JPH0952898A - 抗ｈｔｌｖ−ｉアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents
抗ｈｔｌｖ−ｉアンチセンスオリゴヌクレオチドInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 抗ＨＴＬＶ−Ｉアンチセンスオリゴヌクレオ
チドを提供する。 【解決手段】 AACCCTGGGA AGTGGGCCAT GGTGTTGGAG GTC
TTで表される塩基配列の内の少なくとも１５塩基からな
る部分配列を有する。
チドを提供する。 【解決手段】 AACCCTGGGA AGTGGGCCAT GGTGTTGGAG GTC
TTで表される塩基配列の内の少なくとも１５塩基からな
る部分配列を有する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗ＨＴＬＶ−Ｉア
ンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。詳細には、成
人Ｔ細胞白血病の原因ウイルスであるＨＴＬＶ−Ｉの遺
伝子の特有の塩基配列に対して相補性を有し、その相補
性を利用してウイルス遺伝子と結合することによって、
ウイルス遺伝子の発現を阻害することができるアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドに関するものである
ンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。詳細には、成
人Ｔ細胞白血病の原因ウイルスであるＨＴＬＶ−Ｉの遺
伝子の特有の塩基配列に対して相補性を有し、その相補
性を利用してウイルス遺伝子と結合することによって、
ウイルス遺伝子の発現を阻害することができるアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドに関するものである
【０００２】
【従来の技術】ＨＴＬＶ−Ｉ １９７６年、日本において成人が罹患するＴ細胞系の白
血病、すなわち成人Ｔ細胞白血病（ａｄｕｌｔ Ｔ−ｃ
ｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ；以下、ＡＴＬと称する）が
新しい白血病として発見された。この白血病の特徴とし
ては、その発生に地域的な偏りがあり、特に九州、四国
地方に集中発生していた。そのようなことから特に病因
に興味が持たれていたが、１９８１年になって、ＡＴＬ
患者が特異な抗体を持つことが発見されたこと、さら
に、ＡＴＬ患者の白血病細胞において、ウイルス様粒子
が見出されたこと、次いで実際のウイルス粒子も分離さ
れたことから、この白血病はウイルス感染がその原因で
あることが明確になった。その原因ウイルスがレトロウ
イルスであり、ＡＴＬ患者が持つ抗体が反応するのはこ
のウイルスのタンパク質であることも証明された。この
ウイルスはＡＴＬＶと命名されたが、後に、米国で発見
されたヒトＴ細胞白血病ウイルス（ｈｕｍａｎＴ−ｃｅ
ｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ；以下、ＨＴＬＶ
と称する）と同一であることが確認され、ＨＴＬＶ−Ｉ
として名称が統一された。ＨＴＬＶ−Ｉの全塩基配列は
解明され〔Seiki, M. et al., Proc Natl. Acad.Sci.
U.S.A., 80, 3618 (1983) 及びInoue, J.-I. et al., V
irology, 150, 187 (1986)〕、発現される遺伝子とその
機能もほぼ解明されている。ＨＴＬＶ−Ｉの構造の概略
を図１に示す。両端に位置し、細胞遺伝子に組み込まれ
る際に用いられるＬＴＲ（ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ
ｒｅｐｅａｔ）、構造遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ及
びｅｎｖ、並びに調節遺伝子であるｔａｘ及びｒｅｘな
どがコードされている。
血病、すなわち成人Ｔ細胞白血病（ａｄｕｌｔ Ｔ−ｃ
ｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ；以下、ＡＴＬと称する）が
新しい白血病として発見された。この白血病の特徴とし
ては、その発生に地域的な偏りがあり、特に九州、四国
地方に集中発生していた。そのようなことから特に病因
に興味が持たれていたが、１９８１年になって、ＡＴＬ
患者が特異な抗体を持つことが発見されたこと、さら
に、ＡＴＬ患者の白血病細胞において、ウイルス様粒子
が見出されたこと、次いで実際のウイルス粒子も分離さ
れたことから、この白血病はウイルス感染がその原因で
あることが明確になった。その原因ウイルスがレトロウ
イルスであり、ＡＴＬ患者が持つ抗体が反応するのはこ
のウイルスのタンパク質であることも証明された。この
ウイルスはＡＴＬＶと命名されたが、後に、米国で発見
されたヒトＴ細胞白血病ウイルス（ｈｕｍａｎＴ−ｃｅ
ｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ；以下、ＨＴＬＶ
と称する）と同一であることが確認され、ＨＴＬＶ−Ｉ
として名称が統一された。ＨＴＬＶ−Ｉの全塩基配列は
解明され〔Seiki, M. et al., Proc Natl. Acad.Sci.
U.S.A., 80, 3618 (1983) 及びInoue, J.-I. et al., V
irology, 150, 187 (1986)〕、発現される遺伝子とその
機能もほぼ解明されている。ＨＴＬＶ−Ｉの構造の概略
を図１に示す。両端に位置し、細胞遺伝子に組み込まれ
る際に用いられるＬＴＲ（ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ
ｒｅｐｅａｔ）、構造遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ及
びｅｎｖ、並びに調節遺伝子であるｔａｘ及びｒｅｘな
どがコードされている。
【０００３】先に述べたように、ＨＴＬＶ−Ｉ感染者の
分布には地域的な偏りがある。日本においては特に九
州、四国南部や沖縄などに集中している。また、世界的
に見ると、太平洋諸島では、フィリピン、パプアニュー
ギニア、ハワイ諸島（日系移民に特に多い）、アメリカ
大陸では、コロンビア、チリ、またカリブ海諸島にもキ
ャリアが多い。アメリカのメキシコ湾地域にも多発す
る。この中でも、日本は世界最大のＡＴＬ発生地であ
る。ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体陽性者すなわちキャリヤ
ーは全国で約１００万人おり、年間５００人以上のＡＴ
Ｌ患者が発生すると言われている。このようなことか
ら、日本において、その対策が特に望まれている。ＨＴ
ＬＶ−Ｉの感染経路としては、（１）母子感染、（２）
性交感染、（３）輸血感染の三つが知られている。特に
（１）の経路では、経胎盤感染、産道感染、および母乳
による感染が考えられる。そのうちで、母親から乳児へ
の授乳による母子感染が主経路であるとされている。
分布には地域的な偏りがある。日本においては特に九
州、四国南部や沖縄などに集中している。また、世界的
に見ると、太平洋諸島では、フィリピン、パプアニュー
ギニア、ハワイ諸島（日系移民に特に多い）、アメリカ
大陸では、コロンビア、チリ、またカリブ海諸島にもキ
ャリアが多い。アメリカのメキシコ湾地域にも多発す
る。この中でも、日本は世界最大のＡＴＬ発生地であ
