JPH09510345A

JPH09510345A - 蛋白キャリブレーター／コントロール製品

Info

Publication number: JPH09510345A
Application number: JP7522000A
Authority: JP
Inventors: マグネソン，ジェラルド・アール; レイチェンバーク，デイビッド・エル
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1994-02-22
Filing date: 1995-02-21
Publication date: 1997-10-21
Also published as: CA2183654A1; WO1995022605A1; EP0748378A4; EP0748378A1; AU1929595A; AU699639B2; US5547873A

Abstract

(57)【要約】本発明は、２〜８℃における長期乾燥貯蔵のための、そして向上した復元安定性に関する元の蛋白構造の優れた回復のための組成物に関する。該組成物は、１）脱フィブリン化されたナトリウム不含血漿、２）ガラス状物質形成糖、３）血清アルブミンおよび／またはゼラチン、および４）カリウム塩からなる。もう１つの態様において、本発明は、上記組成物を用いて乾燥貯蔵のための蛋白を安定化する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】蛋白キャリブレーター／コントロール製品発明の背景大型の分子サイズおよび疎水的性質によるＬＤＬおよびＶＬＤＬのごときリポ蛋白は変性および／または凝集傾向にあるので、脂質およびリポ蛋白のレベルを測定するための現在の血清をベースにしたキャリブレーターおよび品質管理用製品には、長期乾燥貯蔵のためにこれらの物質を安定化することにおいて困難が生じている。いくつかの場合、臨床化学研究室は、短期使用および２〜８℃での貯蔵のために異なるリポ蛋白濃度を含有する患者血清を貯留することによりヒト・脂質の品質管理用物質を調製する手段をとっている。血清貯留物を調製するために複数のヒト・試料からの血清を取り扱うことに関連した時間の浪費および危険性のため、市販凍結乾燥品質管理用物質が広く認容されるに至った。不幸なことに、これらのヒト・血漿をベースとした凍結乾燥管理用物質の多くは、それらの蛋白成分の変性および／または凝集により、特に内在性ＬＤＬおよびＶＬＤＬにより引き起こされるマトリックス効果が問題となっており、該効果は、マトリックスの混濁により臨床化学的測定において妨害を引き起こす可能性がある。かかる問題を回避するために、ＴＣを上昇させるためにＨＤＬを補足した動物血清（すなわち、内在性ＴＣが主としてＨＤＬとなっている）またはＨＤＬを補足したヒト・脱脂血漿を用いて多くの脂質品質管理用物質が処方されている。それゆえ、ヒト・心臓血管系マーカー蛋白、特に、ＬＤＬ（臨床研究は、増加した血清ＬＤＬと心臓冠状動脈疾患の発生との強い相関があることを示している）を安定化して、新世代のより高感度で特異的な免疫分離／免疫化学的アッセイ法（リファイ，エヌ（Rifai,N.）ら、クリニカル・ケミストリー（Clin.Chem. ）第３８巻：１５０〜１６０頁、１９９２年）を用いる試薬／装置でのその直接測定および／または検出を可能にする品質管理製品に対する必要性がある。発明の概要本発明は、一部には、透析濾過されて内在性ナトリウムをカリウム塩と置換され、血清アルブミンで希釈され、長期乾燥安定性（すなわち、体積あたり５重量％（ｗ／ｖ）以下の残存水分の蛋白に関して２〜８℃において５カ月以上のシェルフライフ）および向上した復元安定性（すなわち、復元された蛋白に関して２〜８℃において１０日以上のシェルフライフ）のために、蛋白構造の完全性を安定化するためのガラス状物質形成糖を補足された、脱フィブリン化されたナトリウム不含血漿を含有する組成物に関する。