JPH0965893A

JPH0965893A - 細菌数の迅速測定方法及び細菌数測定キット

Info

Publication number: JPH0965893A
Application number: JP24384195A
Authority: JP
Inventors: Mikio Sato; 幹夫佐藤; Asami Ito; 朝美伊藤
Original assignee: Idemitsu Kosan Co Ltd
Current assignee: Idemitsu Kosan Co Ltd
Priority date: 1995-08-30
Filing date: 1995-08-30
Publication date: 1997-03-11

Abstract

(57)【要約】【課題】検体採取にスポイトなどの用具を使用せず、
注射器による吸引濾過操作のみで済み、特別な設備や専
門的な知識を必要とせず、１段階の濾過操作で迅速（１
分以内に）かつ簡便に、試料中の細菌数を測定する方法
と測定具とを提供すること。【解決手段】試料中の細菌数を測定する方法におい
て、細菌検出用疎水性フィルターを内部に有する濾過容
器に、細菌試料を吸引操作により導入した後、色素液組
成物に押し出して注入し、次いで吸引濾過して、前記細
菌検出用疎水性フィルターへの染色された細菌の捕集を
行ない、前記細菌検出用疎水性フィルターの着色度から
試料中の細菌数を測定することを特徴とする細菌数の迅
速測定方法、並びに細菌検出用疎水性フィルター１とフ
ィルター支持体２を内部に有する濾過容器Ａ、必要に応
じてプレフィルター３を内装した、前記濾過容器の先端
に装着しうる試料採取用部材Ｃ、色素液組成物Ｄ、前記
色素液組成物を入れる容器Ｅ及び色対照表Ｆからなる細
菌数測定キットの提供。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、検体採取にスポイ
トなどの用具を使用せず、注射器による吸引濾過操作で
済むため、高度な技術や専門的な知識を必要とすること
なく、しかも簡単な１段階の濾過操作で試料中の細菌数
を迅速、かつ、簡便に測定しうる方法と測定キットとに
関する。本発明は、尿中の細菌が問題となる診断分野を
はじめ、金属加工油分野、腐敗が問題となる染料分野，
食品分野、温泉水などの環境分野など、広汎な分野にお
いて有効に利用することができる。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】従来よ
り、尿検査分野などでは、炎症の発見や病状を推定する
ために、尿等の試料中の細菌数等の測定が行なわれてい
る。例えば、尿中の細菌が増殖した場合、細菌尿症と診
断され、尿路感染症が暗示される。従って、早期治療や
薬投与のため、細菌数の測定を行なっている。また、食
品分野などでは、食品が腐敗していないかどうかを判断
するために食品中の細菌数等の測定が行なわれており、
さらに発酵乳や乳酸菌飲料などでは食品中の乳酸菌数管
理のために食品中の乳酸菌数の測定が行なわれている。

【０００３】このような場合の細菌数の測定は、寒天平
板培養法により行なわれるのが主流である。しかしなが
ら、この培養法では、専門技術と恒温槽という機器が必
要であり、また結果が出るのに２４〜４８時間を要す
る。例えば、尿検査では、外来患者の尿試料は細菌検査
室か、または検査センターで培養検査が行なわれるた
め、結果が医者に分かるのは数日後である。精度の高い
診断を行なうために、迅速な細菌測定法が求められてい
る。一方、食品の場合、大腸菌検査と一般細菌検査とが
あり、大腸菌検査は１８時間培養で結果が出るものの、
一般細菌検査では２４時間以上の培養が必要であり、多
くの食品の場合、製品出荷後に結果が出るのが通常であ
る。特に発酵乳等における乳酸菌数の測定の場合には、
通常の培養法では７２時間程度かかるため、商品出荷後
であって、しかも多くの場合、消費者が既にその商品を
飲食し終わった後に、ようやく乳酸菌の菌数が分かると
いう具合であり、菌数管理の面から改善が求められてい
た。

【０００４】また、水溶性切削油などの金属加工油分野
では、細菌が増殖して油剤が腐敗することがある。現
在、簡易培養キット（例：商品名＝イージーカルト）で
細菌の有無がチェックされているが、結果が出るのに４
８時間を要する。従って、腐敗防止対策が後手に回り、
腐敗による悪臭の発生を防止できない場合がある。さら
に、現在実用化されていないが、細菌の酵素活性を測定
する方法（特開昭５７−７４０９５号公報）、蛍光色素
法（特開昭６２−１３８１８５号公報）、フィルター染
色法（特開平１−１２４７６７号公報）等が提案されて
いるが、酵素活性測定用試薬の不安定性、特殊機器（蛍
光光度計）の必要性、染色法の操作性の煩雑さ等の欠点
があった。

【０００５】本出願人は、このような従来の欠点を解消
するものとして、試料中の微生物生菌数を測定するにあ
たり、微生物を染色した後に疎水性フィルターに捕集す
るか、或いは疎水性フィルターに捕集した後に微生物を
染色し、次いで過剰の色素を洗浄により除去し、微生物
の着色度から試料中の微生物菌数を測定する方法を既に
提案している（特開平４−２１８３９２号公報) 。この
方法によれば、熟練した技術や専門的な知識、特別な設
備などを必要とせず、しかも迅速、かつ、簡便に試料中
の微生物菌数を測定することが可能となった。しかしな
がら、この方法の場合、検体採取にスポイトなどの用具
を使用する必要があるばかりか、２段階の濾過操作が必
要であるため、実際使用してみると、操作が煩雑である
という問題があった。

