JP2000510341A - 鋳型増幅の間に直接的に配列決定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 核酸分子を同時に増殖および配列決定し、ならびに高処理量ＤＮＡ配列決定を行う方法およびキットが開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 鋳型増幅の間に直接的に配列決定する方法 発明の背景 ＤＮＡ配列 遺伝子構造、遺伝子活性の制御、および分子レベルにおける細胞の機能に関す る現在の知識は全て、何百万ものＤＮＡ分子の塩基配列の決定に基づいている。 ＤＮＡ配列は、研究において、ならびに遺伝子治療および診断に関して（例えば 、組み替えクローンおよび突然変異を立証するために）、非常に重要である。 ＤＮＡ、デオキシリボ核酸のポリマーは、全ての増殖細胞およびある種のウイ ルスに見い出される。ＤＮＡは遺伝情報の担体であり、遺伝情報はＤＮＡ分子の 相同複製によって１つの世代から次の世代へ伝えられる。全てのタンパク質の合 成に関する情報は、ＤＮＡの塩基配列にコードされている。 遺伝情報を得るため、従って特定のＤＮＡ分子の塩基配列を明らかにするため に、化学的および酵素的配列決定法が開発された。Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ （Ｍａｘａｍ，Ａ，Ｍ．， Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４： ５６０−５６４，１９７７）によって提案されているＤＮＡ配列決定法は、核酸 分子の塩基組成を決定する化学的方法である。５’末端に放射性標識を有する一 本鎖ＤＮＡ分子が、４つの塩基特異性反応において化学的に修飾され、次に、修 飾された位置で開裂される。開裂生成物をポリアクリルアミドゲル上で分離し、 一般にオートラジオグラフィーによって検出する。 サンガー配列決定法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７，１９７７）による酵素的鎖終 結反応が現在、好まれている。サンガー法において、プライマーを未知のＤＮＡ 配列領域に延長させるプライマー／鋳型系で出発し、それによって鋳型をコピー し、鎖終結試薬の存在下にＤＮＡポリメラーゼを用いて相補的な鎖を合成するこ とによって、４組の塩基特異性ＮＤＡ断片が形成される。４つの分離反応混合物 に、４つの通常のデオキシヌクレオシド三燐酸、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ およびｄＣＴＰの他に、鎖終結ジデオキシヌクレオシド三燐酸、ｄｄＡＴＰ、ｄ ｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰ の１つだけを、それぞれ制限低濃度において組み込むことによって、鎖終結事象 が達成される。酵素ＤＮＡポリメラーゼによる成長ＤＮＡ鎖への３’ヒドロキシ ル官能基欠失ｄｄＮＴＰの組み込みが、ＤＮＡポリメラーゼによる３’−５’− ホスホジエステル結合の形成を防止することによって、鎖終結に導く。ｄｄＮＴ Ｐのランダム組み込みよって、各反応が、種々の長さの塩基特異性終結断片の集 団に導き、これらが一緒になって配列決定されたＤＮＡ分子を表す。 サンガー配列決定法の最近の修飾は、ＤＮＡポリメラーゼによって仲介される プライマー延長反応の間に、通常使用されるｄｄＮＴＰの代わりにα−チオｄＮ ＴＰを使用することによって得られるホスホロチオエート含有ＤＮＡ断片の分解 に関わる修飾である（Ｌａｂｅｉｔら、ＤＮＡ ５、１７３−１７７（１９８６ ）；Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＰＣＴ出願第ＧＢ８６／００３４９号；Ｅｃｋｓｔｅｉ ｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６，９９４７（１９８８）） 。これにおいて、４組の塩基特異性配列決定ラダー（ｌａｄｄｅｒ）が、エキソ ヌクレアーゼＩＩＩまたはヘビ毒ホスホジエステラーゼでの限定消化、それに続 くＰＡＧＥ上での分離、およびプライマ ーまたは１つのｄＮＴＰの放射性同位体標識による視覚化によって得られる。他 の修飾においては、塩基特異性開裂が、修飾ホスホジエステル結合中の硫黄原子 のアルキル化、それに続く熱処理によって行われる（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ−Ｇ ｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、ＤＥ３９３０３１２ Ａ１）。 ＤＮＡ増幅 クローニング（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、ポリメラーゼ鎖反応（ ＰＣＲ）（Ｃ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎ ａｎｄ Ａ Ｇｒａｈａｍ，ＰＣＲ，ＢＩＯ Ｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９４）、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）（Ｆ．Ｂａ ｒａｎｙ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８，１８９−９ ３（１９９１））、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｇ．Ｔｅｒｒａｎｃｅ Ｗａｌｋｅ ｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２６７０−７７（１９９４ ））およびＲＴ−ＰＣＲ対立遺伝子特異性増幅（ＡＳＡ）のような変法等を包含 する種々の方法によって、ＤＮＡを増幅することができる。 ポリメラーゼ鎖反応（Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ ｌ．，１５５：３３５−３５０ １９８７）は、生体内ＤＮＡ複製の現象を模倣 することによって、特定のＤＮＡ領域の選択的生体外増幅を可能にする。必要と される反応成分は、一本鎖ＤＮＡ、プライマー（ＤＮＡ鋳型の規定配列の５’お よび３’末端に相補的なオリゴヌクレオチド配列）、デオキシヌクレオチドトリ ホスフェート、およびＤＮＡポリメラーゼ酵素である。一般に、一本鎖ＤＮＡは 、提供される二本鎖ＤＮＡの熱変性によって生成される。反応緩衝剤は、マグネ シウムイオン、ならびに最適な酵素安定性および活性のための共溶媒を含有する 。 増幅は、下記のようなサイクルの反復から生じる：相補鎖の一つにそれぞれ選 択的に結合する２つのプライマーが、増幅の第一サイクルにおいて延長される； 次に、新たに合成された各ＤＮＡが、他のプライマーのための結合部位を含む； 従って、新たな各ＤＮＡ鎖が、増幅の他のサイクルのための鋳型になり、サイク ル毎に鋳型プールを拡大する；繰り返されたサイクルが、理論的に、プライマー の５’末端によって規定される長さを有するＤＮＡ断片の指数合成に導く。 初期ＰＣＲ実験は、熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用した。しかし、熱不 安定性ＤＮＡポリメラーゼは、各変性サイクル後に反応混合物に連続的に加えな ければならない。ＰＣＲ実施における主要な前進は、沸点近くにおいて安定なポ リメラーゼの開発（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４ ９１ １９８８）、および自動熱サイクル装置（ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｔｈｅｒ ｍａｌ ｃｙｃｌｅｒｓ）の開発であった。 熱安定性ポリメラーゼの発見は、有意な利点を有するサンガー配列決定反応の 修飾を可能にした。重合反応を、高温において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを 用いて、サイクル的方法で行うことができるようになった（サイクル配列決定） 。サイクルの条件は、ＰＣＲ法の条件と同様であり、変性、アニーリング、およ び延長工程を含む。プライマーの長さに依存して、反応の初期における１回だけ のアニーリング工程で充分な場合もある。サイクル的方法で高温において配列決 定反応を行うことは、各ＤＮＡ鎖が延長の各新サイクルにおいて鋳型としての役 割を果たし、これによって配列決定に必要なＤＮＡの量を減らし、それによって ＤＮＡの最少容量へのアクセスを提供し、な らびに高温におけるプライマーバイブリッド形成の向上した特異性、および鋳型 鎖の第二構造の減少を生じるという利益を与える。 しかし、終結断片の増幅は、通常のサイクル配列決定法において線状である。 半指数サイクル配列決定と称される最近開発された方法は、配列決定反応におい て第二逆プライマーを用いることによって、必要とされる時間を短縮し、通常の サイクル配列から得られる増幅の程度を増加させる。しかし、逆プライマーは、 配列プライマー結合部位に到達する前に終結されるのを避ける場合にのみ、追加 鋳型鎖を生じる。