JPH09509309A - 免疫複合体の調製及び使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、抗体断片を含む免疫複合体であって、この抗体断片がその軽鎖可変領域１８位近傍の炭水化物部分を介して診断もしくは治療成分と共有結合する免疫複合体に関する。また、本発明は、抗体部分を含む免疫複合体であって、この抗体部分が軽鎖可変ドメイン１８位近傍に糖鎖形成部位を有する完全な抗体であり、この糖鎖形成部位が軽鎖をコードするヌクレオチド配列に変異を誘発することにより抗体に導入されている免疫複合体にも関する。得られた免疫複合体は、抗体断片又は完全な抗体の免疫反応性を保持しており、かつ診断もしくは治療成分を、診断もしくは治療効果が実現される標識組織に狙いを定めて送達する。このように、本発明は、上記免疫複合体の診断もしくは免疫療法への使用を意図している。さらに、本発明は、上記免疫複合体の調製方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫複合体の調製及び使用 発明の背景１．発明の分野 本発明は、診断及び治療に有用な新規免疫複合体に関するものである。特に、 本発明は、抗体断片を含む免疫複合体であって、この抗体断片がその軽鎖可変領 域の炭水化物部分を介して診断もしくは治療成分と共有結合している免疫複合体 に関する。また、本発明は、軽鎖可変ドメインに糖鎖形成部位を有する完全な抗 体である抗体部分を含む免疫複合体であって、この糖鎖形成部位が軽鎖をコード するヌクレオチド配列の突然変異によってこの抗体に導入されたものである免疫 複合体にも関する。さらに、本発明は、そのような免疫複合体を調製する方法に も関する。また、本発明は、そのような免疫複合体を用いる診断及び治療方法に も関する。２．関連技術 モノクローナル抗体を様々な薬剤に結合させて、診断及び治療に用いられる免 疫複合体を形成することができる。これらの薬剤には、免疫複合体と放射性同位 体との安定な結合の形成を可能にするキレート類、並びに毒素及び化学療法剤の ような細胞毒性因子が含まれる。例えば、通常は患者に対する毒性が全身的に投 与された場合に強すぎる細胞毒性因子を、それらの毒性効果が標的抗原を保持す る腫瘍細胞のみに向けられるような方法で抗ガン抗体に結合させることができる 。免疫複合体の診断及び治療効率は、幾つかの因子に依存する。これらの因子の うち、抗体に対する診断もしくは治療成分のモル比、及び免疫複合体の抗体結合 活性が主な関心事である。 抗体に直接的に結合させることが可能な診断もしくは治療成分の最大数が、抗 体分子の修飾可能な部位の数及び抗体の免疫活性の損失によって制限されること が研究によりわかっている。例えば、Kulkarni et al.，Cancer Research 41: 2 700-2706(1981)では、抗原結合活性を大きく低下させることなく抗体中に組み込 むことが可能な薬剤分子の数には限界があることが報告されている。Kulkarniら は、メトトレキセートについて得られる最大組み込みが抗体１分子当たりメトト レキセート約１０分子であり、この薬剤−抗体モル比を１０以上に増加させる試 みが免疫複合体の収量を低下させ、抗体活性を損なうことを見出した。Kanellos et al.，JNCI 75: 319-329(1985)にも、同様の結果が報告されている。 抗原結合活性を大きく損なうことなく薬剤−免疫複合体の高い置換レベルを達 成するために、研究者は、薬剤の間接的結合のための介在物として水溶性ポリマ ー分子の使用を調査している。そのようなポリマー類には、酸化デキストラン（ Arnon et al.，Immunol．Rev．62: 5-27(1982)）、ポリグルタミン酸（Greenfie ld et al.，Antibody Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 2: 201-216 (1989)）、ヒト血清アルブミン（Baldwin et al.，NCI Monographs 3: 95-99(19 87)）、及びカルボキシメチルデキストラン（Schechter et al.，Cancer Immuno l．Immunother．25: 225-230(1987)）が含まれる。 Shih et al.，Int．J．Cancer 41: 832-839(1988)には、部位特異的結合法が 記載されている。この方法では、アミノデキストランを介して抗体の定常領域、 すなわち「Ｆｃ」領域の炭水化物部分にメトトレキセートを結合させ、その結果 、高い置換比を有し、かつ免疫活性を保持する免疫複合体を得ている。さらに最 近では、Shih et al.，Int．J．Cancer 46: 1101-1106(1990)に、アミノデキス トランを介してモノクローナル抗体のＦｃ領域の炭水化物部分に結合している５ −フルオロウリジンを含む免疫複合体の効能が示されている。これらの研究の両 者において、Shihらは、この免疫複合体が免疫グロブリン１分子当たり３０〜５ ０ 分子の薬剤を含むことを見出した。このように、抗体のＦｃ領域の炭水化物部分 に診断もしくは治療成分を間接的に結合することにより、機能的な抗原結合活性 及び高い置換レベルを有する免疫複合体を得る手段が提供される。 Ｆｃ領域の炭水化物部分を部位特異的な結合部位として使用することの利点は 、全てのサブタイプの抗体が糖鎖形成されたＦｃ領域を典型的に有することであ る。一般に、抗体分子は、それらのアイソタイプによって特徴的な位置で、それ らのＦｃ領域が糖鎖形成されている。例えば、炭水化物は、典型的には、ＩｇＧ 分子のＦｃ領域におけるＣ_H２ドメインのアミノ酸２９７に存在する。抗原結合 部位から遠く離れたこの位置の炭水化物部分に診断もしくは治療成分を結合して も、Shihらによって示されているように、得られた免疫複合体の免疫反応性には 最小限の影響しか及ぼさない。 しかしながら、Ｆｃ領域の炭水化物部分を結合部位として使用することの不都 合な点は、抗体全体が免疫複合体に必要とされる点である。抗体断片、特にＦａ ｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）₂を使用することで、抗体全体の使用を上回る利 点が得られる。これは、そのような断片が、毛管外に、そして標的組織内に、よ り拡散できるためである。Brown，"Clinical Use of Monoclonal Antibodies," in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY，Pezzuto et al.，eds．Chapman & Hall，pp.2 27-249(1993)を参照のこと。さらに、抗体断片は、抗体全体よりも容易に血液及 び正常組織から除去される。例えば、完全なマウスＩｇＧの血液半減期は約３０ 時間である。これに対して、Ｆ（ａｂ’）₂及びＦａｂ／Ｆａｂ’の半減期は、 それぞれ、約２０時間及び２時間である。同上。このように、免疫複合体の構築 に抗体断片を用いることには利点がある。放射性同位体への正常組織の露出を最 小限に止めなければならない放射免疫療法及び放射免疫診断への適用においては 、抗体断片は特に有利である。 抗体可変領域は、時折、抗体断片から免疫複合体を調製するための潜在的な結 合部位を提供する炭水化物部分を有する。例えば、アスパラギン結合型炭水化物 アクセプターがマウス可変領域の約１５〜２５％に同定されている。Kabat et a l.，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，5th ed．U.S．Depart ment of Health and Human Services(1990)。抗デキストラン系の抗体の場合に は、糖鎖形成部位は、重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）、特にＣＤＲ２ に存在する。同上。これらの抗体のＣＤＲにおけるアスパラギン（Ａｓｎ）に結 合した炭水化物の存在によって、抗原の結合は高まっているように思われる。Wa llick et al.，J．Exp．Med．168．1099-1109(1988)、及び、Wright et al.，EM BO J．10: 2717-2723(1991)。しかしながら、部位指定突然変異誘発（site-dire cted mutagenesis）によってＣＤＲにさらなる炭水化物結合部位を導入すると、 糖鎖形成部位が導入された位置に依存して、抗原に対する親和性を高めるか、あ るいは低減させるかのいずれかの結果が生じた。Wrightら（前出）参照。このよ うに、診断もしくは治療成分をＶＨ ＣＤＲ領域の炭水化物部分に結合させる可 能性は不確かである。 炭水化物結合についての本発明者らの研究では、ＩｇＧ抗体であるＬＬ２との 高い結合効率が示された。この抗体は、Pawlak-Byczkowskaら（Cancer Res．49: 4568-4577(1989)）及びGoldenbergら（J.Clin．Oncol．9: 548(1991)）によっ て記述されたマウスのモノクローナル抗体である。還元条件下でのドデシル硫酸 ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いたＬＬ ２複合体の分析では、ＬＬ２抗体の軽鎖可変（ＶＬ）領域に糖鎖形成部位の存在 が示された。ＬＬ２のＶＬ領域のクローニングの後、ＶＬ領域のフレームワーク −１（ＦＲ１）配列の１８〜２０位にアスパラギン結合型の糖鎖形成部位が見出 された。 これらの研究は、ＶＬ領域内の炭水化物部分での優先的な結合の可能性を示唆 した。この予期せざる知見は、ＶＬ領域における利用可能性の改良によって説明 することができる。我々は、部位指定突然変異誘発を用いてアスパラギン結合型 の糖鎖形成部位を除去し、得られたタンパク質が元の抗体と同様の免疫反応性を 示すことを見出した。この結果は、軽鎖ＦＲ１炭水化物部分と抗原結合部位との 間で起こる無視し得る、もしくは最小限の相互作用を示唆する、発明者らによる コンピューターでモデル化した研究と一致する。このように、これらの研究は、 ＶＬ領域のＦＲ１配列内の炭水化物部分に診断もしくは治療成分を結合させるこ とにより、機能的な抗原結合活性を有する抗体断片の免疫複合体を得るための手 段が提供されることを示している。 本発明は、完全な抗体又はそれらの抗原結合断片に軽鎖可変領域の炭水化物部 分を介して結合した診断もしくは治療成分を含む新規免疫複合体の調製方法を提 供する。 発明の概要 本発明は、変異組換え抗体又は抗体断片であって、該抗体又は抗体断片の軽鎖 の１８位近傍に、天然に存在しないアスパラギン型糖鎖形成部位を有する変異抗 体又は抗体断片に向けられている。 また、本発明は、糖鎖形成された変異組換え抗体又は抗体断片の調製方法であ って、 （ａ）変異軽鎖及び重鎖を含む変異抗体又は抗体断片を発現し、かつ糖鎖形成す る形質転換宿主細胞を培養する工程であって、１８位アミノ酸近傍に天然に存在 しないアスパラギン型糖鎖形成部位を有する変異軽鎖をコードする変異ＤＮＡ分 子がクローン化されている発現ベクターによって、該宿主細胞が形質転換されて いる工程、及び （ｂ）該培養宿主細胞から、発現し、かつ変異抗体又は抗体断片を回収する工程 、を包含する方法に向けられている。 さらに、本発明は、 （ａ）糖鎖形成された抗体断片であって、該抗体断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ ａｂ）₂、及びＦ（ａｂ’）₂からなる群より選択され、かつ該抗体断片が軽鎖可 変領域及び該軽鎖可変領域の１８位アミノ酸近傍に結合する炭水化物部分を含む 糖鎖形成された抗体断片、及び （ｂ）少なくとも１つの遊離アミン基を有するポリマー担体、及び該ポリマー担 体に共有結合する複数の薬剤、毒素、キレート剤、ボロンアデンド又は検出可能 な標識分子を含む中間複合体 を含む可溶性免疫複合体であって、 該中間複合体が該ポリマー担体の少なくとも１つの遊離アミン基を介して該抗 体断片の炭水化物部分に共有結合し、かつ該免疫複合体が該抗体断片の免疫反応 性を保持する可溶性免疫複合体に向けられている。 加えて、本発明は、 （ａ）糖鎖形成された抗体断片であって、該抗体断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ ａｂ）₂、及びＦ（ａｂ’）₂からなる群より選択され、かつ該抗体断片が軽鎖可 変領域及び該軽鎖可変領域の１８位アミノ酸近傍に結合する炭水化物部分を含む 糖鎖形成された抗体断片、及び （ｂ）薬剤、毒素、キレート剤、ポリエチレングリコール、ボロンアデンド及び 検出可能な標識分子からなる群より選択される非抗体部分 を含む可溶性免疫複合体であって、 該非抗体部分が該抗体断片の炭水化物部分に共有結合し、かつ該免疫複合体が 該抗体断片の免疫反応性を保持する可溶性免疫複合体に向けられている。 さらに、本発明は、 （ａ）軽鎖可変領域及び該軽鎖可変領域の１８位アミノ酸近傍に結合する炭水化 物部分を含む変異抗体、及び （ｂ）薬剤、毒素、キレート剤、ポリエチレングリコール、ボロンアデンド及び 検出可能な標識分子からなる群より選択される非抗体部分、 を含む可溶性免疫複合体であって、 該非抗体部分が該変異抗体の炭水化物部分に共有結合し、かつ 該免疫複合体が該変異抗体の免疫反応性を保持する可溶性免疫複合体に向けら れている。 また、本発明は、 （ａ）Ｆｖ及び一本鎖抗体からなる群より選択され、かつ軽鎖可変領域及び該軽 鎖可変領域の１８位アミノ酸近傍に結合する炭水化物部分を含む抗体成分、及び （ｂ）少なくとも１つの遊離アミン基を有するポリマー担体及び該ポリマー担体 に共有結合する複数の薬剤、毒素、キレート剤、ボロンアデンド又は検出可能な 標識分子を含む中間複合体 を含む免疫複合体であって、 該中間複合体が該ポリマー担体の少なくとも１つの遊離アミン基を介して該抗 体成分の炭水化物部分に共有結合し、かつ 該免疫複合体が該抗体成分の免疫反応性を保持する可溶性免疫複合体に向けら れている。 さらに、本発明は、 （ａ） Ｆｖ及び一本鎖抗体からなる群より選択され、かつ軽鎖可変領域及び該 軽鎖可変領域の１８位アミノ酸近傍に結合する炭水化物部分を含む抗体成分、及 び （ｂ）薬剤、毒素、キレート剤、ポリエチレングリコール、ボロンアデンド及び 検出可能な標識分子からなる群より選択される非抗体成分 を含む可溶性免疫複合体であって、 該非抗体成分が該抗体成分の炭水化物部分に共有結合し、かつ 該免疫複合体が該抗体成分の免疫反応性を保持する可溶性免疫複合体に向けら れている。 また、本発明は、免疫複合体の調製方法であって、 （ａ）軽鎖をコードするＤＮＡ分子のヌクレオチド配列に変異を生成させること により、抗体の軽鎖の１８位近傍にアスパラギン型糖鎖形成部位を導入する工程 、 （ｂ）該変異ＤＮＡ分子を発現ベクターにクローニングする工程、 （ｃ）該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、変異軽鎖及び重鎖を有する変異 抗体を発現する形質転換宿主細胞を回収する工程、 （ｄ）該形質転換宿主細胞を培養し、該培養宿主細胞から変異抗体を回収する工 程、 （ｅ）回収された抗体から抗体断片を調製する工程であって、該抗体断片がＦａ ｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）₂及びＦ（ａｂ’）₂からなる群より選択され、かつ該 抗体断片が該抗体断片の変異軽鎖に炭水化物部分を有する工程、及び （ｆ）該抗体断片の炭水化物部分に中間複合体を共有結合させる工程であって、 該中間複合体が少なくとも１つの遊離アミン基を有するポリマー担体及び該ポリ マー担体に共有結合する複数の薬剤、毒素、キレート剤、ボロンアデンド又は検 出可能な標識分子を含み、該中間複合体が該ポリマー担体の少なくとも１つの遊 離アミン基を介して該抗体断片の炭水化物部分に共有結合し、かつ該免疫複合体 が該抗体断片の免疫反応性を保持する工程、 を包含する方法に向けられている。 また、本発明は、哺乳動物において疾患の存在を診断する方法であって、 （ａ）検出可能な標識、及び軽鎖の１８位近傍に結合する炭水化物部分を有する 抗体断片を含む免疫複合体を調製する工程であって、該検出可能な標識が該抗体 断片の炭水化物部分に結合し、かつ該抗体断片が疾患に関連する抗原に結合する ことが可能である工程、 （ｂ）該免疫複合体及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物を哺乳動物に投与 する工程、及び （ｃ）生体内造影を用いて、疾患部位に免疫複合体の存在を検出する工程 を包含する方法に向けられている。 さらに、本発明は、哺乳動物において疾患を治療する方法であって、 （ａ）軽鎖の１８位近傍に結合する炭水化物部分を有する抗体断片と、薬剤、毒 素、キレート剤、ボロンアデンド及び放射性同位体からなる群より選択される非 抗体部分とを含む免疫複合体を調製する工程であって、該非抗体部分が該抗体断 片の炭水化物部分に共有結合し、かつ該抗体断片が疾患に関連する抗原に結合す ることが可能である工程、及び （ｂ）該免疫複合体及び薬学的に許容し得る担体を含む組成物を哺乳動物に投与 する工程 を包含する方法に向けられている。 また、本発明の免疫複合体を用いる、組織学的標本中の抗原のin vitro免疫検 定及びin situでの検出の改良法も本発明に含まれる。 また、適切なポリマー担体、キレート類、検出可能な標識分子、及び本発明の 免疫複合体の調製に用いるのに適した結合基も提供される。 詳細な説明１．概観 この発明は、抗体部分の軽鎖可変領域内の炭水化物部分を介して診断もしくは 治療成分に共有結合する完全な抗体、又はそれらの抗原結合断片を含む免疫複合 体に向けられたものである。さらに、この発明は、そのような免疫複合体の調製 方法に関する。また、この発明は、そのような免疫複合体の診断及び免疫療法へ の使用を意図している。２．定義 以下の説明において、多くの用語が広範に用いられる。本発明の理解を容易に するために、本明細書に定義する。 抗体。ここで用いられる場合、「抗体」には、マウス、キメラもしくはヒト化 抗体のようなモノクローナル抗体が、それらの抗原結合断片と同様に含まれる。 そのような断片には、完全な抗体からＦｃ断片を欠くＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａ ｂ）₂、及びＦ（ａｂ’）₂が含まれる。また、そのような断片には、軽鎖可変領 域からなる単離断片、重鎖及び軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、並びに軽 鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続されている組換え一本鎖ポ リペプチド分子も含まれる。 変異抗体。ここで用いられる場合、変異抗体は、軽鎖の１８位アミノ酸近傍に アスパラギン結合型の糖鎖形成部位を有する完全な抗体、又はそれらの抗原結合 断片であり、前記アスパラギン結合型の糖鎖形成部位は対応するヌクレオチド配 列を改変することによって軽鎖に導入されたものである。軽鎖をコードするヌク レオチド配列に変異を形成する方法には、ポリメラーゼ連鎖反応、部位指定突然 変異誘発、及びポリメラーゼ連鎖反応を用いる合成ＤＮＡオリゴマーでの遺伝子 合成が含まれる。 診断もしくは治療成分。ここで用いられる場合には、診断もしくは治療成分は 、抗体に結合して診断もしくは治療に有用な免疫複合体を生成する分子又は原子 である。診断もしくは治療成分の例には、薬剤、毒素、キレート剤、ホウ素化合 物、及び検出可能な標識が含まれる。 免疫複合体。ここで用いられる場合には、免疫複合体は、抗体及び診断もしく は治療成分を含む分子である。免疫複合体は抗体の免疫反応性を保持する。すな わち、その抗体部分は、結合後に、結合前とほぼ同様の抗原との結合能力を有す るか、もしくはわずかに低下した抗原との結合能力を有する。 構造遺伝子。伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、次いでそれが特定のポリペ プチドの特徴を有するアミノ酸の配列に翻訳されるＤＮＡ配列。 プロモーター。構造遺伝子の転写を指示してｍＲＮＡを生成するＤＮＡ配列。 典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の開始コドン近隣の、遺伝子の５’領 域に位置する。プロモーターが誘導的プロモーターである場合には、転写速度は 誘導剤に応じて増加する。一方、プロモーターが構成的プロモーターである場合 には、転写速度は誘導剤によって調節されることはない。 エンハンサー。プロモーター要素。エンハンサーは、転写の開始部位に対する エンハンサーの距離又は方向に関わりなく、特定の遺伝子をｍＲＮＡに転写する 効率を増加させる。 相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）。相補的ＤＮＡは、酵素である逆転写酵素によって ＲＮＡテンプレートから形成される一本鎖ＤＮＡ分子である。典型的には、ｍＲ ＮＡの一部に相補的なプライマーが逆転写の開始に用いられる。