JPH09512015A - セルトーリ細胞および同種移植片または異種移植片を用いる疾患処置方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、哺乳動物にセルトーリ細胞および生物学的因子を産生する細胞を投与することを特徴とする生物学的因子の欠損に起因する疾患の処置方法、特に、ランゲルハンス膵島細胞と組み合わせてセルトーリ細胞を移植して免疫学的に特別免除された部位を創設する糖尿病の処置方法、さらに、哺乳動物に細胞移植物の免疫学的に特別免除された部位の創設方法に関する。セルトーリ細胞および生物学的因子を産生する細胞を含む医薬組成物をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 セルトーリ細胞および同種移植片または異種移植片を用いる疾患処置方法 発明の関連分野 健康な臓器または細胞の疾病患者への移植はしばしば外来の組織または細胞の ために起こる免疫応答により身体により拒絶される。本発明は免疫学的に特別免 除された部位を創設すること、すなわち、従来の移植治療に伴う拒絶反応を軽減 する細胞の移植方法を提供する。具体的には、哺乳動物のセルトーリ細胞および 生物学的因子を産生する細胞を投与することを含む生物学的因子の欠如により生 起する疾患の処置方法に関する。特に、本発明は免疫学的に特別免除された部位 を創設するセルトーリ細胞と共同してランゲルハンス島の膵島細胞を移植するこ とによって糖尿病を処置する方法に関する。さらに、本発明は細胞移植に関して 哺乳動物に免疫学的に特別免除された部位を創設する方法に関する。本発明はま た、セルトーリ細胞および生物学的因子を産生する細胞を含む医薬組成物を提供 する。 発明の背景 ある種の慢性疾患は冒された臓器の機能的細胞を破壊する。このような罹患哺 乳動物はしばしばホメオスタシスの維持に必要なタンパク質またはホルモンの産 生が不可能であり、通常、生存のために種々の外因性物質を必要とする。このよ うな疾病哺乳動物に健康な臓器または細胞を移植することは哺乳動物の生命の維 持に必要である。この種の治療は一般にそうでなければ死に至る症状を治療する ための最後の選択手段であると見なされている。しかしながら、このような移植 はしばしば外来の組織または細胞のために起こる免疫応答により身体により拒絶 される。現在、この免疫反応に対して防御する唯一頼みの綱は慢性的に非特異的 免疫抑制剤を投与することである。不幸にも、これは慢性疾患の合併症を免疫抑 制剤によって起こされた他の合併症と交換するだけのことである。医者が臓器お よび／または細胞移植で治療しようと試みたが殆ど成功しなかった疾患が糖尿病 である。糖尿病は哺乳動物に広く蔓延している変性疾患である。糖尿病は膵臓の ランゲルハンス島内のベータ細胞によるインスリン分泌の相対的または完全欠失 また欠陥性インスリン受容体を特徴とする。 このインスリン不足は血糖値の正常な制御を妨げ、しばしば高血糖症またはケ トアシドーシスをもたらす。インスリンは、哺乳動物に投与されたとき、グルコ ースの利用、タンパク質合成、中性脂質の形成および貯蔵およびある種の細胞の 成長を促進する。 合衆国内だけでも約１３００万人の糖尿病患者が存在する。このうち、２６０ 万人はインスリン依存性糖尿病患者である（Drug & Market Dev.，4:210(1994) ）。健康管理評論家は糖尿病は１年当たり医療経費および生産性損失は９２０億 ドルになると推定している。 種々の形態の糖尿病が国立保健研究所の全国糖尿病データグループによって開 発された一連の種類に分類体系化されている。この分類体系によるＩ型糖尿病は ケトン症を予防するためのインスリン依存性患者である。この群の糖尿病患者は 以前は若年性突発性糖尿病、不安定性糖尿病またはケトン症性糖尿病と称されて いた。Ｉ型糖尿病はベータ細胞の完全な破壊を起こす自己免疫反応により発症す る。 II型糖尿病は成人期発症糖尿病として分類される。この糖尿病患者はインスリ ン依存性または非依存性である。II型糖尿病は種々の要因により発症する。II型 糖尿病の哺乳動物患者では、ベータ膵島細胞のインスリン分泌に欠陥がある。 現在糖尿病治療に用いられる治療法は数多くあるが、いずれも限界がある。多 くの真性糖尿病患者の直面する主な問題は現在用いられている治療法が疾病過程 における合併症を防げないことである。哺乳動物のＩ型糖尿病患者の最も普通の 治療法は、ブタ、ウシまたはヒトのインスリンなどのインスリンの内因性源を供 給することである。インスリン注射治療は重篤な高血糖症およびケトアシドーシ スを予防するが、しかし、完全には血糖値を正常化しない。さらに、この治療法 は、未熟血管の劣化を含む疾病過程の合併症を防ぎ得ない。未熟血管劣化は糖尿 病患者の死亡の主な原因である。なおまた、長期の糖尿病から起こる合併症は腎 不全、網膜劣化、狭心症、動脈硬化症、心筋梗塞および末梢神経障害である。 糖尿病の第２の治療法は慢性的な非特異的免疫抑制剤の投与を伴う膵臓移植に よるものである。この治療法は通常腎不全などを併発している進行した糖尿病患 者に行われる。腎臓の全移植は１年間の生存率が約７５％で成功のうちに行われ 得るが、膵臓の外科的移植は非常に困難である。さらに、臓器全体を供与されな ければならないから、唯一の利用源は死亡ドナーである。さらに、臓器移植者の 最も普通に投与される免疫抑制剤であるシクロスポリンは免疫反応を抑制するの に十分な量が投与されたとき、この薬物は膵臓細胞の機能を阻害する。さらに、 臓器移植者にしばしば投与されるこのステロイド類は患者を糖尿病にしてしまう 。 第３の治療法は糖尿病患者にランゲルハンス膵島細胞の移植である。しかし、 この膵島移植は膵島移植用組織切片のひどい免疫拒絶反応により一般に成功しな い（Gray，1991，Immunology Letters，29:153; Jung et al.，1990，Seminars in Surgical Oncology 6:122）。特に、切除された膵臓の膵島細胞のうまくいく 移植は非常に困難で、移植後の細胞の臓器拒絶反応を防止するのに必要な免疫抑 制剤の慢性的投与により達成される。これらの免疫抑制剤の投与量は感染症、高 血圧、腎不全および腫瘍形成の危険性を増大させる。さらに、多くの臓器移植と 異なり、膵島細胞は移植患者に移植後、細胞が生き残るために患者自身が血液供 給するようにならなければならない。従前の移植技術は新規の血管の産生を刺激 するのに必要な因子を供給し得ない。 本発明は元気な臓器の機能的細胞を破壊する慢性疾患の現在の治療法に関連す る多くの問題を緩和するものである。特に本発明は糖尿病の哺乳動物に膵島細胞 を移植することによって移植細胞が糖尿病の哺乳動物中にインスリンを産生させ る方法を提供することによって真性糖尿病従来の治療法に関連する問題を解決す るものである。本発明者はすでに精巣における膵島細胞同種移植片および異種移 植片の長期の機能的生存を示した（Selawry et al，1989，Diabetes 38:220）。 本発明によって、驚くべきことに、哺乳動物の非精巣部位にセルトーリ細胞を移 植することによって、哺乳動物に免疫学的に特別免除された部位が創設されるこ とが判明した。新規に創設された免疫学的に特別免除された部位は疾患、特に糖 尿病の処置に有用な生物学的因子を産生する細胞の移植および生存を可能にする ものである。 発明の概要 本発明は、セルトーリ細胞および生物学的因子を産生する細胞を投与すること を含む哺乳動物の生物学的因子の欠損に起因する疾患の処置方法に関する。好ま しい具体例において、生物学的因子はホルモンである。 より好ましい具体例において、疾患は真性糖尿病であり、因子を産生する細胞 は膵島細胞であり、因子はインスリンである。 さらに、他の好ましい具体例において、生物学的因子を産生する細胞は、遺伝 子工学的、例えば、生物学的因子を発現する核酸の形質転換により産生された細 胞である。 本発明はさらに、膵島細胞およびセルトーリ細胞を投与することを含む哺乳動 物の真性糖尿病の処置方法に関する。好ましい具体例において、セルトーリ細胞 および膵島細胞は移植によって投与される。 本発明の別の態様は、哺乳動物に免疫学的に特別免除された部位を創設する方 法に関する。 本発明のさらに別の具体例は、セルトーリ細胞および生物学的因子を産生する 細胞を含む医薬組成物を提供する。