180 157 frakcji o pH 3,0; 321,98 dla frakcji o pH 4,0; 506,79 TM27 z NSO. W komórkach Jurkata zabarwienie było na poziomie tła dla wszystkich próbek.

Przykład 2. Sekwencje przeciwciał TM27 szczepionego CDR w porównaniu z ludzkimi kasetami szkieletowymi

TM27 N_k

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQTPGKAPKLLIYY 50

REI =======================Q===D=IK==================E

TM2 3 ======TT======L======S================K=DGTV======

WAL =======================R=========S ====K==========A

TSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPRTFGQ100

RE I A=N=QA===================================QS==Y====

TM2 3 ===================== SL===N=E====^::=====^:=======^:===⁼G

WAL A===Q===T===========F=L=========S=======SYSTLI====

101 GTKLQIT 107

REI =======

TM23 -==VE=K

WAL ==R=E=K

TM27 VH

J* QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVRQPPGRGLEWLGM 50

NEWM ====EQ====================STFSNDYYT============I=Y

TM23 ====K=======A===S==I======================K=======

HIL ==K=VQA=G=V=Q=GRS=R=S=IA===TFSN==MH====A==K====VAV

IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV100

NEWM VFYH=TS-DTTPLR======V==========================NLI

TM2 3 ================LSIS==N==S=VF=KMN=LQTD===R======== ciąg dalszy na str. 45

180 157 ciąg dalszy

HIL ==YN=SR=Y=GDSV=G=F=ISR=N==RTLYMZMN=LRTE==========PD

101 TATLYAMDYWGQGSLVTVSS 120

NEWM AGCIDV ===========

TM23 =============TS=====

HIL IL=AFSF======VL==== * HUVHL zawiera L AT nr 48

TM27L z leucyną w pozycji 48 ciężkiego łańcucha.

TM27I z izoleucyną w pozycji 48 ciężkiego łańcucha.

TM27.1 ze zmianami FS do VF (78-79).

TM27.2 ze zmianami VTML/T LSIS/N (67-70/73).

TM27.3 ze zmianami V do R (92).

Przykład 3. Analiza Scatcharda TM23

Doświadczenie	Kd	Receptory/komórkę
617:096	3,27e-8 M	3,04e5
617:115	2,30e-8 M	2,43e5
617:119	2,46e-8 M	2,46e5

Średnio

Kd = 2,52 (±0.67) e-8 M

Receptory/komórkę = 2.64e5

Analiza Scatcharda TM27

Doświadczenie	Kd	Receptory/komórkę
613:78	1.48e-8M	3.3 le4
613:82	1.14e-8M	2.47e4

Średnio

Kd= 1,31 (±0.24) e-8M

Receptory/komórkę = 2.89e4

Przykład 4. Podsumowanie pracy nad TM27I

TM27I (48) w COS/CHO:

* cDNA otrzymano z obszarów V szczepionych CDR w linii produkującej NS0, zamplifikowano metodą PCR, przeprowadzono sekwencjonowanie.

* Fragmenty DNA sklonowane do pTCSLNeo w konfiguracji cDNA.

* Plazmid współtransfekowano z pTCSLDHFRTM27ł do COS i CHO.

* Dodatnie wyniki testu ELISA ekspresji IgGi/ł z supematantu komórek COS wykazują że konstrukty plazmidowe były bardzo dobre.

* Transfektant komórek CHO wybrano, powiększono i sklonowano. Po klonowaniu komórki zamrożono w ciekłym azocie.

180 157

Przykład 5. Dane dotyczące sekwencji aminokwasów z ciężkiego łańcucha cDNA 16G8

Ciężki łańcuch

	10	20	30 *	40	50 ★
TTRAP	RSSHS VISTE	HRPLT MDSRL	NLVFL VLILK	GVQCD VQLVE	SGGGL
	60	70	80	90	100
	*	*	*	*
VQPGG	SRKLS CAASG	FTFSN FGMHW	VRQAP DKGLE	WVAYI SSGSS	TIYYA
	110	120	130	140	150
	*			+
DTLKG	RFTIS RDNPK	NTLFL QMTSL	RSEDT AMYYC	ARRGE GAMDY	WGQGT
	160	170
	*	*
SVTVS	SAKTT PPSVY	PLAPG

Lekki łańcuch

	10	20	30	40		50
				★		k
ISQGT	KFKYT MDFQV	QIFSF LLISI	SWMS RGENV	LTQSP	AIMSA	SLGEK
	60	70	80	90		100
	*	★	*			*
VTMSC	RASSS VNYIY	WYQQK SDASP	KLWIY YTSNL	APGVP	TRFSG	SGSGN

ciąg dalszy na str. 47

180 157 ciąg dalszy

110 120 130 140 150 * * * * *

SYSLT ISSME GEDAA TYYCQ QFTSS PFTFG SGTKL EIKRA DAAPT VSIFP

153 *

PSS

Dane dotyczące sekwencjowania białka H=DVQLVE?GGGLVQPG L=ENVLTQ

Przykład 6. Podsumowanie prac nad TM29 * Otrzymano hybrydomy w sposób zasadniczo taki sam jak w przykładzie 1 oraz wydzielono cDNA (pokazane w przykładzie 5).

* Wydzielone cDNA (H i k) (z hybrydomy 16G8) sklonowano do wektorów Ml3.

* Ludzki szkielet (VH_KOI/Vk_m) wprowadzono na drodze mutagenezy.

* Obszary V szczepione CDR sklonowano do szpiczakowych wektorów ekspresji.

* Humanizowane przeciwciała (po ~ 1 mg) oczyszczono z transfektantów do wykonania wstępnej oceny.

Wykonano 4 różne TM29:

TM29

TM29.1 ze zmianami SS na AA (23-24).

TM29.2 ze zmianą S na P (75).

TM29.3 ze zmianami GV/F na AM/Y (92-93/95).

Szczegóły doświadczeń - TM29 Wydzielanie ludzkiego stałego obszaru łańcucha k metodą PCR

Stosując niestrawiony plazmid pSV184AH-Neo/DNS-V_(tC_i. (pSVHuk), który zawiera ludzki stały obszar łańcucha k, przeprowadzono PCR z dwoma starterami (jednym do przodu i jednym odwrotnym) w celu wydzielenia stałego obszaru. Oligomery (startery) otrzymano z firmy Operon. Zastosowano odczynniki do reakcji PCR z zestawu odczynników do amplifikacji DNA GeneAmp DNA z AmpliTaą (Perkin-Elmer Cetus). Reakcje PCR prowadzono przy 3 różnych stężeniach Mg²⁺. Próbki produktów PCR analizowano na 1% żelu agarozowym. Wybrano produkt reakcji PCR z pierwszej próbki Mg²⁴· (stężenie 1,5 mM). Startery flankujące obszar C dobrano tak, aby zawierały miejsca dla enzymów restrykcyjnych, w celu przeprowadzenia klonowania. I tak zamplifikowany DNA strawiono EcoRI (na końcu 3'). Miejsca przy 5' (PvuII) nie trawiono. Strawiony fragment DNA wprowadzono na 1% żel agarozowy i wycięto pasmo 300 bp. DNA wyekstrahowano z żelu i małą próbkę zanalizowano na 1% żelu agarozowym w celu określenia jakości i oszacowania ilości. Okazało się, że pasmo 300 bp jest czyste, a całkowitą ilość DNA oszacowano na ~ 140 ng.

Fragment DNA stałego obszaru ludzkiego łańcucha k, strawiony EcoRI, wstawiono do wektora pBS KS⁺, który strawiono Smal i EcoRI, stosując ligazę T4 DNA. Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformowania kompetentnych komórek E. coli DH5a. Pojedyncze

180 157 kolonie zebrano i zastosowano do zaszczepienia 24 ciekłych hodowli. Z każdek z hodowli wypreparowano DNA. Każdą z próbek DNA strawiono PvuII (5' koniec CJ i EcoRI (3' koniec C J, a następnie zanalizowano na 2% żelu agarozowym. Z uwagi na trudność w oddzieleniu pasm o niskim zasięgu (300 bp), próbki DNA strawiono tylko PvuII. Po analizie na 2% żelu agarozowym stwierdzono, że 19 spośród 24 próbek zawiera prawidłowy insert C_k. Próbki nr 1-5 (spośród 19 właściwych próbek) wybrano do sekwencjonowania z zastosowaniem starterów T7 i T3 (sekwencja w insercie flankującym wektor). Inne odczynniki do sekwencjonowania pochodziły z zestawu Seąuenase Version 2.0 (USB). Potwierdzono, że próbka nr 5 zawierała prawidłową sekwencję dla stałego obszaru ludzkiego łańcucha k.

