JPH09511133A - Ｄｎａ配列決定のアーティファクトの除去のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はDNA配列決定法における改良に関する。特に、本発明は、DNA配列決定の鎖終止法において、ベタイン、トリエチルアミンＮ-オキシド、およびジメチルグリシンなどの窒素含有有機化合物を添加することによる、停止または休止の除去に関する。本発明はまた、これらの化合物を含有するDNA配列決定キットを提供する。本発明はまた、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などのDNAポリメラーゼを使用する他の実験手順における改良を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 DNA配列決定のアーティファクトの除去のための方法 本願発明は、国立衛生研究所(NIH)によって承認されたGrant(契約)番号GM1201 0のもとで、政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。 発明の背景 本願発明は、主にDNA配列決定の方法における改良に関する。特に、本発明は 主に、DNA配列決定の鎖終止法(chain termination method)において、ベタイン 、トリメチルアミンＮ-オキシド、およびジメチルグリシンなどの窒素含有有機 化合物を添加することによる、停止(stop)または休止(pause)の除去に関する。 本発明はまた、これらの化合物を含有するDNA配列決定キットを提供する。本発 明はまた、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などのDNAポリメラーゼを使用する他の実 験手順における改良を提供する。 効率的なDNA配列決定技術は、バイオテクノロジー産業の発達および基礎的な 生物学的研究のために非常に重要である。DNA配列決定の効率および正確さの両 方における改良が、DNA配列情報の要求に歩調を合わせるために必要とされてい る。例えば、ヒトゲノムプロジェクトは、DNA配列決定技術の効率、費用効果、 および処理量の劇的な増加を目標としてきた。（Collins,F.,およびGalas,D．（ 1993）Science 262:43-46を参照のこと。） 今日、大部分のDNA配列決定は、DNA配列決定の鎖終止法によって行われる。最 も一般的な鎖終止法は、Sangerのジデオキシヌクレオチドが介在する鎖終止法(S angerら（1977）Proc．Nat．Acad．Sci.，USA 74:5463-5467を参照のこと)の改 変方法である。数千の研究室がこの技術を使用しており、ヒトゲノムプロジェク トのために自動化された配列決定を行っている研究室も含まれる。このDNA配列 決定法に必要な試薬を含む市販のキットが入手可能であり、そして広く使用され ている。 日常的に使用されてはいるが、Sangerの(ジデオキシ)配列決定技術は、問題お よび限界を有している。この方法の主な問題の１つは、DNA配列の決定を妨害す るDNAポリメラーゼの停止または休止の発生率である。停止はGCリッチなDNAの領 域、またはプライマーから特に離れた領域において主に問題である。さらに、停 止は不純なDNA調製液においてより頻繁に生じる。このため、DNAがジデオキシ法 によって配列決定され得る前に、DNA精製が一般的に必要とされる。 種々の方法が、ジデオキシ配列決定において停止を除去するために提案されて きた。例えば、研究者達は、反応温度を変えたり、種々のDNAポリメラーゼを使 用したり、DNAポリメラーゼを安定化したり、およびターミナルデオキシヌクレ オチジルトランスフェラーゼで早めに停止したDNA分子を伸長したりして試みて きた(T.W.FawcetteおよびS.G.Bartlett（1990）BioTechniques 9:46-48; D.Pisa -WilliamsonおよびC.W.Fuller（1992）United States Biochemical Corp．Comme nts 19:29-36；J.Sambrook,E.F．FritschおよびT.Maniatis,編（1989）Molecula r Cloning: A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harbor Press，Cold S pring Harbor，N.Y.; およびF.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore ，J.G.Seidman，J.A.SmithおよびK.Struhl,編（1989）Current Protocols in Mo lecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscientific, John Wiley and Sons，New Yorkを参照のこと)。しかし、確かな方法は１つもな い。DNA配列決定における停止の問題を除去することが依然として必要とされ、 それゆえに、この重要なプロセスの効率および費用効果を改良することが必要と されている。 発明の要旨 本発明はDNAポリメラーゼを含有する反応混合液中で生じるDNAポリメラーゼの 停止の発生率を減少する方法を提供する。DNAポリメラーゼの停止の発生率は、 本明細書中に記載されるような窒素含有有機分子を反応混合液に添加することに より減少する。本発明のこれらの組成物は、DNAポリメラーゼの停止の発生率を 減少するのに効果的な量で反応混合液に添加される。DNA配列決定の鎖終止法に おいて、この反応混合液は使用され得る。好ましくは、DNA配列決定の鎖終止法 は、ジデオキシヌクレオチドDNA配列決定法である。反応混合液はまた、PCR反応 混合液であり得る。配列決定されるDNAまたは増幅されるDNAは、精製され得るか または精製され得ない。未精製のDNAは、例えば、細胞の粗溶解物として存在し 得る。 DNAポリメラーゼの停止の発生率を減少する方法は、水溶液、DNA分子、１種類 のDNAポリメラーゼまたは数種のDNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三 リン酸の混合液、鎖伸長インヒビター、および１つ以上の本発明の組成物を組み 合わせて、反応混合液を形成し得る。DNAポリメラーゼは、DNA分子を鋳型として 使用することによりDNA分子の部分に相補的な核酸を生成し得る。反応混合液は インキュベートされ、DNA分子を鋳型として使用することによりDNAポリメラーゼ が種々の長さの核酸フラグメントを形成することが可能になる。形成された核酸 フラグメントは、配列決定されるDNA分子に相補的である。 上記の方法のいくつかの改変方法において、核酸プライマーもまた、反応混合 液に添加され得る。このプライマーは、DNA分子の１つの鎖の第一の部分から下 流に位置するその鎖の第二の部分に相補的である。使用されるDNAポリメラーゼ はプライマーの3'末端を伸長し得、DNA分子の第一の部分に相補的な核酸を生成 する。 本発明は、鎖終止法によってDNA分子を配列決定するための改良方法を提供し 、ここでDNA分子は、DNA分子を鋳型として使用することによりDNA分子の一部分 に相補的な核酸を生成し得るDNAポリメラーゼ；デオキシリボヌクレオシド三リ ン酸の混合液；および鎖伸長インヒビターと組み合わされ、反応混合液を形成す る。この反応混合液はインキュベートされ、DNA分子を鋳型として使用すること によりDNAポリメラーゼが種々の長さの核酸フラグメントを形成することが可能 になり、ここで核酸フラグメントはDNA分子に相補的である。本発明の改良部分 は、ある量の本明細書中に記載の１つ以上の窒素含有有機化合物を反応混合液に 添加することである。 