より好ましい具体例において、医薬組成物は セルトーリ細胞およびランゲルハンス膵島細胞および医薬的に許容され得る添加 物を含む。 本発明はさらに、セルトーリ細胞および生物学的因子を含む区画化されたキッ トを提供する。包装材料およびその包装材料内に含まれるセルトーリ細胞を含む 製品部材もまた提供する。 図面の簡単な説明 図１は、サルの「ラッキー」に行われた膵切開前（ラッキー−前）；膵切開後 移植前（ラッキー−後）；および移植後（各１４３日、７３０日および９３０日 ）の間隔での経口サスタカル（sustacal）耐性試験に対するグルコース応答を示 す。 図２は、図１に示されたと同じ時における経口サスタカル（sustacal）耐性試 験に対するＣ−ペプチド応答を示す。 図３は、サル「オスカー」における経口サスタカル耐性試験に対するグルコー ス応答を示す。 図４は、図３に示された同じ時における同じ動物のＣ−ペプチド応答を示す。 図５ａおよび図５ｂは、特発性糖尿病ＢＢ／Ｗor dpラットにおける経口投与 グルコースに対する血漿グルコース値およびインスリン応答に対する精巣内膵島 移植片の効果を示す。図５ａは、３群のラットにおける５０％グルコース溶液の ２g／kg経口投与グルコース投与に対する血漿グルコース（mg／dl）濃度を示す ：未処置対照スプラーグドーリー、移植糖尿病ＢＢ／Ｗor dpラットおよびイン スリン処置糖尿病ＢＢ／Ｗor dpラット。図５ｂは、未処置対照スプラーグドー リーおよび移植ＢＢ／Ｗor dpラットにおける同投与量の経口投与グルコースに 対する血清インスリン値を示す。 図６ａおよび６ｂは、特発性糖尿病ＢＢ／Ｗor dpラットにおける経口投与グ ルコースおよびグルコース＋グリピジドの組み合わせに対する血漿グルカゴン分 泌応答に対する精巣内膵島移植片の効果を示す。図６ａは、３群のラットにおけ る５０％グルコース溶液の２g／kg経口グルコース投与に対する血漿グルカゴン 応答を示す：未処置対照スプラーグドーリー、移植糖尿病ＢＢ／Ｗor dpラット およびインスリン処置糖尿病ＢＢ／Ｗor dpラット。図６ｂは、３群のラットに おけるグリピジド７mg／kgおよび５０％グルコース溶液の２g／kg経口グルコー ス投与に対する、投与３０分後の血漿グルカゴン応答を示す：未処置対照スプラ ーグドーリー、移植糖尿病ＢＢ／Ｗor dpラットおよびインスリン処置糖尿病Ｂ Ｂ／Ｗor dpラット。データは各群ラット８匹の平均値±ＳＥを示している。 図７は、糖尿病ラットの腎嚢下腔(renal subcapsular space)中へ移植された ランゲルハンスの膵島およびラットから分離のセルトーリ細胞の光学顕微鏡写真 である。 図８は、移植膵島内の各細胞の電子顕微鏡写真である。 図９は、図７中に「Ｓ」で標識された膵島外細胞の微細構造の電子顕微鏡写真 である。 図１０は、移植雌ラット７匹の１日当たりの尿産生量に対する腎嚢下への子ブ タ膵島およびセルトーリ細胞の移植の効果を示す。各棒線は移植１０日間の１日 当たりの平均尿産生量を表している。 図１１は、ラット３匹の５０日間の１日当たりの平均尿量に対する皮下への子 ブタ膵島およびセルトーリ細胞の移植の効果を示す。 図１２は、糖尿病ラットの腎嚢下腔中へ移植された子ブタのランゲルハンス膵 島およびラットセルトーリ細胞の光学顕微鏡写真である。ＩＬは、腎嚢(renal c apsule)（Ｋ）下の小リンパ球の侵潤によって囲まれたベータ細胞（ＩＬ）の膵 島の存在を示す；Ｂ（上左）は、膵島がベータ細胞からなることを示すより高い 拡大図であり、Ｂ（下右）は、ベータ細胞が特徴的なインスリン顆粒を含むこと を示している。 発明の詳細な説明 本発明は哺乳動物のセルトーリ細胞および生物学的因子を産生する細胞を投与 することを含む哺乳動物の生物学的因子の欠損に起因する疾患の処置方法に関す る。本発明に定義されているように、生物学的因子を産生する、細胞の代謝また はホメオスタシスに必要なタンパク質または非タンパク質化合物である。好まし い具体例において、生物学的因子とはホルモンである。本発明に記載の方法を用 いて投与され得るホルモン産生細胞は、例えば、ランゲルハンスの膵島、下垂体 、肝臓、上皮小体および甲状腺細胞である。 本発明によれば、セルトーリ細胞および生物学的因子を産生する細胞は処置さ れるべき哺乳動物と同じ種からのものでも、異なる種からのものでもよい。さら に、セルトーリ細胞および生物学的因子を産生する細胞は同一の種から誘導され る必要はない。本発明によって、ブタからのセルトーリ細胞およびブタからのラ ンゲルハンス膵島がラットの真性糖尿病の処置に有効であることが判明した。好 ましい具体例において、セルトーリ細胞はウシ、ブタまたはヒトのものである。 本発明で用いられ雄精巣に豊富な細胞であるセルトーリ細胞は、通常の技術を 用いて、ライデッヒ細胞、周細管性細胞、生殖細胞などの他の精巣の細胞から分 離され得る。例えば、最初、去勢されていない雄ブタ、雄ヒツジなどの雄の哺乳 動物の精巣が去勢によって収集される。ついで、精巣は数片に細断され、ついで 、遠心洗浄される。 精巣のライデッヒ細胞はトリプシンおよびＤＮアーゼなどの消化剤を用いて組 織懸濁液から分離され得る。ついで、残部の細胞懸濁液は数回遠心洗浄される。 ペレットをコラゲナーゼ中に再懸濁し、インキュベートし、遠心洗浄し、精巣内 の周細管細胞を除去する。精巣の生殖細胞はヒアウロニダーゼおよびＤＮアーゼ とペレットをインキュベートすることによって除去する。数回遠心洗浄した後、 セルトーリ細胞が集められ、本発明の方法を用いて移植される。 本発明の方法によれば、生物学的因子は疾病状態で存在しないか、欠損してい るかまたは変化しているタンパク質または非タンパク質化合物である。生物学的 因子を産生する細胞は、例えば、第１に哺乳動物から因子を産生する組織を外科 的に除去することによって得られる。ついで、この組織は細断され、通常の技術 を用いて消化される。例えば、組織はコラゲナーゼ消化を用いて消化される。つ いで、特定の因子産生細胞は、フィコル勾配などの分離勾配を用いて消化混合物 から集められ得る。ついで、因子産生細胞は通常の技術を用いて血清中の組織培 養物中で成長させる。因子産生細胞は組織培養物中でセルトーリ細胞とともに共 培養し得る。組織培養物中で成長させた細胞は本発明の方法を用いてセルトーリ 細胞とともに哺乳動物中に移植され得る。本発明の方法によれば、因子産生細胞 は、後の移植のための組織培養物中での成長前の細胞を凍結保存するなどの種々 の通常の技術を用いて貯蔵し得る。本発明において、膵島細胞などの因子産生細 胞とともに共培養されるセルトーリ細胞は組織培養物中の因子産生細胞の増殖お よび回収率を高め、特に、あらかじめ凍結保存などの技術を用いて貯蔵した因子 産生細胞の回収率および増殖を増大させる。 好ましい態様では、この因子はホルモンであり、ホルモン産生細胞は既述のご とく組織資源から単離される。例えば、インスリン産生細胞は膵臓から単離され る。別の好ましい態様では、該因子産生細胞は、目的の因子を発現することがで きる核酸で適切な宿主細胞を形質転換することによって得られる。形質転換細胞 は当業者に知られた方法によって得られ、Sambrookらの（1989）、Molecular Cl oning: A Laboratory Mammal，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring ，New York を含む数多くの教科書や実験哺乳動物にみることができる。必要で あれば、目的の因子をコードしている核酸を当業者に知られた方法に応用し、形 質転換細胞から該分子を分泌させることができる。本発明の方法によれば、セル トーリ細胞を該因子産生細胞と一緒に用い、処理された哺乳動物に免疫学的に特 別免除された部位を作り出すことができる。 哺乳動物への因子産生細胞とセルトーリ細胞の投与は通常の技術によって達成 される。好ましい態様では、投与は移植によって行われ、因子産生細胞は、哺乳 動物にセルトーリ細胞を注射するのと同時にかまたは注射した直後に同じ部位に 投与される。本発明によれば、因子産生細胞とセルトーリ細胞を移植した後に、 移植細胞が治療的有効量の生物学的因子を産生するまで、外因性生物学的因子を 投与してよい。例えば、糖尿病を治療するために、膵臓の膵島細胞とセルトーリ 細胞を移植した後に、移植した膵島細胞が治療的有効量のインスリンを産生する までインスリンを投与してよい。 