Stały obszar ludzkiego łańcucha k wydzielono z wektora pBS KS (próbka nr 5) stosując enzymy restrykcyjne PvuII i EcoRI. Jednakże z uwagi na wspomniany problem z rozdzielaniem pasm drugie trawienie przeprowadzono z konstruktem pBS/ludzki C_k. Drugie trawienie z EcoRI i Xbal (5' względem miejsca PvuII) dało fragment o ~ 300 bp. Fragment ten oczyszczono na żelu i strawiono PvuII w celu usunięcia niewielkiego pozostałego fragmentu wektora na końcu 5' C_k. Ten ostatni fragment oczyszczono na żelu, a następnie zanalizowano na 1 % żelu agarozowym w celu określenia jakości i ilości. Okazało się, że C_k DNA daje czyste pasmo przy około 280 bp, a jego ilość oszacowano na ~ 135 ng.

Z uwagi na obecność 3 miejsc EcoRI w wektorze ekspresji pTCSLDHFR* stwierdzono, że powiedzenie może zapewnić jedynie klonowanie w miejscu PvuII. W związku z tym, że C^DNA otrzymano przez trawienie PvuII - EcoRI, koniec EcoRI naprawiono (do uzyskania tępego końca) stosując fragment Klenowa. Naprawiony C^DNA z tępym końcem zligowano z wektorem pTCSLDHFR* strawionym PvuII i poddanym obróbce fosfatazą (zastosowano fosfatazę z jelita bydlęcego). Mieszaninę z ligowania zastosowano do transformowania kompetentnych komórek E. coli DH5a. Pojedyncze kolonie zebrano i zastosowano do zaszczepienia 24 ciekłych hodowli. Z każdej z hodowli wypreparowano DNA. Każdą z próbek DNA strawiono PvuII i Hindlll, a następnie zanalizowano na 1% żelu agarozowym. Stwierdzono, że spośród 24 próbek 5 zawiera insert C_k o prawidłowej orientacji. Próbkę nr 7 wybrano do dalszych badań.

Zastępowanie genu mutantowego DHFR* dzikim genem DHFR

W celu przeprowadzenia ekspresji wektora pTCSLC^DHFR* w komórkach CHO(dhfr) DUX Bil, gen DHFR* zastąpiono genem DHFR. DNA z próbki nr 7 pTCSLC^DHFR* oraz plazmid pSV2-DHFR (otrzymany od dr Paula Berga, Department of Biochemistry, Stanford University Medical School) strawiono enzymami restrykcyjnymi Hindlll i Bglll w celu wydzielenia odpowiednich fragmentów genu. W wyniku analizy stwierdzono, że dodatkowe miejsce Bglll w wektorze pTCSLC^DHFR* usunęło także część miejsca poły A, co mogłoby zakłócić działanie wektora. Z tego względu trawienie potworzono stosując Hindlll i BamHI. Część wektora (DHFR*) pTCSLC_A potraktowano fosfatazą. Następnie obydwa wydzielone fragmenty (PTCSLC* i DHFR) oczyszczono na żelu i zanalizowano na 1% żelu agarozowym w celu określenia jakości i oszacowania ilości. Okazało się, że obydwa pasma są czyste, a ponadto oszacowano, że ich stężenia są zbliżone, ~ 40-50 ng/ml. Gen DHFR zligowano z wektorem pTCSLC* stosując ligazę T4 DNA. Mieszaninę z ligowania zastosowano do transformowania kompetentnych komórek E. coli DH5a. Pojedyncze kolonie zebrano i zastosowano do zaszczepienia 24 ciekłych hodowli. Z każdej z hodowli wypreparowano DNA. DNA zanalizowano przez trawienie enzymami restrykcyjnymi Hindlll i BamHI. Spośród 24 hodowli 23 zawierało prawidłowe pasma świadczące o insercji genu DHFR do wektora PTCSLC^. Próbkę nr 22 wybrano do dalszych zastosowań.

180 157

Klonowanie obszaru V ciężkiego łańcucha ludzkiego k wydzielonego z PCR w wektorze CHO pTCSLQDHFR i pTCSLCgłNeoApa' cDNA obszaru V łańcucha k V dla 16G8 oczyszczono na żelu i strawiono odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Małą porcję próbki DNA zanalizowano na 1% żelu agarozowym w celu oszacowania ilości i potwierdzenia jakości. Dodatkowe pasmo (zanieczyszczenia) zaobserwowano przy ~ 800 bp, oceniając jego stężenie na 1,25 ng/ml. Obszar V zligowano z wektorem PTCSLC^DHFR, który strawiono enzymami restrykcyjnymi Xhoł i PvuII oraz poddano obróbce fosfatazą. Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformowania kompetentnych komórek E. coli DH5a. Wydajność transformowanych kolonii była bardzo niska. Pojedyncze kolonie wybrano i zastosowano do zaszczepiania 12 ciekłych hodowli. Z każdej wypreparowano DNA, strawiono Xhol i PvuII i zanalizowano na 1% żelu agarozowym. Uzyskano 4 dodatnie próbki, nr 1, nr 4, nr 7 i nr 10. Każdą z dodatnich próbek poddano sekwencjonowaniu. Obszar V wydzielonego γ TM29 z PCR sklonowano do wektora COH pTCSLCgNeoApa’.

Sekwencjonowanie dwuniciowe ludzkiego obszaru V łańcucha k próbki 16G8 (nr 1, nr 4, nr 7 i nr 10) poddano sekwencjonowaniu w obydwu niciach. Nić odwrotną sekwencjonowano w całości poprzez miejsca enzymów restrykcyjnych (3'-5'; PuvII - Xhol) stosując starter HUCK5PR. Okazało się, że próbki nr 1 i 4 zawierają prawidłową sekwencję, próbka nr 7 nie uległa sekwencjonowaniu, a próbka nr 10 zawierała złą sekwencję. Dla próbek nr 1 i 4 sekwencję nici postępowej określono stosując dwa różne startety, PTCSFOR i PTCSFWD. Sekwencję o pełnej długości otrzymano poprzez miejsca enzymów restrykcyjnych (5' - 3'; Xhol - PvuII) przez połączenie sekwencji otrzymanych z każdego ze starterów. Stwierdzono obecność niewielkiego obszaru kompresji w niciach postępowych, którego nie można rozwikłać żadnym ze starterów lub poprzez zastosowanie sposobu sekwencjonowania, który łagodzi takie kompresje. Jednakże potwierdzona została prawidłowa sekwencja nici odwrotnej w tym obszarze. Okazało się, że obydwie próbki, nr 1 i 4, zawierają prawidłową sekwencję. Próbkę 4 wybrano do zastosowania w transfekcji komórek ssaków.

Kotransfekcja plazmidów lekkich i ciężkich łańcuchów TM29 w komórkach COS i CHO

We współtransfekcji lekkich i ciężkich łańcuchów TM29 zastosowano zarówno komórki Cos-1 jak i CHO(dhfr’)DUX Bil. Linię komórek CHO DUX Bil otrzymano z Biogen, Inc., z tym że otrzymana ona była po raz pierwszy przez dr Lawrence’a Chaisina (Columbia University).

