JPH09510087A

JPH09510087A - 酵母において発現する異種ｇ蛋白質結合受容体、ｇ蛋白質とその融合およびバイオアッセイにおけるその使用

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Publication number: JPH09510087A
Application number: JP7521439A
Authority: JP
Inventors: ポーシュ，マーク・ヘンリー; オーゼンバーガー，ブラッドリー・アルトン; ハドコック，ジョン・リチャード; プライス，ローラ・アリシア; カジコウスキ，アイリーン・マリー; キアシュ，ドナルド・リチャード; チャレフ，デボラ・ターディー
Original assignee: アメリカン・サイアナミド・カンパニー
Priority date: 1994-02-14
Filing date: 1995-02-14
Publication date: 1997-10-14
Also published as: US6406871B1; DE69534741D1; US20090081764A1; CA2183166A1; US5691188A; US20040023315A1; WO1995021925A1; EP0745130A1; SG49061A1; US6607906B1; DE69534741T2; ATE315657T1; EP0745130B1; US5846819A; US7148053B2; AU1846995A

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ｇ蛋白質結合受容体、例えば、ソマトスタチン受容体をコードする第１の異種ヌクレオチド配列と、Ｇ蛋白質αβγ複合体の全部または一部をコードする第２のヌクレオチド配列を含む発現ベクターおよびそれで形質転換された酵母細胞に関する。該異種蛋白質は、宿主細胞中で、リガンドの立体選択的結合および細胞膜の細胞質側のＧ蛋白質との機能的相互反応の両方に対して適性に配向して物理的に発現される。いくつかの具体例において、異種またはキメラＧα蛋白質をコードするヌクレオチド配列が、酵母Ｇ蛋白質βγサブユニットからのヌクレオチド配列と共に発現される。本発明の第２の態様は、キメラ酵母／異種Ｇ蛋白質結合受容体をコードする発現ベクターおよびそれで形質転換された酵母細胞を提供する。本発明の第３の態様は、そのような発現構造および酵母発現系を使用する、系中で発現した異種受容体に結合するリガンドの影響を測定するための化合物の分析法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】酵母において発現する異種Ｇ蛋白質結合受容体、Ｇ蛋白質とその融合およびバイオアッセイにおけるその使用発明の分野本発明は、異種Ｇ蛋白質-結合受容体発現構築物、かかる受容体を発現する酵母細胞、かかる細胞を作製するに有用なベクター、ならびにその作製および使用に関する。発明の背景多くの細胞外シグナル、例えば：神経伝達物質、ホルモン、臭気物質および光の作用は、７個の貫膜ドメイン(Ｇ蛋白質-結合受容体)、およびヘテロ三量体グアニンヌクレオチド-結合調節蛋白質(Ｇ蛋白質)を有する受容体によって仲介される。Ｇ蛋白質は、３種のサブユニット：グアニル-ヌクレオチド結合αサブユニット；βサブユニット；およびγサブユニットよりなる[概説に関しては、コンクリン,ビイ・アール(Ｃonklin,Ｂ.Ｒ.)およびボルネ,エイチ・アール(Ｂourne ,Ｈ.Ｒ.)(１９９３、セル(Ｃell)７３、６３１-６４１)参照]。Ｇ蛋白質は、ＧＤＰまたはＧＴＰがαサブユニットに結合するか否かに依存して、２種の型の間を循環する。ＧＤＰが結合した場合には、Ｇ蛋白質はヘテロ三量体Ｇαβγとして存在する。ＧＴＰが結合した場合には、αサブユニットが解離してＧβγ複合体が残る。重要なことは、細胞膜においてＧαβγ複合体が活性化Ｇ蛋白質結合受容体と機能的に会合した場合に、結合ＧＤＰにＧＴＰが交換される速度が上昇し、よって、Ｇβγ複合体からの結合Ｇαサブユニットの解離速度が上昇する。遊離ＧαサブユニットおよびＧβγ複合体は、種々のシグナル変換経路の下流エレメントへとシグナルを伝達することができる。この事象の基本的スキームは、種々の細胞シグナリング現象の多様性の基礎をなす(概説については、エイチ・ジイ・ドールマン(Ｈ.Ｇ.Ｄohlman)、ジェイ・ソーナー(Ｊ.Ｔhorner)、エム・キャロン(Ｍ.Ｃaron)およびアール・ジェイ・レフコビッツ(Ｒ.Ｊ.Ｌefkowitz)アニュアル・レビュー・イン・バイオケミストリー(Ａnn.Ｒev.Ｂiochem.)６０、６５３- ６８８(１９９１)参照)。Ｇ蛋白質-仲介シグナリング系は、酵母およびヒトのような異なる生物に存在する。酵母サッカロマイセス・セレビシアエ(Saccharomyce s cerevisiae)はモデル真核生物として利用されている。酵母サッカロマイセス・セレビシアエの遺伝子的構築をだれもが操作できる簡便性により、研究者は多くの複雑な生物学的経路の詳細な理解を進めている。蛋白質構造の進化的な保存が、多くの異種蛋白質をその酵母相当物に置き換えることができるようなものであることが膨大な系で示されてきている。例えば、哺乳動物Ｇα蛋白質は酵母Ｇ βγ蛋白質とヘテロ三量体複合体を形成し得る[カン,ワイ-エス(Ｋang,Ｙ.-Ｓ.) 、ケイン・ジェイ(Ｋane,Ｊ.)、カラヤン,ジェイ(Ｋurjan,Ｊ.)、ステーデル・ジェイ・エム(Ｓtadel,Ｊ.Ｍ.)およびティッパー,ディー・ジェイ(Ｔipper,Ｄ.Ｊ. )(１９９０)モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Ｍol.Ｃell.Ｂiol .)１０、２５８２-２５９０]。Ｇ蛋白質-結合受容体は、新規な治療薬剤の重要な標的を表す。かかる薬剤の発見には、高い特異性および処理量のスクリーニングアッセイが必然的に必要であろう。例えば、ソマトスタチン-成長ホルモン・アキシスにおける治療的介入には、ソマトスタチン受容体サブタイプ-選択性様式で作用する新規な化学剤が必要である。ソマトスタチン受容体(ＳＳＴＲ)は、哺乳動物細胞における受容体の７個の貫膜-ドメインクラスのプロトタイプである。視床下部から最初に単離され、下垂体前葉から放出される成長ホルモンの潜在的なインヒビターであることが示されている環状テトラデカペプチドであるソマトスタチンは、ＣＮＳおよび末梢組織における広範な調節作用を有することが示されている。ソマトスタチンの結合に応答して、ＳＳＴＲがヘテロ三量体Ｇ蛋白質を活性化し、このことが、限定するものではないが、アデニル酸シクラーゼ、イオンチャンネルおよびホスホリパーゼを包含する種々のエフェクター蛋白質の活性を代わって修飾する。ソマトスタチンの効果は、最近クローン化された５種の異なる受容体サブタイプ[ストルナド,ジェイ(Ｓtrnad,Ｊ.)、エップラー,シイ・エム(Ｅppler,Ｃ.Ｍ.)、コルベット,エム(Ｃorbett,Ｍ.)およびハドコック, ジェイ・アール(Ｈadcock,Ｊ.Ｒ.)(１９９３)ビイビイアールシー(ＢＢＲＣ)１９１、９６８-９７６；ヤマダ,ワイ(Ｙamada,Ｙ.)、ポスト,エス・アール(Ｐost,Ｓ.Ｒ.) 、ワン,ケイ(Ｗang,Ｋ.)、タガー,エイチ・エス(Ｔager,Ｈ.Ｓ.)、ベル,ジイ・アイ(Ｂell,Ｇ.Ｉ.)およびセイノ,エス(Ｓerino,Ｓ.)(１９９２)プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユウエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)８９、２５１-２５５；メイアーホフ,ダブリュ(Meyerhof,Ｗ.)、ポースト,エイチ-ジェイ(Paust,Ｈ.-Ｊ.)、シュンロック, ツェー(Ｓchonrock,Ｃ.)およびリヒター,デー(Ｒichter,Ｄ.)(１９９１)；クルクセン,エフ-ベ(Ｋluxen,Ｆ.-Ｗ.)、ブルンス,ツェー(Ｂruns,Ｃ.)およびルッベルト,ハー(Ｌubbert,Ｈ.)(１９９２)プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユウエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ)８９、４６１８-４６２２；リ,エックス-ジェイ(Ｌi,Ｘ.-Ｊ.)、フォルテ,エム(Ｆorte,Ｍ.)、ノース,アール・エイ(Ｎorth,Ｒ.Ａ.)、ローズ,シイ・エイ(Ｒose,Ｃ.Ａ.)およびスナイダー,エス(Ｓnyder,Ｓ.)(１９９２)ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.)２６７、２１３０７-２１３１２；ブルーノ,ジェイ・エフ(Ｂruno,Ｊ.Ｆ.)、ズ,ワイ(Ｘu,Ｙ.)、ソン, ジェイ(Ｓong,Ｊ.)およびベレロビッツ,エム(Ｂerelowitz,Ｍ.)(１９９２)プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユウエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)８９、１１１５１−１１１５４；オキャロル,エイ-エム(Ｏ'Ｃarrol,Ａ.-Ｍ.)、ローレイト,エス・ジェイ(Ｌolait ,Ｓ.Ｊ.)、クーニッヒ,エム(Ｋonig,Ｍ.)およびマーハン,エル(Ｍahan,Ｌ.)(１９９２)モレキュラー・ファーマコロジー(Ｍol.Ｐharmacol.)４２、９３９-９４６)]にコードされる遺伝子産物の作用を通して変換される。Ｇ蛋白質-結合受容体の機能的発現に適応するように遺伝子的に改変した酵母株を利用したスクリーニングアッセイにより、ソマトスタチン受容体へのリガンドの結合、ならびに種々の疾病状態に関与する他の受容体の宿主を包含する研究に大きな利点が付与される。発明の概要本発明の第一の態様は、Ｇ蛋白質-結合受容体(例えば、ソマトスタチン受容体 )をコードする第一の異種ヌクレオチド、およびＧ蛋白質αβγ複合体の全体または一部をコードする第二のヌクレオチド配列を含む発現ベクターならびにそれで形質転換した酵母細胞に関する。ある種の具体例において、異種Ｇ蛋白質αサブユニットをコードするヌクレオチド配列の全体または一部を酵母Ｇ蛋白質αサブユニットからのヌクレオチド配列に融合する。ある種の好ましい具体例において、発現ベクターおよび形質転換細胞には、フェロモン応答性プロモーターおよびそのフェロモン-応答性プロモーターから下流に位置しそれと作動可能に連結したインジケーター遺伝子よりなる第三の異種ヌクレオチド配列が含まれる。該ベクターおよび細胞には、さらに数種の突然変異が含まれ得る。これらには、１）酵母Ｇα蛋白質を不活化して異種受容体とＧ蛋白質との相互作用を促進する酵母ＳＣＧ１/ＧＰＡ１遺伝子の突然変異；２）酵母遺伝子の機能を不活化して、フェロモン応答性シグナル変換経路の活性化にも拘わらず酵母細胞を増殖させ続けることができる酵母遺伝子の突然変異(好ましい具体例はＦＡＲ１および/またはＦＵＳ３遺伝子の突然変異)；ならびに３）その効果がフェロモン応答性シグナル変換経路の受容体-依存性活性化に対する細胞の応答性の感度を顕著に上昇させる酵母遺伝子の突然変異(この点で好ましい遺伝子はＳＳＴ２、ＳＴＥ５０、ＳＧＶ１、ＳＴＥ２、ＳＴＥ３、ＰＩＫ１、ＡＦＲＩ、ＭＳＧ５およびＳＩＧ１遺伝子)が含まれる。本発明の第二の態様は、異種Ｇ蛋白質結合受容体をコードする異種ヌクレオチド配列と作動可能に連結した酵母Ｇ蛋白質結合受容体をコードする第一のヌクレオチド配列よりなるキメラ発現構築物およびそれで形質転換した酵母細胞である。該構築物および細胞には、フェロモン-応答性プロモーターおよび該フェロモン-応答性プロモーターの下流に位置しそれと作動可能に連結したインジケーター遺伝子よりなる第二の異種ヌクレオチド配列が含まれ得る。該構築物および細胞には、さらに、数種の突然変異が含まれ得る。これらには、１）酵母細胞の機能を不活化し、フェロモン応答性シグナル変換経路の活性化にも拘わらず酵母細胞を増殖させ続けることができる酵母遺伝子の突然変異(好ましい具体例はＦＡＲ１および/またはＦＵＳ３遺伝子の突然変異)；および２）その効果が、フェロモン応答性シグナル変換経路の受容体-依存性活性化に対する細胞の応答性の感度を顕著に上昇させることである酵母遺伝子の突然変異(この点において好ましい遺伝子はＳＳＴ２、ＳＴＥ５０、ＳＧＶ１、ＳＴＥ２、ＳＴＥ３、ＰＩＫ１、ＡＦＲＩ、ＭＳＧ５およびＳＩＧ１遺伝子)が含まれる。産生するシグナルは、該異種受容体が酵母蛋白質に結合することを介したバイオアッセイで検出する。本発明の第三の態様は、細胞増殖性に対する効果を測定することによって異種受容体へのリガンド結合の効果を測定するための化合物アッセイ法である。ある種の好ましい具体例において、前記した種の酵母細胞を適当な増殖培地で培養して寒天増殖培地に固定した異種蛋白質の発現を引き起こし、該寒天プレートの表面に適用した化合物に暴露する。固定した細胞の増殖性に対する効果は、異種受容体を活性化する化合物周辺に予想される。増殖の上昇がアゴニストとして作用する化合物で認められ得るのに対して、増殖の低下はアンタゴニストとして作用するもので認められ得る。図面の簡単な説明図１．接合フェロモン(α因子)で処理した、示したＧα発現プラスミドを含有する菌株。得られるシグナル変換の測定は、ＦＵＳ１-ｌａｃＺを運搬するレポーターによって供される。データは、野生型Ｇα蛋白質を唯一発現する株で測定したβ-ガラクトシダーゼ活性の％として表す。図２．接合フェロモン(α因子)で処理した、示したＣＵＰ１ｐ-Ｇα発現プラスミドを含有し、処置濃度の銅を含有する培地で増殖させた株。得られるシグナル変換の測定は、ＦＵＳ１-ｌａｃＺを運搬するレポータープラスミドによって供される。データは、異種Ｇα蛋白質を全く発現しない株において測定したβ- ガラクトシダーゼ活性の％として表す。図３．５ＨＴ１ａセロトニン受容体を発現する菌株(ＣＹ３８２)から調製した酵母膜画分に対する³Ｈ-スピペロンの飽和結合。Ｂｍａｘ＝３.２ｐｍｏｌ/ｍｇ蛋白質；Ｋｄ＝１１５ｎＭ。図４．アミノ-末端キメラＳｔｅ２/５ＨＴ１ａ受容体。ＣＨＩ１１受容体には、酵母Ｓｔｅ２蛋白質の最初の１４アミノ酸が含まれる。ＣＨＩ１１７受容体は、Ｓｔｅ２受容対の相当する領域と最初の２種の貫膜ドメインを通る５ＨＴ１ａ受容対のアミノ末端の置換を有する。ＣＨＩ１８受容体は、５ＨＴ１ａ受容体のアミノ末端に直接融合して細胞膜を９回またがると予想される受容体を作製する同一のＳｔｅ２配列を有する。Ｂｍａｘ値は、放射性同位体標識リガンドである³ Ｈ-スピペロンの最大結合を測定することによって決定した。値は、ｍｇ全蛋白質当たりのｐｍｏｌ放射性同位体標識リガンド結合性として供する。図５．β-アドレナリン受容体を発現する野生型酵母株から調製した粗製膜抽出物での、¹²⁵Ｉ-シアノピンドロールに対するアゴニストであるイソプロテレノールまたはエピネフリンの競合結合解析。データは％最大放射性同位体標識リガンド結合として表す。ＩＣ₅₀値＝１０ｎＭ、イソプロテレノール；２００ｎＭ、エピネフリン。図６．β₂-アドレナリン受容体および哺乳動物Ｇ_asを同時に発現する酵母株から調製した抽出物での、¹²⁵Ｉ-シアノピンドロールに対するアゴニストであるイソプロテレノールまたはエピネフリンの競合結合解析。データは％最大放射性同位体標識リガンド結合として表す。ＩＣ₅₀値＝１０ｎＭ、イソプロテレノール；６０ｎＭ、エピネフリン。図７．ＳＳＴＲ２サブタイプおよびＳｃｇｌ/Ｇ_iα2を同時に発現する酵母細胞の膜に対する[¹²⁵Ｉ]ｔｙｒ¹¹Ｓ-１４の飽和結合。ＳＳＴ２サブタイプを発現する酵母細胞からの膜は、「実験方法」に記載するごとく調製した。飽和結合は、２０-１６００ｐＭの[¹²⁵Ｉ]ｔｙｒ¹¹Ｓ-１４で行った。１μＭのコールドＳ- 14存在下のｃｐｍ結合としての各時点での非-特異的結合は、１０〜４０％の範囲である。示すのは、２回行ったうちの代表的な一実験である。図８．ソマトスタチン受容体発現を示すイムノブロット。膜画分は、示した酵母株から単離する。５〜３０μｇの蛋白質のアリコットを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動/ウエスタンブロット分析によって検査する。分子量マーカーはキロダルトンで示す。矢印は、ソマトスタチン受容体蛋白質のバンドを示す。数種のこの受容体が認められる；４３ｋｄの単一の受容体にくわえて、ダブレットおよびトリプレットのバンド。レーン、１＋２、ＣＹ６０２(表１参照)；３＋４、ＣＹ６０３；５＋６、ＣＹ６２４；７、受容体を発現しない同種株。図９．ムスカリン・アセチルコリン受容体(ｍＡｃｈＲ)発現を示すイムノブロット。膜画分は、示した酵母株から単離する。蛋白質３０μｇのアリコットを、本明細書に記載するごとく、ポリアクリルアミドゲル電気泳動/ウエスタンブロット分析によって検査する。分子量マーカーは、キロダルトンで示す。矢印は、ｍＡｃｈＲ蛋白質のバンドを示す。図１０．α２-ＡＲ発現を示すイムノブロット。膜画分は、示した酵母株から単離する。蛋白質３０μｇのアリコットを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動/ ウエスタンブロット分析によって検査する。分子量マーカーは、キロダルトンで示す。矢印は、α２-ＡＲ蛋白質のバンドを示す。図１１．ソマトスタチン受容体発現プラスミド、ｐＪＨ１。図１２．Ｇ蛋白質発現プラスミド、ｐＬＰ８２。図１３(ＡおよびＢ)．ソマトスタチンに対する酵母細胞の用量依存性増殖応答性。酵母株ＬＹ２６８の培養物を寒天に固定する(上部プレート)か、または寒天プレート表面上に一様に広げ(底部のプレート)、該寒天の上部に置いたペーパーディスクにスポットした所定量の示した化合物に暴露する。プレートは、３０℃ にてインキュベートする。図１４(Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ)．発現するキメラＧ蛋白質量に依存する、ソマトスタチンに暴露した酵母株の増殖応答性。本明細書に記載した酵母株の培養物を寒天に固定し、該寒天上部に置いたペーパーディスクにスポットした所定量の示した化合物に暴露する。プレートは、３０℃にてインキュベートする。図１５(Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ)．発現する酵母Ｇ蛋白質量に依存する、ソマトスタチンに暴露した酵母株の増殖応答性。本明細書に記載した酵母株の培養物を寒天に固定し、該寒天上部に置いたペーパーディスクにスポットした所定量の示した化合物に暴露する。プレートは、３０℃にてインキュベートする。図１６(ＡおよびＢ)．接合フェロモンに暴露した場合にＡＴに対して耐性の上昇を示す、ｓｓｔ２遺伝子中に突然変異を有する酵母細胞。酵母株の培養物を寒天に固定し、該寒天上部に置いたペーパーディスクにスポットした所定量のα接合因子に暴露する。プレートは、３０℃にてインキュベートする。図１７(Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ)．ソマトスタチンに暴露した酵母細胞の増殖を上昇する、ｓｓｔ２遺伝子中の突然変異。本明細書に記載した酵母株の培養物を寒天に固定し、該寒天上部に置いたペーパーディスクにスポットした所定量の示した化合物に暴露する。プレートは、３０℃にてインキュベートする。図１８．酵母で発現するラットＣＣＫ_B受容体に対するリガンド-結合性。ＬＹ６３１細胞の一晩液体培養物から粗製膜画分を調製し、「方法および材料」に記載するごとく、アゴニスト飽和結合アッセイを行った。飽和結合は、４-６０ｎＭ[³Ｈ]ＣＣＫ-８(２５μｇ蛋白質/試験管)で行った。１μＭコールドＣＣＫ-８存在下におけるｃｐｍ結合としての各時点の非-特異的結合は２０〜６０％の範囲であった。２回行ったうちの代表的な一実験を示す。図１９(ＡおよびＢ)．ＣＣＫ_B受容体アゴニストに応答しての酵母の増殖性。「方法および材料」に記載するごとく培養した、ラットＣＣＫ_B受容体(ＬＹ６２８、ＬＬＹ６３１)を機能的に発現する酵母株を、ＳＣガラクトース(２％)-ｕｒａ、ｔｒｐ、ｈｉｓ寒天培地(２×１０⁴細胞/ｍl)に平板した。滅菌フィルターディスクを固化した寒天表面上に置き、示した化合物１０μl量を含むＤＭＳＯ１０μlで飽和した。ついで、プレートを３０℃にて３日間インキュベートした。( Ａ)ＣＣＫ-８、(Ｂ)ＣＣＫ-４。図２０．Ａ_2a-アデノシン受容体飽和結合アッセイ。放射性同位体標識リガンド結合アッセイは、プロテアーゼインヒビター(５μｇ/ｍl ロイペプチン、５μ ｇ/ｍl アプロチニン、１００μｇ/ｍl バシトラシン、および１００μｇ/ｍl ベンズアミジン)を含有する結合緩衝液(５０ｎＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、１０ｍＭＭｇＣl₂、０.２５％ＢＳＡ)を用いた９６-ウェルマイクロリッタープレート中で行った。全ての成分は、プロテアーゼインヒビターを含有する結合緩衝液中で希釈し、以下の順序でマイクロリッタープレート・ウェルに添加した：結合緩衝液、コールド競合物(ＮＥＣＡ、最終濃度１μＭ)、[³Ｈ]ＮＥＣＡ(１- ５０ｎＭ)。１７０μl容量中の膜蛋白質８２μｇを添加することによって、結合反応を開始させた。最終反応容量は２００μl/ウェルであった。全てのインキュベーションは、室温にて２時間行った。イノテック・セル・ハーベスター(Ｉnotec h cell harvester)を用いたガラスファイバー・フィルターを通す高速濾過によって、遊離放射性同位体標識リガンドを結合リガンドから分離した。ついで、計数する前に、ＢＳＡを欠く冷(４℃)結合緩衝液で、フィルターディスクを数回洗浄した。図２１．Ａ_2Aアデノシン受容体アゴニストに応答しての酵母の増殖性。「材料および方法」に記載するごとく培養したＬＹ５９５細胞を、ＳＣガラクトース( ２％)-ｕｒａ、ｔｒｐ、ｈｉｓ寒天培地に平板した(２×１０⁴細胞/ｍl)。滅菌フィルターディスクを固化した寒天表面に置き、示した化合物１０μｇを含有するＤＭＳＯ１０μlで飽和した。ついで、プレートを３０℃にて３日間インキュベートした。(Ａ、Ｂ)ＣＧＳ-２１６８０、(Ｂ)ＮＥＣＡ、(Ｃ)ＤＰＭＡ。図２２．ソマトスタチン受容体アゴニストに応答しての、ＳＳＴＲ５を含有する酵母細胞の増殖性。「材料および方法」に記載するごとく培養したＬＹ６２０細胞を、ＳＣガラクトース(２％)-ｕｒａ、ｔｒｐ、ｈｉｓ寒天培地に平板した (２×１０⁴細胞/ｍl)。滅菌フィルターディスクを固化した寒天表面に置き、所定量の示した化合物を含有する滅菌水１０μlで飽和した。ついで、プレートを３０℃にて３日間インキュベートした。(Ａ)６０ｎｍｏｌＳ−１４、(Ｂ)３０ｎｍｏｌＳ−２８。図２３．ソマトスタチン受容体アゴニストに応答しての、ブタＳＳＴＲ２を含有する酵母細胞の増殖性。