当該技術分野の 熟練者はまた、そのような一本鎖ＤＮＡ及びその相補体からなる二本鎖ＤＮＡ分 子について述べるために「ｃＤＮＡ」という用語を用いる。 発現。発現は、それによって構造遺伝子からポリペプチドが生成する過程であ る。この過程には、遺伝子のｍＲＮＡへの転写及びそのｍＲＮＡのポリペプチド への翻訳が関与する。 クローニングベクター。宿主細胞中で自律的に複製する能力を有し、かつ遺伝 子操作のための細胞の形質転換に用いられる、プラスミド、コスミド、又はバク テリオファージのようなＤＮＡ分子。クローニングベクターは、クローニングベ クターで形質転換された細胞の同定及び選択に用いるのに適切なマーカー遺伝子 、並びに、ベクターの本質的な生物学的機能を損なうことなく、決定可能な方法 で外来ＤＮＡ配列を挿入することができる１もしくは少数の制限エンドヌクレア ーゼ認識部位を典型的に有している。マーカー遺伝子には、テトラサイクリン耐 性又はアンピシリン耐性を供与する遺伝子が典型的に含まれる。 発現ベクター。組換え宿主内において外来タンパク質の発現を供与する、外来 タンパク質をコードするクローン化構造遺伝子を含むＤＮＡ分子。典型的には、 クローン化遺伝子の発現は、プロモーター及びエンハンサー配列のような特定の 調節配列の制御下におかれている（すなわち、作動可能に連結している）。プロ モーター配列は、構成的であっても、誘導的であってもいずれでもよい。 組換え宿主。組換え宿主は、クローニングベクター又は発現ベクターのいずれ かを有する、いかなる原核細胞もしくは真核細胞であってもよい。この用語はま た、遺伝学的に処理されて宿主細胞の染色体又はゲノム中に１あるいは複数のク ローン化遺伝子を含む原核細胞もしくは真核細胞を含むことをも意味する。適切 な宿主の例については、Sambrook et al.，MOLECULAR CLONING: A LABORATORY M ANUAL，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor ，New York(1989)を参照のこと。３．タンパク質をコードするＤＮＡ配列の変異形成による、抗体軽鎖へのアスパ ラギン型糖鎖形成部位の導入方法 Ａ．抗体構造及びアスパラギン結合型の糖鎖形成 抗体分子は、重鎖及び軽鎖の２つの同一のコピーを含んでなり、これらはジス ルフィド結合により内部で共有結合的に接続されている。一般的な考察について は、Schultz et al.，"Proteins II: Structure-Function Relationship of Pro tein Families," in TEXTBOOK OF BIOCHEMISTRY WITH CLINICAL CORRELATIONS， 3rd Ed.，T．M．Devlin(ed.)，Wiley & Sons，pp．92-134(1992)、及び、Turner et al.，"Antigen Receptor Molecules," in IMMUNOLOGY，3rd Ed.，Roitt et al．(eds.)，Mosby，pp．4.1-4.20(1993)を参照のこと。最も普通のタイプの抗 体であるＩｇＧにおいては、２つの重鎖は各々約４４０個のアミノ酸を有してお り、これに対して２つの軽鎖は各々約２２０個のアミノ酸を有している。軽鎖の カルボキシ末端の１／２及び重鎖のカルボキシ末端の３／４のアミノ酸配列は、 異なる抗原特異性を有する抗体間で高度に保存されている。軽鎖及び重鎖のこれ らの保存された領域は「定常領域」と命名され、それぞれＣＬ及びＣＨと呼ばれ ている。ＣＨ領域は、特定の抗体が抗体クラスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ 、又はＩｇＭのいずれに属するのかを決定する。特定のクラス内のＣＨ領域は相 同であるが、他の抗体クラスのＣＨ領域のアミノ酸配列とは大きく異なる。 反対に、軽鎖のアミノ末端の１／２及び重鎖のアミノ末端の１／４は、異なる 抗原特異性を有する抗体間で高度に変化し得る。これらの可変セグメント内の特 定領域は「超可変」であり、「相補性決定領域（ＣＤＲ）」と呼ばれている。こ れは、これらの領域が、抗原構造のトポロジーに相補的な抗原結合部位（ＡＢＳ ）を形成するためである。 重鎖の各々は、両鎖のアミノ末端が互いに近接するように軽鎖と結合していて 、かつ抗原結合部位を含んでいる。抗体を小さな機能的単位へ断片化するのに、 タンパク質分解性の開裂を用いることができる。例えば、パパインを用いるＩｇ Ｇのタンパク質分解性の開裂により、各重鎖のヒンジペプチドにおける抗体の開 裂が生じる。パパイン消化による生成物の１つは、「結晶化可能な断片（Ｆｃ） 」中で共有結合している重鎖のカルボキシ末端の１／２である。このＦｃ断片は 抗原とは結合しない。他の開裂生成物は同一であり、軽鎖全体と結合している重 鎖のアミノ末端セグメントからなる。これらのアミノ末端、すなわち「抗原結合 断片（Ｆａｂ）」は、完全な抗体分子と同様な親和性で抗原と結合することが可 能である。 本発明の目的は、完全な抗体、又はそれらの抗原結合断片の軽鎖可変領域のア スパラギン結合型の炭水化物部分に診断もしくは治療成分を共有結合させること にある。「Ｎ−結合型糖鎖形成」とも呼ばれるアスパラギン結合型糖鎖形成は、 アスパラギン残基のアミド窒素を介して糖残基が結合されている糖鎖形成の一形 態である。アスパラギン結合オリゴ糖の細胞内における生合成は、小胞体の内腔 とそれに続いて起こるゴルジ体へのタンパク質輸送の両者で起こる。アスパラギ ン結合型糖鎖形成は、糖鎖形成配列、すなわち、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ （ここで、Ｘはプロリン又はアスパラギン酸を除くいかなるアミノ酸であっても よい）で起こる。したがって、アスパラギン結合型糖鎖形成をコードする３つの アミノ酸の可能な配列が３６通りある。遺伝コードの縮重を考慮すると、糖鎖形 成シグナル配列をコードする可能なヌクレオチド配列は１０００を超える。Ｂ．変異誘発 １８〜２０位へのアスパラギン結合型糖鎖形成配列の導入に用いられる特定の ヌクレオチド配列は、天然のヌクレオチド配列に依存する。以下に記述されるよ うに、ＰＫＡＰＰＡ（１１）２４タンパク質へのアスパラギン結合型の糖鎖形成 部位の導入は、コドン１８をＡＧＧからＡＡＣに変更することにより達成するこ とができる。そのようなヌクレオチド配列の変異誘発は、当該技術者に周知の方 法で達成することができる。 例えば、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発及びクローン化抗体軽鎖を用い て、アスパラギン結合型の糖鎖形成部位を１８〜２０位に導入することができる 。この手順において、チミジンの代わりに少数のウラシル残基を有するＤＮＡ分 子を生成するために、大腸菌（E．coli）のdut^-ung^-株から抗体の軽鎖配列を有 する一本鎖ＤＮＡテンプレートを調製する。そのようなＤＮＡテンプレートは、 Ｍ１３クローニング、又はＳＰ６プロモーターを用いるin vitroでの転写によっ て得ることができる。例えば、Ausubel et al．(eds.)，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons(1987)を参照のこと。変異配列を有する オリゴヌクレオチドは、周知の方法を用いて合成される。同上。このオリゴヌク レオチドを一本鎖テンプレートにアニールし、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ ４ＤＮＡリガーゼを用いて二本鎖ＤＮＡ分子を生成させる。この二本鎖ＤＮＡ分 子を用いて野生型（dut⁺ung⁺）大腸菌を形質転換することにより、変異ＤＮＡが 効率的に回収される。 オリゴヌクレオチド指定突然変異変異誘発の詳細なプロトコル及びクローン化 ＤＮＡの変異誘発の関連技術は周知である。例えば、前出のAusubel ら、及び、 前出のSambrookらを参照のこと。 代わりに、プライマーとして所望の変異を有するオリゴヌクレオチド、及び、 抗体軽鎖として可変領域のＤＮＡクローンを用いて、あるいは興味対象の抗体を 生成する細胞由来のＲＮＡをテンプレートして用いることにより、抗体軽鎖にア スパラギン結合型の糖鎖形成部位を導入することができる。このような技術には 、例えば、実施例１において説明されるポリメラーゼ連鎖反応が含まれる。Huse ，"Combinatorial Antibody Expression Libraries in Filamentous Phage," in ANTIBODY ENGINEERING: A PLACTICAL GUIDE，C．Borrebaeck(ed.)，W．H．Free man and Company，pp．103-120(1992)も参照のこと。部位指定突然変異誘発は、 例えば、TRANSFORMERTM Site-Directed Mutagenesis Kit（Clontech; Palo Alt o，CA）を製造者の指示に従って用いて行うことができる。 代わりに、オリゴヌクレオチドの１つが所望の変異を有する、互いに起点とな るオリゴヌクレオチドを用いて軽鎖遺伝子を合成することにより、免疫グロブリ ン軽鎖に糖鎖形成部位を導入することができる。巨大合成遺伝子を合成する技術 は、当該技術者に周知である。例えば、Uhlmann，Gene 71: 29-40(1988)、及び 、Wosnick et al.，Gene 60: 115-127(1988)、及び、前出のAusubelらを参照の こと。 要約すると、２つの必要条件が満足される場合に、抗体の軽鎖の１８位アミノ 酸近傍にアスパラギン結合型の糖鎖形成部位を導入することが可能である。第１ に、所望の変異を有する相補的オリゴヌクレオチドを設計するために、関心のあ る抗体の軽鎖の１８〜２０位アミノ酸のコドンの周囲のヌクレオチド配列及びこ れを含むヌクレオチド配列が利用可能でなければならない。第２に、関心のある 抗体を生成するクローン化抗体のＤＮＡもしくは細胞のいずれかが利用可能でな ければならない。これら２つの制限を仮定して、本発明は、マウス、ヒト化、又 はキメラ抗体を含む免疫複合体であって、軽鎖可変領域の１８位アミノ酸近傍に 位置する炭水化物部分を介して、診断もしくは治療成分が抗体成分に結合する免 疫複合体を包含する。このような抗体には、完全な抗体及び抗原結合断片である Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）₂、及びＦ（ａｂ’）₂が含まれる。 さらに、本発明は、Ｆｖ断片又は一本鎖抗体を含む免疫複合体の製造を意図し ている。上に論じられているように、Ｆｖ断片は重鎖及び軽鎖可変領域の非共有 結合的な結合を有している。一方、一本鎖抗体は、ペプチドリンカーによって接 続されている元の抗体の可変領域に由来する重ポリペプチド鎖及び軽ポリペプチ ド鎖を有している。例えば、Bird et al，Science 242: 423-426(1988)、Ladner らの米国特許4,946,778号、及びPack et al.，Bio/Technology 11: 1271-1277(1 993)を参照のこと。 一般に、Ｆｖ断片及び一本鎖抗体は、放射性金属のような特定の診断もしくは 治療成分が結合する部位を欠いている。しかしながら、Ｆｖ断片又は一本鎖抗体 の軽鎖可変領域にアスパラギン結合型の糖鎖形成部位を導入することにより、以 下に記すように、様々な診断もしくは治療成分の結合のための炭水化物部分が提 供される。Ｆｖ断片及び一本鎖抗体が典型的には原核宿主細胞によって生成され るとしても、真核宿主細胞が好ましい宿主細胞である。特に、昆虫細胞、酵母細 胞、及び哺乳動物細胞が好ましい真核細胞である。哺乳動物細胞が最も好ましい 宿主細胞である。 本発明がアスパラギン結合型の糖鎖形成部位を軽鎖可変領域の１８〜２０位ア ミノ酸近傍に導入する方法を提供するとしても、本発明がそのように限定される ものではないことは理解されるであろう。当該技術分野の熟練者には、軽鎖可変 領域の他に代わるべき位置に、あるいは重鎖可変領域にさえも、糖鎖形成部位を 導入することが可能であることが想起される。本発明の免疫複合体は、変異抗体 もしくは断片が抗原結合活性を保持する限りにおいて、そのような他に代わるべ き糖鎖形成部位で結合する炭水化物部分を有する完全な抗体、抗体断片又は一本 鎖抗体を用いて調製することができる。適切な他に代わるべき糖鎖形成部位は、 当該技術分野の熟練者に周知の分子モデル化技術を用いて同定することができる 。例えば、Lesk et al.，"Antibody Structure and Structural Predictions U seful in Guiding Antibody Engineering，" in ANTIBODY ENGINEERING: A PRAC TICAL GUIDE，C．Borrebaeck(ed.)，W．H．Freeman and Company，pp．1-38(199 2)、及び、Cheetham，"Engineering Antibody Affinity" 同上、at pp．39-67を 参照のこと。４．変異抗体ＤＮＡ配列のタンパク生成物の発現及び単離方法 Ａ．変異抗体の発現方法 ヌクレオチド配列に変異を誘発した後、ＤＮＡ配列の確認等のさらなる分析の ために、実施例１に説明されるように、変異ＤＮＡをクローニングベクターに挿 入する。変異ＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドを発現させるために 、ＤＮＡ配列は、発現ベクターにおける転写的な発現を制御する調節配列に作動 可能に連結され、次いで、原核宿主細胞もしくは真核宿主細胞に導入されなけれ ばならない。発現ベクターには、プロモーター及びエンハンサーのような転写調 節配列に加えて、翻訳調節配列及び発現ベクターを担持する細胞の選択に適した マーカー遺伝子が含まれる。 原核宿主中での発現に適したプロモーターは、抑制的、構成的又は誘導的なも のであればよい。適切なプロモーターは当該技術分野の熟練者には周知であり、 Ｔ４、Ｔ３、Ｓｐ６及びＴ７ポリメラーゼを認識することが可能なプロモーター 、バクテリオファージラムダのＰ_R及びＰ_Lプロモーター、大腸菌のｔｒｐプロモ ーター、ｒｅｃＡプロモーター、熱ショックプロモーター及びｌａｃＺプロモー ター、枯草菌（B．subtilis）のαアミラーゼプロモーター及びσ²⁸特異的プロ モーター、バチルス属のバクテリオファージのプロモーター、ストレプトミセス 属プ ロモーター、バクテリオファージラムダのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２の βラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、並びにクロラムフェニコールアセ チルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターが含まれる。原核細胞のプ ロモーターは、Glick，J．Ind．Microbiol．1: 277-282(1987)、Watson et al. ，MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE，4th Ed.，Benjamin Cummins(1987)、前出の Ausubetら、及び、前出のSambrookらで検討されている。 特に好ましい原核宿主は大腸菌である。大腸菌の好ましい株には、Ｙ１０８８ 、Ｙ１０８９、ＣＳＨ１８、ＥＲ１４５１、及びＥＲ１６４７が含まれる（例え ば、Brown(Ed.)，MOLECULAR BIOLOGY LABFAX，Academic Press(1991)を参照）。 他に代わるべき好ましい宿主は、ＢＲ１５１、ＹＢ８８６、ＭＩ１１９、ＭＩ１ ２０、及びＢ１７０のような株（例えば、Hardy，"Bacillus Cloning Methods," in DNA CLONING: A PLACTICAL APPROACH，Glover(Ed.)，IRL Press(1985)を参 照）を含む枯草菌（Bacillus subtilus）である。 大腸菌中で抗体断片を生成させる方法は、当該技術者には周知である。例えば 、Huse，"Combinatorial Antibody Expression Libraries in Filamentous Phag e，" in ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL GUIDE，C．Borrebaeck(Ed.)，W． H．Freeman and Company，pp．103-120(1992)、及び、Ward，"Expression and P urification of Antibody Fragments Using Escherichia coli as a Host," 同 上at pp．121-138(1992)を参照のこと。また、当該技術分野の熟練者は、大腸菌 中で、重鎖及び軽鎖の可変領域からなるＦｖ断片を生成させる方法も知っている 。同上。Whitlow et al.，"Single-Chain Fv Proteins and their Fusion Prote ins," in NEW TECHNIQUES IN ANTIBODY GENERATION，Methods 2（2）(1991)も参 照のこと。 さらに、原核細胞における抗体をクローニングするための発現システムは市販 もされている。例えば、IMMUNO ZAPTMクローニング及び発現システム（Stratage ne Cloning Systems; La Jolla，CA）は、大腸菌中で抗体軽鎖及び重鎖を発現さ せるためのベクターを提供する。 原核細胞における変異ＤＮＡ配列の発現では、続いてin vitroの糖鎖形成が必 要とされるため、本発明は、好ましくは、真核細胞、特に哺乳動物細胞、昆虫細 胞及び酵母細胞における変異ＤＮＡ配列の発現を包含する。特に好ましい真核宿 主は哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、クローン化ポリペプチドに対して、 適正な折畳み及び糖鎖形成を含む翻訳後修飾を加える。そのような哺乳動物宿主 細胞には、例えば、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）、非分泌性ミ エローマ細胞（ＳＰ２／０−ＡＧ１４；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、チャイニ ーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ラット下垂 体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ Ｃ ＣＬ２．２）、及びラットヘパトーマ細胞（Ｈ−４−II−Ｅ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８）が含まれる。 哺乳動物宿主に対しては、転写及び翻訳調節シグナルを、アデノウイルス、ウ シ乳頭腫ウイルス及びシミアンウイルスのようなウイルス源から得ることができ る。加えて、アクチン、コラーゲン又はミオシンのような哺乳動物発現生成物由 来のプロモーターを用いることができる。代わりに、真核細胞プロモーターによ って調節される（バクテリオファージＴ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの ような）原核細胞プロモーターを用いることもできる（例えば、Zhou et al.，M ol．Cell．Biol．10: 4529-4537(1990)、及び、Kaufman et al.，Nucl．Acids R es．19: 485-4490(1991)を参照）。抑制または活性化させる転写開始調節シグナ ルは、遺伝子の発現を調節できるように選択することができる。 一般に、真核調節領域には、ＲＮＡ合成の開始を指示するのに十分なプロモー ター領域が含まれる。そのような真核細胞プロモーターには、マウスメタロチオ ネインＩ遺伝子のプロモーター（Hamer et al.，J．Mol．Appl．Gene．1: 273-2 88(1982)）、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（McKnight，Cell 31: 355-3 65(1982)）、ＳＶ４０初期プロモーター（Benoist et al.，Nature（London）29 0: 304-310(1981)）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（Gormanら、前出）、サ イトメガロウイルスプロモーター（Foecking et al.，Gene 45: 101(1980)）、 酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター（Johnston et al.，Proc．Natl.Acad．Sci．