該組成物は：１）脱フィブリン化されたナトリウム不含血漿、２）ガラス状物質形成糖、３）血清アルブミンおよび／またはゼラチン、および４）カリウム塩からなる。もう１つの態様において、本発明は、上記組成物を用いて乾燥貯蔵のために蛋白を安定化する方法に関する。さらに本発明は、蛋白の乾燥貯蔵のための安定化バッファーの製造方法に関する。該方法は：１）血漿を脱フィブリン化すること、２）カリウム塩を含有する水溶液を用いて工程１）の生成物を透析濾過すること、３）工程２）の生成物を、１）ガラス状物質形成糖、２）血清アルブミンおよび／またはゼラチン、および３）カリウム塩からなる蛋白含有水溶液で希釈すること、次いで、４）工程３）の生成物の本質的にすべての水性成分を除去することからなる。また本発明は、水、または塩ならびに／もしくは保存料を含有する水性バッファーを添加することにより製品を復元することに関する。発明の詳細な説明本発明は、品質管理用物質中のリポ蛋白および他の心臓血管系マーカーを含有する血漿または血漿由来の組成物であって、長期乾燥貯蔵のための安定化され、水での復元によりそれらのネイティブならびに／もしくは蛋白の構造決定因子、または免疫学的エピトープの本質的にすべてを回復する組成物に関する。詳細には、本発明は、フリーズドライ凍結乾燥されたヒト・血清をベースにしたキャリブレーター＼コントロール物質であって、長期のシェルフライフの間においてその内在性および外来性リポ蛋白および心臓血管系マーカー蛋白の構造完全性を安定化し、リポ蛋白の免疫分離のための診断装置において使用され、あるいは臨床的に重要な心臓血管系分析対象の測定を助ける標準臨床化学コントロールとして使用するための向上した復元安定性を有するキャリブレーター＼コントロール物質に関する。該分析対象は、例えば、全コレステロール（すなわち、ＴＣ）；超高密度リポ蛋白コレステロール（すなわち、ＶＬＤＬ）；中密度リポ蛋白コレステロール（すなわち、ＩＤＬ）；低密度リポ蛋白コレステロール（すなわち、ＬＤＬ）；リポ蛋白（ａ）コレステロール（すなわち、Ｌｐ（ａ））；高密度リポ蛋白コレステロール（すなわち、ＨＤＬ）；Ａ、アポＬｐ（ａ）、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨのごときアポリポ蛋白イソ体；クレアチンキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびカルボニックアンヒドラーゼのごときイソ酵素；トロポニンおよびミオシン軽鎖のごとき細胞骨格蛋白イソ体；およびミオグロビンならびにトリグリセリド（すなわち、ＴＡＧ）のごとき心臓血管系マーカー／蛋白である。本発明組成物の主成分は血漿であって、新鮮凍結血漿、回収（recovered）血漿もしくは「血液銀行」の血漿、ソース（source）血漿もしくは血漿分離した血漿、オフ−クロット真性（off-clot true）血清、および他の哺乳動物由来の血漿または血清を包含する。新鮮凍結血漿は、クエン酸、リン酸、デキストロースおよびアデノシンからなる抗凝集剤溶液ＣＰＤＡ−１の入ったプラスチックバッグ中に集められる全血のシングルドネイション（single donation）である。収集後、血漿を血液細胞から分離し、２４時間以内に−１８℃またはそれ以下で凍結する。回収血漿もしくは「血液銀行」の血漿は、アデノシン、クエン酸およびデキストロースからなるＡＣＤのごとき抗凝集溶液、ＥＤＴＡのごとき抗凝集溶液およびヘパリンのごとき抗凝集溶液を入れたプラスチックバッグ中に集めた全血のシングルドネイションである。