「材料および方法」に記載するごとく培養したＬＹ４７４(２種の独立単離株：２１、２２)を、ＳＣガラクトース(２％)-ｕｒａ、ｔｒｐ、ｈｉｓ寒天培地に平板した(２×１０⁴細胞/ｍl)。滅菌フィルターディスクを、固化した寒天表面に置き、所定量の示した化合物を含有する滅菌水１０μ lで飽和した。ついで、プレートを３０℃にて３日間インキュベートした。(１) ６００ｐｍｏｌ、(２)６０ｐｍｏｌ。図２４．酵母バイオアッセイの感度を上昇するＭＳＧ５の欠失。酵母株の培養物を「材料および方法」に記載するごとく誘導してＳＳＴＲ２を発現させ、ＳＣガラクトース(２％)-ｕｒａ、ｔｒｐ、ｈｉｓ寒天培地に平板した(２×１０⁴細胞/ｍl)。滅菌フィルターディスクを固化した寒天表面に置き、所定量のＳ-１４を含有する滅菌水１０μlで飽和した。ついで、プレートを３０℃にて３日間インキュベートした。(Ａ)ＭＰＹ４５９ｓｓｔ２ΔＡＤＥ２ｍｓｇ５ΔＬＥＵ２、(Ｂ)ＭＰＹ４５８ＳＳＴ２ｍｓｇ５ΔＬＥＵ２、(Ｃ)ＬＹ２８８ＳＳＴ２ＭＳＧ５、(Ｄ)ＬＹ２６８ｓｓｔ２ΔＡＤＥ２ＭＳＧ５。図２５(ＡおよびＢ)．ＧＲＦ受容体アゴニストに応答しての酵母の増殖性。「材料および方法」に記載するごとく培養したＣＹ９９０細胞を、ＳＣガラクトース(２％)-ｕｒａ、ｔｒｐ、ｈｉｓ寒天培地に平板した(２×１０⁴細胞/ｍl)。滅菌フィルーディスクを固化した寒天表面に置き、示した化合物２０ｎｍｏｌを含有する滅菌水１０μlで飽和した。ついで、プレートを３０℃にて３日間インキュベートした。(Ａ)ｈＧＲＦ(１-２９)-ＮＨ₂、(Ｂ)ｈＧＲＦ(１-２９)、(Ｄ-ａｒｇ²)-ｈＧＲＦ(１-２９)。図２６(ＡおよびＢ)．ＳＳＴＲ２バイオアッセイに対するＳＴＥ５０過剰発現の効果。アッセイ培地および酵母株は「材料および方法」に記載するごとく調製した。プレートＡにはＳＴＥ５０過剰発現株ＣＹ５６０が含まれ；プレートＢには対照株ＣＹ５６２が含まれる。以下のペプチド溶液で飽和したフィルターディスクを各プレートに適用した：１ｍＭ酵母αフェロモン(左側中段)、１μｇ/ｍl ソマトスタチン-１４(右側上段)、１００μｇ/ｍlソマトスタチン-１４(右側下段)。プレートは、３０℃にて３日間インキュベートした。図２７(ＡおよびＢ)．ソマトスタチン受容体および/またはアンタゴニスト特性を有する化合物のバイオアッセイ。ＬＹ３６４細胞をＳＣガラクトース(２％) -ｕｒａ、ｔｒｐ、ｈｉｓ寒天培地に平板した(２×１０⁴細胞/ｍl)。アンタゴニストのアッセイのために、注入前に、溶解した寒天にソマトスタチン(２０ｎＭＳ-１４)を添加した。滅菌フィルターディスクを固化した寒天表面に置き、試験化合物を含有する滅菌水１０μlで飽和した。ついで、プレートを３０℃にて３日間インキュベートした。(左)ソマトスタチン・アゴニストに関するアッセイ。ソマトスタチン(Ｓ-１４)を底部列の位置に適用した。左側(６ｎｍｏｌ、６００ｐｍｏｌ、６０ｐｍｏｌ、６００ｐｍｏｌ)(右)ソマトスタチン・アンタゴニストに関するアッセイ。ソマトスタチン(Ｓ-１４)を底部列の位置に適用した。左側(６ｎｍｏｌ、６００ｐｍｏｌ、６０ｐｍｏｌ、６００ｐｍｏｌ)。図２８(ＡおよびＢ)．ソマトスタチンに応答してのシグナリング効率を低下する、ＳＳＴＲ２のアミノ末端へのＳＴＥ２配列の融合。ＬＹ２６８およびＬＹ３２２細胞をＳＣガラクトース(２％)-ｕｒａ、ｔｒｐ、ｈｉｓ寒天培地に平板した(２×１０⁴細胞/ｍl)。固化した寒天表面に滅菌フィルターディスクを置き、ソマトスタチン(Ｓ-１４)１０μlで飽和した。ついで、プレートを３０℃にて３日間インキュベートした。(Ａ)ＬＹ２６８。Ｓ-１４を、上部から右回りにフィルターディスクに適用した：担体、６０ｎｍｏｌ、６ｎｍｏｌ、６００ｐｍｏｌ、６０ｐｍｏｌ、６ｐｍｏｌ。(Ｂ)ＬＹ３２２。Ｓ-１４を、上部から右回りにフィルターディスクに適用した：０.６ｐｍｏｌ、担体、６０ｎｍｏｌ、６ｎｍｏｌ、６００ｐｍｏｌ、６０ｐｍｏｌ、６ｐｍｏｌ。発明の詳細な説明本明細書においては、ヌクレオチド塩基を以下のごとく略する：Ａ-アデニンＧ-グアニンＣ-シトシンＴ-チミンＵ-ウラシル(本明細書においては、しばしば「ｕｒａ」と略する) 本明細書においてはアミノ酸残基を以下のごとく３文字または１文字に略する：Ａｌａ；Ａ-アラニンＬｅｕ；Ｌ-ロイシンＡｒｇ；Ｒ-アルギニンＬｙｓ；Ｋ-リジンＡｓｎ；Ｎ-アスパラギンＭｅｔ；Ｍ-メチオニンＡｓｐ；Ｄ-アスパラギン酸Ｐｈｅ；Ｆ-フェニルアラニンＣｙｓ；Ｃ-システインＰｒｏ；Ｐ-プロリンＧｌｎ；Ｑ-グルタミンＳｅｒ；Ｓ-セリンＧｌｕ；Ｅ-グルタミン酸Ｔｈｒ；Ｔ-スレオニンＧｌｙ；Ｇ-グリシンＴｒｐ；Ｗ-トリプトファンＨｉｓ；Ｈ-ヒスチジンＴｙｒ；Ｙ-チロシンＩｌｅ；Ｉ-イソロイシンＶａｌ；Ｖ-バリン「ＤＮＡ」および「ヌクレオチド配列」なる語は、相互交換的に用い、限定されるものではなく、適当な場合にはＲＮＡを含む、ヌクレオチド塩基よりなるすべての形態の直鎖状ポリマーを包含することを意味する。本明細書にて用いる「哺乳動物」なる語は、いずれかの哺乳動物種(例えば、ヒト、マウス、ラットおよびサル)をいう。「異種」なる語は、本明細書では酵母に関して用い、よって、ＤＮＡ配列、蛋白質および酵母以外の生物(例えば、哺乳動物、鳥類、両生類、昆虫、植物)起源の他の物質、または酵母では天然に見い出されないその組合せをいう。本明細書にて用いる「上流」および「下流」なる語は、転写および翻訳の向きをいい、他の配列の前に転写または翻訳される配列を後者の「上流」という。いずれのＧ-蛋白質-結合受容体、またはその一部、ならびにそれと同一物をコードするヌクレオチド配列も本発明を実施するに使用することができる。かかる受容体の例には、限定するものではないが、アデノシン受容体、ソマトスタチン受容体、ドーパミン受容体、コレシストキニン受容体、ムスカリンコリン受容体、α-アドレナリン受容体、β-アドレナリン受容体、オピエート受容体、カンナビノイド受容体、成長ホルモン放出因子、グルカゴンおよびセロトニン受容体が含まれる。本明細書にて用いる受容体なる語は、命名した受容体のサブタイプ、ならびにその突然変異および相同物を、同一物をコードするヌクレオチド配列と共に包含することを意図する。また、当業者であれば、ある種の例において、望む目的を達成するためには全体の受容体が発現されることが必要となり得ることは理解されるであろう。したがって、受容体なる語は、限定するものではなく、所与の受容体の切断および他の変形形態を含むことを意味する。Ｇαサブユニット(Ｇα)をコードするいずれのＤＮＡ配列も、本発明を実施するに用いることができる。Ｇαサブユニットの例には、限定するものではないが、Ｇｓサブユニット、Ｇｉサブユニット、Ｇｏサブユニット、Ｇｚサブユニット、Ｇｑ、Ｇ１１、Ｇ１６および変換サブユニットが含まれる。本発明を実施するに有用なＧ蛋白質およびサブユニットには、サブタイプ、ならびにその突然変異および相同物と共に、それらの同一物をコードするＤＮＡ配列が含まれる。当業者であれば、本発明の構築物および酵母細胞において有用なＧ蛋白質が、異種Ｇαサブユニット、酵母Ｇαサブユニット、またはキメラ酵母/異種バージョンよりなり得ることが、本明細書に示した技術から理解されるであろう。本明細書で教示したごとく単純にベクターを構築することによって、特定の異種受容体に適当に結合するのにいずれの立体配置が最も適するか、および所与のアッセイに応答してリガンド結合のシグナリングを測定することを容易に決定することができる。ある種の好ましい具体例において、特に異種Ｇ結合蛋白質がソマトスタチン受容体の全体または一部である場合には、Ｇα_i2が選択のＧαサブユニットである。該Ｇα_i2サブユニットが酵母Ｇαβγ複合体に結合するのが、この例においては特に好ましい。また、ある種のキメラ構築物も、特定の異種受容体に関するシグナル変換を上昇することができる。特に好ましいのは、酵母ＧＰＡ１ /ＳＣＧ１のアミノ末端ドメインと異種Ｇαｉ、Ｇαｓおよび特にＧα_i2のカルボキシ末端ドメシンの融合から形成したキメラ構築物である。Ｇβγサブユニット(Ｇβγ)をコードするいずれのＤＮＡ配列も、本発明を実施するに使用することができる。本発明を実施するに有用なＧ蛋白質およびサブユニットには、サブタイプならびにその突然変異および相同物がそれらの同一物をコードするＤＮＡ配列と共に含まれる。宿主細胞は、異種Ｇαを発現するようにそれらを設計するのと同様にして、内因性Ｇβγを発現することができ、あるいは、所望により、異種Ｇβγ(例えば、哺乳動物)を発現するように設計することもできる。異種ＤＮＡ配列は、発現「構築物」または「ベクター」手段によって宿主で発現される。発現ベクターとは、その中で、異種ＤＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列が、意図する宿主における異種ＤＮＡ配列付近にコードされる蛋白質またはタンパク質サブユニットの発現に影響し得る適当な制御配列に作動可能に連結された複製性のＤＮＡ構築物である。一般的に、真核生物制御配列には、転写プロモーターが含まれるが、しかし、適当なｍＲＮＡリボソーム結合サイトをコードする配列、および(所望により)転写の終結を制御する配列が供されることも適当となり得る。本発明を実施するに有用なベクターには、プラスミド、(バクテリオファージを含む)ウイルス、および組込み可能なＤＮＡ断片(すなわち、遺伝子組換えによって宿主ゲノムに組込まれ得る断片)が含まれる。ベクターは、プラスミドの場合と同様に、複製でき、かつ宿主ゲノムとは独立して機能し得、あるいは組込み可能なＤＮＡ断片の場合と同様に、それ自体でゲノムに組込まれ得る。適当なベクターには、意図する発現宿主と和合性の種由来である複製開始点および制御配列が含まれるであろう。例えば、宿主細胞で作動可能なプロモーターは、その細胞のＲＮＡポリメラーゼに結合するものであり、宿主細胞で作動可能なリボソーム結合部位はその細胞の内因性リボソームに結合するものである。ＤＮＡ領域が互いに機能的に関連する場合には、それらは作動可能に連結されている。例えば：プロモーターが配列の転写を制御する場合、それは作動可能にコード配列に連結されており；リボソーム結合部位が転写を許容するよう位置する場合、それはコード配列に作動的に結合している。一般的に、作動可能に連結するとは、隣接することを意味し、リーダー配列の場合には、隣接して読み相(r eading phase)にあることを意味する。本発明の形質転換宿主細胞とは、組換えＤＮＡ技術を用いて構築したベクターで形質転換またはトランスフェクションした細胞であり、これは異種ＤＮＡ配列によってコードされる蛋白質または蛋白質サブユニットを発現する。種々の酵母培養物および酵母細胞を形質転換するのに適当な発現ベクターは知られている( 例えば、米国特許第４,７４５,０５７号；米国特許第４,７９７,３５９号；米国特許第４,６１５,９７４号；米国特許第４,８８０,７３４号；米国特許第４,７１１,８４４号；米国特許第４,８６５,９８９号参照)。サッカロマイセス・セレビシアエ(Ｓaccharomyces cerevisiae)は、多種の他の酵母種も通常利用できるが、酵母の中では最も一般的に用いられる(例えば、米国特許第４,８０６,４７２号(クルベロマイセス・ラクティス(Ｋluveromyces lactis)およびその発現ベクター)；第４,８５５,２３１号(ピチア・パストリス(Ｐichia pastoris)およびその発現ベクター)参照)。酵母ベクターには、酵母細胞においてプラスミドに高コピー数で複製する能力を付与する内因性２μ酵母プラスミドまたは自律複製配列(ＡＲＳ)からの複製起源、酵母細胞において低コピー数のみで複製するようプラスミドの能力を制限するセントロメア(centromeric)(ＣＥＮ)配列、プロモーター、異種ＤＮＡ配列をコードするＤＮＡ、ポリアデニル化および転写終結の配列、ならびに選択マーカー遺伝子が含まれる。例示的なプラスミド、ならびに同プラスミドを作製し用いる材料および方法の説明は、実施例のセクションに記載する。酵母系において機能し得るいずれのプロモーターも、本発明の構築物および細胞の使用に選択できる。酵母ベクター中の適当なプロモーター配列には、メタロチオネイン、３-ホスホグリセレートキナーゼ(ＰＧＫ)[ヒッツェマン(Ｈitzeman )ら、(１９８０)ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol. Ｃhem.)２５５、２０７３]、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのごとき他の解糖系酵素[ヘス(Ｈess)ら、(１９６８)ジェイ・アドブ・エンザイム・レギ(Ｊ.Ａdv.Ｅnzyme Ｒeg.)７、１４９；およびホーランド(Ｈolland)ら、(１９７８)バイオケミストリー(Ｂio- chemistry)１７、４９００]のプロモーターが含まれる。酵母発現に使用される適当なベクターおよびプロモーターは、アール・ヒッツェマン(Ｒ.Ｈitzeman)ら、ＥＰＯ公開７３,６５７号にさらに記載されている。増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ、１,２-イソチトクロームＣ、窒素代謝に関連する酸リン酸化物分解酵素、および前記したメタロチオネインおよびグリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびに、ガラクトース誘導性プロモーター、ＧＡＬ１のごときマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域である。本明細書で使用するのに特に好ましいのは、ＰＧＫ、ＧＡＬ１およびアルコールデヒドロゲナーゼ(ＡＤＨ)プロモーターである。最後に、適当な発現プラスミドを構築することにおいて、これらの遺伝子に連結する終止配列も、異種コード配列の発現ベクター３'側に連結して、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終止を供する。本発明の好ましい発現ベクターの調製において、翻訳開始部位は、酵母細胞において所与の核酸配列の最も効率的な発現を付与するように選択する[適当な翻訳開始部位の記載に関しては、チーガン,エム(Ｃigan,Ｍ.)およびティー・エフ・ドナヒュー(Ｔ.Ｆ.Ｄonahue)、１９８７、ジーン(ＧＥＮＥ)第５９巻、１-１８頁参照]。本発明を実施するに有用な特に好ましいヌクレオチド発現ベクターは、発現するのがの望ましい異種Ｇ蛋白質結合受容体をコードする異種ヌクレオチド配列の翻訳開始部位の上流に、それと正確な読み枠で位置する、かかる前記したプロモーター配列よりなる。この点で特に好ましいプロモーターは、ＧＡＬ１、ＰＧＫおよびＡＤＨプロモーターである。前記したプロモーターを選択した翻訳開始部位の上流に位置させると、異種蛋白質発現を上昇することができる。これらの好ましい具体例において、酵母Ｇ蛋白質結合受容体セグメントは全く異種Ｇ蛋白質結合受容体セグメントに融合しない。本発明者らは、かかるハイブリッド受容体が、酵母における受容体発現を達成するのに重要でないことを発見した。このことは、この点に関して教示している認知された技術[キング(Ｋing)ら、前掲参照 ]に矛盾する。しかしながら、ある種の他の具体例において、少なくとも酵母遺伝子の５'-非翻訳領域の断片を、異種Ｇ蛋白質結合セグメントから上流に位置させ、かつそれと作動可能に結合する。最後に、また、本発明は、前記したごとき適当なプロモーターおよび翻訳開始部位を有する構築物を提供するが、これらの構築物には、少なくとも酵母Ｇ蛋白質-結合受容体のヌクレオチド配列をコードする一番アミノ末端の断片、ならびに該第一セグメントから下流にそれと正確な読み枠で位置する第二セグメントよりなる酵母セグメントが含まれ、該第二セグメントは異種Ｇ蛋白質-結合受容体をコードするヌクレオチド配列よりなる。この点に関する酵母セグメントは、酵母系において異種Ｇ蛋白質の有効な発現を上昇するように供されるというよりも、むしろレポーター配列として実際に作動するよう供することができる。かくして、ある種の具体例は、その中で、それが抗体結合などのごとき慣用手段を介して検出し得るペプチドをコードするレポーターセグメントとして作用する酵母Ｇ蛋白質-結合受容体の酵母セグメントをコードする遺伝子配列よりなる。この点に関して好ましいのは、発現されるエピトープ配列に特異的に向けられた抗体を用いた所望の異種受容体の発現を高度に特異的に検出する「エピトープ・タグ」として主に用いることができる、異種Ｇ蛋白質結合受容体に融合した酵母フェロモン受容体の全体または一部分である。かかるベクターの構築において、該酵母セグメントは異種蛋白質の上流に位置させることができ、あるいは別法として、異種Ｇ蛋白質-結合受容体の一番アミノ-末端コード配列の断片を欠失することができ、酵母セグメントを直接それに融合する。ある場合においては、異種蛋白質の１またはそれを超えるアミノ末端貫膜ドメインまたは細胞内ドメインを欠失する。別法として、酵母セグメントを異種受容体のアミノ末端に直接付加して、それによってキメラ受容体構築物の全体を伸長することもできる。第一および第二セグメントは、酵母細胞において作動可能であるＧＡＬ１プロモーターのごときプロモーターと作動的に結合させる。かかるベクターを構築するのに用いることができる酵母Ｇ蛋白質-結合受容体のコード配列は、酵母フェロモン受容体をコードする遺伝子(例えば、α-因子受容体をコードするＳＴＥ２遺伝子、およびａ-因子受容体をコードするＳＴＥ３遺伝子)配列によって例示される。本明細書に記載されるある種の好ましいキメラ受容体は、異種Ｇ蛋白質受容体、好ましくは５ＨＴ１ａ受容体、ムスカリン受容体、α-アドレナリン受容体またソマトスタチン受容体の全体または一部に直接融合した酵母Ｓｔｅ２蛋白質セグメントよりなる。リガンド結合の効果を検出するいずれの種々の手段も利用することができる。例えば、ＧβγからＧαの解離の測定は、慣用的な生化学技術を介して行うことができる。しかしながら、受容体へのリガンドの結合は、それ自体が測定を助け得る検出可能な生物学的応答性の引金を引く、または遮断し得ることは注意しなければならない。かかる生物学的応答の１つは、酵母細胞が接合する能力である。フェロモン誘導性接合シグナル変換経路の使用は、本明細書に示したアッセイ系におけるリガンド結合の効果を検出する好ましい方法であり、その基本的な前提を以下に詳細に論じる。酵母におけるＧ蛋白質-結合フェロモン受容体は、ａ/α二倍体を形成するためのａおよびα半数体細胞型の接合(融合)を完了する発達プログラムを制御する( 概説については、「酵母サッカロマイセスの分子生物学および細胞生物学(Molecu lar Ｂiology and Ｃelllar Ｂiology of the Ｙeast Ｓaccharomyces)」：第ＩＩ巻、遺伝子発現、のジイ・エフ・スプラーグ,ジュニア(Ｇ.Ｆ.Ｓprague,Ｊr.) およびジェイ・ダブリュ・ソーナー(Ｊ.Ｗ.Ｔhorner)参照)。接合のプロセスは、細胞外ペプチド、接合フェロモンによって開始される。ａ接合型の細胞は、α -因子を分泌し、これはα-細胞における応答を誘起し；α-接合型の細胞はａ-因子を分泌し、これはａ細胞にのみ作用する。半数体細胞は、内因性Ｇ蛋白質-結合フェロモン受容体の作用を介してペプチド接合フェロモンの存在に応答する( ＳＴＥ２：α-因子受容体、α細胞でのみ発現されている、およびＳＴＥ３：ａ- 因子受容体、ａ-細胞でのみ発現されている)。両方の受容体は、同一のヘテロ三量体Ｇ蛋白質、両方の半数体細胞型に共通のシグナル変換カスケードと相互作用する。受容体にフェロモンが結合する際に、該受容体は、おそらく、Ｇ蛋白質の活性化に通じる立体配置の変化を起こす。α-サブユニット、ＳＣＧ１/ＧＰＡ１は、フェロモン応答経路の負の効果に働きかけ、これは受容体-依存性活性化によって助けられる。βγサブユニット(ＳＴＥ４、ＳＴＥ１８)の複合体は、エフェクター、おそらく、予想プロテインキナーゼであるＳＴＥ２０に正のシグナルを伝達すると考えられている[リーベラー,イー(Ｌeberer,Ｅ.)、ジグナード,ディー(Ｄignard,Ｄ.)、ハルカス,ディー(Ｈarcus,Ｄ.)、トーマス,ディー・ワイ( Ｔhomas,Ｄ.Ｙ.)、ホワイトウェイ,エム(Ｗhiteway,Ｍ.)(１９９２)エンボ・ジャーナル(ＥＭＢＯＪ.)１１、４８１５-４８２４]。エフェクターは、順番に、ＳＴＥ５を含むシグナル変換経路の下流エレメント、およびＳＴＥ１１、ＳＴＥ７、ＦＵＳ３およびＫＳＳ１遺伝子の産物よりなる仮想プロテインキナーゼ・カスケードを活性化し、最終的に、細胞周期拘束および転写誘導を起こす。フェロモン応答経路および細胞周期調節機構の間の主なインターフェースは、ＦＡＲ１遺伝子産物である。ＦＡＲ１およびＦＵＳ３のある種の劣性遺伝子座は、フェロモンに応答した細胞循環拘束を行えないが、フェロモン依存性転写を起こすことはできる。フェロモン-依存性転写は、配列-特異的ＤＮＡ-結合蛋白質ＳＴＥ１２の作用を介して仲介される。ＳＴＥ１２の活性化は、シス-作用性ＤＮＡ配列、フェロモン応答因子を有する遺伝子の転写を起こす。これらのフェロモン応答性遺伝子は、フェロモン合成(ＭＦａ１、ＭＦａ２、ＭＦＡ１、ＭＦＡ２、ＳＴＥ６、ＳＴＥ１３)およびフェロモンに対する応答性(ＳＴＥ２、ＳＴＥ３、ＳＣＧ１/ＧＰＡ１、ＦＵＳ３)に必要な産物をコードしており、細胞会合および融合(ＦＵＳ１)、細胞周期拘束(ＦＡＲ１)および接合に必要な形態学的事象を促進し、またはそれらに関与する。接合プロセスが完了していない事象において、酵母細胞はフェロモンの存在に適応するようになり、分裂増殖を再開する。かくして、ある種の好ましい具体例において、ＦＵＳ３またＦＡＲ１遺伝子は互いに突然変異または欠失され、それによってシグナル変換経路からの細胞周期拘束経路の連絡が断絶され、接合フェロモンが異種受容体に結合することに応答して細胞の連続した増殖が可能となる。ＦＡＲ１は細胞周期調節経路の主な因子であるため、その欠失または突然変異は本発明の発現構築物において好ましい。かかる構築物で形質転換した酵母細胞により、リガンド-結合アッセイにつき優れた酵母株が得られる。接合シグナル変換経路は、ＳＳＴ２、ＳＴＥ５０、ＡＦＲ１[コノプカ,ジェイ・ビイ(Ｋonopka,Ｊ.Ｂ.)(１９９３)モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Ｍol.Ｃell.Ｂiol.)１３、６８７６-６８８８]ならびにＳＧＶ１、ＭＳＧ５およびＳＩＧ１遺伝子の産物によるフェロモンシグナル変換の受容体、Ｇ蛋白質および/または下流因子フェロモン分解および修飾を含む数種の機構によって減感するようになることが知られている。これらの遺伝子における選択された突然変異は、フェロモンに対する過敏感およびフェロモンの存在に対する不適応性に通じることができる。例えば、異種Ｇ蛋白質-結合受容体を発現する株への機能を妨害する突然変異の導入は、野生株の重要な改善点を構成し、受容体と相互作用する化合物の非常に感受性のバイオアッセイを開発することができる。