( USA)79: 6971-6975(1982)、Silver et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)81: 5951-5955(1984)）、及び、ＩｇＧプロモーター（Orlandi et al.，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 86 3833-3837(1989)）が含まれる。 本発明の調節配列には、強制調節配列が最も好ましい。そのような好ましい調 節配列の例には、ＳＶ４０プロモーター−エンハンサー（Gorman，"High Effici ency Gene Transfer into Mammalian cells," in DNA CLONING: A PLACTICAL AP PROACH，Volume II，Glover(Ed.)，IRL Press pp．143-190(1985)）、ｈＣＭＶ −ＭＩＥプロモーター−エンハンサー（Bebbington et al.，Bio/Technology 10 : 169-175(1992)）、及び抗体重鎖プロモーター（Orlandi et al.，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 86: 3833-3837(1989)）が含まれる。また、軽鎖発現のための κ鎖エンハンサー及びＩｇＨエンハンサー（Gillies，"Design of Expression V ectors and Mammalian Cell System Suitable for Engineered Antibodies," in ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL GUIDE，C．Borrebaeck(Ed.)，W．H．Free man and Company，pp．139-157(1992)、及び、Orlandiら、前出）も好ましい。 変異抗体をコードする配列及び作動可能に連結されたプロモーターは、非複製 ＤＮＡ分子として真核細胞に導入することができる。この非複製ＤＮＡ分子は、 直線状分子であっても、あるいは、より好ましくは、閉環状分子であってもよい 。そのような分子は自律的な複製が不可能であるため、タンパク質の発現は導入 した配列の一過性発現によって生じ得る。好ましくは、宿主染色体に導入配列を 組込むことにより、恒久的な発現を生じさせる。 好ましくは、この導入配列は、受容宿主中での自律的な複製が可能なプラスミ ドまたはウイルスベクターに組込まれる。幾つかの可能性のあるベクターシステ ムをこの目的に利用することができる。あるクラスのベクターは、自律的に複製 する染色体外プラスミドを供与する、ウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス 、アデノウイルスもしくはＳＶ４０ウイルスのような哺乳動物ウイルス由来のＤ ＮＡ要素を利用する。また、他のクラスのベクターは、宿主染色体への所望のゲ ノムもしくはｃＤＮＡ配列の組込みを頼みとする。ｍＲＮＡの最適な合成には、 さらに他の要素も必要とされる。これらの要素には、転写プロモーター、エンハ ンサー及び終止シグナルに加えて、スプライスシグナルが含まれる。そのような 要素を含むｃＤＮＡ発現ベクターには、Okayama，Mol．Cell．Biol．3: 280(198 3)、前出のSambrookら、前出のAusubelら、前出のBebbingtonら、前出のOrlandi ら、及びFouser et al.，Bio/Technology 10: 1121-1127(1992)、及び、前出のG illiesに記述されるものが含まれる。イントロン配列を含むゲノムＤＮＡ発現ベ クターは、前出のOrlandiらに記述されている。一般には、Lerner et al．(Eds. )，NEW TECHNIQUES IN ANTIBODY GENERATION，Methods 2(2)(1991)も参照のこと 。 完全な抗体を発現する哺乳動物細胞を得るために、変異抗体軽鎖を有する発現 ベクターを抗体重鎖発現ベクターと共に哺乳動物細胞中に同時トランスフェクシ ョンすることができる。例えば、前出のOrlandiらを参照のこと。代わりに、重 鎖発現ベクターを有する哺乳動物細胞に変異抗体軽鎖を含む発現ベクターをトラ ンスフェクションし、また、変異軽鎖を含む発現ベクターを有する哺乳動物細胞 に重鎖発現ベクターをトランスフェクションすることができる。さらに、哺乳動 物細胞に、抗体重鎖をコードするＤＮＡ断片だけでなく変異抗体軽鎖をコードす るＤＮＡ断片を含む単一の発現ベクターをトランスフェクションすることもでき る。例えば、前出のGillies、及び、前出のBebbingtonらを参照のこと。これら の研究方法はいずれも、変異抗体軽鎖を有する完全な抗体分子を発現するトラン スフェ クションされた細胞を生成する。標準的なトランスフェクション技術は当該技術 分野において周知である。例えば、前出のSambrookら、及び、前出のAusubelら を参照のこと。Ｂ．トランスフェクションした細胞からの変異抗体の単離方法 発現ベクターを担持するトランスフェクションされた細胞は、適当な薬剤を用 いて選択する。例えば、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子を有 する発現ベクターを担持するトランスフェクションされた細胞の選択には、Ｇ４ １８を用いることができる。Southern et al.，J．Mol．Appl．Gen．1: 327-341 (1982)。あるいは、ハイグロマイシンＢ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子を有 する発現ベクターを担持するトランスフェクションされた細胞の選択に、ハイグ ロマイシンＢを用いることができる。Palmer et al.，Proc．Natl．Acad．Sci． USA 84: 1055-1059(1987)。あるいは、キサンチン−グアニンホスホリボシルト ランスフェラーゼ遺伝子を有する発現ベクターを担持するトランスフェクション された細胞の選択に、アミノプテリン及びマイコフェノール酸を用いることがで きる。Mulligan et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78: 2072-2076(1981)。 変異抗体を生成するトランスフェクションされた細胞は、様々な方法を用いて 同定することができる。例えば、あらゆる免疫検出検定をそのような「トランス フェクトーマ（transfectomaｓ）」の同定に用いることができる。実施例１は、 そのような目的への酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）の使用を説 明する。 トランスフェクトーマが同定された後、この細胞を培養し、培養上清から抗体 を単離する。単離技術には、プロテインＡセファロースを用いるアフィニティー クロマトグラフィー（完全な抗体用）、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイ オン交換クロマトグラフィーが含まれる。詳細なプロトコルについては、例えば 、Coligan et al．(Eds.)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，John Wiley & S on s(1991)を参照のこと。５．免疫複合体の調製方法 Ａ．抗体断片の調製 本発明は、完全な変異抗体又は抗原結合抗体断片からの免疫複合体の調製を意 図している。抗体断片は、トランスフェクトーマにより生成された完全な変異抗 体のタンパク質分解性開裂により、あるいは、軽鎖の１８〜２０位に天然のアス パラギン結合型の糖鎖形成部位を有する完全な抗体のタンパク質分解性開裂によ り、トランスフェクトーマから得ることができる。 抗体断片は、変異を受けている重鎖構造遺伝子を細胞にトランスフェクション することにより、トランスフェクトーマから直接得ることができる。例えば、Ｃ Ｈ１ドメインの配列に続いて終止コドンが挿入されている場合には、トランスフ ェクトーマはＦａｂ断片を生成するはずである。あるいは、重鎖のヒンジ領域を コードする配列の後に終止コドンが挿入されている場合には、トランスフェクト ーマはＦａｂ’又はＦ（ａｂ’）₂断片を生成するはずである。 代わりに、周知のタンパク質分解技術を用いて、完全な抗体から抗体断片を調 製することができる。例えば、前出のColiganらを参照のこと。説明されるよう に、実施例２ではパパインを用いてＦａｂ断片を得る方法が提供される。さらに 、完全な抗体のペプシンによる消化を用いて、Ｆ（ａｂ’）₂断片を得ることが できる。 通常のジスルフィド結合還元剤、例えばシステイン、ジチオトレイトール（ＤＴ Ｔ）等を用いて、２価の断片を１価の断片に開裂することができる。Ｂ．結合方法 （ｉ）間接的結合 診断もしくは治療成分を完全な抗体、又はそれらの抗原結合断片に間接的に結 合させることにより、免疫複合体を調製することができる。そのような技術は、 Shih et al.，Int．J．Cancer 41: 832-839(1988)、Shih et al.，Int．J．Can cer 46: 1101-1106(1990)、及び、Shihら、米国特許5,057,313号に記述されてい る。一般的な方法は、酸化された炭水化物部分を有する抗体成分を、少なくとも １つの遊離アミン官能基を有し、かつ複数の薬剤、毒素、キレート剤、又はボロ ンアデンド（boron addend）、又は検出可能な標識を担持する担体ポリマーと反 応させることを含む。この反応の結果、最初のシッフ塩基（イミン）結合が生じ る。この結合は、第二アミンに還元して最終複合体を形成することにより安定化 することが可能である。 担体ポリマーは、他の実質的に同等のポリマー担体も使用可能であるとはいえ 、少なくとも５０個のアミノ酸残基を有するアミノデキストランまたはポリペプ チドが好ましい。好ましくは、最終免疫複合体は、診断もしくは治療に使用する ため投与を容易にし、かつ効果的に標的を定めるために、哺乳動物の血清のよう な水溶液に可溶である。したがって、担体ポリマー上の可溶性官能基は最終免疫 複合体の血清溶解性を高める。また、以下に記されるように、可溶性官能基は、 in vitro免疫検定及びin situでの検出のための免疫複合体の使用にも重要であ る。特に、アミノデキストランが好ましい。 アミノデキストラン担体を有する免疫複合体の調製方法は、典型的には、デキ ストランポリマー（約１０，０００〜１００，０００の平均分子量のデキストラ ンが好都合である）を用いて開始される。このデキストランを酸化剤と反応させ て、その炭水化物環部分の制御された酸化を行い、アルデヒド基を生成させる。 この酸化は、通常の手順に従い、ＮａＩＯ₄のような解糖化学剤を用いて都合よ く行われる。 次いで、酸化デキストランをポリアミン、好ましくはジアミン、より好ましく はモノもしくはポリヒドロキシジアミンと反応させる。適切なアミンには、エチ レンジアミン、プロピレンジアミン、もしくは他の同様のポリメチレンジアミン 類、ジエチレントリアミンもしくは同様のポリアミン類、１，３−ジアミノ−２ −ヒドロキシプロパン、もしくは他の同様のヒドロキシル化ジアミン類もしくは ポリアミン類等が含まれる。デキストランのアルデヒド基に対して過剰のアミン は、確実に、アルデヒド官能基をシッフ塩基部へ実質的に完全に変換するために 用いられる。 ＮａＢＨ₄、ＮａＢＨ₃ＣＮ等の還元剤が、得られたシッフ塩基中間体の還元安 定化を行うために用いられる。得られた付加物は、通常のサイズ分別カラムを通 過させて架橋デキストランを除去することにより精製することができる。 アミン官能基を導入するデキストランの誘導体形成の他の通常の方法も用いる ことができ、例えば、臭化シアンと反応させ、次いでジアミンと反応させる。 次に、このアミノデキストランを、活性のある形態として担持しようとする特 定の薬剤、毒素、キレート剤、ボロンアデンド、または標識の誘導体、好ましく はカルボキシル活性化誘導体と反応させて中間付加物を形成する。これらの誘導 体は、通常の手段、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又はそ れらの水溶性変種を用いて調製される。 あるいは、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク又はリシン(ricin)Ａ鎖の ようなポリペプチド毒素とアミノデキストランとを、グルタルアルデヒド縮合に より、又はタンパク質上の活性化されたカルボキシル基とアミノデキストラン上 のアミンとを反応させることにより結合させることができる。 放射性金属又は磁気共鳴エンハンサーに対するキレート剤が、当該技術分野に おいて周知である。１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン四酢酸（ＤＯ ＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、及びジエチレントリアミン五酢 酸（ＤＴＰＡ）の誘導体がその典型である。これらのキレート剤は、典型的に側 鎖上に基を有しており、それによってキレート剤を担体に結合させることができ る。そのような基には、例えば、ベンジルイソチオシアネートが含まれる。ＤＯ ＴＡ、ＤＴＰＡ又はＥＤＴＡは、これによって担体のアミン基と結合することが できる。あるいは、キレート剤のカルボキシル基又はアミン基を、周知の手段で 活性化もしくは予め誘導体形成した後に結合させることにより、担体と結合させ ることができる。 当該技術分野において周知の通常の方法で、酵素、蛍光化合物、電子伝達物質 のような標識を担体に結合することができる。これらの標識担体及びそれらから 調製される免疫複合体は、以下に記述されるように、in vitro免疫検定及びin s ituでの検出に用いることができる。 通常の方法によって、カルボランのようなボロンアデンドを抗体成分に結合さ せることができる。例えば、当該技術分野において周知のように、カルボランは ぶら下がった側鎖のカルボキシル官能基を用いて調製することができる。このよ うなカルボランの担体への結合、例えばアミノデキストランへの結合は、カルボ ランのカルボキシル基を活性化し、担体のアミンと縮合させて中間複合体を生成 することにより達成することができる。次いで、以下に記述されるように、この ような中間複合体を抗体成分に結合させ、治療上有用な免疫複合体を生成させる 。 アミノデキストランの代替物として、ポリアミドアミンデンドリマー（dendri mer）を担体ポリマーとして用いることができる。適切なタイプのデンドリマー 分子は、例えば、Tomalia et al.，Angew．Chem．Int．Engl．29: 138-175(1990 )の方法によって調製することができる。この方法によって調製されるデンドリ マーは、均質なサイズ、形態及び電荷を示し、分子の表面上に既知数の第一アミ ン基を担持する。これらのアミン基の全ては、結合目的に用いることができる。 また、ポリアミドアミンデンドリマーは、生理学的なｐＨの水溶液中でプロトン 化して担体分子に水溶性を付与する第三アミン基も有している。 ポリペプチド担体もアミノデキストランまたはポリアミドアミンデンドリマー の代わりに用いることができるが、ポリペプチド担体は鎖中に少なくとも５０個 のアミノ酸残基、好ましくは１００〜５０００個のアミノ酸残基を有していなけ ればならない。少なくとも幾つかのアミノ酸は、リジン（lysine）残基又はグル タミン酸もしくはアスパラギン酸残基であるべきである。リジン残基のぶら下が ったアミン及びグルタミン、及び、アスパラギン酸のぶら下がったカルボキシレ ートは、薬剤、毒素、キレート剤、又はボロンアデンドの結合に好都合である。 適切なポリペプチド担体の例には、所望の溶解特性を得られる担持担体及び免疫 複合体に付与するための、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸 、それらの共重合体、及びこれらのアミノ酸とその他、例えばセリンとの混合ポ リマーが含まれる。 中間複合体と抗体成分との結合は、抗体成分の炭水化物部分を酸化し、得られ たアルデヒド（及びケトン）のカルボニルを、薬剤、毒素、キレート剤、ボロン アデンド、又は標識を担持した後に担体に残るアミン基と反応させることにより 行われる。代わりに、診断もしくは治療成分を担持させた後に中間複合体に導入 されたアミン基を介して、中間複合体を酸化された抗体成分に結合させることが できる。酸化は、例えばＮａＩＯ₄又は他の解糖試薬を用いて化学的に行うか、 あるいは、例えばノイラミニダーゼ及びガラクトースオキシダーゼを用いて酵素 的に行うかの、いずれかで都合よく行われる。アミノデキストラン担体の場合に は、典型的には、診断もしくは治療成分の担持にアミノデキストランの全てのア ミンが用いられることはない。アミノデキストランの残余のアミンは、酸化され た抗体成分と縮合してシッフ塩基付加物を形成する。このシッフ塩基付加物は、 次いで、通常水素化ホウ素還元剤を用いて還元的に安定化される。 本発明による他の免疫複合体の生成に、類似の手順が用いられる。担体分子と 診断もしくは治療成分との間の化学量論は、担持デンドリマー及びポリペプチド 担体が、抗体成分の酸化炭水化物部分との縮合のための残余の遊離アミン残基を 好ましく有するように調整される。必要であれば、ポリペプチド担体のカルボキ シルを、例えばＤＣＣで活性化して過剰のジアミンと反応させることにより、ア ミンに変換することができる。 最終免疫複合体は、通常の技術、例えばセファクリルＳ−３００（Sephacryl S-300）又は類似のマトリックスでのサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、 精製する。 抗体断片への間接的結合は、実施例４において説明される。 （ii）直接的結合 代わりに、抗体成分を診断もしくは治療成分と直接結合させることにより、免 疫複合体を調製することができる。一般的な手順は、診断もしくは治療成分を酸 化された抗体成分に直接結合させることを除いて、間接的結合法に類似している 。キレート剤の抗体断片への直接的結合が実施例３に説明されている。酸化軽鎖 の炭水化物に結合させることによる免疫複合体の調製の特別な利点は、酸化反応 が診断もしくは治療成分の結合に対する多数の部位を提供することである。軽鎖 炭水化物部分は抗原結合部位を侵害することがないので、この方法は、ポリマー 担体を用いることなく、多数の診断もしくは治療成分を抗体断片に直接結合させ て抗体担持能力を増大させる手段を提供する。これは、荷電中間担体分子の存在 が免疫複合体の好ましからざる薬物動態に関与する状況において有利である。 下記キレート剤の代わりに他の診断もしくは治療成分を用いることが可能であ ることは明らかである。当該技術分野における熟練者は、過度の実験を行うこと なく、結合方法を案出することが可能である。 加えて、当該技術分野における熟練者は、この結合方法の可能性のある多くの 変法を認識するであろう。一例において、血液、リンパ液、又は他の細胞外液中 における完全な抗体、又はそれらの抗原結合断片の薬物動態特性を変えるため、 ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合するのに、炭水化物部分を用いること ができる。これは、放射性免疫診断（ＲＡＩＤ）における放射性金属、特に^99m Ｔｃで標識された抗体断片の使用に特に有利である。 ^99mＴｃは、全ての核医学分野に容易に利用可能であり、また、安価で、患者 に与える放射線量は最小であり、かつ理想的な核造影能力を有しているために、 治療及び診断用途には特に魅力的な放射性同位体である。^99mＴｃの半減期は６ 時間であり、このことはテクネチウム標識抗体には迅速に目標を定めることが要 求されることを意味する。したがって、免疫グロブリン全体よりも迅速に標的を 定められるＦ（ａｂ’）₂及びＦ（ａｂ）₂、特にＦａｂ及びＦａｂ’のような抗 体断片が、Ｔｃ−９９ｍ標識を用いるＲＡＩＤ用途には好ましい。造影へのＴｃ −９９ｍ標識断片の使用の主な欠点は、腎臓における放射活性の比較的高い取り 込みと保持である。これは、この器官の領域における造影の困難性につながる。 Ｔｃ−９９ｍ標識抗体断片にＰＥＧを結合することにより、腎臓取り込みの量及 び断片の保持の著しい低下が生じることが見出されている。米国特許出願08/309 ,313号を参照のこと。この特許出願は、引用することにより、そのまま本明細書 に組込まれる。 ＰＥＧを軽鎖の炭水化物に結合するために、過ヨウ素酸で炭水化物部分を酸化 し、当該技術分野において周知の方法で親核性基を有するＰＥＧ誘導体を結合す ることができる。例えば、ＰＥＧヒドラジド（Shearwater Polymers，Inc.、Hun tsville，AL）を抗体断片と混合することでヒドラゾンが形成される。あるいは 、ＰＥＧ−アミンを酸化炭水化物と反応させてシッフ塩基を形成し、次いで、こ のシッフ塩基を水素化シアノホウ素ナトリウムで処理することにより還元して安 定な第二アミン結合を形成することができる。Ｆａｂ抗体断片へのＰＥＧの結合 が、実施例８に説明されている。 