Do transfekcji komórek Cos-1 po 5 mg każdego z niestrawionych plazmidów TM29 (pTCSLHuV*16GąDHFR i _PTCSLHuV_H16GC_AlNeoApa-; odpowiednio TM29-4 i TM29-26) strącono etanolem i ponownie zawieszono w wodzie w stężeniu 1 mg/ml. Następnie przeprowadzono współtransfekcję plazmidów w 3,8 χ 10⁶ komórek metodą elektroporacji, stosując BioRad Gene Pulser przy 250 V, 960 mF. Transfekowane komórki zawieszono w ośrodku Dulbec-cols Modified Eagle’s medium (DMEM) i umieszczono w hodowli na 3 dni. Otrzymano kontrolne wektory plazmidowe (pTCSLDHFRApa’ i pTCSLNeoApa’) i przeprowadzono ich współtransfekcję w podobny sposób jak dla plazmidów TM29. Transfekowane komórki zawieszono i hodowano w podobny sposób jak komórki Cos transfekowane TM29.

W przypadku transfekcji komórek CHO DUX Bil po 5 mg każdego z plazmidów TM29 (patrz wyżej) strawiono enzymem restrykcyjnym Aatll uzyskując liniowy fragment DNA, strącono etanolem i ponownie zawieszono w wodzie w stężeniu 1 mg/ml. Następnie przeprowadzono współtransfekcję plazmidów w 5 χ 10⁶ komórek metodą elektroporacji, jak wyżej. Transfekowane komórki zawieszono w ośrodku Minimal Essential (ocMEM) uzupełnionym o tymidynę, adenozynę i dezoksyadenozynę (ośrodki nieselektywne) i prowadzono hodowlę przez 3 dni. Plazmidy kontrolne (jak powyżej) otrzymano i współtransfekowano podobnie jak plazmidy TM29. Transfekowane komórki zawieszono i hodowano w podobny sposób jak komórki Cos transfekowane TM29.

180 157

Analiza supematantu komórek Cos transfekowanych TM29 metodą ELISA z ludzkim IgGu

Po 3 dniach w hodowli okazało się, że nastąpiło zlanie komórek Cos transfekowanych TM29. W związku z tym supematant zebrano, a komórki odrzucono. Produkcję ludzkiego IgG przez komórki określono z supematantu hodowli metodą ELISA z ludzkiego IgG_u. IgG w supernatancie wychwycono przez mysie, przeciwludzkie przeciwciało Fc IgC,, którym powleczono płytkę o 96 studzienkach, po czym wykrywano przeciwludzkim przeciwciałem Ig_tskoniugowanym z peroksydazą chrzanową wywoływano barwne OPD (o-fenylenodiaminą). Stężenia IgG w supernatancie wyznaczono porównując zmierzone gęstości optyczne z krzywą wyznaczoną dla oczyszczonego ludzkiego przeciwciała IgG_u o znanym stężeniu. W supernatancie z komórek Cos transfekowanym TM29 stężenie ludzkiego IgG wynosiło 201,3 ng/ml. W kontrolnym supernatancie komórek Cos transfekowanych DNA stężenie ludzkiego IgG wynosiło 0 ng/ml.

Selekcja komórek CHO transfekowanych TM29

Po 3 dniach w hodowli okazało się, że nastąpiło zlanie komórek CHO transfekowanych TM29. W związku z tym do komórek dodano 0,25% tiypsynę (w roztworze Hank’s Balanced Salt) w celu oddzielenia ich od kolb reakcyjnych. Komórki zebrano, odwirowano i supematant usunięto. Pozostałość komórkową zawieszono w ośrodku selekcji MEM w stężeniu 2 χ 10⁶ komórek/ml i naniesiono w ilości 1 ml/studzienkę na płytki z 24 studzienkami. Ośrodek selekcji aMEM wykazuje podwójną zdolność selekcji, gdyż nie zawiera uzupełnień nukleotydowych i zastępuje FBS dializowanym FBS stanowiąc selekcję względem DHFR⁺na pTCSLHuY^lóGC^DHFR i wprowadzając gentamycynę (G-418) selekcjonującą względem neo’ na pTCSLHuV_H16C_glNeoApa'.

Analiza supematantu komórek CHO transfekowanych TM29 metodą ELISA z ludzkimi IgGu i cytometrii przepływowej

Po 14 dniach w ośrodku selekcji supematanty komórek CHO transfekowanych TM29 zebrano z każdej studzienki i oznaczono metodą ELISA z ludzkimi IgG_ljt. Stężenie ludzkiego IgG w supernatantach komórek CHO transfekowanych TM29 wynosiło 144,6-291,9 ng/ml, średnio 240,5 ng/ml. W kontrolnych supernatantach komórek CHO transfekowanych DNA stężęnie ludzkiego IgG wynosiło 0 ng/ml.

Supematanty z 3 najsilniej produkujących studzienek z komórek CHO transfekowanych TM29 (2C3, 2C4 i 2B6) oraz z jednej studzienki komórek CHO transfekowanych kontrolnym DNA (3D4) zebrano także metodą cytometrii przepływowej. 3 próbki TM29, 2C3, 2C4 i 2B6 barwią dodatnio komórki Jurkata (średnia fluorescencja kanałów w zakresie 186,61-290,01) i nie barwią dodatnio komórek HBP (średnia fluorescencja kanałów w zakresie 11,77-13,82). Próbka kontrolna 3D4 nie barwi dodatnio komórki Jurkata (średnia fluorescencja kanałów 11,96).

Klonowanie komórek CHO transfekowanych TM29 metodą ograniczonego rozcieńczenia najsilniej produkujące studzienki dla komórek CHO transfekowanych TM29 (2C3, 291,9 ng/ml; 2C4, 289,7 ng/ml; 2B6, 298,5 ng/ml) wybrano do klonowania metodą ograniczonego rozcieńczenia. Dla każdej ze studzienek komórki rozcieńczono ośrodkiem selekcji oMEM i naniesiono na płytkę z 96 studzienkami w ilości 2 komórki/płytkę, 1 komórka/płytkę i 0,5 komórki/płytkę. W 10 dni po klonowaniu zaobserwowano wzrost kolonii w licznych studzienkach na każdej z płytek z 0,5 komórki/płytkę dla 2C3, 2C4 i 2B6. W związku z tym supematanty ze wszystkich studzienek na każdej z płytek z 0,5 komórki/płytkę zebrano i oznaczono metodą ELISA z ludzkimi IgG_u. Wszystkie studzienki wykazywały w teście ELISA

180 157 dodatni wzrost komórek. Łącznie wybrano 24 najsilniej produkujące studzienki (10 z 2C3 i 14 z 2B6), przeniesiono na płytki z 24 studzienkami i prowadzono hodowlę do zlania. Z każdej studzienki zebrano supematant i oznaczono metodą ELISA z ludzkimi IgG_u. Stężenie ludzkiego IgG wynosiło od 0,7 do 4,8 mg/ml, średnio 2,9 mg/ml. Supematanty z 6 najsilniej produkujących studzienek z klonami CHO transfekowanymi TM29 (1C7, 1D9, 1G2, 2G1, 2G10, 2H2a) zbadano metodącytometrii przepływowej. Wszystkie 6 próbek dodatnio barwiło komórki Jurkata (średnia fluorescencja kanałów w zakresie 313,68-356,87) oraz nie barwiło dodatnio komórek HPB (średnia fluorescencja kanałów w zakresie 7,59-8,16). Każdą z 6 próbek przeniesiono do kolby 25 ml, zamrożono i przechowywano w ciekłym azocie. Do subklonowania wybrano 3 najsilniej produkujące studzienki (2C3-1G2, 2C3-2G10, 2C3-2H2a).

Jedną ze studzienek z komórkami CHO transfekowanymi kontrolnym DNA (3D4) sklonowane metodą ograniczonego rozcieńczenia, podobnie jak studzienki z TM29. Rozcieńczając komórki 10-krotnie bardziej niż potrzeba w 10 dni po klonowaniu nie zaobserwowano wzrostu kolonii. W związku z tym rozpoczęto świeżą hodowlę z zamrożonej fiolki (3D4). Dla tej nowej hodowli powtórzono klonowanie metodą ograniczonego rozcieńczania. W 16 dni po klonowaniu 6 najsilniej zlanych studzienek z płytek z 0,5 komórki/studzienkę (1B5, 1C11, 1D6, 2E7, 2F3, 2F9) wybrano do powiększenia skali na płytkach z 24 studzienkami. Każdą studzienkę przeniesiono do 25 ml kolby, a następnie do 75 ml kolby i prowadzono hodowlę do zlania. Supematanty z każdek kolby zebrano i oznaczono metodą ELISA z ludzkimi IgGj_k. Stężenie ludzkiego IgG wynosiło 0 ng/ml. Każdą kolbę zamrożono i przechowywano w ciekłym azocie.

