JPH0956379A - 固定化リパーゼの再生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 固定化リパーゼを、水が存在しないか存在し
ても極微量である有機溶剤中でエステル結合の転移反応
に触媒として使用後、活性が低下した固定化リパーゼを
再生し、再利用する。 【解決手段】 エステル転移反応の活性が、初期活性の
１０分の１を越えないまで低減した固定化リパーゼを、
１〜５％の水を含む極性溶剤中に入れ、酵素活性を再生
させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【０００１】

【０００２】

【発明の属する技術分野】本発明は、水が存在しないか
存在しても極微量である有機溶剤中で、エステル結合の
合成および交換反応に触媒として用いた際に、活性が低
減した固定化リパーゼを再生し再利用する方法に関する
ものであり、固定化リパーゼを用いて光学分割や不斉合
成を行い液晶原料や医薬、農薬等の生理活性物質を効率
的に合成する手段を提供するものである。

【０００３】

【０００２】

【０００４】

【従来の技術】近年、酵素や微生物といった生体触媒を
有機溶剤中で用い、光学活性物質を製造する研究が活発
に行われている。特に、リパーゼは、有機溶液中でエス
テルに関連する多くの反応に優れた触媒活性を示す事か
ら、最も注目される生体触媒の一つである。この際、リ
パーゼは有機溶剤に溶解せず基質と有効に反応しない。
また高価なリパーゼを有効に利用したいという要求から
リパーゼの固定化が盛んに試みられてきた。

【０００５】

【０００３】固定化リパーゼを有機溶剤中で働かせると
き、溶剤中の水の存在が酵素活性に大きな影響を与える
事は周知の事実である。しかし溶剤中の水の量が多いと
加水分解反応が優先し、エステルの移転反応や合成反応
が起こらない。その結果、固定化リパーゼの反応は水が
存在しないか、存在しても極微量である有機溶剤中で行
われるが、長期間の反応でリパーゼの近傍に存在する水
が有機溶剤に取られることでリパーゼは徐々に活性が低
下する。やがては失活し、失活した固定化リパーゼは廃
棄せざるを得なかった。

【０００６】

【０００４】

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は水が存在しな
いか存在しても極微量である有機溶剤中でエステル結合
の転移反応に触媒として使用した際に、一旦活性が低下
した固定化リパーゼを再生し、再利用する方法を提供す
るものである。

【０００８】

【０００５】

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究を
行い、固定化リパーゼを、有機溶剤中での繰り返しの反
応、もしくは連続反応に使用して、長期に渡ってエステ
ル結合の分解、合成および交換反応に触媒として使用す
る際に、固定化されたリパーゼから水分子が脱離し失活
することを見出し、本発明に到達した。即ち、本発明は
エステル転移反応の活性が初期活性の１０分の１を越え
ないまで低減した固定化リパーゼを１〜５％の水を含む
極性溶剤中に入れ、酵素活性を再生させる固定化リパー
ゼの再生方法である。

【００１０】

【０００６】

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明で用いる固定化リパーゼに
おいて、リパーゼを固定化する担体としては、セライ
ト、ケイソウ土、パーライト、シリカゲル、活性炭、セ
ルロースパウダー、再生粒状多孔質キトサン担体、ポリ
スチレンおよびジビニルベンゼンを母体とするイオン交
換樹脂、またはキレート樹脂等が挙げられる。特に特開
平７−８７９７４号公報で開示した、高級脂肪酸を導入
した架橋再生粒状多孔質キトサン担体にリパーを固定化
した固定化リパーゼの場合に活性の回復が著しく、極め
て優れた効果を発揮する。

【００１２】

【０００７】固定化されるリパーゼは特に限定されるも
のではなく、ブタ肝臓，ブタ膵臓由来リパーゼの他、リ
ゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属，アスペルギルス（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属，ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属，
ゲオトリウム（Ｇｅｏｔｏｒｉｃｈｕｍ）属，キャンデ
イダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属，クロモバクテリウム（Ｃｈ
ｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属，シュードモナス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属，ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃ
ｉｌｌｉｕｍ）等の細菌，糸状菌，酵母由来のものが挙
げられる。

【００１３】

【０００８】また活性の低減した固定化リパーゼを処理
する際に使用する極性溶剤としては、リパーゼを失活さ
せない有機溶剤であれば良く、アセトン，ジオキサン，
アルコール，ジメチルスルホキシド，ジメチルアセトア
ミド等が挙げられるが、アセトンまたはジオキサンが最
も有効である。

【００１４】

【０００９】固定化リパーゼを再生処理する極性溶剤に
溶解した水の濃度としては１〜５％が好適である。水が
１％未満では再生の効果が低く、５％を越える濃度の水
が含まれていると再生操作後も固定化リパーゼに多量の
水が残留し、エステルの転移反応より分解反応が優先す
るので好ましくない。

