JPH10507635A - 遺伝子発現をダウンレギュレートするための２’−置換オリゴヌクレオチドの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 動物中の遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法であって、該遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を動物に経口投与することを特徴とする方法が開示される。投与する該オリゴヌクレオチドは非ホスホジエステルインターヌクレオチド結合を有し、少なくとも一つの２'−置換リボヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドは該遺伝子産物の発現を抑制することによって該遺伝子の発現をダウンレギュレートする。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子発現をダウンレギュレートするための２'−置換オリゴヌクレオチドの使 用 発明の背景 本発明は、遺伝子発現の制御に関する。さらに詳しくは、本発明は動物中で遺 伝子の発現をダウンレギュレート（down-regulate）するための合成オリゴヌク レオチドの使用に関する。 アンチセンスオリゴヌクレオチド治療法の開発の可能性は、最初、１９７７年 および１９７８年に発行された３つの論文で示唆された。パターソン（Ｐaterso n）ら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）（１９７７）７４：４３７０〜４３ ７４）は、セルフリーのｍＲＮＡ翻訳が該ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチ ドの結合によって抑制されうることを開示している。ザメクニク（Ｚamecnik） ら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）（１９７８）７５：２８０〜２８４お よび２８５〜２８８）は、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ゲノムの一部に相補的 な１３ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドが感染ニワトリ線維芽細胞中でのＲＳＶ の複製を抑制し、初代ニワトリ線維芽細胞の悪性肉腫細胞へのＲＳＶ媒体トラン スフォーメーションを抑制することを開示している。 合成オリゴヌクレオチドがウイルスの増殖および腫瘍形成を抑制するのに使用 しうるというこれら初期の指摘に続いて、ＨＩＶ（たとえば、米国特許第４，８ ０６，４６３号参照）、インフルエンザ（たとえば、ライター（Ｌeiter）ら（ １９９０）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）８７：３４３０〜３４３４参照 ）、水泡性口内炎ウイルス（たとえば、アグリス（Ａgris）ら（１９８６）Ｂio chem.２５：６２６８〜６２７５参照）、単純ヘルペス（たとえば、ガオ（Ｇao ）ら（１９９０）Ａntimicrob.Ａgents Ｃhem.３４：８０８〜８１２参照）、Ｓ Ｖ４０（たとえば、バーグ（Ｂirg）ら（１９９０）Ｎucleic Ａcids Ｒes.１８ ：２９０１〜２９０８参照）およびヒトパピローマウイルス（たとえば、ストレ イ（Ｓtorey）ら（１９９１）Ｎucleic Ａcids Ｒes.１９：４１０９〜４１１４ 参照）などの 広範囲のウイルスを抑制するための合成オリゴヌクレオチドの使用が示されてい る。近年、抗ウイルス剤としての合成オリゴヌクレオチドおよびそのアナログの 使用はアグラワル（Ａgrawal）によって詳しく検討されている（Ｔrends in Ｂi otech.（１９９２）１０：１５２〜１５８）。 さらに、種々の非ウイルス性の病原体を抑制するため、並びにある種の細胞遺 伝子の発現を選択的に抑制するために合成オリゴヌクレオチドが使用されている 。それゆえ、ウイルスの増殖、非ウイルス性の病原体の増殖および細胞遺伝子の 選択的発現を抑制する試薬としての合成オリゴヌクレオチドの有用性は充分に確 立されている。 このようなウイルス、病原体および選択的な遺伝子発現の抑制においてより効 果的な改良されたオリゴヌクレオチドがもっと最近になって開発されている。イ ンターヌクレオチド結合に修飾を有するこれらオリゴヌクレオチドの幾つかは、 非修飾の対応物に比べて一層効果的であることが示されている。たとえば、アグ ラワルら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）（１９８８）８５：７０７９〜 ７０８３）は、ホスホジエステル結合した通常のオリゴデオキシヌクレオチドに 比べてオリゴヌクレオチドホスホロチオエートおよびある種のオリゴヌクレオチ ドホスホルアミデートがＨＩＶ−１を抑制するうえで一層効果的であることを教 示している。アグラワルら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）（１９８９） ８６：７７９０〜７７９４）は、初期および臨床的に感染した細胞においてＨＩ Ｖ−１を抑制するうえでオリゴヌクレオチドホスホロチオエートが有利であるこ とを開示している。 さらに、オリゴヌクレオチド内に１を越えるタイプのインターヌクレオチド結 合をペするキメラオリゴヌクレオチドが開発されている。ペダーソン（Ｐederso n）ら（米国特許第５,１４９,７９７号および同第５,２２０,００７号）は、ヌ クレオチドメチルホスホネートまたはホスホルアミデートによってフランキング されたオリゴヌクレオチドホスホジエステルまたはオリゴヌクレオチドホスホロ チオエートコア配列を有するキメラオリゴヌクレオチドを開示している。ファー ドン（Ｆurdon）ら(Ｎucleic Ａcids Ｒes.（１９８９）１７：９１９３〜９２ ０４） は、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートかまたはメチルホスホネート領域に 加えてオリゴヌクレオチドホスホジエステルの領域を有するキメラオリゴヌクレ オチドを開示している。カーチン（Ｑuartin）ら（Ｎucleic Ａcids Ｒes.（１ ９８９）１７：７５２３〜７５６２）は、オリゴヌクレオチドホスホジェステル およびオリゴヌクレオチドメチルホスホネートの領域を有するキメラオリゴヌク レオチドを開示している。イノウエ（Ｉnoue）ら（ＦＥＢＳ Ｌett.（１９８７ ）２１５：２３７〜２５０）は、デオキシリボヌクレオチドおよび２'−Ｏ−メ チルーリボヌクレオチドの領域を有するキメラオリゴヌクレオチドを開示してい る。 これら修飾オリゴヌクレオチドの多くはアンチセンスオリゴヌクレオチド治療 法の潜在的な効能を改善するのに貢献してきている。しかしながら、これら公知 のオリゴヌクレオチドにはある種の欠点が依然として存在し、これら欠点はこれ らオリゴヌクレオチドの治療剤としての有効性を制限しうる。たとえば、ウイッ クストローム（Ｗickstrom）（Ｊ.Ｂiochem.Ｂiophys.Ｍeth.（１９８６）１３ ：９７〜１０２）は、オリゴヌクレオチドのホスホジエステルがヌクレアーゼに より媒体された分解を受けやすく、それゆえインビホでの生体利用性が制限され ることを教示している。アグラワルら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）（ １９９０）８７：１４０１〜１４０５）は、オリゴヌクレオチドホスホルアミデ ートまたはメチルホスホネートはＲＮＡにハイブリダイズしたときにＲＮアーゼ Ｈを活性化しないことを教示しているが、このＲＮアーゼＨの活性化はアンチセ ンスオリゴヌクレオチドの機能にとって重要である。