る。ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体陽性者すなわちキャリヤ
ーは全国で約１００万人おり、年間５００人以上のＡＴ
Ｌ患者が発生すると言われている。このようなことか
ら、日本において、その対策が特に望まれている。ＨＴ
ＬＶ−Ｉの感染経路としては、（１）母子感染、（２）
性交感染、（３）輸血感染の三つが知られている。特に
（１）の経路では、経胎盤感染、産道感染、および母乳
による感染が考えられる。そのうちで、母親から乳児へ
の授乳による母子感染が主経路であるとされている。
【０００４】ＡＴＬの症状及び治療法 ＡＴＬの発症は成人してからであり、発症年齢は２０歳
代から７０歳代に分布し、５０歳代が最も多い。この症
状は多彩で、皮疹、リンパ腫肥大、肝腫大、脾腫が高率
で観察され、肺その他の臓器が冒されることが多い。病
型としては、典型例である急性型と、その他として慢性
型、くすぶり型、急性転化型、リンパ腫型に分類され
る。また、ＨＡＭ（ＨＴＬＶ−Ｉ ａｓｓｏｃｉａｔｅ
ｄ ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ）と呼ばれる中枢神経系の病
気も引き起こすことがあり、ＨＴＬＶ−Ｉが原因となる
ぶどう膜炎を発症する場合もある。ＡＴＬの治療には、
例えば、悪性リンパ腫に対する併用化学療法が行われ、
単独で投与される治療薬としては、２’−デオキシコフ
ォルマイシン（２’−ｄｅｏｘｙｃｏｆｏｒｍｙｃｉ
ｎ）、カンプトテシンの半合成誘導体であるＣＰＴ−１
１、インターフェロン又はＩＬ−２トキシン（ＩＬ−２
ｔｏｘｉｎ）を投与する臨床試験も行われている。し
かし、これらはいずれも十分な治療効果をあげていると
はとても言いがたい状況である。
代から７０歳代に分布し、５０歳代が最も多い。この症
状は多彩で、皮疹、リンパ腫肥大、肝腫大、脾腫が高率
で観察され、肺その他の臓器が冒されることが多い。病
型としては、典型例である急性型と、その他として慢性
型、くすぶり型、急性転化型、リンパ腫型に分類され
る。また、ＨＡＭ（ＨＴＬＶ−Ｉ ａｓｓｏｃｉａｔｅ
ｄ ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ）と呼ばれる中枢神経系の病
気も引き起こすことがあり、ＨＴＬＶ−Ｉが原因となる
ぶどう膜炎を発症する場合もある。ＡＴＬの治療には、
例えば、悪性リンパ腫に対する併用化学療法が行われ、
単独で投与される治療薬としては、２’−デオキシコフ
ォルマイシン（２’−ｄｅｏｘｙｃｏｆｏｒｍｙｃｉ
ｎ）、カンプトテシンの半合成誘導体であるＣＰＴ−１
１、インターフェロン又はＩＬ−２トキシン（ＩＬ−２
ｔｏｘｉｎ）を投与する臨床試験も行われている。し
かし、これらはいずれも十分な治療効果をあげていると
はとても言いがたい状況である。
【０００５】アンチセンス法 近年、化学合成した遺伝子断片を用いて遺伝子発現を制
御し、疾病治療に使用しようという試みがなされるよう
になった。その遺伝子発現制御法の代表的な一例とし
て、アンチセンス法の概略を述べる。病原タンパク質が
合成されるためには、そのアミノ酸組成を特定する固有
の遺伝子の発現が必要になる。すなわち、遺伝子が二重
鎖ＤＮＡから一本鎖ｍＲＮＡに転写され、次にｍＲＮＡ
分子が特定のタンパク質に翻訳されなければならない。
この一本鎖部分の特定の領域に選択的に結合する遺伝子
断片を存在させると、その遺伝子は翻訳が不可能とな
り、遺伝子発現がなされなくなる。１９５３年にワトソ
ンとクリックにより明らかにされたように、ＤＮＡは二
重らせんを形成する性質がある。これは、片方の鎖の核
酸塩基が他方の鎖のそれと水素結合を形成することによ
り行われる。アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）又はウラシ
ル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）が水素結合
を形成する対である。そこで、標的の一本鎖ｍＲＮＡに
対して、これと水素結合を形成することができるような
塩基配列（相補的配列）を備えたオリゴヌクレオチドを
用いれば、二重鎖を形成することによりリボソームによ
る翻訳を妨げ、病原タンパク質は産生されない。アンチ
センス法は、このような作用によって効果をもたらすと
考えられる遺伝子発現制御法である。このような手法
は、ガンやウイルス性疾患のような遺伝子に関わる疾患
の治療薬としての効果に大きな期待が寄せられている。
御し、疾病治療に使用しようという試みがなされるよう
になった。その遺伝子発現制御法の代表的な一例とし
て、アンチセンス法の概略を述べる。病原タンパク質が
合成されるためには、そのアミノ酸組成を特定する固有
の遺伝子の発現が必要になる。すなわち、遺伝子が二重
鎖ＤＮＡから一本鎖ｍＲＮＡに転写され、次にｍＲＮＡ
分子が特定のタンパク質に翻訳されなければならない。
この一本鎖部分の特定の領域に選択的に結合する遺伝子
断片を存在させると、その遺伝子は翻訳が不可能とな
り、遺伝子発現がなされなくなる。１９５３年にワトソ
ンとクリックにより明らかにされたように、ＤＮＡは二
重らせんを形成する性質がある。これは、片方の鎖の核
酸塩基が他方の鎖のそれと水素結合を形成することによ
り行われる。アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）又はウラシ
ル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）が水素結合
を形成する対である。そこで、標的の一本鎖ｍＲＮＡに
対して、これと水素結合を形成することができるような
塩基配列（相補的配列）を備えたオリゴヌクレオチドを
用いれば、二重鎖を形成することによりリボソームによ
る翻訳を妨げ、病原タンパク質は産生されない。アンチ
センス法は、このような作用によって効果をもたらすと
考えられる遺伝子発現制御法である。このような手法
は、ガンやウイルス性疾患のような遺伝子に関わる疾患
の治療薬としての効果に大きな期待が寄せられている。
【０００６】アンチセンス法に用いられる修飾核酸 アンチセンス法に代表されるような遺伝子制御法では、
短鎖の合成遺伝子断片であるオリゴヌクレオチド（通常
は１５〜３０塩基程度の鎖長のもの）が主に用いられ
る。これらのオリゴヌクレオチドには、以下の特性が求
められる。 （１）塩基配列特異性、（２）二重鎖安定性、（３）ヌ
クレアーゼ耐性、（４）細胞膜透過性、（５）低細胞毒
性と適度な代謝性、及び（６）簡便な調製法である。天
然型のＤＮＡ又はＲＮＡをこの手法に用いると、生体内
ですぐに分解し、その効果を示さない。そこで、これら
に修飾を施し、上記の条件に適合するような骨格を用い
なければならない。このような修飾オリゴヌクレオチド
としては、主にそのリン酸ジエステル結合部分を修飾し
たオリゴヌクレオチドが用いられている。主な修飾結合
として、リン酸ジエステル結合の二つの非架橋酸素のう
ちの一つをメチル基に置き換えたメチルホスホネート型
結合、同じくアミノ基若しくは置換アミノ基に置き換え
たホスホロアミデート型結合、同じく硫黄原子に置き換
えたホスホロチオエート型結合、又は二つの非架橋酸素
をともに硫黄原子に置き換えたホスホロジチオエート型
結合などが用いられている。最近では、アンチセンスオ
リゴヌクレオチドが、性器いぼの原因ウイルスであるヒ
トパピローマウイルス、ＡＩＤＳ（後天的免疫不全症候
群）や急性骨髄性白血病などにおいて臨床試験に用いら
れるまでに至った。これらには、ホスホロチオエート型
アンチセンスオリゴヌクレオチドが用いられており、ホ