Rozszerzenie skali hodowli nieklonowanych komórek CHO transfekowanych TM29 do butelek do toczenia najsilniej produkujące studzienki dla komórek CHO transfekowanych TM29 (2C3, 291,9 ng/ml; 2C4, 289,7 ng/ml; 2B6, 289,5 ng/ml) wybrano do rozszerzenia skali w 25 ml kolbach jako nieklonowane hodowle. Na tym etapie po jednej fiolce z każdą z hodowli TM29 (oraz jedną fiolkę z hodowli komórek CHO transfekowanych kontrolnym DNA zamrożono i przechowywano w ciekłym azocie. Każdą z nieklonowanych hodowli przeniesiono następnie do 75 ml kolby. Z jednej 75 ml kolby każdą hodowlę przeniesiono do 3 kolb 75 ml zmniejszając równocześnie stężenie surowicy w ośrodku MEM z 10 do 5%. Hodowlę z każdej z kolb 75 ml dla 2C3 i 2B6 przeniesiono do 2 litrowych butelek do toczenia. Wszystkie 375 ml kolby z 2C4 zamrożono i przechowywano w ciekłym azocie. Po przeniesieniu hodowli do butelek do toczenia stężenie w ośrodku otMEM ponownie zmniejszono, z 5 do 1%. Po 9 dniach hodowle w butelkach 2B6 doszły do stanu zlania, a w butelkach 2C3 osiągnęły -25% zlania. Supematanty ze wszystkich butelek 2B6 i 2C3 zebrano w dniu 9, dniu 14 i dniu' 16, po czym komórki odrzucono. Zebrane supematanty odwirowano i przechowywano w -20°C. Próbkę każdego z 3 zebranych supematantów z 2B6 i 2C3 zanalizowano metodą ELISA z ludzkimi IgG_u. Całkowita ilość IgG w 2B6 wynosiła 820 mg, a w 2C3 1923 mg.

Subklonowanie klonów komórek CHO transfekowanych TM29 metodą ograniczonego rozcieńczenia

Trzy najsilniej produkujące komórki dla klonów komórek CHO transfekowanych TM29 (2C3-1G2, 4,8 mg/ml; 2C3-2H2a, 4,1 mg/ml; 2C3-2G10, 4,0 mg/ml) wybrano do subklonowania metodą ograniczonego rozcieńczenia. 14 dni po subklonowaniu zaobserwowano wzrost kolonii w licznych studzienkach na każdej z płytek z 0,5 komórki/studzienkę dla 1G2, 2G10 i 2H2a. W związku z tym supematanty z tych studzienek o silnym wzroście kolonii zebrano i poddano analizie metodą ELISA z ludzkimi IgG_ljt. Wszystkie studzienki wykazywały dodatni wzrost komórek w teście ELISA, tak że uzyskano wydajność klonowania 100%. Łącznie wybrano 24 najsilniej produkujące studzienki (2 z 2H2a, 5 z 2G10, 17 z 1G2), przeniesiono na płytki z 24 studzienkami i hodowano do zlania. Z każdej studzienki zebrano supematant i oceniono metodą ELISA z ludzkimi IgG_1)t. Stężenie ludzkiego IgG wynosiło 1,2-9,2 mg/ml, śred

180 157 nio 4,2 mg/ml. Supematanty z 4 najsilniej produkujących studzienek dla subklonów CHO transfekowanych TM29 (2G5, 2H12, 1H6 i 2E9) zbadano metodą cytometrii przepływowej. Wszystkie 4 próbki dodatnio barwiły komórki Jurkata (średnia fluorescencja kanałowa 211,51-292,45) oraz nie barwiły dodatnio komórek HPB (średnia fluorescencja kanałowa 8,36-8,80). Każdą z 4 próbek przeniesiono do 25 ml kolby.

Drugie subklonowanie klonów komórek CHO transfekowanych TM29 metodą ograniczonego rozcieńczenia

Dwa najlepsze klony komórek CHO transfekowanych TM29 (2C3-1G2-2G5 i 2C3-1G2-1H6), na podstawie kombinowanych wyników z testu ELISA i danych z cytometrii przepływowej, wybrano do drugiego subklonowania metodą ograniczonego rozcieńczenia. W tym czasie po jednej fiolce z każdym klonem (a także po jednej fiolce z 2C3-1G2-2H12 i 2C3-1G2-2E9) zamrożono i przechowywano w ciekłym azocie. 12 dni po subklonowaniu zaobserwowano wzrost kolonii w szeregu studzienkach na każdej z płytek z 0,5 komórki/studzienkę, dla 2G5 i 1H6. Z tego względu supematanty z tych studzienek wykazujące wzrost kolonii zebrano i poddano analizie metodą ELISA z ludzkimi IgG_1A. Wszystkie studzienki wykazywały dodatni wzrost komórek w teście ELISA, tak że uzyskano wydajność klonowania 100%. Łącznie wybrano 24 najsilniej produkujące studzienki (20 z 2G5, 4 z 1H6) do hodowli na płytkach z 24 studzienkami (nr 646-101) hodowano do zlania. Supematanty zebrano z każdej studzienki i poddano analizie metodą ELISA z ludzkimi IgG_u. Z uwagi na spadek aktywności wzorca ludzkiego IgG_u stosowanego w teście nie można było oznaczyć stężeń dla nieznanych próbek. Z tego względu najsilniej produkujące studzienki oznaczono na podstawie gęstości optycznej. 6 najsilniej produkujących studzienek (5 z 2G5 i 1 z 1H6) wybrano i przeniesiono do kolb 25 ml, a następnie do 75 ml i hodowano do zlania. Supematanty zebrano z każdej studzienki i poddano analizie metodąELISA z ludzkimi IgG_u. Stężenie ludzkiego IgG wynosiło 14,6-21,2 mg/ml, średnio 18,6 mg/ml. Supematanty z 6 kolb z subklonami CHO transfekowanymi TM29 (1B5, 1D1, 1F11, 2B10, 2F5, 2F9) oceniono metodą cytometrii przepływowej (nr 646-122). Wszystkie 6 próbek dodatnio barwiły komórki Jurkata (średnia fluorescencja kanałowa 304,51-383,00) oraz nie barwiło dodatnio komórek HPB (średnia fluorescencja kanałowa 8,67-10,25).

Wytwarzanie bazy zamrożonych komórek klonu komórek CHO transfekowanego TM29

Jako klon komórek CHO transfekowanego TM29 do przygotowania bazy zamrożonych komórek wybrano 2C3-1G2-1H6-2F5. Klon ten przeniesiono z jednej kolby 25 ml do 5 kolb 225 ml, aby uzyskać niezbędną liczbę komórek do założenia banku komórek w celach badawczych. Bank zamrożonych komórek przygotowano zgodnie z SOP TMB1-001.00. Komórki zadano with* trypsyną zebrano z każdej kolby i uśredniono. Stwierdzono, że uśredniona zawiesina zawiera 3,2 χ 10⁸ komórek o żywotności 99%. Przygotowano 72 fiolki, z których każda zawierała 2 χ 10⁶ komórek w 1 ml. Wszystkie fiolki z klonem oznaczono jako TM29-646-132.