それゆえ、治療学的特性が 改善されたオリゴヌクレオチドを使用した遺伝子発現の制御方法に対する必要性 が存在する。 潜在的なＡＩＤＳ治療剤としてのホスホロチオエート結合したオリゴヌクレオ チドの開発に関して幾つかの報告が刊行されている。オリゴヌクレオチドの化学 的および分子的なメカニズムに関する広範な研究はこの治療戦略の潜在的な価値 を示してはいるものの、これら化合物のインビボでの薬動力学および代謝につい ては殆どわかっていない。 最近、このトピックに関して予備的な研究が刊行された。アグラワルら（Ｐro c. Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）（１９９１）８８：７５９５〜７５９９）は、２ ０−ｍｅｒのホスホロチオエート結合したオリゴヌクレオチドのマウスへの静脈 内および腹腔内投与を記載している。この研究では、投与した投与量の約３０％ が最初の２４時間に尿中に排泄され、主として肝臓および腎臓に蓄積した。血漿 半減期はそれぞれ約１時間（ｔ_{1/2 α}）から４０時間（ｔ_{1/2 β}）の範囲であった 。同様の結果はその後の研究においても報告されている（イバーセン（Ｉversen ）（１９９１）Ａnti−Ｃancer Ｄrug Ｄesign６：５３１〜５３８；イバーセン （１９９４）Ａntisense Ｒes.Ｄevel.４：４３〜５２；およびサンズ（Ｓands ）（１９９４）Ｍol.Ｐharm.４５：９３２〜９４３）。しかしながら、オリゴヌ クレオチドを静脈内および腹腔内投与した場合に安定性の問題がある。 それゆえ、治療すべき動物および条件およびターゲティングすべき遺伝子に適 合させるべく容易に操作できる、遺伝子の発現をダウンレギュレートするための 一層有効な治療法を開発する必要性が依然として存在する。好ましくは、これら 方法は、遺伝子をターゲテイングするうえで簡単で痛みがなく正確でなければな らない。発明の要約 本発明は、動物における遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法を提供す るものであり、該方法は該遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドを経口で投与す ることを含み、それによって静脈内や他のインビボ投与法の形態において経験さ れる複雑化（complications）が回避される。 ある種のオリゴヌクレオチド（ホスホジエステル以外の結合を有し、少なくと も一つの２'−置換リボヌクレオチドを有する）は動物に経口投与した後にイン ビボで比較的安定であり、これら分子が胃腸管から有効に吸収され種々の生体組 織に分布することがわかった。この発見を活用して、動物における遺伝子の発現 をダウンレギュレートする方法である本発明を開発した。 この方法はまた、動物における種々の遺伝子（動物の成長に必須の遺伝子を含 む）の機能を調べる手段でもある。現在のところ、遺伝子の機能はマウスなどの 「ノックアウト」動物を作製するという骨の折れる仕事によってのみ調べること ができる。この仕事は困難であり、時間を要し、しかも「ノックアウト」が致死 的な表現型を生じるために動物の成長に必須の遺伝子については行うことができ ない。本発明は、このモデルの欠点を克服するものである。 本発明の方法において、標的遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドを含有する 医薬組成物を薬理学的に許容しうる担体中にて該遺伝子を有する動物に経口で投 与する。該オリゴヌクレオチドは該遺伝子の発現を抑制し、それによってその発 現をダウンレギュレートする。 本発明の目的のためには「動物」なる語は、ヒト並びに他の哺乳動物、並びに 爬虫類、両生類および昆虫を包含する。「経口投与」なる語は、食物摂取による 口を介した、または食道を含む胃腸管系の他の部分を介した調合物の提供をいう 。 本明細書において「オリゴヌクレオチド」なる語は、５'→３'インターヌクレ オチド結合により連結された２またはそれ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチ ドアナログのポリマー（アンチセンス技術の分野で知られた結合を含んでいてよ い）を含むことを意味する。そのような分子は３'末端および５'末端を有する。 投与する特定のオリゴヌクレオチドは少なくとも一つの２'−置換リボヌクレオ チドを含み、非ホスホジエステルインターヌクレオチド結合により連結されてい る。 本発明の目的のためには、「２'−置換オリゴヌクレオチド」なる語は、その ２'位にてヒドロキシル基以外の化学基に結合した糖を有するオリゴヌクレオチ ドをいう。リボース分子の２'−ＯＨは、炭素数１〜６の−Ｏ−低級アルキル、 アリールまたは置換アリールまたは炭素数２〜６のアリル、たとえば２'−Ｏ− アリル、２'−Ｏ−アリール、２'−Ｏ−アルキル（２'−Ｏ−メチルなど）、２' −ハロ、または２'−アミノなどで置換されていてよいが、２'−Ｈで置換されて いてはならず、その際、アリル、アリールまたはアルキル基は置換されていなく てもよいし、またはハロゲン、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニト ロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルブアルコキシルま たはアミノ基で置換されていてもよい。 本明細書において用いる「非ホスホジエステル結合したオリゴヌクレオチド」 なる語は、そのヌクレオチドのすべてが合成結合、すなわち一方のヌクレオチド の５'端と他方のヌクレオチドの３'端との間のホスホジエステル以外の結合であ って５'ヌクレオチドリン酸が化学基で置換されているものを介して共有結合し ているオリゴヌクレオチドである。好ましい合成結合としては、アルキルホスホ ネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエ ート、ホスホルアミデート、ホスホルアミダイト、リン酸エステル、カルバメー ト、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデートおよびカルボキシメ チルエステルが挙げられる。本発明の一つの好ましい態様において、オリゴヌク レオチド中のすべてのヌクレオチドがホスホロチオエートおよび／またはホスホ ロジチオエートを介して結合している。 本発明の幾つかの態様において、投与すべきオリゴヌクレオチドは修飾されて いる。本明細書において用いる「修飾オリゴヌクレオチド」なる語は、天然に認 められるもの以外の修飾された核酸、塩基および／または糖を有するオリゴヌク レオチドを包含する。たとえば、３',５'−置換オリゴヌクレオチドは、その３' および５'位の両方においてヒドロキシル基以外の化学基（その３'位において） またはリン酸基以外の化学基（その５'位において）に結合した糖を有するオリ ゴヌクレオチドである。 修飾オリゴヌクレオチドはまた、ジアミン、コレステリルまたは他の親油性基 またはキャッピング種などの置換基が付加したものであってもよい。さらに、該 分子中のヌクレオチド当たり一つの非架橋性の酸素に置換を有する酸化されてい ないまたは部分的に酸化されたオリゴヌクレオチドもまた修飾オリゴヌクレオチ ドと考えられる。また、その３'および／または５'端にヌクレアーゼ耐性を付与 する嵩ばった置換基を有するオリゴヌクレオチドも修飾オリゴヌクレオチドと考 えられるし、および／またはヒトの介入なしにはインビボで認められない種々の 他の構造的修飾もまた本明細書において修飾されたものと考えられる。 本発明の一つの好ましい態様において、投与すべきオリゴヌクレオチドはその ３'末端に少なくとも一つの２'−置換リボヌクレオチドを含む。