【０００６】本発明者らは、このような従来の欠点を解
消し、検体採取にスポイトなどの用具を使用せず、注射
器による吸引濾過操作で済むため、特別な設備や専門的
な知識を必要とすることなく、しかも簡単な１段階の濾
過操作で迅速（１分以内に）、かつ簡便に、試料中の細
菌数を測定し得る方法とその測定キットとを提供するこ
とを目的とするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の本発明
は、試料中の細菌数を測定する方法において、細菌検出
用疎水性フィルターを内部に有する濾過容器に、細菌試
料を吸引操作により導入した後、色素液組成物に押し出
して注入し、次いで吸引濾過して、前記細菌検出用疎水
性フィルターへの染色された細菌の捕集を行ない、前記
細菌検出用疎水性フィルターの着色度から試料中の細菌
数を測定することを特徴とする細菌数の迅速測定方法を
提供するものである。

【０００８】次に、請求項８記載の本発明は、細菌検出
用疎水性フィルターとフィルター支持体を内部に有する
濾過容器、プレフィルターを内装した、前記濾過容器の
先端に装着しうる試料採取用部材、色素液組成物、前記
色素液組成物を入れる容器及び色対照表からなる細菌数
測定キットを提供するものである。

【０００９】さらに、請求項９記載の本発明は、細菌検
出用疎水性フィルターとフィルター支持体を内部に有す
る濾過容器、前記濾過容器の先端に装着しうる試料採取
用部材、色素液組成物、前記色素液組成物を入れる容器
及び色対照表からなる細菌数測定キットを提供するもの
である。請求項９記載の発明は、請求項８記載の発明に
おいて、試料採取用部品がプレフィルターを装着したも
のでない点で異なる。

【００１０】

【発明の実施の形態】上記請求項１記載の本発明の方法
は、請求項８或いは請求項９記載の本発明の細菌数測定
キットによって、好適に実施することができる。従っ
て、以下、請求項８或いは請求項９記載の本発明の細菌
数測定キットを参照しつつ、請求項１記載の本発明の測
定方法を説明することとする。

【００１１】請求項１記載の本発明について述べると、
この測定方法では、試料中の細菌数を測定するにあた
り、先ず細菌検出用疎水性フィルターを内部に有する濾
過容器に、細菌試料（例えば、発酵乳や発酵乳飲料）を
吸引操作により導入する。

【００１２】濾過容器は、チューブ状、即ち筒状或いは
管状をなしており、塩化ビニルなどのプラスチック製と
ガラス製とのいずれをも使用することができる。さら
に、その容量は、使用する色素液組成物等の液量に応じ
て適宜選択すればよい。この濾過容器は、細菌検出用疎
水性フィルターを内部に有し、さらに前記フィルターの
支持体を予め配したものである。このような濾過容器と
しては、請求項８に記載されたものを好適に用いること
ができる。

【００１３】以下、図面により本発明を説明する。図１
は、請求項８に記載された本発明の細菌数測定キットの
１態様を示す説明図である。また、図２は、請求項８に
記載された本発明の細菌数測定キットを市販の注射器と
組み合わせて、細菌数測定の準備をした状態を示す説明
図である。なお、図中、符合Ａが濾過容器である。

【００１４】請求項８に記載された細菌数測定キットに
おける濾過容器Ａは、細菌検出用疎水性フィルター１と
フィルター支持体２とを内部に有するものである。この
濾過容器Ａは、前記したようにチューブ状、即ち筒状或
いは管状をなしており、その一端に細菌検出用疎水性フ
ィルター１を備えたものである。濾過容器Ａとしては、
前記したように塩化ビニルなどのプラスチック製とガラ
ス製のいずれをも使用することができるが、プラスチッ
ク製のものが取扱上からは好ましい。

【００１５】細菌検出用のフィルターとして、本発明の
方法では疎水性フィルター１を用いる。疎水性フィルタ
ーは極性が弱いか、或いは極性がなく、過剰の色素の除
去が容易であるため細菌捕集用のフィルターとして好適
である。一方、極性のあるフィルターは過剰の色素の除
去が容易ではないため、好ましくない。

【００１６】このような疎水性フィルター１としては、
例えばナイロン系、ポリテトラフルオロエチレン（四フ
ッ化エチレン樹脂）等のフッ素系、ポリプロピレンなど
のポリオレフィン系、ポリカーボネート系、或いはガラ
ス系などの疎水性フィルターが挙げられる。これらのフ
ィルターの中でも特にポリテトラフルオロエチレンやポ
リプロピレンを材料とする疎水性フィルターが、過剰の
色素の除去が容易であるため好ましい。また、親水性の
材料、例えばニトロセルロース系フィルターを表面処理
により疎水性にすれば、疎水性フィルターとして使用す
ることができる。ここで表面処理としてはコーティング
などであり、コーティングに用いる材料として、前記ナ
イロン系，フッ素系，ポリオレフィン系の材料などを用
いることができる。