収集後、血漿を血液細胞から分離し、周囲温度または２〜８℃または−１８℃以下で貯蔵する。ソース血漿もしくは血漿分離した血漿は、抗凝集剤であるクエン酸ナトリウムを入れたプラスチックバッグまたはガラス瓶中に、血液細胞を含まないように集められた血漿のシングルまたはダブルドネイション（double donation）である。収集後、血漿を−１８℃またはそれ以下で貯蔵する。オフ−クロット真性血清は、抗凝集剤溶液の入っていないプラスチックバッグまたはガラス瓶中に集められる全血のシングルドネイションであり、無傷の凝集カスケード系の活性化により凝集させられ、血液細胞クロットから分離されたものである。収集後、オフ−クロット真性血清を２〜８℃または−１８℃以下で貯蔵する。哺乳動物由来の血漿または血清は、ウシ、ウマ、ヤギ、ネズミ、ヒツジまたはブタ血清のごとき哺乳動物ソース由来の、単一もしくは複数のドナーから収集された血漿または血清であって、プラスチックバッグまたはガラス瓶に集められ、上記手段により血液細胞から分離されたものである。収集後、哺乳動物由来の血漿または血清を２〜８℃または−１８℃以下で貯蔵する。本発明の目的のために、血漿成分を脱フィブリン化する。当業者に知られたいずれの脱フィブリン法も適する。脱フィブリン化法の一例は以下のものを包含する：血漿に哺乳動物由来のスロンビンおよびカルシウム塩を添加し、室温で溶液を混合してフィブリノーゲンをフィブリンに変換し、次いで、フィブリンクロットを濾別する。本発明における１の鍵となる工程において、脱フィブリン化血漿をカリウム塩を含有する溶液に対して透析濾過または透析すると、得られた血漿生成物はナトリウム不含となる（すなわち、１０ｍＭ未満の濃度の透析濾過され希釈されたナトリウム濃度）。血漿中のナトリウム塩をカルシウムに交換することのできる当業者に知られたいずれの透析濾過法、透析法、クロマトグラフィー法および／または他の方法も本発明に適するが、対象蛋白の構造上の完全性が維持されることが条件となる。好ましくは、脱フィブリン化されたナトリウム不含血漿を、無処理の血清中に存在するのとほぼ等しい全蛋白濃度として用いる。４ｇ／ｄＬ未満の血漿蛋白濃度は本発明の目的には十分であることを銘記すべきである。さらに、本発明組成物は、還元性単糖もしくは二糖、または非還元性単糖もしくは二糖、あるいは糖アルコールのごときガラス状物質形成糖を含有する。用語「ガラス状物質形成糖」は、上記糖またはそれらの混合物を包含する。本発明において、還元性および非還元性単糖のグループは、約１０ないし３０％（ｗ／ｖ）の間の濃度のアラビノース、キシロース、グルコース、フルクトースおよびマンノースを包含する。還元性および非還元性二糖のグループは、約１０ないし３０％（ｗ／ｖ）の濃度のラクトース、マルトース、セロビオース、ラフィノース、シュクロースおよびトレハロースを包含する。さらに、糖アルコールのグループは、約１０ないし３０％（ｗ／ｖ）の間の濃度のマンニトール、キシリトールおよびソルビトールを包含する。さらに本発明組成物は血清アルブミンを含有する。適当な血清アルブミンは哺乳動物由来のものを包含する。さらに、本発明組成物はゼラチンを含有する。適当なゼラチンは、哺乳動物由来、魚類由来、および／または植物由来のものを包含する。上記のごとく、血漿に存在する内在性ナトリウム塩をカリウム塩と交換する。適当なカリウム塩は、塩化カリウム、硫酸カリウム、硝酸カリウム、および／または他の可溶性カリウム塩を包含する。２〜８℃で復元された血漿をベースにしたコントロール物質の液状貯蔵には、典型的に、微生物の増殖によるコンタミネーションを防止するために保存料および／または滅菌手順の包含を必要とする。