言うまでもなく、逆プライマーによって生じる終結断片は、充 分な鋳型として機能することができない。従って、実際、半指数法による増幅は 、完全に指数的であるわけではない（Ｓａｒｋａｔ，Ｇ．およびＢｏｌａｎｄｅ ｒ Ｍａｒｋ Ｅ．，Ｓｅｍｉ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑ ｕｅｎｃｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９５， Ｖｏ．２３，Ｎｏ．７，ｐ．１２６９−１２７０）。 前記に指摘したように、現在の核酸配列決定法は、比較的多量（一般に約１ｇ ）の高精製ＤＮＡ鋳型を必要とする。しかし、 少量の鋳型ＤＮＡしか得られない場合が多い。増幅を行うことはできるが、増幅 工程が一般に時間を要し、生成される増幅鋳型の量が制限され、増幅されたＤＮ Ａを配列決定の前に精製しなければらならい。特に高処理核酸配列決定を促進す るために、ＤＮＡを増幅し配列する合理化された工程が必要である。発明の概要 一般に、本発明は、ＤＮＡ鋳型から、ＤＮＡ配列決定を可能にするのに充分な 品質の塩基特異性終結断片を生成する一段階工程を提供する。 本発明の方法によると、組み合わされた増幅および終結反応は、鎖終結ヌクレ オチドに対して異なる親和性をそれぞれ有する少なくとも２種類のポリメラーゼ 酵素を用いて行われ、それによって、鎖終結ヌクレオチドに対して比較的低い親 和性を有する酵素による重合が指数増幅に導き、一方、鎖終結ヌクレオチドに対 して比較的高い親和性を有する酵素が重合を終結させて、配列生成物を生じる。 他の局面において、本発明は、核酸鋳型を直接的に増幅し、塩基特異性終結断 片を生成するキットに関する。１つの実施態様においては、キットは、適切な量 の、ｉ）完全な組の鎖延長 ヌクレオチド、ｉｉ）少なくとも１つの鎖終結ヌクレオチド、ｉｉｉ）鎖終結ヌ クレオチドに対して比較的低い親和性を有する第一ＤＮＡポリメラーゼ、および ｉｖ）鎖終結ヌクレオチドに対して比較的高い親和性を有する第二ＤＮＡポリメ ラーゼ、を含んで成る。キットは、任意に、適切な１つまたは複数のプライマー 、適切な緩衝剤、ならびに使用説明書を含むこともできる。 本発明は、ＤＮＡ増幅および終結を１つの反応器中で行うことを可能にする。 ジデオキシヌクレオチド三燐酸に対して異なる親和性を有する２種類のポリメラ ーゼを用いることによって、標的配列の指数増幅を、終結反応ヌクレオチドとの 組み合わせにおいて達成することができる。さらに、この方法は、塩基終結断片 生成と分離して増幅が行われる場合に必要とされる精製工程を必要としない。さ らに、本発明の方法は、分離した増幅および塩基特異性終結反応よりも、より少 ない時間で行うことができる。 該方法は、検出手段と組み合わせた場合に、少量の鋳型しか利用できず、迅速 かつ正確な配列データの取得が望まれる際に、特定の核酸配列を検出し及び／又 は定量することに使用できる。 例えば、検出手段と組み合わせた場合に、該方法は、未知の遺伝子または他の核 酸配列を配列決定するのに有用であり、ならびに、遺伝的疾病、染色体異常、あ る種の疾病（例えば、癌、肥満症、関節硬化症）への遺伝的疾病素質、および病 原性（例えば、最近、ウイルス、真菌、原生生物）感染のような、ある種の疾患 および症状を診断または監視するのに有用である。さらに、二本鎖ＤＮＡ分子が 出発物質として使用される場合、本発明の方法は両方の鎖を同時に配列決定する 機会を与え、それによって、得られる配列データをより正確にし、またはより長 い鋳型の両端から配列情報を得る。 本発明の前記および他の特徴および利点が、下記の詳細な説明および請求の範 囲によって明らかにされる。図面の簡単な説明 図１は、実施例１に記載の反応において、大腸菌のｒｒｎＢ遺伝子からの４０ ０塩基対（ＢＰ）挿入を有するｐ０Ｍ８誘導組換えプラスミドを鋳型として用い た場合のＡＢＩ−プリズム自動シークエンサー（３７３Ａ型）からの配列データ を示す。この図は、ＰＣＲ生成物の長さである約４４０ＢＰまで読み取ることが できる信頼性のある配列を示す。 図２は、大腸菌のｒｒｎＢ遺伝子からの４００ＢＰ挿入を有するｐ０Ｍ８誘導 組換えプラスミドをここでもまた用いた場合のＡＢＩ−プリズム自動シークエン サー（３７３Ａ型）からの配列データを示す。しかし、配列反応が、少量の鋳型 （５０ｎｇ）上での標準配列プロトコルを用いて行われたので、信頼性のある配 列が得られなかった。 図３は、２種類のポリメラーゼ、および検出のための色素標識ジデオキシヌク レオチド三燐酸、および２つの逆向きプライマーを用いた場合の、増幅および配 列決定反応の組合せの略図である。 図４は、同時増幅および配列決定反応において生じた前向き配列ラダー（ｆｏ ｒｗａｒｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌａｄｄｅｒ）の蛍光クロマトグラムのプロッ トである。 図５は、同時増幅および配列決定反応において生じた逆配列ラダーの蛍光クロ マトグラムのプロットである。発明の詳細な説明 一般に、本発明は、核酸分子を直接的に増幅し、塩基特異的に終結させる方法 に関する。本発明の方法によれば、組み合わせた増幅および終結反応が、核酸鋳 型上で、ｉ）完全な組の鎖 延長ヌクレオチド、ｉｉ）少なくとも１つの鎖終結ヌクレオチド、ｉｉｉ）鎖終 結ヌクレオチドに対して比較的低い親和性を有する第−ＤＮＡポリメラーゼ、お よびｉｖ）鎖終結ヌクレオチドに対して比較的高い親和性を有する第二ＤＮＡポ リメラーゼ、を用いて行われ、それによって、鎖終結ヌクレオチドに対して比較 的低い親和性を有する酵素による重合が鋳型の増幅に導き、一方、鎖終結ヌクレ オチドに対して比較的高い親和性を有する酵素が重合を終結させ、配列生成物を 生じる。 組み合わせた増幅および配列決定は、ポリヌクレオチド合成能力を有する酵素 （例えば、ポリメラーゼ）を用いるどのような増幅法にも基づくことができる。 ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）に基づく１つの好ましい方法は、下記の３つの熱 工程から成る：１）二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ分子を適切な温度において適切な時間 で変性させて、２つの一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ分子（鋳型：センス（ｓｅｎｓｅ） およびアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）鎖）を得る；２）少なくとも１つの ｓｓＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーと鋳型とを、 適切な温度において適切な時間接触させて、プライマー含有ｓｓＤＮＡ鋳型を得 る；３）該プライマー含有鋳型を、適切な温度 において、適切な時間、ｉ）完全な組の鎖延長ヌクレオチド、ｉｉ）少なくとも １つの鎖終結ヌクレオチド、ｉｉｉ）鎖終結ヌクレオチドに対して比較的低い親 和性を有する第一ＤＮＡポリメラーゼ、およびｉｖ）鎖終結ヌクレオチドに対し て比較的高い親和性を有する第二ＤＮＡポリメラーゼ、と接触させる。 工程１）〜３）を適切な回数（サイクル）で連続的に実施して、所望量の増幅 配列ラダーを得る。所望される塩基特異性終結断片の量が、実施されるサイクル 数を決定する。サイクル数の増加は、増幅レベルの増加を結果的に生じさせるが 、後の検出の感度を損なう。従って、一般に、約５０サイクル以上実施すること は望ましいことではなく、約４０サイクル未満（例えば、約２０〜３０サイクル ）を実施するのが好ましい。 好ましい実施態様においては、第一変性工程が、約８５℃〜約１００℃の範囲 （最も好ましくは約９２℃〜約９６℃）において、約２０秒（ｓ）〜約２分間（ 最も好ましくは約３０秒〜１分間）で行われる。第二ハイブリダーゼーション形 成工程は、約４０℃〜約８０℃（最も好ましくは約４５℃〜約７２℃）の範囲に おいて、約２０秒〜約２分間（最も好ましくは約３０秒〜１分間）で行うのが好 ましい。第三プライマー延長工程は、 約６５℃〜約８０℃（最も好ましくは約７０℃〜約７４℃）において、約３０秒 〜約３分間（最も好ましくは約１〜約２分間）で行うのが好ましい。 ＤＮＡ分子のセンスおよびアンチセンス鎖の両方に関する配列情報を同時に得 るために、変性工程から生じる一本鎖センスおよびアンチセンス鋳型のそれぞれ を、工程２）において適切なプライマーと接触させ、それによって工程３）にお いて生じる増幅および鎖終結核酸分子が、両方の鎖に対して相補的にされる。 核酸配列の増幅および終結を同時に行う他の好ましい方法は、鎖置換増幅（Ｓ ＤＡ）に基づく（Ｇ．Ｔｅｒｒａｎｃｅ Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２６７０−７７（１９９４）；ＥＰ特許公開第０６８ ４３１５号、発明の名称「Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌ ｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ 」）。