ある態様におい ては、５'末端の４または５のヌクレオチド以外のすべてが２'−置換されたリボ ヌクレオチドであり、ある態様においてはこれら４または５の非置換５'ヌクレ オチドはデオキシリボヌクレオチドである。他の側面において、オリゴヌクレオ チドは３'および５'末端の両方に少なくとも一つの２'−置換リボヌクレオチド を有し、さらに他の態様においてオリゴヌクレオチドは内部のいずれかの位置に ある少なくとも４または５の隣接デオキシリボヌクレオチドヌクレオチドを除く すべての位置に含まれる２'−置換リボヌクレオチドからなる。本発明の他の側 面は、すべて２'−置換されたリボヌクレオチドであるヌクレオチドからなるオ リゴヌクレオチドの投与を含む。特定の態様は２'−Ｏ−メチルなどの２'−Ｏ− アルキル−リボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを含む。 本発明の他の態様において、投与するオリゴヌクレオチドは少なくとも一つの デオキシリボヌクレオチドを有し、好ましい態様においてオリゴヌクレオチドは ＲＮアーゼＨを活性化しうる少なくとも４または５の隣接したデオキシリボヌク レオチドを有する。 本発明の幾つかの態様において、投与するオリゴヌクレオチドはウイルス遺伝 子、病原生物遺伝子または細胞遺伝子に相補的である。幾つかの態様においてオ リゴヌクレオチドは、ＡＩＤＳ、口または生殖器ヘルペス、乳頭腫のゆうぜい、 インフルエンザ、口蹄疫、黄熱、水痘、帯状疱疹、成人Ｔ細胞白血病、バーキッ トリンパ腫、鼻咽頭癌腫または肝炎に関与するウイルスの遺伝子に相補的である 。一つの特定の態様において、オリゴヌクレオチドはＨＩＶの遺伝子に相補的で あり、ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合により連結された約１５〜 ２６のヌクレオチド（該ヌクレオチドの３'末端のヌクレオチドの少なくとも一 つは２'−置換されたリボヌクレオチドである）および少なくとも４の隣接する デオキシリボヌクレオチドを含む。 他の態様において、オリゴヌクレオチドはアルツハイマー病に関連するタンパ ク質をコードする遺伝子に相補的である。 さらに他の態様において、オリゴヌクレオチドは、アメーバ症、シャガス病、 トキソプラズマ症、ニューモサイトーシス（pneumocytosis）、ランブル鞭毛虫 症、隠足症（cryptoporidiosis）、トリコモナス症、マラリア、回虫症、フィラ リア症、旋毛虫症または住血吸虫症感染などの寄生虫疾患を引き起こす病原体中 で発現されるタンパク質をコードする遺伝子に相補的である。図面の簡単な説明 本発明の上記および他の目的、その種々の特徴、並びに本発明そのものは、添 付の図面とともに以下の記載を読んだときに一層完全に理解される。該図面にお いて： 図１は、放射性標識した修飾ＰＳ−オリゴヌクレオチド１を経口投与した後の 該オリゴヌクレオチドの肝臓、腎臓および血漿中での経時変化を示すグラフであ る； 図２Ａは、放射性標識したオリゴヌクレオチド標準のＨＰＬＣクロマトグラム である； 図２Ｂは、放射性標識したオリゴヌクレオチドの投与１２時間後に採取した血 漿試料から抽出したオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣクロマトグラムである； 図３Ａは、放射性標識したオリゴヌクレオチド標準のＨＰＬＣクロマトグラム である； 図３Ｂは、放射性標識したオリゴヌクレオチドの投与６時間後のラット肝臓か ら抽出したオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣクロマトグラムである； 図３Ｃは、放射性標識したオリゴヌクレオチドの投与２４時間後のラット肝臓 から抽出したオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣクロマトグラムである； 図４は、放射性標識したオリゴヌクレオチドを経口投与した後のラットの排泄 尿中の放射能の経時変化を示すグラフである； 図５Ａは、放射性標識したオリゴヌクレオチド標準のＨＰＬＣクロマトグラム である； 図５Ｂは、放射性標識したオリゴヌクレオチドの投与６時間後にラット尿から 抽出したオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣクロマトグラムである； 図５Ｃは、放射性標識したオリゴヌクレオチドの投与１２時間後にラット尿か ら抽出したオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣクロマトグラムである； 図６は、放射性標識したオリゴヌクレオチドを経口投与した後のラットの胃腸 管中および糞便中の放射能の経時変化を示すグラフである； 図７は、放射性標識したオリゴヌクレオチドの投与１時間、３時間および６時 間後にラット胃から抽出したオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣクロマトグラムであ る；および 図８は、放射性標識したオリゴヌクレオチドの投与３時間、６時間および１２ 時間後にラット大腸から抽出したオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣクロマトグラム である。 好ましい態様の詳細な説明 本明細書中に引用する特許および科学文献は当業者に利用可能な知識を確立す るものである。発行された米国特許、許された特許出願、およびそれらに引用さ れた文献は参照のため本明細書中に引用する。 本発明は、標的遺伝子に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチ ドを経口投与することによる、動物中の遺伝子の発現をダウンレギュレートする 方法を提供する。 「アンチセンスオリゴヌクレオチド」と呼ばれるオリゴヌクレオチドは、標的 一本鎖核酸分子にワトソン−クリック型またはフーグスティーン型の塩基対形成 に従って結合することができ、かかる結合によって幾つかのメカニズムのうちの 一つにより該標的の機能を妨害することが知られている。すなわち、正常な転写 、スプライシングまたは翻訳に必要な因子の結合を妨害することによって、該オ リゴヌクレオチド中にデオキシリボヌクレオチドの隣接領域が存在する場合には ＲＮアーゼＨによるｍＲＮＡの酵素的分解を誘起することによって、および／ま たは該アンチセンスオリゴヌクレオチドに直接結合した反応性の基を介して標的 を破壊することによって。 それゆえ、上記特性のため、かかるオリゴヌクレオチドは本発明の方法に従っ て動物における特定の遺伝子の発現を制御ないしダウンレギュレートする能力に よって治療学的に有用である。 本発明の方法において有用なオリゴヌクレオチドは長さが少なくとも６ヌクレ オチドであるが、好ましくは６〜５０ヌクレオチドの長さであり、１５〜３０ ｍｅｒが最も一般的である。該オリゴヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド 、リボヌクレオチド、またはそれらの組み合わせからなり、一方のヌクレオチド の５'末端と他方のヌクレオチドの３'末端とが非ホスホジエステルインターヌク レオチド結合により共有結合されている。そのような結合としては、アルキルホ スホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチ オエート、アルキルホスホネート、ホスホルアミデート、リン酸エステル、カル バメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カーボネートおよび リン酸トリエステルが挙げられる。