本発明はまた、鎖終止法によるDNA配列決定のためのキットを提供する。これ らのキットは使用説明書、１つ以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む 容器、鎖伸長インヒビターを含有する容器、およびある量の本発明の組成物を有 する。キットはまた、他の成分も含み得る。好ましくは、キットはジデオキシDN A配列決定法によりDNA配列決定するためのものである。 図面の簡単な説明 図１Ａ．ジデオキシDNA配列決定におけるDNAポリメラーゼの停止。２本鎖DNA のジデオキシDNA配列決定は、水をベタインの代わりに用いた以外は、本明細書 の実施例１において記載されるように行った(結果は、水を使用した場合と使用 しない場合で同一であった)。反応混合液は、実施例１に記載されるように、ポ リアクリルアミド／尿素のDNAシークエンスゲルで分離した。DNAポリメラーゼの 停止の位置を、矢印で示す。 図１Ｂ．ベタインによるジデオキシDNA配列決定におけるDNAポリメラーゼの停 止の除去。ジデオキシDNA配列決定は、実施例１で記載されるようにベタインの 存在下で行った。反応混合液は、実施例１に記載されるように、ポリアクリルア ミド／尿素のDNシークエンスゲルで分離した。矢印は図１ＡのDNAポリメラーゼ の停止に対応する位置を示す。 定義 本明細書で使用される用語「核酸」は、DNAまたはRNAのいずれかをいう。これは 、プラスミド、DNAおよび／またはRNAの感染性高分子、非機能的DNAまたはRNA、 染色体DNAまたはRNA、および(ポリメラーゼ連鎖反応によるなどの)インビトロで 合成されたDNAまたはRNAを包含する。「核酸配列」または「ポリヌクレオチド配列」 は、５'末端から３'末端へ読まれるデオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌ クレオチド塩基の１本鎖高分子または２本鎖高分子をいう。 本明細書で使用される用語「DNA分子」は、任意の形態のDNA分子をいい、天然に 存在するDNA分子、組換えDNA分子、または合成DNA分子を包含する。この用語は 、プラスミド、細菌DNAおよびウイルスDNA、および染色体DNAを含む。この用語 は、細胞溶解またはそれに続くDNA分子の操作によって生成されるDNAフラグメン トを包含する。特定しない限り、１本鎖DNA配列の左側の端が５'末端である。 用語「上流」は、１本鎖DNA分子に関して使用される場合、DNA分子の参照領域の ５'側に位置するそれらのDNA配列をいう。例えば、DNA分子の定義された部分か ら上流に位置するそれらの配列は、定義された部分の５'側に位置する配列であ る。同様に、用語「下流」は、１本鎖DNA分子に関して使用される場合、DNA分子の 参照領域の３'側に位置するそれらのDNA配列をいう。 本明細書で使用される用語「相補的」は、２つの核酸配列の間の関係をいう。あ る核酸配列が第二の核酸と２本鎖を形成し得るのであれば、その核酸配列は第二 の核酸配列に相補的であり、ここで２本鎖の各残基は、グアノシン−シチジン(G -C)またはアデノシン−チミジン(A-T)塩基対または等価な塩基対を形成する。等 価な塩基対は、グアノシン、シチジン、アデノシン、またはチミジン以外のヌク レオシドアナログまたはヌクレオチドアナログを含み得、これらはDNA鋳型にお いてDNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼによって核酸へ組み込まれ得る。相 補的なDNA配列は、DNA２重ヘリックスの通常の塩基対合の法則(Watson J.D.ら(1 987)Molecular Biology of the Gene，第４版，Benjamin Cummings Publishing Company，Menlo Park，California，65-93頁を参照のこと)により公知の配列か ら予測され得る。相補的な核酸は、異なる大きさであり得る。例えば、小さな核 酸は大きな核酸の一部分に相補的であり得る。 本明細書で使用される用語「DNA鋳型」または「鋳型」は、DNAまたはRNAポリメラ ーゼによって使用されるDNA分子またはDNA分子の一部分をいい、新しく合成され る核酸の配列を決定する。(Watson,J.D.ら、上述 鋳型DNA分子におけるDNAポリ メラーゼおよびRNAポリメラーゼの作用の詳述な記載を参照のこと)。 DNAポリメラーゼに関して本明細書で使用される用語「複製」は、DNA分子を鋳型 として使用してそのDNA分子の一部分に相補的な核酸を生成するプロセスをいう 。 本明細書で使用される用語「精製DNA」または「精製DNA分子」は、RNAまたはタン パク質などの他の生物学的高分子または細胞性代謝物が混入していないDNAをい う。精製DNAは、タンパク質、他の細胞性核酸、および細胞性代謝物からの５%未 満の混入を含む(重量基準)。用語「未精製DNA」または「未精製DNA分子」は、他の細 胞性核酸、細胞性タンパク質、および細胞性代謝物からの５%以上の混入を有す るDNA調製物をいう。未精製DNAは、LiClまたはポリエチレングリコールのいずれ かと併用したエタノールを用いる沈澱のような、単一の精製工程を使用すること により得られ得る。用語「細胞溶解粗調製物」または「粗細胞溶解物」または「粗溶 解物」は、未精製DNAの調製物をいい、ここでは細胞またはウイルス粒子は溶解さ れているが、DNAのさらなる精製は行われていない。 本発明のいくつかの化合物は、溶液のpHに依存して、正電荷または負電荷を有 するか、あるいは正電荷および負電荷の両方を有して存在し得る。これらの化合 物の種々の形態が、本発明に含まれることが理解される。 本明細書で使用される用語ベタインは、N,N,N-トリメチルグリシンをいう。 本明細書における全ての数の範囲は、それらの上限および下限を含むことが意 図される。 詳細な説明Ａ． 概論 DNA分子の配列を決定する多くの異なる方法がある。現在、通常に使用される 大部分の方法は、２つの一般的な方法のうちの１つの方法の改変である。１つの 一般的なスキームは、特定の塩基と反応して、他の化学物質がリン酸ジエステル 骨格をそれらの部分で切断することを可能にする化学試薬を使用する。第二の一 般的な方法は、配列決定されるDNA分子に相補的なDNAフラグメントを生成するた めにポリメラーゼ酵素を使用する。反応混合液中の少量の鎖伸長インヒビターの 含有は、異なる大きさのDNAフラグメントの生成を引き起こす。化学的方法また は鎖終止法のいずれかによって生成されるDNAフラグメントは、種々の方法によ って分離および解析され得る。例えば、DNAフラグメントは、大きさに基づいて シークエンスゲルにおいて分離され得る。ゲル上の任意の位置に存在するバンド を試験することにより、DNA分子の配列が、対応する位置で決定され得る。例え ば、バンドがＧのレーンのみの位置に存在するので、図１Ａに表される配列の上 部は３つの連続したＧヌクレオチドを含有する。 DNA配列決定の鎖終止法は、化学切断法よりも広く使用されている。ジデオキ シヌクレオシド三リン酸は、DNA配列決定において用いられる最も一般的なチェ ーンターミネーターである。ジデオキシDNA配列決定の特定のプロトコルの例は 、Sambrookら、上述を参照のこと。 広く使用されているのにも関わらず、ジデオキシ配列決定法に関する技術的な 問題がある。主要な問題の１つは、DNA配列の決定を妨害するDNAポリメラーゼの 停止または休止の発生率である。DNAポリメラーゼが特定の部位で停止した場合 、バンドはシークエンスゲルの４つの全てのレーンに現れ、そしてその位置での ヌクレオチド残基は決定され得ない。 DNAポリメラーゼの停止は、いくつかの理由のために生じる。停止は、酵素が プライマーの３'末端からさらに長く伸長するような場合に、より頻繁に観察さ れる。この現象は一度に配列決定され得るDNAフラグメントの長さを制限する。 