他の突然変異、例えば、ＳＴＥ５０、ｓｇｖ１、ｓｔｅ２、ｓｔｅ３、ｐｉｋ１、ｍｓｇ５、ｓｉｇ１およびａｆｒ１は、バイオアッセイの感度を上昇する同様な効果を有する。当業者であれば、アッセイ系の感度の上昇が、これら前記した１またはそれを超える遺伝子の欠失、それらの発現をダウンレギュレーションするか、またはある種の例において、それらの過剰発現に影響する突然変異の導入を通して達成されることは理解されよう。例えば、ＳＴＥ５０構築物においては、該遺伝子の欠失ではなく、該遺伝子の過剰発現が望ましい。接合シグナル変換経路における突然変異の配列の導入により、酵母細胞は異種Ｇ蛋白質-結合受容体の発現によく適するようになり、このことによって、リガンドへの受容体の結合をシグナリングする生物学的応答性を供しつつ、同起源のリガンドには機能的に応答することができる。前記した１またはそれを超える突然変異とともに、酵母細胞において発現される異種受容体に対するリガンド結合を検出する特に簡便な方法は、慣用的な遺伝子インジケーター系を利用している。かくして、ある種の好ましい具体例において、フェロモン-応答性プロモーターおよびフェロモン-応答性プロモーターから下流に位置しそれと作動可能に連結したインジケーター遺伝子よりなるさらなる異種ヌクレオチド配列を有する細胞が供される。かかる配列の代わりに、該検出工程は、細胞中のインジケーター遺伝子の発現をモニターすることによって行うことができる。いずれの種々のフェロモン応答性プロモーターも用いることができ、プロモーターである例は、いずれかの前記したフェロモン応答性遺伝子(例えば、ｍＦａ１、ｍＦａ２、ＭＦＡ１、ＭＦＡ２、ＳＴＥ６、ＳＴＥ１３)、ＢＡＲ１遺伝子プロモーター、およびＦＵＳ１遺伝子プロモーターを作動する。同様にして、ＨＩＳ３、Ｇ４１８ｒ、ＵＲＡ３、ＬＹＳ２、ＣＡＮ１、ＣＹＨ２およびＬａｃＺ遺伝子を含む例と共に、広範なインジケーター遺伝子を用いることができる。特に好ましいレポーター遺伝子構築物を、ＦＵＳ１遺伝子の転写制御因子をＨＩＳ３蛋白質コード配列に融合し、元のＦＵＳ１遺伝子をこのレポーター構築物で置換することによって利用する。ＨＩＳ３遺伝子産物の発現は、それによって、フェロモンシグナル変換経路の制御下に置かれる。この構築物を有する酵母株(ｈｉｓ３)は、ヒスチジンを欠く補充最小培地ではほとんど増殖することができず、ＨＩＳ３遺伝子産物のインヒビターに対して感受性である。他の好ましい具体例において、プラスミドはＦＵＳ１−ｌａｃＺ遺伝子融合物を運搬する。ＦＵＳ１遺伝子の発現は、フェロモンの結合による受容体の活性化に応答して刺激される。したがって、シグナル変換は、ＦＵＳ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子から生成するβ-ガラクトシダーゼ活性を測定することによって定量できる。前記で論じたレポーター系と二者択一ではあるが、フェロモンシグナル変換経路の因子の制御下でも、有用な他のレポーター遺伝子構築物には、同時発現される他の異種エフェクター蛋白質を介して変換されるシグナルが含まれ得る。例えば、１）異種アデニリルシクラーゼのリガンド-依存性刺激は、ｃｄｃ３５遺伝子中の突然変異によりそれ自体のアデニリルシクラーゼを欠失している酵母株を生存させることができ、２）異種Ｇ蛋白質-結合カリウムチャンネルのリガンド- 依存性刺激は、低カリウム濃度を含有する培地において酵母株を増殖させることができず[(ｔｒｋ１、ｔｒｋ２)例えば、アンダーソン,ジェイ・エイ(Ａnderson ,Ｊ.Ａ.)ら、(１９９２)プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユウエスエイ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)８９、３７３６-３７４０参照]、あるいは３）異種ホスホリパーゼＣ(特にＰＬＣ- β)のリガンド-依存性刺激は、それ自体のＰＬＣを欠失している酵母株を生存させることができる[(ｐｌｃ)、例えば、ペイン,ダブリュ・イー(Ｐayne,Ｗ.Ｅ.) およびフィッツジェラルド-ヘイズ,エム(Ｆitzgerald-Ｈayes,Ｍ.)(１９９３)モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Ｍol.Ｃell.Ｂiol.)１３、４３５１-４３６３参照]。本発明を実施するのには、アデニリルシクラーゼをコードするいずれのＤＮＡ配列も用いることができる。アデニリルシクラーゼの例には、本発明を実施するのに有用な、ディー・メラノガスター・ルタバガ(Ｄ.melanogaster Ｒutabaga) 遺伝子の産物、および哺乳動物サブユニット型Ｉ-ＶＩＩＩ[概説に関しては、タン,ダブリュージェイ(Ｔang,Ｗ.Ｊ.)およびジルマン,エイ・ジイ(Ｇilman,Ａ.Ｇ .)(１９９２)セル(Ｃell)７０、８６９-８７２]、ならびにそれらの突然変異および相同物が、同一物をコードするＤＮＡ配列と共に含まれる。Ｇ蛋白質-ゲートカリウムチャンネルをコードするいずれのＤＮＡ配列も、本発明を実施するのに用いることができる。Ｇ蛋白質-結合カリウムチャンネルの例には、ＧＩＲＫ１[クボ,ワイ(Ｋubo,Ｙ.)、リューベニー,イー(Ｒeuveny,Ｅ.) 、スレシンガー,ピイ・エイ(Ｓlesinger,Ｐ.Ａ.)、ジャン,ワイ・エヌ(Ｊan,Ｙ. Ｎ.)およびジャン,エル・ワイ(Ｊan,Ｌ.Ｙ.)(１９９２)ネイチャー(Ｎature)３６５、８０２-８０６]、本発明を実施するに有用なサブユニット、ならびにその突然変異および相同物が、同一物をコードするＤＮＡ配列と共に含まれる。ホスホリパーゼ蛋白質をコードするいずれのＤＮＡ配列も、本発明を実施するに用いることができる。ホスホリパーゼ(ＰＬＣ)蛋白質の例には、ディー・メラノガスター(Ｄ.melanogaster)ｎｏｒｐＡ遺伝子産物およびＰＬＣ-β蛋白質[概説に関しては、リー,エス・ジイ(Ｒhee,Ｓ.Ｇ.)およびコイ,ケイ・ディー(Ｃhoi ,Ｋ.Ｄ.)(１９９２)ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂio l.Ｃhem.)２６７、１２３９２−１２３９６参照]。本発明を実施するに有用なサブユニット、ならびにその突然変異および相同物が同一物をコードするＤＮＡ配列とともに含まれる。特に好ましい酵母発現系は、本明細書で記載するが、ＳＳＴＲおよびキメラ- 蛋白質を有し、連続した増殖につきソマトスタチン存在に依存する。前記したごとく、本発明の形質転換宿主細胞は異種ＤＮＡ配列によってコードされた蛋白質または蛋白質サブユニットを発現する。発現された場合、該Ｇ蛋白質-結合受容体は宿主細胞膜に局在する(すなわち、リガンドの立体配置選択的な結合および細胞膜の細胞質側のＧ蛋白質との機能的相互作用の両方で、適当な向きで生理学的でそこに位置する)。本明細書に記載した感受性および特異性の酵母発現系の実行によって、受容体-リガンドおよび受容体-Ｇ蛋白質相互作用の構造および機能面の説明が促進されるであろう。接合シグナル変換経路の因子を修飾することによって可能となる強力な遺伝子選抜スキームは、アゴニスト選択性、リガンド立体配置選択性、ならびにアゴニスト/アンタゴニスト結合の決定因子に作用する受容体の態様を同定するに用いることができる。リガンドに対する受容体およびＧ蛋白質の応答性を修飾する蛋白質の役割は、この強力な遺伝子系の助けで詳細に作用し得る。重要なことには、該系は、Ｇ蛋白質-結合シグナル変換系の機能および成分を研究する一般化されたアプローチ、ならびにＧ蛋白質結合シグナル変換系を利用するスクリーニングアッセイの一般化されたアプローチを提供する。本発明は、「発現カセット」形態で、いずれの種々の異種Ｇ蛋白質結合受容体も受け取るように適応した発現構築物およびアッセイ系を提供する。異種Ｇ蛋白質-結合受容体は、本明細書に記載したベクターに単純に挿入し、酵母細胞で発現させることが望ましい研究である。発現受容体に結合し得るリガンドは、いずれの慣用的なアッセイ法で細胞と接触させることができ、相互作用の効果は容易にモニターできる。かくして、本明細書に示した系は、孤独なＧ蛋白質-結合受容体に対するリガンドの同定、および医学、獣医学および農業的に重要な受容体に対する新規な治療的に有用なリガンド望ましい発見において強大な有用性を提供する。以下の実施例は本発明の種々の態様をさらに説明するために記載する。これらは、本発明を限定することを意味するものではない。実施例１サッカロマイセス・セレビシアエ(Ｓaccharomyces cerevisiae) における哺乳動物Ｇα蛋白質の機能的発現感受性バイオアッセイを利用して、異種Ｇα蛋白質の発現による酵母ＧαおよびＧβγ相互作用の妨害性を測定する。哺乳動物Ｇα遺伝子は、構造性ＰＫＧまたは誘導性ＣＵＰ１プロモーター制御下の２μまたはセントロメアを有するプラスミドから発現させる。データは、ラットＧα₃、Ｇα_i2およびキメラ酵母/哺乳動物Ｇαが有効に酵母Ｇβγと相互作用し得ることを示している。培地および菌株：細菌菌株の増殖およびプラスミド操作は、標準的な方法(マニアティス,ティー(Ｍaniatis,Ｔ.)、モレキュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃloning)(コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Ｃold Ｓp ring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress)、１９８２))によって行う。酵母株の増殖および形質転換は、ローズら(ローズ,エム・ディー(Ｒose,Ｍ.Ｄ.)「メソッズ・イン・イースト・ジェネティクス(Ｍethods in yeast genetics)」(コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress)、１９９０))に記載されているごとく行う。これらの研究に用いた酵母株(ＣＹ４１４、ＭＡＴａｕｒａ３-５２ｔｒｐ１ｌｅｕ２ｈｉｓ３ｐｅｐ４::ＨＩＳ３)は、イー・ジョーンズ(ジョーンズ,イー・ダブリュ(Ｊones,Ｅ.Ｗ.) 、アニュアル・レビュー・イン・ジェネティクス(Ａnn.Ｒev.Ｇenet.)１８：２３３、１９８４)により記載されている菌株起源である。ＣＹ４１４は、ＦＵＳ１-ｌａｃＺ融合プラスミドｐＳＢ２３４(トゥルーハート,ジェイ(Ｔrueheart, Ｊ.)ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Ｍol.Ｃell.Ｂiol.)７( ７)：２３１６-２３２８、１９８７)およびＧα発現プラスミドで順次形質転換する。Ｇα発現プラスミドの構築：Ｇα_sおよびＧα_i2用および酵母ＳＣＧ１遺伝子との融合用のラットｃＤＮＡクローンは別に記載されている[ワン,ワイ・エス( Ｗang,Ｙ.-Ｓ.)、ケイン,ジェイ(Ｋane,Ｊ.)、カラヤン,ジェイ(Ｋurjan,Ｊ.)、スターデル,ジェイ・エム(Ｓtadel,Ｊ.Ｍ.)およびティッパー,ディー・ジェイ( Ｔipper,Ｄ.Ｊ.)(１９９０)モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Ｍ ol.Ｃell.Ｂiol.)１０、２５８２-２５９０]。これらの遺伝子を低-コピー数プラスミドから発現させるために、各発現カセットを含むＸｈｏＩ-ＳａｌＩ断片( ＰＧＫプロモーターおよびターミネーター配列を含む)を単離し、ＸｈｏＩで消化したＣＥＮプラスミドｐＲＳ４１４にクローン化する。誘導発現には、ＰＧＫプロモーター配列を含むＤＮＡセグメントを、上流の活性化配列で置換し、ＣＵＰ１遺伝子を形成させる。 β-ガラクトシダーゼ・アッセイ：培養物を５×１０⁷細胞/ｍlに希釈し、分離試験管に等分する。フェロモンを１試料に添加し、最終濃度１０^-9Ｍとする。ついで、培養物を３０℃にて４時間インキュベートする。つづいて、β-ガラクトシダーゼ活性の測定は、別に記載のごとく行う(ローズ,エム・ディー(Ｒose,Ｍ. Ｄ.)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress)、１９９０)。酵母ＰＧＫプロモーターから発現された酵母ＳＣＧ１または哺乳動物Ｇα_sもしくはＧα_iまたはキメラ酵母/哺乳動物Ｇα遺伝子を運搬する高および低-コピー数プラスミドを、これもＦＵＳ１-ｌａｃＺ融合遺伝子を運搬するプラスミドを含有する野生型酵母株に形質転換する。ＦＵＳ１遺伝子の発現は、フェロモンの結合による受容体活性化に応答して刺激される。したがって、シグナル変換は、ＦＵＳ１-ｌａｃＺレポーター遺伝子から発生するβ-ガラクトシダーゼ活性を測定することによって定量することができる。異種Ｇα蛋白質の発現による正常なシグナル変換の妨害は、β-ガラクトシダーゼ活性の低下として認められる。導入したＧα遺伝子を発現する菌株を、フェロモン-誘導性遺伝子活性化につきアッセイする。データは、図１中の野生型応答性の％として表す。すべてのＧ αプラスミドからの発現がＦＵＳ１-ＬａｃＺ発現レベルを低下したことは、Ｇ α蛋白質が酵母Ｇβγに機能的に結合していることを示している。用量依存性は、Ｓｃｇ１、ＧａｓおよびＧα_i2について認められた。高-コピー数プラスミドからの発現が顕著にシグナリングを低下することは、大過剰の異種Ｇα蛋白質が存在することを示唆している。Ｓｃｇ-Ｇα_i2キメラ蛋白質は、低-コピー数プラスミドからでさえ、刺激していないバックグラウンドレベル付近まで、シグナリングを低下する。他のＣＥＮ発現プラスミドは、シグナリングを野生型レベルの５３から８４％低下する。Ｇα発現のより正確な制御を達成し、かつフェロモン誘導シグナリングに対して最小の影響しか起こさないであろう十分に低いレベルに発現を低下させるために、Ｇα遺伝子(Ｇαｓ以外)を誘導性ＣＵＰ１プロモーター制御下に置き、低- コピー数プラスミドで酵母に形質転換する。これらのプラスミドによって仲介されるシグナリング抑制のレベルは、培地に添加したＣｕ＋＋４の濃度に依存する (図２)。しかしながら、基底発現(Ｃｕ＋＋４無添加)は、ＰＧＫプロモーターから認められたレベルと同等であった(図１)。以前の実験と同様に、ＳＣＧ-Ｇα_i ₂ キメラ蛋白質は、シグナリングをほぼバックグラウンドレベルまで低下させる。図１および２に示すデータは、検査したすべてのＧα発現プラスミドがシグナル変換経路を全て阻害する機能性のＧα蛋白質を産生することを示している。構造性プロモーター(ＰＧＫ)を用いると、大部分のＧα遺伝子が、高-コピー数の２μプラスミドが顕著にシグナリングを低下する、大部分のＧα遺伝子が用量- 依存性の効果を示す(図１)。ＣＥＮプラスミドからの低い発現性は、１６％ほどにシグナリングレベルを低下する(Ｇ_i、図１参照)。ＣＵＰ１プロモーターからのＧα遺伝子の発現は、Ｃｕ＋＋濃度の上昇に比例してシグナル伝達を低下する、予想された用量/応答性効果を示す(図２)。実施例２サッカロマイセス・セレビシアエ(Ｓaccharomyces cerevisiae) において発現される異種Ｇ蛋白質-結合受容体の薬理学的評価酵母株：酵母株の増殖および形質転換は、記載されているように行う(ロアー, エム・ディー(Ｒore,Ｍ.Ｄ.)メソッズ・イン・イースト・ジェネティクス(Ｍethods in Ｙeast Ｇenetics)コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス (Ｃold Ｓpring Ｈorbor Ｌaboratory Ｐress)、１９９０)。これらの実験に用いた酵母株(ＣＹ４１４；ＭＡＴａｕｒａ３-５２ｔｒｐ１ｌｅｕ２ｈｉｓ３ｐｒｅｐ４ΔＨＩＳ３)は、イー・ジョーンズによって記載されている菌株(ジョーンズ,イー・ダブリュ(Ｊones,Ｅ.Ｗ.)アニュアル・レビュー・イン・ジェネティクス(Ａnn.Ｒev.Ｇenet.)１８：２３３、１９８４)起源である。核酸操作：細菌株の増殖およびプラスミド操作は、標準的な方法[サムブルック,ジェイ(Ｓambrook,Ｊ.)、フリッシュ,イー・エフ(Ｆritsch,Ｅ.Ｆ.)およびマニアティス,ティー(Ｍaniatis,Ｔ.)モレキュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃ loning)第２版(コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Ｃold Ｓp ring Ｈorbor Ｌaboratory Ｐress))、１９８９]によって行う。ＤＮＡ配列決定は、高温循環配列決定(アプライド・バイオシステムズ(Ａpplied Ｂiosystems)社 )によって行った。蛋白質分析：受容体発現株は、プラスミド保持性選抜用の特異的な栄養を欠き、かつ受容体遺伝子発現誘導用の３％ガラクトースを含有する合成完全培地中にて増殖させる。細胞をペレットととし、菌溶解用緩衝液(１０ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ７.２、１ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭＥＤＴＡ)中にて洗浄し、ついで菌溶解用緩衝液＋プロテアーゼインヒビター(５μｇ/ｍlロイペプシン、１０μｇ/ ｍlベンズアミジン、１０μｇ/ｍlバシトラシン(Bacitracin)、５μｇ/ｍlペプスタチン(pepstatin)、５μｇ/ｍlアプロチニン(aprotinin))中に再懸濁し、ガラスビーズでの物理的破砕によって溶解する。１０００×ｇにて１０分間、遠心によって夾雑物を除去する。１００，０００×ｇにて１０分間の遠心によって、膜画分を単離する。このペレットを再度、菌溶解用緩衝液＋インヒビター中にてもう１度洗浄する。酵母抽出物のポリアクリルアミドゲル電気泳動は、試料を煮沸しない以外は標準的な方法によって行う。セミ-乾燥技術によってイモビロン( Ｉmmobilon)-Ｐミリポア・フィルターに転写する。ウサギ抗-Ｓte２抗体を入れたＥＣＬ試薬を用いて、受容体蛋白質を視覚化する。放射性標識リガンド結合アッセイ：反応は、５〜５０μｇ蛋白質を含む０.２ μl容量で行う。５ＨＴ１ａ受容体またはβ２-アドレナリン受容体リガンド用の結合アッセイは、５０ｍＭトリス、ｐＨ７.４、１０ｍＭＭｇＣl₂の緩衝液を用いる。ソマトスタチン結合は、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、５ｍＭＭｇＣl₂の緩衝液中にて行う。室温にてリガンド結合が平衡に達した後に、膜画分をＧＦＣガラスファイバー・フィルター上に単離する。以下の最終濃度のリガンドを用いる：放射性標識リガンド-³Ｈスピペロン、８０ｎＭ；¹²⁵Ｉ-シアナピンドロール、２５０ｐＭ；[¹²⁵Ｉ-ｔｙｒ¹¹]-ソマトスタチン１４、２５０ｐＭ；競合物-セロトニン、１０μＭ；プロプラノロール２０μＭ、ソマトスタチン１４、１μＭ。三リン酸グアノシンアナログＧｐｐ(ＮＨ)_pは１００μＭで用いる。ヒト５ＨＴ１ａセロトニン受容体の発現：ヒト５ＨＴ１ａ受容体をコードする遺伝子を改変して、酵母Ｓｔｅ２蛋白質の最初の１４アミノ酸を付加し、発現プラスミドｐＭＰ３にクローン化し、これをｐＣＨＩ１１と命名する。ＣＹ３８２と命名したこの菌株を、受容体発現を誘導するためのガラクトースを含有する培地で増殖させ、分画し、放射性標識アンタゴニスト³Ｈ-スピペロンの結合性によって受容体活性につき試験する。飽和結合性は、該受容体が高レベル(Ｂｍａｘ＝３.２ｐｍｏｌ/ｍｇ蛋白質)で発現すること、およびそれが哺乳動物組織で認められるもの(Ｋｄ＝２０〜１００ｎＭ)と同様なアフィニティー(Ｋd＝１１５ｎＭ；図３)でスピペロンに結合することを示している。２種のキメラ受容体遺伝子を設計する；ｐＣＨ１１７においては、５ＨＴ１ａ受容体の最初の２個の貫膜ドメインを含むＮ-末端をコードする配列を、Ｓｔｅ２受容体の相当配列で置換し、ｐＣＨ１１８においては、これらのＳｔｅ２配列を５ＨＴ１ａ受容体のＮ-末端に直接付加して、新規な９個の貫膜ドメイン-受容体を作製する(図４)。これらの受容体を発現する菌株を、放射性同位体標識リガンドの結合性につき検査する。両方の受容体とも、５ＨＴ受容体アンタゴニスト³ Ｈ-スピペロンの特異的結合を示す(図４)。最初の２個の貫膜ドメインを無関係な受容体のもので置換しても、このリガンドの結合性に明らかに影響しない。貫膜ドメインの付加が結合性に影響しないことは、この通常でない受容体が細胞膜において機能的な立体構造を達成し得ることを示唆している。ｐＣＨＩ１１、ｐＣＨＩ１７またはｐＣＨＩ１８を運搬する菌株は、各々、３.１、１.６または０ .７ｐｍｏｌ/ｍｇのＢｍａｘ値を作り出す。これらのキメラ受容体は受容体構造に関する興味深い結果を作り出すが、これらは、細胞における機能的な受容体の全体的なレベルを上昇しない。５ＨＴ１ａ受容体のすべての細胞内配列を酵母Ｓｔｅ２蛋白質の相当する配列で置換し、酵母Ｇ蛋白質に該受容体を直接結合させる。得られたキメラ受容体ＣＨＩ１６を野生型酵母株で発現させ、５ＨＴ１ａ受容体アゴニストの高アフィニティー結合につき検査する。アゴニスト結合は検出されない。しかしながら、放射性同位体標識スピペロン結合性のレベルがＣＨＩ１１に等しいことは、この受容体が高レベルで、かつ機能的立体構造で発現していることを示唆している。ヒトβ２-アドレナリン受容体の発現：ヒトアドレナリン受容体をモデルとしてそれを用いる強度で酵母にて発現させて、発現およびＧ蛋白質結合を最適化する。該受容体を発現する酵母株を、リガンド¹²⁵Ｉ-シアノピンドロールの結合のスキャッチャード分析によって検査する。結合は飽和可能で、哺乳動物組織で報告されているものと同様なＫｄ(２３ｐＭ)を示した。ついで、同時発現Ｇαを有する、または有しない菌株を、この放射性リガンドの結合をアゴニストイソプロテレノールまたはエピネフリンと競合させる競合アッセイで検査する。受容体がＧ蛋白質に作動可能に結合した場合にのみ期待される高アフィニティーが、両方の菌株で認められた(図５および６)。これらのリガンドの補外Ｋｉ値(イソプロテレノール＝１０ｎＭ；エピネフリン＝６０ｎＭ)は、哺乳動物組織で認められているアフィニティーと一致し、予想された位の有効性を示す。しかしながら、他のデータは、酵母におけるβ２-アドレナリン受容体へのアゴニストの高アフィニティー結合が異常であり、Ｇ蛋白質への結合の結果ではないことを示唆している。特に、β２-アドレナリン受容体の３番目の細胞内ループ(１番目のＧα接触点を含む)は、酵母Ｓｔｅ２受容体の対応するドメインで置き換わる。この受容体がアドレナリンアゴニストと同一のアフィニティーを示すことは、β２-アドレナリン受容体が酵母において不適当な立体構造をとっていることを示唆している。ラット・ソマトスタチン受容体の発現：ＳＳＴＲ２へのソマトスタチンの高アフィニティー結合性は、受容体/Ｇ蛋白質複合体の形成に依存する(ストルナド( Ｓtrnad)ら、１９９３)。