【００１５】

【００１０】再生処理時の処理温度は５〜５０℃、好ま
しくは２５〜４０℃が好適であり、その処理時間は１〜
４８時間、好ましくは１０〜２０時間が好適である。処
理する方法としては活性が低減した固定化リパーゼに対
し再生処理液を通液処理する方法、また、含浸処理する
方法等凡ゆる方法が採用出来る。尚、再生処理はエステ
ル転移反応の活性が初期活性の１０分の１を越える程度
に低減した固定化リパーゼに適用させても活性の再生に
は有利ではない。

【００１６】

【００１１】

【００１７】

【実施例】以下、本発明を実施例をあげて具体的に説明
するが、本発明はこの範囲に限定されるものではない。

【００１８】なお、固定化リパーゼのエステル転移反応
の活性は以下の方法で測定し、エステル転移率として求
めた。

【００１９】

【００１２】（活性測定方法） １）乾燥固定化リパーゼを内径0.4cm 、長さ５cmのステ
ンレスカラムに充填する。 ２）10％のＲ，Ｓ−α−フェニルエチルアルコールと４
％のビニルアセテートと100ppmの水を含むヘキサン溶液
を基質とし、温度２５℃，空間速度５ｈｒ^-1でカラムに
通液する。 ３）基質とステンレスカラムからの流出液を光学分割カ
ラム（ダイセル化学工業（株）製，商品名キラルセルＯ
Ｂ）で分析し、流出液中のＲ−α−フェニルエチルアル
コール量を測定する。 ４）エステル転移率を次式により計算する。

【００２０】

【００１３】

【００２１】

【数１】

【００２２】

【００１４】（実施例１）脱アセチル化度８０％、平均
分子量６０，０００のキトサン１２００ｇを３．５％酢
酸水溶液１８８０ｇに溶解した。該水溶液を、７％水酸
化ナトリウム、２０％エタノール、７３％水よりなる凝
固溶液中に落下し、キトサンを粒状多孔質に凝固再生
し、中性になるまで充分水洗し、平均粒径０．１mmの再
生粒状多孔質キトサン担体１０００ml（湿潤）を得た。

【００２３】

【００１５】この再生粒状多孔質キトサン担体８００ml
に水８００mlとエチレングリコールジグリシジルエーテ
ル４．１８４ｇを加えて６０℃で１時間架橋反応させ
た。反応終了後、水洗し、架橋再生粒状多孔質キトサン
担体８００mlを得た。

【００２４】

【００１６】架橋再生粒状多孔質キトサン担体が含む水
をジメチルアセトアミドで充分に除去した。該架橋再生
粒状多孔質キトサン担体１００mlにジメチルアセトアミ
ド１００mlと４．５４４ｇの塩化ステアロイルと１．５
１８ｇのトリエチルアミンを加え４０℃で攪拌し１０時
間反応させた。

【００２５】

【００１７】反応残液を除去したのち、ジメチルホルム
アミドで洗浄し、次いでジメチルアセトアミドを純水で
除去し塩化ステアロイルを導入した架橋再生粒状多孔質
キトサン担体を得た。

【００２６】

【００１８】湿潤状態の担体を湿重で１０ｇとり、クロ
モバクテリウムビスコスム由来のリパーゼ（旭化成工業
（株）製、商品名Ｔ−０１）１００mgを溶かした水溶液
１０ml、１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を５ml、純
水を２３５ml混合して酵素液とし、担体を入れた。３７
℃で１時間攪拌しリパーゼを担体に吸着させた後、担体
を濾別しよく水洗した。１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）を５ml、純水を２４２．５ml、１％グルタルアルデ
ヒド水溶液を２．５ml混合し固定液とし、固定液にリパ
ーゼ吸着後の担体を入れ、３７℃で１時間攪拌し、リパ
ーゼを担体と共有結合で固定化した。リパーゼを固定化
させた担体を濾別し、よく水洗し、湿潤固定化リパーゼ
を得、アセトンで固定化リパーゼに含まれる水を十分に
除去脱水し、真空乾燥することにより水分率５％の乾燥
固定化リパーゼを得た。

【００２７】

【００１９】得られた乾燥固定化リパーゼを５本のステ
ンレスカラムに夫々充填し、活性測定方法に記述したエ
ステル転移反応を行い、エステル転移反応の活性を測定
したところ、初期のエステル転移率は７５％、８００時
間後のエステル転移率は２５％であった。