これら結合を有するオリゴヌクレオチドの調 製はホスホルアミデートやＨ−ホスホネート化学などの公知の方法に従って行う ことができ、これら方法はブラウン（Ｂrown）によって記載されているように（ ＡＢrief Ｈistory of Ｏligonucleotide Ｓynthesis．Ｐrotocols for Ｏligon ucleotides and Ａnalogs，Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology（１９９４）２０ ：１〜８）手動または自動合成機により行うことができる。（また、たとえば、 ソンボー（Ｓonveaux）「オリゴヌクレオチド合成における保護基」、アグラワ ル（１９９４）Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology２６：１〜７２；ウールマン （Ｕhlmann）ら（１９９０）Ｃhem.Ｒev.９０：５４３〜５８３をも参照）。 組成物のオリゴヌクレオチドはまた、標的核酸へハイブリダイズする能力を損 なうことなく幾つかの方法で修飾できる。そのような修飾は、たとえば、オリゴ ヌクレオチド分子の内部または末端の修飾を含み、アミノ基と末端リボース、デ オキシリボースとの間の種々の数の炭素残基を有するコレステリルやジアミン化 合物などのインターヌクレオシドリン酸結合の該分子への付加、および開裂する または反対鎖または関連酵素またはウイルスゲノムに結合する他のタンパク質に 架橋するリン酸修飾を含む。そのような修飾オリゴヌクレオチドの例としては、 修飾した塩基および／または糖（リボースの代わりのアラビノースなど）を有す るオリゴヌクレオチド、またはその３'位および５'位の両方においてヒドロキシ ル基以外の化学基（その３'位にて）およびリン酸基以外の化学基（その５'位に て）に結合した糖を有するオリゴヌクレオチドを含む。他の修飾オリゴヌクレオ チドは、その３'および／または５'末端においてヌクレアーゼ耐性を付与する嵩 ばった置換基でキャッピングされているか、またはヌクレオチド当たり一つの非 架橋性の酸素に置換を有する。そのような修飾は、インターヌクレオシド結合の 幾つかまたはすべてにおいて、並びにオリゴヌクレオチドのいずれかの末端また は両末端において、および／または該分子の内部にあってよい。かかる修飾オリ ゴヌクレオチドの調製については、たとえば、アグラワル（１９９４）Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology２６；ウールマンら（１９９０）Ｃhem.Ｒev.９０：５ ４３〜５８３を参照。 自己安定化されたオリゴヌクレオチドもまた、本発明の方法に有用な修飾オリ ゴヌクレオチドであると考えられる（タング（Ｔang）ら（１９９３）Ｎucleic Ａcids Ｒes.２０：２７２９〜２７３５）。これらオリゴヌクレオチドは２つの 領域：標的ハイブリダイズ領域；および該自己安定化されたオリゴヌクレオチド の内部の核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を有する自己相補的領域を 含む。 これら非修飾および修飾オリゴヌクレオチドの調製は当該技術分野でよく知ら れている（アグラワルら（１９９２）Ｔrends.Ｂiotechnol.１０：１５２〜１５ ８において概説されている）（たとえば、ウールマンら（１９９０）Ｃhem.Ｒev .９０：５４３〜５８４；および（１９８７）Ｔetrahedron Ｌett.２８：（３１ ）：３５３９〜３５４２；アグラワル（１９９４）Ｍethods in Ｍolecular Bio logy２０：６３〜８０を参照）。 これらオリゴヌクレオチドは、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、 ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、ホ スホルアミダイト、リン酸エステル、カルバメート、カーボネート、リン酸トリ エステル、アセトアミデートおよびカルボキシメチルエステルなどの非ホスホジ エステルインターヌクレオチド結合を有することによってさらに安定性が付加さ れる。特に有用なオリゴヌクレオチドはホスホロチオエートおよび／またはホス ホロジチオエートインターヌクレオチド結合により連結されている。 動物に投与するオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドおよび少な くとも一つの２'置換されたリボヌクレオチドの両方を含有するという点でハイ ブリッドオリゴヌクレオチドであってよい。本発明の目的のためには、「２'− 置換された」なる語は、たとえば、２'−Ｏ−アリル、２'−Ｏ−アルキル、２' −ハロゲン、または２'−アミノなどによるリボース分子の２'−ＯＨの置換を意 味するが、２'−Ｈの置換であってはならず、その際、アリル、アリールまたは アルキル基は置換されていなくてもよいし、またはハロゲン、ヒドロキシ、トリ フルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボ キシル、カルブアルコキシルまたはアミノ基で置換されていてもよい。 本発明の方法において有用なハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチド はヌクレオチド分解に抵抗し、ＲＮＡまたはＤＮＡと安定な二本鎖を形成し、好 ましくはＲＮＡとハイブリダイズしたときにＲＮアーゼＨを活性化する。これら オリゴヌクレオチドは少なくとも一つの非置換のリボヌクレオチドをさらに含ん でいてよい。たとえば、本発明の方法に有用なオリゴヌクレオチドは、オリゴヌ クレオチドの３'末端における一つの２'置換されたリボヌクレオチドを例外とし てすべてデオキシリボヌクレオチドを含んでいてよい。 別の態様では、オリゴヌクレオチドはその３'末端および５'末端の両方におい て少なくとも一つの置換リボヌクレオチドを有していてよい。 本発明の方法において有用なオリゴヌクレオチドの一つの好ましいクラスは、 ＲＮアーゼＨの活性化セグメントを提供すべく隣接ブロック中に４またはそれ以 上のデオキシリボヌクレオチドを含む。ある場合には、１を越えるそのような活 性化セグメントがオリゴヌクレオチド内のいずれかの位置に存在するであろう。 本発明によるオリゴヌクレオチドでデオキシリボヌクレオチドが過半数を占めて いてよい。実際、そのようなオリゴヌクレオチドは１以外のすべてとなる程多く のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドであってよい。それゆえ、好ましい オリゴヌクレオチドは約２〜約５０のヌクレオチドを有し、最も好ましくは約１ ２〜約２５のヌクレオチドを有するので、その中で存在するデオキシリボヌクレ オチドの数は１〜約２４の範囲である。他の有用なオリゴヌクレオチドは２'− 置換されたリボヌクレオチドのみからなる。 表１は、本発明の方法に有用なオリゴヌクレオチドの幾つかの代表的な分子種 を示す。２'−置換ヌクレオチドには下線を引いてある。 オリゴヌクレオチド中の２'置換リボヌクレオチドは、リボースの２'位に炭素 数１〜６の−Ｏ−低級アルキル、アリールまたは置換アリールまたは炭素数２〜 ６のアリル、たとえば、２'−Ｏ−アリル、２'−Ｏ−アリール、２'−Ｏ−アル キル、２'−Ｏ−ハロゲン、または２'−アミノを含んでいてよいが、２'−Ｈで 置換されていてはならず、その際、アリル、アリールまたはアルキル基は置換さ れていなくてもよいし、またはハロゲン、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シ アノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルブアル コキシルまたはアミノ基で置換されていてもよい。