典型的な保存料はメチルオキサゾリジン誘導体、硫酸ゲンタマイシンおよびメチル−イソチアゾリン−オン誘導体を包含する。本発明における好ましい具体例は０.１％（ｗ／ｖ）硫酸ゲンタマイシンである。美容目的には、ビリルビンを血漿に添加して正常または病んだ血漿の外観を得てもよい。ここに、本発明における好ましい具体例は、約０.５ないし０.８ｍｇ／ｍｌの最終濃度となるように十分な全ビリルビンを添加することにより正常な外観を与えることである。実施例光学的透明性を求めて安定化されたヒト・血漿をベースとした凍結乾燥された品質管理用物質の機能性と、本質的にすべての構造決定因子または免疫学的エピトープを回復するように安定化されたリポ蛋白および心臓血管系マーカー蛋白を含有する品質管理用物質との間の相違を示す典型的な実施例を用いることにより本発明を明確に示すことができる。光学密度（Ｏ.Ｄ.）の値はベールの法則（Be er's Law）（すなわち、Ｏ.Ｄ.＝Ｉ₀／Ｉ）に関連し、ここにＩ₀は光源の強度であり、Ｉは透過光の強度である。用いたすべてのＯ.Ｄ.の例について、抗原の波長は７１０ｎｍであり、ギルフォード・スタサーIII（Gilford Stasar III）またはベックマン（Beckman）の分光光度計のいずれかを用いて光路長１ｃｍにおいて読んだ。用いたＬＤＬコレステロールの回収に関するすべての例について、復元された直接ＬＤＬ値（すなわち、抗体被覆ラテックスビーズを用いてＨＤＬおよびＶＬＤＬを選択的に除去するためにダイレクト・ＬＤＬ・コレステロール・イミュノセパレイション・リエージェント・キット（Direct LDL Cholesterol Immunoseparation Reagent Kit）（ジェンザイム・ダイアグノスティクス（Gen zyme Diagnostics）、マサチューセッツ州ケンブリッジ）を用いて処理した試料の濾液から測定された全コレステロール）を、フリードワルドの等式（すなわち、ＴＣ＝ＨＤＬ＋ＬＤＬ＋ＴＡＧ／５、またはＬＤＬ＝ＴＣ−ＨＤＬ−ＴＡＧ／５）を用いて間接的に決定された凍結乾燥前のＬＤＬ濃度で割ることにより回収ＬＤＬ値を決定した。実施例１〜９表１に用いる血漿ベースを、新鮮凍結ヒト・血漿の個人の献血単位量を用いて調製し、ヒト・血漿を回収した。各タイプの血漿を異なる時間において処理した。まず単位量を室温で融解し、次いで、以下のように脱フィブリン化した：脱イオン水１ｍｌあたり０.３４ｇのＣａＣｌ₂をヒト・血漿１リットルあたり添加し；ＣａＣｌ₂添加後即座に３.５ｍｇのウシ・スロンビンを含有する水溶液を血漿１リットルあたり添加し；室温で血漿を３０分以上またはFactor Ｉアッセイキット（Factor Ｉ Assay kit）（バクスター・ダイアグノスティクス・インコーポレイテッド（Baxter Diagnostics Inc.）イリノイ州マクグロウ・パーク）を用いてフィブリノーゲン（すなわち、因子Ｉ）が検出されなくなるまで処理血漿を混合した。次いで、脱フィブリン化ヒト・血漿を、さらなる処理を行うまで−１８ ℃で凍結貯蔵した。凍結／融解サイクリングがこの生成物に対して生じうる安定化効果を調べるために、脱フィブリン化ヒト・血漿の一部を以下の凍結／融解プロセスに４回供した：凍結血漿を周囲温度で完全に融解し、次いで、−１８℃で凍結し、少なくとも５日間（このサイクルを繰り返す前）貯蔵した。フラットシート膜（排除分子量（ＭＷ）サイズ３００００ダルトン）を装備したミリポア・ペリコン・ＢＳＡカセット（Millipore Pellicon BSA cassette）（マサチューセッツ州ベドフォードのミリポア・コーポレイション（Millipore Corpoation））を用いて脱フィブリン化血漿を透析濾過した。