スホロチオエート型骨格が現在、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドに求められる特性に最も適合する骨格である
と考えられている。
短鎖の合成遺伝子断片であるオリゴヌクレオチド（通常
は１５〜３０塩基程度の鎖長のもの）が主に用いられ
る。これらのオリゴヌクレオチドには、以下の特性が求
められる。 （１）塩基配列特異性、（２）二重鎖安定性、（３）ヌ
クレアーゼ耐性、（４）細胞膜透過性、（５）低細胞毒
性と適度な代謝性、及び（６）簡便な調製法である。天
然型のＤＮＡ又はＲＮＡをこの手法に用いると、生体内
ですぐに分解し、その効果を示さない。そこで、これら
に修飾を施し、上記の条件に適合するような骨格を用い
なければならない。このような修飾オリゴヌクレオチド
としては、主にそのリン酸ジエステル結合部分を修飾し
たオリゴヌクレオチドが用いられている。主な修飾結合
として、リン酸ジエステル結合の二つの非架橋酸素のう
ちの一つをメチル基に置き換えたメチルホスホネート型
結合、同じくアミノ基若しくは置換アミノ基に置き換え
たホスホロアミデート型結合、同じく硫黄原子に置き換
えたホスホロチオエート型結合、又は二つの非架橋酸素
をともに硫黄原子に置き換えたホスホロジチオエート型
結合などが用いられている。最近では、アンチセンスオ
リゴヌクレオチドが、性器いぼの原因ウイルスであるヒ
トパピローマウイルス、ＡＩＤＳ（後天的免疫不全症候
群）や急性骨髄性白血病などにおいて臨床試験に用いら
れるまでに至った。これらには、ホスホロチオエート型
アンチセンスオリゴヌクレオチドが用いられており、ホ
スホロチオエート型骨格が現在、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドに求められる特性に最も適合する骨格である
と考えられている。
【０００７】アンチセンスオリゴヌクレオチドのＨＴＬ
Ｖ−Ｉウイルスへの抑制効果の検討としては、北島らが
行った間葉系腫瘍（ｆｉｂｒｏｍａ）を発症するＨＴＬ
Ｖ−Ｉ ｔａｘトランスジェニックマウスを用いた研究
がある。ｍＲＮＡのｔａｘ翻訳開始部位（ＡＵＧコド
ン）を含む領域をターゲットとし、配列表の配列番号１
７で表される塩基配列を有し、３’末端側のヌクレオシ
ド間結合３個をホスホロチオエート型の結合とし、他は
天然型のリン酸ジエステル型の結合とした塩基数１９の
アンチセンスオリゴヌクレオチド 5' GAAGTGGGCC ATGTG
G*A*A*G 3'（＊は、ホスホロチオエート型結合であるこ
とを示す）を、かなりの高濃度である４０ｍｇ／ｍｌの
濃度で投与したところ、ｔａｘタンパク質の産生が９０
％抑制されることを報告した。しかし、この抑制条件下
では、腫瘍細胞の増殖能や形態は不変であり、活性化さ
れた他の遺伝子（ｃ−ｆｏｓ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、
ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６）の変化も認められなかった
〔Kitajima et al., J. Biol.Chem., 267, 25881-25888
(1992)〕。
Ｖ−Ｉウイルスへの抑制効果の検討としては、北島らが
行った間葉系腫瘍（ｆｉｂｒｏｍａ）を発症するＨＴＬ
Ｖ−Ｉ ｔａｘトランスジェニックマウスを用いた研究
がある。ｍＲＮＡのｔａｘ翻訳開始部位（ＡＵＧコド
ン）を含む領域をターゲットとし、配列表の配列番号１
７で表される塩基配列を有し、３’末端側のヌクレオシ
ド間結合３個をホスホロチオエート型の結合とし、他は
天然型のリン酸ジエステル型の結合とした塩基数１９の
アンチセンスオリゴヌクレオチド 5' GAAGTGGGCC ATGTG
G*A*A*G 3'（＊は、ホスホロチオエート型結合であるこ
とを示す）を、かなりの高濃度である４０ｍｇ／ｍｌの
濃度で投与したところ、ｔａｘタンパク質の産生が９０
％抑制されることを報告した。しかし、この抑制条件下
では、腫瘍細胞の増殖能や形態は不変であり、活性化さ
れた他の遺伝子（ｃ−ｆｏｓ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、
ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６）の変化も認められなかった
〔Kitajima et al., J. Biol.Chem., 267, 25881-25888
(1992)〕。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】今まで述べてきたよう
に、現在のところＨＴＬＶ−Ｉが引き起こす成人Ｔ細胞
白血病（ＡＴＬ）に対して、有効な治療薬は存在しな
い。本発明者らは、図１に示すように、このウイルスの
発現する主要なタンパク質の翻訳開始コドンの近傍、ス
プライシング結合部位、又はタンパク質の結合部位等を
標的とした種々のアンチセンスオリゴヌクレオチドを合
成し、後述する新規なアッセイ系（ウイルス抗原発現抑
制試験）を用いて抗ウイルス効果の高いアンチセンスオ
リゴヌクレオチドの探索を行なったところ、ＨＴＬＶ−
Ｉの遺伝子配列のうち、ｍＲＮＡのｔａｘ翻訳開始部位
（ＡＵＧコドン）を含む領域及びその近傍のアンチセン
スオリゴヌクレオチドが有効であることを見出した。本
発明は、こうした知見に基づくものである。
に、現在のところＨＴＬＶ−Ｉが引き起こす成人Ｔ細胞
白血病（ＡＴＬ）に対して、有効な治療薬は存在しな
い。本発明者らは、図１に示すように、このウイルスの
発現する主要なタンパク質の翻訳開始コドンの近傍、ス
プライシング結合部位、又はタンパク質の結合部位等を
標的とした種々のアンチセンスオリゴヌクレオチドを合
成し、後述する新規なアッセイ系（ウイルス抗原発現抑
制試験）を用いて抗ウイルス効果の高いアンチセンスオ
リゴヌクレオチドの探索を行なったところ、ＨＴＬＶ−
Ｉの遺伝子配列のうち、ｍＲＮＡのｔａｘ翻訳開始部位
（ＡＵＧコドン）を含む領域及びその近傍のアンチセン
スオリゴヌクレオチドが有効であることを見出した。本
発明は、こうした知見に基づくものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、配列表の配列
番号１で表される塩基配列の内の少なくとも１５塩基か
らなる部分配列を有することを特徴とする、オリゴヌク
レオチドに関する。
番号１で表される塩基配列の内の少なくとも１５塩基か
らなる部分配列を有することを特徴とする、オリゴヌク
レオチドに関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明のオリゴヌクレオチドの塩
基配列は、配列表の配列番号１で表される塩基配列の内
の少なくとも１５塩基からなる部分配列を有する。配列
表の配列番号１で表される塩基配列は、ＨＴＬＶ−Ｉの
第５１８８番目〜第５２０６番目及び第７３２５番目〜
第７３４０番目のｔａｘ遺伝子の部分配列〔Seiki, M.
et al., Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 3618-362
2 (1983)〕に相補的な塩基配列であるので、前記部分配
列は、ＨＴＬＶ−Ｉのｔａｘ遺伝子から転写されるｍＲ
ＮＡと特異的に結合して二重鎖を形成することができ
る。
基配列は、配列表の配列番号１で表される塩基配列の内
の少なくとも１５塩基からなる部分配列を有する。配列
表の配列番号１で表される塩基配列は、ＨＴＬＶ−Ｉの
第５１８８番目〜第５２０６番目及び第７３２５番目〜
第７３４０番目のｔａｘ遺伝子の部分配列〔Seiki, M.