好ましい態様においては、一度抗体断片がＰＥＧに結合すると、それを制御さ れた条件下で還元剤を用いて処理して、この断片をＴｃ−９９ｍで直接標識する ことを可能にする遊離チオール基を生成させることができる。抗体断片の制御還 元の方法は、当該技術分野の熟練者には周知である。例えば、米国特許5,128,11 9号を参照のこと。この米国特許は、引用することによりそのまま本明細書に組 込まれる。他の好ましい態様においては、トラウト試薬（Traut's reagent）又 は米国特許出願08/253,772号に記述されるようなチオール化剤と反応させること により、ＰＥＧ結合抗体断片に非部位特異的に遊離チオール基を生成させ、次い でＴｃ−９９ｍで直接標識することができる。 別の態様においては、アミンが末端に存在する二官能性キレート剤（ＢＦＣ） を抗体又は抗体断片の酸化軽鎖の炭水化物に結合させる。これらの二官能性試薬 は、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、¹¹¹Ａｇ、及び⁶⁷Ｃｕのような放射性金属を強固に結合 するのにふさわしく配置されているぶら下がったチオール及びアミン基を有して いる。ＢＦＣの抗体への結合は、ＢＦＣのアミン又はヒドラジン官能基によって 達成される。そのアミン又はヒドラジン官能基は、それぞれ、酸化炭水化物のア ルデヒド官能基とイミン又はヒドラゾン結合を形成することができる。イミン結 合は、水素化シアノホウ素ナトリウムのような還元剤を用いる反応により安定化 することができる。結合工程の間、キレート剤部分のチオール基をチオールエス テルもしくはジスルフィドとしてマスクし、複合体が調製された後、脱保護する 。 ＢＦＣ類は、下記一般構造Ｉａ、Ｉｂ、及びＩｃで記述することができる。 一般構造Ｉａにおいて、ＸはＣＨであるか、あるいはＸとＺが一緒になってＣ Ｏであってもよい。ＹはＣＲ₄Ｒ₅、ＣＨ₂ＣＲ₄Ｒ₅又は（ＣＨ₂）₂ＣＲ₄Ｒ₅（こ こで、Ｒ₄及びＲ₅は同じであるか、もしくは異なっており、かつ水素、アルキル 、置換アルキル、アリール又は置換アリール基からなる群より選択される）であ る。Ｚはタンパク質の酸化炭水化物部分と反応し、及び／又は配位することが可 能な任意の基でよく、あるいはＺはＨであってもよい。Ｒ₁はタンパク質の免疫 反応性を大きく低下させることのない条件下で除去することが可能なチオール保 護基である。Ｒ₂及びＲ₃は同じであっても異なっていてもよく、各々、アシル基 もしくは置換アシル基、又は水素、アルキル、アリール、置換アルキル、もしく は置換アリールを表し、ここでアルキル又はアリール基の置換基はスルフヒドリ ル基（sulfhydryl、メルカプト基）、アミン及びカルボン酸又はそれらの保護誘 導体からなる群より選択される金属配位基である。また、Ｒ₂及びＲ₃はタンパク 質の酸化炭水化物部分と反応し、及び／又は配位することが可能な任意の基でよ い。 式（II）において、ＤはＨ又はＣＨ₂ＳＲ₁である。Ｅはタンパク質の酸化炭水 化物部分と反応し、及び／又は配位することが可能な任意の基でよい。Ｒ₁はタ ンパク質の免疫反応性を大きく低下させることのない条件下で除去することが可 能なチオール保護基である。ｍは０、Ｉ、２、又は３である。 式（III）において、Ｑはタンパク質の酸化炭水化物部分と反応し、及び／又 は配位することが可能な任意の基でよい。Ｒ₁はタンパク質の免疫反応性を大き く低下させることのない条件下で除去することが可能なチオール保護基である。 各々のｎは独立に２又は３である。 Ｉａ、Ｉｂ及びＩｃの代表例を以下に示す。これらの幾つかにおいては、抗体 結合基がヒドラジドとして示されているが、これに限定されるものではない。チ オール脱保護複合体には金属配位が関与するが、チオール脱保護構造のみが示さ れている（アシル、ベンゾイル又は２−チオピリジルである「Ｒ」を有する）。 ＢＦＣ類の合成は、当該技術分野において周知の方法で達成することができる。 幾つかのＢＦＣ類の代表的な合成及び結合方法を実施例９〜１４に示す。 ＢＦＣにおいて用いられるチオール保護基は、穏やかな条件下で容易に除去さ れ、タンパク質の活性を実質的に変えることなく、タンパク質の存在下で遊離の スルフヒドリル基を生成する任意の有機基もしくは無機基でもよい。適切な保護 基の例には、チオールエステル類、チオカルバメート類及びジスルフィド類が含 まれる。好ましい態様においては、チオール保護基は安息香酸チオエステルであ る。当該技術分野の熟練者は、チオール基の保護及び脱保護の手順を熟知してい る。例えば、安息香酸チオエステルは、ヒドロキシルアミンを用いる温和かつ選 択的な条件下で脱保護することができる。しかしながら、アミンがヒドラジドで ある場合には、チオール基は、最も好ましくは、例えば２−ピリジルチオ基のよ うな「Ｒ」官能基とのジスルフィドとして保護される。 本発明の別の態様においては、抗体の予備標的設定（pretargeting）のための 結合基に酸化炭水化物を用いることができる。モノクローナル抗体の予備標的設 定は、抗体ベースの作用物質における抗体の標的を設定する工程と放射性診断剤 を送達する工程及び放射性治療剤を送達する工程との「分離」に有用である。標 的での抗体の高い取り込みを維持しつつ、循環する放射性同位体の量を減少させ ることにより、血液及び造血組織の被爆放射線量を低下させ、かつ放射性同位体 の標的：非標的比をより高くすることが可能である。予備標的設定実験の典型的 な例は、前局所化（prelocalization）工程において抗体−アビジン（又は抗体 −ストレプトアビジン）複合体を用い、次いでビオチン基に結合した同位体を送 達するか、又は、前局所化工程において抗体−ビオチン複合体を用い、次いでア ビジン（又はストレプトアビジン）基に結合した同位体を送達する、又は、前局 所化工程において抗体−ビオチン複合体を用い、次いでアビジン（又はストレプ トアビジン）基を送達し、さらに続いてビオチン基に結合した同位体を送達する ことである。二次標的設定担体としての類似の使用法を見出すことができる他の 作用物質の対は、例えば、一本鎖核酸の２つの相補的な配列、酵素とその特異的 な基質、又はタンパク質とその特異的なリガンド、例えば内性因子とビタミンB1 2、である。 米国特許出願08/051,144号に記述されているように、さらなる標的設定工程を 行うこともでき、１種以上の放射性標識種を用いることも可能である。この米国 特許出願は、引用することによりそのまま本明細書に組込まれる。抗体標的部位 における治療剤の量をより高める他の実験には、例えば、抗体−アビジン（ビオ チン）で予備標的設定された標的に向けられる、後工程における同位体送達担体 としての抗体−ビオチン（アビジン）−放射性同位体複合体を組込むことが含ま れる。この例において、抗体−ビオチン（アビジン）−放射性同位体複合体は、 標的とすることができる２つの部位、すなわち、抗原及びアビジン（ビオチン） を有する。例えば、米国特許出願０８／０６２，６６２号を参照のこと。この特 許出願は、引用することにより本明細書にそのまま組込まれる。 抗体断片に軽鎖の炭水化物が存在することにより、Ｆ（ａｂ’）₂のような抗 体断片への適切な予備標的設定試薬の結合の部位特異性が許容される。加えて、 遊離チオール基を有するＦａｂ’断片の場合には、炭水化物及びチオール官能基 が存在することにより、各々個別の化学特性を有していてもよい２つの異なる基 の部位特異的な結合が許容される。 予備標的設定結合（下線）を調製する方法の例を以下に示す。 （アビジン−チオール）と（マレイミド−Ｌ−ヒドラジン）とで（アビジン−Ｌ −ヒドラジド）を形成する ２（アビジン−Ｌ−ヒドラジド）と（ＣＨＯ−Ｆａｂ’−Ｓ−Ｓ−Ｆａｂ’−Ｃ ＨＯ）とで（アビジン）₂−Ｆ（ａｂ’）₂ を形成する （アビジン）₂−Ｆ（ａｂ’）₂を２−メルカプトエタノールで還元して２×アビ ジン−Ｆａｂ’−ＳＨを 形成する アビジンと（スクシンイミド−Ｌ−マレイミド）とで（アビジン−Ｌ−マレイミ ド）を形成する （アビジン−Ｌ−マレイミド）と（アビジン−Ｆａｂ’−ＳＨ）とで（アビジン ）₂−Ｆａｂ’ を形成する （アビジン−ＣＨＯ）と（ヒドラジド−Ｌ−ヒドラジド）とで（アビジン−Ｌ− ヒドラジド）を形成する ２（アビジン−Ｌ−ヒドラジド）と（ＣＨＯ−Ｆａｂ’−Ｓ−Ｓ−Ｆａｂ’−Ｃ ＨＯ）とで（アビジン）₂−Ｆ（ａｂ’）₂ を形成する （アビジン）₂−Ｆ（ａｂ’）₂を２−メルカプトエタノールで還元して２（アビ ジン−Ｆａｂ’−ＳＨ） を形成する アビジン−Ｆａｂ’−ＳＨと（アビジン−マレイミド）とで（アビジン）₂−Ｆ ａｂ’ を形成する ｎ（ビオチン−Ｌ−ヒドラジド）と（ＣＨＯ−Ｆａｂ’−Ｓ−Ｓ−Ｆａｂ’−Ｃ ＨＯ）とで（ビオチン）₂−Ｆ（ａｂ’）₂ を形成する ここで、ｎは通常１ないし約３０の整数であり、Ｌはリンカー、炭化水素、アル キル、アシル又は、２つの個別の反応性官能基に分離し、かつ市販のタンパク架 橋剤を含む組合せを表す。上記例におけるアビジンの代わりにストレプトアビジ ンを用いることもできる。指示された場合に、それぞれ、過ヨウ素酸ナトリウム 及び２−メルカプトエタノールのような標準的な試薬で還元して遊離チオールを 生成するアルデヒド結合及びジスルフィド結合は、炭水化物部分を酸化して生成 させることができる。チオール基は、２−イミノチオランのような周知のチオー ル化剤を用いてアビジンに導入することができる。アビジン（ストレプトアビジ ン）−Ｆａｂ’複合体の遊離チオール基は、それらを使用する前に、例えばヨー ドアセトアミドを用いて任意にブロックすることができる。あるいは、遊離のチ オール基は、さらなる修飾のための反応性基として用いることができる。このさ らなる修飾は、例えば、Ｔｃ−９９ｍでの放射標識、又は、続いて遊離のチオー ル基と結合するためにマレイミド反応により活性化されたポリ（エチレングリコ ール）（ＰＥＧ）誘導体のような作用物質との結合によるものである。 Ｆ（ａｂ’）₂ベースのストレプトアビジン／アビジン複合体は、２つの非立 体化学的に妥協された抗原結合部位及び８つのビオチン結合部位の全てを保持し ており、一価のＦａｂ’単位は、保持する全てのビオチン結合能力をもって１つ の Ｆａｂ’当たり１つもしくは２つのストレプトアビジン／アビジンを担持してい る。炭水化物を使用することは、断片の抗原結合能力を阻害することなく、酸化 炭水化物を介して、幾つかのビオチン単位を各断片分子に結合させることができ ることを意味する。 本発明の別の態様においては、浄化２次抗体（clearing second antibody）が 抗イディオタイプ抗体である場合に、抗原結合部位から離れた軽鎖の炭水化物へ の結合によって、続いて投与されるこの２次抗体の結合の干渉が確実に生じない ようにする。この場合、２次抗体はその抗原結合部位を介して循環する抗体に結 合し、標的設定抗体は肝臓によって除去される。このシステムの使用には、浄化 工程の間、ブロックされる標的設定抗体の二次部位（例えば、アビジン又はビオ チン）がないという利点がある。 本発明の別の態様においては、放射性核種を有するキレート剤を、代謝性結合 によって酸化軽鎖炭水化物に結合させることができる。放射性治療及び放射性診 断用途において抗体断片を使用することでしばしば遭遇する問題は、腎臓に放射 標識抗体断片が潜在的な危険性をもって蓄積することである。酸もしくは塩基不 安定性リンカーを用いて複合体が形成されている場合には、抗体からの放射性キ レートの開裂が都合よく起こり得る。このキレートが比較的低分子量のものであ る場合には、これは腎臓に止まらずに尿中に排出され、それ故に腎臓が放射活性 に晒されることが少なくなる。 この用途に適した低分子量キレート類には、例えば、上記二官能性キレート類 、及びＤＯＴＡ又はＤＴＰＡタイプのキレート類が含まれる。これらの分子の各 々を当該技術分野に周知の標準的な法で修飾して、抗体断片の酸化炭水化物のカ ルボニル基と酸不安定性結合を形成する反応性官能基を提供することが可能であ る。適切な酸不安定性結合には、ヒドラゾン及びチオセミカルバゾン官能基が含 まれる。これらは、酸化炭水化物を、それぞれヒドラジド、チオセミカルバジド 、及 びチオカルバジド官能基を有するキレート類と反応させることにより形成される 。ＤＴＰＡのチオカルバジド誘導体の調製及び結合が実施例１５に示されている 。 代わりに、腎臓からの二官能性キレート−⁹⁹Ｔｃ−標識断片の高度な浄化に用 いられている塩基開裂性リンカーを用いることができる。例えば、Weber et al. ，Bioconjug．Chem．1: 431(1990)を参照のこと。ヒドラジン結合によって二官 能性キレートを軽鎖の炭水化物に結合させることにより、塩基感応性エステル基 をリンカーのスペーサーアームに組込むことができる。そのようなエステル保有 リンカー単位は、２つの１，４−ジブチル酸単位の２つの末端Ｎ−ヒドロキシス クシンイミド（ＮＨＳ）エステル誘導体を有し、その各々が２つのアルキルエス テルによって単一のエチレングリコール基に結合しているエチレングリコールビ ス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ、Pierce Chemical Co.，Rockfor d，ILより入手）によって例示される。ＮＨＳエステルの一方を、他方のＮＨＳ エステルを制限量のヒドラジンと反応させる一方で、適切なアミン含有ＢＦＣ（ 例えば、２−アミノベンジルＤＴＰＡ）に置換することができる。得られたヒド ラジドは、２つのアルキルエステル官能基を有する抗体−ＢＦＣ結合を形成する 、抗体又は抗体断片の軽鎖の炭水化物との結合に用いられる。このような複合体 は生理学的ｐＨでは安定であるが、塩基性ｐＨでは容易に開裂する。 本発明の別の態様においては、診断もしくは治療成分を炭水化物部分及び遊離 のスルフヒドリル基に結合させることにより、「二価免疫複合体」を構築するこ とが可能である。このような遊離のスルフヒドリル基は、抗体成分のヒンジ領域 に位置すればよい。６．免疫複合体の診断及び治療への使用 Ａ．免疫複合体の診断への使用 放射標識モノクローナル抗体を用いる診断造影法は周知である。例えば、Sriv astava(ed.)，RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING AND THERAPY ， Plenum Press(1988)、Chase，"Medical Applications of Radioisotopes," in R EMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，18th Edition，Gennaro et al．(eds.) ，Mack Publishing Co.，pp．624-652(1990)、及び、Brown，"Clinical Use of Monoclonal Antibodies," in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY，Pezzuto et al．(e ds.)，Chapman & Hall，pp．227-249(1993)を参照のこと。イムノシンチグラフ ィーとしても知られるこの技術は、ガンマカメラを用いて、モノクローナル抗体 に結合するガンマ線放出放射線同位体の位置を検出する。診断造影は、心血管疾 患及び感染性疾患の診断に用いることができる。前出のBrown参照。 本発明は、心血管疾患の診断への免疫複合体の使用を意図している。例えば、 抗ミオシン断片を有する免疫複合体を、急性心筋梗塞に関連する心筋壊死の造影 に用いることができる。血小板及びフィブリンに結合する抗体断片を有する免疫 複合体を、深静脈血栓症の造影に用いることができる。さらに、活性化血小板に 結合する抗体断片を有する免疫複合体を、アテローム硬化性プラークの造影に用 いることができる。 また、本発明の免疫複合体は、感染性疾患の診断に用いることもできる。例え ば、特定の細菌抗原に結合する抗体断片を有する免疫複合体を、菌塊の位置を確 定するのに用いることができる。加えて、顆粒細胞及び炎症白血球に結合する抗 体断片を有する免疫複合体を、細菌感染部位の位置を確定するのに用いることが できる。 多くの研究が、ガンのシンチグラフ検出へのモノクローナル抗体の使用を評価 している。例えば、前出のBrown及びその参考文献を参照のこと。調査は、主要 なタイプの固形腫瘍、例えば、ミエローマ、結腸直腸ガン、卵巣ガン、乳ガン、 肉腫、及び肺ガンをカバーしている。したがって、本発明は、腫瘍マーカーに結 合してガンを検出する抗体断片を含む免疫複合体を用いる、ガンの検出を意図し ている。そのような腫瘍マーカーには、ガン胎児性抗原、αフェトプロテイン、 が ん遺伝子生成物、腫瘍関連細胞表面抗原、及び壊死関連細胞内抗原が含まれる。 診断に加えて、モノクローナル抗体造影は、治療応答の監視、疾患の再発の検 出、及び次の臨床判断の指針に用いることができる。 診断造影に対しては、介在官能基を用いることにより、放射性同位体を直接的 もしくは間接的に抗体断片に結合することができる。そのような介在官能基には 、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ及びＤＥＴＡが含まれる。患者に送達される放射線量は、 できる限り低レベルに維持される。これは、最小の半減期、体内における最低限 の保持、及び検出と正確な測定とを可能にする最低量の同位体の組合せについて 同位体を選択することにより達成される。抗体に結合することが可能であり、か つ診断造影に適切な放射性同位体の例には、^99mＴｃ及び¹¹¹Ｉｎが含まれる。 抗体断片、特にＦａｂ及びＦａｂ’、により有利な腫瘍／バックグランド比が 得られることが研究により示されている。前出のBrown参照。したがって、免疫 複合体の調製にＦａｂ及びＦａｂ’抗体断片を用いることは、本発明の好ましい 態様である。しかしながら、Ｆ（ａｂ）₂又はＦ（ａｂ’）₂を用いた場合、二価 を有することが、標的での抗体の絶対量が一価の断片よりも多いことにつながり 、幾つかの組織においてはより良好な標的：非標的比につながることがある。 また、本発明において有用な免疫複合体は、生体内診断のために常磁性イオン で標識することもできる。磁気共鳴造影に特に有用な元素には、Ｇｄ^III、Ｍｎ 、Ｄｙ、及びＦｅイオンが含まれる。 本発明の一態様においては、ＤＴＰＡのような多重キレート分子を抗体断片の 酸化軽鎖炭水化物に直接結合させ、中間担体を必要とすることなく多量の常磁性 イオンをキレート化することを可能にしている。幾つかのタイプの中間担体の使 用が、金属キレートを用いてなされた磁気共鳴造影の結果に有害な作用を及ぼす ことが観察されている。例えば、Wiener et al.，Magnetic Resonance in Medic ine 31: 1-8(1994)を参照のこと。したがって、このような方法でのキレートの 直接的結合は、そのような問題を排除する。 本発明の別の態様においては、ＤＴＰＡのようなキレート基を結合させるため の中間担体としてポリアミドアミンデンドリマーが免疫複合体に用いられる。こ のようなデンドリマーは、磁気共鳴造影のための常磁性イオンの担体として使用 するにあたり、他の分子を凌駕する幾つかの利点を有していることが示されてい る。例えば、前出のWienerらを参照のこと。 また、本発明は、in vitroにおける特定の抗原の存在の検出への免疫複合体の 使用をも意図している。そのような免疫検定においては、免疫複合体を液相で、 又は固相担体に結合させて用いることができる。例えば、抗体成分をポリマー被 覆ビーズ、プレート又はチューブのような不溶性支持体に結合させるために、完 全な抗体、又はそれらの抗原結合断片をアミノデキストランのようなポリマーに 結合させることができる。 あるいは、本発明の免疫複合体を、組織学的標本から調製される組織切片にお ける特定抗原の存在の検出に用いることができる。このようなin situでの検出 は、検出可能に標識された免疫複合体を組織切片に使うことにより行うことがで きる。in situでの検出は、特定抗原の存在の決定及び被検組織における抗原分 布の決定に用いることができる。in situでの検出の一般的な技術は熟練者には 周知である。例えば、Ponder，"Cell Marking Techniques and Their Applicati on," in MAMMALIAN DEVELOPMENT: A PRACTICAL APPROACH，Monk(ed.)，IRL Pre ss，pp．115-138(1987)、及び、前出のColiganらを参照のこと。 酵素、蛍光化合物、電子伝達作用物質等の検出可能な標識は、当該技術分野に おいて周知の通常の方法によって担体に結合させることができる。これらの標識 担体及びそれらから調製される免疫複合体は、標識を抗体に直接結合させること により調製される抗体複合体と同様に、in vitro免疫検定及びin situ検出に用 いることができる。しかしながら、本発明による免疫複合体に複数の標識を担持 さ せることにより、標的抗原への抗体又は抗体断片の結合が低い程度にしか達成さ れない場合に、免疫検体又は組織学的方法の感応性を増大させることができる。Ｂ．免疫複合体の治療への使用 免疫複合体は、ウイルス性及び細菌性感染疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、 及びガンの治療に用いることができる。