ペリスタポンプを用いてこの膜を通過させて血漿を透析濾過し、経膜圧２０ｐ.ｓ.ｉ.までとして分子流速約１５０ｍｌ血漿／分を得た。９.０ｇ／ＬＮａＣｌまたは７.８ｇ／ＬＫＣｌのいずれかを含有する３〜４倍体積の水溶液を１体積の異なる血漿ベースの透析濾過に用いて、約１００ｍＭのＮａＣｌ最終濃度とするか、または内在性ナトリウムレベルを２０ｍＭ未満にまで低下させ、その一方で、カリウムレベル約１００ｍＭまで上昇させた。塩交換を行った後、透析濾過により該系を用いて血漿ベースを濃縮して全蛋白濃度を８ないし１４ｍｇ／ｄｌとした。この材料をさらなる処理まで−１８℃で貯蔵した。これらのコントロールパイロット試験物の処方を完了するために、透析濾過され限界濾過された脱フィブリン化血漿を周囲温度で融解した。あるパイロット試験物については、シュクロースまたはトレハロースを固体で添加して最終濃度２０％（ｗ／ｖ）とした。次いで、すべてのパイロット試験物について、固体硫酸ゲンタマイシンを添加して０.１ｍｇ／ｍｌとした。次いで、ビリルビンを各パイロット試験物に添加して０.５ないし０.８ｍｇ／ｍｌの間の濃度とした。次いで、２ＮＫＯＨを用いて血漿ベースのｐＨを７.４に調節した。最後に、これらのパイロット試験物を、最後は０.２２の滅菌フィルターを用いる一連のフィルターで濾過した。各パイロット試験物の一部（２.３ｍｌ）をガラスバイアル（１０ｃｃ、ウィートン（Wheaton）、タイプＩ）中に入れ、ＦＴＳトレイドライヤー（ＦＴＳ・システムズ・インコーポレイテッド（FTS Systems Inc.）、ストーンリッジ，ＮＹ）でフリーズドライ凍結乾燥した。窒素ガス環境下でバイアルに栓をした後、これらのパイロット試験物を試験まで２〜８℃で貯蔵した。オリンパスＡＵ５０００化学アナライザー（オリンパス・コーポレイション（ Olympus Corporation）、レイクサクセス，ＮＹ）により、オリンパス試薬を用いて、ナショナル・ヘルス・ラボラトリーズ（National Health Laboratories）（フロリダ州マイアミ）によりＴＣ、ＨＤＬおよびＴＡＧについての凍結乾燥前のパイロット試験物の値が決定された。上記フリーデワルドの等式を用いてＬＤＬコレステロールを間接的に測定した。ダイレクト・ＬＤＬ・コレステロール・イミュノセパレイション・リエイジェント・キット（Direct LDL Cholesterol I mmunoseparation Reagent Kit）（Genzyme（ジェンザイム））を用いて、復元されたパイロット試験物中の直接ＬＤＬ濃度を測定し、ＤＣＬコレステロール試薬（ダイアグノスティクス・ケミカルズ・リミテッド（Diagnostics Chemicals Li mited）、カナダのシャーロットタウン,P.E.I.）を用いてアボットＶＰアナライザー（アボット・ダイアグノスティクス（Abbot Diagnostics）、イリノイ州アボットパーク）により濾液のＴＣをアッセイした。表１は、ガラス状物質形成糖不存在下では、透析濾過された回収血漿の凍結／融解サイクリングによる処理は、再構成試料の濁度をわずかに減じることを示す（実施例１〜３参照）。しかしながら、２０％（ｗ／ｖ）トレハロースまたはシュクロースの添加は、凍結乾燥された回収血漿を安定化して光学的に透明な復元コントロール物質を生じるが、その内在性ＬＤＬの回収率は３０％をこえない（実施例４〜６参照）。実施例５および６において存在する塩の同一性はＬＤＬの慣習率に有意な影響を及ぼさないことを銘記すべきである。なぜなら、内在性ＬＤＬは、疑いなく、この回収血漿中ですでにダメージを受け、さらに／または凝集しているため、カリウム塩の有益な効果が観察できないからである。