有用な置換リボヌクレオチド は２'−Ｏ−メチルなどの２'−Ｏ−アルキルである。 好ましくは、本発明によるオリゴヌクレオチドは長さが約２〜約５０ヌクレオ チドであり、最も好ましくは長さが約１５〜約２５ヌクレオチドであろう。それ ゆえ、この好ましい場合において、本発明によるオリゴヌクレオチドは１４〜２ ４の非ホスホジエステルインターヌクレオチド結合を有するであろう。 本発明によるオリゴヌクレオチドは、ウイルス、病原生物中での種々の遺伝子 の発現の抑制、または細胞遺伝子の発現の抑制において有効である。そのような 因子を抑制する能力は、種々の疾患状態の治療にとって明らかに重要である。そ れゆえ、本発明の方法によるオリゴヌクレオチドは、ウイルス、病原生物または 細胞遺伝子からの核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する。好ましくは、 そのようなオリゴヌクレオチドは長さが約６〜約５０ヌクレオチドである。 本発明の目的のためには、「核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列」な る語は、生理的条件下で、たとえばワトソン−クリック型の塩基対形成（オリゴ ヌクレオチドと一本鎖核酸との間の相互作用）によりまたはフーグスティーン型 の塩基対形成（オリゴヌクレオチトと二本鎖核酸との間の相互作用）によりまた はＲＮＡへのオリゴヌクレオチド結合の場合における偽結び目形成（pseudoknot formation）を含む他のいずれかの手段により標的核酸配列に結合するオリゴヌ クレオチド配列を意味する。生理的条件下での（ワトソンクリック型塩基対形成 による）そのような結合は、実際問題として該核酸配列の機能に対する妨害を観 察することにより測定される。 本発明によるオリゴヌクレオチドが相補的である核酸配列は、ダウンレギュレ ートしようとする遺伝子に応じて変わるであろう。幾つかの場合には標的遺伝子 または核酸配列はウイルス核酸配列であろう。種々のウイルスを抑制するための アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用はよく知られている（アグラワル（１９ ９２）Ｔrends in Ｂiotech.１０：１５２〜１５８において概説されている）。 有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的なウイルス核酸配列は、ヒト免 疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）（米国特許第４,８０６,４６３号）、単純ヘ ルペスウイルス（米国特許第４,６８９,３２０号）、インフルエンザウイルス（ 米国特許第５,１９４,４２８号）、およびヒトパピローマウイルス（ストレイら （１ ９９１）Ｎucleic Ａcids Ｒes.１９：４１０９〜４１１４）を含む多くのウイ ルスについて記載されている。これら核酸配列のいずれかに相補的な配列は本発 明によるオリゴヌクレオチドに用いることができ、他のいずれかのウイルスから の核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列も同様に用いることができる。ア ンチセンスオリゴヌクレオチドを調製できる既知の核酸配列を有する他のウイル スとしては、これらに限られるものではないが、口蹄疫ウイルス（ロバートソン （Ｒobertson）ら（１９８５）Ｊ.Ｖirol.５４：６５１；ハリス（Ｈarris）ら （１９８０）Ｖirol.３６：６５９参照）、黄熱ウイルス（ライス（Ｒice）ら（ １９８５）Ｓcience２２９：７２６参照）、水痘帯状疱疹（vericella-zoster） ウイルス（デービソン（Ｄavison）およびスコット（Ｓcott）（１９８６）Ｊ. Ｇen.Ｖirol.６７：２２７９参照）、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガ ロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、およびキュウリモザイク病ウイ ルス（リチャーズ（Ｒichards）ら（１９７８）Ｖirol.８９：３９５参照）が挙 げられる。 たとえば、ＨＩＶ−１遺伝子の一部に相補的なオリゴヌクレオチドを設計した が、これは有意の抗ＨＩＶ作用を有する（アグラワル（１９９２）Ａntisense Ｒes.Ｄevelopment２：２６１〜２６６）。このオリゴヌクレオチドの標的は種 々のＨＩＶ−１単離物の間で保存されていることがわかった。それは５６％Ｇ＋ Ｃに富み、水溶性で、生理学的条件下で比較的安定であった。このオリゴヌクレ オチドは生理学的条件下で相補的なＲＮＡ標的に結合し、その場合、得られた二 本鎖のＴは約５６℃であった。このオリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性を、急 性および慢性に感染させたＣＥＭ細胞、インビボ条件を模倣した長期培養、ヒト 末梢血リンパ球およびマクロファージ、およびＨＩＶ−１感染患者からの単離物 を含む幾つかのモデルで試験した（リスツィーウィッツ（Ｌisziewicz）ら（Ｐr oc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）（１９９２）８９：１１２０９〜１１２１３） ；リスッィーウィッツら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）（１９９３）９ ０：３８６０〜３８６４）；リスツィーウィッツら（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. （ＵＳＡ）（１９９４）９１：７９４２〜７９４６）；アグラワルら（Ｊ.Ｔher . Ｂiotech）印刷中）。 本発明によるオリゴヌクレオチドは、別の態様として病原生物の核酸配列に相 補的なオリゴヌクレオチド配列を有していてよい。マラリア生物、プラスモジウ ム・ファルシパルム（Ｐlasmodium falciparum）、および多くの病原細菌を含む 多くの病原生物の核酸配列が記載されている。このような病原生物のいずれかに 由来する核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列は本発明によるオリゴヌク レオチドにおいて用いることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを調製 できる既知の核酸配列を有する病原真核生物の例としては、トリパノソーム・ア ブルセイ・ガンビエンセ（Ｔrypanosom abrucei gambiense）およびレイシュマ ニア（Ｌeishmania）（キャンプベル（Ｃampbell）ら、Ｎature３１１：３５０ （１９８４）参照）、ファシオラ・ヘパチカ（Ｆasciola hepatica）（ズリタ（ Ｚurita）ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ８４：２３４０（１９８７）参照 ）が挙げられる。 抗真菌オリゴヌクレオチドは、たとえばキチンシンテターゼ遺伝子からの核酸 配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列を有する標的ハイブリダイズ領域を用い て調製でき、抗菌オリゴヌクレオチドは、たとえばアラニンラセマーゼ遺伝子を 用いて調製できる。本発明による処置方法により処置しうる真菌疾患としては、 カンジダ症、ヒストプラスマ症、クリプトコッカス症、ブラストミセス症、アス ペルギルス症、スポロトリクム症、クロモセス症、皮膚糸状菌症、およびコクシ ジオイデス症が挙げられる。