ＳＳＴＲ２および蛋白質が互いに結合しない場合には、[¹²⁵Ｉ]ｔｙｒ¹¹Ｓ−１４の高アフィニティー結合が弱まる。図８に示すごとく、Ｓｃｇ１/Ｇ_αi2を同時発現する酵母において発現するＳＳＴＲ２への[¹²⁵ Ｉ]ｔｙｒ¹¹Ｓ-１４の結合は飽和であり、かつ高アフィニティーである。酵母で発現するＳＳＴＲ２に結合する[¹²⁵Ｉ]ｔｙｒ¹¹Ｓ-１４の計算Ｋｄは６００ｐＭである。同様な結合アフィニティーは、Ｇ_αi2がＳｃｇｌ/Ｇ_αi2よりもＳＳＴＲ２と同時発現される場合に認められる。酵母において認められるＫｄは、哺乳動物細胞で発現するＳＳＴＲ２の[¹²⁵Ｉ]ｔｙｒ¹¹Ｓ-１４結合の計算Ｋｄによく一致する(ストルナド(Ｓtrnad)ら、１９９３)。酵母Ｓｔｅ２受容体のこの受容体のＮ-末端への付加が、Ｓ-１４に結合するその能力に何ら影響を及ぼさないことが示されている。Ｓｔｅ２配列は、受容体発現の免疫化学検査のタグとして作用する。図７に示したイムノブロットは、３種の異なる菌株におけるＳＳＴＲ２の高レベルの発現を説明しでいる。ＳＳＴＲ２ソマトスタチン受容体および種々のＧα蛋白質を発現する酵母株は、菌株ＹＰＨ５００由来である。これらの菌株は、ゲノタイプＭＡＴａ、ｓｃｇｌΔｈｉｓＧｌｙｓ２-８０１ｕｒａ３-５２ｌｅｕ２Δ１ｔｒｐ１Δ６３ｈｉｓ３Δ２００ａｄｅ２ＳＳＴＲ２を分割している。ＣＹ６２４(Ｇ_αi2)、ＣＹ６０２(Ｇ_αsおよびＣＹ６０３Ｓｃｇｌ)と命名した菌株を、放射性標識ソマトスタチン-1４(Ｓ-１４)の特異的結合性につき検査する。３種はすべて、幾分かの程度のソマトスタチン結合性を示す( 表１)。このリガンドの高アフィニティー結合には、該受容体がＧ蛋白質、通常Ｇ_αiへ結合することを要し、よってＧ_αi不存在下の高レベルの結合は予想されない。受容体がＧ蛋白質に結合する立体構造と同様に、非加水分解性グアノシン三リン酸アナログＧｐｐ(ＮＨ)ｐ存在下にて結合性を検査する。この化合物の添加によりリガンドの結合性が消失することは、ＳＳＴＲ２受容体がＧ蛋白質に結合することを示している。これらのデータは、哺乳動物Ｇ蛋白質-結合受容体がその好ましいＧα蛋白質＋酵母ＧβおよびＧγサブユニットよりなるＧ蛋白質と機能的に相互作用し得ること、および異種受容体が全体的に酵母サブユニットよりなるＧ蛋白質に機能的に結合し得ることを示している。ドロソフィラ(Ｄrosophila)ムスカリン・アセチルコリン受容体の発現：ＰＣＲの使用を介した５'コード配列中のＳａｌＩサイトの付加によって、ドロソフィラ(Ｄrosophila)ムスカリン・アセチルコリン受容体(ＤｍｍＡＣｈＲ)をコードするＤＮＡ配列を改変する。ＳＴＥ２遺伝子産物の最初の２３個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を、ＢａｍＨＩ/ＳａｌＩ断片として、ＤｍｍＡＣｈＲの５ '末端に付加する。改変ＤｍｍＡＣｈＲをプラスミドｐＭＰ３中のＢａｍＨＩサイトに挿入し、受容体の発現をＧＡＬ１プロモーターの制御下に置き、プラスミドｐＭＰ３-ＤｍｍＡＣｈＲを形成する。標準的な方法によって、菌株ＣＹ４１４をこのプラスミドで形質転換し、受容体発現用に培養する。粗製膜調製物は、これらの細胞から調製して、アトロピン(５０μＭ)と比較したムスカリンアンタゴニスト３Ｈ-キヌクリジニルベンジレート(１０ｎＭ)の特異的結合サイトの存在につき試験する。特異的結合サイトが認められる(Ｂｍａｘ１０および３０ｆｍｏｌ/ｍｇ)。ドロソフィラｍＡｃｈＲ発現も、イムノブロッティング法によって検出できる。ｍＡｃｈＲの一次配列から予想される分子量と一致する、豊富な７５ｋＤａポリペプチドは、結合したＳｔｅ２エピトープに対して向けた抗体を用いるｐＭＰ３からｍＡｃｈＲを発現する細胞からの粗製膜調製物からの蛋白質の試料中(３０μｇ/レーン)で検出する(図９)。ＧＡＬ４配列を欠失するｐＭＰ３の誘導体であり、高レベルのｍＡｃｈＲの発現が確認されると予想されないｐＭＰ２からｍＡｃｈＲが発現される場合、実質的にほとんど蛋白質は検出されない。 β-アドレナリン受容体(２α-ＡＲ)の発現：ＧＡＬ１、１０プロモーターＥｃｏＲＩ-ＢａｍＨＩ断片、ＢａｍＨＩ-ＳａｌＩ断片上に存在するＳＴＥ２遺伝子産物の最初の２３アミノ酸をコードするＤＮＡ配列、ＹＥｐ３５２からのＳａｌＩ-ＳｐｈＩポリリンカー断片、およびＳＴＥ７ターミネーター配列を含む、プラスミドｐＭＰ３からのＥｃｏＲＩ-ＮａｒＩ断片をｐＲＳ４２４に移入してｐＬＰ１５を形成する。ブタα２Ａ-ＡＲをコードするＰｓｔＩ-ＰｖｕＩＩ断片[ ガイヤー,シー・エイ(Ｇuyer,Ｃ.Ａ.)、ホルストマン,ディー・エイ(Ｈorstman, Ｄ.Ａ.)、ウィルソン,エイ・エル(Ｗilson,Ａ.Ｌ.)、クラーク,ジェイ・ディー( Ｃlark,Ｊ.Ｄ.)、クラゴー,イー・ジェイ(Ｃragoe,Ｅ.Ｊ.)およびリムバード,エル・イー(Ｌimbird,Ｌ.Ｅ.)(１９９０)ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.)２６５、１７３０７-１７３１７]を、ｐＬＰ１５のＰｓｔＩ-ＳｍａＩサイトに挿入し、ｐＰＬ５０を形成する。ＧＡＬ４のＥｃｏＲＩ断片をｐＬＰ５０のＥｃｏＲＩサイトに挿入して、ｐＬＰ６０を形成する。ｓｃｇｌΔｈｉｓＧ対立遺伝子を含み、かつｐＰＧＫＨ-Ｓｃｇ１-Ｇα_i2からのＰＧＫ-Ｓｃｇｌ-Ｇα_i2ＸｈｏＩ-ＳａｌＩ断片を含むプラスミドｐＬＰ１０[ ｐＬＰ１０：ｐＵＮ７５(エレッジ,エス・ジェイ(Ｅlledge,Ｓ.Ｊ.)およびデービス,アール・ダブリュ(Ｄavis,Ｒ.Ｗ.)ジェネティクス(Ｇenetics)８７、１８９-１９４])を有する]菌株ＬＹ１２４[ＹＰＨ５００の誘導体(ストラタジーン( Ｓtratagene)社)]を標準的な方法によってｐＬＰ６０で形質転換し、受容体発現用に培養する。粗製膜調製物は、これらの細胞から調製し、フェントルアミン(１０μＭ)と競合するα２-ＡＲアンタゴニスト３Ｈ-ラウボルシン(rau wolscine)(２００ｎＭ)に対する特異的結合サイトの存在につき試験する。１０および８４ｆｍｏｌ/ｍｇの間のＢｍａｘを有する特異的結合サイトが認められた。ブタα２ＡＲ発現も、イムノブロット法によって検出可能である(図１０)。数種の豊富なポリペプチドが、結合したＳｔｅ２エピトープに対して向けた抗体を用いて、ｐＭＰ３からα２ＡＲを発現する細胞からの粗製膜調製物からの蛋白質試料(３０μｇ/レーン)で検出される。実施例３ソマトスタチン受容体アゴニストに応答しての酵母のアゴニスト依存性増殖数種の改変を典型的な研究室酵母株に導入することによって、ソマトスタチンに応答する酵母株を作製する。最初に、ソマトスタチン受容体サブタイプ２をコードするｃＤＮＡ(ＳＳＴＲ２)をマルチコピー酵母プラスミド中のガラクトース -誘導性ＧＡＬ１プロモーターの制御下に置く(図１１)。受容体の高レベル発現は、同プラスミドからの転写活性化蛋白質ＧＡＬ４の誘導性同時-過剰発現によって達成される。第二に、内因性Ｇα蛋白質遺伝子、ＧＰＡ１/ＳＣＧ１をＧＰＡ１/ＳＣＧ１からのアミノ末端ドメインおよびラットＧα_i2からのＣ-末端配列よりなるキメラ遺伝子で置換する(図１２)。酵母におけるキメラＧ蛋白質の発現は、ｓｃｇｌ/ｇｐａｌ突然変異細胞の成長欠陥を抑制することが以前に示されている[カン,ワイ・エス(Ｋang,Ｙ.-Ｓ.)、ケイン，ジェイ(Ｋane,Ｊ.)、カラヤン,ジェイ(Ｋurjan,Ｊ.)、ステーデル,ジェイ・エム(Ｓtadel,Ｊ.Ｍ.)およびティッパー,ディー・ジェイ(Ｔipper,Ｄ.Ｊ.)(１９９０)、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Ｍol.Ｃell.Ｂiol.)１０、２５８２-２５９０]。第三に、ＦＡＲ１遺伝子を欠失させると、活性化接合シグナル変換経路の存在下にて増殖させ続けることができる。ＦＡＲ１蛋白質は、接合シグナル変換経路および細胞周期機構の間の第一インターフェースとして働くと考えられている[チャン,エフ(Ｃhan,Ｆ.)およびヘルスコビッツ,アイ(Ｈerskowitz,Ｉ.)(１９９０)セル(Ｃell)６３、９９９-１０１２;ピーター，エム(Ｐeter,Ｍ.)、ガートナー(Ｇ artner,Ａ.)、ホレッカ,ジェイ(Ｈorecka,Ｊ.)、アマーラー,ジイ(Ａmmerer,Ｇ. )およびヘルスコビッツ,アイ(Ｈerskowitz，Ｉ.)(１９９３)セルラー・バイオロジー(Ｃell.Ｂiol.)１３、５６５９-５６６９]。第四に、ＦＵＳ１遺伝子を、ＦＵＳ１遺伝子の転写制御エレメントをＨＩＳ３蛋白質コード配列に融合することによって構築したレポーター遺伝子構築物で置換し、それによってフェロモンシグナル伝達経路の制御下にＨＩＳ３遺伝子産物の発現を置く。この構築物を有する酵母株(ｈｉｓ３)は、ヒスチジンを欠く補給最小培地でほとんど増殖することができず、ＨＩＳ３遺伝子産物のインヒビターである３-アミノ-１,２,４-トリアゾール(ＡＴ)に感受性である。アゴニスト-結合による受容体活性化は、ＨＩＳ３蛋白質発現の上昇、ＡＴに対する耐性における対応した上昇、および、したがって、ヒスチジンを欠く培地中および/またはインヒビター存在下で増殖する能力に通じる。増殖培地のｐＨを＞ｐＨ５.５に調整すると、かかる細胞がアゴニスト存在下で増殖する能力を上昇する。これは、恐らく、ソマトスタチンがＳＳＴＲ２に結合する能力の上昇による。酵母発現系の有用性は、迅速な大量スクリーニングへのその適応性にある。ＳＳＴＲに指向した新規な医薬物のスクリーニングを促進するために、受容体へのソマトスタチンの機能的結合およびつづく結合シグナル変換経路の活性化が適用した化合物周辺の増殖ゾーン(ハロー)として検出される簡便な寒天プレートバイオアッセイを開発する(図１３)。ｕｒａおよびｔｒｐを欠くＳＣデキストロース (２％)中のＬＹ２６８[ＹＰＨ５００の誘導体(ストラタジーン(Ｓtratagene)社) ＭＡＴａｕｒａ３-５２ｌｙｓ２-８０１ａｄｅ２ｔｒｐ１Δ６３ｈｉｓΔ ２００ｌｅｕ２Δ１ｆａｒ１ΔＬＹＳ２ｓｃｇ１ΔｈｉｓＧｆｕｓ１ΔＦＵＳ１-ＨＩＳ３ｓｓｔ２ΔＡＤＥ２]の一晩培養物をｕｒａおよびｔｒｐを欠くＳＣラクテート(２％)培地、つづいてｕｒａおよびｔｒｐを欠くＳＣガラクトース(２％)培地に移した。ついで、ｕｒａ、ｔｒｐおよびｈｉｓを欠くＳＣガラクトース(２％)寒天培地３０ｍlに細胞(２×１０⁵)を平板し(図１３、上部パネル)、あるいは、該表面に均一に拡げ(図１３、底パネル)、寒天プレート表面に置いたペーパーディスクに所定量の選択した化合物を適用し、３０℃にて３- ５日間インキュベートする。種々のソマトスタチン(Ｓ-１４)およびＭＫ６７８[ ＳＳＴＲ２に高アフィニティー結合を示すソマトスタチンのヘキサペプチドアナログ[バーバー,ディー(Ｖerber,Ｄ.)、シャペルシュタイン,アール(Saperstein, Ｒ.)、ナット,アール(Ｎutt,Ｒ.)、フリーディンジャー,アール(Friedinger,Ｒ. )、ブラディー,ピイ(Ｂrady,Ｐ.)、カーレイ,ピイ(Ｃurley,Ｐ.)、ペルロフ,ディー(Ｐerlov,Ｄ.)、パレベダ,ダブリュ(Ｐaleveda,Ｗ.)、ザッチェイ,エイ(Ｚa cchei,Ａ.)、コルデス,イー(Ｃordes,Ｅ.)、アンダーソン,ピイ(Ａnderson,Ｐ.) およびヒリシュマン,アール(Ｈirschmann,Ｒ.)(１９８１)ライフ・サイエンス( Ｌife Ｓci.)３５、１３７１−１３７８]]濃度で飽和したディスク周辺に増殖のハローが認められた。ハローの大きさが適用したアゴニストの量に比例して増加し、かつ最小量を適用した場合(６ｎｍｏｌＳ-１４)でさえ顕著な応答性が認められることは、アッセイの鋭敏な感度を示している。担体単独で、あるいはオピエート受容体のアゴニストであるｍｅｔ-エンケファリンでは検出可能な応答性が全く認められなかったことは、該アッセイの高い特異性を示している。酵母培地および培養条件は、標準的な方法に従って処方化し、酵母のＤＮＡ- 仲介形質転換はＬｉＡｃ法[シャーマン,エフ(Ｓherman,Ｆ.)、フィンク,ジイ・アール(Ｆink,Ｇ.Ｒ.)およびヒックス,ジェイ・ビイ(Ｈicks,Ｊ.Ｂ.)(１９８６) メソッズ・イン・イースト・ジェネティクス(Ｍethods in Ｙeast Ｇenetics)( コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress))]による。組換えｓｃｇｌ：ΔｈｉｓＧ、ｆａｒｌΔＬＹＳ２、ＦＵＳ１ΔＨＩＳ３およびｓｓｔ２ΔＡＤＥ２対立遺伝子を用いた、逐次挿入欠失によってＬＹ２６８を構築する。ＳＣＧ１/ＧＰＡ１の５'ＥｃｏＲＩ- ＨｉｎｄＩＩＩおよび３'ＳｐｈＩ-ＳｎａＢＩ断片の間のｐＮＫＹ５１からのｈｉｓＧ-ＵＲＡ３-ｈｉｓＧ断片を挿入することによって、ｓｃｇ１ΔｈｉｓＧ対立遺伝子を結合する[アラニ,イー(Ａlani,Ｅ.)、キャオ,エル(Ｃao,Ｌ.)およびクレクナー,エヌ(Ｋleckner,Ｎ.)(１９８７)ジェネティクス(Ｇenetics) １１６、５４１-５４５]。適当な酵母株のＤＮＡ-媒介形質転換および染色体対立遺伝子の置換のための選抜の後に、５-フルオロオロティックアシッド(FOA)- 含有培地上で増殖させることにより、ｈｉｓＧリピートの間の組換えを誘導することによってＵＲＡ３遺伝子を除去する[ボエク,ジェイ(Ｂoeke,Ｊ.)、ラクルート,エフ(Ｌacrute,Ｆ.)およびフィンク,ジイ(Ｆink，Ｇ.)(１９８４)モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス(Ｍol.Ｇen.Ｇenet.)１９７、３４５-３４６]。ｆａｒ１ΔＬＹ２対立遺伝子は、５'断片中の１２０１にＥｃｏＲＩサイトを導入し、ポジション２０１７にＨｉｎｄＩＩＩサイトを導入し、３'断片中の２８２１にＳａｌ１サイトを導入する合成ヌクレオチドを用いて、酵母ゲノムＤＮＡ(ＹＰＨ５０１株、ストラタジーン(Ｓtratagene)社)からのＦＡＲ１遺伝子の２個の断片を増幅することによって構築した。該断片を、ｐＢＳＫ(ストラタジーン(Ｓtratagene)社)のＥｃｏＲＩ/Ｓａｌ１断片にクローン化する。完成したｆａｒ１ΔＬＹＳ２構築物をＥｃｏＲＩで消化し、酵母を形質転換するのに用いる。ＦＵＳ１-ＨＩＳ３レポーター遺伝子をコードするＥｃｏＲＩ断片をｐＳＬ１４９７[スティーブンソン,ビイ・ジェイ(Ｓtevenson,Ｂ.Ｊ.)、ローデス, エヌ(Ｒodes,Ｎ.)、エレーデ,ビイ(Ｅrrede,Ｂ.)およびスプラーグ,ジイ・エス( Ｓprague,Ｇ.Ｆ.)(１９９２)ジーン・デブ(Ｇene Dev.)６、１２９３]から放出し、適当な酵母株を形質転換するのに用いる。ｓｓｔ２ΔＡＤＥ２対立遺伝子[ ディーツェル,ツェー(Ｄietze,Ｃ.)およびカラヤン,ジェイ(Ｋurjan,Ｊ.)(１９８７)モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Ｍol.Ｃell Ｂiol.)７、４１６９-４１７７]は、ポジション１にＣｌａ１サイトを、ポジション２５１８にＮｈｅＩサイトを位置するオリゴを用いたＰＣＲによって増幅したＡＤＥ２遺伝子の２.５ｋｂ断片から構築する。この断片を用いてＳＳＴ２中の内部Ｃｌａ- ＮｈｅＩ断片を置換する。Ｓａｌ１で消化することによってｓｓｔ２ΔＡＤＥ２断片を放出し、適当な酵母株を形質転換するのに用いる。ＳＳＴＲ２発現プラスミドｐＪＨ２の複数工程構築(図１１)は、ＳＴＥ７遺伝子からの３'非翻訳領域のＳｐｈＩ／ＮａｒＩ断片を挿入することによって開始し[テアーグ,エム・エイ(Ｔeague,Ｍ.Ａ.)、チャレフ,ディー・ティー(Ｃhaleff , Ｄ.Ｔ.)およびエレーデ,ビイ(Ｅrrede,Ｂ.)(１９８６)プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・イン・ユウエスエイ(Ｐroc .Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)８３、７３７１-７３７５]、ＧＡＬ１/１０プロモーターのＥｃｏＲＩ/ＢａｍＨＩ断片[ヨッカム,アール・アール(Ｙocum,Ｒ.Ｒ.)、ハンレイ,エス(Ｈanley,Ｓ.)、ウエスト,アール(Ｗest,Ｒ.)およびプタシュン, エム(Ｐtashne,Ｍ.)(１９８４)モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー (Ｍol.Ｃell.Ｂiol.)４、１９８５-１９９８]をＹＥｐ３５２[ヒル,ジェイ・イー(Ｈill,Ｊ.Ｅ.)、メイアーズ二世,エイ・エム(Ｍyers 2,Ａ.Ｍ.)、コーナー, ティー・ジェイ(Ｋoerner,Ｔ.Ｊ.)およびザゴロフ(Ｔzagoloff)、(１９８６)イースト(Ｙeast)２、１６３-１６７]の適当なサイトに挿入し、ｐＥＫ１を作製する。ＧＡＬ４遺伝子のオープンリーディングフレームおよび転写終止配列をコードするＰＣＲ産物を、５'ＥｃｏＲＩおよび３'ＡａｔＩＩサイトを含むオリゴで増幅し、ｐＥＫ１に挿入して、ｐＭＰ３を作製する。ラットＳＳＴＲ２をコードするｃＤＮＡ(ストルナド,ジェイ(Ｓtrnad,Ｊ.)、エッペラー,シイ・エム(Ｅppl er,Ｃ.Ｍ.)、コルベット,エム(Ｃorbett,Ｍ.)およびハドコック,ジェイ・アール (Ｈadcock,Ｊ.Ｒ.)(１９９３)ビイビイアールシイ(ＢＢＲＣ)１９１、９６８-９７６)を、ＳＳＴＲ２のアミノ末端をコードするＤＮＡ配列中にＢｇｌＩＩサイトを付加し、翻訳終始サイト直後にＢｇｌＩＩサイトを付加するオリゴヌクレオチド用いたＰＣＲによって修飾する。ＳＳＴＲ２コード配列を、ＢｇｌＩＩＰＣＲ断片として、ｐＭＰ３のＢａｍＨＩサイトに挿入する。最初に、ｐＰＧＫＨ-ＳＣＧ１-Ｇαｓ[カン,ワイ・-エス(Ｋang,Ｙ.-Ｓ.)、ケイン,ジェイ(Ｋane,Ｊ.)、カラヤン,ジェイ(Ｋurjan,Ｊ.)、ステーデル,ジェイ・エム(Ｓtadel,Ｊ.Ｍ.)およびティッパー,ディー・ジェイ(Ｔipper,Ｄ.Ｊ.)(１９９０)モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Ｍol.Ｃell.Ｂiol.)１０、２５８２-２５９０]を、ポジション-２００および-４２に５'ＸｈｏＩおよび３'ＥｃｏＲＩサイトを導入するオリゴヌクレオチドを用いて酵母ゲノムＤＮＡから増幅した改変ＳＣＧ１プロモーター断片[ディーツェル,シイ(Ｄietzel,Ｃ .)およびカラヤン,ジェイ(Ｋurjan,Ｊ.)(１９８７)セル(Ｃell)50、１００１-１０１０] で置換することによってプラスミドｐＬＰ８２を構築し、ｐＰＬ６１を形成する。ＧａｓドメインをコードするＢａｍＨＩ断片を、Ｇα_i2をコードする和合性断片で置換して、プラスミドｐＬＰ７１を形成する。ＳＣＧ１プロモーター制御下にて発現されるＳＣＧ１-Ｇα_i2キメラＧ蛋白質をコードするｐＬＰ７１のＸｈｏＩ/ＳａｌＩ断片を、ｐＲＳ４１４(ストラタジーン(Ｓtratagene)社)のＳａｌＩサイトに移入し、ｐＬＰ８２を形成する。ｐＬＰ７１中のＥｃｏＲＩ断片をｐＰＧＫＨ-ＳＣＧ１[カン,ワイ・-エス(Ｋa ng,Ｙ.-Ｓ.)、ケイン,ジェイ(Ｋane,Ｊ.)、カラヤン,ジェイ(Ｋurjan,Ｊ.)、ステーデル,ジェイ・エム(Ｓtadel,Ｊ.Ｍ.)およびティッパー,ディー・ジェイ(Ｔi pper,Ｄ.Ｊ.)(１９９０)モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Ｍol. Ｃell.Ｂiol.)１０、２５８２-２５９０]からのＩをコードするＥｃｏＲＩ断片で置換することによって、プラスミドｐＬＰ８３を構築し、プラスミドｐＬＰ７５を形成する。ＳＣＧ１をコードするＸｈｏＩ/Ｓａｌ１断片をｐＲＳ４１４(ストラタジーン(Ｓtratagene)社)中のＳａｌＩサイトに移入して、プラスミドｐＬＰ８３を形成する。実施例４バイオアッセイの感度に対するＧ蛋白質発現の影響酵母ＹＬ２６８株(ｐＰＬ８２：ＣＥＮｐＳＣＧ１-Ｓｃｇ１-Ｇα_i2)、ＬＹ２６２(ｐＲＳ４１４-ＰＧＫ-Ｓｃｇ１-Ｇα_i2:ＳａｌＩサイト中のｐＰＧＫＨ- Ｓｃｇ１-Ｇαｉ２からのＰＧＫ-Ｓｃｇ１-Ｇαｉ２Ｘｈｏ/ＳａｌＩ断片を含むｐＲＳ４１４)、ＬＹ３２４(ｐＬＰ８４：２μ ｐＳＣＧ１-Ｓｃｇ-Ｇαｉ２) 、およびＬＹ２８４(ｐＲＳ４２４-ＰＧＫ-Ｓｃｇ-Ｇαｉ２：ＳａｌＩサイト中のｐＰＧＫＨ-Ｓｃｇ１-Ｇαｉ２からのＰＧＫ-Ｓｃｇ１-Ｇαｉ２Ｘｈｏ/ＳａｌＩ断片を含むｐＲＳ４２４)は、示したプラスミドをＬＹ２６０株[ＳＳＴＲ２発現プラスミドを有するＹＰＨ５００の誘導体(ストラタジーン(Ｓtratagene) 社)ＭＡＴａｕｒａ３-５２ｌｙｓ２-８０１ａｄｅ２ｔｒｐ１Ｄ６３ｈｉｓ３Δ２００ｌｅｕ２α１ｆａｒ１ΔＬＹＳ２ｓｃｇ１ΔｈｉｓＧｆｕｓ１Δ ＦＵＳ１-ＨＩＳ３ｓｓｔ２ΔＡＤＥ２]に入れることによって構築した。ｕｒａおよびｔｒｐを欠くＳＣ-デキストロース(２％)中の一晩液体培養物を、ｕｒａおよびｔｒｐを欠くＳｃ-ラクテート(２％)培地に移し、つづいて、ｕｒａおよびｔｒｐを欠くＳＣ-ガラクトース(２％)培地に移す。ついで、細胞(２×１０⁵ )を、ｕｒａ、ｔｒｐおよびｈｉｓを欠くＳＣ-ガラクトース(２％)寒天培地３０ｍlに平板し、所定量の選択した化合物を寒天プレート表面上に設置したペーパーディスクに適用し、３０℃にて３-５日間インキュベートする(図１４)。Ｓ- １４周囲の増殖範囲は、各株に含まれるＧ蛋白質発現プラスミドに依存する。最も豊富な増殖は、ＬＹ２６８(ｐＬＰ８２：ＣＥＮｐＳＣＧ１-Ｓｃｇ１-Ｇαｉ２)によるＳ-１４に対する応答で認められ、より低い増殖は、ＬＹ２６２株(ｐＲＳ４１４-ＰＧＫ-Ｓｃｇ１-Ｇαｉ２)およびＬＹ３２４株(ｐＬＰ８４：２μ ｐＳＣＧ１-Ｓｃｇ-Ｇαｉ２)で認められ、一方、ほとんど検出不可能な増殖はＬＹ２８４株(ｐＲＳ４２４-ＰＧＫ-Ｓｃｇ１-Ｇαｉ２)によって示される。これらの結果は、Ｇα蛋白質発現量の上昇によるフェロモン刺激性の転写誘導の認められた阻害と一致する。かくして、異種Ｇ蛋白質-結合受容体を発現する菌株におけるＧ蛋白質発現レベルの正確な調節は、受容体と相互作用する化合物のバイオアッセイの設計および首尾よい完成に非常に重要である。最初に、ｐＰＧＫＨ-ＳＣＧ１-Ｇα_s[カン,ワイ・-エス(Ｋang,Ｙ.-Ｓ.)、ケイン,ジェイ(Ｋane,Ｊ.)、カラヤン,ジェイ(Ｋurjan,Ｊ.)、ステーデル,ジェイ・エム(Ｓtadel,Ｊ.Ｍ.)、およびティッパー,ディー・ジェイ(Ｔipper,Ｄ.Ｊ.)( １９９０)モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Ｍol.Ｃell.Ｂiol.) １０、２５８２-２５９０]中のＸｈｏＩ/ＥｃｏＲＩプロモーター断片を、ポジション-２００および-４２に５'ＸｈｏＩおよび３'ＥｃｏＲＩサイトを導入するオリゴヌクレオチドを用いて酵母ゲノムＤＮＡから増幅した改変ＳＣＧ１プロモーター断片[ディーツェル,ツェー(Ｄietzel,Ｃ.)およびカラヤン,ジェイ(Ｋurja n,Ｊ.)