前出のBrown参照。そのような治療の目 的は、非標的組織への暴露を最小限に止めつつ、細胞毒性用量の放射活性、毒素 又は薬剤を標的細胞に送達することである。 上に論じられているように、放射性同位体のを、キレート剤によって、直接的 もしくは間接的に完全な抗体、又はそれらの抗原結合断片に結合させることがで きる。例えば、その６１．５時間という半減期並びにベータ粒子及びガンマ線の 多量の供給量により放射免疫治療により有望な放射性同位体の一つと考えられる⁶⁷ Ｃｕを、キレート剤であるｐ−ブロモアセトアミドベンジルテトラエチルアミ ン四酢酸（ＴＥＴＡ）を用いて抗体に結合させることができる。前出のChase参 照。あるいは、活発なベータ粒子を放出する⁹⁰Ｙを、本明細書に記述されるよう に、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、又はより好ましくは、テトラア ザシクロドデカン四酢酸（ＤＯＴＡ）を用いて抗体、又はそれらの抗原結合断片 に結合させることができる。 複数分子のキレート剤の直接的結合に抗体断片の軽鎖炭水化物部分を用いるこ とにより、ＤＯＴＡを⁹⁰Ｙのキレート剤として使用することに関連する問題の魅 力的かつ潜在的な解決が提示される。ＤＯＴＡは、⁹⁰Ｙ−ＤＯＴＡ錯体の高い結 合定数及び非常に遅い解離速度によって、⁹⁰Ｙの好ましいキレート剤であること が示されている。例えば、Camera et al.，J．Nucl．Med．35: 882-888(1994)を 参照のこと。しかしながら、金属結合の非常に遅い動態により、ＤＯＴＡ免疫複 合体の⁹⁰Ｙ標識において高い組込みを達成することは困難である。例えば、Wu e t al.，Bioorg．Med．Chem．Lett．4: 449-454(1994)を参照のこと。前出のWuら は、最近、非部位特異的な方法で１０〜１１のＤＯＴＡ分子を完全な抗体に結合 させるのにポリアミドアミンデンドリマー中間物を使用することを記述しており 、これが⁹⁰Ｙ配位の速度を増加させて複合体の特異活性を許容し得るレベルまで 上昇させたことを示している。本発明においては、同様に多数のＤＯＴＡ分子を 抗体断片の軽鎖の炭水化物に直接結合させることが可能であり、これが⁹⁰Ｙ配位 の速度を増加させ、中間複合体を用いることなく高い取り込み量の複合体を調製 することを可能にしている。加えて、両タイプの炭水化物を有するＩｇＧについ ては、軽鎖の炭水化物を重鎖の炭水化物と一緒にハプテン担持の部位として用い 、それにより免疫複合体のハプテン保持能力を増大させることができる。 代わりに、Wuらによって用いられたものに類似するデンドリマーを中間担体と して用いて、さらに多数のＤＯＴＡ分子の結合及び免疫複合体における⁹⁰Ｙのよ り高い取り込みの達成を可能にすることができる。Wuらは、非部位特異的な結合 法を用いて、抗体に対するデンドリマーの僅かに1：1の比を達成した。本発明に おいては、その全てが潜在的な結合部位である軽鎖の炭水化物の多数の糖残基が 存在することにより、1よりも大きな担体：抗体比が可能となる。さらに、炭水 化物は抗原結合部位を侵害することがないので、免疫複合体の免疫反応性が大き く低下することはない。 代わりに、カルボランのようなボロンアデンドを完全な抗体、又はそれらの抗 原結合断片に結合させることができる。カルボランは、当該技術分野において周 知のように、ぶら下がった側鎖のカルボキシル官能基を用いて調製することがで きる。アミノデキストランのような担体へのカルボランの結合は、カルボランの カルボキシル基を活性化し、担体のアミンと縮合させることにより達成すること ができる。次いで、この中間複合体を抗体成分と結合させる。免疫複合体を投与 した後、熱中性子照射によりボロンアデンドを活性化し、α放射によって減衰す る放射性原子に変換して、強毒性の射程の短い作用を生じさせる。 さらに、治療成分が毒素又は薬剤である免疫複合体を調製することができる。 そのような免疫複合体の調製に有用な毒素には、リシン（ricin）、アブリン、 アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン（gelonin）、ジフテリン （diphtherin）毒素、及びシュードモナス(Pseudomonas)菌体内毒素が含まれる 。免疫複合体の調製に有用な化学療法剤には、ドキソルビシン（doxorubicin） 、ダウノルビシン、メトトレキセート、メルファリン（melphalin）、クロラム ブシル、ビンカアルカロイド、５−フルオロウリジン、及びミトマイシンＣが含 まれる。Ｃ．免疫複合体の投与 一般に、投与される免疫複合体の量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般 的な健康状態、及び以前の病歴のような因子に大きく依存する。より少量もしく はより多量を投与することもできるが、典型的には、約１ｐｇ／ｋｇないし１０ ｍｇ／ｋｇ（作用物質量／患者の体重）の範囲にある投与量の免疫複合体を投与 される者に与えることが望ましい。例えば、多くの研究は０．１ないし１．０ｍ ｇの用量で診断造影がうまく行えることを示しているが、他の研究では１０ｍｇ を超える用量で局在化が改良されることが示されている。前出のBrown参照。 治療用途に対しては、通常、数日の期間毎日、約１０〜２００ｍｇの免疫複合 体が投与される。患者の感受性を低下させるために、他の種に由来する抗体及び ／又は低アレルゲン性抗体、例えばハイブリッドヒトもしくは霊長類抗体の投与 量及び／又は使用を減らすことが必要になることもある。 患者への免疫複合体の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜 腔内、くも膜下投与であってもよく、あるいは局所カテーテルを介する潅流によ るもの、又は病変内への直接注入によるものであってもよい。免疫複合体を注入 により投与する場合には、連続注入によるものであっても、又は単一もしくは複 数の巨丸剤によるものであってもよい。 熱中間子活性化療法のためのボロンアデンド標識担体の免疫複合体は、通常、 同様の方法で実施される。しかしながら、中間子照射を行う前に、標的を失った 抗体が排除されるまで待機するのが有利である。例えば、米国特許4,624,846号 により周知のように、２次抗体を使用することにより、そのような排除を促進す ることができる。 本発明の免疫複合体は、周知の方法に従って薬学的に有用な組成物を処方する ことが可能である。これにより、混合物中で、免疫複合体は薬学的に許容し得る 担体と組み合わせられる。組成物は、その投与が受容患者に寛容される場合に、 「薬学的に許容される担体」であると言われる。無菌のリン酸緩衝生理食塩水が 薬学的に許容し得る担体の一例である。他の適切な担体は、当該技術者に周知で ある。例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，18th Ed．(1990)を参照 のこと。 免疫治療のために、治療上有効な量の免疫複合体及び薬学的に許容し得る担体 を、患者に投与する。投与される量が生理学的に重要である場合に、免疫複合体 と薬学的に許容し得る担体との組合せが「治療上有効な量」投与されると言われ る。ある作用物質の存在が受容患者の生理状態に検出可能な変化を生じる結果と なる場合、その作用物質は生理学的に重要である。 治療用途における免疫複合体の作用の遅延を制御するために、さらなる薬学的 な方法を用いることができる。ポリマーを免疫複合体の結合又は吸着に用いるこ とにより、遅放調製品を調製することができる。例えば、生体適合性ポリマー類 には、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセテート）のマトリックス及びステアリ ン酸二量体とセバチン酸とのポリ無水共重合体のマトリックスが含まれる。Sher wood et al.，Bio/Technology 10: 1446-1449(1992)参照。そのようなマトリッ クスからの免疫複合体の放出速度は、免疫複合体の分子量、マトリックス中の免 疫複合体の量、及び分散粒子のサイズに依存する。Saltzman et al.，Biophysic al．J．55: 163-171(1989)、及び、前出のSherwoodら。他の固形投与形態は、R EMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，18th Ed．(1990)に記述されている。 本発明を一般的に説明したが、同様のことは以下の実施例を参照することによ ってより容易に理解されるであろう。これらの実施例は、説明のために提示され るものであって、特に断らない限り、本発明を限定することを意図するものでは ない。 実施例 １ 軽鎖可変ドメインのＦＲ１領域における天然のアスパラギン型糖鎖形成部位を 欠くモノクローナル抗体を用いる免疫複合体の調製 （ａ）変異誘発によるアスパラギン型糖鎖形成部位の導入 アスパラギン型糖鎖形成部位は、モノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインＦＲ １領域の１８位アミノ酸に、アミノ酸残基１８〜２０をコードするヌクレオチド 配列を改変することにより導入される。説明として、ＭＰＣ−１１細胞によって 産生されるマウスモノクローナル抗体であるＰＫＡＰＰＡ（１１）２４の軽鎖可 変領域のフレームワーク−１配列に、アミノ酸配列Ａｒｇ₁₈Ｖａｌ₁₉Ｓｅｒ₂₀が 見出されている。Rabbitts et al.，Can．J．Biochem．58: 176-187(1980)、及 び、Kabat et al.，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，U．S ．Department of Health and Human Services(1993)。１８位のアルギニン（Ａ ｒｇ）残基は、配列ＡＧＧによってコードされている。同上。したがって、変異 誘発技術の目的は、ヌクレオチド配列をＡＧＧから、アスパラギン（Ａｓｎ）を コードするＡＡＣに改変することである。 アスパラギン型糖鎖形成部位の導入に、Orlandi et al.，Proc Natl．Acad． Sci．USA 86: 3833-3837(1989)の一般的な手順に従って、ポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）が用いられる。この手順においては、標準的な手順を用いて、約５× １０⁸個のＭＰＣ−１１細胞から全細胞ＲＮＡを調製し、オリゴ（ｄＴ）−セル ロースで全ＲＮＡからｍＲＮＡを選択する。Orlandiらによって記述されるＶＫ 領域 ３’プライマーであるＶＫ１ＦＯＲプライマーを用いて、第１鎖ｃＤＮＡの合成 を行う。１０μｇのｍＲＮＡ、２０ピコモルのＶＫ１ＦＯＲプライマー、２５０ μＭの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭのジチオトレイトール、１００ｍＭのトリス−ＨＣ ｌ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、及び１４０ｍＭのＫＣｌを含有する ５０μｌの反応混合液を、７２℃で１０分間保温した後、冷ました。逆転写酵素 （４６単位）を加え、反応混合液を４２℃で１時間保温する。この反応を、反応 溶液を９０℃で５分間加熱することにより終了させる。 あるいは、SUPERSCRIPU^TM予備増幅システム（Gibco/BRL; Gaithersburg，MD） を用いて、ＭＰＣ−１１細胞由来の全細胞ＲＮＡから第１鎖ｃＤＮＡをＶＫ１Ｆ ＯＲプライマーで合成する。 アミノ酸１８〜２０がアスパラギン型糖鎖形成部位をコードすることを除いて 、ＶＫドメインの最初の２０個のアミノ酸をコードする５’プライマーを用いて 、ＶＫ配列を増幅させる。この実施例において、１８位のアミノ酸残基は、上に 論じられるように、ＡＡＣによってコードされる。ＰＣＲ反応混合液は、１０μ ｇの第１鎖ｃＤＮＡ生成物、９μｌの１０×ＰＣＲバッファー（５００ｍＭのＫ Ｃｌ、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭのＭｇＣｌ₂、及 び０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン）、５μｌのＶＫ１ＦＯＲ及び５’プライマ ー、並びに５単位のAMPLITAQ^TM ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus; No rwalk，CA）を含む。この混合液にパラフィン油をかぶせ、プログラム可能な加 熱ブロックで温度サイクルを３０回施す。典型的なサイクルは、９４℃で１分間 の変性、５０℃で１．５分間のアニーリング、及び７２℃で１．５分間の重合か らなる。 ＤＮＡサンプルを、エーテルで２回、フェノールで１回、フェノール／クロロ ホルムで１回抽出した後、エタノールで沈殿させる。あるいは、その後のアガロ ースゲルでの電気泳動でＤＮＡサンプルを精製することもできる。 増幅したＶＫ断片を、標準的な技術を用いて、２％アガロースゲルで精製する 。 次いで、約３００塩基対のＶＫ断片を制限酵素ＰｖｕII及びＢｇｌIIで消化し、 クローニングベクターの相補的な制限部位に結合させる。様々なクローニングベ クターが市販されている。例えば、ｐＧＥＭ^TMベクター（Promega; Madison，WI ）及びＺＡＰ ＥＸＰＲＥＳＳ^TMベクター（Stratagene Cloning Systems; La J olla，CA）がＶＫ断片のクローニングに有用である。あるいは、適切な免疫グロ ブリンプロモーター及びリーダー配列を有するベクターを用いることができる。 例えば、前出のOrkandiらを参照のこと。結合したＤＮＡを、標準的な塩化カル シウム法を用いて、ＤＨ５αコンピテント大腸菌細胞に形質転換する。 クローン化ＤＮＡを分析するため、ＳＯＣ（２％バクト−トリプトン（Bacto- tryptone）、０．５％のバクト−イースト(Bacto-yeast)抽出物、１０ｍＭのＮ ａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのＭｇＳＯ₄及び ２０ｍＭのグルコース）中において、３７℃で一晩、形質転換体を増殖させる。 ＳＯＣ培地には、前記ベクターを含む細菌の増殖を選択するための適切な抗生物 質が含まれている。例えば、ＳＯＣ培地は、ｐＧＥＭ^TMベクターを担持する細菌 の増殖を選択するため、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有している。標準的な 技術を用いてコロニーのミニプラスミドＤＮＡ調製品を調製し、制限消化分析に 処する。Sanger et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 75: 5463-5467(1977)の ジデオキシ法を用いて、陽性コロニーからのＤＮＡの配列決定を行う。ＤＮＡ配 列決定の結果を用いて、望ましからざる変異がＰＣＲによって導入されてはおら ず、かつ１８〜２０領域に変異（複数）が導入されていることを確認する。（ｂ）哺乳動物細胞のトランスフェクション 制限酵素を用いて、ステージングベクター（staging vector）から、１８位に アスパラギン型糖鎖形成部位を有するＶＫ配列を含むＤＮＡ断片を切出す。次い で、このＤＮＡ断片を、適切な哺乳動物発現ベクターにクローニングする。その ような発現ベクターには、定常領域、免疫グロブリンエンハンサー、κエンハン サー及び薬剤選択マーカー（例えば、ハイグロマイシン（hygromycin）耐性遺伝 子を含むコード配列）が含まれているべきである。例えば、前出のOrlandiらを 参照のこと。 変異ＶＫ領域を有する直線状にした軽鎖発現ベクター約１０μｇ及び直線状に した重鎖発現ベクター２０〜３０μｇを、標準的な技術を用いて、エレクトロポ レーションにより哺乳動物細胞に同時トランスフェクションする。例えば、Co e t al.，J．Immunol．148: 1149-1154(1992)の技術を用いて、あるいは、前出のS ambrookら、もしくはCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Ausubel et al .，eds.，John Wiley & Sons(1989)のいずれかに記載される類似の技術を用いて 、約１０⁶個のＳＯＰ２／０−ＡＧ１４非分泌ミエローマ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲ Ｌ １５８１）にトランスフェクションする。トランスフェクションした後、こ れらの細胞を、９６穴マイクロプレートにおける完全ハイブリドーマ血清非含有 培地（GIBCO/BRL）中において、３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下で増殖させる 。２日後、適切な選択剤（例えば、ハイグロマイシン）を含む培地を添加するこ とにより、選択工程を開始する。典型的には、エレクトロポレーションに続いて ２ないし３週間で、コロニーが出現する。拡大のため、コロニーを２４穴トレイ に移す。（ｃ）抗体分泌トランスフェクトーマクローンの検定 ＥＬＩＳＡ検定を用いて、抗体分泌トランスフェクトーマのクローンを選択す る。簡潔に述べると、集密ウェルからの上清を希釈し、各希釈物１００μｌを、 予めヒツジ抗マウスＩｇＧ特異抗体（The Binding Site Ltd．； San Diego，CA ）でコートしたＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに３つずつ加える。このマ イクロタイタープレートを室温で１時間保温した後、プレートを洗浄バッファー （０．０５％ポリソルベート−２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄することにより未 結合のタンパク質を除去する。結合した抗体は、ペルオキダーゼ結合ヤギ抗マウ スＩｇＧ特異抗体（HyClone Laboratories; London，Utah）と反応させる。洗浄 バッファーでプレートを３回洗浄した後、各ウェルに１００μｌの基質溶液（３ ．３ｍｇ／ｍｌのオルソ−フェニレンジアミン及び０．１２％過酸化水素を含む ０．０２Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ５．０））を添加する。暗所で３０分間発 色させ、１ウェル当たり４ＭのＨＣｌを５０μｌ添加して反応を停止させる。自 動ＥＬＩＳＡプレート読取り機（Bio-Tek Instrument; Winooski，VT）を用いて ４９０ｎｍでの吸光度を測定する。 代わりに、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートをヤギ抗ヒトＦａｂもしくは κ特異抗体（Jackson ImmunoResearch; West Grove，PA）でコートし、ペルオキ シダーゼ結合ヤギ抗ヒトＦｃ特異抗体（Jackson ImmunoResearch; West Grove， PA）で結合抗体を検出することにより、キメラもしくはヒト化変異抗体を検出す ることができる。（ｄ）抗体精製及び分析 トランスフェクトーマを、集密するまで、血清非含有培地において５００ｍｌ 培養物として増殖させる。培養物を遠心して細胞をペレット化し、上清を０．２ ミクロン膜を通して濾過する。上清を、自由落下によって０．５〜１ｍｌ／分の 速度で３ｍｌプロテインＡカラムに通すことにより、抗体を単離する。次いで、 このカラムを２０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍのグリシン及び１０ｍＭのＥ ＤＴＡ（ｐＨ３．５）を含有する溶液１０ｍｌで結合した抗体を溶出させる。３ Ｍのトリス（ｐＨ８．６）１０μｌの存在下で、１ｍｌの溶出画分を収集する。 ２８０ｎｍでの吸光度を測定して抗体の存在を検出し、バックグランドを超える 吸光度を示す溶出画分を集めて、濾過し、ＰＢＳに対して透析し、セントリコン ３０（Centricon 30）（Amicon；Beverly，MA）で濃縮する。抗体の最終濃度を ＥＬＩＳＡにより決定し、抗体の濃度を、０．０１％（Ｗ／Ｖ）アジ化ナトリウ ムを含むＰＢＳ中に抗体濃度を１ｍｇ／ｍｌに調整する。 標準的な技法を用い、還元条件下で、４〜２０％勾配ＳＤＳ−ポリアクリルア ミドゲルを用いて精製抗体又は抗体断片の電気泳動を行うことにより、軽鎖の糖 鎖形成を確認する。例えば、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，Coligan et al .，eds.，John Wiley & Sons(1991)を参照のこと。軽鎖の糖鎖形成の存在は、よ り高い見かけの分子量、及び複数の軽鎖バンドの存在によって示される。（ｅ）複合体の調製 以下に記述する通り、免疫複合体を得るために直説法又は間接法を用いること ができる。 