本発明のセルトーリ細胞と因子産生細胞は、所望の部位を外科的に露出させた 後に非経口的投与または皮下投与のような哺乳動物内に細胞を導入することがで きるあらゆる技術を用いて移植することができる。移植を行う前に、通常の技術 に従った局所もしくは全身麻酔によって受容哺乳動物を麻酔する。好ましい態様 では、処理される哺乳動物はヒトである。別の態様では、本発明の疾病の治療方 法には、さらに、例えばシクロスポリン、タクロリマス、デスパーグアリンやモ ノクローナル抗体（例えばＴ細胞に対する）を投与することが含まれる。好まし い態様では、免疫抑制性物質はサイクロスポリンである。別の好ましい態様では 、シクロスポリンは０.５mg〜２００mg／kg体重の用量で投与される。最も好ま しい態様では、シクロスポリンは５mg〜４０mg／kg体重の用量で投与される。 本発明は、セルトーリ細胞と因子産生細胞を投与することにより、処理された 哺乳動物に免疫学的に特に免除された部位が作り出されることを開示するもので ある。本発明で定義している免疫学的に特別免除された部位とは、移植された細 胞によって生じる免疫反応がセルトーリ細胞の産生する免疫抑制物質によって抑 制される、哺乳動物の部位をいう。免疫学的に特別免除された部位は、互いにき わめて近接した中に移植された細胞を保つための密な組織および移植細胞に栄養 を与えるために利用できる血液供給を特徴とする。本発明によって定義される免 疫学的に特別免除された部位の例には、腎嚢下腔、皮下筋膜(facie)、脳および 肝門脈が含まれる。 本発明によって、セルトーリ細胞は移植された因子産生細胞の移植部位におけ る血管新生率を増加させることが示された。したがって、セルトーリ細胞（すな わち、セルトーリ細胞によって産生される関連物質）は移植された細胞（例えば 、膵島細胞）の血管新生率の増加を促すことが示されている。 好ましい態様において、本発明は、ランゲルハンス島をセルトーリ細胞ととも に移植し、免疫学的に特に免除された部位を創設することによって、糖尿病を治 療する方法を開示するものである。本発明に使用する同種移植とは、同じ動物種 の遺伝学的に異なる２哺乳動物間で組織や細胞を移入することをいう。本発明に おいて、異種移植なる語は、異なる動物種の２哺乳動物間で組織や細胞を移入す ることをいう。 本発明の方法を用いて移植されるランゲルハンス膵島細胞とセルトーリ細胞は 、あらゆる数多くの通常の技術を用いて調製することができる。例えば、ランゲ ルハンス膵島細胞は、同一動物種の多くの哺乳動物の膵臓から調製することがで きる。膵臓を一緒にプールし、細切し、コラゲナーゼで消化する。ランゲルハン ス膵島細胞は、さらに通常のグラジエントを用いて単離することができる。単離 された膵島細胞を培養物中で増殖させ、次いでセルトーリ細胞とともに移植して 免疫学的に特に免除された部位を作り出すことができる。 本発明の方法に用い るセルトーリ細胞は哺乳動物の雄の精巣から単離することができる。膵島細胞を 回収するには、まず最初に精巣を小片に細切し、遠心洗浄する。粗混合物中に存 在するライデッヒ細胞は、トリプシンやＤＮアーゼのような消化剤を用いて組織 懸濁液から除去することができる。次に、残りの細胞懸濁液を数回遠心洗浄する 。次いでペレットをコラゲナーゼに再懸濁させ、インキュベートし、遠心洗浄す ることにより、精巣内の管周囲細胞を除去することができる。ペレットをヒアル ロニダーゼとＤＮアーゼとともにインキュベートすることにより精巣の胚細胞を 除去することができる。数回遠心洗浄した後、移植用のセルトーリ細胞を回収す ることができる。 種々の技術を用いてこのセルトーリ細胞を移植することにより哺乳動物内に免 疫学的に特に免除された部位を作り出すことができる。例えば、哺乳動物を麻酔 した後、組織マス中にセルトーリ細胞を注射して免疫学的に特に免除された部位 を作り出すことができる。 セルトーリ細胞は、免疫学的に特に免除された部位を作り出すのに有効な量で 投与される。そのような有効量は、後にまたは一緒に投与された、生物学的因子 を産生する細胞が免疫的に拒絶されるのを防ぐ量として定義される。免疫的拒絶 は、例えば、組織学的、または細胞によって産生された因子の機能的評価によっ て測定することができる。 好ましい態様において、セルトーリ細胞は１０¹〜１０¹⁰個の範囲の量で投与 される。より好ましい態様では、１０⁵〜１０¹⁰個が投与される。 生物学的因子を産生する細胞は治療的有効量で投与される。当業者は、当該技 術分野で知られた方法によって生物学的因子産生細胞の適切な量を決定すること ができる。細胞の量は、細胞の産生する因子の量とその疾患を治療するのに必要 なその因子の既知の治療的有効量により変化する。例えば、同種移植片を用いる 糖尿病の治療には膵島細胞１〜１０００個／g体重を投与することができ、異種 移植片を用いる場合は膵島細胞２０〜１０００個／g体重を投与することができ る。別の好ましい態様では、糖尿病を治療するために膵島細胞５〜１００個／ｇ 体重が投与される。最も好ましい態様では、同種移植を用いて膵島細胞５〜２０ 個／g体重が投与され、異種移植では膵島細胞１００〜１０００個／g体重が投与 される。 別の態様では、本発明の糖尿病治療法にはさらに、例えば、シクロスポリン、 タクロリムス、デスパーグアリン、およびモノクローナル抗体（例えばＴ細胞に 対する）のような免疫抑制物質を投与することが含まれる。好ましい態様におい て、この免疫抑制物質はシクロスポリンである。別の好ましい態様では、シクロ スポリンは０.５〜２００mg／kg体重の用量で投与される。最も好ましい態様で は、シクロスポリンは５mg〜４０mg／kg体重の用量で投与される。 より一般的には、免疫抑制物質は移植された膵島細胞を機能性であるようにな し得る十分な期間投与することができる。この期間は、膵島の移植前または移植 直後の時点から細胞が治療的有効量のインスリンを産生できる時点にわたる。好 ましい態様において、免疫抑制物質を投与するための十分な期間は、膵島の移植 後約４０〜約１００日である。より好ましい態様では、十分な期間は約５０〜６ ０日である。 本発明の好ましい態様は、ランゲルハンス島をセルトーリ細胞とともに腎嚢下 腔に移植することによるＩ型およびII型糖尿病の治療方法をめざすものである。 先行技術文献に記載の糖尿病の療法とは異なり、本発明の糖尿病の治療法は、 疾病の過程で生じる合併症を予防し、通常の糖尿病療法に関連した副作用をもた らさない。さらに、本発明の膵島細胞の移植法は膵島移植物への血管新生に必要 な因子を提供する。 さらに、本発明は、哺乳動物に免疫学的に特別免除された部位を創設する方法 を開示する。免疫学的に特に免除された部位は、免疫学的に特に免除された部位 を作り出すのに有効な量の単離されたセルトーリ細胞を哺乳動物に移植すること によって作り出される。好ましい態様では、１０²〜１０¹⁰個の細胞が投与され る。より好ましい態様では１０⁵〜１０¹⁰個の細胞が投与される。好ましい態様 では、セルトーリ細胞は腎嚢下腔または皮下筋膜に注射により投与される。好ま しい態様において、哺乳動物はヒトであり、セルトーリ細胞はヒトまたはブタの ものである。 本発明はさらに、生体外(ex vivo)において細胞の回復と増殖の増強を達成す るのに十分な時間と条件下で、該細胞をセルトーリ細胞とともに培養することを 含む、ex vivoにおける細胞の回復および増殖の増強する方法に関する。 本発明の別の態様は、セルトーリ細胞と生物学的因子産生細胞および医薬的に 許容される担体を含有する医薬組成物を提供することである。好ましい態様では 、該組成物はセルトーリ細胞、ランゲルハンス膵島細胞、および医薬的に許容さ れる担体を含有する。本発明のさらに好ましい態様では、ブタ、ウシ、またはヒ トのセルトーリ細胞とブタ、ウシ、またはヒトのランゲルハンス膵島細胞を用い ることが含まれる。本明細書において、医薬的に許容される担体には、いずれの およびすべての溶媒、分散媒質、コーティング剤、抗菌・抗真菌剤、等張剤など が含まれる。そのような媒質および物質の使用は当該技術分野でよく知られてい る。さらに、本発明はセルトーリ細胞と医薬的に許容される担体を含有する医薬 製剤に関する。 本発明は、疾病を治療するためのキットにも関する。