本発明の方法はまたリケッチア疾患（たとえば、発 疹チフス、ロッキー山紅斑熱）、並びにクラミジア・トリコマチス（Ｃhlamydia trachomatis）やリンホグラニュローマ・ベネレウム（Ｌymphogranuloma venere um）により引き起こされる異性間接触伝播疾患を処置するために用いることがで きる。アメーバ症、シャガス病、トキソプラズマ症、ニューモサイトーシス、ラ ンブル鞭毛虫症、隠足症、トリコモナス症およびニューモシスチス・カリニ肺炎 を含む種々の寄生虫疾患は本発明による方法により処置することができ、回虫症 、糸状虫症、旋毛虫症、住血吸虫症、および線虫または条虫感染などの虫（蠕虫 ）疾患もまた処置できる。マラリアは、それがプラスモジウム・ファルシプ・ア ルム （Ｐ.falcip arum）、プラスモジウム・ビバス（Ｐ.vivas）、プラスモジウム・ オラレ（Ｐ.orale）またはプラスモジウム・マラリア（Ｐ.malariae）により引 き起こされたかに拘わらず、本発明の処置方法により処置できる。 上記で示した感染疾患はすべて本発明による処置方法により処置できる。なぜ なら、これら疾患の感染因子は知られており、それゆえ該感染因子の増殖に必須 の核酸配列、たとえば必須遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチド配列を有する本 発明によるオリゴヌクレオチドを調製できるからである。 本発明による方法により処置できる他の疾患状態は、細胞遺伝子の異常な発現 または産物によるものである。これら状態は本発明によるオリゴヌクレオチドを 投与することにより処置でき、この点は本明細書ですでに検討した。 本発明による他のオリゴヌクレオチドは、その異常な発現または産物が疾患状 態となる細胞遺伝子または遺伝子転写物に相補的なヌクレオチド配列を有してい てよい。そのような幾つかの細胞遺伝子の核酸配列が記載されているが、それに はプリオンタンパク質（スタール（Ｓtahl）ら（１９９１）ＦＡＳＥＢ Ｊ.５： ２７９９〜２８０７）、アルツハイマー病に関連するアミロイド様タンパク質（ 米国特許第５,０１５,５７０号）、およびｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ａｂｌ 、およびｎ−ｒａｓなどの種々のよく知られた癌遺伝子が含まれる。さらに、精 子形成、精子の運動性、精子の卵への結合または精子の生存力に影響を及ぼす他 の段階に主としてまたは唯一関与する構造タンパク質または酵素の合成を抑制す るオリゴヌクレオチドは避妊薬として用いることができる。同様に、女性の避妊 薬は、排卵、受精、着床に関与する、またはこれらプロセスに関与するホルモン の生合成に関与するタンパク質または酵素を抑制するオリゴヌクレオチドである 。 高血圧は、レニン／アンジオテンシン系においてアンジオテンシン変換酵素ま たは関連酵素の合成をダウンレギュレートするオリゴヌクレオチドにより制御で きる。心筋や脳の循環疾患、梗塞、動脈硬化、塞栓症および血栓症に使用するた め、トロンボキサンＡ２の合成に必要な酵素の合成を抑制することにより血小板 凝集を制御できる。動脈壁中のコレステロールの沈着は、動脈硬化において脂肪 酸補酵素Ａ：コレステロールアシルトランスフェラーゼの合成を抑制することに より抑制できる。コリンホスホトランスフェラーゼ合成の抑制は高脂血症におい て有用である。 ハイブリダイゼーション阻止（arrest）を疾患の有害作用を減少または除去す るために用いることのできる多くの神経性疾患が存在する。たとえば、モノアミ ンオキシダーゼ合成の抑制はパーキンソン病に用いることができる。カテコール ｏ−メチルトランスフェラーゼの抑制は鬱病の治療に用いることができ、インド −ルＮ−メチルトランスフェラーゼの抑制は精神分裂病の治療に用いることがで きる。 プロスタグランジンやロイコトリエンの合成に導くアラキドン酸カスケードに おいて選択した酵素の抑制は、血小板凝集、アレルギー、炎症、疼痛および喘息 のコントロールに有用である。 多剤耐性（ｍｄｒ−１）遺伝子（種々の抗癌剤に対する腫瘍の耐性が生じる原 因であり、化学療法の主たる障害となっている）により発現されるタンパク質の 抑制は、癌の治療において有益であることが判明している。これら遺伝子のいず れかに由来する核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列は本発明によるオリ ゴヌクレオチドとして用いることができ、その異常な発現または産物が疾患状態 となる他の細胞遺伝子転写物に相補的なオリゴヌクレオチド配列も同様に用いる ことができる。 本明細書に記載するオリゴヌクレオチドは、ウイルス感染、病原生物による感 染、または異常な遺伝子発現もしくは異常な遺伝子産物の発現に由来する疾患を 処置するのに有効な治療医薬組成物の形態で動物被験者に経口または経小腸にて 投与する。本発明による方法の幾つかの側面において、オリゴヌクレオチドをた とえばＡＩＤＳの場合にはＡＺＴなどの他の治療薬とともに投与する。 本発明のオリゴヌクレオチドを含有する治療医薬組成物は生理学的に許容しう る担体、たとえば不活性な希釈剤または該ペプチドを一緒に投与する資化しうる 可食性の担体を含む。注射以外の経路により血流中に化合物を導入するための薬 理学的に許容しうる賦形剤を含む適当な組成物は、Ｒemington's Ｐharmaceutic alＳciences（第１８版）（ジェナロ(Ｇenarro）編（１９９０）マック・パブリ ッ シング（Ｍack Ｐublishing Ｃo.）、イーストン、ペンシルベニア）に記載され ている。オリゴヌクレオチドおよび他の成分は、ハードまたはソフトゼラチンカ プセル中に封入し、打錠し、または個体の食事の中に直接混入させることができ る。オリゴヌクレオチドは賦形剤とともに配合でき、可食（ingestible）錠剤、 バッカル錠、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、水剤な どの剤型にて用いることができる。オリゴヌクレオチドを経口にて投与する場合 には、オリゴヌクレオチドを他の食料形態（food forms）および薬理学的に許容 しうる香味促進剤と混合する。オリゴヌクレオチドを経小腸にて投与する場合に は、オリゴヌクレオチドを固体、半固体、懸濁液または乳濁液の形態に配合し、 多くのよく知られた薬理学的に許容しうる添加剤と混練する。除放性の経口デリ バリーシステムおよび／または経口投与剤型のための腸溶コーティング、たとえ ば米国特許第４,７０４,２９５号、同第４,５５６,５５２号、同第４,３０９,４ ０４号および同第４,３０９,４０６号に記載されているものもまた本発明に包含 される。 そのような治療学的に有用な組成物中のオリゴヌクレオチドの量は、適当な投 与量が得られるようなものである。本発明による好ましい組成物または製剤は、 経口の単位剤型が動物の体重１ｋｇ当たり約５０μｇ〜約２００ｍｇ含有するよ うに調製し、体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ〜１００ｍｇ含有するのが最も好ましい 。 各剤型の個々の投与量中に含まれる活性成分の単位含量は、それ自体、有効量 を構成する必要はないことが認識されるであろう。なぜなら、必要な有効量は複 数の投与量単位（カプセル剤や錠剤またはその組み合わせなど）を投与すること によって達成しうるからである。 本発明の方法により投与したオリゴヌクレオチドが生体組織に吸収されるか否 かを決定するため、またもしも吸収されるのであればどの組織で吸収されるのか を決定するため、以下の研究を行った。種々の生体組織の試料を、放射性標識し たオリゴヌクレオチドを経口投与した後の増加時間における放射能について分析 した。図１は、放射性標識オリゴヌクレオチドの経口投与後のオリゴヌクレオチ ド等価物の血漿、肝臓および腎臓における経時濃度を示す。