実施例 ２ 抗体断片の調製 Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）₂、又はＦ（ａｂ’）₂断片は、重鎖発現ベクタ ーにおける重鎖構造遺伝子に変異を誘発することにより、トランスフェクトーマ から得ることができる。Ｆａｂの発現は、ＣＨ１ドメインの配列の後に終止コド ンを挿入することにより達成される。一方、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）₂の発現 は、重鎖のヒンジ領域をコードする配列の後に終止コドンを挿入することにより 達成される。前出のColiganらに記述されるように、サイズ排除クロマトグラフ ィー、イオン交換クロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィー により、トランスフェクトーマ培養上清から抗体断片を精製する。あるいは、市 販の精製システム、例えば、クイックＭＡＢカラム（Quick MAB Column）（Ster ogen; Santa Clara，CA）を用いて断片を精製する。 代わりに、タンパク質分解により、完全な抗体から抗体断片を調製することが できる。これらの技術は当該技術分野の熟練者に周知である。例えば、前出のCo liganら、pp．2.8.1-2.8.10を参照のこと。また、Stanworth et al.，"Immunoch emical Analysis of Human and Rabbit Immunoglobulins and Their Subunits," in HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY，Vol．1，D．M．Weir，ed.，Blackw ell Scientific pp．12.1-12.46(1986)及びParham，"Preparation and Purifica tion of Active Fragments from Mouse Monoclonal Antibodies," 同上 at pp 1 4.1-14.23も参照のこと。 例として、以下のように、ＩｇＧ１に由来するＦ（ａｂ）₂断片、又は、Ｉｇ Ｇ２ａとＩｇＧ２ｂに由来するＦａｂ断片の調製に、予め活性化したパパインを 用いることができる。３７℃の水浴中において、２ｍｇ／ｍｌのパパイン（２× 再結晶化懸濁液、シグマ（Sigma）＃Ｐ３１２５）及び０．０５Ｍのシステイン （遊離塩基、結晶性；シグマ ＃Ｃ７７５５）を３０分間保温することにより、 パパインを活性化する。システインを除去するために、パパイン／システイン混 合物を、２０ｍｌの酢酸塩／ＥＤＴＡバッファー（３ｍＭのＥＤＴＡを含有する ０．１Ｍ酢酸塩、ｐＨ５．５）で平衡にされたＰＤ−１０カラム（ファルマシア （Pharmacia）＃Ｇ−２５）にかける。２８０ｎｍでの吸光度を測定することに より画分を検定し、タンパク質を含有する２つもしくは３つの画分を集める。下 記式を用いて、予備活性化パパインの濃度を決定する。 （２８０ｎｍでの吸光度）／２．５＝予備活性化パパインのｍｇ／ｍｌ 消化する抗体を調製するため、２ないし５ｍｌのＰＢＳ中の１０ｍｇの抗体を 酢酸塩／ＥＤＴＡバッファーに対して透析する。この透析した抗体溶液に５００ μｇの予備活性化パパインを添加し、この混合液を激しく撹拌する。３７℃の水 浴中で６〜１２時間保温した後、結晶ヨードアセトアミド（シグマ ＃１６１２ ５）を添加することによりパパインを不活性化し、最終濃度を０．０３Ｍとする 。次いで、この混合液を、１リットルのＰＢＳ（ｐＨ８．０）に対して、４℃で ６〜１２時間透析する。 未消化の抗体及びＦｃ断片を除去するため、この混合物を、ＰＢＳ（ｐＨ８． ０）で平衡化したプロテインＡ−セファロースカラムにかける。非結合画分を集 めて２ｍｌアリコートとし、集める。この集めた画分を総容積５ｍｌ以下に濃縮 した後、サイズ排除クロマトグラフィーによりタンパク質を分画し、その結果を ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。 実施例 ３ Ｆ（ａｂ’）₂断片の軽鎖可変ドメインＦ１領域の炭水化物部分での直接的結合 （ａ）キレート剤によるマウスＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂断片の結合 ＬＬ２は、非ホジキンスＢ細胞リンパ種の診断及び治療に有効であることが示 されているマウスモノクローナル抗体である。Goldenberg et al.，Eur．J．Cli n．Oncol．9: 548-564(1991)、及び、Murthy et al.，Eur．J．Nucl．Med．19: 394-401(1992)参照。ＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂断片を、アミノベンジルＤＴＰＡ（ ＤＴＰＡ）又は長鎖リンカーである−ＣＳＮＨ（ＣＨ₂）₁₀ＮＨ₂を有するＤＴＰ Ａの誘導体（ＬＣ−ＤＴＰＡ）のいずれかと結合させた。簡潔に述べると、５０ ｍＭの酢酸塩緩衝０．９％生理食塩水（ＡＢＳ）約１ｍｌ中のＬＬ２ Ｆ（ａｂ ’）₂断片（２．５ｍｇ）を、暗所中で、メタ過ヨウ素酸ナトリウム（２１０μ ｌの５．６８ｍｇ／ｍｌ溶液）を用いて０℃で１時間処理することにより酸化し た。この反応混合物を、エチレングリコール（２０μｌ）で処理して未反応の過 ヨウ素酸を分解し、ＰＢＳ（ｐＨ６．１）で平衡にしたセファデックスＧ−５０ ／８０（Sephadex G-50/80）カラム（Pharmacia; Piscataway，NJ）を用いて酸 化された抗体を精製した。次いで、この酸化断片を、過剰のＤＴＰＡ又はＬＣ− ＤＴＰＡと反応させた。室温で４０時間後、このシッフ塩基をＮａＢＨ₃ＣＮで 還元した。０．１Ｍの酢酸塩（ｐＨ６．５）で平衡化した遠心サイズ排除カラム （セファデックスＧ−５０／８０）を用いて、結合抗体を精製した。２８０ｎｍ での吸光度を測定することにより、抗体複合体の濃度を決定した。 抗体断片１分子当たりのキレート分子の割合は、金属結合検定により決定した 。この検定は、ＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂−キレート剤複合体のアリコートを０． １Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ７）及び２Ｍのトリエタノールアミンと混合し、 この 混合物を⁵⁷コバルトの酢酸塩が混入する既知過剰量の酢酸コバルトと共に室温で 保温することにより行った。３０分後、ＥＤＴＡ（ｐＨ７）を添加して最終濃度 １０ｍＭとした。さらに１０分間保温した後、この混合物を、展開に１０ｍＭの ＥＤＴＡを用いる即時薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）により分析した。抗 体に結合する放射性画分を、ガンマカウンターでＩＴＬＣストリップの区画を計 測することにより決定した。その結果は、１抗体断片当たり約６分子のＤＴＰＡ 、及び１抗体断片当たり約５分子のＬＣ−ＤＴＰＡが存在することを示していた 。（ｂ）ＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂−キレート剤複合体の免疫反応性の測定 ＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂−ＤＴＰＡ及びＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂−ＬＣ−ＤＴＰ Ａ複合体の免疫反応性を、ＥＬＩＳＡ検定を用いて測定した。その結果は、ＬＬ ２ Ｆ（ａｂ’）₂とＤＴＰＡ及びＬＣ−ＤＴＰＡとの複合体が、ＬＬ２抗同位 体抗体に対して同様の結合活性を発揮することを示していた。 加えて、ＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂−ＤＴＰＡ及びＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂−ＬＣ −ＤＴＰＡ複合体の免疫反応性を結合競合検定で試験した。これらの実験におい ては、ヒトキメラＬＬ２（ＩｇＧ／κ）を、ラージリンパ種細胞（ＡＴＣＣ Ｃ ＣＬ８６）への結合について、ＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂又はその複合体と競合さ せるために用いた。ラージ細胞を、１０％ウシ胎児血清及び２ｍＭのＬ−グルタ ミンを補足したＤＭＥＭ培地で培養した。細胞を５％二酸化炭素雰囲気下におい て37℃に維持した。細胞の培地及び成分は、Gibco/BRL（Gaithersburg，MD）か ら得た。 これらの研究において、１μｇのキメラＬＬ２（ＩｇＧ／κ）を、１％ウシ胎 児血清及び０．０１％（Ｗ／Ｖ）アジ化ナトリウムを補足した最終容積１００μ ｌのＰＢＳ（ＰＢＳ−ＦＡ）中において、様々な濃度のＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂ 又はその複合体の存在下で、５×１０⁵個のラージ細胞と共に保温した。この混 合物を４℃で３０分間保温した後、ＰＢＳで３回洗浄して未結合の抗体を除去し た。 競合後に残存するキメラＬＬ２による結合の程度を、フルオレセインイソチオシ アネートで標識したヤギの抗ヒトＦｃ特異抗体を含む溶液（ＰＢＳ−ＦＡ中に２ ０倍希釈した保存溶液）１００μｌを添加し、４℃で３０分間保温することによ り決定した。この混合物をＰＢＳで３回洗浄した後、ＦＡＣＳＣＡＮ蛍光活性化 細胞ソーターを用いて蛍光強度を測定した。これらの研究の結果は、ＬＬ２ Ｆ （ａｂ’）₂及びその複合体がラージ細胞への同等の結合を発揮することを示し ていた。 このように、これらの研究は、両複合体が免疫反応性であり、未結合のＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂断片に匹敵する結合活性を発揮することを示した。（ｃ）¹¹¹インジウムでの標識 以下のようにして、ＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂−キレート剤複合体を¹¹¹インジウ ムで標識した。¹¹¹インジウム塩化物を、酢酸アンモニウムを用いて、最終酢酸 塩濃度が約０．２ＭとなるようにｐＨ５．５に緩衝した。¹¹¹インジウム酢酸塩 をＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂複合体の０．１Ｍ酢酸塩（ｐＨ６．５）溶液に添加し 、この混合物を約１時間保温した。反応混合物は、９．７μｇのＬＬ２ Ｆ（ａ ｂ’）₂−ＤＴＰＡ及び７２．６μＣｉの¹¹¹インジウムか、あるいは10μｇのＬ Ｌ２ Ｆ（ａｂ’）₂−ＬＣ−ＤＴＰＡ及び１２６．７μＣｉの¹¹¹インジウムの いずれかを含んでいた。 ¹¹¹インジウム取り込みの程度を、標識混合物を１０ｍＭのＥＤＴＡと共に１ ０分間保温し、次いで、１０ｍＭのＥＤＴＡを展開に用いるＩＴＬＣによって分 析した。この検定において、未結合の¹¹¹インジウムは、抗体結合¹¹¹インジウム が元の位置に留まるのに対して、溶液の先端に移動する。コロイド状¹¹¹インジ ウムの存在は、水：エタノール：アンモニア（５：２：１）溶液を展開に用いる ＩＴＬＣ（ヒト血清アルブミンと共にスポット）によって検定した。このシステ ムにおいて、元の位置における放射性画分はコロイド状¹¹¹インジウムを表す。 加えて、 放射性高圧液体クロマトグラフィー（放射性ＨＰＬＣ）を用いて、標識混合物の 全てを分析した。 これらの研究の結果は、¹¹¹インジウム標識ＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂−ＤＴＰＡ が７．４７μＣｉ／μｇの比活性を有し、かつＩＴＬＣによる測定で９７．４％ 、放射性ＨＰＬＣによる測定で９２．５％の¹¹¹インジウムが取り込まれたこと を示していた。さらに、¹¹¹インジウム標識ＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂−ＬＣ−ＤＴ ＰＡは、１２．６７μＣｉ／μｇの比活性を有し、かつＩＴＬＣによる測定で９ ５．６％、放射性ＨＰＬＣによる測定で９４％の¹¹¹インジウムが取り込まれて いた。コロイド状¹¹¹インジウムの量は典型的には約１ないし３％である。（ｄ）⁹⁰イットリウムでの標識 ＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂−キレート剤複合体を上述の通り調製した。この複合 体を、以下の通り⁹⁰イットリウムで標識した。簡潔に述べると、市販の⁹⁰イット リウム塩化物（デュポンＮＥＮ（DuPont NEN）；１７．６８μｌ；５．６３ｍＣ ｉ）を０．５Ｍの酢酸塩（ｐＨ６．０）３５．４μｌで緩衝した。この溶液を室 温で５〜１０分間静置した後、放射標識に用いた。 ⁹⁰イットリウム酢酸塩（１２８．７μＣｉ）をＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂−ＤＴ ＰＡ（３０μｇ；８．３μｌ）と混合して室温で１時間保温し、０．１Ｍの酢酸 塩（ｐＨ６．５）９０μｌで希釈することにより、⁹⁰イットリウム標識ＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂−ＤＴＰＡを調製した。⁹⁰イットリウム酢酸塩（１０９．５μＣ ｉ）をＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂−ＬＣ−ＤＴＰＡ（３０μｇ；７．６μｌ）と混 合して室温で１時間保温し、０．１Ｍの酢酸塩（ｐＨ６．５）９０μｌで希釈す ることにより、⁹⁰イットリウム標識ＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂−ＬＣ−ＤＴＰＡを 調製した。この標識手順の結果を、上述の２つの溶媒系のＩＴＬＣ及びＨＰＬＣ により試験した。 ⁹⁰イットリウム標識ＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂−ＤＴＰＡは４．２９μＣｉ／μ ｇ タンパク質の比活性を有しており、一方、⁹⁰イットリウム標識ＬＬ２ Ｆ（ａｂ ’）₂−ＬＣ−ＤＴＰＡは３．６５μＣｉ／μｇタンパク質の比活性を有してい た。放射性ＨＰＬＣ分析は、ＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂−ＤＴＰＡには⁹⁰イットリ ウムが９６％取り込まれ、一方、ＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂−ＬＣ−ＤＴＰＡには^{9 0} イットリウムが９０％取り込まれたことを示していた。 実施例 ４ Ｆ（ａｂ’）₂断片の軽鎖可変ドメインＦＲ1領域の炭水化物部分での間接的結合 （ａ）中間複合体の調製 Shih et al.，Int．J．Cancer 41: 832-839(1988)の方法を用いて、マウスＬ Ｌ２ Ｆ（ａｂ’）₂断片をデキストランを介してドキソルビシンと結合させた 。簡潔に述べると、１ｇのデキストラン（分子量１８ｋＤ；シグマケミカル社（ Sigma Chemical Co.）；St．Louis，MO）を水７０ｍｌに溶解することにより、 アミノデキストランを調製した。このデキストランを、０．５ｇのメタ過ヨウ素 酸ナトリウムを添加して室温で一晩溶液を撹拌することにより、部分的に酸化し てポリアルデヒドデキストランを形成した。この混合物をアミコンセル（Amicon cell）（ＹＭ１０ｍｅｍｂｒａｍｅ；ＭＷＣＯ＝１０，０００）で濃縮した後 、ポリアルデヒドデキストランをセファデックスＧ−２５クロマトグラフィーで 精製し、凍結乾燥して約９００ｇの白色粉末を得た。次いで、ポリアルデヒドデ キストランを、水相中において室温で２４時間、２当量の１，３−ジアミノ−２ −ヒドロキシプロパンで処理した。この混合物に水素化ホウ素ナトリウム（１， ３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン２．１５ミリモル当たり０．３１１ミリ モル）を添加することにより、得られたシッフ塩基を安定化した。この混合物を 、室温で６時間保温した。セファデックスＧ−２５カラムを用いて、アミノデキ ストランを精製した。 乾燥リアクチバイアル（Reacti-vial）中でドキソルビシン（シグマケミカル 社 ；St．Louis，MO）０．１ミリモルに無水ＤＭＦ１ｍｌ、次いで無水ＤＭＦ７５ ０μｌにＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２３ｍｇ、０．２ミリモル；シグマ） を溶解した溶液及び無水ＤＭＦ７５０μｌに１，３−ジシクロヘキシルカルボジ イミド（４１．５ｍｇ、０．２ミリモル；シグマ）を溶解した溶液を添加するこ とにより、ドキソルビシンを活性化した。この反応混合液を、暗所において、無 水条件下、室温で１６時間撹拌した。この溶媒系においては、副生物、すなわち 尿素誘導体は、うまく沈殿しない。沈殿を遠心し、溶液を密封ボトル中に−２０ ℃で保存した。 アミノデキストラン（１８ｋＤ；１０ｍｇ）を２ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２） に溶解し、上記Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド−活性化ドキソルビシン溶液０ ．７ｍｌを徐々に添加することにより、ドキソルビシン−デキストラン中間複合 体を調製した。これにより、アミノデキストラン１モル当たりに存在するドキソ ルビシンは５０モルであった。この溶液を室温で５時間撹拌し、沈殿を除去した 後、セファデックスＧ−２５カラムを用いて複合体を精製した。ドキソルビシン −デキストラン複合体は、ドキソルビシン／デキストラン比が１４であることで 特徴付けられた。 あるいは、ドキソルビシン−デキストラン複合体は、Shih et al.，Int．J．C ancer 41: 832-839(1988)に記載されるように、ドキソルビシンを１−エチル− ３（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドと反応させることにより調 製された。また、Shih et al.，Cancer Research 51: 4192-4198(1991)も参照の こと。（ｂ）ＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂への中間複合体の部位特異的結合 ５ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ５．５）中のＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂断片（２５ｍｇ） を、室温で60分間、メタ過ヨウ素酸ナトリウム（２１．５ｍｇ／ｍｌ溶液８００ μｌ）で処理することにより、暗所において酸化した。この反応混合液をエチレ ングリ コール（５０μｌ）で処理して、未反応の過ヨウ素酸塩を分解し、０．０５Ｍの ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラムを用いて 酸化された抗体断片を精製した。次いで、この酸化された断片を０．０５ＭのＨ ＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中に５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、ドキソルビシン−デキスト ラン複合体（２２ｍｇ）と反応させた。室温で２４時間後、ＮａＢＨ₃ＣＮでシ ッフ塩基を還元した。セファロースＣＬ−６Ｂカラムを用いて結合抗体を精製し た。 この手順を用いることにより、平均約９個のドキソルビシン分子を、軽鎖可変 ドメインＦＲ１領域の炭水化物部位で、ＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂断片の各々に結 合させることができた。この比率は、ドキソルビシン（Ａ₄₈₂）及びタンパク質 （Ａ₂₈₀）の濃度を測定することにより決定した。この複合体は、上述のフロー サイトメトリー法による測定では、未結合ＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂断片の免疫活 性の８０％を保持している。 実施例 ５ ヒト化ＭＮ１４のＶＫ ＦＲ１領域へのアスパラギン結合型の糖鎖形成部位 の導入 アスパラギン結合型の糖鎖形成部位を、ガン胎児性抗原に結合する抗体である ヒト化ＭＮ１４のＶＫ ＦＲ１領域に導入した。簡潔に述べると、Ａｒｇ₁₈をコ ードするヌクレオチド配列に、実施例１に記載されるＰＣＲ法を用いて変異を誘 発し、Ａｓｎ₁₈をコードするヌクレオチド配列とした。この場合、ヒト化ＭＮ１ ４の軽鎖発現ベクターに由来するＤＮＡをＰＣＲのテンプレートとして用いた。 OrlandiらのＶＫＦＯＲ１プライマーを３’プライマーとして用いた。５’プラ イマーは、18位のコドンがアスパラギン（Ａｓｎ）をコードすることを除いてＭ Ｎ１４ ＶＫドメインの最初の20個のアミノ酸をコードする５７量体からなるも のであった。