停止の発生率の減少は、より長い断片のDNAの配列決定を可能にし、それゆえDNA 配列決定をより効率的にする。 DNAポリメラーゼの停止はまた、DNA調製物に混入物が存在する場合、より頻繁 に生じる。この現象のために、DNA調製物は配列決定の前に精製されなくてはな らない。本発明の改良されたDNA配列決定法は、停止の発生率を減少し、それゆ え純度の低いDNAの調製物が、確実に配列決定されることを可能にする。また、 この方法は、DNA配列決定の効率を増加し、そしてそのコストを減少する。 最後に、至適な条件下でさえ、DNAポリメラーゼの停止がしばしばDNAのGCリッ チ領域において見られる。このことはDNA分子のある領域におけるDNAの配列情報 を決定することを困難にする。プライマーの３'末端から離れたGCリッチ領域ま たは至適に精製されていないDNA調製物においてDNA配列を決定しようとする場合 に、もちろん、この問題は一層大きくなる。従って、本発明の改良された方法は 、コストを減少してDNA配列決定の正確さおよび効率を増加する。 本発明の化合物によって引き起こされるDNAポリメラーゼの停止の発生率の減 少はまた、DNA配列決定以外の手順における有用性も有する。PCR(ポリメラーゼ 連鎖反応)、インビトロ突然変異誘発、ニックトランスレーション、逆転写、お よび平滑末端化などの多くの一般的な実験技術は、DNAポリメラーゼを利用する 。適切な濃度の本発明の化合物の添加は、潜在的にこれらの手順の効率またはス ピードを増加する。Ｂ． DNAポリメラーゼの停止の発生率を減少する化合物 本発明において使用される化合物は、およびDNA配列決定の鎖終止法において 、およびDNAポリメラーゼを使用する他の実験手順(例えば、PCR)において生じる 停 止の発生率を除去または減少し得る窒素含有有機分子である。これらの化合物は 、以下の式によって表される： ここで： Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³は、同じまたは異なり得、そして水素、メチル、エチル、およ びプロピルからなる群より独立して選択されるが、但しＲ¹、Ｒ²、およびＲ³の ２つより多くが水素であることはなく；そして Ｘは以下からなる群より選択される部分である： の式のラジカル ここで： Ｒ⁴はメチル、水素からなる群より選択され、Ｒ¹と結合した場合、ピロリジン 環を形成し； Ｒ⁵は、−ＣＯ₂Ｈおよび−ＳＯ₃Ｈからなる群より選択され；そして ｎは０〜２の整数であり、 但し、Ｒ¹およびＲ⁴がピロリジン環を形成する場合、Ｒ²およびＲ³の１つより 多くが水素であることはなく、そしてここで組成物は停止の発生率を減少するに 効果的な量で添加される。 ピロリジン環がＲ¹およびＲ⁴により形成される場合、以下の式IIの化合物が形 成される。 ある好ましい実施態様において、本発明の方法およびキットは式Iの化合物を 使用し、ここでＲ¹、Ｒ²、およびＲ³は同じかまたは異なり、そしてメチル、エ チル、および水素からなる群より選択され(但しＲ¹、Ｒ²およびＲ³の２つより多 くが水素であることはない)、そしてＲ¹およびＲ⁴がピロリジン環を形成する場 合、Ｒ²およびＲ³の１つより多くが水素であることはない。 好ましい実施態様の別の群において、本発明の方法およびキットは、式Ｉの化 合物を使用し、ここでＸは−ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈである。この群内のさらに好ましい実 施態様は、Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³がメチルである化合物；Ｒ¹、Ｒ²がメチルであ りそしてＲ³が水素である化合物；またはＲ¹がメチルであり、そしてＲ²および Ｒ³が水素である化合物を使用する。 さらに好ましい実施態様において、本発明の方法およびキットは式Iの化合物 を使用し、ここでＸは＝ＯでありそしてＲ¹、Ｒ²、およびＲ³はメチルである。 さらにより好ましい実施態様において、本発明の方法およびキットは式Iの化 合物を使用し、ここでＲ¹およびＲ⁴がピロリジン環を形成し、Ｒ²およびＲ³はメ チルであり、ｎは０であり、そしてＲ⁵は−ＣＯ₂Ｈである(スタキドリン、式III )。 好ましい実施態様のさらに別の群において、本発明の方法およびキットは、Ｒ¹ 、Ｒ²、およびＲ³がメチルであり、そしてＸが−ＣＨ₂−ＳＯ₃Ｈである化合物( スルホベタイン)を使用する。 一般的に、DNA配列決定における、およびDNAポリメラーゼを使用する他の実験 手順におけるDNAポリメラーゼの停止の発生率を除去または減少するために使用 される化合物は、市販されている。例えば、ベタイン、ジメチルグリシン、サル コシン、およびトリメチルアミンＮ-オキシドは、全てSigma Chemical Company( St．Louis，Missouri，USA)から得られ得る。 これらの化合物はまた、当業者に公知の通常の方法によってもまた合成され得 る。例えば、Ｒ⁴がＨであり、ｎが０であり、そしてＲ⁵が−ＣＯ₂Ｈである式の 化合物は、Lloydら(1992)J．Pharm．Pharmacol．44: 507-511の方法により合成 され得る。一般的に、クロロ酢酸エチルを加熱し、エタノール中で適切な第３ア ミンと還流させる。反応が完了すると、減圧下でエバポレートすることにより、 エタノールを反応混合液から除去する。残渣を３〜６%w/v水性HCl中に溶解し、 そして温めて還流させる。減圧下で溶媒をエバポレートすることにより、所望の 生成物が提供される。代表的に、これらの生成物はアセトニトリル／水混合液か ら再結晶され得る。 Ｒ⁴がＨまたはＣＨ₃であり、ｎが１であり、そしてＲ⁵がＣＯ₂Ｈである式Iの 化合物は、Fiedorek,F.T.、米国特許第2,548,428号の方法により合成され得る。 簡単には、βラクトンを第３アミンと反応させて、所望の化合物を提供する。 Ｒ⁴がＨであり、ｎが２であり、そしてＲ⁵が-ＣＯ₂Ｈである式Iの化合物は、A ksnes,G.ら、J．Chem．Soc．London 1959：103-107の方法により合成され得る。 簡単には、4-ブロモ酪酸(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，Wisconsin，USA) を、メチルアルコールおよび触媒硫酸で処理することにより、メチルエステルに 転化する。次いで、過剰のアルコール性第３アミンでメチルエステルを処理する ことにより、所望の化合物が提供される。 Ｒ⁴およびＲ¹が一緒になってピロリジン環を形成し、Ｒ⁵がＣＯ₂Ｈである式I の化合物は、Karerら(1925)Helv．Chim．Acta．8:364の一般的な方法により合成 される。例えば、スタキドリンは、この手順に従ってプロリンのメチル化によっ て形成される。 Ｘが＝Ｏである式Iの化合物は、対応する第３アミンの酸化により合成される( March,J.(1992)Advanced Organic Chemistry，Reactions，Mechanisms and Stru cture，第４版，John Wiley and Sons，New York，1200-1201頁を参照のこと)。 代表的には、酸化は過酸化水素を用いて行われるが、他の過酸類もまた使用され 得る。 スルホベタインは、King,J.F.ら(1985)J．Phosphorus Sulfur 25: 11-20の手 順に従って合成され得る。Ｒ⁵が−ＳＯ₃Ｈである式Iの他の化合物もまた、この 手順の改変および当業者に公知の他の方法により合成され得る。Ｃ． DNA配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応、およびDNAポリメラーゼを使用する 他の実験手順の改良方法 １． DNA配列決定の鎖終止法 本願発明は、鎖終止法によるDNA配列決定における改良を包含する。