ある態様では、このキッ トは、哺乳動物に免疫学的に特別免除された部位を創設するのに有効な量のセル トーリ細胞を含有するのに適した第一容器と、治療すべき疾病に欠損または不足 している生物学的因子を産生する細胞の治療的有効量を含むのに適した第二容器 とを収容するように区分されている。好ましい態様では、該セルトーリ細胞はウ シ、ブタまたはヒトのものであり、１０¹〜１０¹⁰個の量で提供される。より好 ましい態様では、該セルトーリ細胞は１０⁵〜１０¹⁰個の量で提供される。別の 好ましい態様では、生物学的因子を産生する細胞は該因子をコードしているＤＮ Ａで形質転換された細胞である。さらに別の好ましい態様では、該因子を産生す る該細胞は膵臓の膵島細胞である。該膵島細胞は好ましくは５〜２００個／ｇ体 重の量で、より好ましくは５〜１００個／ｇ体重の量で提供される。さらに、本 発明は包装材料と該包装材料内に含有されるセルトーリ細胞を含む製品部材であ って、該セルトーリ細胞が哺乳動物に免疫学的に特別免除された部位を創設する のに有効であり、哺乳動物に免疫学的に特別免除された部位を創設するのに該セ ルトーリ細胞を用いられ得ることを示すラベルを含む製造部材を提供するもので ある。セルトーリ細胞を含有するために用いる包装材料には、ガラス、プラスチ ック、金属または他の適切な不活性部材が含まれ得る。 本発明をさらに例示するために以下の実験が実施された。本発明は特定の実施 例やその中に記載された詳細に限定されるものではないと解すべきである。実施 例中に記載の実験から得られた結果は、添付された図と表に示している。 実施例１ 雄のアカゲザル６頭の精巣に膵島同種移植片を移植し、これら移植物の生存に ついて試験した。レシピエントの膵臓をほぼすべて切除し、次いで２週後にスト レプトゾトシン３５mg／kg体重を静脈内注射して糖尿病を引き起こした。この方 法によって重度の糖尿病が誘発された。血漿中グルコース値は４００mg／dl以上 で、該動物はケトーシスであった。各食事の前にVIOKASE（登録商標）１錠を１ 日２回経口投与して吸収不良となるのを予防した。 膵島細胞は雌のアカゲザル から単離した。まず、５頭の膵臓を取り出してプールし、細切して小断片とした 。３７℃の水浴中でコラゲナーゼ消化した後、直列に調製された少なくとも２つ のフィコールグラジエント上で、膵島と外分泌組織および他の細胞屑とを分けた 。氷冷ハンクス緩衝液中で膵島を３回遠心洗浄し、次いで手で拾い上げ、生物グ レードのペトリ皿に１５０個のグループとなるように移した。各皿には、５％ウ シ 胎児血清、濃度２５０mg／mLのグルコース、ペニシリン（１００U／mL）、およ びストレプトマイシン（１００μg／mL）を添加した培養培地ＣＭＲＬ−１０６ ６の６ｍＬを入れた。膵島の培養は３５℃、５％ＣＯ₂および空気中で、４〜６ 日間実施した。膵島は４８時間間隔で新鮮培地に移した。 膵島の生存性と算定は、色素ジチゾンの取り込みによって容易に行われた。各 サルの両精巣内に、膵島平均約１０⁴個／kg体重が注射により投与された。最初 の動物３頭では、精巣を腹腔内に持ち上げたが、後のレシピエント３頭では、移 植された臓器は鼠けい管内に固定された。シクロスポリン（ＣｓＡ）は、最初の 移植動物３頭には種々の用量で３０日間にわたって投与され、一方、後の宿主３ 頭には第−４日から第＋３日までＣｓＡ（２０mg／kg）を７回注射した。経口サ スタカル（sustacal）トレランス試験を、第３０日と、その後以下の正常血糖動 物における間隔で実施した。 サルは１頭ずつケージに収容し、標準的なサルの餌と果物を１日２回与えた。 さらに、これらのサルには移植前に、糖尿病にするための膵切除術が施されてい るため、餌に膵臓酵素を混合した。 試験前夜に、動物を１２時間絶食させた。次に、翌朝午前８時に動物を麻酔し 、試験飼料を調製した。サスタカルを試験物質に用いた。サスタカルは、標準的 飼料ときわめて類似した、炭水化物、蛋白および脂肪の生理学的混合物からなる 、インスリン放出の強力な刺激物質である。 サスタカルは鼻胃チューブを介して眠っている動物の胃内に直接注入される。 次に、０、１５、３０、６０、９０、１２０、および１８０分の時点で血液試料 を採取する。この遠心を遠心し、インスリンまたはＣ−ペプチドの測定が行われ るまで−２０℃に保存する。Ｃ−ペプチドはβ細胞機能の非常に鋭敏なマーカー である。結果を図１−４に示す。 図１は、膵切除術前（Lucky-pre）、膵切除術後で移植前（Lucky-post）、の 間隔、および移植後の間隔（各１４３日、７３０日および９３０日で）でサル「 Lucky」に対して行った経口サスタカルトレランス試験に対するグルコース反応 を 示す。 動物が膵切除後（Lucky-post）に重度の糖尿病になったことは容易に知ること ができる。移植後のグルコース反応は測定したすべての時期（移植後１４３、７ ３０および９３０日）で正常レベルに回復した。Luckyには移植失敗の徴候はみ られなかった。移植失敗であれば、上昇しているグルコース値は膵切除術後の値 に近づくであろう。 図２は、図１に示すのと同じ時期おける経口サスタカルトレランス試験に対す るＣ−ペプチド反応を示す。膵切除後、Ｃ−ペプチド反応は鈍くなり、重度の糖 尿病を示す。しかし、移植後、その値は正常に回復するばかりか、Ｃ−ペプチド 放出は「過剰反応」現象を示し、７３０日目の値は測定したすべての時点におけ る正常値より高かった。この値の上昇は精巣から放出されたインスリンが体循環 に入るためかも知れない。これに対し、膵臓から放出されたインスリンは門脈に 入り、速やかに肝臓に運ばれ、初回通過時に約６０％が分解される。体循環中に 放出されたインスリンはかなり遅れて肝臓に達するためその値が上昇する。グル コース濃度の観察から明らかなように、Ｃ−ペプチド反応には移植後３０カ月間 機能不全の徴候はみられなかった。 図３は、サル「Oscar」における経口サスタカルトレランス試験に対するグル コース反応を示す。膵臓除去後、Oscarはグルコース値の上昇を伴う重度の糖尿 病になった。膵島の移植後、そのグルコース反応は膵臓除去前の測定値と同様に なった。このグルコース値は移植後３２カ月間正常値にあった。 図４は、図３に示すのと同じ時期に行った同じ動物におけるＣ−ペプチド反応 を示す。この動物はは膵臓除去後に明かな糖尿病となり、その結果Ｃ−ペプチド 反応は鈍っている。移植後とその後７３０日間のＣ−ペプチド反応は正常動物よ り大きかった。移植後９３０日目に、Ｃ−ペプチド反応は正常動物より幾分小さ くなっていた。Ｃ−ペプチドレベルが幾分低いにも関わらず、この動物は正常血 糖を保っている。 この実施例は、持続的な免疫抑制を必要とすることなく、精巣内膵島細胞移植 片が霊長類の動物に成功裡に移植することができること、および精巣内膵島同種 移植片の機能的完全性が、移植失敗の徴候を示すことなく、２年以上の期間維持 されることを証明するものである。 実施例２ この試験では、腹部、精巣内膵島移植片を移植された自然発生糖尿病ｂｂ／Ｗ ｏｒ ｄｐラットにおけるインスリンとグルカゴンの分泌現象について試験した 。糖尿病ＢＢ／Ｗｏｒ ｄｐラットに対し、免疫抑制を行わずに、ＭＨＣ適合Ｂ Ｂ／Ｗｏｒ ｄｒラットからの精巣内膵島移植を行った。正常血糖である７４± １５日の期間後、３つの異なる群（対照；ＢＢ／Ｗｏｒ ｄｐ、移植；およびＢ Ｂ／Ｗｏｒ ｄｐ、インスリン処理）に対し、（１）経口グルコーストレランス 試験（ＯＧＴＴ）、（２）グリピジド１回経口投与、その後ＯＧＴＴ、および（ ３）アルギニンの静脈内注入を行った。この試験の結果は表１と２および図５と ６に示す。 図５は、自然発症糖尿病ＢＢ／Ｗｏｒ ｄｐラットにグルコースを経口投与し たときの血清中グルコースおよびインスリン反応に対する精巣内膵島同種移植片 の影響を示す。図６は、自然発症糖尿病ＢＢ／Ｗｏｒ ｄｐラットにグルコース を経口投与し、そしてグルコースとグリピジドとを一緒に投与したときの血しょ う中グルカゴン分泌反応に対する精巣内膵島同種移植片の影響を示す。この実験 は、自然発症糖尿病ＢＢ／Ｗｏｒ ｄｐラットに移植された精巣がα細胞とβ細 胞の両方を含有し、このα細胞とβ細胞が独立して特異的分泌促進物質に反応す る能力を有することを証明している。 実施例３ この研究は、糖尿病のラットの腎嚢下腔におけるランゲルハンス島同種移植片 の生存に対する、セルトーリ細胞に富む画分（ＳＥＦ）の効果を検討した。 この研究に使用した動物は、体重１５０〜２００ｇのＰＶＧラットであった。 