(１９８７)セル(Ｃell)５０、１００１-１０１０]中で置換することによってプラスミドｐＬＰ８４を構築し、プラスミドｐＬＰ６１を形成する。Ｇα_s ドメインをコードするＢａｍＨＩ断片をＧα_i2をコードする和合性断片で置換して、プラスミドｐＬＰ７１を形成する。ＳＣＧ１プロモーターの制御下にて発現するＳＣＧ１-Ｇα_i2キメラＧ蛋白質をコードするｐＬＰ７１のＸｈｏＩ/ＳａｌＩ断片を、ｐＲＳ４２４(ストラタジーン(Ｓtratagene)社)中のＳａｌＩサイトに移入して、ｐＬＰ８４を形成する。実施例５内因性酵母Ｇαを介してシグナルを伝達することができるソマトスタチン受容体ＳＳＴＲ２は、哺乳動物細胞においては、Ｇα_i2およびＧα_i3に結合すると考えられている[ルーシン,ディー・アール(Ｌuthin,Ｄ.Ｒ.)、エップラー,シイ・エム(Ｅppler,Ｃ.Ｍ.)およびリンデン,ジェイ(Ｌinden,Ｊ.)(１９９３)ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.)２６８、５９９０- ５９９６]。しかしながら、適当な酵母株中で発現させた場合(以下に記載する) 、ＳＳＴＲ２は内因性酵母Ｇα蛋白質を介してシグナルを伝達できることが示されている。この知見に内在する意味は、内因性Ｇα蛋白質への必要なＳＳＴＲ２の結合である。内因性Ｇα蛋白質に結合する異種Ｇ蛋白質-結合受容体の能力は、存在する技術における重要な改善であり、従来技術(キング,ケイ(Ｋing,Ｋ.) 、ドールマン,エイチ・ジイ(Ｄohlman,Ｈ.Ｇ.)、ソーナー,ジェイ(Ｔhorner,Ｊ. )、キャロン,エム・ジイ(Ｃaron,Ｍ.Ｇ.)およびレフコビッツ,アール・ジェイ( Ｌefkowitz,Ｒ.Ｊ.)(１９９０)サイエンス(Ｓcience)２５０、１２１−１２３) で可能であるとは考えられない。酵母ＬＹ２６６株(ｐＬＰ８３：ＣＥＮｐＳＣＧ１-Ｓｃｑ１)、ＬＹ２８０(ｐＲＳ４１４-ＰＧＫ-Ｓｃｇ１：ＳａｌＩサイト中のｐＰＧＫＨ-ＳｃｇＩからのＰＧＫ-Ｓｃｇ１Ｘｈｏ-ＳａｌＩ断片を含むｐＲＳ４１４)、ＬＹ３２６(ｐＬＰ８６：２μｐＳＣＧ１-Ｓｃｇ)、およびＬＹ２８２(Ｓａｌ１サイト中のｐＰＧＫＨ-Ｓｃｇ１からのＰＧＫ-Ｓｃｇ１ＸｈｏＩ -ＳａｌＩ断片を含むｐＲＳ４２４ｐＲＳ４２４-ｐＰＧＫ-Ｓｃｇ)は、ＬＹ２６０株中に示したプラスミドを入れることによって構築した。ｕｒａおよびｔｒｐを欠くＳＣ-デキストロース(２％)中の、ＳＣＧ１/ＧＰＡ１のみを発現できるこれらの株の一晩液体培養物を、ｕｒａ、ｔｒｐを欠くＳＣ-ラクテート(２％) に移し、つづいて、ｕｒａおよびｔｒｐを欠くＳＣ-ガラクトース(２％)培地に移す。ついで、細胞(２×１０⁵)を、ｕｒａ、ｔｒｐおよびｈｉｓを欠くＳＣ-ガラクトース(２％)培地３０ｍlに平板し、寒天プレートの表面上に設置したペーパーディスクに所定量の選択した化合物を適用し、３０℃にて３-５日間インキュベートする。種々の濃度のＳ-１４で飽和したディスク周囲に増殖のハローが認められることは、生成したシグナルがＳＳＴＲ２および酵母ＳＣＧ１/ＧＰＡ１蛋白質の間の相互作用を介して変換され得ることを示している(図１５)。これらの知見は、適当に改変した酵母株においていずれのクラスのメンバーのＧ蛋白質-結合受容体も発現でき、内因性Ｇα蛋白質に結合させることができる、単純かつ広範に適用可能なバイオアッセイを確立し得ることを示している。プラスミドｐＰＬ８６は、ｐＬＰ７１中のＥｃｏＲＩ断片をｐＰＧＫＨ-ＳＣＧ１[カン,ワイ・-エス(Ｋang,Ｙ.-Ｓ.)、ケイン,ジェイ(Ｋane,Ｊ.)、カラヤン ,ジェイ(Ｋurjan,Ｊ.)、ステーデル,ジェイ・エム(Ｓradel,Ｊ.Ｍ.)およびティッパー,ディー・ジェイ(Ｔopper,Ｄ.Ｊ.)(１９９０)モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Ｍol.Ｃell.Ｂiol.)１０、２５８２-２５９０]からのＳＣＧ１をコードするＥｃｏＲＩ断片で置換することによって構築し、プラスミドｐＬＰ７５を形成する。ＳＣＧ１をコードするＸｈｏｌ/Ｓａｌ１断片をｐＲＳ４２４(ストラタジーン(Ｓtratagene)社)中のＳａｌＩサイトに移入し、プラスミドｐＬＰ８６を形成する。実施例６ソマトスタチンの応答感度を上昇するＳＳＴ２中の突然変異ＳＳＴ２遺伝子中の突然変異は、接合フェロモンに対する他の野生型細胞の過敏感性を生じる。ｆａｒ１に発現されるＡＴ耐性のレベルに対するこの突然変異の効果は、ＦＵＳ１-ＨＩＳ３株を調査する(図１６)。ＳＣＤ-ｕｒａ、ｔｒｐ中のＬＹ２３０[ＹＰＨ５０の誘導体(ストラタジーン(Ｓtratagene)社)、ＭＡＴａＳＳＴ２ｕｒａ３-５２ｌｙｓ２-８０１ａｄｅ２ｔｒｐｌΔ６３ｈｉｓ３ Δ２００ｌｅｕ２Δ１ｆａｒ１ΔＦＵＳ１-ＨＩＳ３]およびＬＹ２３８(ＬＹ２３０の改変物ｓｓｔ２ΔＡＤＥ２)の一晩培養物からの細胞(５×１０⁵)を、１０ｍＭＡＴを含有するＳＣＤ-ｕｒａ、ｔｒｐ、ｈｉｓ上に平板し、３０℃にて２日間インキュベートする。接合因子に応答したＡＴ耐性の上昇がＬＹ２３８ (ｓｓｔ２)によって示される。ＬＹ２３８の増殖が１０ｐｍｏｌ接合フェロモンを含有するディスク周辺で認められるのに対して、ＬＹ２３０(ＳＳＴ２)は顕著な増殖が認められるには１ｎｍｏｌの接合因子を要する。かくして、これらの菌株にｓｓｔ２を導入することにより、少なくとも１００-倍でバイオアッセイの感度が上昇し、同様にして他のＧ蛋白質-結合受容体バイオアッセイの感度を上昇する可能性が開かれる。ＳＳＴＲ２を発現し、欠損ｓｓｔ２遺伝子を有する酵母株は、機能性ＳＳＴ２遺伝子を含有する菌株によって示されるものよりも、種々の濃度のソマトスタチンを含むディスク周辺でより大きな増殖を示す。ｕｒａ、ｔｒｐを欠くＳＣデキストロース(２％)中のＬＹ２６８株(ｓｓｔ２、ｐＬＰ８２を含む)、ＬＹ２６６株(ｓｓｔ２、ｐＬＰ８３を含む)、ＬＹ２８８株[ＹＰＨ５００の誘導体(ストラタジーン(Ｓtratagene)社)、ＳＳＴＲ２発現プラスミドおよびＳＣＧ１-Ｇα_i2 発現プラスミド、ＭＡＴａＳＳＴ２ｕｒａ３-５２ｌｙｓ２-８０１ａｄｅ２ｔｒｐｌΔ６３ｈｉｓ３Δ２００ｌｅｕ２Δ１ｆａｒ１ΔＬＹＳ２ｓｃｇ１ΔｈｉｓＧｆｕｓ１ΔＦＵＳ１-ＨＩＳ３、ｐＬＰ８２]およびＬＹ２９０株( ｐＬＰ８３を含むＬＹ２８８の改変物)を、ｕｒａおよびｔｒｐを欠くＳＣラクテート(２％)培地に移し、つづいて、ｕｒａおよびｔｒｐを欠くＳＣガラクトース(２％)培地に移す。ついで、細胞(２×１０⁵)を、ｕｒａ、ｔｒｐおよびｈｉｓを欠くＳＣガラクトース(２％)プレート３０ｍlに平板し、寒天プレートの表面に設置したペーパーディスクに所定量の選択した化合物を適用し、３０℃にて３-５日間インキュベートする。ｓｓｔ２ΔおよびＳＳＴ２株の両方において、種々の濃度のＳ-１４で飽和したディスク周辺に増殖ハローが認められた(図１７) 、しかしながら、ＬＹ２６８株およびＬＹ２６６(ｓｓｔ２)株によって示された増殖量は、ＬＹ２８８およびＬＹ２９０株(ＳＳＴ２)で認められたものよりも顕著に大きい。さらに、ＳＳＴ２のダウン-レギュレートリー効果が、野生型ＳＣＧ１/ＧＰＡ１蛋白質を唯一発現するこれらの株でより顕著であることは、ＳＳＴ２がＳＣＧ１-Ｇα_i2キメラ蛋白質よりも天然の蛋白質と、より正確に相互作用するという予想と一致する。実施例７酵母におけるラット・コレシストキニン(ＣＣＫ_B)受容体の機能的発現コレキストキニン(ＣＣＫ)は、膵臓分泌および胆汁放出の調節において重要な役割を演じる主な腸ホルモンである(１)。また、ＣＣＫは、最も広範に分布する脳神経ペプチドの一種である(２)。ＣＣＫは、細胞表面受容体の作用を介してその作用を促進し、薬理学的基準を用いて２種のサブタイプ、ＣＣＫ_AおよびＣＣＫ_Bに分類できる(３)。モレキュラー・クローニング的な努力により、Ｇ蛋白質- 結合ＣＣＫ_A(４)およびＣＣＫ_B(５-８)受容体をコードするｃＤＮＡが同定された。最近、潜在的な不安緩解活性を有する選択的ＣＣＫ_B受容体アンタゴニスト特性を有する化合物が同定された(９)。酵母におけるＣＣＫ_B受容体の機能的な発現により、ＣＣＫ_Bアンタゴニスト特性を有する新規な化合物の迅速なスクリーニングが可能となり、新規なＣＣＫ_Bリガンドの合理的なデザインに必要なＣＣＫ_B受容体の構造面の分子的特徴付けが促進されるにちがいない。材料および方法プラスミド構築：すべての分子生物学的操作は、標準的な方法(１０)に従って行った。５'および３'末端にＢｇｌＩＩサイトを導入するオリゴヌクレオチドプライマー(5-AAAAGATCTAAAATGGACCTGCTCAAGCTG、3'-AAAAGATCTTCAGCCAGGCCCCAGTG TGCT)を用いたＰＣＲによって、ラットＣＣＫ_B受容体をラット脳ｃＤＮＡからクローン化した。ＣＣＫ_B受容体発現プラスミド、ｐＪＨ２０は、正確な向きでＢａｍＨＩ切断ｐＭＰ３にＢｇｌＩＩ-消化ＰＣＲ断片を挿入することによって構築した( １１)。この実験に用いたＧα蛋白質発現プラスミドは、ｐＬＰ８３(１１)中のＧＰＡ１の４７カルボキシ-末端アミノ酸をコードするＤＮＡ配列をＧα_s(ｐＬＰ１２２)、Ｇα_i2(ｐＬＰ１２１)のもので置換することによって構築した。菌株の構築：標準的な方法(１２)に従って、酵母株を構築し、増殖培地および培養条件を処方化した。酵母のＤＮＡ-仲介形質転換は、酢酸リチウム法を用いて行った。この報告中に記載するすべての実験の基礎として用いる酵母株は、組換え対立遺伝子を用いた逐次挿入的欠失によって構築した。ラットＣＣＫ_B受容体を発現する酵母株は、ＬＹ２９６(ＭＡＴａｕｒａ３-５２ｔｒｐｌΔ６３ｈｉｓ３Δ２００ｌｅｕ２Δ１ａｄｅ２-１０１ｌｙｓ２-８０１ｇｐａ１Δ ｈｉｓＧ１ｆａｒ１ΔＬＹＳ２ＦＵＳ１-ＨＩＳ３ｓｓｔ２ΔＡＤＥ２、参照７)の、ｐＰＪＨ２０につづく前記したＧα蛋白質発現プラスミドでの一連のＤＮＡ-仲介形質転換によって構築した。放射性同位体標識アゴニスト飽和結合アッセイ：対数増加期後期培養物からの粗製酵母膜抽出物は、公開されている方法(１３)に従ったガラス-ビース溶解および４０,０００×ｇの遠心によって調製した。粗製膜画分の蛋白質含量は、製造業者指示書に従ったバイオラド・プロテイン・アッセイ・キット(Ｂiorad pro tein assay kit)を用いて測定した。放射性同位体標識リガンド結合アッセイは、１５０ｍＭＮａＣl存在下の³Ｈ-ＣＣＫ-８(アマーシャム(Ａmersham)社)を用い、ストルナド(Ｓtrnad)ら(１４)に従って行った。非-特異的結合は、１μＭＣＣＫ-４存在下で認められるものとして定義した。無視できる特異的結合が、ＣＣＫ_B受容体を欠く細胞から調製した膜画分において認められた(データは示さず)。バイオアッセイ：酵母において発現するＣＣＫ_B受容体の機能性アッセイは、標準的な方法(１１)の修飾を用いて行った。酵母株を、グルコース(２％)を含み、ウラシルおよびトリプトファンを欠く合成完全液体培地(ＳＣＤ-ｕｒａ-ｔｒｐ) ２ｍl中で一晩増殖させ、洗浄して夾雑グルコースを洗浄し、ＳＣガラクトース( ２％)-ｕｒａ-ｔｒｐ液体培地５ｍl中にて一晩増殖させた。(オートクレーブ処理する前に濃ＫＯＨまたはＮＨ₄ＯＨを添加することによってｐＨ６.８に調整した)融解(５０℃)ＳＣガラクトース(２％)-ｕｒａ-ｔｒｐ-ｈｉｓ寒天培地３０ｍ lを一晩培養物に接種(２×１０⁴細胞/ｍl)し、正方形(９×９ｃｍ)ペトリ皿に注入した。固化した寒天表面に滅菌フィルターディスクを置き、所定量の示した化合物を含むＤＭＳＯ１０μlで飽和した。プレートを３０℃にて３日間インキュベートした。コレシストキニン(ＣＣＫ-４、ＣＣＫ-８)、ソマトスタチン(Ｓ-１４)およびｍｅｔ-エンケファリンはバケム(Ｂachem)社製である。オキシメタゾリン、イソプロテレノールおよびカルバコールはシグマ(Ｓigma)社製である。結果：酵母において発現するラットＣＣＫ_B受容体へのコレシストキニン結合性有用なバイオアッセイの開発には、酵母におけるラットＣＣＫ_B受容体の高レベルの機能的発現が前もって必要であった。ラットＣＣＫ_B受容体ｃＤＮＡは、プラスミドｐＪＨ２０中のＧＡＬ１プロモーターの制御下に置かれた。この構築物は、ＧＡＬ４配列を欠くプラスミドから発現される受容体に比して粗製膜画分中の受容体蛋白質のレベルを顕著に上昇する、ガラクトース-誘導性遺伝子の転写活性化蛋白質であるＧａ１４ｐの誘導性の過剰発現も付与する(データは示さず)。ＣＣＫ_B受容体配列を、蛋白質コード配列を改変することなく、ｐＪＨ２０に導入した。以前に、キング(Ｋing)らは、β₂-アドレナリン受容体のアミノピリミジン末端ドメインを等価のＳＴＥ２配列で置換することが酵母における効率的な受容体発現に必要であることを報告した(１５)。それとは反対に、酵母におけるＣＣＫ_B受容体の機能的な発現にはいずれの酵母配列もアミノ-末端に付加する必要はない。Ｇｐａｌｐからのアミノ-末端βγ-相互作用ドメインおよびＧＰＡ１プロモーターの制御下のラットＧα_i2(ｐＬＰ１２１)またはＧα_s(ｐＬＰ１２２)からカルボキシ-末端受容体相互作用ドメインよりなる、キメラＧα蛋白質を構築した。発現したＣＣＫ_B受容体ならびにキメラＧα_i2(ＬＹ６２８)およびＧα_s(ＬＹ６３１)蛋白質を含む酵母株を、接合シグナル変換経路の成分をコードする遺伝子をＣＣＫ_B受容体およびＧα蛋白質発現プラスミドで欠失することによって改変した酵母株(ＬＹ２９６)の形質転換によって会合した。大部分のＧ蛋白質-結合受容体は、高および低アゴニスト-依存性アフィニティー状態の両方を示す。高-アフィニティーアゴニスト結合は、受容体とヘテロ三量体Ｇ蛋白質との機能的な会合に依存する。受容体がＧ蛋白質と会合しない場合、あるいは、それから脱着しない場合には、放射性同位体標識アゴニスト飽和結合アッセイにおいて、アゴニスト結合は低アフィニティーであるか検出できないかであろう。ＬＹ６３１細胞から作製した粗製酵母膜画分においては、アゴニスト³Ｈ-ＣＣＫ -８が高アフィニティーかつ飽和可能な様式でＣＣＫ_B受容体に結合することは( 図１８)、(１)ＣＣＫ_B受容体の機能的なリガンド-結合立体構造が酵母において発現されたこと、および(２)受容体が機能的にキメラＧα蛋白質と会合して高- アフィニティーのアゴニスト結合状態となっていることを示している。酵母において発現されるＣＣＫ_B受容体は、哺乳動物細胞において発現されるＣＣＫ_B受容体の高アフィニティー結合状態(Ｋｄ＝１００ｐＭ、参照５)よりも実質的に低いアフィニティー(Ｋｄ＝８ｎＭ)を³Ｈ-ＣＣＫ-８に対して示し、このことは恐らくラットＧα_sからの受容体相互作用ドメインとの不十分な相互作用によるものである。これらの結合パラメーターは、同族Ｇα蛋白質、Ｇαｑを含む細胞からの抽出物における天然の値に、より近似していると予想されよう(５-８)。認められた³Ｈ-ＣＣＫ-８結合サイトの全数(Ｂ_max＝２０６ｆｍｏｌ/ｍｇ)は、酵母 α-接合フェロモン受容体について得られた値(２００ｆｍｏｌ/ｍｇ、参照１６) と一致した。多くのＧ蛋白質-結合受容体について、高アフィニティーアゴニスト結合はＧＴＰおよびそのアナログに対して感受性である。ＧＴＰアナログは、受容体/Ｇ-蛋白質複合体の解離を誘導し、低アフィニティーアゴニスト結合状態を生じる。ＧｐｐＮＨｐ(１００μＭ)、非-加水分解性ＧＴＰアナログをアゴニスト結合アッセイに添加すると、ＬＹ６３１細胞からの粗製膜画分において、ＣＣＫ_B受容体に対する³Ｈ-ＣＣＫ-８の特異的結合が５０％を超えて低下した。これらの結果は、ＣＣＫ_B受容体およびキメラＧα蛋白質の間の機能的な結合のさらなる兆候を示している。かくして、酵母において発現されるラットＣＣＫ_B受容体は、哺乳動物組織において認められる高-アフィニティーアゴニスト結合特性に匹敵する特性を示す。酵母において発現させた場合にアゴニスト選択性を達成するＣＣＫ_B受容体前記した遺伝的改変、ならびにＣＣＫ_B受容体およびキメラＧ_αi2およびＧ_αs 蛋白質の発現を付与するプラスミドを有する酵母株を用いて、選択的かつ感受性のバイオアッセイを設計した。ＬＹ６２８およびＬＹ６３１細胞の用量-依存性増殖応答性は、適用したＣＣＫ-４周辺で顕著であった(図-１９)。該アッセイは選択的であり：増殖ゾーンの直径がＣＣＫ_B受容体に対するリガンドの報告されたアフィニティーに比例する(ＣＣＫ-８＞ガストリン＞ＣＣＫ−４)ことは、該バイオアッセイが種々の潜在性のリガンドの間を識別できることを反映している (５-８)。他のＧ蛋白質-結合受容体(ソマトスタチン、ｍｅｔ-エンケファリン、オキシメタゾリン、イソプロテレノール、カルバコール)に選択的な種々のアゴニストの応答においても、またはＣＣＫ_B受容体を欠失する酵母細胞によっても、検出可能な増殖応答性は認められなかった(データは示さず)。ＣＣＫ-４１０ μｇに対して、検出可能な応答性が認められた。ディスカッションＣＣＫ受容体で作用する化合物、特にアンタゴニストは、大きな治療潜在性を有し得る(３)。周辺部においては、ＣＣＫアンタゴニストの阻害効果は、それを、膵炎、膵臓ガン、胆道仙痛、胃排出の疾患、および過敏性腸症候群を治療するための最良の候補としている。ＣＣＫアンタゴニストは飽和した開発を逆行させ、食物接種の増加を要する無食欲性患者他における食欲を改善するのに有効となり得る。反対に、ＣＣＫアゴニストは、有用な食欲抑制剤となり得る。また、ＣＣＫアンタゴニストは、鎮痛剤痛感脱失を強化し、よって臨床痛感の管理における使用に適当となり得る。ＣＮＳにおいては、選択的なＣＣＫアンタゴニストは強力な不安緩解剤としての見込みを有する(９)。さらに、ＣＣＫアンタゴニストは薬物使用からの中止に関連する不安も救済し、よって、通常に濫用された薬物からの投与中止の治療において用途を発見し得る。ＣＣＫアゴニストは、抗-精神剤としての用途を有し得る。本実施例に引用した参照１．アイビー,エイ・シー(Ｉvy,Ａ.Ｃ.)およびイー・オールドバーグ(Ｅ.Ｏld berg)、１９２８、ジャーナル・オブ・フィジオロジー(Ｊ.Ｐhysiol.)(ロンドン (Ｌondon))８６：５９９-６１３。２．ドックレイ,ジイ・ジェイ・アール(Ｄockray,Ｇ.Ｊ.Ｒ.)、１９７６、Ｉm munochemical evidence of 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Ｇuttierez-Ｓteil)、およびケイ・ジェイ・ブラマー(Ｋ.Ｊ.Ｂlumer)、１９９３、Ｄisruption of revceptor-Ｇ protein coupling in yeast promotes the f unction of an ＳＳＴ２-dependent adaptation pathway．ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.)２６８：８０７０-８０７７。実施例９酵母におけるラット・アデノシン(Ａ_2a)の機能的発現アデノシン、ならびにＡＴＰおよび関連するプリン化合物は、細胞から細胞のコミューニケイションのプロセスを調節する神経ホルモン剤およびオータコイドの両方として機能する(１)。この役割において、アデノシンは心拍数、ならびに収縮性、平滑筋の調子、鎮静、神経伝達物質の放出、血小板機能、脂肪分解、腎臓および白血球細胞作用を含む広範な生理学的機能を調節する。アデノシンは、細胞表面受容体の作用を介してその効果を促進し、該受容体は薬理学的基準を用いて３種のサブタイプ、Ａ₁、Ａ_2aおよびＡ_2b、ならびにＡ₃に分類できる。モレキュラー・クローニングの努力により、Ｇ蛋白質-結合アデノシンＡ₁(２-５)、Ａ_2aおよびＡ_2b(６-９)、ならびにＡ₃受容体をコードするｃＤＮＡが同定された (１０)。酵母におけるアデノシン受容体の機能的な発現により、アデノシンアゴニストおよびアンタゴニスト特性を有する新規な化合物を迅速にスクリーニングでき、新規なアデノシンリガンドの合理的な設計に必要なアデノシン受容体の構造面の分子的特徴付けが促進されるにちがいない。材料および方法プラスミド構築物．すべての分子生物学的操作は、標準的な方法(１１)に従って行った。ラットＡ_2a -アデノシン受容体(９)は、５'および３'末端にＢａｍＨＩサイトを導入するオリゴヌクレオチド・プライマー(5'GAAGATCTAAAAAATGGGCTCCTCGGTGTAC、3'ACAT GCATGCAGATCTTCAGGAAGGGGCAAACTC)を用いたＰＣＲによって、ラット脳ｃＤＮＡからクローン化した。Ａ_2a-アデノシン受容体発現プラスミド、ｐＪＨ２１は、正確な向きでＢｇｌＩＩ-消化ＰＣＲ断片をＢａｍＨＩ切断ｐＭＰ３に挿入することによって構築した。グルコース-含有培地でＡ_2a-アデノシン受容体を構造発現させるために、発現ベクター、ｐＬＰ１００を構築した。ＡＤＨ１遺伝子からの転写調節配列をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅し、ｐＲＳ４２６に挿入した。５'ＸｈｏＩ(TTTCTCGAGCGAATTTCTTATGATTT)および３'ＫｐｎＩサイト(TTTGGTACCGGGCCCGGACGGATTACAACAGGT)を付加する合成オリゴヌクレオチドを用いて、酵母ゲノムＤＮＡ(ＹＰＨ５０１、ストラタジーン(Ｓtratagene)社)からＡＤＨ１転写終止断片を増幅した。Ａ_2a-アデノシン受容体発現プラスミド、ｐＬＰ１１６は、５'ＢｇｌＩＩ(AAAGATCTAAAATGGGCTCCTCGGTGTAC)および３'ＳａｌＩ(AAGTCGACTCAGGAAGGGGCAAACTC)サイトを付加するオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。Ａ_2a-アデノシン受容体をコードするＰＣＲ断片をＢａｍＨＩ-Ｓａｌ１切断ＬＰ１００に挿入することによって構築した。この実験で用いたＧα 蛋白質発現プラスミド発現は、ｐＬＰ８３中のＧＰＡ１の４７個のカルボキシ- 末端をコードするＤＮＡ配列(１２)をＧ_αs(ｐＬＰ１２２)およびＧ_αi2(ｐＬＰ１２１)のもので置換することによって構築した。菌株の構築．標準的な方法(１３)に従って、酵母株を構築し、増殖培地および培養条件を処方化した。酵母のＤＮＡ-仲介形質転換は、酢酸リチウム法を用いて行った。本報告に記載したすべての実験の基礎として用いた酵母株は、組換え対立遺伝子を用いた逐次挿入欠失によって構築した。ラットＡ_2a-アデノシン受容体を発現する酵母株は、前記したＡ_2a-アデノシン受容体発現プラスミドにつづきＧα蛋白質発現プラスミドでＬＹ２９６(ＭＡＴａｕｒａ３-５２ｔｒｐ１Δ６３ｈｉｓ３Δ２００ｌｅｕ２Δ１ａｄｅ２-１０１ｌｙｓ２-８０１ｇｐａ１ΔｈｉｓＧｆａｒ１ΔＬＹＳ２ＦＵＳ１-ＨＩＳ３ｓｓｔ２ΔＡΔＥ２、参照２)を一連ＤＮＡ-仲介形質転換することによって構築した。放射性同位体標識アゴニスト飽和結合実験：対数増加期後期培養物からの粗製酵母膜抽出物は、公開された方法(１４)に従ったガラス-ビーズ溶解および４０, ０００×ｇ遠心によって調製した。