本明細書 で使用される用語「DNA配列決定の鎖終止法」、「鎖終止法」、または「鎖終止DNA配 列決定法」は、配列決定されるDNA分子の部分に相補的な核酸フラグメントを生成 するためにDNAポリメラーゼを使用するDNA配列決定法をいう。一般的に、DNA分 子の部分に相補的であるプライマーが使用される。プライマーは、DNAポリメラ ーゼにより、DNA分子の鋳型に沿って伸長される。この方法の原理は、少量の特 定の鎖伸長インヒビターを反応混合液中に含むことにより、DNAポリメラーゼが 極稀にインヒビターを取り込み、そして終止することである。一般的に、４つの 反応混合液が調製され、それぞれ異なる鎖伸長インヒビターを有し、グアノシン 残基、シトシン残基、アデノシン残基、またはチミジン残基で特異的に終止し得 る。DNAポリメラーゼとインキュベートすることにより生成されるDNAフラグメン トは、DNA分子の配列を決定するために分離され得、そして解析され得る。他の 分離法または検出法も使用され得るが、代表的に、フラグメントはゲル電気泳動 により分離され、そしてオートラジオグラフィーにより検出される。(DNA配列決 定の鎖終止法のより詳細な記載についてはSangerら、上述およびSambrookら、上 述を参照のこと)。この手順は自動化に準じ、そして種々の特定の方法が自動化 の目的のために創作され、単一レーンの配列決定、レーザー検出、およびキャピ ラリー電気泳動を包含する。 本明細書で使用される用語「鎖伸長インヒビター」または「鎖終止インヒビター」 は、DNAポリメラーゼ酵素による核酸鎖の伸長を終止させる化合物をいう。上記 のように、これらの化合物は、DNA配列決定の鎖終止法において有用であり得る 。 本明細書で使用される用語「休止」、「停止」、「DNAポリメラーゼ休止」または「DN Aポリメラーゼ停止」は、鎖終止DNA配列決定法において、DNAポリメラーゼがDNA とインキュベートされる場合、特定のヌクレオチドでDNAポリメラーゼが停止す るまたは機能しない現象をいう。これは、取り込まれる次の核酸が存在し、そし て伸長が停止する明白な理由(ジデオキシヌクレオチドの取り込みなど)がなんら 存在しないのにも関わらず、DNAポリメラーゼ分子が伸長できない現象である。D NAフラグメントがDNAシークエンスゲル上に並べられる場合、停止は、ゲルの４ つの全てのレーンにおいて、DNAポリメラーゼが伸長困難性を有したフラグメン ト長に対応する位置でバンドとして現れ、そのため、その位置の核酸の正体が決 定され得ない(例えば、図１Ａ中の矢印を参照のこと)。 DNAの配列を決定するための種々の異なる鎖終止法がある。最も一般的に使用 される方法は、ジデオキシヌクレオチドDNA配列決定法である。本明細書で使用 される用語「ジデオキシヌクレオチドDNA配列決定法」または「ジデオキシDNA配列 決定法」は、DNA配列決定の鎖終止法をいい、ここでは鎖伸長インヒビターは2'3' -ジデオキシヌクレオシドまたはそれらの誘導体である。代表的に2'3'-ジデオキ シヌクレオシド三リン酸が使用される。種々の他の鎖伸長インヒビターもまた、 使用され得る。例えば、アラビノヌクレオシド誘導体または３'0-メチルデオキ シリボヌクレオチド誘導体が、鎖終止法において使用され得る(Sangerら、上述 およびAxelrod,V.O.ら（1978）N.A.R．5:3549-3563を参照のこと)。 種々の異なる酵素が、配列決定されるDNA分子に相補的なDNAフラグメントを生 成するために使用され得る。例えば、T7 DNAポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、 およびDNAポリメアーゼIのKlenowフラグメントは全て、DNA配列決定において使 用される。RNAポリメラーゼおよび逆転写酵素もまた、使用され得る。DNAポリメ ラーゼは、DNA配列決定において使用するための酵素を最適化するために、遺伝 学的にまたは物理的に改変され得る。 DNAポリメラーゼは、プライマー配列を必要とする。プライマー配列は、DNA分 子の消化により生成され得るか、またはプライマー分子として外来的に添加され 得る。本明細書で使用される用語「プライマー分子」、「プライマー」または「核酸 プライマー」あるいは「DNAプライマー」は、配列決定されるDNA分子の一部分に相 補的である１本鎖核酸分子をいう。プライマーはDNA分子にアニールさせられ、 続くDNAポリメラーゼによるプライマーの３'末端の伸長が、配列決定されるDNA 分子の部分に相補的な核酸配列を生成する。プライマーは、DNA配列決定の鎖終 止法において、一般的に使用される。しかし、鎖終止法によるDNA配列決定のあ る改変において、プライマー配列は適切な酵素での消化により生成され得る(下 記を参照のこと)。 別の実施態様において、DNA配列決定ベクターが、鎖終止法によるDNA配列決定 を容易にするために使用され得る。種々のこのようなベクターが使用され得、M1 3、Bluescriptベクター(例えばpBS-KS⁺およびpBS-KS^-)(Stratagene，San Diego ，California，U.S.A.)、pUCベクター(例えば、pUC18およびpUC19)、およびpBR3 22ベクターを含む。配列決定されるDNA分子は、配列決定ベクターへ挿入される 。プライマーは、配列決定ベクター中のDNAの領域に相補的であるように構築さ れ得、プライマーの３'末端からの伸長が、配列決定されるDNA分子の一部分に相 補的なDNAフラグメントを生成する。従って、配列決定ベクターが使用される場 合、配列決定されるDNA分子はベクター中のインサートとして存在し得る。DNA配 列決定ベクターの領域に相補的であるプライマーが使用され得、鎖伸長がプライ マーの３'末端からDNAインサートの領域へ生じる。それゆえ、インサートのDNA 配列の決定が可能になる。 配列決定のためのDNA調製物は、精製済または未精製のいずれかであり得る。 未精製DNAは、粗細胞溶解物であり得る。DNAポリメラーゼの停止の発生率を除去 または減少する本発明の化合物は、未精製DNA調製物(粗細胞溶解物を含む)のDNA 配列決定における使用を可能にする。 DNA調製物は、１本鎖形態または２本鎖形態で存在し得る。例えば、直鎖状２ 本鎖DNAは、PCRにより生成され得る。このようなDNAが配列決定される場合、DNA ポリメラーゼの停止の発生率は減少するか、または除去する。 DNA配列決定の鎖終止法において生成されるDNAフラグメントの混合物は、最も 一般的には、ゲル電気泳動によって分離および解析される。DNAシークエンスゲ ルの例としては、本願における図の１Ａおよび１Ｂを参照のこと。DNAフラグメ ントを分離するために有用な他の分離方法もまた使用され得る(Sambrookら、上 述を参照のこと)。例えば、質量分析測定法が、DNAフラグメントの混合液を解析 するために使用され得る(Jacobsonら、（1991）J.Genetic Analysis，Technique s and Applications 8:223-229を参照のこと)。 DNAフラグメントは標識済または無標識であり得る。例えば、無標識のDNAフラ グメントは、自動化技術における紫外分光光度法により、またはゲル電気泳動後 の銀染色により検出され得る。しかし、検出を容易にするために標識DNAフラグ メントを生成することが、一般的に望ましい。例えば、放射性標識DNAフラグメ ントが生成され得る。それらは、例えば、放射性プライマーを使用することによ って生成され得る。あるいは、DNAポリメラーゼとのインキュベートの間に、放 射性ヌクレオチドが取り込まれ得る。放射性標識DNAフラグメントが生成される 場合、それらは、ゲル電気泳動により分離され得、そしてオートラジオグラフィ ーにより可視化され得る(本願における図１Ａおよび１Ｂを参照のこと)。