糖尿病は、ストレプトゾトシン６５mg／dlの一回の静脈内注射によって誘発され た。血漿グルコース値が４００mg／dl以上であるラットのみに移植した。異系交 配したスプーグドーリー(Ｓ−Ｄ)異系交配ラットを膵島のドナーとして使用した 。１６〜１８日齢のＰＶＧまたは雄のＳ−Ｄラットをセルトーリ細胞のドナーと して使用した。 膵島の調製 Ｌondonら（１９９０）のＴransplantation，４９：１１０９−１１１３記載 の方法の変法に従って、膵島を調製した。それらの膵島をフィコールのグラジエ ントで精製した後、使用前に、５％ ＣＯ₂および空気の湿潤雰囲気下、単離した 細胞を３７℃で４日間インキュベートした。パッセンジャー白血球が混入してい る膵島を除去するための努力は特にしなかった。 セルトーリ細胞に富む画分の調製 ＣhengらのＪ.Ｂiol.Ｃhem.，２６：１２７６８−１２７７９の方法に従って 、高度に精製したセルトーリ細胞の調製物を若い雄の精巣から単離した。精巣を 取り除き、幾つかの片に切断して、ハム(Ｈam)のＦ１２／ＤＭＥＭ培養液５０ml を含む５０mlのコニカル管に入れた。それらの片を８００×ｇで２分間１回遠心 洗浄した。上清を吸引して、２５０mlの無菌エーレンマイヤーフラスコ中、トリ プシン４０mgおよびＤＮアーゼ０.８mgを含む培養液４０mlに組織を再懸濁させ た。そのフラスコを６０〜９０osc／分、３７℃の振盪インキュベーターに３０ 分間入れた。この工程では、ライディッヒ細胞を取り除いた。次いで、細管を５ ０mlのコニカル管に移して、８００×ｇで２分間遠心分離した。上清画分を吸引 して、４０mlの、０.０１％ 大豆トリプシン阻害剤およびＤＮアーゼ０.８mgを 含む、１Ｍ グリシン、２mＭ ＥＤＴＡにペレットを再懸濁させて、室温で１０ 分間イ ンキュベートした。この工程では、残りのライディッヒ細胞を全て溶解した。そ れらの細胞を２分間遠心洗浄して、その工程を２回、すなわち、培養液が濁らな くなるまで繰り返した。三角フラスコ中、コラゲナーゼ２０mgを含む培養液４０ mlにガラス製パスツールピペットで穏やかにホモジナイズすることにより、ペレ ットを再懸濁させて、６０〜９０osc／分、３７℃で５分間インキュベートした 。細胞懸濁液を８００×ｇで２分間遠心分離して、コラゲナーゼ４０mgおよびＤ Ｎアーゼ０.２mgを含む培養液４０mlにパスツールのピペットで穏やかにホモジ ナイズすることにより、ペレットを再懸濁させて、三角フラスコ中、６０〜９０ osc／分、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、それらの細胞を２分 間遠心洗浄して、その工程を少なくとも３回繰り返して、周細管性細胞を除去し た。ヒアルロニダーゼ４０mgおよびＤＮアーゼ０.２mgを含む培養液４０mlにパ スツールのピペットで穏やかにホモジナイズすることにより、それらの細胞を再 び懸濁させて、６０〜９０osc／分、３７℃で３０分間インキュベートした。そ れらの細胞を２分間穏やかに遠心ペレット化して、少なくとも５回洗浄して、生 殖細胞を除去した。得られたＳＥＦを培養液０.２５mlに再懸濁させて、直ちに レシピエントのラットに移植した。移植したラット各々に、１つの精巣に含まれ るセルトーリ細胞の全量と同じ量を与えた。 ラットの移植 糖尿病のラットを滅菌食中のメトキシフルランＵＳＰで麻酔して、左側腹部を 切開して、腎臓を露出した。約５００万個のセルトーリ細胞を含む、セルトーリ に富む画分をまず最初に、腎嚢下腔に注入した。それらの細胞は該嚢腔下に乳白 色の気泡として見ることができた。直後に、合計１０膵島細胞／ｇ（体重）を前 述の乳白色の気泡に注入した。針をゆっくりと引き抜いて、移植した細胞の漏出 を防いだ。シクロスポリン(ＣsＡ)を２０日間にわたり種々の用量で２〜４群に 皮下投与した。移植ラットは、薬物が２０日間にわたって投与されようと、３日 間にわたって投与されようと、同様に反応したので、雌のラットを含め、その後 の群は全て、移植から０日目、＋１日目、および＋２日目に行う、２５mg／kg ＣsＡの３回の注射のみで処置した。それらのラットには、他の治療を施さなか った。 合計３６匹の雄のラットおよび２１匹の雌のＰＶＧラットを６つの異なる処置 群に分けた：群１、対照群は、ドナーのＳ−Ｄラットからの膵島のみを移植した ６匹の雄のラットからなっていた。それらには、ＳＥＦもＣsＡも与えなかった 。群２は、Ｓ−Ｄラットからの膵島と移植後のＣsＡとの組み合わせで移植した １０匹のラットからなっていたが、ＳＥＦは与えなかった。群３は、Ｓ−Ｄから の膵島とドナーのＰＶＧラットからのＳＥＦとの組み合わせで移植した合計１０ 匹のラットからなっていたが、移植後にＣsＡは与えなかった。群４は、Ｓ−Ｄ のドナーからの膵島、ＰＶＧのドナーからのＳＥＦ、および移植後のＣsＡとの 組み合わせで移植した１０匹のラットからなっていた。群５は、群４に関して示 した細胞の同じ組み合わせで移植した１１匹の雌のラットからなっていた。群６ は、膵島並びにＳＥＦ、Ｓ−Ｄのドナーから得られた両方の細胞型、および移植 後のＣsＡとの組み合わせで移植した１０匹の雌のラットからなっていた。 ラットの移植後評価 移植ラットを代謝ケージに移して、血漿グルコース値を週１回測定した。尿量 および尿グルコース含量を１日１回測定した。ラットは、以下の診断基準を満た したなら、糖尿病の進行が治療したものとみなされた：任意に選択した血漿グル コース値＜１５０mg／ＤＬ；糖尿；および移植した腎臓を外科的に取り除いた後 に起こる高血糖への即時逆転。 いずれものラットが移植に対して非反応性となったかどうかを測定するために 、正常血糖のラットを、少なくとも５００個の、新たに調製した、スプーグドー リーの膵島細胞からなる別の膵島同種移植片を対側性腎嚢下腔に注入して、免疫 刺激した。免疫刺激後、免疫抑制は施されなかった。 雌のラットの受胎能に対する、ＳＥＦ移植の影響を試験するために、３０日以 上正常血糖のラットをＰＶＧの雄とつがわせた。先に概要を示した代謝パラメー ターを詳しく観察したが、それは妊娠の経過であった。 移植組織の構造分析 合計５匹の移植が成功したラットを移植後に腎摘出した。Ｃameronら（１９９ ０）のＴransplantation，５０：６４９−６５３による前記の、光学および電子 顕微鏡検査による試験のために、膵島およびＳＥＦを注入した部位から得られた 腎組織の楔形切片を調製した。簡単に言えば、楔形組織を０.１Ｍ ｓ−コリジン 緩衝液中の５％ グルタルアルデヒドで１時間浸漬固定し、緩衝液中で洗浄して 、０.１Ｍ 緩衝液中の１％ 四酸化オスミウムで１時間、後固定した。その楔形 組織から小さな組織塊を切り取って、濃度段階系列のエチルアルコールを通して 脱水し、プロピレンオキシドに移して、Ｅpon ８１２／Ａralditeプラスチック 樹脂に埋め込んだ。光学および電子顕微鏡検査による構造分析のために、厚い( ０.５μm)切片および薄い(９００mg)切片を各々、トルイジンブルーおよび酢酸 ウラニル／クエン酸鉛で通常通り染色した。結果を表３および第７〜９図に示す 。 群１：膵島のみを移植し、ＳＥＦまたはＣsＡのどちらも与えなかった６匹の ラットはいずれも、正常血糖にはならなかった。 群２：膵島を移植して、ＣsＡで処置した１０匹のラットのうち３匹は、１０ ０日以上たって正常血糖になった。その３匹の正常血糖のラットを各々、１１６ 日目、１９２日目および１９７日目に第２次移植片で免疫剌激した。１匹のラッ トは１３０日目に高血糖に戻ったが、２匹は正常血糖のままであった。 群３：膵島およびＳＥＦを移植したが、ＣsＡは与えなかった１０匹のラット のうち６匹は最初、正常血糖になったが、それらは全て、１４日目までに高血糖 に戻った。 群４：ＳＥＦと膵島とを組み合わせて移植して、またＣsＡも与えたラットは １０匹とも全て、正常血糖になった。２匹は各々、１９日目および７６日目に自 発的に糖尿病に戻った。３匹は、移植後５８日目、８４日目および１６７日目に 腎摘出した。これらのラットは３匹とも全て、後の２４時間以内に高血糖になっ た。残り５匹のラットを各々、１１９日目、１２９日目、２８０日目、３４２日 目および４００日目に第２次膵島同種移植片で免疫刺激した。これらのうち、最 初の２匹は各々、１２７日目および１３９日目に糖尿病に戻ったが、あとの３匹 は正常血糖のままであった。 