これら結果は、該薬 剤が胃腸管で吸収され、腎臓および肝臓に蓄積することを示している。 血漿中の放射能の化学的形態をＨＰＬＣによりさらに調べたところ、経口投与 １２時間後に完全なオリゴヌクレオチド（Ａ）と代謝物（Ｂ）との両者の存在が 示された（図２Ｂ）。完全なオリゴヌクレオチドはまた、投与６時間後（図３Ｂ ）および１２時間後（図３Ｃ）に肝臓で検出された。脳、胸腺、心臓、肺、肝臓 、腎臓、副腎、胃、小腸、大腸、骨格筋、精巣、甲状腺、表皮および骨髄中での 放射能は、放射性標識オリゴヌクレオチドの経口投与４８時間後に検出できた。 オリゴヌクレオチドの吸収を支持する他の証拠は、放射性標識したオリゴヌク レオチドを経口投与した後の尿試料の分析から得られた。図４は、放射性標識オ リゴヌクレオチドの投与４８時間後の尿中に累積排泄された放射性標識オリゴヌ クレオチド量を示す。オリゴヌクレオチドが時間の経過に伴って尿中に排泄され 続けていることは、他の組織がオリゴヌクレオチドを吸収したこと、および生体 が長期にわたって吸収しえたことを示唆している。図５Ｂおよび５Ｃは、尿中の 放射能の大部分は分解産物として存在したけれども、完全なオリゴヌクレオチド もまた検出されたことを示しており、このオリゴヌクレオチドが完全な形で吸収 されることを示している。 経口投与後のオリゴヌクレオチドの生体利用性のレベルを決定するため、胃腸 管（胃および腸）および糞便中のオリゴヌクレオチドレベルを測定した。図６は 、投与したオリゴヌクレオチドの約８０％が残留するかまたは糞便中に排泄され たことを示しており、投与したオリゴヌクレオチドの２０％が吸収されたことを 示している。このオリゴヌクレオチドは胃中で安定であり、経口投与６時間後に 胃内容物中に有意の分解産物は検出されなかった（図７）。大腸の内容物中の投 与オリゴヌクレオチドの大部分もまた完全な化合物として存在した（図８）。 それゆえ、本発明の方法を用いることにより、胃腸管からのオリゴヌクレオチ ドの首尾よい吸収が達成され、生体中を広く分布した。完全なオリゴヌクレオチ ドは血漿および種々の組織中で検出され、尿中に排泄された。これら結果は、経 口投与が治療剤としてのオリゴヌクレオチドの送達の強力な手段であることを示 している。 以下の実施例は本発明を製造および実施するための好ましい態様を示すが、本 発明の範囲を限定するものではない。なぜなら、同様の結果を得るために別法を 利用できるからである。 実施例 １．オリゴヌクレオチドの合成および分析 配列番号１の配列を有し、２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチド３'および５'配 列および内部のデオキシリボヌクレオチドを含有するハイブリッド２５−ｍｅｒ ホスホロチオエート結合オリゴヌクレオチドを以下のようにして合成、精製、お よび分析した。 非修飾ホスホロチオエートデオキシヌクレオシドを、米国特許第５,１４９,７ ９８号に記載されたＨ−ホスホネート法を用い、自動合成機（モデル８７００、 ミリポア（Ｍillipore）、ベッドフォード、マサチューセッツ）にて５〜６μモ ルスケールでＣＰＧ上で合成した。デオキシヌクレオシドＨ−ホスホネートはミ リポア（ベッドフォード、マサチューセッツ）から入手した。２'−Ｏ−メチル リボヌクレオチドＨ−ホスホネートまたはホスホロチオエートは、標準法で合成 するか（たとえば、Ｍeth.Ｍol.Ｂiol.（１９９３）Ｖolume２０中の「オリゴヌ クレオチドおよびアナログのためのプロトコール」を参照）、または市販されて いるものを用いた（たとえば、グレン・リサーチ（Ｇlenn Ｒesearch）、スター リング、バージニア、およびクローンテック（Ｃlontech）、パロアルト、カリ フォルニアからのもの）。２'−Ｏ−メチルヌクレオシドを含有するオリゴヌク レオチドのセグメントを、所望のサイクルにて２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシ ドＨ−ホスホネートまたはホスホロチオエートを用いることにより組み立てた。 同様に、デオキシリボヌクレオシドを含有するオリゴヌクレオチドのセグメント を、所望のサイクルにてデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネートを用いることに より組み立てた。組み立て後、ＣＰＧに結合したオリゴヌクレオチドＨ−ホスホ ネートを硫黄で酸化してホスホロチオエート結合を生成させた。ついで、オリゴ ヌクレオチドを濃ＮＨ₄ＯＨ中、４０℃にて４８時間脱保護した。 粗製のオリゴヌクレオチド（約５００Ａ₂₆₀単位）をＣ₁₈逆相媒体上の逆相低 圧クロマトグラフィーにより分析した。ＤＭＴ基を８０％酢酸水溶液で処理する ことにより除去し、ついでオリゴヌクレオチドを蒸留水に対して透析し、凍結乾 燥した。 ２．オリゴヌクレオチドの放射性標識 ³⁵Ｓ−標識したオリゴヌクレオチドを得るため、２段階で合成を行った。配列 番号１の３'末端から最初の１９ヌクレオチドをβ−シアノエチルホスホルアミ ダイト法（ボーケージ（Ｂeaucage）、Ｐrotocols forＯligonucleotides and Ａnalogs（アグラワルら編）、ヒューマナ・プレス（Ｈumana Ｐress）（１９９ ３）、３３〜６１頁を参照）を用いて組み立てた。残りの６ヌクレオチドをＨ− ホスホネート法（フローラー（Ｆroehler）、Ｐrotocols for Ｏligonucleotide s and Ａnalogs（アグラワルら編）、ヒューマナ・プレス（１９９３）、６３〜 ８０頁を参照）を用いて組み立てた。５つのＨ−ホスホネート結合を含むコント ロールドポアガラス（ＣＰＧ）支持体に結合したオリゴヌクレオチド（ＣＰＧを ３０ｍｇ；約１μＭ）を、６０ｍｌの二硫化炭素／ピリジン／トリエチルアミン （１０：１０：１）中で³⁵Ｓ₈（４ｍＣｉ、１Ｃｉ／ｍｇ、アマーシャム；１Ｃ ｉ＝３７ＧＢｑ）で酸化した。この酸化反応は時々振盪しながら室温で１時間行 った。ついで、同溶媒混合物中の５％非放射性硫黄（³²Ｓ₈）の２μｌ、５μｌ 、および２００μｌを３０分毎に加えて酸化を完了した。溶液を除去し、ＣＰＧ 支持体を二硫化炭素／ピリジン／トリエチルアミン（１０：１０：１）（３×５ ００μｌ）およびアセトニトリル（３×７００μｌ）で洗浄した。得られた生成 物を濃水酸化アンモニウム中で脱保護し（５５℃、１４時間）、蒸発させた。得 られた生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動（７Ｍ尿素を含有する２０％ポ リアクリルアミド）により精製した。所望のバンドをＵＶ投影下で切り出し、Ｐ Ｓ−オリゴヌクレオチドをゲルから抽出し、Ｓｅｐ−ＰａｋＣ１８カートリッジ （ウオーターズ（Ｗaters））およびセファデックスＧ−１５カラムで脱塩した 。収量は２０Ａ₂₆₀単位（６００μｇ;比活性、１μＣｉ／μｇ）であった。 ３．動物および処置 雄のスプラーグードーリーラット（１００〜１２０ｇ、ハーラン・ラボラトリ ーズ（Ｈarlan Ｌaboratories）、インディアナポリス、インディアナ）を本研 究に用いた。試験１週間前に被験動物に市販の食餌および任意量の水を与えた。 動物にガバージュにて５０ｍｇ／ｋｇの投与量を投与した。非標識および³⁵Ｓ 標識したオリゴヌクレオチドを２５ｍｇ／ｍｌの濃度にて生理食塩水（０.９％ ＮａＣｌ）に溶解した。投与量は前処理体重に基づき、最近似の０.０１ｍｌに 丸めた。投与後、各被験動物を代謝ケージ中に入れ、市販の食餌および任意量の 水を与えた。排尿された全尿を回収し、ついで各代謝ケージを回収期間の後に洗 浄した。各被験動物から排泄された糞便を種々の時点ですべて回収し、放射能量 を定量する前に糞便試料をホモジナイズした。被験動物からの血液試料をヘパリ ン処理管にて種々の時点で回収した。