et al., Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 3618-362
2 (1983)〕に相補的な塩基配列であるので、前記部分配
列は、ＨＴＬＶ−Ｉのｔａｘ遺伝子から転写されるｍＲ
ＮＡと特異的に結合して二重鎖を形成することができ
る。
【００１１】本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、前
記部分配列、すなわち、アンチセンス領域を構成する塩
基数は、１５塩基以上、好ましくは１５塩基〜３５塩
基、より好ましくは１５〜３０塩基である。１５塩基よ
りも少ない場合には、標的ｍＲＮＡと二重鎖を形成する
ことが困難になり、また、目的の遺伝子以外の遺伝子と
結合する確率が高くなる。３５塩基よりも多い場合に
は、非特異的結合が多くなり、合成も難しくなる。前記
部分配列は、その部分配列からなるオリゴヌクレオチド
が、標的となるｍＲＮＡと特異的に結合して二重鎖を形
成することができる限り、配列表の配列番号１で表され
る塩基配列を連続して含む必要はなく、非相補的塩基１
又はそれ以上が１又はそれ以上の箇所で欠失、挿入及び
／又は置換されていてもよい。しかし、配列表の配列番
号１で表される塩基配列における連続した少なくとも１
５塩基からなる部分配列を含むオリゴヌクレオチドであ
ることが好ましい。
記部分配列、すなわち、アンチセンス領域を構成する塩
基数は、１５塩基以上、好ましくは１５塩基〜３５塩
基、より好ましくは１５〜３０塩基である。１５塩基よ
りも少ない場合には、標的ｍＲＮＡと二重鎖を形成する
ことが困難になり、また、目的の遺伝子以外の遺伝子と
結合する確率が高くなる。３５塩基よりも多い場合に
は、非特異的結合が多くなり、合成も難しくなる。前記
部分配列は、その部分配列からなるオリゴヌクレオチド
が、標的となるｍＲＮＡと特異的に結合して二重鎖を形
成することができる限り、配列表の配列番号１で表され
る塩基配列を連続して含む必要はなく、非相補的塩基１
又はそれ以上が１又はそれ以上の箇所で欠失、挿入及び
／又は置換されていてもよい。しかし、配列表の配列番
号１で表される塩基配列における連続した少なくとも１
５塩基からなる部分配列を含むオリゴヌクレオチドであ
ることが好ましい。
【００１２】本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、各
ヌクレオシド間の結合は、それぞれ独立に、リン酸ジエ
ステル結合、又は修飾リン酸ジエステル結合であること
ができる。修飾リン酸ジエステル結合としては、例え
ば、リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子２個のうち
の酸素原子１個をメチル基に置換したメチルホスホネー
ト結合、リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子２個の
うちの酸素原子１個をアミノ基若しくは置換アミノ基に
置換したホスホロアミデート型結合、リン酸ジエステル
結合の非架橋酸素原子２個のうちの酸素原子１個を硫黄
原子に置換したホスホロチオエート型結合、又はリン酸
ジエステル結合の非架橋酸素原子２個のうちの酸素原子
２個を硫黄原子２個に置換したホスホロジチオエート型
結合などを挙げることができ、それらの１種又はそれ以
上を、ヌクレオシド間の結合の１箇所又はそれ以上の箇
所に導入することができる。塩基配列特異性、二重鎖安
定性、抗ヌクレアーゼ耐性、細胞膜透過性、低細胞毒性
と適度な代謝性、及び簡便な調製法などの点から、修飾
されたリン酸ジエステル結合であることが好ましく、ホ
スホロチオエート型結合であることが特に好ましい。更
に、半分以上（特には全部）のヌクレオシド間の結合が
修飾されたリン酸ジエステル結合（特には、ホスホロチ
オエート型結合）であることが特に好ましい。
ヌクレオシド間の結合は、それぞれ独立に、リン酸ジエ
ステル結合、又は修飾リン酸ジエステル結合であること
ができる。修飾リン酸ジエステル結合としては、例え
ば、リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子２個のうち
の酸素原子１個をメチル基に置換したメチルホスホネー
ト結合、リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子２個の
うちの酸素原子１個をアミノ基若しくは置換アミノ基に
置換したホスホロアミデート型結合、リン酸ジエステル
結合の非架橋酸素原子２個のうちの酸素原子１個を硫黄
原子に置換したホスホロチオエート型結合、又はリン酸
ジエステル結合の非架橋酸素原子２個のうちの酸素原子
２個を硫黄原子２個に置換したホスホロジチオエート型
結合などを挙げることができ、それらの１種又はそれ以
上を、ヌクレオシド間の結合の１箇所又はそれ以上の箇
所に導入することができる。塩基配列特異性、二重鎖安
定性、抗ヌクレアーゼ耐性、細胞膜透過性、低細胞毒性
と適度な代謝性、及び簡便な調製法などの点から、修飾
されたリン酸ジエステル結合であることが好ましく、ホ
スホロチオエート型結合であることが特に好ましい。更
に、半分以上（特には全部）のヌクレオシド間の結合が
修飾されたリン酸ジエステル結合（特には、ホスホロチ
オエート型結合）であることが特に好ましい。
【００１３】本発明のオリゴヌクレオチドは、標的とな
るｍＲＮＡと特異的に結合して二重鎖を形成することが
できる限り、デオキシヌクレオシド、リボヌクレオシ
ド、及び／又はそれらの修飾リボヌクレオシド、例え
ば、２’−Ｏ−修飾リボヌクレオシドから形成すること
ができる。修飾リボヌクレオシドとしては、標的となる
塩基配列との結合力の強さの点から、２’−Ｏ−メチル
リボヌクレオシドが好ましい。
るｍＲＮＡと特異的に結合して二重鎖を形成することが
できる限り、デオキシヌクレオシド、リボヌクレオシ
ド、及び／又はそれらの修飾リボヌクレオシド、例え
ば、２’−Ｏ−修飾リボヌクレオシドから形成すること
ができる。修飾リボヌクレオシドとしては、標的となる
塩基配列との結合力の強さの点から、２’−Ｏ−メチル
リボヌクレオシドが好ましい。
【００１４】本発明のオリゴヌクレオチドは、従来公知
の方法に従って、化学的に合成することができる。例え
ば、各ヌクレオシド間のすべての結合がホスホロチオエ
ート型結合である本発明のオリゴヌクレオチドは、天然
型ＤＮＡの合成法であるホスホアミダイト法を準用し、
ヨウ素酸化工程をテトラエチルチウラムジスルフィド
（ＴＥＴＤ）による硫黄化工程に置き換えることによっ
て、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を使用して合成すること
ができる。通常の脱保護を行った後、逆相クロマトグラ
フィーの手法でトリチル−オン及びトリチル−オフでの
分離精製を行なうことによって、目的のオリゴヌクレオ
チドを精製することができる。
の方法に従って、化学的に合成することができる。例え
ば、各ヌクレオシド間のすべての結合がホスホロチオエ
ート型結合である本発明のオリゴヌクレオチドは、天然
型ＤＮＡの合成法であるホスホアミダイト法を準用し、
ヨウ素酸化工程をテトラエチルチウラムジスルフィド
（ＴＥＴＤ）による硫黄化工程に置き換えることによっ
て、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を使用して合成すること
ができる。通常の脱保護を行った後、逆相クロマトグラ
フィーの手法でトリチル−オン及びトリチル−オフでの
分離精製を行なうことによって、目的のオリゴヌクレオ
チドを精製することができる。
【００１５】本発明のオリゴヌクレオチドの抗ウイルス
効果は、例えば、以下に示すウイルス抗原発現抑制試験
を行なうことによって確認することができる。ウイルス
抗原発現抑制試験とは、ＨＴＬＶ−Ｉ陽性Ｔ細胞株、例
えば、ＭＴ−１細胞〔Miyoshi, I. et al, Gann, 71, 1
55-156 (1980) 〕に発癌物質である１２−Ｏ−テトラデ
カノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）を加
えると、ＨＴＬＶ−Ｉ抗原発現が誘導される現象を利用
したアッセイ系である。具体的には、ＴＰＡと被験対象
のオリゴヌクレオチドとを同時にＭＴ−１細胞に加え、
３日間培養した後、ＨＴＬＶ−Ｉｇａｇ ｐ１９に特異
的に反応するモノクローナル抗体を用いて抗原発現量を
フローサイトメーターにて測定することによって、前記