本質的に、この方法は、一緒になって１つのサイクルを構成する下記の３ つの工程を含む：１）増幅される配列を有する二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ分子を、適 切な温度において、適切な時間で変性させて、２つの一本鎖 （ｓｓ）ＤＮＡ配列（鋳型：センスおよびアンチセンス鎖）を得る；２）制限エ ンドヌクレアーゼ（ＲＥ）のための認識／開裂部位を有し、少なくとも１つのｓ ｓＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする、少なくとも１つのプライマー（Ｐ）と、鋳 型とを、適切な温度において、適切な時間接触させて、プライマー含有ｓｓＤＮ Ａ鋳型を得る：３）該プライマー含有鋳型を、適切な温度において、適切な時間 で、ｉ）完全な組の鎖延長ヌクレオチド、ｉｉ）少なくとも１つの鎖終結ヌクレ オチド、ｉｉｉ）鎖終結ヌクレオチドに対して比較的低い親和性を有する第−Ｄ ＮＡポリメラーゼ、ｉｖ）鎖終結ヌクレオチドに対して比較的高い親和性を有す る第二ＤＮＡポリメラーゼ、およびｖ）プライマー認識／開裂部位にニックを入 れるＲＥ、と接触させる。 工程１）〜３）を適切な回数（サイクル）で連続的に実施して、所望量の増幅 配列ラダーを得る。ＰＣＲに基づく方法と同様に、所望される塩基特異性終結断 片の量が、実施されるサイクル数を決定する。好ましくは５０サイクル未満、よ り好ましくは約４０サイクル未満、最も好ましくは約２０〜３０サイクルが実施 される。 前記のようにして得られる増幅配列決定ラダーを、ポリアク リルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、または毛細管ゾーン電気泳動（ＣＺＥ） （Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ３５２，３３７ （１９８６）；Ｇｅｓｔｅｌａｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８，１４１５−１４１９（１９９０））；または、直接吸収電気泳動（ｄｉ ｒｅｃｔ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＤＢＥ）（ Ｂｅｃｋ ａｎｄ Ｐｏｈｌ，ＥＭＢＯＪ．，ｖｏｌ．３，ｐｐ．２９０５−２ ９０９（１９８４）））のような充分に確立された方法を、例えば、測色法、蛍 光測定法、化学発光および放射能と組み合わせて用いて、分離、検出及び／又は 定量することができる。 色素ターミネーター化学（Ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ）を、組み合わせた増幅および配列決定反応に用いて、前向きおよび逆向き配 列ラダーの同時発生を可能にし、これを、１つのビオチニル化プライマーが提供 された場合にストレプタビジン−ビオチン系に基づいて分離することができる。 図３は、２種類のポリメラーゼ、および検出のための色素標識鎖終結ヌクレオ チド（ｄｄＮＴＰ）、および２つの逆向きプ ライマーを用いる、組み合わせた増幅および配列決定の反応式を表す。同時発生 の前向きおよび逆向き配列ラダーの分離方法が示されている。工程Ａは、ｄｄＮ ＴＰに対して低い親和性を有するポリメラーゼによる標的配列の指数増幅を表す 。配列特異性オリゴヌクレオチドプライマーの１つがビオチニル化される。工程 Ｂは、原鋳型から、またはｄｄＮＴＰに高親和性を有するポリメラーゼによる同 時発生増幅生成物からの、配列ラダーの発生を表す。反応終了後、生成物を、ス トレプタビジン被覆固形支持体を用いて培養する（工程Ｃ）。ビオチニル化され た前向き配列生成物および前向き鋳型にハイブリダイズされた逆向き生成物を、 固定化する。読み取り可能な配列情報を得るために、前向きおよび逆向き配列ラ ダーを、工程Ｄにおいて分離する。固定化された鎖を、洗浄し、水酸化アンモニ ウムを用いて室温で変性することによって分離する。非ビオチニル化逆向き配列 生成物を、この手順の間の水酸化アンモニウ上澄みを用いてビーズから除去する 。ビオチニル化前向き配列生成物が、固定化されてビーズにされ、水酸化アンモ ニウムを用いて６０℃において再溶解される。エタノール沈殿後、両配列種を充 填色素に再懸濁させ、例えば、自動シークエンサーにかける ことができる。 質量分光測定が、直接的増幅および鎖終結法と共に使用される場合、配列ラダ ーを、初めにいくつかの質量分光計フォーマットを用いて分離することなく、直 接的に検出することができる。本発明に使用できるフォーマットは、マトリック ス補助レーザー脱着（ＭＡＬＤＩ）、連続またはパルス電気スプレー（ＥＳＩ） および関連法（例えば、イオンスプレーまたはサーモスプレー）および塊状クラ スターインパクト（ＭＳＩ）のようなイオン化法を包含し；これらのイオン源を 、線状またはリフレクトロンフライト時間（ＴＯＦ）、単一または複式四極子、 単一または複式磁気セクター、Ｆｏｕｒｉｅｒ Ｔｒａｓｎｆｏｒｍイオンサイ クロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）、イオントラップ、またはこれらの組み合わせの ような検出フォーマットと適合させて、ハイブリッド検出器が得られる（例えば 、イオントラップ−ＴＯＦ）。イオン化に関しては、多くのマトリックス／波長 組み合わせ（ＭＡＬＤＩ）または溶媒組み合わせ（ＥＳＩ）を使用することがで きる。 前記方法は、ＤＮＡ鋳型源として、事実上どのような核酸分子を用いても行う ことができる。例えば、核酸は、ａ）一本鎖 または二本鎖であるか；ｂ）線状、あるいは超コイルまたは弛緩状態の共有的に 閉鎖した（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ）環状であるか；または、ｃ） ｃＤＮＡを合成する逆転写と組み合わせた場合のＲＮＡであってもよい。例えば 、逆転写は、好適な逆転写酵素（例えば、、モロニーマウス白血病ウイルス逆転 写酵素）を用いて、標準法（例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ（１９９０）、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐ ｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓら、ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ，ｐｐ２１−２７）によって行うことができる。 核酸鋳型源は、ａ）プラスミド（天然または組換え）；ｂ）ＲＮＡ−またはＤ ＮＡ−ウイルスおよびバクテリオファージ（天然または組換え）：ｃ）染色体ま たはエピソーム複製ＤＮＡ（例えば、組織、血液試料、またはバイオプシーから ）；ｄ）核酸断片（例えば、エキソヌクレアーゼ、非特異性エンドヌクレアーゼ 、または制限エンドヌクレアーゼ消化によって、または物理的崩壊（例えば、音 波処理または霧状化）によって誘導される）；およびｅ）ＲＮＡまたはｍＲＮＡ のようなＲＮＡ転 写物；を包含する。 増幅および配列決定される核酸は、事実上どのような生物学的試料からも得る ことができる。本明細書において使用される「生物学的試料」という用語は、生 体源（例えば、ヒト、動物、植物、細菌、真菌、原生生物、ウイルス）から得ら れる物質を意味する。本発明に使用するのに適している生物学的試料の例は、固 形物質（例えば、組織、細胞ペレット、生検）、および生物学的液体（例えば、 尿、血液、唾液、羊水、口内洗浄液、脊髄液）を包含する。増幅され配列決定さ れる核酸は、非精製全細胞、細菌、またはウイルスによって供給することができ る。または、ａ）塩化セシウム勾配遠心分離；ｂ）ＲＮＡｓｅ処理を用いるかま たは用いないアルカリ分解；ｃ）イオン交換クロマトグラフィー；ｄ）フェノー ル／クロロホルム抽出；ｅ）オリゴヌクレオチドへのバイブリッド形成による分 離；ｆ）ゲル電気泳動および溶離；アルコール沈殿；ｈ）前記の組み合わせ；の ような標準法を用いて、初めに核酸をサンプルから精製することもできる。 本明細書に使用される「鎖延長ヌクレオチド」および「鎖終結ヌクレオチド」 という用語は、当分野で認識されている意味 に従って使用されている。例えば、ＤＮＡに関して、鎖延長ヌクレオチドは、２ ’−デオキシリボヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよび ｄＴＴＰ）を包含し、鎖終結ヌクレオチドは、２’，３’−ジデオキシリボヌク レオチド（例えば、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴＰ）を 包含する。ＲＮＡに関しては、鎖延長ヌクレオチドは、リボヌクレオチド（例え ば、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）を包含し、鎖終結ヌクレオチドは、 ３’−デオキシリボヌクレオチド（例えば、３’ｄＡ、３’ｄＣ、３’ｄＧ、お よび３’ｄＵ）を包含する。完全な組の鎖延長ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＣ ＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを意味する。「ヌクレオチド」という用語も、当 分野において既知である。