Przykład 7. Porównanie sekwencji przeciwciał TM29 szczepionych CDR z innymi obszarami szkieletu

TM29 Vk

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVNYIYWYQQTPGKAPKLLIYYT 50

REI ======================Q==QDIIK=LN================EA

16G8 ENVL====AIM===L=EK==MS====== ========KSDAS===W====

HIC E=VL====GT==L=P=EPA=LS====Q==SSSYLA====K==Q==R====GA

SNLAPGVPSRPSCSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQGT 101 ciąg dalszy na str. 53

180 157 ciąg dalszy

REI ===QA=================================YQ=L=Y=======

16G8 =======T========NS=SL====MEG==A=================S==

HIC =SR=T=I=D========DF=L===RLE=X=F=V=====YG===W=======

102 KLQIT 106

REI =====

16G8 ==E=K

HIC =VE=K

TM29 VH

EVQLVE S GGGWQ PGRS LRLS CS S S GFT FSNFGMHWVRQAPGKGLE WVAY

KOL Q===========================if=S YA=Y==============I 16G8 D=========L====G=RK===AA===== ============0======== WEA Q====D====L=E==G=======A===== =AND=N============LSF

ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG

KOL =WDDG=DQH===SV==================================D=

16G8 ========================P=::==:=====T===S===AM=Y=====

WEA =GGSG=======SV========NB===S=Y===S===A===A=YY== ==

101 EGAM DYWGQGTPVTVSS

KOL GHGFCSSASCIFGP=============

16G8 ===== =======S=====

WEA WLL

N =====L=====

TM29 z sekwencjami z 1 wersji

TM29.1 ze zmianami SS na AA (23-24)

TM29.2 ze zmianą S na P (75)

TM29.3 ze zmianami GV/F na AM/Y (92-93/95)

180 157

Przykład 8. Analiza Scatcharda TM29 mAb

Analizę przeciwciał TM29 i 16G8 wykonano w 3 niezależnych doświadczeniach. W poniższej tabeli podano wielkości Kd oznaczone w każdym z doświadczeń.

Doświadczenie	TM29 Kd (M)	16G8 Kd (M)
1	1,45 χ 10’⁹	2,86 x W⁹
2	1,65 χ 10'⁹	2,65 χ 10'⁹
3	1,15 χ 10'⁹	2,44 χ 10'⁹
Średnio	1,42 χ 10‘⁹	2,65 χ 10’⁹

Przykład 9. Zestawienie prac nad chimerycznym TM29

Chimery ki w COS i CHO:

* Obszar V(D)J cDNA sklonowane w wektorach ekspresji komórek CHO, pTCSLNeo (H) i pTCSLDHFR (k) w konfiguracji cDNA * Plazmidy ekspresji współtransfekowano w COS i CHO * Stężenie Ab w supematancie z komórek COS ~ 35 ng/ml * Transfektanty komórek CHO zanalizowano (metodami FACS i ELISA), raz sklonowane i zamplifikowano z ΜΤΧ (20 nM, 100 nM i 500 nM) * Stężenie przeciwciał z nieamplifikowanych klonów wynosi ~ 3 pg/ml; barwią one dodatnio komórki Jurkata. Nieamplifikowane klony zamrożono w ciekłym azocie.

Przykład 10. Ekspresja chimerycznego 16G8 w komórkach COS i CHO

16G8 Chimery ki

Konstrukty lekkiego łańcucha i ciężkiego łańcucha, zawierające kompletny mysi obszar V ze stałym ludzkim obszarem w tych samych wektorach ekspresji zastosowano do szczepienia konstruktów CDR: PTCSDHFR połączenie pTCSNeo połączenie - konstrukty wykazują podwójną zdolność selekcji

Transfektanty komórek COS - ~ 35 ng/ml

Transfektanty komórek CHO - 16 dodatnich studzienek/54 studzienki

	ng/ml		Skorygowany względem objętości
1	2	3	4
1A1	151,6
1A6	166,6
1B3	107,2
1B6	179,6
1D2	101,0
1D5	215,1	*	2,2 μg/ml
2A4	199,8
2B1	184,5
2B2	213,8	*	2,1 gg/ml
2B4	130,6
2C2	119,6
2C6	214,4	*	2,1 gg/ml

180 157 ciąg dalszy tabeli

1	2	3	4
2D3	216,6	*	2,2 μg/ml
2D6	139,7
3A1	198,7
3A2	172,2

Wszystkie przeniesiono do 25 ml kolb * Wykonano cytometrię przepływową

Przykład 11. Podsumowanie prac nad TM29

TM29

TM29 w COS/CHO:

* cDNA wytworzono z obszarów V szczepionych CDR w linii wytwarzającej NSO, zamplifikowano metodą PCR i przeprowadzono sekwencjonowanie * Fragmenty cDNA sklonowano w pTCSLNeo (H) i pTCSLDHFR (k) w konfiguracji cDNA * Plazmid współtransfekowano w COS i CHO * Supernatant z komórek COS zawiera ~ 2 pg/ml Ab * Transfektanty komórek CHO wydzielają - 3 pg/ml Ab przed klonowaniem i amplifikacją, supernatant barwi dodatnio komórki Jurkata. Przygotowano bank z najlepszych nieamplifikowanych producentów Ab po trzykrotnym klonowaniu * Linie komórek CHO zamplifikowano przy różnych stężeniach ΜΤΧ.

Przykład 12. Porównanie TM27L, TM27I i TM23 w 4H11-FITC

Test konkurencji

Przykład 1:

nachylenie TM23 _ nachylenie TM27L ’ nachylenie TM23 _ 2 44 nachylenie TM27I ’

Przykład 2:

W porównaniu z TM23 wielkości dla TM27L i TM27I są<3 razy większe.

180 157

Przykład 13. Amplifikacja TM27 metokreksanu

Produktywność (pg/10⁶ komórek/dzień) Poziom metokreksanu (nM)

	0	20	100	20-100	20-200
C7	*7/30	27	nd	nd	nd	9.8
* 7/22	3,5	nd	19,2	14,7	34.2
7/6	2,6	nd	nd	9,1	nd
6/25	2	4,8	4,5	nd	nd
6/18	3	8,9	nd	nd	nd
H9	* 7/30	22,7	nd	nd	nd	181,9
& 7/22	3,9	nd	9,4	11,6	34,4
6/25	1,5	1,8	4,7	3.6	nd
6/18	1,8	1,5	nd	nd	nd

* Brak porównania między testami

Względne porównanie między testami

	0	20	100	20-100	20-200
C7	*7/30	1	nd	nd	nd	9,8
*7/22	1	nd	5,5	4,2	9,8
7/6	1	nd	nd	3,5	nd
6/25	1	2,4	2,3	nd	nd
6/18	1	3,0	nd	nd	nd
H9	*7/30	1	nd	nd	nd	8,0
& 7/22	1	nd	2,4	3,0	8,8
6/25	1	1,2	3,1	2,4	nd
6/18	1	0,8	nd	nd	nd

Status

0	20	100	20-100	20-200
C7 8/11	fm	fm, s, sf4	fm	fin	fin, s*
H9 8/11	fm	odrzucono	fin, s, f2	fin	fin, s *

Klucz:

fm = zamrożono 1 probówkę mieszanej hodowli s = podhodowla z 1 ograniczonym rozcieńczaniem s * = pierwsze ograniczone rozcieńczanie w trakcie f # = zamrożono po 1 fiolce dla każdej z # studzienek.

180 157

ΤΜ2 3 V_L DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYY TM27 V_L DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQTPGKAPKLLIYY

Lu EH Λ CU o u Cu EH Cd Pj ci a

3: ω

Βω o id o o a: o to w

X	X	CU	CU
0*0	O	O CU	CU
ΟΛ Ql	Ot	x Ci	Ct
U	U	cd	cd
X	X	>	>
X	X
H	E-¹

Q	Cl	X	X
μ ω	ω	<	<
Cd O ♦ CU	Cu	o * H	H
Q co CJ	a	n >j	J
U J	Cl	to	co
Z	co	Lu	Lu
CO	to	0	0
	X	CO	to
H	H	>	>
	tu	H	H
tO	Η	O	U
—. X	X	E-<	H
S Q	Q		O
H	H	™ en	co
0	0		J
CO	to	co	Ei
0	0	o	Ot
co	to	to	to
0.	0	CU	CU
co	to	<	Cd
ω	ω	>	>
cd	Λ
Oj, CO	to	O . 0	0
co * Cu	i?	X * CU	CU
>	ρ-	r-~ O	0
0	ω	£ * E-h to	co
ω	W	5 χ χ ω	ω
•ν*	n:	cm χ ω o sc	Ot
3	►4	S + +>	►J
co	w	o U ii o	ot
w	to	U Η H >	>
E-<	Η	0 0 O	Ot

Π g II

<1 u II

180 157

100

IWGDGNTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARDRV IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV rWGDGNTDYNSALK============»~================DRV IWGDGNTDYNSALK===~======VF================DRV IWGDGNTDYNSALK==LSIS==N===“====“==============DRV THGDGNTDYNSĄLK===========»=======»=-==============R=======DRV CDR2

110 120

TATLYAMDYWGQGTSVTVSS TATLYAMDYWGQGSLVTVSS TATLYAMDY°=—===== TATLYAMDY====—===== TATLYAMDY========= TATŁYAMDY==========

CDR3

FIG.1 (c.d.)