オリゴヌクレオチドによるウイルス抗原発現量の抑制効
果を調べるものである。
効果は、例えば、以下に示すウイルス抗原発現抑制試験
を行なうことによって確認することができる。ウイルス
抗原発現抑制試験とは、ＨＴＬＶ−Ｉ陽性Ｔ細胞株、例
えば、ＭＴ−１細胞〔Miyoshi, I. et al, Gann, 71, 1
55-156 (1980) 〕に発癌物質である１２−Ｏ−テトラデ
カノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）を加
えると、ＨＴＬＶ−Ｉ抗原発現が誘導される現象を利用
したアッセイ系である。具体的には、ＴＰＡと被験対象
のオリゴヌクレオチドとを同時にＭＴ−１細胞に加え、
３日間培養した後、ＨＴＬＶ−Ｉｇａｇ ｐ１９に特異
的に反応するモノクローナル抗体を用いて抗原発現量を
フローサイトメーターにて測定することによって、前記
オリゴヌクレオチドによるウイルス抗原発現量の抑制効
果を調べるものである。
【００１６】本発明のオリゴヌクレオチドは、ＨＴＬＶ
−Ｉに対する抗ウイルス効果により、ＡＴＬ又はＨＡＭ
等のＨＴＬＶ−Ｉに由来する疾病に対する治療薬として
用いることができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、
以下の推論に限定されるものではないが、細胞膜を通過
して細胞内に入り、ウイルス遺伝子から転写後に２回の
スプライシングを受けたｍＲＮＡのｔａｘの翻訳開始コ
ドンを含むその前後の塩基配列と二重鎖を形成し、ｔａ
ｘタンパク質の産生を抑制することによって、ウイルス
の発現を阻害し、結果として増殖を抑制する作用がある
と考えられる。
−Ｉに対する抗ウイルス効果により、ＡＴＬ又はＨＡＭ
等のＨＴＬＶ−Ｉに由来する疾病に対する治療薬として
用いることができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、
以下の推論に限定されるものではないが、細胞膜を通過
して細胞内に入り、ウイルス遺伝子から転写後に２回の
スプライシングを受けたｍＲＮＡのｔａｘの翻訳開始コ
ドンを含むその前後の塩基配列と二重鎖を形成し、ｔａ
ｘタンパク質の産生を抑制することによって、ウイルス
の発現を阻害し、結果として増殖を抑制する作用がある
と考えられる。
【００１７】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計 以下の実施例で使用するために、本発明のオリゴヌクレ
オチドとしてアンチセンスオリゴヌクレオチド６種類
（以下、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、及びＴ６と称
する）、比較化合物としてアンチセンスオリゴヌクレオ
チド６種類（以下、ＳＪ１、Ｐ１、Ｒ１、ＲＲ１、Ｅ
１、及びＧ１と称する）、並びに対照化合物としてオリ
ゴヌクレオチド４種類（以下、Ｔ１Ｓ、ＨＣ、ＨＴ、及
びＲＡＮと称する）を設計した。比較化合物であるオリ
ゴヌクレオチドＳＪ１、Ｐ１、Ｒ１、ＲＲ１、Ｅ１、及
びＧ１は、それぞれ、配列表の配列番号２〜７で表され
る塩基配列を有する。比較化合物の標的となる塩基配
列、及びそれらの塩基配列とＨＴＬＶ−Ｉ遺伝子との関
係を図１に示す。それぞれの比較化合物の塩基配列は、
図１に示す塩基配列に対する相補的な塩基配列である。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計 以下の実施例で使用するために、本発明のオリゴヌクレ
オチドとしてアンチセンスオリゴヌクレオチド６種類
（以下、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、及びＴ６と称
する）、比較化合物としてアンチセンスオリゴヌクレオ
チド６種類（以下、ＳＪ１、Ｐ１、Ｒ１、ＲＲ１、Ｅ
１、及びＧ１と称する）、並びに対照化合物としてオリ
ゴヌクレオチド４種類（以下、Ｔ１Ｓ、ＨＣ、ＨＴ、及
びＲＡＮと称する）を設計した。比較化合物であるオリ
ゴヌクレオチドＳＪ１、Ｐ１、Ｒ１、ＲＲ１、Ｅ１、及
びＧ１は、それぞれ、配列表の配列番号２〜７で表され
る塩基配列を有する。比較化合物の標的となる塩基配
列、及びそれらの塩基配列とＨＴＬＶ−Ｉ遺伝子との関
係を図１に示す。それぞれの比較化合物の塩基配列は、
図１に示す塩基配列に対する相補的な塩基配列である。
【００１８】対照化合物であるオリゴヌクレオチドＴ１
Ｓ、ＨＣ、ＨＴ、及びＲＡＮのうち、Ｔ１Ｓ、ＨＣ、及
びＨＴは、それぞれ、配列表の配列番号８〜１０で表さ
れる塩基配列を有する。オリゴヌクレオチドＴ１Ｓは、
ｔａｘのセンス配列の一部である。対照化合物であるオ
リゴヌクレオチドＲＡＮは、４種類の塩基をランダムに
組み合わせて合成した塩基数２０のオリゴヌクレオチド
の混合物である。本発明のオリゴヌクレオチドであるＴ
１〜Ｔ６は、塩基数２０個のアンチセンスオリゴヌクレ
オチドであり、それぞれ、配列表の配列番号１１〜１６
で表される塩基配列を有する。それぞれの塩基配列は、
配列表の配列番号１で表される塩基配列の第１０番目〜
第２９番目（Ｔ１）、第１６番目〜第３５番目（Ｔ
２）、第１３番目〜第３２番目（Ｔ３）、第７番目〜第
２６番目（Ｔ４）、第４番目〜第２３番目（Ｔ５）、及
び第１番目〜第２０番目（Ｔ６）の部分配列である。オ
リゴヌクレオチドＴ１〜Ｔ６の標的となる塩基配列を図
２に示す。図２において下線で示すＡＴＧは、ｔａｘタ
ンパク質の開始コドンである。実施例１で設計したこれ
ら全てのオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシド間の結
合がすべてホスホロチオエート型結合となるようにし
た。
Ｓ、ＨＣ、ＨＴ、及びＲＡＮのうち、Ｔ１Ｓ、ＨＣ、及
びＨＴは、それぞれ、配列表の配列番号８〜１０で表さ
れる塩基配列を有する。オリゴヌクレオチドＴ１Ｓは、
ｔａｘのセンス配列の一部である。対照化合物であるオ
リゴヌクレオチドＲＡＮは、４種類の塩基をランダムに
組み合わせて合成した塩基数２０のオリゴヌクレオチド
の混合物である。本発明のオリゴヌクレオチドであるＴ
１〜Ｔ６は、塩基数２０個のアンチセンスオリゴヌクレ
オチドであり、それぞれ、配列表の配列番号１１〜１６
で表される塩基配列を有する。それぞれの塩基配列は、
配列表の配列番号１で表される塩基配列の第１０番目〜
第２９番目（Ｔ１）、第１６番目〜第３５番目（Ｔ
２）、第１３番目〜第３２番目（Ｔ３）、第７番目〜第
２６番目（Ｔ４）、第４番目〜第２３番目（Ｔ５）、及
び第１番目〜第２０番目（Ｔ６）の部分配列である。オ
リゴヌクレオチドＴ１〜Ｔ６の標的となる塩基配列を図
２に示す。図２において下線で示すＡＴＧは、ｔａｘタ
ンパク質の開始コドンである。実施例１で設計したこれ
ら全てのオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシド間の結
合がすべてホスホロチオエート型結合となるようにし
た。
【００１９】実施例２：アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの合成 実施例１で設計した本発明のアンチセンスオリゴヌクレ
オチド、比較化合物であるアンチセンスオリゴヌクレオ
チド、及び対照化合物であるオリゴヌクレオチドの合成
は、ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ社：３９４型）を用いて行った。合成は、
１μｍｏｌスケールで行ない、テトラエチルチウラムジ
スルフィド（ＴＥＴＤ）を硫黄化剤として用いたホスホ
ロチオエート型オリゴヌクレオチド合成プロトコルを用
いて、トリチル−オン（オリゴヌクレオチド鎖の５’末
端のジメトキシトリチル基を結合させた状態で合成を終
了する）の条件で行った。得られたＤＮＡ混合物から目
的の塩基配列を有するＤＮＡの分離精製を、以下の操作
により行った。
ドの合成 実施例１で設計した本発明のアンチセンスオリゴヌクレ
オチド、比較化合物であるアンチセンスオリゴヌクレオ
チド、及び対照化合物であるオリゴヌクレオチドの合成
は、ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ社：３９４型）を用いて行った。合成は、
１μｍｏｌスケールで行ない、テトラエチルチウラムジ
スルフィド（ＴＥＴＤ）を硫黄化剤として用いたホスホ
ロチオエート型オリゴヌクレオチド合成プロトコルを用
いて、トリチル−オン（オリゴヌクレオチド鎖の５’末
端のジメトキシトリチル基を結合させた状態で合成を終