本発明の目的のために、ヌクレオチドは、ヌクレオシ ドモノ−、ジ−、およびトリ燐酸を包含する。ヌクレオチドは、ホスホロチオエ ートヌクレオチドおよびデアザプリンヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドを も包含する。完全な組の鎖延長ヌクレオチドは、ＤＮＡ鋳型を構成する４種類の 塩基のそれぞれにハイブリダイズすることができる４種類のヌクレオチドを意味 する。 増幅配列ラダーが質量分析によって検出される場合、核酸分子を「条件付けす る」、例えば、揮発に必要なレーザーエネルギーを減少する、及び／又は断片化 を最少限にすることが有用である。条件付けは、配列ラダーが固定化される間に 行うのが好ましい。条件付けの例は、ヌクレオチド単位当たりに結合している陽 イオンにおける不均一性によるビークの広がりを排除するのに有用な、核酸分子 のホスホジエステル主鎖の修飾である（例えば、陽イオン交換）。−チオ−ヌク レオシド−トリホスフェートを有する核酸分子を、重合の間に、アルキル沃化物 （ａｋｙｌｉｏｄｉｄｅ）、ヨードアセタミド、ヨードエタノール、または２， ３−エポキシ−１−プロパノールのようなアルキル化剤と接触させて、核酸分子 のモノチオホスホジエステル結合がホスホトリエステル結合に転換される。さら に、条件付けは、脱プリン化（ＭＳの間の断片化）に対する感受性を減少させる ヌクレオチド、例えばＮ７−またはＮ９−デアザプリンヌクレオシドのようなプ リン類似体、および、ＲＮＡｓｅまたはアルカリ処理によって、増幅および修飾 配列ラダーから未修飾プライマーを除去することができる部分ＲＮＡ含有オリゴ デオキシヌクレオチド、の組み込みを包含する。蛍光検出およ びゲル電気泳動分離を用いるＤＮＡ配列決定において、Ｎ７デアザプリンヌクレ オチドが、配列情報を発生させることができないバンド圧縮を生じる第二構造の 形成を減少させる。 本発明の新規方法に重要なことは、適切な量の２種類のポリメラーゼ酵素を使 用することであり、各酵素が、特定の鎖終結ヌクレオチドに対して異なる親和性 を有し、それによって、鎖終結ヌクレオチドに対して比較的低い親和性を有する 酵素による重合が増幅に導き、一方、鎖終結ヌクレオチドに対して比較的高い親 和性を有する酵素が重合を終結させ、配列生成物が得られる。好ましくは、約０ ．５〜約３単位のポリメラーゼが、組み合わせた増幅および終結反応に使用され る。最も好ましくは約１〜２単位が使用される。ＰＣＲまたは他の熱増幅法と共 に使用するのに特に好ましいポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼであり、例 えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＦＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ^-）、Ｖｅｎｔ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ^-）およびＤ ｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ ｂｓ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、またはｅｘｏ（−）Ｐｓｅｕｄｏｃ ｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇ ｅｎｅ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ｕｌｔ ｍａｎ、９ｄｅｇｒｅｅ Ｎｍ、Ｔｔｈ、Ｈｏｔ Ｔｕｂ、およびＰｙｒｏｃｏ ｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓである。さらに、ポリメラーゼが、５’−３’エキ ソヌクレアーゼ活性を有さないのが好ましい。 実施例１に示されるように、本発明の方法は、鎖終結ヌクレオチドに対して、 比較的高い親和性を有するＡｍｐｌｉＴａｑ ＦＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅ ｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、および比較的低い親和性を有するＴａｑ ＤＮＡポリ メラーゼを用いて行うことができる。本発明に使用するのに適している他のポリ メラーゼの対は、当業者によって決めることができる（例えば、Ｔａｂｏｒおよ びＣ．Ｃ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ（ＵＳＡ），ｖｏｌ．９２，ｐｐ．６３３９−６３４３を参照）。 鎖終結ヌクレオチドに対して比較的高い親和性および比較的低い親和性を有す るポリメラーゼの他に、校正能力を有する第 三ポリメラーゼ（例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）ＤＮ Ａポリメラーゼ）を増幅混合物に加えて、増幅の忠実度を高めることもできる。 本発明に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、増幅され配列決定され るヌクレオチド配列の５’及び／又は３’領域、例えば、クローニングおよび配 列決定ベクター（例えば、Ｍ１３、ｐＵＣ、Ｐｈａｇｅｍｉｄ，ｃｏｓｍｉｄ） の挿入フランキング領域、に関する知識に基づいてデザインすることができる。 任意に、鎖延長および終結反応に使用される少なくとも１つのプライマーを固形 支持体に結合させて、プライマーおよび他の反応物からの増幅生成物の精製を促 進することもでき、それによって収量を増加させ、または鋳型ＤＮＡのセンスお よびアンチセンス鎖の両方の同時増幅−配列決定が実施された場合に、センスお よびアンチセンス鋳型鎖からのサンガーラダーを分離することができる。 適切な固形支持体の例は、フィルタープレートを伴うかまたは伴わない、ビー ズ（シリカゲル、制御孔ガラス、磁気ビーズ、セファデックス／セファロースビ ーズ、セルロースビーズ等）、毛細管、平らな支持体、例えば、ガラス繊維フィ ルター、ガラ ス面、金属面（鋼、金、銀、アルミニウム、および銅）、プラスチック物質また は膜（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニリデンジフルオリ ド）、またはウェハ（例えば、シリコンウェハ）のような平らな表面の穴の中の ビーズ、を包含する。 例えば、支持体および相補的核酸配列に既に固定化され、および検出される核 酸配列を有する核酸分子内に含まれている、捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）核酸配列間 のハイブリッド形成に基づいて、固定化を行うことができる。それによって、相 補的核酸分子間のハイブリッド形成は支持体に妨害されず、捕獲核酸は、固形支 持体と捕獲核酸配列との間の長さ中に少なくとも約５つのヌクレオチドのスペー サー領域を含むことができる。形成される二本鎖がレーザーパルスの影響下に開 裂され、脱着を開始することができる。固形支持体結合塩基配列を、天然オリゴ リボ−またはオリゴデオキシリボ−ヌクレオチドならびに類似体（例えば、チオ 修飾ホスホジエステルまたはホスホトリエステル主鎖）を介して与えることがで き、または、塩基配列が酵素崩壊を受けにくくし、従って固形支持体結合捕獲塩 基配列の総体的な安定性を増加させるＰＮＡ類似体（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，１４９７（１９９１）参照）のようなオリゴヌク レオチド擬似体を使用することもできる。 あるいは、標的核酸分子上の適切な官能基（Ｌ’）と捕獲分子上の適切な官能 基（Ｌ）との間の可逆的または不可逆的結合を介して、標的検出部位を、固形支 持体に直接的に結合させることもできる。可逆的結合は、質量分析の条件下にお いて開裂されるような結合である（即ち、トリチルエーテル結合のような光開裂 性結合、または電荷移動複合体、または比較的安定な有機ラジカル間に形成され る不安定な結合）。さらに、この結合は、第四級アンモニウム基であるＬ’を用 いて形成することができ、この場合、好ましくは、固形支持体の表面が、負の電 荷を帯びた核酸主鎖に反発する負の電荷を有し、従って、質量分析計による分析 に必要とされる脱着を促進する。脱着は、レーザーパルスによって発生する熱に よって、及び／又は、Ｌ’に依存して、Ｌ’発色団と共鳴するレーザーエネルギ ーの特異的吸収によって起こすことができる。 例として、Ｌ−Ｌ’化学は、一種のジスルフィド結合型（例えば、メルカプト エタノールまたはジチオエリトロールによって化学的に開裂性である）、ビオチ ン／ストレプタビジン系、 緩酸条件下および質量分析条件下において開裂されるトリチルエーテル基のヘテ ロ二官能価誘導体（Ｋｏｓｔｅｒら、「Ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ａｃｉｄ−Ｌ ａｂｉｌｅ Ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎ ｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ ｔｅｒｓ ３１，７０９５（１９９０））、ヒドラジニウム／アセテート緩衝液 によるほぼ中性条件下において開裂されるレブリニル基、トリプシンのようなエ ンドペプチダーゼ酵素によって開裂されるアルギニン−アルギニンまたはリジン −リジン結合、またはポリホスファターゼによって開裂されるピロホスフェート 結合、またはＲＮＡｓｅまたはアルカリによって開裂されるデオキシヌクレオチ ド配列間のリボヌクレオチドであってもよい。 