180 157

16G8 V_L

TM29 V_L

FIG.2

16G8 ν_ΗTM29 V_HTM29.1V_hTM29.2V_hTM29.3V_h

20 30 40 50 *****

ENVLTQSPAIMSASLGEKVTMSCRASSSVNYIYWYQQKSDASPKLWIYYT DIQMTQS PS SLSASVGDRVTITCRASSSVNYIYWYQQT PGKAPKLLIYYT

CDRI

70 80 90 100 *****

SNLAPGVPTRFSGSGSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQQFTSSPFTFGSG SNIAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQG

CDR2 CDR3

106 ★

TKLEIK

TKLQIT

20 30 40 50 *****

DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSNFGMHWVRQAPDKGLEWVAY EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCSSSGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY ======================AA======NFGMH==============Y ==============================nfgmh==============y ==============================nfgmh==============y

CDRI

180 157

80 90

100 *

ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARRG ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG

ISSGSSTIYYADTLKG=====’===-~“=-===-=*=“==-==-======-=RG

ISSGSSTIYYADTLKG=======P=====»=—»»«===»==«==“===RG

ISSGSSHY3fADTIiK(3^a*^aBi’^:s=s;isi:*^Bał“^5Bis’^tecBe’^{=fflxin:::sBe}*^B,:Bssse’^:ea===mAM^s=Y“^s=“RG

CDR2

110 £

117

EGAMDYWGQGTSVTVSS EGAMDYWGQGTPVTVSS EQAMDY^{==s====a=a3e3c=}“^=,eEGAMDY========== EGAMDY°~»-====-===

CDR3

FIG.2 (c.d.)

180 157

FIGJ

ŚREDNIA FLUORESCENCJA KANAŁU

PORÓWNANIE TM27L/NSO I TM27UCHO W TEŚCIE RYWALIZACJI Z 4H11

100 —MYSI 4H11 —>— TM27UNS0 —TM27L7CHO

-T— t· -i -Ί i r —-r i ι i T” i

10 20 30 40 50 60 % NIEZNACZONY

MYSI 4H11 TM27L/NS0 TM27L/CHO y = 393.85 - 5.0535x R^A2 = 0.985 y = 415.77-2.3218Χ R^A2 = 0.939 y = 415.64 - 2.1880x R^A2 = 0.987

UG/ML	% NIEZNACZONY ^4H11	TM27L/NS0	TM27L/CHO
5.000	50.000 149.687	303.633	299.073
3.750	42.900 181.330	296.867	328.207
2.500	33.300 219.803	349.850	342.667
1.875	27.300 251.783	367.640	358.120
1.250	20.000 288.993	360.657	374.003
0.938	15.800 308.113	380.870	378.773
0.625	11.100 333.177	388.950	395.623
0.312	5.900 349.383	405.483	401.297
0.156	3.030 380.860	400.113	402.853
0.000	0.000 417.797	417.797	417.792

180 157

ANALIZA SCATCHARDA TM27 - KOMORKI HPB

Kd (nM)

TM27CH0 12.3 φ TM27 NSO 8.2

4H11 4.5

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące, posiadające sekwencję aminokwasów obejmującą całość lub część CDR pochodzących zasadniczo od monoklonalnego przeciwciała wykazującego specyficzność względem wybranej subpopulacji komórek T ekspresjonujących region zmienny νβ5.2 lub νβ5.3 łańcucha beta receptora antygenowego komórek T, w połączeniu z wybranymi resztami zmiennego szkieletu również pochodzącymi od tego monoklonalnego przeciwciała, przy czym to humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zdolne jest do wiązania się z wybranymi subpopulacjami komórek T z powinowactwem wiązania co najmniej porównywalnym z powinowactwem wykazywanym przez to monoklonalne przeciwciało i korzystnie redukuje liczbę komórek T w subpopulacji reagującej z tym humanizowanym przeciwciałem lub jego białkiem wiążącym, przy czym takie humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zawiera sekwencję aminokwasową TM27Vł:

1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQTPGKAPKLLIYY 50 51 TSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPRTFGQ 100 101 GTKLQIT 107, i zawiera ponadto sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z: sekwencji amino kwasowej TM27 VH:

1 QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVROPPGRGLEWLGM 50 51 IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNQKSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV 100 101 TATLYAMDYWGQGSLVTVSS 120, sekwencji TM27 VH, w której resztę aminokwasową 48 zastąpiono izoleucyną (I), sekwencji TM27 VH, w której reszty aminokwasowe 78 i 79 są waliną (V) i fenyloalaniną (F), sekwencji TM27 VH, w której reszty aminokwasowe 67 do 70 posiadające sekwencję VTML zostały zastąpione LSIS, odpowiednio, a resztą aminokwasową 73 jest asparagina (N), oraz sekwencji TM27 VH, w której resztą aminokwasową 92 jest arginina (R).
2. Humanizowane przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowi izotyp IgG2a.
3. Humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące posiadające sekwencję aminokwasów obejmującą całość lub część CDR pochodzących zasadniczo od monoklonalnego przeciwciała wykazującego specyficzność względem wybranej subpopulacji komórek T ekspresjonujących region zmienny Υβ8.1 łańcucha beta receptora antygenowego komórek T, w połączeniu z wybranymi resztami zmiennego szkieletu również pochodzącymi od tego monoklonalnego przeciwciała, przy czym to humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zdolne jest do wiązania się z wybranymi subpopulacjami komórek T z powinowactwem wiązania co najmniej porównywalnym z powinowactwem wykazywanym przez to monoklonalne przeciwciało i korzystnie redukuje liczbę komórek T w subpopulacji reagującej z tym humanizowanym przeciwciałem lub jego białkiem wiążącym, przy czym takie humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zawiera sekwencję aminokwasową TM29Vk:

1 DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVNYIYWYQQTPGKAPKLLIYYT 50 51 SNLAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQG 100 101 TKLQIT 106,

180 157 i zawiera ponadto sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z: sekwencji aminokwasowej TM29 VH:

1 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY

51 ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG

101 EGAMDYWGQGTPVTVSS 117, sekwencji TM29 VH, w której obydwie reszty aminokwasowe 23 i 24 zostały zastąpione resztami alaniny (A), sekwencji TM29 VH, w której reszta aminokwasowa 75 została zastąpiona proliną (P), oraz sekwencji TM29 VH, w której reszty aminokwasowe 92 i 93 zostały zastąpione alaniną (A) i metioniną (M), odpowiednio, a resztą aminokwasową 73 jest asparagina (N), a reszta aminokwasowa 95 została zastąpiona tyrozyną (Y).
4. Humanizowane przeciwciało według zastrz. 3, znamienne tym, że stanowi izotyp IgG2a.
5. Sposób wytwarzania humanizowanego przeciwciała lub jego białka wiążącego zawierającego co najmniej jeden CDR, pochodzący zasadniczo z mysiego monoklonalnego przeciwciała anty-Vp5.2/Vp5.3 o specyficzności względem wybranej subpopulacji komórek T, przy czym humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące posiada sekwencję aminokwasową TM27 Vł:

1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQTPGKAPKLLIYY 50 51 TSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPRTFGQ 100