対照的に、実施例７のパイロット試験処方は、ＮａＣｌで透析濾過された脱フィブリン化新鮮凍結血漿はその内在性ＬＤＬの約４分の３の回収率であり、また、すぐれた光学的透明度を示すことを示している（表１参照）。しかしながら、ナトリウムをカリウムに交換した場合、新鮮凍結ヒト・血漿ベース中の本質的にすべての内在性ＬＤＬが回収される。なぜなら、凍結乾燥の間、無処理のリポ蛋白構造が維持されるからである（凍結／融解サイクリングの存在または不存在において−−実施例８および９参照）。実施例１０〜１３最終ＨＤＬおよびＬＤＬレベルを変化させるために内在性および／または外来性リポ蛋白フラクションを用いて、バイレベル（bilevel）の心臓血管系マーカーの品質管理用物質の利便性を確認するために、実施例９記載の脱フィブリン化されたナトリウム不含ヒト・血漿処方を用いて２種の異なるフォーマットを構築したが、以下の例外を伴っていた：１）ＬＤＬ濃度フォーマットにおいて、限界濾過による血漿ベースの濃縮により内在性ＬＤＬおよびＨＤＬ濃度は上昇した。さらに２）ＬＤＬ補足フォーマットにおいて、血漿ベースを内在性ＨＤＬレベルにまで希釈し、ヒト・ＬＤＬ濃縮物（クリエイティブ・ラボラトリー・プロダクツ・インコーポレイテッド（Creative Laboratory Products Inc.）、インディアナ州インディアナポリス）を補足することによってＬＤＬレベルを上昇させることにより、ＬＤＬおよびＨＤＬ濃度を調節した。これらの研究において、各フォーマットを処方して１のパイロット試験物についてはナショナル・コレステロール・エデュケイション・プログラム（ＮＣＥＰ）のガイドラインにより決定された臨床的に有意な正常ＬＤＬ範囲（すなわち、１３０ｍｇ／ｄＬ未満が望ましいレベル）よりも低いＬＤＬ濃度を回復させるようにし、他方のパイロット試験物についてはＮＣＥＰガイドラインにより決定された臨床的に有意に異常なＬＤＬ範囲（すなわち、１６０ｍｇ／ｍｌをこえると危険レベル）よりの高いＬＤＬレベルを回復させるようにした。ＬＤＬ濃度フォーマットについて、望ましいレベルのパイロット試験物（実施例１３）に関する脱フィブリン化されたナトリウム不含新鮮凍結ヒト・血漿組成物を実施例９記載のごとく調製したが、危険レベルの血漿の調製方法を以下のように変更した：１）シュクロース成分の添加直前に、７ｇ／ｄｌのウシ・血清アルブミンおよび７.８ｇ／ＬのＫＣｌを含有する水溶液でそのベース材料を希釈して内在性ＨＤＬレベルを約１５〜２５ｍｇ／ｄｌにまで低下させた。さらに２）ｐＨを調節した直後に、希釈した危険レベルのパイロット試験物に十分なＬＤＬ濃縮物（クリエイティブ・ラボラトリー・プロダクツ・インコーポレイテッド）を補足して約１７０ｍｇ／ｄＬの最終濃度とした。各パイロット試験物の一部（１.０ｍｌ）をガラスバイアル（１０ｃｃ、ウィートン、タイプＩ）に入れ、ＦＴＳトレイドライヤー（ＦＴＳシステムズ・インコーポレイテッド、ストーンリッジ，ＮＹ）でフリーズドライ凍結乾燥した。窒素ガス環境下でバイアルに栓をした後、これらのパイロット試験物を試験まで２〜８℃で貯蔵した。これらの実施例において、凍結乾燥前のパイロット試験物のＴＣ、ＨＤＬ、ＴＡＧおよび間接ＬＤＬ値を上記のごとく決定した。復元された試料において、直接ＬＤＬ濃度をダイレクト・ＬＤＬ・コレステロール・イミュノセパレイション・リエイジェント・キット（ジェンザイム））を用いて測定し、ロッシュ・コレステロール・リエイジェント（ロッシュ・ダイアグノスティクス、ニュージャージー州ナトリー）を用いてロッシュ・ＣＯＢＡＳＦＡＲＡ II化学アナライザーにより濾液のＴＣをアッセイした。