了する）の条件で行った。得られたＤＮＡ混合物から目
的の塩基配列を有するＤＮＡの分離精製を、以下の操作
により行った。
【００２０】合成したＤＮＡを担持した担体に２８％ア
ンモニウム水１ｍｌを加え、１５分間保持した後、担体
とアンモニウム水とを分離した。これを５回繰り返すこ
とにより、担体からのＤＮＡの切出しを行なった。この
操作で得られたＤＮＡを含む水酸化アンモニウム水溶液
合計５ｍｌを密栓し、５５℃で１０時間保持することに
より、核酸塩基の脱保護を行った。反応終了後、溶媒を
留去し、反応副生成物（例えば、不完全な配列のＤＮ
Ａ）を含むＤＮＡを得た。得られた粗ＤＮＡを０．１Ｍ
トリエチルアンモニウムアセテート（以下、ＴＥＡＡと
称する）水溶液１ｍｌに溶解し、分離用カラム（Ｍｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ社：Ｓｅｐ−ｐａｋ ｐｌｕｓ）に注入し
た。０．１Ｍ−ＴＥＡＡ水溶液（８５％）とアセトニト
リル（１５％）との混合溶液５ｍｌで分離用カラムを洗
浄し、不完全な配列のＤＮＡ（ｆａｉｌｕｒｅ ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅｓ）を除去した。０．１Ｍ−ＴＥＡＡ水溶液
（５０％）とアセトニトリル（５０％）との混合溶液５
ｍｌにより、目的とするＤＮＡを流出させた。アセトニ
トリル 5ｍｌで洗浄し、目的とするＤＮＡが流出しない
ことを確認した。得られた溶液の溶媒を減圧下、遠心濃
縮器で溶媒留去し、トリチル−オンの状態のＤＮＡを得
た。
ンモニウム水１ｍｌを加え、１５分間保持した後、担体
とアンモニウム水とを分離した。これを５回繰り返すこ
とにより、担体からのＤＮＡの切出しを行なった。この
操作で得られたＤＮＡを含む水酸化アンモニウム水溶液
合計５ｍｌを密栓し、５５℃で１０時間保持することに
より、核酸塩基の脱保護を行った。反応終了後、溶媒を
留去し、反応副生成物（例えば、不完全な配列のＤＮ
Ａ）を含むＤＮＡを得た。得られた粗ＤＮＡを０．１Ｍ
トリエチルアンモニウムアセテート（以下、ＴＥＡＡと
称する）水溶液１ｍｌに溶解し、分離用カラム（Ｍｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ社：Ｓｅｐ−ｐａｋ ｐｌｕｓ）に注入し
た。０．１Ｍ−ＴＥＡＡ水溶液（８５％）とアセトニト
リル（１５％）との混合溶液５ｍｌで分離用カラムを洗
浄し、不完全な配列のＤＮＡ（ｆａｉｌｕｒｅ ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅｓ）を除去した。０．１Ｍ−ＴＥＡＡ水溶液
（５０％）とアセトニトリル（５０％）との混合溶液５
ｍｌにより、目的とするＤＮＡを流出させた。アセトニ
トリル 5ｍｌで洗浄し、目的とするＤＮＡが流出しない
ことを確認した。得られた溶液の溶媒を減圧下、遠心濃
縮器で溶媒留去し、トリチル−オンの状態のＤＮＡを得
た。
【００２１】得られたＤＮＡに８０％酢酸２４０μｌを
加え、１５分間反応させることにより、脱トリチル反応
を行った。反応終了後、酢酸を手早く減圧下、遠心濃縮
器で留去した。０．１Ｍ−ＴＥＡＡ水溶液２４００μｌ
を加えた後、更にエーテル２４００μｌを加え、エーテ
ル可溶分を抽出除去した。得られた溶液を、０．１Ｍ−
ＴＥＡＡ水溶液（Ａ液）／５０％アセトニトリルを含む
０．１Ｍ−ＴＥＡＡ水溶液（１Ｍ−ＴＥＡＡ水溶液と超
純水とアセトリトリルとを１：４：５の体積比で混合し
た溶液：Ｂ液）〔グラジエント：Ｂ液１０％（０分）、
Ｂ液２５％（１２．５分）、Ｂ液１００％（２２．０
分）、Ｂ液１００％（２７．０分）、Ｂ液１０％（３
０．０分）〕を用いて溶出する逆相液体クロマトグラフ
ィー〔カラム：ＯＤＳ−Ｘ １５０Ｌ Ｘ ６ｍｍＩ．
Ｄ．（信和化工）、流量：１ｍｌ／分〕により精製し
た。なお、Ｂ液に用いた超純水は、Ｍｉｌｌｉ−ＱIIシ
ステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）により精製した。溶出
液は３〜５回に分けて分取し、減圧下、遠心濃縮器で溶
媒留去した後、超純水に溶解し、凍結乾燥した。これを
再度行ない、トリチル−オフの状態のＤＮＡを得た。得
られたＤＮＡは、逆相液体クロマトグラフィーによって
単一のピークになることを確認した。
加え、１５分間反応させることにより、脱トリチル反応
を行った。反応終了後、酢酸を手早く減圧下、遠心濃縮
器で留去した。０．１Ｍ−ＴＥＡＡ水溶液２４００μｌ
を加えた後、更にエーテル２４００μｌを加え、エーテ
ル可溶分を抽出除去した。得られた溶液を、０．１Ｍ−
ＴＥＡＡ水溶液（Ａ液）／５０％アセトニトリルを含む
０．１Ｍ−ＴＥＡＡ水溶液（１Ｍ−ＴＥＡＡ水溶液と超
純水とアセトリトリルとを１：４：５の体積比で混合し
た溶液：Ｂ液）〔グラジエント：Ｂ液１０％（０分）、
Ｂ液２５％（１２．５分）、Ｂ液１００％（２２．０
分）、Ｂ液１００％（２７．０分）、Ｂ液１０％（３
０．０分）〕を用いて溶出する逆相液体クロマトグラフ
ィー〔カラム：ＯＤＳ−Ｘ １５０Ｌ Ｘ ６ｍｍＩ．
Ｄ．（信和化工）、流量：１ｍｌ／分〕により精製し
た。なお、Ｂ液に用いた超純水は、Ｍｉｌｌｉ−ＱIIシ
ステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）により精製した。溶出
液は３〜５回に分けて分取し、減圧下、遠心濃縮器で溶
媒留去した後、超純水に溶解し、凍結乾燥した。これを
再度行ない、トリチル−オフの状態のＤＮＡを得た。得
られたＤＮＡは、逆相液体クロマトグラフィーによって
単一のピークになることを確認した。
【００２２】実施例３：ウイルス抗原発現抑制試験
（Ｉ） ＭＴ−１細胞（ＨＴＬＶ−Ｉ陽性Ｔ細胞株）〔Miyoshi,
I. et al, Gann, 71,155-156 (1980) 〕を、１０％ウ
シ胎児血清（ＦＣＳ）含有のＲＰＭＩ１６４０培地を用
いて、３７℃で経時培養した。培養したＭＴ−１細胞
を、６×１０5 細胞／６００μｌの濃度になるように、
１０％ＦＣＳと抗生物質〔ペニシリンＧカリウム（５万
単位／リットル）及びストレプトマイシン（５０ｍｇ／
リットル）〕とを含むＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁し
た。懸濁したＭＴ−１細胞を、最終容量６００μｌ／穴
となるように、４８穴丸底プレートに分注した。各ウェ
ルに最終濃度が１ｎｇになるようにＴＰＡを添加し、更
に、実施例２で得られた各オリゴヌクレオチドのうち、
本発明のオリゴヌクレオチドであるＴ１、比較化合物で
あるＳＪ１、Ｐ１、Ｒ１、ＲＲ１、Ｅ１、若しくはＧ
１、又は対照化合物であるＴ１Ｓ、ＨＣ、ＨＴ、若しく
はＲＡＮを各ウエルに最終濃度で０．１μＭとなるよう
に加え、３７℃のＣＯ2 インキュベータで３日間培養し
た。
（Ｉ） ＭＴ−１細胞（ＨＴＬＶ−Ｉ陽性Ｔ細胞株）〔Miyoshi,
I. et al, Gann, 71,155-156 (1980) 〕を、１０％ウ
シ胎児血清（ＦＣＳ）含有のＲＰＭＩ１６４０培地を用
いて、３７℃で経時培養した。培養したＭＴ−１細胞
を、６×１０5 細胞／６００μｌの濃度になるように、
１０％ＦＣＳと抗生物質〔ペニシリンＧカリウム（５万
単位／リットル）及びストレプトマイシン（５０ｍｇ／
リットル）〕とを含むＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁し
た。懸濁したＭＴ−１細胞を、最終容量６００μｌ／穴
となるように、４８穴丸底プレートに分注した。各ウェ
ルに最終濃度が１ｎｇになるようにＴＰＡを添加し、更
に、実施例２で得られた各オリゴヌクレオチドのうち、
本発明のオリゴヌクレオチドであるＴ１、比較化合物で
あるＳＪ１、Ｐ１、Ｒ１、ＲＲ１、Ｅ１、若しくはＧ
１、又は対照化合物であるＴ１Ｓ、ＨＣ、ＨＴ、若しく
はＲＡＮを各ウエルに最終濃度で０．１μＭとなるよう
に加え、３７℃のＣＯ2 インキュベータで３日間培養し
た。
【００２３】オリゴヌクレオチドを添加してから３日後
に、培地を除去し、細胞を１．５ｍｌのチューブに移し
た。リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕ
ｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：以下、ＰＢＳ溶液と称す
る）で洗浄し、各チューブに７０％エタノールを含有す
るＰＢＳ溶液１ｍｌを加えて１分間保持することによっ