種々の 非放射性標識もまた使用され得、発蛍光団、化学発光剤、および検出可能な小分 子(例えば、ビオチン)を含む。例えば、自動化塩基配列決定技術において、蛍光 標識または比色標識は、キャピラリーチューブまたはシークエンスゲルを使用し て、レーザー分光器により検出され得る。 非放射性標識は、間接的な手段により付着され得る。一般的に、リガンド分子 (例えば、ビオチン)は、分子に共有結合的に結合する。次いで、リガンドは、固 有に検出可能であるか、またはシグナルシステム(例えば、検出可能な酵素、蛍 光化合物、または化学発光化合物)に共有結合的に結合するかのいずれかである 抗リガンド分子(例えば、ストレプトアビジン)に結合する。多くのリガンドおよ び抗リガンドが利用され得る。リガンドが天然の抗リガンドを有する場合(例え ば、ビオチン、チロキシン、およびコルチゾール)、リガンドは標識された天然 に存在する抗リガンドと共に使用され得る。あるいは、任意のハプテン性化合物 または抗原性化合物が、抗体と組み合わせて使用され得る。 DNA配列決定の鎖終止法の種々の改変がある。例えば、DNA配列決定は、手動に より、半自動化手順により、または自動化DNA配列決定機器の使用により実施さ れ得る。さらに、鎖終止DNA配列決定技術は、他の技術と組み合わせられ得る。 例えば、「exometh」法においてDNA分子はエキソヌクレアーゼで処理され、多様な 長さの１本鎖の５'伸長部を有する一連のDNA分子を生成する。次いで、これらの DNA分子は、外来のプライマーを添加しないでDNA配列決定の鎖終止法により直接 配列決定され得る。(「exometh」改変によるDNA配列決定のより詳細な記載につい ては、Sorge,J.A.ら(1989)Proc．Nat．Acad．Sci，USA86：9208-9212を参照のこ と)。鎖終止DNA配列決定法のこのような改変は、全て本発明に包含される。 本発明の化合物は、停止の発生率を除去または減少するために、DNAをDNAポリ メラーゼとインキュベートする前またはその間に、反応混合液に添加され得る。 DNA分子、DNAポリメラーゼ、鎖伸長インヒビター、ジデオキシリボヌクレオシド 三リン酸、プライマー、および本発明の化合物の添加の順番もまた多様であり得 る。実施例４において示されるように、停止の発生率を減少または除去する化合 物は、DNAポリメラーゼの通常のインキュベート時間の後においてでさえも添加 され得、そしてインキュベートはDNAポリメラーゼの停止を取り除くために延長 され得る。２． ポリメラーゼ連鎖反応手順 本発明はまた、PCRなどの核酸増幅手順における改良を包含し、これはDNAポリ メラーゼによる鎖伸長を包含する。 TaqポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼ酵素を利用する種々の異なるPCR技術 がある。PCR方法論の詳細な記載については、PCR Protocols：A Guide to Metho ds and Applications(Innis,M，Gelfand,D.，Sninsky,J.およびWhite,T.編)、Ac ademic Press，San Diego(1990)を参照のこと。代表的なPCRプロトコルでは、標 的核酸、２つのオリゴヌクレオチドプライマー(プライマーの１つは各鎖にアニ ールする)、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、および適切な塩を混合して、そして 温度をサイクルさせることにより、プライマーを鋳型にアニールさせ、ポリメラ ーゼにプライマーを伸長させ、そして鋳型鎖を新しく合成された鎖から分離させ る。温度サイクルを続けて行うことにより、プライマー間の領域の指数関数的増 幅が可能になる。ポリメラーゼが、他のプライマーがアニールする位置まで少な くとも伸長させ得る限り、プライマーは、元の鋳型と新しく合成された核酸との 両方にアニールし得る。この理由のために、PCRが産物を増幅する能力は、ポ リメラーゼがアニールされたプライマーを伸長させる能力によって主に制限され る。ポリメラーゼがアニールされたプライマーを伸長させる能力は、プライマー 間の距離およびプライマー間の配列のヌクレオチド組成に依存する。本明細書中 に記載される１つ以上の化合物の適切な量の添加は、この伸長を促進する。Taq ポリメラーゼを使用するPCRプロトコルにおける鎖伸長に対するベタインの効果 の実証については、本明細書中の実施例８および実施例９を参照のこと。ベタイ ンに加えて本発明の他の化合物も、種々の異なるPCR方法における鎖伸長を改良 するために、同様の方法で使用され得る。 本発明の化合物はまた、DNA配列決定およびポリメラーゼ連鎖反応以外の実験 手順においても、DNAポリメラーゼの停止を減少することにおいて有用性を有す る。多くの一般的な実験技術(例えば、インビトロ変異誘発、ニックトランスレ ーション、逆転写および平滑末端化)がDNAポリメラーゼを利用する。これらの方 法の記載については、Sambrookら(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manu al，第２版，1-3巻，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(19 89)を参照のこと。従って、本発明の化合物は、DNAポリメラーゼによる鎖伸長を 含む種々の手順において有用である。３． 停止の発生率を減少または除去する化合物の試験および最適化 DNA配列決定の鎖終止法およびDNAポリメラーゼを使用する他の実験手順におけ る停止の発生率を除去または減少し得る化合物は、上記の通りである。これらの 化合物は、DNAポリメラーゼの停止を除去または減少するそれらの相対的な能力 について試験され得る。例えば、化合物は、本明細書中の実施例１において記載 される手順によって試験され得る。簡単には、DNA配列決定は、選択された濃度 の本発明の化合物の存在下または非存在下においてジデオキシ配列決定法により 行われる。次いで、化合物の存在下および非存在下において得られるDNAシーク エンスゲルが、DNAポリメラーゼの停止を除去するにおける化合物の有効性を測 定するために比較される(例えば、図１Ａおよび１Ｂを参照のこと)。各化合物の 有効濃度は、この手順によって決定され得る。所定の化合物についての至適濃度 は、チェインターミネーターDNA配列決定法の異なる改変法について変化し得る 。 これらの濃度は、異なる量の化合物を添加し、そして停止の発生率を測定するこ とにより、実験に基づいて容易に測定され得る(例えば、本明細書中の実施例７ を参照のこと)。 本発明はまた、鎖終止法によるDNA配列決定のための、DNAポリメラーゼの停止 の発生率を除去または減少する量の本明細書中に記載される１つ以上の化合物を 含有するキットを包含する。キットはさらに、使用説明書、１つ以上のデオキシ リボヌクレオシド三リン酸を含む容器、DNAポリメラーゼを含有する容器、およ び鎖伸長インヒビターを含有する容器を包含し得る。キット中の容器は種々の方 法で組み合わされ得る。例えば、鎖伸長インヒビターは、デオキシリボヌクレオ シド三リン酸の混合物と共に同じ容器中で組み合わされ得る。 本発明はまた、DNAポリメラーゼ連鎖反応のための、DNAポリメラーゼの停止の 発生率を除去または減少する量の本明細書中に記載される１つ以上の化合物を含 有するキットを包含する。キットはさらに、使用説明書、DNAポリメラーゼを含 有する容器、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む容器を包含し得る 。 他で定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学的用 語は、本発明の属する技術分野における当業者に一般に理解される意味と同じ意 味を有する。