官能基ＬおよびＬ’は、電荷移動複合体から形成することもでき、それによっ て、一時的なＬ−Ｌ’結合を形成する。多くの場合、「電荷移動バンド」はＵＶ ／ｖｉｓ分光測定によって求めることができるので(例えば、Ｒ．Ｆｏｓｔｅｒ によるＯｒｇａｎｉｃ Ｃｈａｒｇｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｏｍｌｅｘｅｓ, Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ,１９６９を参照)、 レーザーエネルギーを電荷移動波長の対応するエネルギーに向けることができ、 従って、固形支持体からの特異的脱着を開始させることができる。当業者は、い くつかの組み合わせがこの目的を果たすことができ、ドナー官能基が固形支持体 上にあるか、または検出される核酸分子に結合しているか、またはその逆であっ てもよいことを理解するであろう。 さらに他の方法においては、可逆性Ｌ−Ｌ’結合が、ホモリシス的に形成され る比較的安定なラジカルによって形成される。レーザーパルスの影響下に、脱着 （前記に記載）およびイオン化がラジカルの位置において起こる。当業者は、他 の有機ラジカルを選択することができ、およびそれらの間の結合をホモリシス的 に開裂するのに必要な分離エネルギーに関して、対応するレーザー波長を選択す ることができることを理解するであろう（例えば、Ｃ．ＷｅｎｔｒｕｐによるＲ ｅａｃｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ． １９８４を参照）。 ＰＣＲ、ＬＲＣまたは転写増幅のような増幅工程の間に、適切なプライマーを 用いて、固定官能基Ｌ’を標的捕獲配列に組み込むこともできる。 ある種の適用に関しては、特定の捕獲核酸断片上（配列の１つのスポット上） の１つ以上の（突然変異）遺伝子座を同時に増幅および鎖終結するのが有用な場 合があり、または、種々の固形支持体上のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌク レオチド擬似配列を使用する平行処理を行うのが有用な場合もある。「マルチプ レクシング」は、配列自体（組成または長さ）によるか、またはプライマーオリ ゴヌクレオチドへの質量修飾官能基の導入のいずれかによって行うことができる 。そのようなマルチプレクシングは、質量分析ＤＮＡ配列決定または移動度修飾 ゲルに基づく蛍光配列決定との組み合わせにおいて、特に有効である。 本発明の範囲を限定するものではないが、質量および移動度修飾は、オリゴ− ／ポリエチレングルコール誘導体を使用することによって導入することができる 。オリゴ−／ポリエチレングルコールは、メチル、エチル、プロピル、イソプロ ピル、t−ブチル等のような低級アルキルによってモノアルキルすることもでき る。例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ 、Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、編集者 ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１に最近記載された他の化学物質を、質量修 飾化合物に使用することができる。 さらに他の実施態様において、オリゴ／ポリエチレングリコール以外の種々の 質量または移動度修飾官能基を、選択して適切な結合化学物質を介して結合させ ることができる。メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ヘキ シル、フェニル、置換フェニルまたはベンジルのような、種々のアルキル、アリ ール、またはアラルキル成分を用いて、単純な修飾を行うことができる。さらに 他の修飾が、ホモ−またはヘテロペプチドを、核酸分子（例えば、プライマー） またはヌクレオシド三燐酸に結合させることによって得られる。単純なオリゴア ミドを使用することもできる。前記に記載したもの以外に、他の多くの可能な方 法が、当業者によって行われる。 種々の質量または移動度修飾プライマーは、プライマー修飾サンガー配列ラダ ーの同時検出によって、マルチプレックス配列決定を可能にする。質量または移 動度修飾は、ヌクレオシド三燐酸または修飾プライマーによって、増幅工程の間 に組み込むことができる。 ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）のような、あ る種の検出手段と共に使用するために、検出可能な標識を、プライマー（一般に 、５’−末端における）、または鎖延長ヌクレオチドまたは鎖終結ヌクレオチド の１つにおいて、使用しなければならない。³²Ｐ、³³Ｐ、または³⁵Ｓのような放 射性同位体の使用は今なお、最も頻繁に使用されている技術である。ＰＡＧＥ後 に、ゲルがＸ線フィルムに曝露され、銀粒子曝露が分析される。 非放射性標識法が探求されており、近年、部分的に自動ＤＮＡ配列決定工程に 統合されている。すべてのこれらの改良は、サンガー配列決定法を利用している 。標識（例えば、蛍光色素）を、プライマーに付加することができる（Ｓｍｉｔ ｈら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１，６７４−６７９（１９８６）およびＥＰＯ特許第 ８７３００９９８．９号；Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ＥＰＯ出願 第０３５９２２５；Ａｎｓｏｒｇｅら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ１３ ，３２５−３２（１９８６））、または鎖終結ジデオキシヌ クレオシド三燐酸（Ｐｒｏｂｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８，３３６−４１（ １９８７）；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／ ０５０６０号）。プ ライマーまたはｄｄＮＴＰのいずれかの標識に基づいて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３５，Ｇ８９（１９８ ７）；ＵＳ特許第５７００９７３号および第６８９０１３号）、Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ（Ｐｒｏｂｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３８，３３６ −３４１（１９８７）；ＵＳ特許第８８１３７２号および第５７５６６号）、Ｐ ｈａｒａｍａｃｉａ−ＬＫＢ（Ａｎｓｏｒｇｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １５，４５９３−４６０２（１９８７）およびＥＭＢＬ特許出願ＤＥ Ｐ３７２４４４２号およびＰ３８０５８０８．１号）およびＨｉｔａｃｈｉ（Ｊ Ｐ第１−９０８４４号およびＤＥ第４０１ １９９１ Ａ１号）によって系が開 発されている。いくらか類似した方法が、Ｂｒｕｍｂａｕｇｈらによって開発さ れた（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５，５６１０−１４（１９８８ ）およびＵＳ特許第４７２９９４７号）。１レーンに対して２種の特異的標識を 有する２つの電気泳動レーンを用いるＤｕ Ｐｏｎｔ系の改良された方法が記載 されている（ＰＣＴ出願第ＷＯ９２／０２６３５号）。異なる方法は、蛍光によ って標識されたアビジンおよびビオチンで標識されたプ ライマーを使用する。ここにおいて、ビオチンで終結する配列ラダーが、電気泳 動の間に、標識されたアビジンと反応し、その結果、個々の配列バンドが検出さ れる（Ｂｒｕｍｂａｕｇｈら、米国特許第５９４６７６号）。 最近、酵素によって誘発され増幅される化学発光を用いる、ＤＮＡのためのよ り高感度の非放射性標識法が開発された（Ｂｅｃｋ，Ｏ’Ｋｅｅｆｅ，Ｃｏｕｌ ｌおよびＫｏｓｔｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １７，５１１５ −５１２３（１９８９）およびＢｅｃｋおよびＫｏｓｔｅｒ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅ ｍ． ６２，２２５８−２２７０（１９９０））。これらの標識法が、マルチプ レックスＤＮＡ配列決定（Ｃｈｕｒｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，１８５− １８８（１９８８）および直接吸収電気泳動（ＤＢＥ）（ＢｅｃｋおよびＰｏｈ ｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．，Ｖｏｌ．