て細胞を固定した後、ＰＢＳ溶液に懸濁した。次に、一
次抗体として、５０倍に希釈したＨＴＬＶ−Ｉｇａｇ
ｐ１９に特異的なマウスモノクローナル抗体ＧＩＮ１４
〔Tanaka, Y. et al., Japanese Journal of Cancer Re
search, 74, 327-330 (1983)〕３０μｌを各チューブに
加え、３７℃で一時間保持した。各チューブをＰＢＳで
洗浄し、２次抗体として、２０倍希釈のＦＩＴＣ標識抗
マウスＩｇＧ抗体（ＣＡＰＰＥＬ社）３０μｌを各チュ
ーブに加え、３７℃で１時間保持した。最後に、各細胞
をＰＢＳで洗浄し、抗原発現量をフローサイトメーター
にて測定（波長４８８ｎｍ）した。
に、培地を除去し、細胞を１．５ｍｌのチューブに移し
た。リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕ
ｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ：以下、ＰＢＳ溶液と称す
る）で洗浄し、各チューブに７０％エタノールを含有す
るＰＢＳ溶液１ｍｌを加えて１分間保持することによっ
て細胞を固定した後、ＰＢＳ溶液に懸濁した。次に、一
次抗体として、５０倍に希釈したＨＴＬＶ−Ｉｇａｇ
ｐ１９に特異的なマウスモノクローナル抗体ＧＩＮ１４
〔Tanaka, Y. et al., Japanese Journal of Cancer Re
search, 74, 327-330 (1983)〕３０μｌを各チューブに
加え、３７℃で一時間保持した。各チューブをＰＢＳで
洗浄し、２次抗体として、２０倍希釈のＦＩＴＣ標識抗
マウスＩｇＧ抗体（ＣＡＰＰＥＬ社）３０μｌを各チュ
ーブに加え、３７℃で１時間保持した。最後に、各細胞
をＰＢＳで洗浄し、抗原発現量をフローサイトメーター
にて測定（波長４８８ｎｍ）した。
【００２４】この結果を図３に示す。図３において、ｎ
ｏ−ｏｌｉｇｏとは、オリゴヌクレオチド無添加の場合
を意味する。フローサイトメーターの測定結果から、全
細胞数及び蛍光陽性細胞数を求め、蛍光陽性細胞の割
合、すなわち抗原発現陽性細胞の割合を計算した。な
お、蛍光陽性細胞と蛍光陰性細胞との境界値は、陰性対
照として、２次抗体を添加しない試料を用いて決定し
た。ＭＴ−１細胞を用いたウイルス抗原発現抑制試験か
ら明らかなように、本発明のオリゴヌクレオチドである
Ｔ１の効果が特に大きかった。すなわち、本実施例に用
いた他のすべての化合物が、抗原発現陽性細胞の割合が
２５％以上であったのに対して、Ｔ１のみが２０％以下
の値を示した。
ｏ−ｏｌｉｇｏとは、オリゴヌクレオチド無添加の場合
を意味する。フローサイトメーターの測定結果から、全
細胞数及び蛍光陽性細胞数を求め、蛍光陽性細胞の割
合、すなわち抗原発現陽性細胞の割合を計算した。な
お、蛍光陽性細胞と蛍光陰性細胞との境界値は、陰性対
照として、２次抗体を添加しない試料を用いて決定し
た。ＭＴ−１細胞を用いたウイルス抗原発現抑制試験か
ら明らかなように、本発明のオリゴヌクレオチドである
Ｔ１の効果が特に大きかった。すなわち、本実施例に用
いた他のすべての化合物が、抗原発現陽性細胞の割合が
２５％以上であったのに対して、Ｔ１のみが２０％以下
の値を示した。
【００２５】本発明のオリゴヌクレオチドであるＴ１添
加、対照化合物であるＴ１Ｓ添加、及びオリゴヌクレオ
チド無添加の場合のフロサイトメトリーの結果を、図４
に示す。図４から明らかなように、オリゴヌクレオチド
無添加又は対照化合物であるＴ１Ｓ添加の場合と比較し
て、本発明のオリゴヌクレオチドであるＴ１のウイルス
抗原発現抑制効果が著しく高かった。
加、対照化合物であるＴ１Ｓ添加、及びオリゴヌクレオ
チド無添加の場合のフロサイトメトリーの結果を、図４
に示す。図４から明らかなように、オリゴヌクレオチド
無添加又は対照化合物であるＴ１Ｓ添加の場合と比較し
て、本発明のオリゴヌクレオチドであるＴ１のウイルス
抗原発現抑制効果が著しく高かった。
【００２６】実施例４：ウイルス抗原発現抑制試験（I
I） 被験化合物として、実施例２で得られたオリゴヌクレオ
チドのうち、本発明のオリゴヌクレオチドであるＴ１〜
Ｔ６、又は対照化合物であるＴ１Ｓ若しくはＲＡＮを用
いること以外は実施例３と同様の操作を行なった。結果
を図５に示す。Ｔ１〜Ｔ６のアンチセンスオリゴヌクレ
オチドすべてが、対照化合物に対して大きな効果を示
し、抗原発現陽性細胞の発現率は、すべて２３％以下で
あった。
I） 被験化合物として、実施例２で得られたオリゴヌクレオ
チドのうち、本発明のオリゴヌクレオチドであるＴ１〜
Ｔ６、又は対照化合物であるＴ１Ｓ若しくはＲＡＮを用
いること以外は実施例３と同様の操作を行なった。結果
を図５に示す。Ｔ１〜Ｔ６のアンチセンスオリゴヌクレ
オチドすべてが、対照化合物に対して大きな効果を示
し、抗原発現陽性細胞の発現率は、すべて２３％以下で
あった。
【００２７】
【発明の効果】本発明のオリゴヌクレオチドを用いるこ
とによって、ＨＴＬＶ−Ｉ抗原発現を抑制することがで
きる。
とによって、ＨＴＬＶ−Ｉ抗原発現を抑制することがで
きる。
【００２８】
【００２９】配列番号：１ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 AACCCTGGGA AGTGGGCCAT GGTGTTGGAG GTCTT 35
【００３０】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド アンチセンス：Ｙｅｓ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート
型結合である。 配列 GACCAGGAAG CTAGACGGCG 20
型結合である。 配列 GACCAGGAAG CTAGACGGCG 20
【００３１】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド アンチセンス：Ｙｅｓ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート
型結合である。 配列 GATAACGCGT CCATCGATGG 20
型結合である。 配列 GATAACGCGT CCATCGATGG 20
【００３２】配列番号：４ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド アンチセンス：Ｙｅｓ 配列の特徴 存在位置：１．．１９ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート
型結合である。 配列 GGTCTTGGGC ATGCAGCTC 19
型結合である。 配列 GGTCTTGGGC ATGCAGCTC 19
【００３３】配列番号：５ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド アンチセンス：Ｙｅｓ 配列の特徴 存在位置：１．．１７ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート
型結合である。 配列 CCCGGTCTCG ACCTGAG 17
型結合である。 配列 CCCGGTCTCG ACCTGAG 17
【００３４】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド アンチセンス：Ｙｅｓ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート
型結合である。 配列 AACTTACCCA TGGTGTTGGA 20
型結合である。 配列 AACTTACCCA TGGTGTTGGA 20
【００３５】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド アンチセンス：Ｙｅｓ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート
型結合である。 配列 GATTTGGCCC ATTGCCTAGG 20
型結合である。 配列 GATTTGGCCC ATTGCCTAGG 20
【００３６】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート
型結合である。 配列 TCCAACACCA TGGCCCACTT 20
型結合である。 配列 TCCAACACCA TGGCCCACTT 20
【００３７】配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート
型結合である。 配列 CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC 20
型結合である。 配列 CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC 20
【００３８】配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート
型結合である。 配列 TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 20
型結合である。 配列 TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 20
【００３９】配列番号：１１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド アンチセンス：Ｙｅｓ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート
型結合である。 配列 AAGTGGGCCA TGGTGTTGGA 20
型結合である。 配列 AAGTGGGCCA TGGTGTTGGA 20
【００４０】配列番号：１２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド アンチセンス：Ｙｅｓ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート
型結合である。 配列 GCCATGGTGT TGGAGGTCTT 20
型結合である。 配列 GCCATGGTGT TGGAGGTCTT 20
【００４１】配列番号：１３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド アンチセンス：Ｙｅｓ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート
型結合である。 配列 TGGGCCATGG TGTTGGAGGT 20
型結合である。 配列 TGGGCCATGG TGTTGGAGGT 20
【００４２】配列番号：１４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド アンチセンス：Ｙｅｓ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート
型結合である。 配列 GGGAAGTGGG CCATGGTGTT 20
型結合である。 配列 GGGAAGTGGG CCATGGTGTT 20
【００４３】配列番号：１５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド アンチセンス：Ｙｅｓ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート
型結合である。 配列 CCTGGGAAGT GGGCCATGGT 20
型結合である。 配列 CCTGGGAAGT GGGCCATGGT 20
【００４４】配列番号：１６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド アンチセンス：Ｙｅｓ 配列の特徴 存在位置：１．．２０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート
型結合である。 配列 AACCCTGGGA AGTGGGCCAT 20
型結合である。 配列 AACCCTGGGA AGTGGGCCAT 20
【００４５】配列番号：１７ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド アンチセンス：Ｙｅｓ 配列の特徴 存在位置：１６．．１９ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ヌクレオシド間の結合はホスホロチオエート
型結合である。 配列 GAAGTGGGCC ATGTGGAAG 19
型結合である。 配列 GAAGTGGGCC ATGTGGAAG 19
【００４６】
【図１】ＨＴＬＶ−Ｉの構造並びに本発明のオリゴヌク
レオチドであるＴ１及び比較化合物の標的となる塩基配
列を示す説明図である。
レオチドであるＴ１及び比較化合物の標的となる塩基配
列を示す説明図である。
【図２】本発明のオリゴヌクレオチドであるＴ１〜Ｔ６
の標的となる塩基配列を示す説明図である。
の標的となる塩基配列を示す説明図である。
【図３】本発明のオリゴヌクレオチドであるＴ１、比較
化合物、又は対照化合物によるウイルス抗原発現抑制試
験の結果を示すグラフである。
化合物、又は対照化合物によるウイルス抗原発現抑制試
験の結果を示すグラフである。
【図４】本発明のオリゴヌクレオチドであるＴ１又は対
照化合物であるＴ１Ｓによるウイルス抗原発現抑制試験
のフローサイトメトリーの結果を示す説明図である。
照化合物であるＴ１Ｓによるウイルス抗原発現抑制試験
のフローサイトメトリーの結果を示す説明図である。
【図５】本発明のオリゴヌクレオチドであるＴ１〜Ｔ６
によるウイルス抗原発現抑制試験の結果を示すグラフで
ある。
によるウイルス抗原発現抑制試験の結果を示すグラフで
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山本 直樹 東京都渋谷区恵比寿南３−11−17 原町住 宅501号
Claims (4)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１で表される塩基配列
の内の少なくとも１５塩基からなる部分配列を有するこ
とを特徴とする、オリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 前記の部分配列がＣＡＴで表される塩基
配列を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 修飾リン酸ジエステル結合を含む、請求
項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】 修飾リン酸ジエステル結合がホスホロチ
オエート型結合である、請求項３に記載のオリゴヌクレ
オチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22460695A JPH0952898A (ja) | 1995-08-09 | 1995-08-09 | 抗ｈｔｌｖ−ｉアンチセンスオリゴヌクレオチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22460695A JPH0952898A (ja) | 1995-08-09 | 1995-08-09 | 抗ｈｔｌｖ−ｉアンチセンスオリゴヌクレオチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0952898A true JPH0952898A (ja) | 1997-02-25 |
Family
ID=16816367
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22460695A Pending JPH0952898A (ja) | 1995-08-09 | 1995-08-09 | 抗ｈｔｌｖ−ｉアンチセンスオリゴヌクレオチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0952898A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106957844A (zh) * | 2017-04-20 | 2017-07-18 | 华侨大学 | 一种能有效敲除HTLV‑1病毒基因组的CRISPR/Cas9的gRNA序列 |
-
1995
- 1995-08-09 JP JP22460695A patent/JPH0952898A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106957844A (zh) * | 2017-04-20 | 2017-07-18 | 华侨大学 | 一种能有效敲除HTLV‑1病毒基因组的CRISPR/Cas9的gRNA序列 |
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