本明細書中に記載されるものに類似したまたは等価な任意の方法お よび材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、ここでは好ましい 方法および材料が記載されている。本明細書で以下に言及する全ての刊行物は、 本明細書に参考として援用される。他で言及しない限り、本明細書中で使用また は意図される技術は、当業者に周知の標準的な方法論である。材料、方法、およ び実施例は、例証にすぎず、限定するものではない。 実施例実施例１ ベタインによるDNA配列決定のジデオキシ法における停止の除去 ベタインは、標準的なジデオキシ配列決定手順において通常見られる停止を除 去する。 ベタイン一水和物をSigmaから得、5.5Mのストック溶液として-20℃で保存した 。改変T7ポリメラーゼ(シークナーゼ2.0(Amersham，Arlington Heights，Illino is, U.S.A.))およびヌクレオチド混合物は、USBから購入した。³⁵S-dATPは、Amersha mから購入した。 一般的に、DNA配列決定は、Del Salら(1989)BioTechniques 7:514-519のプロ トコルに従った。配列決定を、１ピコモル(pmol)のスーパーコイル２本鎖プラス ミドDNA(製造業者の使用説明書に従ってQIAGEN tip-100カラムにかけることによ り精製した)と２〜４pmolの種々のオリゴヌクレオチドプライマー(一般的に、ポ リアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、このことは30ヌクレオチド以下の プライマーの不必要性を証明した)とを混合し、そして0.1NのNaOHを含む10μlの 容量に調整することにより、実施した。チューブを10分間68℃でインキュベート し、次いで、室温に移し、そして４μlのTDMN(200mM NaCl，50mM DTT，120mM HC l，80mM MgCl₂，280mM TES)を添加した。さらに室温で10分間インキュベートし た後、２μlのGTP標識混合液(7.5μM dCTP，7.5μM dGTP，7.5μM dTTP)および ５μCiの³⁵S-dATPを添加した。次いで、２μlのシークナーゼ(冷却10mM Tris.Cl pH8.0，1mM EDTAで、1:8に希釈した)を添加した。この混合液を５分間室温でイ ンキュベートし、次いで、3.5μlを予め37℃に温めた４本のチューブ(それぞれ 、3.5μlの5.5M ベタインおよび2.5μlの終止反応混合液(80μMの各dNTP、８μM の１種類のddNTP、50mM NaCl)を含む)に等分し、ベタインの最終濃度を約２Mと した。これを５分間37℃でインキュベートし、次いで、４μlの停止溶液(80%の 脱イオン化ホルムアミド，１×TBE，0.05% キシレンシアノール，0.05% ブロモ フェノールブルー)で停止した。95℃で2.5分後、チューブを短時間氷上で冷却し た。4.5μlを６%のポリアクリルアミド(19:1 アクリルアミド：ビスアクリルア ミド)／７M 尿素／１×TBEゲルにロードし、種々の期間、35Wで泳動した。ゲル を12%メタノール／12%酢酸溶液で固定し、Whatmanペーパーにトランスファーし て、そして乾燥した。一般的に、これをKodak XAR ５フィルムに一晩感光した。 ２Mの濃度のベタインの添加は、DNA配列決定を上記のようなDel Salら、上述 の方法の改変型を用いて実施した場合、事実上全ての停止を除去した。ベタイン を用いない配列決定は、時折停止を導き、GCリッチ領域においておよび特にプラ イマーから離れた領域において生じる傾向がある(図１Ａ)。17個のこのような停 止の解析は、ピリミジン−グアニン−シトシンに類似する配列の中央の位置の後 に停止が生じることを示し、試験した17個の停止のうちの11個は、このコンセン サスに一致しており、および残りの６個は１つの位置のみが異なっていた。GCG パッケージの一部分であるMFOLDプログラムによって決定されるような、１本鎖 鋳型の潜在的な２次構造との明白な相関はなかった。ベタインの存在下(図１Ｂ) では、これらの停止の全てが消え、正確な配列が決定されることを可能にする。実施例２ プライマーから離れた解読可能なDNA配列が、ベタインの存在下で得 られる ジデオキシ法によるDNA配列決定における停止の発生率は、プライマーから離 れて位置するDNA領域において増加する。この現象は１つのプライマーから得ら れ得る有用なDNA配列を限定する。しかし、ジデオキシ配列決定反応混合液中に ベタインが含まれると、プライマーから下流に離れるDNA領域における停止の発 生率を減少する。このことにより、有用な配列情報が、別のプライマーを用いて さらに配列決定反応を行うことなく、DNAのこれらの領域において得られ得る。 DNA配列決定は、2M ベタインの存在下および非存在下で、実施例１に記載のよ うに実施した。得られた配列決定反応物を、より長いDNAフラグメントを試験す るためにゲルを12時間泳動した以外は、実施例１に記載のようにDNAシークエン スゲルに泳動した。これらのより長いDNAフラグメントは、ジデオキシDNA配列決 定手順において通常得られるよりも、プライマーから離れたDNA領域の配列を明 瞭に示した。ベタインの非存在下では、これらのゲルから、有用な配列情報はほ とんど決定され得なかった。しかし、ベタインの存在下では、DNA配列は、プラ イマーの３'末端から少なくとも520ヌクレオチドまで解読され得た。それを越え る配列は、ゲルの分離能のために、やや解読されにくくなる。実施例３ ベタイン存在下での未精製DNA調製物からのDNA配列決定 DNAは、標準的なアルカリ溶解技術(Silhavyら(1984)Experiments With Gene F usions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York 147- 148)に一般的に従って調製し、次いでエタノール沈澱した。有機抽出、RNAse処 理または他のさらなる精製技術は使用しなかった。pDSM3プラスミドを含有するX L1-blue細胞(Stratagene，San Diego，California)をDNAの供給源として使用し た。次いで、DNAを実施例１に記載されるように配列決定した。予想された通り 、ベタインの非存在下では多数の停止があった。しかし、ベタインを終止反応液 に添加した場合、このDNAを配列決定したときに存在した停止が消滅した。実施例４ ベタインで追跡することによるDNA配列決定の間の停止の除去 ベタインは、通常の終止反応の後に添加される場合、停止を除去し得る。DNA 配列決定を、終止反応混合液にベタインを添加しなかったこと以外は、実施例１ に記載されるように行った。37℃で５分間インキュベートした後、3.5μlの5.5M ベタイン溶液かまたは3.5μlの水のいずれかを添加した。次いで、さらに、５分 間インキュベートを続け、そして実施例１に記載のように停止溶液で停止した。 この時点でのベタインの添加は、ベタインの非存在下で見られた停止を大きく減 少した。従って、シークエンスゲル上で停止を表すバンドは、停止したDNAポリ メラーゼ複合体を表すようである。終止反応混合液と通常のインキュベートを行 った後に添加したベタインは、停止したDNAポリメラーゼ複合体が伸長を再び始 めることを可能にできる。このことは、ベタインが単にDNAポリメラーゼを安定 化することによって作用するのであれば、この時点でのベタインの添加は何の効 果も有さないので、ベタインが単にDNAポリメラーゼを安定化することによって 作用するのではないことを示す。実施例５ 改変されたジデオキシDNA配列決定手順における停止の発生率の除去 または減少 実施例１のDNA配列決定手順を、ベタインが種々のジデオキシDNA配列決定プロ トコルにおいて生じる停止を除去し得ることを示すために、改変した。