群５：膵島とＳＥＦとを組み合わせて移植した後、ＣsＡを与えた雌のラット は１１匹とも全て、正常血糖になった。これらのうち、４匹は２８日目までに自 発的に高血糖に戻った。雄のＰＶＧラットとつがわせた７匹の正常血糖のラット のうち、６匹が妊娠して、これらのうち、８匹は、１〜１０匹内の同腹子を生ん だ。それらは、子供を上手に育てた。長期生存している合計７匹の雌を、移植後 少なくとも２００日目に第２次膵島同種移植片で免疫刺激した。それらはいずれ も、高血糖に逆もどりしなかった。 群６：ラットの同じドナー系統から得られた膵島およびＳＥＦを移植した１０ 匹のラットのうち、１０匹とも全て、正常血糖になった。２匹は１０日目までに 高血糖に戻った。生存しているラットのうち２匹に対して各々、移植片を取り除 くための腎摘出を９６日目および２０１日目に行った。両方とも、後の２４時間 以内に直ちに高血糖に戻った。 組織形態学 光学顕微鏡検査により、長期移植腎臓から得られた腎組織は、構造的に正常に 見えた(第７図)。この器官に移植した膵島は、腎嚢の真下にあって、構造的に正 常に見えた。それらは、その場にある膵島と同じ組織および細胞構造を示した( 第７図)。個々の膵島細胞は、小さな血管および毛細管を含む薄い連結中隔によ り細胞群に区分されている(第７図)。膵島細胞の大部分が分泌顆粒を含むように 見えた。電子顕微鏡検査により分析すると、超微細構造を特徴とする封入体、お よび特徴的なインスリン含有分泌顆粒により、膵島細胞はβ細胞型であることが 確認された(第８図)。観察されたβ細胞群は全て、膵島内毛細管に極めて近かっ た(第８図)。 移植した膵島と腎実質との間にあって、直接隣接する細胞は、高密度であった 。光学顕微鏡検査により、それらは、膵島細胞、腎細胞ではなく、細胞または血 液由来でもないらしかった(第７図)。電子顕微鏡検査により観察すると、これら の細胞は、それらの核が側面から見たところ不規則であって、深い核裂を含み、 特徴とする核小体が存在することが多く、またミトコンドリア構造が密集してい るという点で、超微細構造がセルトーリ細胞に似ていた。これらの細胞は、イン ビボにおけるセルトーリ細胞の典型的な極性を保有していなかったが、しかし、 それらの細胞を基底膜基質にないときは、それらは、外観がインビトロのセルト ーリ細胞と同じである。それらの細胞は、基底膜とは関係なく、またランダムに 組織化されているらしかった(第９図)。生殖細胞またはライディッヒ細胞のいず れかの超微細構造特徴を示す細胞は、観察されなかった。 この実施例は、単離した膵島の移植に関して免疫学的に特権を与えられた部位 が、セルトーリ細胞を移植することにより、長期にわたる免疫抑制を必要とする ことなく、雄または雌の糖尿病レシピエントにおいて創設され得ることを実証す るものである。 実施例４ この研究は、実験動物での非免疫学的に特権を与えられた様々な器官部位にお ける、不一致の膵島異種移植片の生存を検討した。 膵島を若い子ブタから以下のように調製した：体重が２.２kg以下の雄の子ブ タのみを使用した。子ブタを麻酔して、瀉血した後、膵臓と精巣の両方を無菌条 件下に収集した。２mg／ml コラゲナーゼ XI型(Ｓigma)からなるコラゲナーゼ溶 液を膵臓に直接注入した。その膵臓を３７℃で１７分間インキュベートして、消 化した組織を３回遠心洗浄して、１mlのアリコートを各々、ペトリ皿に移した。 １０％ ウマ血清で補足した組織培地中、膵島を３２℃で６日間インキュベート した。 ７日目に、培養した膵島を±４,０００のバッチに集めて、標準的なプロトコ ルを用いて凍結保存した。細胞を、液体窒素中、−９６℃で２〜４週間内の異な る期間保存した。その液体窒素から膵島を取り出し、確立された手順を用いて解 凍した。解凍した膵島をペトリ皿に移して、上記と同じ１９９培地中、ブタのセ ルトーリ細胞と共に３２℃で３日間共培養した。以前の研究は、すでにセルトー り細胞の存在下に培養した、解凍した膵島の生存率の改善を示している。 解凍した後３日目に、それらの膵島を手操作で選び、計数して、全１２膵島細 胞／ｇ(体重)を雌の糖尿病のスプーグドーリーラットに移植した。子ブタの精巣 から得られた合計５００万個のセルトーリ細胞を同じ場所に同時に移植した。膵 島の移植に関して試験すべき器官部位には、以下のものが含まれる：ａ］腎嚢下 腔、ｂ］皮下、およびｃ］肝臓。移植後、ラットをシクロスポリンで以下のよう に処置した：２５mg／kgを７日間；１５mg／kgを５日間；１０mg／kgを５日間； ５mg／kgをさらに１３日間。３０日目に停止した。 単離した子ブタの膵島の生存率および機能的完全性を実証するために、以下の 検討を行った：ａ）細胞をジチゾンで染色する、この染色はインスリンに対して 非常に特異的である；ｂ）細胞を０.４％ トリパンブルーで染色する、これは膵 島の生存率を示す；およびｃ）培養し、凍結保存して解凍した後の指定期間に、 低濃度および高濃度のグルコースといったようなインスリン分泌促進物質の存在 下に５膵島細胞のバッチを培養する。結果を表４に示す。 表５に示したように、１日、３日、および７日培養した後の、膵臓１ｇ当たり の膵島の収量は各々、３７,６９２±１,２３３、３４,５１３±１,３０７および ２９,４４２±１,１１９であった。セルトーリ細胞の存在下に細胞を凍結保存し 、解凍して再び培養した後、表６に示したように、約２０％の細胞が損害を受け たか、または損失した。従って、凍結保存して解凍した後、±２４,０００膵島 細胞／ｇ(子ブタの膵臓)を移植のために利用できた。 それらの結果は、凍結保存する前にグルコースをインスリン分泌促進物質とし て使用すると、インスリン分泌が鈍ることを示した。その効果は、凍結保存して 解凍した後により明らかであった。セルトーリ細胞の存在は、凍結保存して解凍 した後でも生き残る膵島の数に対して著しい効果を有していたが、それらの存在 は、膵島がインスリン放出物質としての低濃度のグルコースに反応する能力に対 してほとんど効果を有していなかった。しかし、実施例８に示すように、セルト ーリ細胞の存在は、高濃度のグルコースの存在下およびフォルスコリンを加えた グルコースの存在下にインスリンの分泌を増大させた。 実施例５ 子ブタドナーからの膵島移植（不一致性異種移植）に対する糖尿病スプラーグ ドーリーラットの応答 ストレプトゾトシン ５５mg/kgの１回の静脈内投与により、ラットを糖尿病に した。血糖値が４００mg/dL以上のラットにのみ、移植した。移植後、ラットを それぞれ代謝ケージ（metabolic cage）に入れ、尿量、尿グルコース量、及び体 重を１日毎に測定した。血中グルコース値は、１週間毎に測定した。ラットは、 血中グルコース値が１６０mg/dL以下、及び／又は１日の尿量が１５mL以下であ れば、糖尿病が治癒したとみなす。 結果を図１０及び図１１に示す。 図１０は、７匹の移植を受けた雌性ラットレシピエントの１日の平均尿排出量 に対する腎嚢下への子ブタ膵島およびセルトーリ細胞の移植の効果を示している 。各棒線は、移植後１０日間隔での１日当たりの平均尿排出量を示している。こ の試験は８０日間行った。従って一番右の棒線は、即ち、８０日目から８９日目 の１日当たりの平均尿排出量を示すなどである。 この図は、始めの６０日間の１日当たりの平均尿量は、１９.７mLから２７mL の間、即ち糖尿病域内で変動したことを示している。７０日目から８９日目の間 で初めて尿量が正常値付近にまで減少したことが容易に分かるであろう。最初と 最後の日の間の、対応する血漿グルコース値は、それぞれ４７４±４６mg/dL、 １５５±７０mg/dLであった。 これらの結果は、子ブタ膵島及びセルトーリ細胞の移植後に、移植した膵島が 生存している証拠をこのラットが証明したことを示している。正常血糖への逆転 には約８０日間かかった。治癒したラットの内１匹は妊娠しており、妊娠中も正 常血糖であったことは注目すべきである。 図１１は、３匹のラットの１日の平均尿量に対する、皮下への子ブタ膵島とセ ルトーリ細胞の移植の５０日間の効果について示している。この結果は、平均尿 量が始めの１０日間の平均４１.７mLから第５週目の間の平均１２.３mLに減少し たことを示している。対応する血漿グルコース値はそれぞれ５０９±４５mg/dL 、および２００±１２mg/dLであった。 