３：Ｐ２９０５−２９０９（１９８４））と組み 合わされて、高処理量ＤＮＡ配列決定を目的とする方法を提供した（Ｋｏｓｔｅ ｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒ．Ｎ ｏ．２４ ，３１８−３２１（１９９１）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａ ｈ，ＰＣＴ出願第ＷＯ９０／１５８８３号）。しかし、この方法は なお、自動化するのが非常に面倒で困難であるという欠点を有する。 自動配列において、レーザー励起による配列ゲル中の移動の間に、蛍光標識Ｄ ＮＡ断片が検出される。蛍光標識は、標識されたプライマーまたは鎖延長ヌクレ オチドを介して、配列決定反応の間に組み込まれる（Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．ら、Ｆｌ ｕｏｒｅ ｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄ ＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：６７４− ８９，１９８６）、（Ｋｎｉｇｈｔ，Ｐ．，Ａｕｔｏｍｅｔｅｄ ＤＮＡ ｓｅ ｑｕｅｎｃｅｒｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１０９５−９６，１９８ ８）。 複数の明確に標識されたプライマーを使用して、配列パターンを識別すること ができる。単一の終結反応に特異的な４つの異なる標識付けのなされた配列プラ イマー、例えば、蛍光色素および自動配列装置においてレーザー励起を用いるオ ンライン検出。８つの異なる標識付けのなされたプライマーの使用は、両方の鎖 からの配列パターンの識別を可能にする。両方の鎖から引き出された配列断片の 分離がなされる場合には、標識プライマーの代わりに、標識ｄｄＮＴＰを検出に 使用することもで きる。１つのビオチン標識プライマーを用いて、１つの鎖からの配列断片が、例 えば、ビオチン−ストレプタビジン被覆磁気ビーズによって単離されうる。ジゴ キシゲニン標識プライマーの場合には、免疫親和性クロマトグラフィーによって 、または固形支持体に結合している相補的オリゴヌクレオチドの場合には、親和 性クロマトグラフィーによって、単離することも可能である。 本発明の他の局面は、増幅された塩基特異性終結断片を、核酸鋳型から直接的 に発生させるキットに関する。そのようなキットは、前記反応体の組み合わせを 含む。例えば、１つの実施態様において、キットが、（ｉ）１組の鎖延長ヌクレ オチド；（ｉｉ）１組の鎖終結ヌクレオチド；および（ｉｉｉ）鎖終結ヌクレオ チドに対して比較的低い親和性を有する第一ＤＮＡポリメラーゼ；および（ｉｖ ）鎖終結ヌクレオチドに対して比較的高い親和性を有する第二ＤＮＡポリメラー ゼを含んで成ることができる。該キットは、捕獲／精製のための適切な固形支持 体、および緩衝剤、ならびに使用説明書をも含むことができる。 限定するものとして決して解釈すべきではない下記実施例によって、本発明が さらに例示される。全ての引例（文献、発行 特許、公開特許（Ｈ．Ｋｏｅｓｔｅｒによる国際特許公開第ＷＯ９４／１６１０ １号、発明の名称「ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ ｔｒｏｍｅｔｒｙ」；およびＨ．Ｋｏｓｔｅｒによる国際特許公開第ＷＯ９４／ ２１８２２号、発明の名称「ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｖｉａ Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｄｅｇｒａｄａ ｔｉｏｎ」を含む）、および同時係属中の特許出願（Ｈ．Ｋｏｅｓｔｅｒによる ＵＳ特許出願第０８／４０６１９９号、発明の名称「ＤＮＡ Ｄｉａｇｎｏｓｔ ｉｃｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」を含む）、 および同時係属出願の部分継続出願（公開または未公開）を含む）の内容は、参 照により本明細書に取り込まれる。 実施例１：直接的な核酸の増幅および配列決定物質および方法 細菌株およびプラスミド 大腸菌Ｋ１２菌株ＨＢ１０１およびＸＬ１−ブルー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を、１００ｇアンピシリン／ｍＬ（Ｂｉｎｏｔａｌ，Ｂ ａｙｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を補足したＬＢブロス（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．（１９ ７２）， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏ ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）中で増殖させた。配列決定に使用されたＤＮＡ鋳 型は、大腸菌のｒｒｎＢ遺伝子からの４００ＢＰ挿入によるｐ０Ｍ８誘導組換え プラスミド（Ｏｂｅｒｂａｕｍｅｒ，Ｉ．（１９８６）ｇｅｎｅ ４９：８１− ９１ １９８６）であった。プラスミドＤＮＡを、Ｄｉａｇｅｎプラミド精製チ ップス−１００（Ｄａｉｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製 した。 ＤＮＡ単離 Ｉｓｈ−ＨｏｒｏｗｉｃｚｓおよびＢｕｒｋｅの改良（Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉ ｃｚ，Ｄ．およびＢｕｒｋｅ，Ｊ．Ｆ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．９ ：２９８９−２９９８ １９８１）を加えて、ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ （Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．およびＤｏｌｙ，Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．７：１５１３−１５２３ １９７９）によって記載されている方法に よって、配列決定反応に使用されるＤＮＡ鋳型を単離した。 配列決定反応 制御配列決定反応を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，ＡｍｐｌｉＴａｑ ＦＳ キットプロトコルに従って行った。 組み合わせた核酸増幅および配列決定反応を、下記のように行った。塩基特異 性反応混合物（下記に記載のＡ，Ｃ，ＧおよびＴ）はそれぞれ、ｉ）ＤＮＡ鋳型 ；ｉｉ）ｄｄＮＴＰに対してそれぞれ異なる親和性を有する２種類の熱安定性Ｄ ＮＡポリメラーゼ；ｉｉｉ）ｄｄＮＴＰ；ｉｖ）４つの全てのｄＮＴＰ（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；それら一方が蛍光色素で 標識されている１対の配列特異性オリゴヌクレオチドプライマー；の緩衝溶液を 含有した。反応混合物をワックスで被覆した。 配列決定反応を下記のように行った。 Ａ−反応：１８ＭのｄｄＡＴＰ、各８０ＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、７−デアザ −ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰN５００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（２５℃においてｐＨ９． ０）、１ｐｍｏｌ ＪＯＥ色素プライマーを含有する２５ｍＭのＭｇＣｌ₂、熱 安定性ピロホスファターゼ、および１．６ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメ ラーゼ、ＦＳ。これに、前記のように製造したＤ ＮＡ鋳型５０ｎｇ（１ｌ）、１ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１ｌ）、およ び１０ｐｍｏｌの逆プライマー（０．５１）を、ピペットで添加した。 Ｃ−反応：４ １８ＭのｄｄＣＴＰ、各８０ＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、７−デ アザ−ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（２５℃においてｐＨ ９．０）、１ｐｍｏｌＦＡＭ色素プライマーを含有する２５ｍＭのＭｇＣｌ₂、 熱安定性ピロホスファターゼ、および１．６ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリ メラーゼ、ＦＳ。これに、５０ｎｇのＤＮＡ鋳型（１ｌ）、１ＵのＴａｑ ＤＮ Ａポリメラーゼ（１ｌ）、および１０ｐｍｏｌの逆プライマー（０．５１）を、 ピペットで添加した。 Ｇ−反応：８ １８ＭのｄｄＧＴＰ、各８０ＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、７−デ アザ−ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（２５℃においてｐＨ ９．