ジデオキ シDNA配列決定手順において、１本鎖DNA基質を置き換える効果または異なるDNA ポリメラーゼを使用する効果を試験した。 ａ) １本鎖DNAの配列決定 １本鎖DNAを、通常の手順に従って、プラスミドpDSM6を含有するXL1-blue株か ら調製した。実施例１に記載される手順によって、１本鎖DNAを配列決定した場 合、ベタインの非存在下において２本鎖の例においてよりもより少ない停止が見 られた。しかし、これらの停止もまた、ベタインによって除去された。 ｂ) Klenow DNAポリメラーゼ酵素を使用する配列決定 E.coli DNAポリメラーゼのKlenowフラグメントを使用した以外は、本質的に実 施例１に記載される手順によって、DNA配列決定を行った。7.5ユニットのKlenow 酵素を使用し、伸長混合液を、GTP伸長混合物に加えて20μCiの³⁵S-dATPおよび0 .1μlのDTTを含むように改変した。Klenow酵素の使用で異なる場所において停止 が見られたが、シークナーゼを使用する手順について上述したのと同じように、 一般的にベタインによって停止は除去された。 ｃ) Taqポリメラーゼ酵素を使用する配列決定 DNA配列決定を、Promega「fmol^TM DNA Sequencing System」のプロトコルに従っ て行った(Promega Corporation，Madison，Wisconsin，USA)。プロトコルを以下 に記載する。 （１）標識プライマーを停止する。 （２）４〜40fmolのDNA鋳型、５μlの５×fmolシークエンス緩衝液(250mM Tri s.Cl pH9.0，10mM MgCl₂)、1.5pmolの標識プライマー、ベタイン、および水を、 最終容量が16μlになるように混合する(適切な濃度のベタイン(例えば、2M)を含 有)。 （３）１μlのシークエンス用のTaq DNAポリメラーゼ(５U/μl)を添加する。 （４）以下の表に従って、各dNTP/ddNTPのそれぞれに上記の４μlを添加する ： （５）１滴の鉱油で積層する。 （６）チューブを95℃に予備加熱したサーマルサイクラー中に置く。 （７）適切なサイクルプログラムを開始する(プライマーにより変わる、１つ の例は、95℃で２分間、(95℃で30秒間、42℃で30秒間、70℃で60秒間)を30サイ クル)。 （８）３μlの停止溶液(10mM NaOH，95% ホルムアミド，0.05% ブロモフェノ ールブルー，0.05% キシレンシアノール)を添加する。 （９）2.5分間95℃で加熱し、氷冷却し、そしてシークエンスゲルにロードす る。 シークエンスゲルを泳動し、DNAポリメラーゼの停止の存在を、本明細書中の 実施例１に記載するように決定した。反応混合液中に見られる停止の発生率は、 ベタインの存在下で減少した。実施例６ ジメチルグリシン、サルコシン(モノメチルグリシン)、およびトリメ チルアミンN-オキシド(TMANO)によるDNA配列決定の間の停止の除去 ３つの別の化合物が、ジデオキシDNA配列決定手順において停止の発生率を減 少することが示された。ジメチルグリシン、サルコシン(モノメチルグリシン)、 およびトリメチルアミンN-オキシド(TMANO)(全てSigma Chemical Companyから) を、実施例１に記載のように、ジデオキシDNA配列決定法における停止を除去す るこれらの能力について評価した。DNA配列決定は、他になければ実施例１に記 載のように実施した。TMANOは、ベタインよりも良く停止を除去することが分か った。一方、ジメチルグリシンはいくらか効果が低かった。サルコシンは測定可 能な効果を有したが、他の化合物ほど好ましくない。他の２つのN置換荷電化合 物、テトラエチルアンモニウムクロリド(TEACl)およびテトラエチルアンモニウ ムアセテート(TEAAc)もまた、試験した。TEAClは、DNAポリメラーゼを阻害する 。TEAAcはTEAClほどDNAポリメラーゼを阻害しなかったが、またシークエンスゲ ルにおいて見られる停止の数も減少しなかった。実施例７ DNA合成のジデオキシ法において、停止を減少するのに効果的なベタ イン、TMANO、サルコシン、およびジメチルグリシンの濃度範囲 TMANO、サルコシン、ジメチルグリシン、およびベタインの濃度範囲を、実施 例１に記載の手順に従って決定した。 結果を以下の表にまとめる。 実施例８ PCR増幅産物の最大サイズの増大 ベタインは、PCRにおける鎖伸長について、プライマー間の最大距離を伸長す ることが示された。PCRは、B.Krummel，Ph.D．Thesis，University of Californ ia，Berkeley，1990に記載されるようにT7 DNAで実施した。200μM dNTP、50mM KCl、10mM Tris-Cl pH8.3、2.5mM MgCl₂、および0.01% ゼラチンの最終濃度を含 有する200μlの反応液中で、約50pmolの各プライマーを2.5ユニットのAmpliTaq ポリメラーゼ(Perkin-Elmer，Norwalk，Connecticut，USA)および0.5μgのファ ージT7 DNAと合わせた。94℃での１分ホットスタート後、94℃で90秒、37℃で１ 分、および72℃で20秒のサイクル時間でPCRを25サイクル行った。産物を沈澱さ せ、１%のアガロースゲルで泳動し、そしてエチジウム染色した後UVで可視化し た。 2Mの濃度のベタインの添加は、約4000塩基対離れた２つのプライマーが、その 間のDNA領域を増幅することを可能にした。このDNA領域は、ベタインの非存在下 では、認められるほどに増幅されなかった。実施例９ 問題となるDNA配列を含有する領域のPCR増幅 ベタインは、ベタインの非存在下で鎖伸長が妨げられてきたGCリッチなDNA領 域にわたるPCRの鎖伸長を可能にすることが示された。PCRを、配列TGCの複数の 繰り返しを含有するプラスミドで実施した。これによりDNAポリメラーゼの進行 を阻害することを発明者らが示している(本明細書中の実施例１を参照のこと)。 プライマーは500塩基対(PCRにより通常容易に増幅され得る距離)離れているだけ であるが、標準的な反応条件ではいかなる増幅産物も生じなかった。ベタインを 2Mの濃度で添加した場合、その間の領域が増幅された。 本明細書中の実施例および実施態様は、例証の目的のためのものにすぎず、そ れが考慮された種々の改変または変化が当業者に示唆され、そして本出願の意図 および全体的な説明ならびに添付の請求の範囲内に含まれる。本明細書中で引用 される全ての刊行物、特許、および特許出願は、それによって、参考として援用 される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．DNAポリメラーゼを含有する反応混合液において生じるDNAポリメラーゼの停 止の発生率を減少する方法であって、ある量の以下の式の組成物を該反応混合液 に添加する工程を包含し： ここで： Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³は、同じまたは異なり得、そして水素、メチル、エチル 、およびプロピルからなる群より独立して選択されるが、但しＲ¹、Ｒ²、および Ｒ³の２つより多くが水素であることはなく；そして Ｘは以下からなる群より選択される部分であり： の式のラジカル ここで： Ｒ⁴はメチルおよび水素からなる群より選択され、そしてＲ¹と結合した場合、 ピロリジン環を形成し； Ｒ⁵は、−ＣＯ₂Ｈおよび−ＳＯ₃Ｈからなる群より選択され；そして ｎは０〜２の整数であり； 但しＲ¹およびＲ⁴がピロリジン環を形成する場合、Ｒ²およびＲ³の１つより多 くが水素であることはなく、そしてここで該組成物がDNAポリメラーゼの停止の 発生率を減少するに効果的な量で添加される、方法。 ２．