【００２８】

【００２０】次いで５本のカラムそれぞれに表１に示す
水を含むアセトンをそれぞれ２５℃で１８時間流し再生
処理をした。

【００２９】

【００２１】

【００３０】

【表１】

【００３１】

【００２２】再度、上述と同様のエステル転移反応を行
い、エステル転移反応の活性を測定したところ表２の通
りであった。

【００３２】

【００２３】

【００３３】

【表２】

【００３４】

【００２４】この結果から明らかなように１〜５％の水
を含むアセトン溶液を流すことにより、固定化リパーゼ
を効果的に再生することができた。

【００３５】

【００２５】（実施例２）実施例１と同様の方法で水分
率５％の乾燥固定化リパーゼを得、ステンレスカラム５
本に充填した。実施例１と同様にエステル転移反応を行
い、エステル転移反応の活性を測定したところ、初期の
エステル転移率と所定時間後のエステル転移率は表３の
通りであった。

【００３６】

【００２６】

【００３７】

【表３】

【００３８】

【００２７】次に５本のカラムそれぞれに３％の水を含
むアセトンをそれぞれ２５℃で１８時間流し再生処理を
した。

【００３９】再度、エステル転移反応を夫々について同
様に行いエステル転移反応の活性を測定したところ、エ
ステル転移率は表４の通りであった。

【００４０】

【００２８】

【００４１】

【表４】

【００４２】

【００２９】再生後の固定化リパーゼを用い、更に同様
のエステル転移反応を行って、エステル転移反応の活性
を測定したところ、所定時間後のエステル転移率は表５
の通りであった。

【００４３】

【００３０】

【００４４】

【表５】

【００４５】

【００３１】次に５本のカラムそれぞれに３％の水を含
むアセトンをそれぞれ２５℃で１８時間流し再生処理し
た。

【００４６】再々度エステル転移反応を行ってエステル
転移反応の活性を測定したところ、エステル転移率は表
６の通りであった。

【００４７】

【００３２】

【００４８】

【表６】

【００４９】

【００３３】この結果から明らかなように、実験番号６
〜８の如くエステル転移反応の活性が初期活性の１０分
の１を越えないまで低減した固定化リパーゼに、水を含
むアセトン溶液を流すことにより、固定化リパーゼを効
果的に再生することができるが、実験番号９，１０の如
くエステル転移反応の活性が初期活性の１０分の１を越
えているものは再生，再々生してもエステル転移反応の
活性は充分復活していない。

【００５０】

【００３４】（実施例３）実施例１と同様の方法で水分
率５％の乾燥固定化リパーゼを得、内径０．４cm、長さ
５cmのステンレスカラム２本に同じ量充填した。実施例
１と同様のエステル転移反応を行い、エステル転移反応
の活性を測定したところ、初期のエステル転移率は７０
％、８００時間後のエステル転移率は１５％であった。

【００５１】

【００３５】次に１本のカラムには２％の水を含むジオ
キサン、もう一方のカラムには５％の水を含むジオキサ
ンをそれぞれ２５℃で１８時間流し再生した。

【００５２】再度、同様にエステル転移反応を行い、エ
ステル転移反応の活性を測定したところ、エステル転移
率は２％の水を含むジオキサンの場合４８％、５％の水
を含むジオキサンの場合５２％であり、固定化リパーゼ
が効果的に再生されていた。

【００５３】

【００３６】（実施例４）担体として日本錬水（株）
製、商品名ダイヤイオンＨＰ２１とダウケミカル（株）
製、商品名ダウエックスＭＷＡ−１を用いてそれぞれ湿
重で１０ｇとり、実施例１と同様の方法でクロモバクテ
リウムビスコム由来のリパーゼ（旭化成工業（株）製、
商品名Ｔ−０１）を固定化した乾燥固定化リパーゼを得
た。

【００５４】

【００３７】得られた乾燥固定化リパーゼを用い、実施
例１と同様の方法でエステル転移反応を行い、その活性
を測定したところ、ダイヤイオンＨＰ２１の初期のエス
テル転移率は８％、８００時間後のエステル転移率は２
％、ダウエックスＭＷＡ−１の初期のエステル転移率は
８％、８００時間後のエステル転移率は１．５％であっ
た。

【００５５】

【００３８】次にそれぞれのカラムに５％の水を含むア
セトンを２５℃で１８時間流し再生した。再度、エステ
ル転移反応を同様に行い、エステル転移反応の活性を測
定したところ、エステル転移率はダイヤイオンＨＰ２１
の場合５％、ダウエックスＭＷＡ−１の場合４．５％で
あり、固定化リパーゼが初期より活性は低いがそれなり
に効果的に再生された。

【００５６】

【００３９】

【００５７】

【発明の効果】有機溶剤中でエステル結合の転移反応に
触媒として用いた際に、活性が初期活性の１０分の１を
越えないまで低減した固定化リパーゼを、１〜５％の水
を含む極性溶剤中に入れ酵素活性を再生させると効率的
に固定化リパーゼが再生できる効果がある。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エステル転移反応の活性が初期活性の１
   ０分の１を越えないまで低減した固定化リパーゼを、１
   〜５％の水を含む極性溶剤中に入れ酵素活性を再生させ
   る固定化リパーゼの再生方法。