さらにそのうえ、ロッシュ・ＣＯＢＡＳＦＡＲＡ II化学アナライザーによりＴＣおよびＨＤＬを測定した。ワーニック，ジー・アールおよび共同研究者（Warnick,G.R.et al.）、クリニカル・ケミストリー（Clin.Chem.）第２５巻：５９６〜６０４頁、１９７９年により記載されたデキストラン硫酸−塩化マグネシウム法を用いてＨＤＬ値を得た。表２は、バイレベルのコントロールに関する両方の処方フォーマットは、ＬＤＬのごとき心臓血管系マーカー蛋白を安定化させるための実行可能な選択であると思われる。しかしながら、外来性ＬＤＬでのＬＤＬ補足フォーマットを用いるのではなく血漿ベースを濃縮してＬＤＬ濃度を増加させることにより危険レベルのコントロールを調製することはより困難であろうと思われる（表２の実施例１１および１３参照）。さらにそのうえ、ＬＤＬ補足フォーマットは真の危険性のある患者のリポ蛋白プロフィール（すなわち、上昇したＬＤＬおよび異常に低下したＨＤＬ）のシミュレーションを容易にする（実施例１２および１３参照）。それゆえ、本発明において、ＬＤＬ補足フォーマットが好ましい処方である。なぜなら、該処方はリポ蛋白の調節を可能にすることにおいてより柔軟性があり、望ましい製品の安定化特性を達成することが可能だからである。実施例１４〜１５臨床的に重要な心臓血管系マーカー蛋白であるＣＫ−ＭＢの復元安定性を調ベて、２〜８℃で貯蔵された組成物についての向上した液状での安定性を示すか否かを決定した。脱フィブリン化されたナトリウム不含新鮮凍結ヒト・血漿を実施例９記載のごとく調製したが、以下の例外があった：１）ｐＨを調節した後、パイロット試験Ａ用のベース材料に十分なキャリブレーターグレードのヒト・ＣＫ−ＭＢ抗原（バイオプロセッシング・インコーポレイテッド（BioProcessing,Inc.）、スカーボロウ（Scarbrough）、ＭＥ）を補足して最終的なＣＫ−ＭＢ量を１９０ｎｇ／ｍＬとした；さらに２）脱フィブリン化されナトリウム不含の新鮮凍結ヒト・血漿にシュクロースおよびＫＣｌを補足した後、パイロット試験Ｂ処方に１／１００倍体積のＨＥＰＥＳバッファー濃縮物，ｐＨ７.１を補足して最終バッファー濃度１００ｍＭとした；さらに３）ｐＨを７.４に調節した後、パイロット試験Ｂ処方に十分なキャリブレーターグレードのヒト・ＣＫ−ＭＢ抗原（バイオプロセッシング・インコーポレイテッド）を補足して最終的なＣＫ−ＭＢ量を約１９０ｎｇ／ｍＬとした。両方のパイロットの一部（１.０ｍｌ）をガラスバイアル（１０ｃｃ、ウィートン、タイプＩ）に入れ、ＦＴＳトレイドライヤー（ＦＴＳシステムズ・インコーポレイテッド、ストーンリッジ，ＮＹ）でフリーズドライ凍結乾燥した。窒素ガス環境下でバイアルに栓をした後、これらのパイロット試験物を試験まで２〜８℃で貯蔵した。各凍結乾燥コントロールパイロット試験物の１本のバイアルを１.０ｍｌの脱イオン水で復元し、ゆるやかに回転させて混合し、次いで、試験まで２〜８℃で貯蔵した。異なる日に各パイロット試験物の一部をバイアルから取り、２〜８℃での貯蔵のために再度栓をした。ヒト・ＣＫ−ＭＢに関する凍結乾燥前および復元された値を、アボットＩＭｘ免疫化学アナライザー（アボット・ダイアグノスティクス、イリノイ州アボットパーク）によりアボットＩＭｘヒューマンＣＫ−ＭＢ試薬を用いて決定した。復元されたＣＫ−ＭＢ量の値を凍結乾燥前の値（０日目の各パイロット試験物の値）で割ることにより回収率％を計算した。表３は、復元された本発明の血漿をベースにしたコントロール組成物中のヒト・ＣＫ−ＭＢの優れた回収率を示す。両方のパイロット処方は、２〜８℃で繰り返しサンプリングされ貯蔵されたバイアル中において少なくとも２１日間ヒト・ＣＫ−ＭＢ量を安定化させ、大部分の市販ＣＫイソ酵素コントロール物質の液状でのシェルフライフ（５ないし１０日の間）よりも優れている（表３の実施例１４および１５参照）。バイロット試験物Ｂ処方中のＨＥＰＥＳバッファーの存在は、アボットＩＭｘ免疫化学アナライザー（アボット・ダイアグノスティクス、イリノイ州アボットパーク）により測定された観察濃度を低くするので、目下好ましいイソ酵素安定化用の透析濾過されナトリウム不含の血漿組成物はｐＨバッファーを含まないものである。