約３００塩基対のＰＣＲ産生物をＰｖｕII及びＢｇｌIIで消化し、 ステージングベクター（staging vector）もしくはクローニングベクターの相補 的 な部位に結合させる。標準的な塩化カルシウム法を用いて、ＤＨ５αコンピテン ト細胞をこのステージングベクターもしくはクローニングベクターで形質転換す る。例えば、前出のAusubelらを参照のこと。 １８位アミノ酸にアスパラギン型糖鎖形成部位を有するヒト化ＭＮ１４ ＶＫ 配列を含むＤＮＡ断片を、ｐＳＶｈｙｇベースの軽鎖発現ベクターにサブクロー ニングした。直線化軽鎖発現ベクター及び直線化重鎖発現ベクターを、エレクト ロンポレーションにより、ＳＰ２／０−ＡＧ１４非分泌ミエローマ細胞に同時ト ランスフェクションした。ハイグロマイシンＢを用いてトランスフェクトーマを 選択し、培養して抗体を産生させた。 抗体を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲルで分析した。糖鎖形成されたヒト化 ＭＮ１４の軽鎖は多重バンドとして移動し、糖鎖形成されていないＭＮ１４軽鎖 よりも大きい分子量まで到達した。この結果は、新しいアスパラギン結合型の糖 鎖形成部位が炭水化物付加に用いられたことを示している。 糖鎖形成されたＭＮ１４抗体及び糖鎖形成されていないＭＮ１４抗体のＭＮ１ ４ブロッキング活性が実質的に同じであることが見出されたことは重要である。 このように、ヒト化ＭＮ１４のＶＫ ＦＲ１領域での糖鎖形成は、免疫反応性に 影響を及ぼさない。 実施例 ６ Ｆ（ａｂ’）₂断片の軽鎖可変ドメインＦＲ１の炭水化物部分でのＤＯＴＡの 直接的結合 （ａ）マウスＲＳ７ Ｆ（ａｂ’）₂断片とＤＯＴＡとの結合 ＭＡｂ ＲＳ７は、肺、胃、膀胱、乳房、卵巣、子宮及び前立腺のガンと反応 する、迅速内在化抗体である（Stein et al.，1990，Cancer Res.，50，1330-13 36）。上述の手順を用いて、糖鎖形成部位ＮＶＴをＲＳ７のＶＫドメインの１８ 〜２０位に導入する。この糖鎖形成されたＲＳ７を、ＳＰ２／０−ＡＧ１４ミエ ローマ細胞中で発現させ、上述の通りＦ（ａｂ’）₂断片を調製する。 ０．１Ｍリン酸塩緩衝０．９％塩化ナトリウム溶液、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）１ ｍｌ中のＲＳ７のＦ（ａｂ’）₂断片２ｍｇに、２．８４ｍｇ／ｍｌメタ過ヨウ 素酸ナトリウム４００μｌを添加する。この反応混合物を、暗所において、室温 で９０分間撹拌し、エチレングリコール２０μｌを添加して酸化反応を停止させ る。この酸化された抗体断片を、ＰＢＳ（ｐＨ６．１）で平衡化されたセファデ ックスＧ−２５サイズ排除カラム（ファルマシア；Piscataway，NJ）で精製する 。この抗体を、セントリコン３０（アミコン；Beverley，MA）で２ｍｇ／ｍｌに 再濃縮し、過剰の２−ｐ−アミノベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシク ロドデカン四酢酸（ＮＨ₂−Ｂｚ−ＤＯＴＡ）で処理する。この混合物を、４℃ で４８時間反応させる。（抗体に対して）１０倍モル過剰の水素化シアノホウ素 ナトリウムを添加し、次いで３０分間撹拌することにより、シッフ塩基をその場 （in situ）で還元する。酸洗浄成分及び金属非含有バッファー媒体で調製され る０．１Ｍの酢酸塩緩衝０．９％塩化ナトリウム溶液（ＡＢＳ、ｐＨ６．５）で 平衡化された遠心サイズ排除カラム（Sephadex G50/80）を用いて、ＤＯＴＡ− Ｆ（ａｂ’）₂複合体を精製し、酸で洗浄された成分及び金属非含有緩衝液で調 製した。抗体複合体の濃度を、その２８０ｎｍでの吸光度、及び実施例３と同様 のコバルト−５７結合検定によって測定される抗体の１モル当たりのキレートの 比により決定する。 市販のイットリウム−９０塩化物（８．９ｍＣｉ、２７μｌ）を８１μｌの０ ．５ＭのＡＢＳ、ｐＨ６で処理し、この溶液を渦流によって混合する。これを１ ５分間静置した後、下記標識に用いる。 酸で洗浄したプラスチックバイアル中において、ＤＯＴＡ標識ＲＳ７ Ｆ（ａ ｂ’）₂複合体（１ｍｇ、７３μｌ）に、イットリウム−９０酢酸塩（４．９４ ｍＣｉ、６０μｌ）を含むＡＢＳを添加する。このバイアルの内容物を渦流を用 い て穏やかに混合し、室温で１時間静置する。次いで、８５０μｌの０．１ＭのＡ ＢＳを、撹拌しながら標識バイアルに添加した。標識結果を、実施例３に記述さ れる２つの溶媒系での即時薄層クロマトグラフィー及び高性能液体クロマトグラ フィーにより試験する。 実施例 ７ 中間担体としてポリアミドアミンデンドリマーを用いる、Ｆ（ａｂ’）₂断片の 軽鎖可変ドメインＦＲ１領域の炭水化物部分での間接的結合 （ａ）中間複合体の調製 上述の通り酸化されたマウスＲＳ７ Ｆ（ａｂ’）₂断片を、２つのポリアミ ドアミンデンドリマーの生成を介して、ＤＯＴＡに結合させた。デンドリマーは 、Tomalia et al.，Angew．Chem．Int．Ed．Eng1．29: 138-175(1990)の方法に より調製した。このデンドリマー（水８ｍｌ中に１０μＭ）を、４０℃、ｐＨ９ で２４時間、０．２ＭのＮａＯＨを定期的に添加して溶液ｐＨを９．０に保ちな がら、２−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザ シクロドデシル四酢酸と反応させた。３０００ＭＷカットオフフィルターを備え た撹拌セル（アミコン、ＭＡ）を用いる限外濾過により、未反応のリガンドを除 去した。凍結乾燥後、デンドリマー−キレート剤複合体をＡＢＳに再懸濁し、実 施例６に記述される通りにＲＳ７ Ｆ（ａｂ’）₂断片に結合させた。 実施例 ８ Ｆ（ａｂ’）₂軽鎖炭水化物へのＨｚ−ＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコー ルヒドラジド）の結合 結合プロトコル（ａ） 過ヨウ素酸ナトリウム（最終濃度２０ｍＭ）を用いて、ｐＨ６で０℃にて９０ 分間、ＩＭＭＵ−ＬＬ２−Ｆ（ａｂ’）₂炭水化物部分を酸化した。この酸化断 片を、遠心スピン−カラム技術、すなわち、ＰＢＳ（ｐＨ６．０）中のセファデ ッ クスＧ−５０−８０により、過剰の過ヨウ素酸塩から分離した。この精製酸化中 間体に、モル過剰量（５０倍及び３００倍）のメトキシ−ＰＥＧヒドラジド（分 子量５０００、シアウォーターポリマーズ社、Huntsville，AL）を添加すること により、ヒドラゾン結合を得た。この反応を室温で２時間進行させた。この生成 物を、セファデックスＧ−５０−８０、０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０ を有する遠心スピン−カラムで精製し、０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．０２％ アジ化ナトリウム、ｐＨ６．８で溶離させるＢｉｏＳｉｌ ＳＥＣ−４００カラ ムを用いたサイズ排除ＨＰＬＣにより分析した。 その結果は、Ｈｚ−ＰＥＧが５０倍モル過剰の反応では未修飾のＦ（ａｂ’）₂ が１６％であり、３００倍モル過剰の反応では未修飾が僅かに２．３％である ことを示していた。結合プロトコル（ｂ） ２００μｌのＩＭＭＵ−ＬＬ２ Ｆ（ａｂ）₂（２．１ｍｇ、２．１×１０^-8 モル）を、０．５ＭのＮａＩＯ₄（７００×２．１×１０-8モル）を用いて、２ ６℃で４５分間酸化した。この酸化された抗体断片を、２つの連続した２．４ｍ ｌ遠心スピンカラムである、ｐＨ７の０．１Ｍリン酸ナトリウム中のセファデッ クスＧ−５０−８０で、過剰のＮａＩＯ₄から分離した。 この酸化断片へのメトキシ−Ｈｚ−ＰＥＧの結合を、２０５μｌ（１．５２ｍ ｇ、１．５２×１０^-8モル）の酸化ＩＭＭＵ−ＬＬ２ Ｆ（ａｂ）₂を２２．８ ｍｇ（３００×１．５２×１０^-8モル）のメトキシ−Ｈｚ−ＰＥＧ（分子量５０ ００）と共に２５℃で１時間保温することにより行った。この複合体を、セファ デックス−Ｇ−５０−８０のスピン−カラム（４つの連続した２．４ｍｌカラム ）を用いて、０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７で溶離し精製した。０．２Ｍリ ン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム（ｐ Ｈ６．８）で溶離する、ＢｉｏＳｉｌ４００のサイズ排除カラムでのＨＰＬＣ分 析 により、７．４分（１６．９％）及び８．３分（８３．１％）に新しい２つのピ ークが示された。 実施例 ９ 二官能性キレート剤（５）の調製 以下の実施例は、本発明での使用に特に好ましい二官能性キレート剤の調製方 法を説明する。この実施例において調製される二官能性キレート剤を用いる、ぶ ら下がったスルフヒドリル基を有するタンパク質もしくは担体の標識、及び放射 免疫造影または放射免疫療法におけるこれらの放射標識タンパク質もしくは抗体 の使用は、当該技術分野における熟練者の技術の範囲内である。反応式を以下に 示す。 （ａ） アルゴン雰囲気下において４℃に冷却されている、撹拌されたＮ−ε −（ｔ−ブトキシカルボニル）リジンのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液に、 ボラン−テトラヒドロフラン複合体（１当量）を滴下により添加する。２時間後 、水性ＴＨＦを注意深く添加することにより、過剰のボランを分解した。次いで 、この反応混合物を５Ｍ水酸化ナトリウムと共に１０〜１８時間還流して、ホウ 酸エステルを分解した。この水溶液をクロロホルムで完全に抽出して飽和食塩水 で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮し て乾固させることにより、２−アミノ−６−Ｎ（ｔ−ブトキシカルボニル）アミ ノ −１−ヘキサノール（１）を得た。 （ｂ） 化合物（１）を４℃でエタノールに溶解し、この溶液に（アルゴン流 中でパラホルムアルデヒドを加熱することにより調製される）ホルムアルデヒド ガスを１０分間通過させる。次いで、温度を４℃に保ちながら、水素化ホウ素ナ トリウム（１０当量）を徐々に添加する。この混合物を蒸発させて乾固させ、残 滓に０．１ＭのＨＣｌ、次いで直ちに、飽和重炭酸ナトリウム溶液を滴下により 添加する。この溶液を酢酸エチルで抽出して飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水 硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して乾固させた。生成物を、再び、上述の通り ホルムアルデヒド及び水素化ホウ素ナトリウムで処理して、２−（Ｎ，Ｎ−ジメ チルアミノ）−６−［Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−１−ヘキサノ ール（２）を得る。 （ｃ） （２）のジクロロメタン溶液に、４℃で、無水炭酸カリウム（２０当 量）を添加し、過剰の塩化チオニルを滴下により添加しながらこの懸濁液を激し く撹拌する。１時間後、ロータリーエバポレーターで溶媒及び過剰の塩化チオニ ルを除去し、残滓を酢酸エチルで抽出する。蒸発させて乾固させることにより１ −（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−５−（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ−１− クロロメチルペンタン（３）が得られる。必要であれば、シリカゲルでのクロマ トグラフィーにより、これをさらに精製することができる。 （ｄ） （３）のトルエン溶液に、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウ ンデク−７−エン（２．２当量）、次いでチオ安息香酸（１．１当量）を添加し 、この溶液を還流条件下で加熱する。この反応の進行を、５％ホスホモリブジン 酸のエタノール溶液で可視化したシリカゲルプレートでの薄層クロマトグラフィ ー（ＴＬＣ）により監視する。反応が完了したときに、有機抽出物を蒸発させて 乾固させ、残滓をクロロホルムに再溶解して水で一度洗浄し、無水硫酸ナトリウ ムで乾燥させ、蒸発させて粗精製Ｓ−ベンゾイル−２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミ ノ） −５−（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノメルカプタン（４）を得る。フラッシ ュクロマトグラフィーにより、この化合物をさらに精製する。 （ｅ） （４）の撹拌ジクロロメタン溶液に、室温で、トリフルオロ酢酸（１ ０当量）を添加する。２時間後、溶媒を蒸発させて乾固させ、（５）を得る。こ れを、抗体断片の酸化炭水化物への結合に直接用いる。 実施例 １０ 酸化された抗体への二官能性キレート剤（５）の結合 ５０ｍＭの酢酸塩緩衝０．９％生理食塩水（ＡＢＳ；ｐＨ５．３）約１ｍｌ中 のＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂断片（２．５ｍｇ）を、暗所において、０℃で１時間 、メタ過ヨウ素酸ナトリウム（５．６８ｍｇ／ｍｌ溶液２１０μｌ）で処理する ことにより酸化する。この反応混合物をエチレングリコール（２０ｍｌ）で処理 して、未反応の過ヨウ素酸を分解し、ＰＢＳ（ｐＨ６．１）で平衡化したセファ デックスＧ−５０／８０カラム（ファルマシア；Piscataway，NJ）を用いて酸化 された抗体断片を精製する。次いで、この酸化断片を過剰のキレート剤（５）と 反応させる。室温で４０時間後、このシッフ塩基をＮａＢＨ₃ＣＮで還元する。 ０．１Ｍの酢酸塩（ｐＨ６．５）で平衡化した遠心サイズ排除カラム（セファデ ックスＧ−５０／８０）を用いて、結合抗体を精製する。抗体複合体の濃度を、 ２８０ｎｍの吸光度を測定することにより決定する。 実施例 １１ 二官能性キレート剤（１０）の調製 （ａ） ２−アミノ−６−Ｎ（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ−１−ヘキサ ノール（１）の撹拌した無水アセトニリル溶液に無水炭酸ナトリウム、次いでｔ −ブチルブロモアセテート（２．２当量）を添加した。この混合物を還流下で６ 〜１０時間撹拌した後、酢酸エチルで抽出した。この溶液を蒸発させて乾固させ 、シリカゲルでのクロマトグラフィーで精製することにより、（６）を６８〜７ ５％の収率で得た。 （ｂ） 室温で、（６）の撹拌したジクロロメタン溶液にトリフルオロ酢酸（ １０当量）を添加した。１時間後、減圧下で溶媒を除去し、残滓を乾燥ＴＨＦに 溶解した。この溶液を４℃に冷却し、ボラン−ＴＨＦ複合体（３当量）を滴下に より１５分間に亘って添加した。２時間撹拌した後、過剰のボランを水性ＴＨＦ で分解し、５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液と共に１０〜１８時間還流することに よりホウ酸エステルを分解した。この混合物を酢酸エチルで抽出して、有機溶液 を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で蒸発させて乾 固させた。その残滓をＴＨＦ：水（１：１）に取り、０．１ＭのＮａＯＨでｐＨ １０に調整した。必要に応じて０．１ＭのＮａＯＨを添加することによってｐＨ を９〜１０に保ちながら、ジ−ｔ−ブチル重炭酸塩（２．２当量）を分割して添 加した。添加終了の１時間後、この溶液を酢酸エチルで抽出して、有機層を乾燥 させ、減圧下で蒸発させた。残滓をシリカゲルでクロマトグラフィー処理して（ ７）を得た。 （ｃ） ４℃に冷却した（７）のクロロホルム溶液に無水炭酸カリウム（２０ 当量）を添加し、過剰の塩化チオニルを滴下により添加しながら、この懸濁液を 激しく撹拌した。１時間後、ロータリーエバポレーターで溶媒及び過剰の塩化チ オニルを除去し、残滓を酢酸エチルで抽出した。蒸発させて乾固させることによ り（８）を得た。 （ｄ） （８）のトルエン溶液に、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウ ンデク−７−エン（１．８当量／塩化物基）、次いでチオ安息香酸（１．４当量 ／塩化物基）を添加し、この溶液を還流下で加熱した。この反応の進行を、５％ ホスホモリブジン酸のエタノール溶液で可視化したシリカゲルプレートでの薄層 クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により監視した。反応が完了したときに、有機抽 出物を蒸発させて乾固させ、残滓をクロロホルムに再溶解して水で一度洗浄し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で蒸発させて（９）の粗製物を得た。こ れをフラッシュクロマトグラフィーによってさらに精製した。（９）の¹Ｈ Ｎ ＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ）では、以下のシグナルが示された。７．９５（ ｍ，６Ｈ）、７．５５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝８）、７．４２（ｍ，６Ｈ）、３．２５ 〜２．７５（ｍ，１３Ｈ）、１．６〜１．２（ｍ，６Ｈ）、１．４４（ｓ，９Ｈ ）。 （ｅ） 室温で、撹拌した（９）のジクロロメタン溶液にトリフルオロ酢酸（ １０当量）を添加した。２時間後、溶媒を蒸発させて乾固させ、（１０）を得た 。これを、上記実施例１０に記述されるように、結合に直接用いる。 実施例 １２ 二官能性キレート剤（１４）の調製 （ａ） ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）ジアンヒドリド（dianhydr ide）のＤＭＦ溶液にトリエチルアミン（１当量）、次いで４−ニトロフェネチ ルアミン（０．２５当量）を添加する。２時間撹拌した後、０．１ＭのＮａＯＨ （過剰量）を添加する。１時間後、この溶液を０．１ＭのＨＣｌで酸性化し、減 圧下で蒸発させる。有機残滓を無水ＴＨＦに取って硫酸マグネシウムで乾燥させ 、 濾過し、４℃に冷却する。ボラン−ＴＨＦ複合体（６当量）を滴下により１５分 間に亘って添加する。２時間撹拌した後、０．１ＭのＨＣｌを添加してホウ酸エ ステルを分解する。過剰の飽和重炭酸ナトリウムを添加し、この混合物を酢酸エ チルで抽出する。この有機溶液を飽和食塩水で洗浄して無水硫酸ナトリウムで乾 燥させ、減圧下で蒸発させて乾固させ、（１１）を得る。 （ｂ） （１１）の撹拌したメタノール溶液にチャコールム付着パラジウム触 媒（０．１当量）を添加する。この懸濁液を水素雰囲気下に置き、ＴＬＣによっ て（１１）が無くなったことが示されるまで還元を進行させる。この反応混合物 をアルゴンで３回フラッシュし、濾過により触媒を除去し、蒸発させて乾固させ る。残滓をＴＨＦ：水（１：１）に取り、０．１ＭのＮａＯＨでｐＨを１０に調 整する。必要に応じて０．１ＭのＮａＯＨを添加することによりｐＨを９〜１０ に保ちながら、ジ−ｔ−ブチル重炭酸塩（２．２当量）を分割して添加する。添 加終了の１時間後、この溶液を酢酸エチルで抽出し、有機層を乾燥させて減圧下 で蒸発させる。残滓をシリカゲルでクロマトグラフィー処理し、（１２）を得る 。 （ｃ） ４℃で、（１２）のクロロホルム溶液に無水炭酸カリウム（２０当量 ）を添加し、過剰の塩化チオニルを滴下により添加しながらこの懸濁液を激しく 撹拌する。１時間後、ロータリーエバポレーターで溶媒及び過剰の塩化チオニル を除去し、残滓を酢酸エチルで抽出する。減圧下で溶媒を除去し、残滓をトルエ ンに取る。１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（２．２ 当量）、次いでチオ安息香酸（１．１当量）を添加し、溶液を還流下で加熱する 。５時間後、有機抽出物を蒸発させて乾固させ、残滓をクロロホルムに再溶解し て水で一度洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で蒸発させて（１３ ）の粗製物を得る。これをフラッシュクロマトグラフィーによりさらに精製する 。 （ｄ） 室温で、（１３）のジクロロメタン溶液にトリフルオロ酢酸（１０当 量）を添加する。２時間後、溶媒を蒸発させて乾固させ、残滓を、上記実施例１ ０に記載されるように、結合に直接用いる。 実施例 １３ 二官能性キレート剤（１９）の調製 （ａ） １，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンの無水アセトニト リル溶液に、無水炭酸ナトリウム、次いでｔ−ブチルブロモアセテート（６当量 ）を添加する。この混合物を還流下で６〜１０時間加熱した後、酢酸エチルで抽 出する。この溶液を蒸発させて乾固させ、シリカゲルでクロマトグラフィー処理 して（１５）を得る。 （ｂ） 室温で、（１５）のジクロロメタン溶液にトリフルオロ酢酸（１０当 量）を添加する。２時間後、溶媒を蒸発させて乾固させ、残滓を最小容量のＤＭ Ｆに溶解する。この溶液を４℃に冷却し、塩化チオニル（過剰量）を添加する。 ２時間後、この溶液を減圧下で蒸発させて過剰の塩化チオニルを除去し、トリエ チルアミン（１０当量）、次いで４−ニトロフェネチルアミン（０．２５当量） を添加する。粉末水素化ホウ素ナトリウムを分割して添加して、残余の酸塩化物 基を還元し、０．１ＭのＨＣｌを添加する。この溶液を酢酸エチルで抽出し、有 機溶液を飽和食塩水で洗浄して減圧下で蒸発させる。残滓をシリカゲルでクロマ トグラフィー処理して純粋な（１６）を得る。 （ｃ） （１６）の撹拌したメタノール溶液にチャコール付着パラジウム触媒 （０．１当量）を添加する。この懸濁液を水素雰囲気下に置き、（１６）が無く なったことがＴＬＣによって示されるまで還元を進行させる。この反応混合物を アルゴンで３回フラッシュし、濾過により触媒を除去し、蒸発させて乾固させる 。残滓をＴＨＦ：水（１：１）に取り、０．１ＭのＮａＯＨでｐＨを１０に調整 する。必要に応じて０．１ＭのＮａＯＨを添加することによりｐＨを９〜１０に 保ちながら、ジ−ｔ−ブチル重炭酸塩（２．２当量）を分割して添加する。添加 終了の１時間後、この溶液を酢酸エチルで抽出し、有機層を乾燥させて減圧下で 蒸発させる。残滓をシリカゲルでクロマトグラフィー処理して（１７）を得る。 （ｄ） ４℃で、（１７）のクロロホルム溶液に無水炭酸カリウム（２０当量 ）を添加し、過剰の塩化チオニルを滴下により添加しながらこの懸濁液を激しく 撹拌する。１時間後、ロータリーエバポレーターで溶媒及び過剰の塩化チオニル を除去し、残滓を酢酸エチルで抽出する。溶媒を減圧下で除去し、残滓をトルエ ンに取る。１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（１．８ 当量／塩化物基）、次いでチオ安息香酸（１．４当量／塩化物）を添加し、溶液 を還流下で加熱する。５時間後、有機抽出物を蒸発させて乾固させ、残滓をクロ ロホルムに再溶解して水で一度洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下 で蒸発させて（１８）の粗精製物を得る。これを、フラッシュクロマトグラフィ ーによりさらに精製する。 （ｅ） 室温で、（１８）のジクロロメタン溶液にトリフルオロ酢酸（１０当 量）を添加する。２時間後、溶媒を蒸発させて乾固させ、（１９）を得る。これ を、上記実施例１０に記載されるように、結合に直接用いる。 実施例 １３ 二官能性キレート剤（２１）の調製 （ａ） ４℃に冷却したＮ−Ｂｏｃ Ｎ’−メチルエチレンジアミンのジクロ ロメタン溶液にトリエチルアミン（１０当量）、次いでクロロアセチルクロライ ド（１．１当量）を添加する。３０分間撹拌した後、水を添加し、有機層を分離 して乾燥させ、減圧下で濃縮して乾固させる。残滓をトルエンに取り、１，８− ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（２．２当量）、次いでチオ 安息香酸（１．１当量）を添加し、溶液を還流下で加熱する。５時間後、有機抽 出物を蒸発させて乾固させ、残滓をクロロホルムに再溶解して水で一度洗浄し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で蒸発させて（２０）の粗精製物を得る 。これを、フラッシュクロマトグラフィーでさらに精製する。 （ｂ） 室温で、（２０）のジクロロメタン溶液にトリフルオロ酢酸（１０当 量）を添加する。２時間後、溶媒を蒸発させて乾固させ、（２１）を得る。これ を、上記実施例１０に記載されるように、結合に直接用いる。 実施例 １４ 二官能性キレート剤（２３）の調製 （ａ） ４℃に冷却したＮ−Ｂｏｃ−ヒドラジンのジクロロメタン溶液にトリ エチルアミン（１０当量）、次いでジメチルアクリロイルクロライド（１．１当 量）を添加する。３０分間撹拌した後、水を添加し、有機層を分離して乾燥させ 、減圧下で濃縮して乾固させる。残滓をトルエンに取り、１，８−ジアザビシク ロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（２．２当量）、次いでチオ安息香酸（１ ．１当量）を添加し、溶液を還流下で加熱する。５時間後、有機抽出物を蒸発さ せて乾固させ、残滓をクロロホルムに再溶解して水で一度洗浄し、無水硫酸ナト リウムで乾燥させ、減圧下で蒸発させて（２２）の粗精製物を得る。これを、フ ラッシュクロマトグラフィーでさらに精製する。メタノール中において、ナトリ ウムメトキシドでチオール基を脱保護し、このチオールを２−ピリジルチオ単位 として再保護した。 （ｂ） 室温で、（２２）のジクロロメタン溶液にトリフルオロ酢酸（１０当 量）を添加する。２時間後、溶媒を蒸発させて乾固させ、（２３）を得る。これ を、還元工程を省略することを除いて上記実施例１０に記載されるように、結合 に直接用いる。 実施例 １５ ＤＴＰＡのセミカルバジド誘導体の調製及び酸不安定性結合を有する免疫複合体 を生成するための結合及び放射標識 （ａ）ｐ−（チオセミカルバジジル）ベンジル−ＤＴＰＡの調製 水０．５ｍｌ中のｐ−（イソチオシアナト）ベンジルＤＰＴＡ（１９．７μｍ ｏｌ）をヒドラジン水和物（６当量）の５５％水溶液６．６μｌと混合し、固形 炭酸ナトリウムを用いてこの溶液のｐＨを９．１３に調製した。この透明な反応 混合物を３７℃で４時間保温した。次いで、ｐＨを１２．８に上げ、高真空ポン プを用いて水を除去した。残滓をイソプロパノールで２回抽出して残余のヒドラ ジンを除去し、水０．３ｍｌに溶解した。ｐＨを６．５に調整して、所望の生成 物を６０μｍｏｌ／ｍｌの濃度で得た。（ｂ）抗体断片ＬＬ2−Ｆ（ａｂ’）₂の酸化炭水化物部分へのｐ−（チオセミカ ルバジジル）ベンジル−ＤＴＰＡの結合 ５０ｍＭの酢酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ５．３）中のＬＬ２ Ｆ（ａｂ’）₂ 断片（０．８ｍｌ；１．９５ｍｇ／ｍｌ）を、最終濃度１４．３ｍＭのメタ過ヨ ウ素酸ナトリウムで処理し、０℃（氷浴）で１時間保温した。グリセロール（２ ０μｌ）で過剰の過ヨウ素酸塩を分解し、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７） で平衡化した遠心サイズ排除カラムで酸化された抗体を精製した。 酸化された抗体の溶液を塩化ナトリウムに関して１５０ｍＭとし、ｐＨを（固 形リン酸ナトリウム、一塩基性を用いて）６．２に調整した後、３００倍モル過 剰のｐ−（チオセミカルバジジル）ベンジルＤＴＰＡで処理した。この反応混合 物を渦流で撹拌し、暗所において、室温で１８時間保温した。複合体を、０．１ Ｍの酢酸塩（ｐＨ６．５）で平衡化した遠心サイズ排除カラムで精製し、セント リコン３０濃縮器で濃縮した。 この複合体のＨＰＬＣ分析により、未修飾の抗体と同一の保持時間に単一のピ ークが示された。（ｃ）ＬＬ2−Ｆ（ａｂ’）₂当たりのキレートの数の決定 上記複合体40μｇを、５０〜２００，０００ｃｐｍのコバルト−５７放射性同 位体を混入した過剰量の酢酸コバルトで標識した。３０分後、標識混合物を１０ ｍＭのＥＤＴＡ溶液とし、抗体へのコバルトの取り込みについて（シリカゲル含 浸ガラスファイバーストリップでのＩＴＬＣ及びクロマトグラム展開のための１ ０ｍＭのＥＤＴＡを用いて）分析した。抗体に結合した放射性画分から、複合体 の相対モル量及びＣｏ／⁵⁷Ｃｏ溶液を用いて、１抗体断片当たりのキレートの数 が１．２５であることを決定した。（ｄ）複合体のＹ−９０での放射標識 ０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．５）中の５μｌ（５０μｇ）のｐ−（チ オセミカルバゾニル）ベンジル−ＤＴＰＡ−Ｆ（ａｂ’）₂複合体の溶液を４μ ｌのＹ−９０酢酸塩（９５．５μＣｉ）と混合し、１時間保温した。次いで、こ の溶液を０．１Ｍの酢酸ナトリウム９μｌで希釈し、取り込みについて分析した 。１０ｍＭのＥＤＴＡと共に１０分間保温した後、標識混合物のアリコートに対 して即時薄層クロマトグラフィー分析を行った。Ｙ−９０の取り込みは７７．３ ％であり、放射活性の１．２％はコロイドの形態で存在していた。放射ＨＰＬＣ では６４％の取り込みが示された。（ｅ）複合体のＩｎ−１１１での放射標識 ｐ−（チオセミカルバゾイル）ベンジル−ＤＴＰＡ−Ｆ（ａｂ’）₂複合体の 溶液６０μｇを１２４μＣｉのＩｎ−１１１酢酸塩（０．２２Ｍの酢酸アンモニ ウムで緩衝したＩｎ−１１１塩化物）と混合し、室温で４５分間放置した。１０ ｍＭのＥＤＴＡと共に保温した後、この標識混合液のアリコートを分析すること により、複合体のＩｎ−１１１の取り込みが８６％であることが示された。この サンプルを０．１Ｍの酢酸塩で９０μｌに希釈し、１０μｌの０．１ＭのＤＴＰ Ａ溶液（ｐＨ７）と共に１０分間保温した。遠心サイズ排除クロマトグラフィー で２回連続的に精製することにより、Ｉｎ−１１１標識複合体を得た。 前述の記載は特に好ましい態様に言及するものであるが、本発明がそれらに限 定されるものではないことは理解されるであろう。当該技術分野の熟練者は、開 示された態様に対して様々な変形を加えることが可能であり、そのような変形が 下記請求の範囲によって定義される本発明の範囲内にあることが意図されている ことに想到するであろう。 本明細書中に述べられている全ての刊行物及び特許出願は、本発明が属する技 術分野における熟練者のレベルを示している。全ての刊行物及び特許出願は、あ たかも個々の刊行物または特許出願の各々が引用することにより全体として本明 細書に組込まれることが特定して、かつ個別に示されているのと同程度に、引用 することにより本明細書に組込まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 17/00 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 17/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｎ 33/563 0276−2Ｊ 33/563 //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 リューン， シュイ−オン アメリカ合衆国、 07940 ニュー・ジャ ージー、マディソン、キングズ・ロード 254 (72)発明者 シェヴィッツ， ジェリー アメリカ合衆国、 07039 ニュー・ジャ ージー、リヴィングストン、オルコット・ ドライヴ ９ (72)発明者 グリフィス， ゲイリー・エル アメリカ合衆国、 07960 ニュー・ジャ ージー、モリスタウン、エッジヒル・アヴ ェニュー 36 (72)発明者 ゴヴィンダン，セレグラム・ヴィ アメリカ合衆国、 07901 ニュー・ジャ ージー、サミット、ソリングフィールド・ アヴェニュー 767、ボックス ＃44

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．抗体又は抗体断片の軽鎖の１８位近傍に、天然に存在しないアスパラギン型 糖鎖形成部位をもつ変異組換え抗体又は変異組換え抗体断片。 ２．該抗体断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ、及び 一本鎖Ｆｖからなる群から選択される請求項１に記載の抗体断片。 ３．（ａ）重鎖及び変異軽鎖を含む変異抗体又は変異抗体断片を発現し、かつ、 糖鎖形成する形質転換された宿主細胞を培養する工程であって、該宿主細胞がア ミノ酸の１８位近傍に天然に存在しないアスパラギン型糖鎖形成部位を含む変異 軽鎖をコードしている変異ＤＮＡ分子をクローニングした発現ベクターで形質転 換されている工程と、 （ｂ）発現され、糖鎖形成された変異抗体又は変異抗体断片を、培養された 該宿主細胞から回収する工程と、 を含む、糖鎖形成された変異組換え抗体又は変異組換え抗体断片を調整するため の方法。 ４．（ａ）軽鎖の可変部のアミノ酸の位置１８位近傍で結合された炭水化物部分 をもつ該軽鎖の可変部を含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆ（ａｂ’）₂ 、Ｆｖ、及び一本鎖Ｆｖからなる群から選択される糖鎖形成された抗体断片と、 （ｂ）少なくとも１つの遊離アミン基をもつポリマー担体、及び、ポリマー 担体と共有結合した多数の薬剤、毒素、キレート剤、ボロンアデンド、又は検出 可能な標識分子を含む担持担体と を含む可溶性免疫複合体であって、 該担持担体は、該ポリマー担体の少なくとも１つの該遊離アミン基を介して、 該抗体断片の該炭水化物部分と共有結合していて、 該免疫複合体は、該抗体断片の免疫反応性を保持している可溶性免疫複合体。 ５．該抗体断片は、該抗体断片の軽鎖のアミノ酸の１８位近傍に、天然に存在し ないアスパラギン型糖鎖形成部位をもつ変異抗体断片である、請求項４に記載の 可溶性免疫複合体。 ６．該ポリマー担体は、アミノデキストラン、少なくともアミノ酸５０個の長さ のポリペプチド、及びポリアミドアミンデンドリマーからなる群から選択される 請求項４に記載の可溶性免疫複合体。 ７．該検出可能な標識分子は、⁹⁰Ｙ、¹⁸⁶Ｒｅ、ＧｄIII、アビジン、ストレプト アビジン、及びビオチンからなる群から選択される、請求項４に記載の可溶性免 疫複合体。 ８．該キレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン四酢酸と、 下記の式（Ｉ）、（II）、または（III）で表される化合物とからなる群から選 択される、請求項４に記載の可溶性免疫複合体。 式（Ｉ） （式中、Ｘは、ＣＨか、又は、ＸとＺで共にＣＯでもよい、Ｙは、ＣＲ₄Ｒ₅、Ｃ Ｈ₂ＣＲ₄ＣＲ₅、又は（ＣＨ₂）₂ＣＲ₄Ｒ₅である。Ｒ₄とＲ₅は、同じであっても 異なるものでもよく、水素、アルキル基、置換されたアルキル基、アリール基、 置換されたアリール基からなる群から選択されるものである。Ｚは、該抗体断片 の該炭水化物部分と反応できる任意の基であるか、又は、ＺはＨであってもよい 。Ｒ₁は、該タンパク質の免疫反応性を大きく低下することのない条件下では除 去することができるチオール保護基である。Ｒ₂とＲ₃は、同じであっても異なる ものであってもよく、それぞれ、アシル基、置換されたアシル基、水素、アルキ ル基、 アリール基、置換されたアルキル基、又は置換されたアリール基であり、アルキ ル基又はアリール基の置換は、スルフヒドリル基、アミン、カルボン酸からなる 群から選択される金属配位基、又はそれらの保護された誘導体である。Ｒ₂Ｒ₃は 、また、該抗体断片の該炭水化物部分と反応することができる任意の基である。 ） 式（II） （式中、Ｄは、ＨかＣＨ₂ＳＲ₁であり、Ｅは該抗体断片の該炭水化物部分と反応 できる任意の基でもよい。Ｒ₁は、該タンパク質の免疫反応性を大きく低下する ことのない条件下で除去することのできるチオール保護基であり、ｍは０、１、 ２、３である。） 式（III） （式中、Ｑは、該抗体断片の該炭水化物部分と反応することができる任意の基で あり、Ｒ₁は、該タンパク質の免疫反応性を大きく低下することのない条件下で 除去することができるチオール保護基である。ｎは、それぞれ独立して、２か３ で ある。） ９．該キレート剤は、チオセミカルバジド及びヒドラジドからなる化合物から選 択される酸に不安定なリンカーによって該ポリマー担体と共有結合している、請 求項４に記載の可溶性免疫複合体。 １０．抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ、及 び一本鎖Ｆｖからなる群から選択され、該抗体断片は、該抗体断片の軽鎖のアミ ノ酸１８位近傍で炭水化物部分を含み、 担持担体は、少なくとも１つの遊離アミン基をもつポリマー担体、及びポ リマー担体と結合した多数の薬剤、毒素、キレート剤、ボロンアデンド、又は検 出可能な標識分子を含み、 該担持担体は、該ポリマー担体の該少なくとも１つの遊離アミン基を介し て、該抗体断片の該炭水化物部分と共有結合し、 該免疫複合体が該抗体断片の免疫反応性を保持している、 該担持担体と該抗体断片の炭水化物部分を共有結合することを含む、免疫複合体 の調整方法。 １１．（ａ）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ、及び一本 鎖Ｆｖからなる群から選択される糖鎖形成された抗体断片であって、軽鎖の可変 部のアミノ酸１８位近傍で結合した炭水化物部分をもつ該軽鎖可変部を含む糖鎖 形成された抗体断片と、 （ｂ）薬剤、毒素、キレート剤、ポリエチレングリコール、ボロンアデン ド、及び検出可能な標識分子からなる群から選択される少なくとも１つの非抗体 部分と を含む可溶性免疫複合体であって、 該非抗体部分は、それぞれ、該抗体断片の該炭水化物部分と共有結合し、 該免疫複合体は、該抗体断片の免疫反応性を保持している該可溶性免疫複合体 。 １２．該抗体断片は、該抗体断片の軽鎖のアミノ酸１８位近傍で、天然に存在し ないアスパラギン型糖鎖形成部位を含む変異抗体断片である、請求項１１に記載 の可溶性免疫複合体。 １３．該検出可能な標識分子は、⁹⁰Ｙ、¹⁸⁶Ｒｅ、ＧｄIII、アビジン、ストレプ トアビジン、及びビオチンからなる群から選択される請求項１１に記載の可溶性 免疫複合体。 １４．該キレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン四酢酸と 、下記の式（Ｉ）、（II）、または（III）で表される化合物とからなる群から 選択される、請求項１１に記載の可溶性免疫複合体。 式（Ｉ） （式中、Ｘは、ＣＨか、又は、ＸとＺで共にＣＯでもよい、Ｙは、ＣＲ₄Ｒ₅、Ｃ Ｈ₂ＣＲ₄ＣＲ₅、又は（ＣＨ₂）₂ＣＲ₄Ｒ₅である。Ｒ₄とＲ₅は、同じであっても 異なるものでもよく、水素、アルキル基、置換されたアルキル基、アリール基、 置換されたアリール基からなる群から選択されるものである。Ｚは、該抗体断片 の該炭水化物部分と反応できる任意の基であるか、又は、ＺはＨであってもよい 。Ｒ₁は、該タンパク質の免疫反応性を大きく低下することのない条件下では除 去することができるチオール保護基である。Ｒ₂とＲ₃は、同じであっても異なる ものであってもよく、それぞれ、アシル基、置換されたアシル基、水素、アルキ ル基、アリール基、置換されたアルキル基、又は置換されたアリール基であり、 アルキ ル基又はアリール基の置換は、スルフヒドリル基、アミン、カルボン酸からなる 群から選択される金属配位基、又はそれらの保護された誘導体である。Ｒ₂とＲ₃ は、また、該抗体断片の該炭水化物部分と反応することができる任意の基である 。） 式（II） （式中、Ｄは、ＨかＣＨ₂ＳＲ₁であり、Ｅは該抗体断片の該炭水化物部分と反応 できる任意の基でもよい。Ｒ₁は、該タンパク質の免疫反応性を大きく低下する ことのない条件下で除去することのできるチオール保護基であり、ｍは０、１、 ２、３である。） 式（III） （式中、Ｑは、該抗体断片の該炭水化物部分と反応することができる任意の基で あり、Ｒ₁は、該タンパク質の免疫反応性を大きく低下することのない条件下で 除去することができるチオール保護基である。ｎは、それぞれ独立して、２か３ である。） １５．該キレート剤は、チオセミカルバジド及びヒドラジドからなる化合物から 選択される酸に不安定なリンカーによって、該ポリマー担体と共有結合する請求 項１１に記載の可溶性免疫複合体。 １６．抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ、及 び一本鎖Ｆｖからなる群から選択され、 該抗体断片は、該抗体断片の軽鎖のアミノ酸１８位近傍で炭水化物部分を 含み、 非抗体部分は、薬剤、毒素、キレート剤、ポリエチレングリコール、ボロ ンアデンド、及び検出可能な標識分子からなる群から選択され、 免疫複合体は、該抗体断片の免疫反応性を保持している、 該非抗体部分を該抗体断片の炭水化物部分と共有結合させることを含む、免疫複 合体の調整方法。 １７．抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｖ、及 び一本鎖Ｆｖからなる群から選択され、 該抗体断片は、該抗体断片の軽鎖のアミノ酸１８位近傍で炭水化物部分を 含み、 非抗体部分は、薬剤、毒素、キレート剤、ポリエチレングリコール、ボロ ンアデンド、及び検出可能な標識分子からなる群から選択され、 免疫複合体は、該抗体断片の免疫反応性を保持している、 該非抗体部分を該抗体断片の炭水化物部分と共有結合させることを含む、免疫複 合体の調整方法。 １８．免疫複合体及び薬理学的に許容できる担体を含む、哺乳類において疾患の 存在を診断するのに使用するための組成物であって、該免疫複合体は、検出可能 な標識、及び、抗体断片の軽鎖のアミノ酸１８位近傍で炭水化物部分をもつ該抗 体断片を含み、該検出可能な標識は、該抗体断片の該炭水化物部分と結合し、該 抗体断片は、該疾患と関連のある抗原と特異的に結合する組成物。 １９．免疫複合体及び薬理学的に許容できる担体を含む、哺乳類において疾患を 治療するための組成物であって、該免疫複合体は、抗体断片の軽鎖のアミノ酸１ ８位近傍で結合した炭水化物部分をもつ該抗体断片と、薬剤、毒素、キレート剤 、ポリエチレングリコール、ボロンアデンド、及び治療に用いる放射性同位元素 からなる群から選択される非抗体部分とを含み、該非抗体部分は該抗体断片の該 炭水化物部分と共有結合し、該抗体断片は該疾患と関連のある抗原と特異的に結 合する組成物。