上記に示されたデータは、腎嚢下腔と皮下領域の両方が、膵島の異種移植片の 移植のための免疫学的に特別免除された部位を創設する部位として使用し得ると いうことを実証するものである。 実施例６ この試験は、最小限度の初期外因性免疫抑制を伴った、糖尿病ラットにおける 不一致性膵島異種移植片の生存に対する培養セルトーリ細胞の効果を決定するも のである。 膵島の調製 出生後７日以内の出生直後の子ブタを麻酔により屠殺し、Kuo C.Y.，Burghen G.A.，Myvacle A.及びHerrod H.G.著，Isolation of islets from neonatal pig pancreatic tissue"，J．Tissue．Culture．Methods，１６巻,１〜７頁,（１９ ９４年）の方法に従い膵島を単離した。簡潔にいえば、ＤＭＥＭ培養培地中、Ｘ １型コラゲナーゼ ２mg/mLのコラゲナーゼ溶液の注射により、膵臓を膨張させた 。３９℃にて１７分間インキュベートした後、消化断片を遠心洗浄し、次いで、 消化した組織を３２℃にて１０％ウマ血清および１％抗生物質を添加した１９９ 培地中で１週間インキュベートした。次に、膵島をLakey J.R.T.,Warnock G.L., Kneteman N.M.，Ao Z.,Rajotte R.V.,“Effects of precryopreservation cultu re on human islet recovery and in vitro function”，Transplant Proc.，２ ６巻，８２０頁，（１９９４年）による方法にしたがって凍結保存し、液体窒素 中−１９６℃で保存した。移植３日前に、凍結保存した膵島を急速解凍し、３２ ℃にて２日間培養した。移植前日、数個の膵島を集め、セルトーリ細胞と２４時 間共培養した。 セルトーリ細胞単離 若いＳ−Ｄラットの精巣を取り出し、Cheng C.Y.およびBardin C.W.,“Identi fication of two testosterone-responsive proteins in Sertoli cell-enriche d culture medium whose secretion is suppressed by cells of the inatct se miniferous tubule.”J. Biol. Chem.，２６２巻，１２７６８〜１２７７９頁， （１９８７年）の方法によりセルトーリ細胞を単離した。簡潔にいえば、始めに 精巣を１.０％トリプシンを含むＤＭＥＭ中、次いで、１.０％１型コラゲナーゼ を含むＤＭＥＭ中、３７℃にてそれそれ１５分間消化した。精製したセルトーリ 細胞をトランスフェリン１０μg/mL、ＦＳＨ １０ｎg/mL、インスリン２０μg/m Lおよび１.０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中、３７℃にて３日間培養し た。移植のために、セルトーリ細胞および膵島をプールし、５×１０⁶個のセル トーリ細胞と３，０００の膵島からなる混合物か膵島単独（１５の膵島/ｇ体重 ）のいずれかをラットに移植する。 ラットの移植 体重１７０〜２００ｇの雌性Ｓ−Ｄラットをストレプトゾトシン ６０mg/kgの １回の静脈内注射により糖尿病にした。合計３１匹の糖尿病ラットを３群に分け 、以下の様に移植した。群１、対照群（ｎ＝８）、合計で１５の膵島/ｇ体重を 腎嚢下への注射により移植した。セルトーリ細胞は移植しなかった。移植後、ラ ットをシクロスポリンで５５日間処置した：即ち、２５mg/kgを３日間、１５mg/ kgを１０日間、１０mg/kgを１０日間、５mg/kgをその後３２日間。次いで、免疫 抑制を中止した。２４時間の尿グルコース量が１ｇを越えている場合、さらに、 各ラットに１〜３Ｕのウルトラレンテインスリンを１日毎に投与した。インスリ ン治療は、５５日目に中止した。群２、組織対照群（ｎ＝８）、約５×１０⁶個 のセルトーリ細胞及び３,０００の膵島の混合物を腎嚢下注射により移植した。 ＣsＡは投与しなかった。インスリンは上記と同様に投与した。群３、実験群（ ｎ＝１５）、セルトーリ細胞と膵島の両方を移植した後、上記で概説した計画に 従ってＣsＡおよびインスリンで処置した。 ラットの移植後評価 血漿グルコース値を１週間毎に測定した。２４時間の尿量及び尿グルコース量 は毎日記録した。以下の基準に該当すれば糖尿病過程の治癒とみなした：即ち、 血漿グルコース値１０mmol/Ｌ以下、２４時間の尿量１５mL未満、及び移植腎臓 の外科切除後の急速な過血糖症への逆転。６９日目に１匹の正常血糖のラットを つがわせて妊娠能力を試験した。 移植組織の構造的分析 ２匹の正常血糖のラットを１１７日目及び３３０日目に腎切除し、移植組織を 光学及び電子顕微鏡用に調製した。Selawry H.P.，Cameron D.F.，“Sertoli ce ll-enriched fractions in successuful islet cell-transplantation”，Cell Trans .，２：１２３−１２９（１９９２年）。簡潔にいえば、くさび形の組織片 を０.１Ｍ コリジン緩衝液中、５％グルタルアルデヒドで１時間液浸固定し、緩 衝液中で洗浄し、０.１Ｍ緩衝液中、１％四酸化オスミウムで１時間後固定（pos tfix）した。このくさび形組織片から小さな組織塊を切り出し、エチルアルコー ルの濃度段階系列により脱水し、プロピレンオキシドに移し、Epon ８１２/Aral diteプラスチック樹脂に包埋した。厚い（０.５μm）断片及び薄い（９００ng） 断片を光学および電子顕微鏡による構造的分析のために、それぞれトルイジンブ ルーとウリナールアセテート／クエン酸鉛で慣例通りに染色した。 糖尿病雌性ラット腎嚢下腔中へのブタ膵島細胞の異種移植の生存に対するセル トーリ細胞およびシクロスポリンの効果を表７に示す。 表７に示したように、膵島単独で移植し、ＣsＡ及び低用量のインスリンを投 与したラット（群１）については、１匹も有意な過血糖の減退はみられなかった 。さらに、膵島及びセルトーリ細胞の混合物を移植し、ＣsＡを投与しなかった ラットについては、過血糖症の改善は全くみられなかった（群２）。膵島および セルトーリ細胞を移植した後、ＣsＡを投与した１５匹のラット（群３）は、１ ０匹が糖尿病状態の逆転の兆候を示した。１０匹の内４匹は、それそれ１５４、 １６５、１６５および３２７日以上の期間依然として正常血糖であった。１１７ 及び３３０日目に腎切除された正常血糖のラットは、すぐに過血糖になった。そ れらの血漿グルコース値はそれぞれ、腎切除前は４.９mmol/Ｌおよび８.２mmol/ Ｌであり、腎切除後は２０.７mmol/Ｌおよび３２.２mmol/Ｌであった。６９日目 につがわせた雌性ラットは妊娠し、８９日目に合計１０匹のラットを出産し、そ のすべてに好都合に授乳をし、その間正常血糖のままであった。このラットは、 心臓穿刺の結果１４８日目に死亡した。１０匹のラットの内３匹は、正常血糖後 まもなくそれぞれ７１、７７および９６日目に過血糖症が再発した。 これらの結果は、雌性糖尿病ラットにおいて、（ブタからラットへの）不一致 性膵島異種移植片の長期の生存を達成し得るということを実証している。膵島異 種移植片の生存は相伴って行わねばならない２つの因子に依存している：即ち、 セルトーリ細胞との同時移植とシクロスポリンによる処置である。 改善のみられた７匹のラットについて８０日間にわたり１０日間毎に測定した 、ブタ膵島とラットセルトーリ細胞の混合物での移植後の総尿量の応答は、１日 の平均尿量が初めの１０日間は２７.０±１３.０mL／ラットであり、この値が移 植後７０日間で１２.０±４.０mL/ラットに緩やかに低下したことを示した。 図１０に示した組織の形態学的試験は、移植後１１７日目に腎切除されたラッ トにおいて、腎臓実質の組織及び細胞の構造は正常であるとみられたことを示し ている。構造的上明白なＢ−細胞を有する正常とみられる膵島が腎嚢下のよく血 管化した領域内にみられる。さらに、正常とみられるセルトーリ細胞が多数のリ ンパ球と共に、移植された膵島に隣接して観察される。血漿細胞は移植された部 位においては確認されなかった。移植後３３０日目に腎切除されたラットの腎嚢 下腔において、生育可能な内分泌細胞が同様に観察された。 これらの試験は、不一致性膵島異種移植片の有意の長期生存を免疫抑制を続け ることなく達成し得るということを示している。