請求項１に記載の方法であって、ここでＲ¹、Ｒ²、およびＲ³が、同じまた は異なり、そしてメチル、エチル、および水素からなる群より選択されるが、但 しＲ¹、Ｒ²、およびＲ³の２つより多くが水素であることはなく、そしてＲ¹およ びＲ⁴がピロリジン環を形成する場合、Ｒ²およびＲ³の１つより多くが水素であ ることはない、方法。 ３．Ｘが-ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈである、請求項２に記載の方法。 ４．Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³がメチルである、請求項３に記載の方法。 ５．Ｒ¹、Ｒ²がメチルであり、そしてＲ³が水素である、請求項３に記載の方法 。 ６．Ｒ¹がメチルであり、そしてＲ²およびＲ³が水素である、請求項３に記載の 方法。 ７．Ｘが＝Ｏである、請求項２に記載の方法。 ８．Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³がメチルである、請求項７に記載の方法。 ９．Ｒ¹およびＲ⁴がピロリジン環を形成し、Ｒ²およびＲ³がメチルであり、ｎが ０であり、そしてＲ⁵が−ＣＯ₂Ｈである、請求項２に記載の方法。 １０．Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³がメチルであり、そしてＸが−ＣＨ₂ＳＯ₃Ｈである 、請求項２に記載の方法。 １１．前記反応混合液が、DNA配列決定の鎖終止法のための反応混合液である、 請求項１に記載の方法。 １２．前記DNA配列決定の鎖終止法が、ジデオキシDNA配列決定法である、請求項 １１に記載の方法。 １３．前記反応混合液がPCR反応混合液である、請求項１に記載の方法。 １４．前記反応混合液が未精製のDNAを含有する、請求項１に記載の方法。 １５．前記未精製のDNAが粗細胞溶解物である、請求項１４に記載の方法。 １６．チェインターミネーターDNA配列決定法において、DNAポリメラーゼの停止 の発生率を減少する方法であって、 ａ）水性溶液中で、DNA分子；該DNA分子を鋳型として使用することにより該DN A分子の部分に相補的な核酸を生成し得るDNAポリメラーゼ；デオキシリボヌクレ オシド三リン酸の混合物；鎖伸長インヒビター；およびある量の以下の式の組成 物を組み合わせて、反応混合液を形成する工程： ここで： Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³は、同じまたは異なり得、そして水素、メチル、エチル 、およびプロピルからなる群より独立して選択されるが、但しＲ¹、Ｒ²、および Ｒ³の２つより多くが水素であることはなく；そして Ｘは以下からなる群より選択される部分であり： の式のラジカル ここで： Ｒ⁴はメチルおよび水素からなる群より選択され、そしてＲ¹と結合した場合、 ピロリジン環を形成し； Ｒ⁵は、−ＣＯ₂Ｈおよび−ＳＯ₃Ｈからなる群より選択され；そして ｎは０〜２の整数であり； 但しＲ¹およびＲ⁴がピロリジン環を形成する場合、Ｒ²およびＲ³の１つより多 くが水素であることはなく、そしてここで該組成物は停止の発生率を減少するに 効果的な量で添加される；および ｂ）該反応混合液をインキュベートして、該DNA分子を鋳型として使用するこ とにより該DNAポリメラーゼに多様な長さの核酸フラグメントを形成させる工程 であって、ここで該核酸フラグメントは該DNA分子に相補的である、工程 を包含する、方法。 １７．前記鎖伸長インヒビターが2',3'-ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸で ある、請求項１６に記載の方法。 １８．請求項１６に記載の方法であって、ここでＲ¹、Ｒ²、およびＲ³が、同じ または異なり、そしてメチル、エチル、および水素からなる群より選択されるが 、但しＲ¹、Ｒ²、およびＲ³の２つより多くが水素であることはなく、そしてＲ¹ およびＲ⁴がピロリジン環を形成する場合、Ｒ²およびＲ³の１つより多くが水素 であることはない、方法。 １９．Ｘが−ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈである、請求項１８に記載の方法。 ２０．Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³がメチルである、請求項１９に記載の方法。 ２１．Ｘが＝Ｏである、請求項１８に記載の方法。 ２２．Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³がメチルである、請求項２１に記載の方法。 ２３．Ｒ¹およびＲ⁴がピロリジン環を形成し、Ｒ²およびＲ³がメチルであり、ｎ が０であり、そしてＲ⁵が−ＣＯ₂Ｈである、請求項１８に記載の方法。 ２４．Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³がメチルであり、そしてＸが−ＣＨ₂ＳＯ₃Ｈである 、請求項１８に記載の方法。 ２５．前記DNA分子が未精製のDNAである、請求項１６に記載の方法。 ２６．請求項１６に記載の方法であって、工程ａ)が前記DNA分子の第二の部分に 相補的であるプライマーの添加をさらに包含し、DNA分子の該第二の部分がDNA分 子の前記第一の部分の下流に位置し、ここで前記DNAポリメラーゼが該プライマ ーの３'末端を伸長し得、DNA分子の該第一の部分に相補的な核酸を生成する、方 法。 ２７．鎖終止法によってDNAを配列決定するためのキットであって、１またはそ れより多くのデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含有する容器、鎖伸長インヒ ビターを含有する容器、およびある量の以下の式の組成物を含有し： ここで： Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³は、同じまたは異なり得、そして水素、メチル、エチル 、およびプロピルからなる群より独立して選択されるが、但しＲ¹、Ｒ²、および Ｒ³の２つより多くが水素であるということはなく；そして Ｘは以下からなる群より選択される部分であり： の式のラジカル ここで： Ｒ⁴はメチルおよび水素からなる群より選択され、そしてＲ¹と結合した場合、 ピロリジン環を形成し； Ｒ⁵は、−ＣＯ₂Ｈおよび−ＳＯ₃Ｈからなる群より選択され；そして ｎは０〜２の整数であり； 但しＲ¹およびＲ⁴がピロリジン環を形成する場合、Ｒ²およびＲ³の１つより多 くが水素であることはない、キット。 ２８．請求項２７に記載のキットであって、ここでＲ¹、Ｒ²、およびＲ³が、同 じまたは異なり、そしてメチル、エチル、および水素からなる群より選択される が、但しＲ¹、Ｒ²、およびＲ³の２つより多くが水素であることはなく、そして Ｒ¹とＲ⁴がピロリジン環を形成する場合、Ｒ²およびＲ³の１つより多くが水素で あることはない、キット。 ２９．Ｘが−ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈである、請求項２８に記載のキット。 ３０．Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³がメチルである、請求項２９に記載のキット。 ３１．Ｘが＝Ｏである、請求項２８に記載のキット。 ３２．Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³がメチルである、請求項３１に記載のキット。 ３３．Ｒ¹およびＲ⁴がピロリジン環を形成し、Ｒ²およびＲ³がメチルであり、ｎ が０であり、そしてＲ⁵が−ＣＯ₂Ｈである、請求項２８に記載のキット。 ３４．Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³がメチルであり、そしてＸが−ＣＨ₂−ＳＯ₃Ｈであ る、請求項２８に記載のキット。