０）、１ｐｍｏｌ ＴＡＭＲＡ色素プライマーを含有する２５ｍＭのＭｇＣ ｌ₂、熱安定性ピロホスファターゼ、および１．６ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮ Ａポリメラーゼ、ＦＳ。これに、５０ｎｇのＤＮＡ鋳型（１ｌ）、１ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１ｌ）、お よび１０ｐｍｏｌの逆プライマー（０．５１）を、ピペットで添加した。 Ｔ−反応： ８ １８ＭのｄｄＴＴＰ、各８０ＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、７− デアザ−ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（２５℃においてｐ Ｈ９．０）、１ｐｍｏｌ ＲＯＸ色素プライマーを含有する２５ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、熱安定性ピロホスファターゼ、および１.６ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポ リメラーゼ、ＦＳ。これに、５０ｎｇのＤＮＡ鋳型（１ｌ）、１ＵのＴａｑ Ｄ ＮＡポリメラーゼ（１ｌ）、および１０ｐｍｏｌの逆プライマー（０．５１）を 、ピペットで添加した。 培養条件は、４分９５℃の初期変性段階、それに続く、３０秒９５℃、３０秒 ５２℃、６０秒７２℃の１５サイクルを含んだ。この反応は、３０秒９５℃、３ ０秒５２℃、６０秒７２℃の追加の１５サイクルで完了する。 反応混合物をピペッティングよってワックスから分離し、エタノール沈殿させ た。試料を、自動ＡＢｌプリズムシークエンサー３７７型にかけた。結果 図１および図２から分かるように、組み合わせた増幅および 配列決定反応は、１５ｎｇの鋳型ＤＮＡによって４４０ＢＰを読み取れる配列を 生じたが（図１）、同量の鋳型ＤＮＡを使用し、標準サイクル配列プロトコルを 用いた場合には、配列データが得られなかった（図２）。 実施例２：直接的な核酸の増幅および配列決定 組み合わせた核酸増幅および配列決定反応を下記のように行った。反応は、ｉ ）ＤＮＡ鋳型；ｉｉ）ｄｄＮＴＰに対してそれぞれ異なる親和性を有する２種類 の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ；ｉｉｉ）色素標識ｄｄＮＴＰ；ｉｖ）４つの全 てのｄＮＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；そ れらのうち一方がビオチン基で標識されている１対の配列特異性オリゴヌクレオ チドプライマー；の緩衝溶液を含有した。 ２種類のＤＮＡポリメラーゼを用いる、組み合わされた増幅および配列決定プ ロトコル ４μＬの５ｘＴＡＣＳ緩衝液、０．５μＬの各色素ｄｄＮＴＰ溶液、１μＬの ｄＮＴＰミックス（５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよび１０ｍＭのＮ⁷ デアザｄＧＴＰ）、１μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ ＦＳ、０．７５Ｕ（０．３μ Ｌ）の（エキソー）Ｐｆｕ ポリメラーゼ、および各４０ｐｍｏｌの標準 Ｍ１３プライマー（配列に関しては、前記参照）を、最終容量２０μＬになるま で添加することによって、４ｎｇ（１μＬ）のｐ９Ｇ５５１Ｄ（ヒト突然変異Ｃ ＦＴＲ遺伝子からの４１９ＢＰ挿入物を有するｐＵＣ誘導体）を配列決定させた 。サイクルプロフィールは、４分間９５℃の１サイクル、４５秒間９５℃、４５ 秒間５２℃、および４５秒間７２℃の２０サイクル、それに続く、５０秒間９６ ℃６０秒間５５℃、および４分間６０℃の２８サイクルから構成された。反応を 、加熱蓋付きのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ５３３０を使 用して行った。 前向きおよび逆向き配列断片の分離 該反応を、３００μｇの予洗ストレプタビジンＭ−２８０ Ｄｙｎａｂｅａｄ ｓ（Ｄｙｎａｌ）を含有する同容量の２ｘＢ／Ｗ緩衝液（１０ｍＭ トリス−Ｈ Ｃｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌ）と混合した。室温で３０ 分間培養後、ビーズを５０μＬの１ｘＢ／Ｗ緩衝液で２回洗浄して、望ましくな い反応成分および非組み込み色素ターミネーターを除去した。 逆向き配列生成物を、２０μＬの２０％水酸化アンモニウム 水溶液（新たに調製）の添加および室温で２分間のインキュベーションによって 、固定化ビオチニル化前向き配列生成物から回収した。この工程を１回繰り返し 、生成物をためた。 次にビーズを２０μＬの２５％水酸化アンモニウム水溶液を用いて室温で１時 間洗浄し、上澄みを捨てた。 前向き配列決定反応液を、３０μＬの２５％水酸化アンモニウム水溶液を用い て６０℃で８分間インキュベートして、ビーズから除去した。この工程を１回繰 り返し、生成物をためた。 分離した前向きおよび逆向き配列決定反応液をそれぞれ最終的に、２０μＬの エタノールを水酸化アンモニウム溶液に加えることによって沈殿させ、４μＬ充 填色素（５：１の割合の、脱イオンホルムアミド：２５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８ ．０）／５０ｍｇ／ｍｌ ブルーデキストラン）に懸濁し、ＡＢＩプリズムシー クエンサー（３７７型）で分析した。結果 図４および図５は、同時増幅および配列決定反応において発生する前向き（図 ４）および逆向き（図５）配列ラダーの、蛍光クロマトグラムプロットを示す。 この実験において、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＦＳおよび４ｎｇのみのプラスミドＤＮ Ａ、ビオ チニル化前向きプライマーおよび逆向きプライマーを含有する色素ターミネータ ーサイクル配列決定混合物に、１．５単位のＴａｑポリメラーゼが添加された。 サイクル反応後、ビオチニル化前向き配列生成物、および前向き鋳型にハイブリ ダイズされた逆向き生成物か、ストレプタビジン被覆磁気ビーズ上に固定化され た。逆向きおよび前向き配列ラーダーの分離が、水酸化アンモニウムを用いるビ ーズのインキュベーションによって行われた。水酸化アンモニウムが、室温にお いて二本鎖ＤＮＡの変性剤として作用し、従って、溶液中の逆向き配列生成物を 放出した。ビオチニル化生成物はストレプタビジンに結合したままにされ、一方 、逆向き生成物は上澄みと共に除去される。ビオチニル化生成物の回収は、６０ ℃の培養温度において水酸化アンモニウムを用いて行われた。高温において、水 酸化アンモニウムは、ストレプタビジン−ビオチン相互作用の変性剤として作用 した。次に、このようにして分離された配列ラダーをエタノール沈殿させ、ＡＢ Ｉプリズムシークエンサーで別々に分析した。同等物 当業者は、本明細書に記載されている特定の方法に関して多く の同等物を認識し、単なる通常実験を用いて確認することができるであろう。そ のような同等物は、本発明の範囲内であり、下記の、請求の範囲に含まれるもの と見なされる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 ルペルト，アンドレアス ドイツ国、デー―35440、リンデン、ハウ プトシユトラーセ・10

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 核酸鋳型から、増幅され鎖終結された核酸分子を得るためのキットであっ て、該キットが、ｉ）適切な量の１組の鎖延長ヌクレオチド、ｉｉ）適切な量の 少なくとも１つの鎖終結ヌクレオチド、ｉｉｉ）少なくとも１つの鎖終結ヌクレ オチドに対して比較的低い親和性を有する適切な量の第一ポリメラーゼ、および ｉｖ）少なくとも１つの鎖終結ヌクレオチドに対して比較的高い親和性を有する 適切な量の第二ポリメラーゼ、を含んで成るキット。 ２． プライマーを開裂する制限酵素をさらに含んで成る請求項１に記載のキッ ト。 ３． 第一および第二ポリメラーゼが、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである請求 項１に記載のキット。 ４． 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ａｍｐｌ ｉＴａｑ ＦＳ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ^-）ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ^-）ＤＮＡポ リメラーゼおよびＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ｅｘｏ（−）Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕ ｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ｕｌｔｍａｎ、９ ｄｅ ｇｒｅｅ Ｎｍ、Ｔｔｈ、Ｈｏｔ Ｔｕｂ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏ ｓｕｓ（Ｐｆｕ）、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）ＤＮ Ａポリメラーゼ、から成る群から選択される請求項３に記載のキット。 ５． １組の鎖延長ヌクレオチドが、ｉ）少なくとも１つのデオキシアデノシン 三燐酸、ｉｉ）少なくとも１つのデオキシグアノシン三燐酸、ｉｉｉ）少なくと も１つのデオキシシチジン三燐酸、およびｉｖ）少なくとも１つのチミジン三燐 酸、から成る群から選択される請求項１に記載のキット。 ６． デオキシアデノシン及び／又はデオキシグアノシンがＮ７−またはＮ９− デアザプリンヌクレオチドである請求項５に記載のキット。 ７． 鎖終結ヌクレオチドが、２’，３’−ジデオキシアデノシン三燐酸、２’ ，３’−ジデオキシグアノシン三燐酸、２’，３’−ジデオキシシチジン三燐酸 、２’，３’−ジデオキシチミジン三燐酸、から成る群から選択される請求項１ に記載のキ ット。 ８． 少なくとも１つのプライマーをさらに含んで成る請求項１に記載のキット 。 ９． プライマーが固形支持体に結合される請求項８に記載のキット。 １０． 固形支持体が、ビーズ、毛細管、平らな支持体、膜、およびウェハから 成る群から選択される請求項９に記載のキット。 １１． プライマーが制限部位またはリボヌクレオチドを含有する請求項９に記 載のキット。 １２． プライマーが重量修飾される請求項８に記載のキット。 １３． プライマーが移動度修飾される請求項８に記載のキット。 １４． 少なくとも１つのｄｄＮＴＰが重量修飾される請求項７に記載のキツト 。 １５． 校正ＤＮＡポリメラーゼをさらに含んで成る請求項１に記載のキット。 １６． 逆転写酵素をさらに含んで成る請求項１に記載のキット。 １７． 一本鎖核酸分子を同時に増幅および配列決定する方法であって、該方法 が、 ａ）一本鎖核酸分子を、（ｉ）鋳型にハイブリダイズすることができる少なく とも１つのプライマー、（ｉｉ）１組の鎖延長ヌクレオチド、（ｉｉｉ）少なく とも１つの鎖終結ヌクレオチド、（ｉｖ）鎖終結ヌクレオチドに対して比較的低 い親和性を有する第−ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｖ）鎖終結ヌクレオチドに 対して比較的高い親和性を有する第二ＤＮＡポリメラーゼと接触させ、そうする ことによって、第一ポリメラーゼによる重合が増幅を生じ、および第二ポリメラ ーゼによる重合が鎖終結断片の形成を生じ； ｂ）適切な検出手段によって鎖終結断片を検出し；および ｃ）移動度または分子量によって断片を整列して、ＤＮＡ鋳型の配列を決定す る； 工程を含んで成る方法。 １８． 第一および第二ポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである請求 項１７に記載の方法。 １９． １組の鎖延長ヌクレオチドが、ｉ）少なくとも１つのデオキシアデノシ ン三燐酸、ｉｉ）少なくとも１つのデオキシ グアノシン三燐酸、ｉｉｉ）少なくとも１つのデオキシシチジン三燐酸、および ｉｖ）少なくとも１つのチミジン三燐酸、から成る群から選択される請求項１２ に記載の方法。 ２０． デオキシアデノシン及び／又はデオキシグアノシンが、Ｎ７−またはＮ ９−デアザプリンヌクレオチドである請求項１９に記載の方法。 ２１． 鎖終結ヌクレオチドが、２’，３’−ジデオキシアデノシン三燐酸、２ ’，３’−ジデオキシグアノシン三燐酸、２’，３’−ジデオキシシチジン三燐 酸、２’，３’−ジデオキシチミジン三燐酸、から成る群から選択される請求項 １７に記載の方法。 ２２． 検出手段が、測色法、蛍光測定法、化学発光、放射能、および質量分析 法から成る群から選択される視覚化手段との組み合わせにおける、ポリアクリル アミドゲル電気泳動、毛細管ゾーン電気泳動、および質量分析法、から成る群か ら選択される分離手段である請求項１７に記載の方法。 ２３． 検出手段が質量分析法である請求項１７に記載の方法。 ２４． 質量分析法が、マトリックス補助レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ） 、電気スプレー（ＥＳ）、イオンスプレー、 サーモスプレー、および塊状クラスターインパクトから成る群から選択されるイ オン源を用いて行われ；および、検出フォーマットが、フライト時間、四極子、 磁気セクター、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴、およびイオントラップ から成る群から選択される請求項２３に記載の方法。 ２５． 二本鎖ＤＮＡ分子が、逆転写酵素を用いてＲＮＡから合成される請求項 １７に記載の方法。 ２６． プライマーが固形支持体に結合される請求項１７に記載の方法。 ２７． 固形支持体が、ビーズ、毛細管、平らな支持体、膜、およびウェハから 成る群から選択される請求項２６に記載の方法。 ２８． プライマーが制限部位またはリボヌクレオチドを含有する請求項２６に 記載の方法。 ２９． プライマーが重量修飾される請求項２６に記載の方法。 ３０． プライマーが移動度修飾される請求項２６に記載の方法。 ３１． 少なくとも１つのｄｄＮＴＰが重量修飾される請求項２６に記載の方法 。 ３２． 校正ＤＮＡポリメラーゼをさらに含んで成る請求項１７に記載の方法。 ３３． 核酸分子を同時に増殖し配列決定する方法であって、該方法が、 ａ）二本鎖ＤＮＡ分子を適切な温度において適切な時間で変性させて、２つの 相補的一本鎖ＤＮＡ分子を得； ｂ）少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡ分子を、適切な温度において適切な時間で 、相補的プライマーと接触させて、少なくとも１つのプライマー含有一本鎖ＤＮ Ａ分子を得； ｃ）少なくとも１つのプライマー含有一本鎖ＤＮＡ分子を、適切な温度におい て適切な時間で、（ｉ）１組の鎖延長ヌクレオチド、（ｉｉ）少なくとも１つの 鎖終結ヌクレオチド、（ｉｉｉ）鎖終結ヌクレオチドに対して比較的低い親和性 を有する第一ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｉｖ）鎖終結ヌクレオチドに対して 比較的高い親和性を有する第二ＤＮＡポリメラーゼと接触させ、そうすることに よって、第一ポリメラーゼによる重合が増幅を生じ、および第二ポリメラーゼに よる重合が鎖終結断片の形成を生じ； ｄ）ａ）〜ｃ）の工程を適切な回数繰り返して、検出のため に充分な量の鎖終結断片を得；および ｅ）鎖終結断片を適切な検出手段によって検出し、分子量によって断片を整列 して、ＤＮＡ鋳型の配列を決定する 工程を含んで成る方法。 ３４． 第一および第二ポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである請求 項３３に記載の方法。 ３５． １組の鎖延長ヌクレオチドが、ｉ）少なくとも１つのデオキシアデノシ ン三燐酸、ｉｉ）少なくとも１つのデオキシグアノシン三燐酸、ｉｉｉ）少なく とも１つのデオキシシチジン三燐酸、およびｉｖ）少なくとも１つのチミジン三 燐酸、から成る群から選択される請求項３３に記載の方法。 ３６． デオキシアデノシン及び／又はデオキシグアノシンが、Ｎ７−またはＮ ９−デアザプリンヌクレオチドである請求項３５に記載の方法。 ３７． 鎖終結ヌクレオチドが、２’，３’−ジデオキシアデノシン三燐酸、２ ’，３’−ジデオキシグアノシン三燐酸、２’，３’−ジデオキシシチジン三燐 酸、２’，３’−ジデオキシチミジン三燐酸、から成る群から選択される請求項 ３３に記載の方法。 ３８． 検出手段が、測色法、蛍光測定法、化学発光、放射能、および質量分析 法から成る群から選択される視覚化手段との組み合わせにおける、ポリアクリル アミドゲル電気泳動、毛細管ゾーン電気泳動、および質量分析法、から成る群か ら選択される分離手段である請求項３３に記載の方法。 ３９． 検出手段が質量分析法である請求項３３に記載の方法。 ４０． 質量分析法が、マトリックス補助レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ） 、電気スプレー（ＥＳ）、イオンスプレー、サーモスプレー、および塊状クラス ターインパクトから成る群から選択されるイオン源を用いて行われ；および、検 出フォーマットが、フライト時間、四極子、磁気セクター、フーリエ変換イオン サイクロトロン共鳴、およびイオントラップから成る群から選択される請求項３ ９に記載の方法。 ４１． 二本鎖ＤＮＡ分子が、逆転写酵素を用いてＲＮＡから合成される請求項 ３３に記載の方法。 ４２． プライマーが固形支持体に結合される請求項３３に記載の方法。 ４３． 固形支持体が、ビーズ、毛細管、平らな支持体、膜、およびウェハから 成る群から選択される請求項４２に記載の方 法。 ４４． プライマーが制限またはリボヌクレオチドを含有する請求項３３に記載 の方法。 ４５． プライマーが重量修飾される請求項３３に記載の方法。 ４６． プライマーが移動度修飾される請求項３３に記載の方法。 ４７． ｄｄＮＴＰが重量修飾される請求項３３に記載の方法。 ４８． 校正ＤＮＡポリメラーゼをさらに含んで成る請求項３３に記載の方法。