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ．脱フィブリン化されたナトリウム不含血漿；ｂ．ガラス状物質形成糖；ｃ．血清アルブミンおよび／またはゼラチン；およびｄ．カリウム塩からなる、長期乾燥貯蔵のために蛋白を安定化させる組成物。２．蛋白がリポ蛋白である請求項１の組成物。３．蛋白がイソ酵素である請求項１の組成物。４．蛋白が細胞骨格蛋白である請求項１の組成物。５．蛋白がミオグロビンである請求項１の組成物。６．血漿が新鮮凍結血漿である請求項１の組成物。７．血漿が回収血漿である請求項１の組成物。８．血漿がソース血漿である請求項１の組成物。９．血漿が哺乳動物由来である請求項１の組成物。１０．ガラス状物質形成糖がシュクロースである請求項１の組成物。１１．ガラス状物質形成糖がトレハロースである請求項１の組成物。１２．ガラス状物質形成糖が糖アルコールである請求項１の組成物。１３．血清アルブミンが哺乳動物由来である請求項１の組成物。１４．ゼラチンが哺乳動物由来および／または魚類由来および／または植物由来である請求項１の組成物。１５．カリウム塩が塩化カリウムである請求項１の組成物。１６．ａ．脱フィブリン化されたナトリウム不含血漿；ｂ．ガラス状物質形成糖；ｃ．血清アルブミンおよび／またはゼラチン；およびｄ．カリウム塩からなる組成物を添加することを特徴とする、長期乾燥貯蔵のために蛋白を安定化させる方法。１７．蛋白がリポ蛋白である請求項１６の組成物。１８．蛋白がイソ酵素である請求項１６の組成物。１９．蛋白が細胞骨格蛋白である請求項１６の組成物。２０．蛋白がミオグロビンである請求項１６の組成物。２１．血漿が新鮮凍結血漿である請求項１６の組成物。２２．血漿が回収血漿である請求項１６の組成物。２３．血漿がソース血漿である請求項１６の組成物。２４．血漿が哺乳動物由来である請求項１６の組成物。２５．ガラス状物質形成糖がシュクロースである請求項１６の組成物。２６．ガラス状物質形成糖がトレハロースである請求項１６の組成物。２７．ガラス状物質形成糖が糖アルコールである請求項１６の組成物。２８．血清アルブミンが哺乳動物由来である請求項１６の組成物。２９．ゼラチンが哺乳動物由来および／または魚類由来および／または植物由来である請求項１６の組成物。３０．カリウム塩が塩化カリウムである請求項１６の組成物。３１．ａ．血漿を脱フィブリン化し；ｂ．カリウム塩を含有する水溶液を用いて工程ａ）の生成物を透析濾過し；ｃ．ｉ．血清アルブミンおよび／またはゼラチン； ii．カリウム塩からなる水溶液を用いて工程ｂ）の生成物を希釈し；次いでｄ．ガラス状物質形成糖を工程ｃ）の生成物に添加することを特徴とする、２〜８℃における蛋白の長期乾燥貯蔵および向上した液状での安定性のための安定化バッファーの製造方法。３２．ａ）ＨＤＬ−およびＶＬＤＬ−特異的抗体で被覆されたラテックスビーズを入れた瓶；ｂ）メンブレンフィルター遠心分離チューブ；およびｃ）ｉ）リポ蛋白； ii）脱フィブリン化されたナトリウム不含血漿； iii）ガラス状物質形成糖； iv）血清アルブミンおよび／またはゼラチン；および v）カリウム塩からなるコントロール組成物よりなる、臨床試料からリポ蛋白を単離するためのキット。