粗製膜画分の蛋白質含量は、製造業者指示書に従ってバイオラド・プロテイン・アッセイ・キット(Ｂiorad protein assay k it)を用いて測定した。放射性同位体結合アッセイは、³Ｈ-ＮＥＣＡ(アマーシャム(Ａmersham)社)を用い、ストルナド(Ｓtrnad)ら(１５)に従って行った。非-特異的結合は、１μＭＮＥＣＡ存在下で認められるものと定義した。Ａ_2a-アデノシン受容体を欠く細胞から調製した膜画分において、無視できる特異的結合が認められた(データは示さず)。バイオアッセイ：酵母において発現するＡ_2a-アデノシン受容体の機能的アッセイは、標準的な方法(１２)の修飾を用いて行った。酵母株は、グルコース(２％)を含有し、ウラシルおよびトリプトファンを欠く合成完全液体培地(ＳＣＤ- ｕｒａ-ｔｒｐ培地)２ｍl中で一晩増殖させ、洗浄して夾雑グルコースを除去し、ＳＣガラクトース(２％)-ｕｒａ-ｔｒｐ液体培地５ｍl中にて一晩増殖させた。５ｍＭ３-アミノトリアゾール(シグマ(Ｓigma)社)を含有する融解(５０℃)ＳＣガラクトース(２％)-ｕｒａ−ｔｒｐ-ｈｉｓ寒天培地(３０ｍl、オートクレーブ処理する前に濃ＫＯＨまたはＮＨ₄ＯＨを添加することによってｐＨ６.８に調整した)を一晩培養物に接種し(２×１０⁴細胞/ｍl)、正方形(９×９ｃｍ)ペトリ皿に平板した。グルコース含有培地中でＡ_2a-アデノシン受容体を発現させるために、最初の一晩培養物から試料を取り出し、グルコース(２％)をガラクトースに置き換えた前記のものよりなる寒天培地においてアッセイした。滅菌フィルターディスクを固化した寒天表面に置き、示した化合物を所定量含むＤＭＳＯ１０ μl で飽和した。プレートは、３０℃にて３日間インキュベートした。アデノシン・リガンドＣＧＳ-２１６８０、ＮＥＣＡおよびＤＰＭＡはＲＢＩ社から購入した。ソマトスタチン(Ｓ-１４)およびｍｅｔ-エンケファリンはバケム(Ｂachem)社製である。オキシメタゾリン、イソプロテレノールおよびカルバコールはシグマ (Ｓigma)社製である。結果：酵母において発現するラットＡ_2aアデノシン受容体へのアデノシンアゴニスト結合性酵母におけるＡ_2a-アデノシン受容体の高レベルの機能的発現が、有用なバイオアッセイの開発に前もって必要であった。プラスミドｐＪＨ２１において、ラットＡ_2a-アデノシン受容体ｃＤＮＡは誘導性ＧＡＬ１プロモーターの制御下に置いた。また、この構築物は、ガラクトース-誘導性遺伝子の転写活性化蛋白質であるＧａｌ１４ｐの誘導性過剰発現を付与し、ＧＡＬ４配列を欠くプラスミドから発現された受容体と比較して、粗製膜画分中の受容体蛋白質のレベルを顕著に上昇する(データは示さず)。プラスミドｐＬＰ１１６は、ＡＤＨ１プロモータ制御下の、Ａ_2a-アデノシン受容体の高レベルの構造発現を付与する。両方のプラスミドにおいて、蛋白質コード配列を修飾することなく、Ａ_2a-アデノシン受容体をコードするＤＮＡ配列を導入した。以前に、キング(Ｋing)らは、酵母における効率的な受容体発現には、β₂-アドレナリン受容体のアミノ-末端ドメインを等価のＳＴＥ２で置換することが必要であることを報告した(１６)。それとは反対に、酵母におけるＡ_2a-アデノシン受容体の機能的な発現は、該アミノ-末端にいずれの酵母配列も付加する必要がない。ＧＰＡ１プロモーター制御下の、Ｇｐａ１ｐからの提唱したアミノ-末端βγ-相互作用ドメイン、およびラットＧ α_s(ｐＬＰ１２２)からのカルボキシル-末端受容体相互作用ドメインよりなるキメラＧα蛋白質を構築した。接合シグナル変換経路の成分をコードする遺伝子をＡ_2a-アデノシン受容体およびＧα蛋白質発現プラスミドで欠失することによって改変した酵母株(ＬＹ２９６)の形質転換によって、発現Ａ_2a-アデノシン受容体およびキメラＧα蛋白質を含む酵母株を会合させた。大部分のＧ蛋白質-結合受容体は、高および低アゴニスト-依存性アフィニティー状態の両方を示す。高-アフィニティーアゴニスト結合性は、ヘテロ三量体Ｇ蛋白質と受容体との機能的会合に依存する。受容体がＧ蛋白質と会合しないか、またはそれから脱着する場合、放射性同位体標識アゴニスト飽和結合アッセイにおいてアゴニスト結合は低いアフィニティーで検出不可能であろう。ｐＬＰ１１６およびｐＬＰ１２２(ＬＹ６２６)を有する細胞からの粗製酵母膜画分においては、アゴニスト³Ｈ-ＮＥＣＡが高アフィニティーおよび飽和様式でＡ_2α-アデノシン受容体に結合する(図２０)ことは、(１)Ａ_2a-アデノシン受容体の機能的なリガンド-結合立体構造が酵母において発現されたこと、および(２)該受容体がキメラＧα蛋白質と機能的に会合して高-アフィニティーアゴニスト結合状態を生じたことを示している。認められた³Ｈ-ＮＥＣＡ結合サイトの全数(Ｂ_max＝２４２ｆｍｏｌ/ｍｇ)は、酵母α-接合フェロモン受容体で得られた値を超えた(２００ｆｍｏｌ/ｍｇ、参照１７)。酵母膜中のＡ_2a-アデノシン受容体に対する[³ Ｈ]ＮＥＣＡのアフィニティー(Ｋｄ＝８μＭ)が哺乳動物ＳＡＩＢＯＵで認められているものに等価であることは、受容体およびＧ蛋白質の間の機能的結合を示している。酵母において発現させた場合にアゴニスト選択性が達成されるＡ_2a-アデノシン受容体Ａ_2a-アデノシン受容体(ｐＬＰ１１６)およびＧＰＡ１(ｐＬＰ８３)の発現を付与する前記した遺伝子改変およびプラスミドを有する酵母株(ＬＹ５９５)を用いて、選択性かつ感受性のバイオアッセイを設計した。ＬＹ５９５細胞の用量- 依存的な増殖応答性は、Ａ_2a-アデノシン受容体選択性アゴニストであるＣＧＳ- ２１６８０を適用した周辺で顕著であった。増殖応答性は、ＮＥＣＡおよびＤＰＭＡに応答する細胞によって示されるものよりも顕著により強烈であった(図２１)。該アッセイは選択的であり：増殖ゾーンの直径がＡ_2a-アデノシン受容体に対するリガンドの報告したアフィニティー(ＣＧＳ-２１６８０＞ＮＥＣＡ＝ＤＰＭＡ)に比例したことは、該バイオアッセイが変動する潜在性のリガンドの間を識別できることを反映している。検出可能な増殖応答性は、他のＧ蛋白質-結合受容体(ソマトスタチン、ｍｅｔ-エンケファリン、オキシメタゾリン、イソプロテレノール、カルバコール)に対して選択的な種々のアゴニストに応答して、あるいはＡ_2a-アデノシン受容体を欠失する酵母細胞により認められなかった(データは示さず)。ＣＧＳ-２１６８０１０μｇにおいて、検出可能な応答が認められた。ディスカッションアデノシン受容体の機能を調節する化合物について、複数の治療機会が存在する(１)。アデノシン・アゴニストは、癇癪発作発症の治療、ならびに発作における神経障害および神経変性疾患の予防に有用となり得る。抗リズム障害作用のアデノシンは、アデノシンアゴニストが複雑な不整脈の治療に有効となり得ることを示唆している。Ａ₂アデノシンアゴニストは、潜在的な鎮静、抗痙攣および不安緩解活性を有する。Ａ_2a-アデノシン選択性アゴニストが、脂肪組織における脂質分解を刺激するのに有用であり得ることは、体重損失治療または抗糖尿病剤として、および農業用動物における死体品質の改善に有用なものとしている。Ａ₁ アデノシンアンタゴニストは、急性腎臓不全の治療に有用となり得る。Ａ₃-アンタゴニストは、喘息を包含する炎症疾患を治療するために、マスト細胞脱顆粒を調節するのに有用となり得る。本実施例において引用した参照１．ジェイコブソン,ケイ・エイ(Ｊacobson,Ｋ.Ａ.)、ペイ・ヨット・エム・ファン・ガーレン(Ｐ.Ｊ.Ｍ.van Ｇalen)、およびエム・ウイリアムス(Ｍ.Ｗill iams)、１９９２、Ａdenosine receptors：Ｐharmacology,structure-activity relationships，and therapeutic 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mammalian β₂-adrenergic receptor and Ｇ_s α subunit．サイエンス(Ｓcience)２５０：１２１−１２３。１７．ベイナー,ヨット・エル(Ｗeiner,Ｊ.Ｌ.)、ツェイ・ガッティエレツ-ステイル(Ｃ.Ｇuttierez-Ｓteil)、およびケイ・ジェイ・ブラマー(Ｋ.Ｊ.Ｂlumer )、１９９３、Ｄisruption of receptor-Ｇ protein coupling in yeast promot es the function of an ＳＳＴ２-dependent adaptation pathway．ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.)２６８：８０７０-８０７７。実施例８酵母におけるラット・ソマトスタチンサブタイプ５受容体の機能的発現環状テトラデカペプチド・ソマトスタチンは、下垂体からの成長ホルモン、膵臓からのグルカゴンおよびインスリン、および消化管からのガストリンを包含する数種のホルモン分泌の潜在的なインヒビターである。また、ソマトスタチンは、神経伝達物質としても作用し、ＣＮＳおよび末梢組織において広範な調節作用を有することが示されてきている(１)。ソマトスタチンの効果は、ホルモンが高 -アフィニティーの原形質膜に局在するソマトスタチン(ＳＳＴＲ)受容体に高アフィニティーで結合することを介して変換される(２)。５種の異なるサブタイプ (ＳＳＴＲ１-５)中にコードされるＳＳＴＲは、ソマトスタチンに応答しての組織-特異的な相違に一部関与し、広範な細胞外シグナルの応答を仲介するＧ蛋白質-結合受容体スーパーファミリーである７個の貫膜ドメインのサブファミリーよりなる。酵母におけるＳＳＴＲ５の機能的な発現により、新規なサブタイプ- 選択性ソマトスタチンアゴニストおよびアンタゴニスト特性を有する化合物の迅速なスクリーニングが可能となり、かつ新規なソマトスタチン・リガンドの合理的なデザインに必要なＳＳＴＲ５の構造面の分子的特徴付けを促進できるにちがいない。材料および方法プラスミド構築:すべての分子生物学的操作は、標準的な方法(１１)に従って行った。ラットＳＳＴＲ５(７)は、５'および３'末端にＢｇｌＩＩサイトを導入するオリゴヌクレオチド・プライマー(5'AAAAAGATCTAAAATGGAGCCCCTCTCTCTG、3' AGCAGATCTTCAGATCCCAGAAGACAAC)を用いたＰＣＲによってラットゲノムＤＮＡからクローン化した。ＳＳＴＲ５発現プラスミドｐＪＨ１９は、ＢｇｌＩＩ-消化ＰＣＲ断片を正確な向きでＢａｍＨＩ切断ｐＭＰ３に挿入することによって構築した(１２)。この実験に用いたＧα蛋白質発現プラスミドは、ｐＬＰ８３中のＧＰＡ１の４７個のカルボキシ-末端アミノ酸をコードするＤＮＡ配列をＧα_s(ｐＬＰ１２２)、Ｇα_i2(ｐＬＰ１２１)で置換することによって構築した。菌株の構築：標準的な方法(１３)に従って、酵母株を構築し、増殖培地および培養条件を処方化した。酵母のＤＮＡ-仲介形質転換は、酢酸リチウム法を用いて行った。この報告に記載したすべての実験の基礎として用いた酵母株は、組換え対立遺伝子を用いた逐次挿入欠失によって構築した。ＳＳＴＲ５を発現する酵母株は、ＬＹ２９６(ＭＡＴａｕｒａ３-５２ｔｒｐ１Δ６３ｈｉｓΔ２００ｌｅｕ２Δ１ａｄｅ２-１０１ｌｙｓ２-８０１ｇｐａ１ΔｈｉｓＧｆａｒ１ ΔＬＹＳ２ＦＵＳ１-ＨＩＳ３ＳＳＴ２ΔＡＤＥ２、参照１２)をｐＪＨ１９につづいて前記したＧα蛋白質発現プラスミドで順次ＤＮＡ-仲介形質転換することによって構築した。バイオアッセイ．酵母において発現されるＳＳＴＲ５の機能的アッセイは、標準的な方法(１２) の修飾を用いて行った。酵母株を、グルコース(２％)を含有し、ウラシルおよびトリプトファンを欠く合成完全液体培地(ＳＣＤ-ｕｒａ-ｔｒｐ)培地２ｍl中にて一晩増殖させ、洗浄して夾雑グルコースを除去し、ＳＣガラクトース(２％)- ｕｒａ-ｔｒｐ液体培地５ｍl中で一晩増殖させた。融解(５５℃)ＳＣガラクトース(２％)-ｕｒａ-ｔｒｐ-ｈｉｓ寒天培地(３０μl、オートクレーブ処理する前に濃ＫＯＨまたはＮＨ₄ＯＨを添加することによってｐＨ６.８に調整した)を一晩培養物(２×１０⁴細胞/ｍl)で接種し、正方形(９×９ｃｍ)ペトリ皿に平板した。滅菌フィルターディスクを固化した寒天表面上に置き、示した化合物所定量を含む滅菌水１０μlで飽和した。プレートは、３０℃にて３日間インキュベートした。ソマトスタチン(Ｓ-１４、Ｓ-２８)、ｍｅｔ-エンケファリン、およびＣＣＫ-８はバケム(Ｂachem)社製である。オキシメタゾリン、イソプロテレノール、およびカルバコールはシグマ(Ｓigma)社製である。結果ＳＳＴＲ５を発現する酵母細胞のソマトスタチン依存性増殖応答性酵母におけるＳＳＴＲ５の高レベルの機能的な発現が、有用なバイオアッセイの開発に前もって必要であった。ＳＳＴＲ５ｃＤＮＡは、プラスミドｐＪＨ１９中のＧＡＬ１プロモーターの制御下に置いた。また、この構築物は、ガラクトース-誘導性遺伝子に対する転写活性化蛋白質であるＧａｌ４ｐの誘導性過剰発現を付与し、ＧＡＬ４配列を欠くプラスミドから発現される受容体に比して、粗製膜画分中の受容体蛋白質のレベルを顕著に上昇させる(データは示さず)。ＳＳＴＲ５配列は、蛋白質コード配列を修飾することなしに、ｐＪＨ１９に導入した。従前、Kingらは、β₂−アドレナリン受容体のアミノ末端ドメインを同等のＳＴＥ２配列で置換することが酵母における効率的な受容体発現に必要であると報告した（１５）。それとは異なり、ＳＳＴＲ５の酵母における機能的発現は、アミノ末端に何らの酵母配列の付加を必要としない。ＧＰＡ１プロモーターの制御下、Ｇｐａ１ｐからの提案されたアミノ末端β₂−相互反応ドメインおよびラットＧα_i2（ｐＬＰ１２１）からのカルボキシ末端受容体相互反応ドメインからなるキメラＧα蛋白質を構築した。発現されたＳＳＴＲ５およびキメラＧα蛋白質を含む酵母株（ＬＹ６２０）を、接合シグナル形質導入経路（mating signal tr ansduction pathway）の成分をコードする遺伝子の欠失で修飾した酵母株（ＬＹ２９６）のＳＳＴＲ５（ｐＪＨ１９）およびＧα蛋白質発現（ｐＬＰ１２１）プラスミドでの形質転換により組み立てた。ＬＹ６２０細胞の用量依存性増殖応答が、適用したＳ−１４の周辺で明らかとなった（図２２）。検知できる応答は、他のＧ蛋白質結合受容体（ＣＣＫ−８、ｍｅｔ−エンケファリン、オキシメタゾリン、イソプロテラノール、カルバコール）に対して選択的な種々のアゴニストについても、ＳＳＴＲ５を欠く酵母細胞によっても観察されなかった（データ示さず）。検知できる応答は、Ｓ−１４の６０ｎｍｏｌまで観察された。本実施例で引用した文献１．Brazeau，P.，W．Vale，R．Burgeus，N．Ling，M．Butcher，J．RivierおよびR．Guillemin，Science，Vol．１２９，７７−７９，１９７３；免疫反応性下垂体成長ホルモンの分泌を抑制する視床下部ポリペプチド。２．Reisine，T．およびG．I．Bell，Trends Neurosci.，Vol．１６，３４− ３８；ソマトスタチン受容体の分子生物学。３．Meyerhof，W.，H.-J．Paust，C．SchonrockおよびD．Richter，ＤＮＡ C ell Biol.，Vol．１０，６８９−６９４，１９９１；特定のラット脳領域において発現した新規な推定的Ｇ蛋白質結合受容体をコードするcＤＮＡのクローニング。４．Bruno，J．F.，Y．Xu，J．SongおよびM．Berelowitz，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA，Vol．８９，１１１５１−１１１５５，１９９２；脳特異性ソマトスタチン受容体の分子クローニングおよび機能的発現。５．Kluxen，F.-W.，C．BrunsおよびH．Libbert，Proc．Natl．Acad．Sci．US A，Vol．８９，４６１８−４６２２，１９９２；ラット脳ソマトスタチン受容体の発現クローニング。６．Li，X.-J.，M．Forte，R.A．North，C.A．RossおよびS.H．Snyder，J．Bi ol．Chem.，Vol．２６７，２１３０７−２１３１２，１９９２；脳に豊富なラットソマトスタチン受容体のクローニングおよび発現。７．O'Carrol，A.-M.，S.J．Lolait，M．KonigおよびL．Mahan，Mol．Pharmoc ol.，Vol．４２，９３９−９４６，１９９２；ソマトスタチン−２８に対する選択的な親和性を有する視床下部ソマトスタチン受容体の分子クローニングおよび発現。８．Yasuda，K.，S．Rens-Domiano，C．D．Breder，S．F．Law，C．B．Saper ，T．ReisineおよびG．I．Bell.，J．Biol．Chem.，Vol．２８，２０４２２−２０４２８，１９９２；アデニリルシクラーゼに結合した新規ソマトスタチン受容体、ＳＳＴＲ３のクローニング。９．Yamada，Y.，S．R．Post，K．Wang，H．S．Tager，G．I．BellおよびS．S eino，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，Vol．８９，２５１−２５５，１９９２；脳、胃腸管および腎臓で発現されたヒトおよびマウスのソマトスタチン受容体ファミリーのクローニングおよび機能的特徴。１０．Strnad，J.，C．M．Eppler，M．CorbettおよびJ．R．Hadcock，Biochem ．Biophys．Res．Comm.，Vol．１９１，９６８−９７６，１９９３；ラットＳＳＴＲ２ソマトスタチン受容体サブタイプが結合して環状ＡＭＰ蓄積を阻害する。１１．Sambrook，J.，E．F．FritschおよびT．Maniatis，１９８９，Molecula r Cloning，A Laboratory Handbook，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY. １２．Price，L．A.，E．M．Kajkowski，J．R．Hadcock，B．A．OzenbergerおよびM．H．Pausch，１９９５，投稿中、哺乳類ソマトスタチン受容体のアゴニスト依存活性に応じた酵母細胞増殖。１３．Rose，M.，F．WinstonおよびP．Hieter，１９９０，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY．１４．Blumer，K．J.，J．E．RenekeおよびJ．Thorner，J．Biol．Chem.，Vol ．２６３、１０８３６−１０８４２，１９８８；ＳＴＥ２遺伝子産物は、サッカロミセス・セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）のα−因子受容体のリガンド結合成分である。１５．King，K.，H．G．Dohlman，J．Thorner，M．G．CaronおよびR．J．Lefk owitz，Science，Vol．２５０、１２１−１２３，１９９０；哺乳類β₂−アドレナリン受容体およびＧα αサブユニットによる酵母接合シグナル形質導入の制御。１６．Weiner，J．L.，C．Guttierez-SteilおよびK．J．Blumer，J．Biol．Ch em.，Vol．２６８，８０７０−８０７７，１９９３；酵母における受容体−Ｇ蛋白質カップリングの崩壊はＳＳＴ２−依存適応経路の機能を促進する。実施例１０酵母におけるブタ・ソマトスタチン・サブタイプ２（ＳＳＴＲ２）の機能的発現環状テトラデカペプチド、ソマトスタチンは、下垂体からの成長ホルモン、膵臓からのグルカゴンおよびインシュリンならびに腸からのガストリンを含む幾つかのホルモン分泌の強力な阻害剤である。ソマトスタチンも神経伝達物質として作用し、ＣＮＳおよび末梢組織で広範なモジュレーター効果を有することが示されている（１）。ソマトスタチンの効果は、高親和性の原形質膜局在ソマトスタチン（ＳＳＴＲ）受容体へのホルモンの結合を介して導入される（２）。ソマトスタチンに応じた組織特異的な差異の部分的原因である（３−１１）、５つの異なるサブタイプ（ＳＳＴＲ１−５）にコードされたＳＳＴＲは、非常に広範な細胞外シグナルに対する応答を伝達するＧ蛋白質結合受容体スーパーファミリーである、７−トランスメンブラン・ドメインのサブファミリーを含む。酵母におけるフタＳＳＴＲ２の機能的発現は、新しい種およびサブタイプ選択性ソマトスタチン・アゴニストおよびアゴニスト特性を有する化合物の迅速なスクリーニングを可能にし、新しいソマトスタチン・リガンドの合理的な設計に必要なブタＳＳＴＲ２の構造的様相の分子的な特徴付けを容易にするはずである。高スループット、メカニズム・ベースのスクリーニングで同定された化合物はブタにおいて使用するための新しい成長促進剤の手がかりとなる。材料および方法プラスミドの構築：全ての分子生物学操作は標準的方法（１２）で行った。ブタＳＳＴＲ２（１１）は、５’および３’末端でＢｇｌＩＩ部位を導入するオリゴヌクレオチド・プライマー（５’ＡＡＡＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＴＧＴＣＣＡＴＴＣＣＡＴＴＴＧＡＣ、３’ＡＡＡＡＧＧＴＡＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＡＴＡＣＴＧＧＴＴＴＧＧＡＧ）を用いるＰＣＲにより、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーからクローンした。ＢｇｌＩＩ消化ＰＣＲフラグメントを正しい配向でＢａｍＨＩカットｐＭＰ３に挿入し、ブタＳＳＴＲ２発現プラスミド、ｐＪＨ１８を構築した（１３）。株の構築：酵母株を構築した。増殖培地および培養条件は標準的方法に従った（１４）。酵母のＤＮＡ伝達形質転換は酢酸リチウム法を用いて行った。本報告の全ての実験の基礎に使用した酵母株は、組換え対立遺伝子を用いる逐次挿入欠失（sequential insertional deletion）により構築した。ブタＳＳＴＲ２を発現する酵母株を、キメラＧ_αi2蛋白質発現プラスミド、ｐＬＰ８２（１３）、ついでｐＪＨ１８またはｐＪＨ１７を用いる、ＬＹ２９６（ＭＡＴａｕｒａ３ −５２ｔｒｐ１Δ６３ｈｉｓ３Δ２００ｌｅｕ２Δ１ａｄｅ２−１０１ｌｙｓ２−８０１ｇｐａ１ΔｈｉｓＧｆａｒ１ΔＬＹＳ２ＦＵＳ１−ＨＩＳ３ｓｓｔ２ΔＡＤＥ２、参考文献１３）の逐次ＤＮＡ伝達形質転換により構築した。放射線標識アゴニスト飽和結合分析：対数増殖期後期の培養物からの粗酵母膜抽出物を、文献記載の方法（１５）に従い、ガラス・ビーズ溶菌および４０，０００×ｇでの遠心分離により調製した。粗膜フラクションの蛋白含量を、バイオラド（Biorad）蛋白分析キットを用い、製造者の指示書に従い測定した。放射性リガンド結合分析を、放射線標識ソマトスタチン（¹²⁵Ｉ−ｔｙｒ¹¹−Ｓ−１４、Amersham）を用い、Strnadら（１０）に従って行った。非特異的結合は、１ μＭのＳ−１４の存在下で観察されるものとして定義した。無視してもよい特異的結合が、ブタＳＳＴＲ２を欠く細胞から作った膜フラクションで観察された（データ示さず）。