血漿を遠心分離により分離した。ペントバ ルビタールナトリウムでの麻酔下、被験動物を放血によって安楽死させた。安楽 死後、各被験動物から組織を回収した。すべての組織／器官の外側に付着してい る脂肪または結合組織を切り取り、他の器に移し、すべての内容物を清浄にし、 個々の重さを計り、その重さを記録した。 ４．全放射能の測定 組織および体液中の全放射能の測定を液体シンチレーションスペクトル分析（ ＬＳ６０００ＴＡ、ベックマン（Ｂeckman）、アービン、カリフォルニア）によ り行った。簡単に説明すると、生物学的流体（血漿、５０〜１００μｌ；尿、５ ０〜１００μｌ）を６ｍｌのシンチレーション溶媒（バジェット−ソルブ（Ｂud get−Ｓolve）、ＲＰＩ、マウントプロスペクト、イリノイ）と混合して全放射 能を測定した。糞便を破砕し、重さを計り、ついで９倍の容量の０.９％ＮａＣ ｌ食塩水中でホモジナイズした。このホモジネートのアリコート（１００μｌ） を可溶化剤（ＴＳ−２、ＲＰＩ、マウントプロスペクト、イリノイ）と混合し、 ついでシンチレーション溶媒（６ｍｌ）と混合して全放射能の定量が行えるよう にした。 組織を除いた後、直ちにファットマンＮｏ.１濾紙上にブロットし、重さを計 ったのち、０.９％ＮａＣｌ食塩水中でホモジナイズした（湿重量１グラム当た り３〜５ｍｌ）。得られたホモジネート（１００μｌ）を可溶化剤（ＴＳ−２、 ＲＰＩ、マウントプロスペクト、イリノイ）と混合し、ついでシンチレーション 溶媒（６ｍｌ）と混合して全放射能を測定した。各組織試料に加えた０.９％Ｎ ａＣｌ食塩水の量を記録した。ホモジナイズした組織／器官をさらに分析のため に使用するまで≦−７０℃で凍結保存した。 ５．ＨＰＬＣ分析 尿中の放射能の分析を、本質的にサンズらにより記載された方法（Ｍol.Ｐhar m（１９９４）４５：９３２〜９４３）の変法を用い、イオン対（paired-ion） ＨＰＬＣにより行った。尿試料を遠心分離し、分析の前に０.２−μｍアクロ（ Ａcro）フィルター（ジェルマン（Ｇelman）、アンアーバー、ミシガン）に通し た。血漿中のハイブリッドオリゴヌクレオチドおよび代謝物をＰＡＧＥの試料調 製における上記方法を用いて抽出した。勾配を作るために４つ組ポンプを備えた ヒューレットパッカード（Ｈewlet Ｐackard）１０５０ＨＰＬＣを用いたＨＰＬ Ｃにおいてマイクロソーブ（Ｍicrosorb）ＭＶ−Ｃ４カラム（レイニン・インス ツルメンツ（Ｒainin Ｉnstruments）、ウォバーン、マサチューセッツ）を用い た。移動相は２つの緩衝液を含んでいた：緩衝液Ａは水中の５ｍＭ−Ａ試薬（ウ オーターズ、ベッドフォード、マサチューセッツ）であり、緩衝液Ｂは４：１（ ｖ／ｖ）アセトニトリル（フィッシャー（Ｆisher））／水であった。カラムを 以下の勾配を用いて１.５ｍｌ／分の流速にて溶出した：（１）０〜４分、０％ 緩衝液Ｂ；（２）４〜１５分、０〜３５％緩衝液Ｂ；および（３）１５〜７０分 、３５〜８０％緩衝液Ｂ。カラムを次の分析に移す前に少なくとも３０分間、緩 衝液Ａで平衡化した。レディフラック（ＲediＦrac）フラクションコレクター（ ファルマシア・ＬＫＢ・バイオテクノロジー（Ｐharmacia ＬＫＢ Ｂiotechnolo gy）、ピスカタウエイ、ニュージャージー）を用いることにより、１分フラクシ ョン（１.５ｍｌ）を７ｍｌシンチレーションバイアル中に回収し、５ｍｌのシ ンチレーション溶媒と混合して各フラクション中の放射能を測定した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＤＵ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＤＵ ＡＤＹ ＡＤＹ ＡＥＣ ＡＥＣ // Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ジァン，ルイウェン アメリカ合衆国35244アラバマ州バーミン ガム、ラセット・ウッズ・レイン1824番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．動物中の遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法であって、該遺伝子に 相補的なオリゴヌクレオチドを薬理学的に許容しうる担体中に含む医薬組成物を 経口投与する工程からなり、該オリゴヌクレオチドは非ホスホジエステルインタ ーヌクレオチド結合を有し、かつ少なくとも一つの２'−置換リボヌクレオチド を含み、該オリゴヌクレオチドは該遺伝子の産物の発現を抑制することによって 該遺伝子の発現をダウンレギュレートすることを特徴とする方法。 ２．該オリゴヌクレオチドが３'末端および５'末端を有し、該２'−置換リボヌ クレオチドが３'末端にある請求項１に記載の方法。 ３．該オリゴヌクレオチドがさらに少なくとも一つの２'−置換リボヌクレオチ ドを５'末端に含む請求項２に記載の方法。 ４．該オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオチドが２'−置換リボヌクレオ チドである請求項１に記載の方法。 ５．該２'−置換リボヌクレオチドが２'−Ｏ−アルキルリボヌクレオチドである 請求項１に記載の方法。 ６．該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのデオキシリボヌクレオチドを含む 請求項１に記載の方法。 ７．該オリゴヌクレオチドが、ＲＮアーゼＨ活性を活性化しうる少なくとも４つ の隣接デオキシリボヌクレオチドの領域を含む請求項６に記載の方法。 ８．該オリゴヌクレオチドが、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホ スホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、ホス ホルアミダイト、リン酸エステル、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエ ステル、アセトアミデートおよびカルボキシメチルエステルよりなる群から選ば れたインターヌクレオチド結合を含む請求項１に記載の方法。 ９．本質的にすべてのヌクレオチドがホスホロチオエートまたはホスホロジチオ エートインターヌクレオチド結合により連結されている請求項８に記載の方法。 １０．該オリゴヌクレオチドが修飾されている請求項１に記載の方法。 １１．該オリゴヌクレオチドが、ウイルス遺伝子、病原生物遺伝子、または細胞 遺伝子に相補的である請求項１に記載の方法。 １２．該オリゴヌクレオチドが、ＡＩＤＳ、口または生殖器ヘルペス、乳頭腫の ゆうぜい、インフルエンザ、口蹄疫、黄熱、水痘、帯状疱疹、成人Ｔ細胞白血病 、バーキットリンパ腫、鼻咽頭癌腫および肝炎よりなる群から選ばれた疾患に関 与するウイルスの遺伝子に相補的である請求項１１に記載の方法。 １３．該オリゴヌクレオチドが、アルツハイマー病に関連するタンパク質をコー ドする遺伝子に相補的である請求項１に記載の方法。 １４．該オリゴヌクレオチドが、アメーバ症、シャガス病、トキソプラズマ症、 ニューモサイトーシス、ランブル鞭毛虫症、隠足症、トリコモナス症、マラリア 、回虫症、フィラリア症、旋毛虫症、住血吸虫症感染よりなる群から選ばれた寄 生虫疾患を引き起こす寄生虫中のタンパク質をコードする遺伝子に相補的である 請求項１に記載の方法。 １５．該オリゴヌクレオチドがＨＩＶ遺伝子に相補的であり、ホスホロチオエー トインターヌクレオチド結合により連結された約１５〜２６ヌクレオチドを含み 、３'末端にあるこれらヌクレオチドの少なくとも一つが２'−置換リボヌクレオ チドであり、少なくとも４つのヌクレオチドが隣接デオキシリボヌクレオチドで ある請求項１に記載の方法。