これらの試験は、これによって セルトーリ細胞が膵島異種移植片の生存を増進するという機構が３重構造である ということを実証している：即ち、（１）セルトーリ細胞は移植中に損傷を受け た膵島の回復を刺激し、（すなわち、培養された膵島の収率及び機能を改善する ）、（２）セルトーリ細胞はＴ−細胞の増殖を強力に抑制する因子を産生するこ とにより、移植された膵島を免疫学的な拒絶反応から保護し、そして（３）セル トーリ細胞はシクロスポリンの毒性作用から膵島を保護する。 実施例７ 本試験は、哺乳類における将来の異種間移植のためのブタ膵臓膵島の単離及び 凍結保存の方法を示すものである。 生後７日以内で体重が２±kgの雄性子ブタをドナーとして使用した。重量１. ４±０.３ｇの膵臓を得、２mg/mLＸＩ型コラゲナーゼを含むＤＭＥＭ溶液を注射 した。膨張した膵臓を３９℃にて、振盪させた水浴中で１７分間インキュベート した。消化した組織を５００μｍステンレススチールフィルターにより濾過し、 濾液を冷却ＤＭＥＭで３回洗浄した。これ以上精製することなく、細胞をＭ１９ ９及び１０％ウマ血清中、３２℃で７日間培養した。次いで、膵島細胞を標準的 な方法を用いて凍結保存した。特定の時点に膵島を解凍し、Ｍ１９９中で培養し た。標準的な方法に従い、雄性子ブタの精巣から単離したものである。 機能的能力を試験するために、３および７日間培養した膵島を静置培養におけ るインスリンの放出について測定した。個々の実験において、セルトーリ細胞存 在及び非存在下で培養した膵島に対するインスリン分泌促進剤の効果を試験した 。この試験の結果を表８および９に示す。 これらの結果は次のことを示している：（１）多量の出生直後ブタ膵島が単純 な方法で単離できる；（２）凍結保存と解凍は、膵島の数において、セルトーリ 細胞非存在下では約４０％、セルトーリ細胞存在下では約２０％の損失をもたら す；（３）培養した膵島はインスリン分泌促進剤としてグルコースとグルコース ＋フォルスコリンの両方に応答する能力を有する；（４）同時培養した膵島の機 能的能力がセルトーリ細胞の存在下で２倍に増大する；（５）凍結保存と解凍後 、膵島はセルトーリ細胞の存在下ではより迅速に回復し、グルコースとグルコー ス＋フォルスコリン両方に対する応答がセルトーリ細胞の存在下で２倍に増大す る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳動物における生物学的因子の欠損に起因する疾患の処置方法であって 、上記方法は、処置を必要とする哺乳動物にセルトーリ細胞および上記生物学的 因子を産生する細胞の治療的有効量を投与し、上記セルトーリ細胞を免疫学的に 特別免除された部位を創設するに有効な量を投与することを特徴とする方法。 ２．上記哺乳動物がヒトである、請求項１記載の方法。 ３．上記生物学的因子がホルモンである、請求項１記載の方法。 ４．上記生物学的因子がインスリンであり、上記疾患が糖尿病である、請求項 １記載の方法。 ５．上記生物学的因子を産生する上記細胞がランゲルハンス膵島細胞である、 請求項４記載の方法。 ６．上記生物学的因子を産生する上記細胞が、上記生物学的因子をコードする 核酸によって形質転換された細胞である、請求項１記載の方法。 ７．上記投与が移植によるものである、請求項１記載の方法。 ８．上記セルトーリ細胞が１０⁵〜１０¹⁰個の細胞の用量で投与される、請求 項１記載の方法。 ９．上記生物学的因子を産生する上記細胞が１０⁵〜１０¹⁰個の細胞の用量で 投与される、請求項１記載の方法。 １０．上記移植が異種移植によるものである、請求項７記載の方法。 １１．上記移植が同種移植によるものである、請求項７記載の方法。 １２．さらに、免疫抑制剤の投与を含むものである、請求項１記載の方法。 １３．上記免疫抑制剤が上記移植細胞が機能可能になるに十分な期間投与され るものである、請求項１２記載の方法。 １４．上記免疫抑制剤がシクロスポリンである、請求項１２記載の方法。 １５．上記シクロスポリンが５〜４０mg／kg体重の用量で投与されるものであ る、請求項１４記載の方法。 １６．さらに、上記生物学的因子を産生する上記細胞の移植後、外来性生物学 的因子の治療的有効量を投与することを含む、請求項１記載の方法。 １７．上記生物学的因子を産生する上記細胞が組織培養物中でセルトーリ細胞 とともに共培養される、請求項１記載の方法。 １８．上記生物学的因子を産生する細胞が組織培養中にセルトーリ細胞との共 培養前、凍結保存される、請求項１７記載の方法。 １９．哺乳動物の糖尿病の処置方法であって、上記方法が、糖尿病哺乳動物に 免疫学的に特別免除された部位を創設するのに有効な量のセルトーリ細胞および ランゲルハンス膵島細胞の治療的有効量を投与することを特徴とする方法。 ２０．上記糖尿病がＩ型またはII型である、請求項１９記載の方法。 ２１．上記哺乳動物がヒトである、請求項１９記載の方法。 ２２．上記セルトーリ細胞がヒト、ウシまたはブタのものである、請求項１９ 記載の方法。 ２３．上記ランゲルハンス膵島細胞がヒト、ウシまたはブタのものである、請 求項１９記載の方法。 ２４．上記投与が移植によるものである、請求項１９記載の方法。 ２５．上記移植が腎嚢下腔への注射によるものである、請求項２４記載の方法 。 ２６．上記移植が皮下筋膜への注射によるものである、請求項２４記載の方法 。 ２７．上記セルトーリ細胞が１０⁵〜１０¹⁰個の細胞の用量で投与される、請 求項１９記載の方法。 ２８．上記ランゲルハンス膵島細胞が５〜１０００膵島細胞／g体重の用量で 投与される、請求項１９記載の方法。 ２９．さらに、免疫抑制剤の投与を含むものである、請求項１９記載の方法。 ３０．上記免疫抑制剤が上記移植膵島細胞が機能可能になるに十分な期間投与 されるものである、請求項２９記載の方法。 ３１．上記免疫抑制剤がシクロスポリンである、請求項２９記載の方法。 ３２．上記シクロスポリンが５〜４０mg／kg体重の用量で投与されるものであ る、請求項３１記載の方法。 ３３．さらに、上記ランゲルハンス膵島細胞の移植後、インスリンの治療的有 効量を投与することを含む、請求項１９記載の方法。 ３４．哺乳動物に免疫学的に特別免除された部位を創設する方法であって、上 記方法が分離されたセルトーリ細胞を哺乳動物に移植することを含む方法。 ３５．上記哺乳動物がヒトである、請求項３４記載の方法。 ３６．上記セルトーリ細胞が腎嚢下腔に注射されるものである、請求項３４記 載の方法。 ３７．上記セルトーリ細胞が皮下筋膜に注射されるものである、請求項３４記 載の方法。 ３８．上記セルトーリ細胞が１０⁵〜１０¹⁰個の細胞の用量で移植されるもの である、請求項３４記載の方法。 ３９．上記セルトーリ細胞がヒト、ウシまたはブタのものである、請求項３４ 記載の方法。 ４０．エクスビボ細胞の採集および増殖を増強させる方法であって、上記採集 および増殖を増強させるに十分な時間および条件下で、上記細胞とセルトーリ細 胞とを共培養することを特徴とする方法。 ４１．セルトーリ細胞および生物学的因子を産生する細胞および医薬的に許容 それ得る添加物を含む医薬組成物。 ４２．上記生物学的因子がホルモンである、請求項４１記載の医薬組成物。 ４３．上記生物学的因子を産生する上記細胞がランゲルハンス膵島細胞である 、請求項４１記載の医薬組成物。 ４４．上記生物学的因子を産生する上記細胞が上記生物学的因子をコードする 核酸によって形質転換された細胞である、請求項４１記載の医薬組成物。 ４５．セルトーリ細胞、ランゲルハンス膵島細胞および医薬的に許容され得る 添加物を含む医薬組成物。 ４６．セルトーリ細胞および医薬的に許容され得る添加物を含む医薬組成物。 ４７．セルトーリ細胞を含むのに適した第１の容器、疾患中に欠失または不足 している生物学的因子を産生する細胞を含むのに適した第２の容器を収容するの に適した区画化されたキット。 ４８．セルトーリ細胞を含むのに適した第１の容器、ランゲルハンス膵島細胞 を含むのに適した第２の容器を収容するのに適した区画化されたキット。 ４９．包装材料および上記包装材料内に含まれたセルトーリ細胞を含む製品部 材であって、上記セルトーリ細胞が哺乳動物に免疫学的に特別免除された部位を 創設するのに有効であり、上記包装材料は上記セルトーリ細胞が哺乳動物に免疫 学的に特別免除された部位を創設するのに用いられ得ることを示すラベルを含む ことを特徴とする製品部材。