バイオアッセイ：酵母で発現したブタＳＳＴＲ２の機能的分析を、標準的方法（１３）の変法を用いて行った。酵母株を、グルコース（２％）を含有し、ウラシルおよびトリプトファンを欠く合成完全液体培地（ＳＣＤ−ｕｒａ−ｔｒｐ）２ｍｌ中で一夜増殖させ、残ったグルコースを洗浄、除去し、ＳＣガラクトース（２％）−ｕｒａ−ｔｒｐ液体培地５ｍｌで一夜増殖させた。溶融（５５℃）ＳＣガラクトース（２％）−ｕｒａ−ｔｒｐ−ｈｉｓ寒天培地（３０ｍｌ、オートクレーブする前に、濃ＫＯＨまたはＮＨ₄ＯＨの添加によりｐＨ６．８に調整）に、この一夜培養物（２×１０⁴細胞／ｍｌ）を接種し、四角のペトリ皿（９ ×９ｃｍ）中で平板とした。滅菌濾紙ディスクを固化した寒天の表面に載せ、所定量の指定した化合物を含有する滅菌水１０μｌで飽和した。平板を３０℃で３日間インキュベートした。ソマトスタチン（Ｓ−１４、Ｓ−２８）、ｍｅｔ−エンケファリンはBachemからのものであった。オキシメタゾリン、イソプロテレノールおよびカルバコールはSigmaからのものであった。ＭＫ６７８およびサンドスタチンは合成的に調製した。結果：ブタＳＳＴＲ２に結合するソマトスタチンが酵母で発現した。酵母におけるブタＳＳＴＲ２の高レベルの機能的発現は、有用なバイオアッセイの開発のための必要な前提条件であった。ブタＳＳＴＲ２ｃＤＮＡを、プラスミドｐＪＨ１７および１８中でＧＡＬ１プロモーターの制御下に置いた。これらの構築物も、ガラクトース誘導遺伝子についての転写活性蛋白質Ｇａｌ４ｐの誘導過剰発現（inducible overexpression）を与え、粗膜フラクションにおいて、ＧＡＬ４配列を欠くプラスミドから発現された受容体に匹敵する受容体蛋白質の著しく高いレベルをもたらす（データ示さず）。ブタＳＳＴＲ２配列を、蛋白質コード配列の修飾なしにｐＪＨ１８に導入した。従前、Kingらは、β₂−アドレナリン受容体のアミノ末端ドメインを同等のＳＴＥ２配列で置換することが、酵母における効率のよい受容体の発現に必要であると報告した（１６）。これと異なって、酵母におけるブタＳＳＴＲ２の機能的発現は、アミノ末端への酵母配列の付加を何ら必要としない。ＧＰＡ１プロモーターの制御下の、Ｇｐａ１ｐからの提案されたアミノ末端βγ−相互反応ドメインおよびラットＧα_i2（ｐＬＰ８２）からのカルボキシ末端受容体相互反応ドメインからなるキメラＧα蛋白質を構築した。発現されたＳＳＴＲ２およびキメラＧα蛋白質を含む酵母株を、接合シグナル形質導入経路の成分をコードする遺伝子の欠失で修飾した酵母株（ＬＹ２９６）のブタＳＳＴＲ２（ｐＪＨ１７、ｐＪＨ１８）およびＧα蛋白質発現（ｐＬＰ８２）プラスミドでの形質転換により組み立てた。大部分のＧ蛋白質結合受容体は高低両方のアゴニスト依存性親和状態を示す。高い親和性アゴニスト結合は受容体の異種Ｇ蛋白質との機能的結合に依存する。受容体がＧ蛋白質と結合しないか、非共役の場合、アゴニスト結合は低親和性で、放射線標識アゴニスト飽和結合分析で検出できない。ｐＪＨ１７を有する細胞からの粗酵母膜フラクションにおいて、アゴニスト、¹²⁵Ｉ−ｔｙｒ¹¹−Ｓ−１４は、高い親和性のブタＳＳＴＲ２と飽和できる状態で結合し、（１）ブタＳＳＴＲ２の機能的リガンド結合コンホーメイションが酵母で発現され、（２）受容体がキメラＧα蛋白質と機能的に結合し、高い親和性アゴニスト結合状態をもたらせたことを示した。観察された¹²⁵Ｉ−ｔｙｒ¹¹−Ｓ−１４結合部位の総数（Ｂ_max＝１４６ｆｍｏｌ／ｍｇ）は、酵母α接合フェロモン受容体から得られた値（２００ｆｍｏｌ／ｍｇ、参考文献１７）と矛盾しなかった。酵母で発現した場合、ブタＳＳＴＲ２はアゴニスト選択性を保持した。選択性および高感度バイオアッセイを、上記の遺伝的修飾およびブタＳＳＴＲ２（ｐＪＨ１８）とＧｐａ１−Ｇα_i2キメラ蛋白質（ＬＰ８２）との発現を与えるプラスミドを持つ酵母株（ＬＹ４７４）を用いて設計した。ＬＹ４７４細胞の用量依存性増殖応答は適用したＳ−１４、ＭＫ６７８およびソマトスタチンの周辺で明らかであった（図２３）。該アッセイは選択的で、増殖域の径はブタＳＳＴＲ２に対するリガンドの報告された親和性と比例し（Ｓ−１４＝ＭＫ６７８＞ソマトスタチン）、種々の効力のリガンドを区別する該バイオアッセイの能力を反映した（１８）。検知できる応答は、他のＧ蛋白質結合受容体（ｍｅｔ−エンドケファリン、オキシメタゾリン、イソプロテレノール、カルバコール）に選択性の種々のアゴニストについても、ブタＳＳＴＲ２を欠く酵母細胞によっても観察されなかった（データ示さず）。検知できる応答は、Ｓ−１４の６０ｎｍｏｌもの少量で観察され、このバイオアッセイが極めて感度の高いことが示された。本実施例で引用した文献１．Brazeau，P.，W．Vale，R．Burgeus，N．Ling，M．Butcher，J．RivierおよびR．Guillemin，Science，Vol．１２９，７７−７９，１９７３；免疫反応性下垂体成長ホルモンの分泌を抑制する視床下部ポリペプチド。２．Reisine，T．およびG．I．Bell，Trends Neurosci.，Vol．１６，３４− ３８；ソマトスタチン受容体の分子生物学。３．Meyerhof，W.，H.-J．Paust，C．SchonrockおよびD．Richter，ＤＮＡ C ell Biol.，Vol．１０，６８９−６９４，１９９１；特定のラット脳領域において発現した新規な推定的Ｇ蛋白質結合受容体をコードするcＤＮＡのクローニング。４．Bruno，J．F.，Y．Xu，J．SongおよびM．Berelowitz，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA，Vol．８９，１１１５１−１１１５５，１９９２；脳特異性ソマトスタチン受容体の分子クローニングおよび機能的発現。５．Kluxen，F.-W.，C．BrunsおよびH．Libbert，Proc．Natl．Acad．Sci．US A，Vol．８９，４６１８−４６２２，１９９２；ラット脳ソマトスタチン受容体の発現クローニング。６．Li，X.-J.，M．Forte，R.A．North，C.A．RossおよびS.H．Snyder，J．Bi ol．Chem.，Vol．２６７，２１３０７−２１３１２，１９９２；脳に豊富なラットソマトスタチン受容体のクローニングおよび発現。７．O'Carrol，A.-M.．S.J．Lolait，M．KonigおよびL．Mahan，Mol． Pharmocol.，Vol．４２，９３９−９４６，１９９２；ソマトスタチン−２８に対する選択的な親和性を有する視床下部ソマトスタチン受容体の分子クローニングおよび発現。８．Yasuda，K.，S．Rens-Domiano，C．D．Breder，S．F．Law，C．B．Saper ，T．ReisineおよびG．I．Bell.，J．Biol．Chem.，Vol．２８，２０４２２−２０４２８，１９９２；アデニリルシクラーゼに結合した新規ソマトスタチン受容体、ＳＳＴＲ３のクローニング。９．Yamada，Y.，S．R．Post，K．Wang，H．S．Tager，G．I．BellおよびS．S eino，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，Vol．８９，２５１−２５５，１９９２；脳、胃腸管および腎臓で発現されたヒトおよびマウスのソマトスタチン受容体ファミリーのクローニングおよび機能的特徴。１０．Strnad，J.，C．M．Eppler，M．CorbettおよびJ．R．Hadcock，Biochem ．Biophys．Res．Comm.，Vol．１９１，９６８−９７６，１９９３；ラットＳＳＴＲ２ソマトスタチン受容体サブタイプが結合して環状ＡＭＰ蓄積を阻害する。１１．Matsumoto，K.，Y．Yokogashi，Y．Fujinaka，C．Z．XhangおよびS．Sa ito，Biochem．Biophys．Res．Comm.，Vol．１９９，２９８−３０５，１９９４；ブタ・ソマトスタチン受容体２の分子クローニングおよびシーケンシング。１２．Sambrook，J.，E．F．FritschおよびT．Maniatis，１９８９，Molecula r Cloning，A Laboratory Handbook，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY．１３．Price，L．A.，E．M．Kajkowski，J．R．Hadcock，B．A．OzenbergerおよびM．H．Pausch，１９９５，投稿中、哺乳類ソマトスタチン受容体のアゴニスト依存活性に応じた酵母細胞増殖。１４．Rose，M.，F．WinstonおよびP．Hieter，１９９０，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY．１５．Blumer，K．J.，J．E．RenekeおよびJ．Thorner，J．Biol．Chem.，Vol ．２６３、１０８３６−１０８４２，１９８８；ＳＴＥ２遺伝子産物は、サッカロミセス・セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）のα−因子受容体のリガンド結合成分である。１６．King，K.，H．G．Dohlman，J．Thorner，M．G．CaronおよびR．J．Lefk owitz，Science，Vol．２５０、１２１−１２３，１９９０；哺乳類β₂−アドレナリン受容体およびＧα αサブユニットによる酵母接合シグナル形質導入の制御。１７．Weiner，J．L.，C．Guttierez-SteilおよびK．J．Blumer，J．Biol．Ch em.，Vol．２６８，８０７０−８０７７，１９９３；酵母における受容体−Ｇ蛋白質カップリングの崩壊はＳＳＴ２−依存適応経路の機能を促進する。１８．Marback，P.，W．BauerおよびU．Briner，Horm Res.，Vol．２９，５４ −５８，１９８８；ソマトスタチン・アナログの構造−機能関係。実施例１１ＭＳＧ５の欠失はアゴニストに対する応答感度を増加する。シグナル形質導入系の持続性刺激に対する応答性は経時的に減少する。この現象は、脱感作または適合（adaptation）として知られ、シグナル応答系の一般的な特徴である。適合についての幾つかの分子メカニズムが、酵母接合シグナル形質導入経路について記載されている（１）。ＳＳＴ２遺伝子における突然変異は、適合欠損と、接合フェロモン感受性の増加とを与える（２および３）。ラットＳＳＴＲ２を機能的に発現する酵母細胞による適用したソマトスタチンに対する応答は、ｓｓｔ２突然変異細胞で大きく増加する（４）。その産物が適合応答における役割を果たす他の遺伝子における突然変異は同様な効果を有すると期待される。推定蛋白質チロシンホスファターゼをコードするＭＳＧ５遺伝子における突然変異は、接合フェロモン（５）に対する感度増加をもたらす。この研究では、ラットＳＳＴＲ２を発現する細胞におけるＭＳＧ５の欠失が、ソマトスタチンに対する感度を大きく増加する。ＭＳＧ５突然変異の効果はＳＳＴ２欠失突然変異と相加する。二重変異株ｓｓｔ２ｍｓｇ５細胞は、Ｇ蛋白質結合受容体とＧ蛋白質とに相互反応する化合物についての非常に感度のよいバイオアッセイの基礎を形成する。材料および方法株の構築：全ての分子生物学的操作は、標準的方法（６）に従って行った。酵母株を構築した。増殖培地および培養条件は標準的方法に従った（７）。酵母のＤＮＡ伝達形質転換は酢酸リチウム法を用いて行った。これらの実験で使用した酵母株は、ｐＳ／ＰＤｅ１およびマルチコピーＹＥｐＭＳＧ５中、組換えｍｓｇ５ΔＬＥＵ２対立遺伝子を用いて構築した。変化したＭＳＧ５レベルを有する酵母株を、ＬＹ２６８（ＭＡＴａｕｒａ３−５２ｔｒｐ１Ｄ６３ｈｉｓ３Ｄ２００ｌｅｕ２Ｄ１ａｄｅ２−１０１ｌｙｓ２−８０１ｇｐａ１ΔｈｉｓＧｆａｒ１ΔＬＹＳ２ＦＵＳ１−ＨＩＳ３ｓｓｔ２ΔＡＤＥ２，ｐＪＨ２，ｐＬＰ８２）のＤＮＡ伝達形質転換により構築し、ＭＰＹ４５９（ＬＹ２６８ｍｓｇ５ΔＬＥＵ２ｓｓｔ２ΔＡＤＥ２）およびＭＰＹ４６７（ＬＹ２６８ＹＥｐＭＳＧ５）を得、また、ＬＹ２８８（ＬＹ２６８ＳＳＴ２）からＭＰＹ４５８（ＬＹ２８８ｍｓｇ５ΔＬＥＵ２ＳＳＴ２）およびＭＰＹ４６６（ＬＹ２８８ＹＭＳＧ５）を得た（４）。バイオアッセイ：酵母で発現したラットＳＳＴＲ２の機能的分析を、標準的方法（４）の変法を用いて行った。酵母株を、グルコース（２％）を含有し、ウラシル、トリプトファンおよびロイシンを欠く合成完全液体培地（ＳＣＤ−ｕｒａ−ｔｒｐ−ｌｅｕ）２ｍｌ中で一夜増殖させ、残ったグルコースを洗浄、除去し、ＳＣガラクトース（２％）−ｕｒａ−ｔｒｐ−ｌｅｕ液体培地５ｍｌで一夜増殖させた。溶融（５５℃）ＳＣガラクトース（２％）−ｕｒａ−ｔｒｐ−ｌｅｕ−ｈｉｓ寒天培地（３５ｍｌ、オートクレーブする前に、濃ＮＨ₄ＯＨの添加によりｐＨ６．８に調整）に、この一夜培養物（２×１０⁴細胞／ｍｌ）を接種し、四角のペトリ皿（９×９ｃｍ）中で平板とした。滅菌濾紙ディスクを固化した寒天の表面に載せ、所定量のソマトスタチン(Ｓ−１４）を含有する滅菌水１０μｌで飽和した。平板を３０℃で３日間インキュベートした。ソマトスタチン（Ｓ−１４）はBachemからのものであった。結果：ＭＳＧ５の欠失はリガンドに対する感度増加を促進する。ＭＳＧ５遺伝子産物の発現の変動効果を、ラットＳＳＴＲ２を発現する細胞によるＳ−１４に対する増殖応答の比較により評価した（図２４）。ＭＳＧ５適合機能を排除する突然変異が適用したＳ−１４に対するバイオアッセイの感度を増加するものと期待されるが、ＭＳＧ５の過剰発現は、増殖応答を鈍くするはずである。期待したように、適用したＳ−１４に対する用量依存性増殖応答がＬＹ２８８（ＳＳＴ２ＭＳＧ５）について観察された。期待どおり、ＭＰＹ４５８におけるＭＳＧ５遺伝子の欠失は、バイオアッセイの感度を実質的に向上させる。ＭＰＹ４５８の増殖応答は、ＬＹ２６８（ｓｓｔ２ΔＡＤＥ２ＭＳＧ５）によって示された応答に匹敵する。両方の遺伝子における突然変異の効果は二重変異株ＭＰＹ４５９（ｍｓｇ５ΔＬＥＵ２ｓｓｔ２ΔＡＤＥ２）でも観察され、増殖応答にさらなる向上を示した。ＳＳＴ２（ＭＰＹ４６６）およびｓｓｔ２ΔＡＤＥ２（ＭＰＹ４６７）株におけるＭＳＧ５の過剰発現は増殖応答を激しく減少させた。本実施例で引用した文献１．Sprague，G．およびJ．W．Thorner，J．R．Pringle，E．W．JonesおよびJ ．R．Broach，Gene expression，２，１９９２，Cold Spring Harbor Laborator y Press，Cold Spring Harbor，NY．；サッカロミセス・セレビシアの接合過程におけるフェロモン応答およびシグナル形質導入。２．Chan，R．K．およびC．A．Otte，Mol．Cell．Biol.，Vol．２，１１−２０，１９８２；α因子および因子フェロモンによるＧ１停止に対して超感受性のサッカロミセス・セレビシア変異株の単離および遺伝的分析。３．Chan，R．K．およびC．A．Otte，Mol．Cell．Biol.，Vol．２，２１−２９，１９８２；α因子および因子フェロモンによるＧ１停止に対して超感受性のサッカロミセス・セレビシア変異株の生理学的特徴付け。４．Price，L．A.，E．M．Kajkowski，J．R．Hadcock，B．A．OzenbergerおよびM．H．Pausch，１９９５，投稿中、哺乳類ソマトスタチン受容体のアゴニスト依存活性に応じた酵母細胞増殖。５．Doi，K.，A．Gartner，G．Ammerer，B．Errede，H．Shinkawa，K．Sugimo toおよびK．Matsumoto，EMBO J.，Vol．１３、６１−７０，１９９４；ＭＳＧ５、新規蛋白質ホスファターゼは、サッカロミセス・セレビシアにおけるフェロモン応答に対する適応を促進する。６．Sambrook，J.，E．F．FritschおよびT．Maniatis，１９８９，Molecular Cloning，A Laboratory Handbook，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Ha rbor，NY．７．Rose，M.，F．WinstonおよびP．Hieter，１９９０，Methods in Yeast Ge netics，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY．実施例１２酵母におけるヒト成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）の機能的発現成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）は下垂体からの成長ホルモン分泌の強力な刺激剤である（１）。ＧＲＦの効果は、該ホルモンの高親和性、原形質膜局在ＧＲＦ受容体に対する結合を介して導入される。ＧＲＦ受容体および関連するセクレチン群受容体は、７−トランスメンブラン・ドメイン、広範な種々の細胞外シグナルに対する応答を伝達するＧ蛋白質結合受容体スパーファミリーのサブファミリーを含み、大きなアミノ末端リガンド結合ドメインの存在によって区別される（２）。酵母におけるヒトＧＲＦ受容体の機能的発現（３）は、新しい種選択性アゴニストの迅速なスクリーニングを可能にし、新しいＧＲＦ受容体リガンドの合理的設計に必要なＧＲＦ受容体の構造的様相の分子的特徴付を容易にするはずである。ＧＲＦアゴニストは、農業動物に使用するための新しい群の成長促進剤に相当し、また、身長の小さい小児の成長管理におけるヒトの治療的適用も見出しうる。材料および方法プラスミドの構築：全ての分子生物学操作は標準的方法（４）で行った。ヒトＧＲＦ受容体（３）は、５’および３’末端でＢａｍＨＩ部位を導入するオリゴヌクレオチド・プライマー（５’ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＴＧＧＡＣＣＧＣＣＧＧＡＴＧＴＧＴＧＧＧＧＧ、３’ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＣＡＣＡＴＡＧＡＴＧＴＣＡＧ）を用いるＰＣＲにより、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーからクローンした。ＢａｍＨＩ消化ＰＣＲフラグメントを正しい配向でＢａｍＨＩカットｐＭＰ３に挿入し、ＧＲＦ受容体発現プラスミド、ｐＪＨ２５を構築した（５）。この研究で使用したＧα蛋白質発現プラスミドは、ｐＬＰ８３において４７個のカルボキシ末端アミノ酸をコードするＤＮＡ配列をＧα_s（ｐＬＰ１２２）のそれと置換することにより構築した。株の構築：酵母株を構築した。増殖培地および培養条件は標準的方法に従った（６）。酵母のＤＮＡ伝達形質転換は酢酸リチウム法を用いて行った。本報告の全ての実験の基礎に使用した酵母株は、組換え対立遺伝子を用いる逐次挿入欠失により構築した。ヒトＧＲＦを発現する酵母株を、ｐＪＨ２５、ついで、キメラＧ_αs蛋白質発現プラスミド、ｐＬＰ１２２（５）を用いる、ＬＹ２９６（ＭＡＴａｕｒａ３−５２ｔｒｐ１Δ６３ｈｉｓ３Δ２００ｌｅｕ２Δ１ａｄｅ２−１０１ｌｙｓ２−８０１ｇｐａ１ΔｈｉｓＧｆａｒ１ΔＬＹＳ２ＦＵＳ１−ＨＩＳ３ｓｓｔ２ΔＡＤＥ２、参考文献５）の逐次ＤＮＡ伝達形質転換により構築した。バイオアッセイ：酵母で発現したヒトＧＲＦの機能的分析を、標準的方法（５）の変法を用いて行った。酵母株を、グルコース（２％）を含有し、ウラシルおよびトリプトファンを欠く合成完全液体培地（ＳＣＤ−ｕｒａ−ｔｒｐ）２ｍｌ中で一夜増殖させ、残ったグルコースを洗浄、除去し、ＳＣガラクトース（２％）−ｕｒａ−ｔｒｐ液体培地５ｍｌで一夜増殖させた。溶融（５５℃）ＳＣガラクトース（２％）−ｕｒａ−ｔｒｐ−ｈｉｓ寒天培地（３０ｍｌ、オートクレーブする前に、濃ＫＯＨまたはＮＨ₄ＯＨの添加によりｐＨ６．８に調整）に、この一夜培養物（２×１０⁴細胞／ｍｌ）を接種し、四角のペトリ皿（９×９ｃｍ）中で平板とした。滅菌濾紙ディスクを固化した寒天の表面に載せ、所定量の指定した化合物を含有する滅菌水１０μｌで飽和した。平板を３０℃で３日間インキュベートした。ヒトＧＲＦ（ｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ₂）、（Ｄ−ａｌａ₂）−ｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ₂およびｍｅｔ−エンケファリンはBachem からのものであった。オキシメタゾリン、イソプロテレノールおよびカルバコールはSigmaからのものであった。結果：ヒトＧＲＦ受容体に結合するＧＲＦが酵母で発現した。酵母におけるヒトＧＲＦ受容体の高レベルの機能的発現は、有用なバイオアッセイの開発のための必要な前提条件であった。該ＧＲＦ受容体ｃＤＮＡを、プラスミドｐＪＨ２５中でＧＡＬ１プロモーターの制御下に置いた。これらの構築物も、ガラクトース誘導遺伝子についての転写活性蛋白質Ｇａｌ４ｐの誘導過剰発現を与え、粗膜フラクションにおいて、ＧＡＬ４配列を欠くプラスミドから発現された受容体に匹敵する受容体蛋白質の著しく高いレベルをもたらす（データ示さず）。ＧＲＦ受容体配列を、蛋白質コード配列の修飾なしにｐＪＨ２５に導入した。従前、King らは、β₂−アドレナリン受容体のアミノ末端ドメインを同等のＳＴＥ２配列で置換することが、酵母における効率のよい受容体の発現に必要であると報告した（９）。これとは異なり、酵母におけるＧＲＦ受容体の機能的発現は、アミノ末端への酵母配列の付加を何ら必要としない。ＧＰＡ１プロモーターの制御下、Ｇｐａ１ｐからの提案されたアミノ末端βγ−相互反応ドメインおよびラットＧα ｓ（ｐＬＰ１２２）からのカルボキシ末端受容体相互反応ドメインからなるキメラＧα蛋白質を構築した。発現されたＧＲＦ受容体およびキメラＧα蛋白質を含む酵母株を、接合シグナル形質導入経路の成分をコードする遺伝子の欠失で修飾した酵母株（ＬＹ２９６）のヒトＧＲＦ受容体（ｐＪＨ２５）およびキメラＧｐａｌ−Ｇαｓ蛋白質発現（ｐＬＰ１２２）プラスミドでの形質転換により組み立てた。ヒトＧＲＦ受容体は、酵母で発現させると、アゴニスト選択性を保持した。上記の遺伝的修飾と、ヒトＧＲＦ受容体（ｐＪＨ２５）およびＧｐａｌ−Ｇα_sキメラ蛋白質（ｐＬＰ１２２）の発現を与えるプラスミドとを有する酵母株（ＣＹ９９０）を用いて選択性の高感度のバイオアッセイを設計した。ＣＹ９９０細胞の用量依存性増殖応答はＧＲＦのアゴニスト・アナログ［ｈＧＲＦ（１−２９） −ＮＨ₂、図２５Ａ］の周辺で明であり、アンタゴニスト・アナログ［（Ｄ−ａｒｇ²）−ｈＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ₂、図２５Ｂ］の共投与により阻害された。アッセイは選択的であり、検知できる応答は、他のＧ蛋白質結合受容体（ｍｅｔ−エンドケファリン、オキシメタゾリン、イソプロテレノール、カルバコール）に選択性の種々のアゴニストについても、ＧＲＦ受容体を欠く酵母細胞によっても観察されなかった（データ示さず）。