101 GTKLQIT 107, i zawiera ponadto sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji aminokwasowej TM27 VH:

1 QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVROPPGRGLEWLGM 50 51 IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNQKSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV100 101 TATLYAMDYWGQGSLVTVSS 120, przy czym wspomniany CDR jest kodowany przez pierwszą sekwencję DNA, znamienny tym, że w trakcie tego sposobu:

a) klonuje się wspomnianą pierwszą sekwencję DNA w odpowiednim wektorze;

b) wprowadza się na drodze mutagenezy wybrany ludzki szkielet aminokwasów tworząc konstrukt kodujący szczepiony CDR zawierający sekwencję wybraną z grupy składającej się z:

sekwencji TM27 VH, w której resztę aminokwasową 48 zastąpiono izoleucyną (I), sekwencji TM27 VH, w której reszty aminokwasowe 78 i 79 są waliną(V) i fenyloalaniną (F), sekwencji TM27 VH, w której reszty aminokwasowe 67 do 70 posiadające sekwencję VTML zostały zastąpione LSIS, odpowiednio, a resztą aminokwasową 73 jest asparagina (N), oraz sekwencji TM27 VH, w której resztą aminokwasową 92 jest arginina (R);

c) transformuje się komórkę gospodarza konstruktem z etapu b); oraz

d) hoduje się tak transformowaną komórkę gospodarza w celu wytworzenia humanizowanego przeciwciała lub jego białka wiążącego.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że komórkę gospodarza stanowi komórka CHO.
7. Sposób wytwarzania humanizowanego przeciwciała lub jego białka wiążącego zawierającego co najmniej jeden CDR, pochodzący zasadniczo z mysiego monoklonalnego przeciwciała zawierającego co najmniej jeden CDR pochodzący zasadniczo z mysiego monoklonalnego przeciwciała anty-Vp8.1 o specyficzności względem wybranej subpopulacji komórek T, przy czym humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące posiada sekwencję aminokwasową TM29 Vic

1 DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVNYIYWYQQTPGKAPKLLIYYT 50

51 SNLAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQG 100 101 TKLQIT 106,

180 157 i zawiera ponadto sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z: sekwencji aminokwasowej TM29 VH:

1 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY

51 ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG 101 EGAMDYWGQGTPVTVSS 117, przy czym wspomniany CDR jest kodowany przez pierwszą sekwencję DNA, znamienny tym, że w trakcie tego sposobu:

a) klonuje się pierwszą sekwencję DNA w odpowiednim wektorze;

b) wprowadza się wybrany ludzki szkielet aminokwasów na drodze mutagenezy, uzyskując konstrukt kodujący szczepiony CDR zawierający sekwencję wybraną z grupy składającej, się z:

sekwencji TM29 VH, w której obydwie reszty aminokwas©we 23 i 24 zostały zastąpione resztami alaniny (A), sekwencji TM29 VH, w której reszta aminokwasowa 75 została zastąpiona proliną (P), oraz sekwencji TM29 VH, w której reszty aminokwasowe 92 i 93 zostały zastąpione alaniną (A) i metioniną (M), odpowiednio, a resztą aminokwasową 73 jest asparagina (N), a reszta aminokwasowa 95 została zastąpiona tyrozyną (Y),

c) transformuje się komórkę gospodarza konstruktem z etapu b); oraz

d) hoduje się tak transformowaną komórkę gospodarza w celu wytworzenia humanizowanego przeciwciała lub jego białka wiążącego.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że komórkę gospodarza stanowi komórka CHO.
9. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące posiadające sekwencję aminokwasów obejmującą całość lub część CDR pochodzących zasadniczo od monoklonalnego przeciwciała wykazującego specyficzność względem wybranej subpopulacji komórek T ekspresjonujących region zmienny Vp5.2 lub νβ5.3 łańcucha beta receptora antygenowego komórek T, w połączeniu z wybranymi resztami zmiennego szkieletu również pochodzącymi od tego monoklonalnego przeciwciała, przy czym to humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zdolne jest do wiązania się z wybranymi subpopulacjami komórek T z powinowactwem wiązania co najmniej porównywalnym z powinowactwem wykazywanym przez to monoklonalne przeciwciało i korzystnie redukuje liczbę komórek T'w subpopulacji reagującej z tym humanizowanym przeciwciałem lub jego białkiem wiążącytn, przy czym takie humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zawiera sekwencję aminokwasową TM27V&:

1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQTPGKAPKLLIYY 50

51 TSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPRTFGQ 100

101 GTKLQIT 107, i zawiera ponadto sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z: sekwencji aminokwasowej TM27 VH:

1 QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVROPPGRGLEWLGM 50 51 IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNQKSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV 100

101 TATLYAMDYWGQGSLVTVSS 120, sekwencji TM27 VH, w której resztę aminokwasową 48 zastąpiono izoleucyną (I), sekwencji TM27 VH, w której reszty aminokwasowe 78 i 79 są waliną (V) i fenyloalaniną (F), sekwencji TM27 VH, w której reszty aminokwasowe 67 do 70 posiadające sekwencję VTML zostały zastąpione LSIS, odpowiednio, a resztą aminokwasową 73 jest asparagina (N), oraz sekwencji TM27 VH, w której resztą aminokwasową 92 jest arginina (R), w kombinacji z farmaceutycznie dopuszczalnym wypełniaczem.
10 . Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące posiadające sekwencję aminokwasów obejmującą całość lub część CDR pochodzących zasadniczo od monoklonalnego przeciwciała wykazującego specyficzność

180 157 względem wybranej subpopulacji komórek T ekspresjonujących region zmienny Υβ8.1 łańcucha beta receptora antygenowego komórek T, w połączeniu z wybranymi resztami zmiennego szkieletu również pochodzącymi od tego monoklonalnego przeciwciała, przy czym to humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zdolne jest do wiązania się z wybranymi subpopulacjami komórek T z powinowactwem wiązania co najmniej porównywalnym z powinowactwem wykazywanym przez to monoklonalne przeciwciało i korzystnie redukuje liczbę komórek T w subpopulacji reagującej z tym humanizowanym przeciwciałem lub jego białkiem wiążącym, przy czym takie humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zawiera sekwencję aminokwasową TM29VA:

1 DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVNYIYWYQQTPGKAPKLLIYYT 50

51 SNLAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQG 100

101 TKLQIT 106, i zawiera ponadto sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z: sekwencji amino kwasowej TM29 VH

1 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFTF SNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY

51 ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG 101 EGAMDYWGQGTPVTVSS 117, sekwencji TM29 VH, w której obydwie reszty aminokwasowe 23 i 24 zostały zastąpione resztami alaniny (A), sekwencji TM29 VH, w której reszta aminokwasowa 75 została zastąpiona proliną (P), oraz sekwencji TM29 VH, w której reszty aminokwasowe 92 i 93 zostały zastąpione alaniną (A) i metioniną (M), odpowiednio, a resztą aminokwasową 73 jest asparagina (N), a reszta aminokwasowa 95 została zastąpiona tyrozyną (Y), w kombinacji z farmaceutycznie dopuszczalnym wypełniaczem.
11. Środek farmaceutyczny służący do co najmniej jednego z następujących celów: redukowania zapalenia w tkankach zapalnych; redukowania infiltracji monocytów do centralnego układu nerwowego; redukowania demielinacji układu nerwowego; inhibicji, supresji, modulacji i/lub zabijania populacji komórek; wzmocnienia, inaktywacji, zabijania i/lub usuwania wybranej populacji komórek T u ssaków; eliminowania wybranej i/lub niepożądanych limfocytów T z krwi obwodowej, leczenia choroby Crohna, leczenia stwardnienia rozsianego, zawierający czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako czynnik aktywny zawiera humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące posiadające sekwencję aminokwasów obejmującą całość lub część CDR pochodzących zasadniczo od monoklonalnego przeciwciała wykazującego specyficzność względem wybranej subpopulacji komórek T ekspresjonujących region zmienny Υβ5.2 lub Υβ5.3 łańcucha beta receptora antygenowego komórek T, w połączeniu z wybranymi resztami zmiennego szkieletu również pochodzącymi od tego monoklonalnego przeciwciała i korzystnie redukuje liczbę komórek T w subpopulacji reagującej z tym humanizowanym przeciwciałem lub jego białkiem wiążącym, czy czym to humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zdolne jest do wiązania się z wybranymi subpopulacjami komórek T z powinowactwem wiązania co najmniej porównywalnym z powinowactwem wykazywanym przez to monoklonalne przeciwciało, przy czym takie humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zawiera sekwencję aminokwasową TM27Vk:

1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQTPGKAPKLLIYY 50

51 TSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPRTFGQ 100

101 GTKLQIT 107, i zawiera ponadto sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z: sekwencji aminokwasowej TM27 VH:

1 QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVROPPGRGLEWLGM 50 51 IWGDGNTDYNS ALKSRVTMLKDTSKNQKSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV 100 101 TATLYAMDYWGQGSLVTVSS 120,

180 157 sekwencji TM27 VH, w której resztę aminokwasową 48 zastąpiono izoleucyną (I), sekwencji TM27 VH, w której reszty aminokwasowe 78 i 79 są waliną(V) i fenyloalaniną (F), sekwencji TM27 VH, w której reszty aminokwasowe 67 do 70 posiadające sekwencję VTML zostały zastąpione LSIS, odpowiednio, a resztą aminokwasową 73 jest asparagina (N), oraz sekwencji TM27 VH, w której resztą aminokwasową 92 jest arginina (R).
12. Środek farmaceutyczny służący do co najmniej jednego z następujących celów: redukowania zapalenia w tkankach zapalnych; redukowania infiltracji monocytów do centralnego układu nerwowego; redukowania demielinacji układu nerwowego; inhibicji, supresji, modulacji i/lub zabijania populacji komórek; wzmocnienia, inaktywacji, zabijania i/lub usuwania wybranej populacji komórek T u ssaków; eliminowania wybranej i/lub niepożądanych limfocytów T z krwi obwodowej, leczenia choroby Crohna, leczenia stwardnienia rozsianego, zawierający czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako czynnik aktywny zawiera humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące posiadające sekwencję aminokwasów obejmującą całość lub część CDR pochodzących zasadniczo od monoklonalnego przeciwciała wykazującego specyficzność względem wybranej subpopulacji komórek T ekspresjonujących region zmienny Vp8.1 łańcucha beta receptora antygenowego komórek T, w połączeniu z wybranymi resztami zmiennego szkieletu również pochodzącymi od tego monoklonalnego przeciwciała, przy czym to humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zdolne jest do wiązania się z wybranymi subpopulacjami komórek T z powinowactwem wiązania co najmniej porównywalnym z powinowactwem wykazywanym przez to monoklonalne przeciwciało i korzystnie redukuje liczbę komórek T w subpopulacji reagującej z tym humanizowanym przeciwciałem lub jego białkiem wiążącym, przy czym takie humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zawiera sekwencję aminokwasową TM29Vł:

1 DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVNYIYWYQQTPGKAPKLLIYYT 50 51 SNLAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQG 100

101 TKLQIT 106, i zawiera ponadto sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z: sekwencji aminokwasowej TM29 VH

1 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY

51 ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG 101 EGAMDYWGQGTPVTVSS 117, sekwencji TM29 VH, w której obydwie reszty aminokwasowe 23 i 24 zostały zastąpione resztami alaniny (A), sekwencji TM29 VH, w której reszta aminokwasowa 75 została zastąpiona proliną (P), oraz sekwencji TM29 VH, w której reszty aminokwasowe 92 i 93 zostały zastąpione alaniną (A) i metioniną (M), odpowiednio, a resztą aminokwasową 73 jest asparagina (N), a reszta aminokwasowa 95 została zastąpiona tyrozyną (Y).
13. Sposób ograniczania w populacji komórek T liczby komórek T ekspresjonujących łańcuch β receptora komórek T, znamienny tym, że poddaje się komórki T ekspresjonujące łańcuch β działaniu skutecznego stężenia humanizowanego przeciwciała posiadającego sekwencję aminokwasów obejmującą całość lub część CDR pochodzących zasadniczo od monoklonalnego przeciwciała wykazującego specyficzność względem wybranej subpopulacji komórek T ekspresjonujących region zmienny Υβ5.2 lub νβ5.3 łańcucha beta receptora antygenowego komórek T, w połączeniu z wybranymi resztami zmiennego szkieletu również pochodzącymi od tego monoklonalnego przeciwciała, przy czym to humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zdolne jest do wiązania się z wybranymi subpopulacjami komórek T z powinowactwem wiązania co najmniej porównywalnym z powinowactwem wykazywanym przez to monoklonalne przeciwciało i korzystnie redukuje liczbę komórek T w subpopulacji reagującej z tym humanizowanym przeciwciałem lub jego białkiem wiążącym,

180 157 przy czym takie humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zawiera sekwencję aminokwasową TM27Vł:

1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQTPGKAPKLLIYY 50 51 TSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPRTFGQ 100

101 GTKLQIT 107, i zawiera ponadto sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z : sekwencji aminokwasowej TM27 VH:

1 QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFSLTAYGVNWVROPPGRGLEWLGM 50 51 IWGDGNTDYNSALKSRVTMLKDTSKNQKSLRLSSVTAADTAVYYCARDRV 100 101 TATLYAMDYWGQGSLVTVSS 120, sekwencji TM27 VE1, w której resztę aminokwasową 48 zastąpiono izoleucyną (I), sekwencji TM27 VH, w której reszty aminokwasowe 78 i 79 sąwaliną(V) i fenyloalaniną(F), sekwencji TM27 VH, w której reszty aminokwasowe 67 do 70 posiadające sekwencję VTML zostały zastąpione LSIS, odpowiednio, a resztą aminokwasową 73 jest asparagina (N), oraz sekwencji TM27 VH, w której resztą aminokwasową 92 jest arginina (R).
14. Sposób ograniczania w populacji komórek T liczby komórek T ekspresjonujących łańcuch β receptora komórek T, znamienny tym, że poddaje się komórki T ekspresjonujące łańcuch β działaniu skutecznego stężenia humanizowanego przeciwciała posiadającego sekwencję aminokwasów obejmującą całość lub część CDR pochodzących zasadniczo od monoklonalnego przeciwciała wykazującego specyficzność względem wybranej subpopulacji komórek T ekspresjonujących region zmienny νβδ.Ι łańcucha beta receptora antygenowego komórek T, w połączeniu z wybranymi resztami zmiennego szkieletu również pochodzącymi od tego monoklonalnego przeciwciała, przy czym to humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zdolne jest do wiązania się z wybranymi subpopulacjami komórek T z powinowactwem wiązania co najmniej porównywalnym z powinowactwem wykazywanym przez to monoklonalne przeciwciało i korzystnie redukuje liczbę komórek T w subpopulacji reagującej z tym humanizowanym przeciwciałem lub jego białkiem wiążącym, przy czym takie humanizowane przeciwciało lub jego białko wiążące zawiera sekwencję aminokwasową TM29Vh

1 DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVNYIYWYQQTPGKAPKLLIYYT 50 51 SNLAPGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQFTSSPFTFGQG 100

101 TKLQIT 106, i zawiera ponadto sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z: sekwencji aminokwasowej TM29 VE1

1 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCSSSGFTFSNFGMHWVRQAPGKGLEWVAY

51 ISSGSSTIYYADTLKGRFTISRDNSKNTLFLQMDSLRPEDTGVYFCARRG 101 EGAMDYWGQGTPVTVSS 117, sekwencji TM29 VE1, w której obydwie reszty aminokwasowe 23 i 24 zostały zastąpione resztami alaniny (A), sekwencji TM29 VH, w której reszta aminokwasowa 75 została zastąpiona proliną (P), oraz sekwencji TM29 VH, w której reszty aminokwasowe 92 i 93 zostały zastąpione alaniną (A) i metioniną (M), odpowiednio, a resztą aminokwasową 73 jest asparagina (N), a reszta aminokwasowa 95 została zastąpiona tyrozyną (Y).

* * *