検知できる応答は、ＧＲＦの２０ｎｍｏｌまで観察され、このバイオアッセイが極めて高い感度であることが示された。本実施例で引用した文献１．Bohlen，P．F．Esch，P．Brazeau，N．LingおよびGuillemin.，Biochem． Biophys．Res．Comm.，Vol．１１６，７２６−７３４，１９８３；ブタ下垂体成長ホルモン放出因子の単離および特徴付け。２．Segre，G．V．およびS．R．Goldring，Trends Endo．Metab.，Vol．4，３０９−３１４，１９９３；新たに発見されたＧ蛋白質結合受容体ファミリーに属する、セクレチン、カルシトニン、パラチロイド・ホルモン（ＰＴＨ）／ＰＴＨ −放出ペプチド、バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド、グルカゴン様ペプチド１、成長ホルモン放出因子およびグルカゴンに対する受容体。３．Gaylinn，B．D.，J．K．Harrison，J．R．Zysk，C．E．Lyons.，K．R．Ly nchおよびM．O．Thorner，Mol．Endocrinol.，Vol．７，７７−８４，１９９３；成長ホルモン放出ホルモンに対するヒト下垂体前葉受容体の分子クローニングおよび発現。４．Sambrook，J.，E．F．FritschおよびT．Maniatis，１９８９，Molecular Cloning，A Laboratory Handbook，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Ha rbor，NY．５．Price，L．A.，E．M．Kajkowski，J．R．Hadcock，B．A．OzenbergerおよびM．H．Pausch，１９９５，投稿中、哺乳類ソマトスタチン受容体のアゴニスト依存活性に応じた酵母細胞増殖。６．Rose，M.，F．WinstonおよびP．Hieter，１９９０，Methods in Yeast Ge netics，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY．７．Blumer，K．J.，J．E．RenekeおよびJ．Thorner，J．Biol．Chem.，Vol．２６３、１０８３６−１０８４２，１９８８；ＳＴＥ２遺伝子産物は、サッカロミセス・セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）のα−因子受容体のリガンド結合成分である。８．Strnad，J.，C．M．Eppler，M．CorbettおよびJ．R．Hadcock，Biochem． Biophys．Res．Comm.，Vol．１９１，９６８−９７６，１９９３；ラットＳＳＴＲ２ソマトスタチン受容体サブタイプが結合して環状ＡＭＰ蓄積を阻害する。９．King，K.，H．G．Dohlman，J．Thorner，M．G．CaronおよびR．J．Lefkow itz，Science，Vol．２５０、１２１−１２３，１９９０；哺乳類β₂−アドレナリン受容体およびＧ_sαサブユニットによる酵母接合シグナル形質導入の制御。１０．Weiner，J．L.，C．Guttierez-SteilおよびK．J．Blumer，J．Biol．Ch em.，Vol．２６８，８０７０−８０７７，１９９３；酵母における受容体−Ｇ蛋白質カップリングの崩壊はＳＳＴ２−依存適応経路の機能を促進する。実施例１３ＳＴＥ５０の過剰発現は、酵母バイオアッセイの感度を高める。適合についての幾つかの分子メカニズムが酵母接合シグナル形質導入経路に関して記載されている（１）。これらのメカニズムの１つ以上の改変は、脱感作経路を変え、そのため、アゴニストの受容体への結合により開始されるシグナルを引き延ばすことにより、バイオアッセイの感度を高めるのに役立つはずである。該酵母バイオアッセイの感度に対するｓｓｔ２突然変異の影響は、先に記載した（実施例６）。ｓｓｔ２における遺伝的修飾についての改変と同様、酵母ＳＴＥ５０遺伝子の過剰発現が同様な効果を有すると推定されたが（２）、異なる作用のメカニズムによるものであった（２および３）。ＳＴＥ５０遺伝子を単離し、高コピー数プラスミド中の強力な構成プロモーターの制御下に置いた。発現したＳＳＴＲ２ソマトスタチン受容体を介する哺乳類ホルモン、ソマトスタチンに対して応答するように操作した酵母が、ＳＴＥ５０が過剰発現すると、より強く応答することが判明した。材料および方法ＳＴＥ５０発現プラスミドの構築：細菌株の増殖およびプラスミドの操作は標準的方法（４）で行った。ＳＴＥ５０についての蛋白質コード配列を、公知の配列（２）を試験し、選択したオリゴヌクレオチドーを用いるポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）により増幅した。センス・オリゴヌクレオチド（５’−ＧＴＣＧＡＣＡＡＡＴＣＡＧＡＴＧＧＡＧＧＧＴＡＡＡＣＡＧＧ−３’）は翻訳開始コドン（アンダーラインを付した）およびＳａｌＩ制限部位を含み、アンチセンス・オリゴヌクレオチド（５’−ＧＡＧＣＴＣＡＴＴＡＧＡＧＴＣＴＴＣＣＡＣＣＧＧＧＧＧ−３’）は、翻訳停止コドン（アンダーラインを付した）およびＳａｃＩ制限部位を含んだ。これらのオリゴヌクレオチドを標準的なＰＣＲでプライマーとして使用し、サッカロミセス・セレビシア・ゲノムＤＮＡからＳＴＥ５０を増幅した。１，１００塩基対増幅生成物をｐＣＲ２ベクター（Invitrogen Corp.，San Diego，CA）にクローンし、ＤＮＡ配列を確認した。ついで、ＳＴＥ５０配列をＳａｌＩ−ＳａｃＩ制限フラグメント上に単離し、ｐＡＤＨ発現ベクター（５）にクローンし、強力な構成ＡＤＨ１プロモーターの制御下、ＳＴＥ５０発現に供した。このプラスミドをｐＯＺ１６２と命名した。酵母株の構築：酵母株の増殖および形質転換はRoseらの方法に従って行った（６）。ソマトスタチン受容体発現株ＬＹ２６８（ＭＡＴａｕｒａ３−５２ｔｒｐ１Δ６３ｈｉｓ３Δ２００ｌｅｕ２Δ１ａｄｅ２−１０１ｌｙｓ２ −８０１ｇｐａ１ΔｈｉｓＧｆａｒ１ΔＬＹＳ２ＦＵＳ１−ＨＩＳ３ｓｓｔ２ΔＡＤＥ２、ｐＪＨ２、ｐＬＰ８２）は、先の実施例およびPriceら（７）によって記載されている。ＬＹ２６８株をＳＴＥ５０発現プラスミドｐＯＺ１６２またはｐＡＤＨベクターのいずれかで形質転換した。これらの株を、各々、ＣＹ５６０およびＣＹ５６２と命名した。バイオアッセイ：酵母で発現したＳＳＴＲ２ソマトスタチン受容体発現のバイオアッセイは先の実施例およびPriceら（７）によって記載されている。要約すると、酵母株を、グルコース（２％）を含有し、ウラシル、トリプトファンおよびロイシンを欠く合成完全液体培地（ＳＣＤ−ｕｒａ−ｔｒｐ−ｌｅｕ）２ｍｌ中で一夜増殖させ、残ったグルコースを洗浄、除去し、ＳＣガラクトース（２％）−ｕｒａ−ｔｒｐ−ｌｅｕ液体培地５ｍｌで一夜増殖させた。溶融（５２℃ ）ＳＣガラクトース（２％）−ｕｒａ−ｔｒｐ−ｌｅｕ−ｈｉｓ寒天培地（３０ｍｌ、オートクレーブする前に、ＫＯＨの添加によりｐＨ６．８に調整）に、この一夜培養物０．０６ｍｌを接種し、最終細胞密度約１０⁵細胞／ｍｌ）とし、四角のペトリ皿（９×９ｃｍ）中で平板とした。滅菌濾紙ディスクを固化した寒天の表面に載せ、所定量のソマトスタチン−１４（Bachem Biosceince Inc.，Ph iladelphia，PA）またはα接合フェロモン（Sigma，St．Louiｓ，MO）を含有する滅菌水１０μｌで飽和した。平板を３０℃で３日間インキュベートした。結果：酵母バイオアッセイの感度に対するＳＴＥ５０過剰発現の影響を、ＳＴＥ５０発現のレベルだけが相異する株と比較して試験した（図２６）。ＳＴＥ５０過剰発現株ＣＹ５６０または対照株ＣＹ５６２を含有させたバイオアッセイ平板を作成した。これらの株のソマトスタチンまたは酵母フェロモンに対する応答を、材料および方法に記載のとおり試験した。野生型酵母Ｇα遺伝子、ＧＰＡ１が破壊され、キメラＧｐａｌ／Ｇα₁₂蛋白質を発現する遺伝子に機能的に置換されたので、両株とも酵母フェロモンに対しては非常に弱い応答を有していた（７）。このキメラＧα蛋白質は酵母フェロモン受容体と、効率的には相互反応しない。しかし、これらの細胞のソマトスタチンに対する応答は強力である（図２６）。予想されたように、ＳＴＥ５０の過剰発現はより強力な応答をもたらせた（図２６ａ）。これらのデータは、ＳＴＥ５０の過剰発現が、たとえ、リガンドおよび受容体が異種源から由来したとしても、ＳＴＥ５０の過剰発現が、酵母シグナル形質導入経路に結合したＧ蛋白質結合受容体を介して作用するリガンドに対する一種の過敏症を生じることを示している。本実施例で引用した文献１．Sprague，G．およびJ．W．Thorner，J．R．Pringle，E．W．JonesおよびJ ．R．Broach，Gene expression，２，１９９２，Cold Spring Harbor Laborator y Press，Cold Spring Harbor，NY.；サッカロミセス・セレビシアの接合過程におけるフェロモン応答およびシグナル形質導入。２．Ramezani-Rad M.，Xu．G.，Hollenberg C．P.，Mol．Gen．Genet.，Vol ．２３６，１４５−１５４，１９９２；サッカロミセス・セレビシアにおける接合の初期段階において接合の活性化に必要な新規遺伝子、ＳＴＥ５０。３．Chan，R．K．およびC．A．Otte，Mol．Cell．Biol.，Vol．２，１１−２０，１９８２；α因子および因子フェロモンによるＧ１停止に対して超感受性のサッカロミセス・セレビシア変異株の単離および遺伝的分析。４．T．Maniatis，E．F．FritschおよびSambrook，J.，１９８２，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press．５．Martin G．A.，Viskochil D.，Bollag G.，et al，Cell，Vol．６３，８４３−８４９，１９９０；神経線維腫症タイプ１遺伝子生成物のＧＡＰ関連ドメインはｒａｓｐ２１と相互反応する。６．Rose，M.，F．WinstonおよびP．Hieter，１９９０，Methods in Yeast Ge netics，Cold Spring Harbor Laboratory Press．７．Price，L．A.，E．M．Kajkowski，J．R．Hadcock，B．A．OzenbergerおよびM．H．Pausch，１９９５，投稿中、哺乳類ソマトスタチン受容体のアゴニスト依存活性に応じた酵母細胞増殖。実施例１４ソマトスタチン受容体アゴニストおよび／またはアンタゴニスト特性を有する化合物の同定ソマトスタチン・アゴニスト特性を有する新規サブタイプ選択性化合物は、種々のタイプの癌の検出および処置に著しい治療学的素質を有する。ソマトスタチン。アンタゴニスト特性を有する化合物は、農業種において成長ホルモンの放出を促進するのに有用でありうる。増加した成長ホルモンの放出は、成長遂行および肉質改善に有用でありうる。これらの目的で、所望のソマトスタチン・アゴニストおよび／またはアゴニスト特性を有する化合物を分析するための、酵母ベースの、メカニズム・ベースのスクリーニング・アッセイを開発した。バイオアッセイ：ソマトスタチン・アゴニストおよび／またはアンタゴニスト特性を有する化合物を検出するために開発されたバイオアッセイを、ＳＳＴＲ２を機能的に発現する酵母株（ＬＹ３６４：ＭＡＴａｕｒａ３−５２ｔｒｐ１Δ６３ｈｉｓ３Δ２００ｌｅｕ２Δ１ａｄｅ２−１０１ｌｙｓ２−８０１ｇｐａ１ΔｈｉｓＧｆａｒ１ΔＬＹＳ２ＦＵＳ１−ＨＩＳ３ｓｓｔ２ΔＡＤＥ２、ｐＪＨ２、ｐＬＰ８２）を用いて行った。アッセイは、標準的な方法の変法を用いて行った。Ｙ３６４を、グルコース（２％）を含有し、ウラシルおよびトリプトファンを欠く合成完全液体培地（ＳＣＤ−ｕｒａ−ｔｒｐ）２ｍｌ中で一夜増殖させ、残ったグルコースを洗浄、除去し、ＳＣガラクトース（２％）−ｕｒａ−ｔｒｐ−ｌｅｕ液体培地５ｍｌで一夜増殖させた。溶融（５５ ℃）ＳＣガラクトース（２％）−ｕｒａ−ｔｒｐ−ｈｉｓ寒天培地（１５０ｍｌ、オートクレーブする前に、濃ＫＯＨまたはＮＨ₄ＯＨの添加によりｐＨ６．８に調整）に、この一夜培養物（２×１０⁴細胞／ｍｌ）を接種し、四角のペトリ皿（５００ｃｍ²）中で平板とした。アンタゴニストのアッセイには、注ぐ前に溶融寒天にソマトスタチン（２０ｎＭＳ−１４）を加えた。滅菌濾紙ディスクを固化した寒天の表面に載せ、所定量の候補化合物を含有する滅菌水１０μｌで飽和した。平板を３０℃で３日間インキュベートした。結果：一次スクリーニングで活性な化合物を再アッセイし、結果を図２７に示した。左側のパネルは、ソマトスタチン・アゴニスト特性を有する化合物についてのアッセイの結果である。実質的な成長促進活性を示した４つの化合物は、ソマトスタチン・アゴニスト特性を有すると期待された。一番下の４つの位置に見られる化合物は、コントロールとして適用した種々の量のソマトスタチンである。右側のパネルは、ソマトスタチン・アンタゴニスト活性を有する化合物についての結果を示している。アンタゴニスト・バイオアッセイにおいて、ソマトスタチンは注ぐ前の溶融寒天に添加している。このようにして、平板内の全ての細胞に、ソマトスタチンに応じた増殖を導入する。適用した、アンタゴニスト特性を有する活性化合物が寒天培地内に拡散し、そのなかの細胞と接触するにつれ、ソマトスタチンによって誘導された増殖応答が妨害され、増殖阻害の透明域を生じる。数種の化合物が検知できる増殖阻害特性を示した。実施例１５ＳＴＥ２配列のＳＳＴＲ２のアミノ末端への融合は、ソマトスタチンに応じたシグナル効率を減じる。一般にＧ蛋白質結合受容体、特に、ＳＳＴＲ２の酵母における高レベルの機能的発現が、有用なバイオアッセイの開発に必須の前提条件であった。Kingらは、 β₂−アドレナリン受容体のアミノ末端ドメインを同等のＳＴＥ２配列で置換することが、酵母における効率のよい受容体の発現に必要であると報告した。この仮説およびＳＴＥ２配列の酵母におけるソマトスタチン受容体発現に対する影響をテストするため、ラットＳＳＴＲ２ｃＤＮＡを、プラスミドｐＪＨ１およびｐＪＨ２で、ＧＡＬ１プロモーターの制御下に置いた。これらの構築物は、ガラクトース誘導遺伝子についての転写活性化蛋白質であるＧａｌ４ｐの誘導過剰発現を与え、ＧＡＬ４配列を欠くプラスミドから発現された受容体に匹敵する、粗膜フラクションにおける著しく高められたレベルの受容体蛋白質をもたらす（データ示さず）。ＳＳＴＲ２発現プラスミドｐＪＨ１において、ＳＳＴＲ２の最初の１３個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を、ＳＴＥ２の最初の２３個のアミノ酸をコードする配列と置換した（図１１）。ラットＳＳＴＲ２配列を、蛋白質コード配列の修飾なしにｐＪＨ２に導入した。これらの構築物を含む酵母株（ＬＹ３２２：ＭＡＴａｕｒａ３−５２ｔｒｐ１Δ６３ｈｉｓ３Δ２００ｌｅｕ２Δ１ａｄｅ２−１０１ｌｙｓ２−８０１ｇｐａ１ΔｈｉｓＧｆａｒ１ΔＬＹＳ２ＦＵＳ１−ＨＩＳ３ｓｓｔ２ΔＡＤＥ２、ｐＪＨ１、ｐＬＰ８２；ＬＹ２６８：ＭＡＴａｕｒａ３−５２ｔｒｐ１Δ６３ｈｉｓ３Δ２００ａｄｅ２−１０１ｌｙｓ２−８０１ｇｐａ１ΔｈｉｓＧｆａｒ１ΔＬＹＳ２ＦＵＳ１−ＨＩＳ３ｓｓｔ２ΔＡＤＥ２、ｐＪＨ２、ｐＬＰ８２）は、ＧＰＡ１プロモーターの制御下、Ｇｐａｌｐからの提案されたアミノ末端βγ 相互反応ドメインおよびラットＧ_αi2からのカルボキシ末端受容体相互反応ドメインからなるキメラＧα蛋白質の発現を与えるプラスミド（ｐＬＰ８２）を有する。これらの株の適用したソマトスタチン（Ｓ−１４）に対する応答の大きさを測定した（図２８）。ＬＹ２６８細胞は、適用したＳ−１４に対して旺盛な増殖応答を示し、ラットＳＳＴＲ２が、酵母で機能的に発現されるためには、ＳＴＥ２配列を必要としないことを示した。ＬＹ２６８細胞の増殖応答は、ＬＹ３２２細胞で示されたよりも、実質的に大きかった（図２８Ｂ）。これらの株での唯一の差異は、ＬＹ３２２において見られるＪＨ１中に、ＳＴＥ２配列が存在することだけである。かくして、ＳＳＴＲ２のアミノ末端の、ＳＴＥ２の同等なセグメントによる置換は、適用されたソマトスタチンに応じたシグナルの効率を大きく減じる。Kingらの知見にもかかわらず、異種Ｇ蛋白質結合受容体の酵母における発現は、機能的発現のための、いずれの酵母蛋白質からのアミノ末端蛋白質コード配列をも必要としない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ (72)発明者ハドコック，ジョン・リチャードアメリカ合衆国08060ニュージャージー州、マウント・ハリー、ノッティンガム・ウェイ36番 (72)発明者プライス，ローラ・アリシアアメリカ合衆国19047ペンシルベニア州、ラングホーン、カンタベリー・アベニュー 181番 (72)発明者カジコウスキ，アイリーン・マリーアメリカ合衆国08551ニュージャージー州、リンゴーズ，リリービレ・ロード336番 (72)発明者キアシュ，ドナルド・リチャードアメリカ合衆国08540ニュージャージー州、プリンストン、ターヒューン・ロード152 番 (72)発明者チャレフ，デボラ・ターディーアメリカ合衆国08534ニュージャージー州、ペニングトン、アルビダ・ドライブ31番

Claims

【特許請求の範囲】１．異種Ｇ蛋白質結合受容体をコードする第１のヌクレオチド配列およびＧ蛋白質複合体の全体または一部をコードする第２のヌクレオチド配列からなる形質転換された酵母細胞。２．第１のヌクレオチド配列が、β２−アドレナリン受容体、α２−アドレナリン受容体、５ＨＴ−１Ａ受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、成長ホルモン放出因子受容体、コレシストキニン受容体、アデノシン受容体およびソマトスタチン受容体からなる群から選ばれる請求項１記載の形質転換された酵母細胞。３．第２のヌクレオチド配列が、酵母Ｇα、異種ＧαおよびキメラＧαからなる群から選ばれるＧα蛋白質をコードする請求項１記載の形質転換された酵母細胞。４．第２のヌクレオチド配列が、酵母Ｇα、異種ＧαおよびキメラＧαからなる群から選ばれるＧα蛋白質をコードする請求項２記載の形質転換された酵母細胞。５．さらに、フェロモン−応答プロモーターおよび該フェロモン−応答プロモーターの下流に位置し、それと機能可能に結合するリポーター遺伝子を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の形質転換した酵母細胞。６．さらに、フェロモン−応答プロモーターおよび該フェロモン−応答プロモーターの下流に位置し、それと機能可能に結合するリポーター遺伝子を含み、該リポーター遺伝子が、ＨＩＳ３、Ｇ４１８ｒ、ＵＲＡ３、ＣＹＨ２、ＬＹＳ２、ＣＡＮ１およびＬａｃＺ遺伝子からなる群から選ばれる請求項１〜４のいずれか１項に記載の形質転換した酵母細胞。７．さらに、リポーター遺伝子構造ＦＵＳ１−ＨＩＳ３を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の形質転換した酵母細胞。８．さらに、ｆｕｓ３、ｆａｒ１、ｓｓｔ２、ｓｇｖ１、ｓｔｅ２、ｓｔｅ３、ｐｉｋ１、ｍｓｇ５、ｓｉｇ１、ａｆｒ１およびＳＴＥ５０からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子突然変異を含む請求項１〜４のいずれか１項記載の酵母細胞。９．該突然変異が欠失である請求項８記載の酵母細胞。１０．該突然変異が過剰発現である請求項８記載の酵母細胞。１１．該遺伝子がＳＴＥ５０である請求項１０記載の酵母細胞。１２．ＳＳＴ２、ＳＴＥ５０、ＳＧＶ１、ＳＴＥ２、ＳＴＥ３、ＰＩＫ１、ＭＳＧ５、ＳＩＧ１およびＡＦＲ１からなる群から選ばれる遺伝子における少なくとも１つの突然変異と共に、さらに、ＦＡＲ１遺伝子における１つの突然変異を含む請求項３記載の酵母細胞。１３．さらに、リポーター遺伝子構造を含む請求項１２記載の酵母細胞。１４．リポーター遺伝子がＦＵＳ１−ＨＩＳ３である請求項１３記載の酵母細胞。１５．さらに、ＳＣＧ１／ＧＰＡ１遺伝子に突然変異を含む請求項３記載の酵母細胞。１６．異種Ｇαサブユニットが、Ｇｓサブユニット、Ｇｉサブユニット、Ｇｏサブユニット、Ｇｚサブユニット、Ｇｑ、Ｇ１１およびＧ１６からなる群から選ばれるサブユニットからなる請求項３または１３記載の酵母細胞。１７．Ｇαサブユニットがキメラサブユニットである請求項３または１３記載の酵母細胞。１８．Ｇαサブユニットが、酵母ＧＰＡ１／ＳＣＧ１のアミノ末端ドメインおよび異種Ｇα₁₂のカルボキシ末端ドメインからなるキメラサブユニットである請求項３または１３記載の酵母細胞。１９．ＧαサブユニットがＧα₁₂で、Ｇβγ複合体が内因性酵母Ｇβγ複合体である請求項３または１３記載の酵母細胞。２０．さらに、異種Ｇ蛋白質受容体をコードするヌクレオチド配列の上流に位置し、それと機能可能に結合してキメラＧ蛋白質結合受容体をコードする、酵母Ｇ蛋白質結合受容体をコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を含む請求項１記載の酵母細胞。２１．酵母Ｇ蛋白質結合受容体の全部または一部をコードするヌクレオチド配列がＳＴＥ２およびＳＴＥ３からなる群から選ばれる酵母遺伝子を含む請求項２０記載のキメラ受容体。２２．さらに、酵母ヌクレオチド配列および異種Ｇ蛋白質からの配列からなるキメラＧ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む請求項２１記載の酵母細胞。２３．さらに、異種Ｇβγ複合体を含む請求項３、１４および２０のいずれか１項に記載の酵母細胞。２４．請求項２０のヌクレオチド配列でコードされるキメラＧ蛋白質結合受容体。２５．異種Ｇ蛋白質結合受容体を酵母細胞の細胞膜中に発現することのできるヌクレオチド発現ベクター。２６．さらに、Ｇα、βおよびγ蛋白質を酵母細胞中に発現できる請求項２５記載のヌクレオチド発現ベクター。２７．ａ）請求項１の形質転換された酵母細胞培養物を用意し、ｂ）該細胞に選択した化合物を接触させて、細胞表面に発現された異種Ｇ蛋白質受容体に該化合物を結合させ、ｃ）該化合物の結合による異種Ｇ蛋白質結合受容体の活性化の指標として該細胞の増殖を測定する工程からなることを特徴とする酵母細胞の表面に発現された異種Ｇ蛋白質結合受容体に対するリガンド結合の効果を測定するための化合物の分析法。２８．（ａ）異種発現受容体の同族アゴニストを含む寒天培地で酵母細胞を平板培養して請求項１の酵母細胞培養物を用意し、（ｂ）寒天平板に選択した化合物を塗布し、（ｃ）異種受容体のアゴニスト依存活性化を阻止する化合物を同定することからなる細胞増殖についての影響を測定する請求項２７記載の化合物の分析法。２９．さらに、異種アデニリルシクラーゼ、異種Ｇ蛋白質結合カリウムチャンネルおよび異種ＰＬＣ−βからなる群から選ばれるリポーター系を含む請求項１〜４のいずれか１項記載の形質転換された酵母細胞。