【００１７】この細菌検出用の疎水性フィルター１の濾
過孔径は、細菌の捕集に通常使用される０．２〜３．０
μｍ程度の範囲で良い。この細菌検出用の疎水性フィル
ター１の吸引濾過面積（着色域の面積）の大きさは、見
やすければ特に制限はない。この着色域の形は特に問わ
ないが、見やすさの点で円形が望ましく、その直径は１
〜３mm程度のものが好ましい。細菌検出用の疎水性フィ
ルター１全体の大きさは特に制限はないが、少なくとも
着色域の大きさは最低必要である。

【００１８】この細菌検出用の疎水性フィルター１の色
としては、用いる色素を考慮して、判定容易な色を定め
ればよい。着色の程度を容易に判定するためには、白色
の疎水性フィルターが好ましい。また、透明，半透明の
疎水性フィルターも用いることができ、フィルター支持
体２を白色にすると、判定が容易となる。

【００１９】次に、フィルター支持体２としては、前記
細菌検出用疎水性フィルター１を支持しうるものであれ
ば、その材質、形状等は問わない。通常はシリコーン樹
脂などで作製されたものである。

【００２０】一方、濾過容器Ａの他端は、注射器Ｂの先
端が装着可能であって、注射器Ｂによる吸引を可能にし
たものとされている。なお、必要に応じて、本発明の細
菌数測定キットの中に注射器Ｂ自体を含めても良い。

【００２１】そして、この濾過容器Ａの先端（細菌検出
用疎水性フィルター１を備えた側）には、図１に示した
ように、内部にプレフィルター３を装着した（すなわ
ち、プレフィルター３を内装した）試料採取用部材Ｃ
が、取外し自在に組み合わせられる。通常は、図１，図
２に示すように、試料採取用部材Ｃの内部に、一部濾過
容器Ａの先端が入り込むような形で嵌合しうるように作
製しておき、嵌合した際に、試料採取用部材Ｃの内部に
装着されたプレフィルター３と、濾過容器Ａの一端に装
着された細菌検出用疎水性フィルター１とが接するよう
にしておく。この試料採取用部材Ｃは、一端が先細状を
なしたチューブ状、即ち筒状或いは管状のものであり、
その先細状の一端から試料を採取しうるように、そこに
試料採取口４が設けられている。さらに、この試料採取
用部材Ｃには、計量目盛りを付しておくことが好まし
い。図１では、３本の計量目盛りを付したものを示して
いる。通常使用する試料の量である５０〜１００μｌの
範囲に目盛りをふっておくと良い。

【００２２】なお、試料採取用部材Ｃの内部に装着され
るプレフィルター３は、動物細胞除去用のものであっ
て、細菌試料中に細菌より大型の動物細胞、例えば白血
球などが共存する場合に、細菌は通過させるが、そのよ
うな大型の動物細胞を通過させず、捕集するためのもの
である。従って、このような大型の動物細胞が存在しな
い細菌試料、例えば発酵乳又は発酵乳飲料のようなもの
の場合には、請求項９に示すように、このプレフィルタ
ー３を省略してもよい。プレフィルター３を使用する場
合には、例えば、濾過孔径が６〜６０μｍ程度のものを
用いて前処理すればよい。このようなプレフィルターと
しては、ポリプロピレン系のフィルター（濾過孔径が７
μｍ程度のもの）、後記する実施例の『ゴナビスライド
・新ゴナビスライド』（持田製薬製）などの妊娠診断薬
用尿採取フィルター（材質：塩ビ系）、市販の油性ペン
などで使用されているフェルト、不織布などを使用する
ことができる。

【００２３】上記したように、請求項１記載の本発明で
は、試料中の細菌数を測定するにあたり、先ず細菌検出
用疎水性フィルター１を内部に有する濾過容器Ａに、細
菌試料（例えば、発酵乳や発酵乳飲料）を吸引操作によ
り導入するわけであるが、この吸引操作を行なう手順に
ついて説明する。

【００２４】すなわち、まず、濾過容器Ａの先端（細菌
検出用疎水性フィルター１を備えた側）に、内部にプレ
フィルター３を装着した試料採取用部材Ｃを取付ける
（嵌合する。）。このとき、プレフィルター３と細菌検
出用疎水性フィルター１とが当接するようにしておく。
但し、請求項９に示すように、プレフィルター３を装着
しない試料採取用部材Ｃを組み合わせ、これを取付けて
も良い。次いで、濾過容器Ａの他端（細菌検出用疎水性
フィルター１を備えた側と反対側）に注射器Ｂを取付け
て、吸引操作の準備をする。但し、以上の操作は、順序
を逆に行なっても差支えない。

【００２５】このようにして吸引操作の準備をした段階
の様子が図２に示されている。この状態で、試料採取用
部材Ｃの先端に設けられている試料採取口４から細菌試
料を注射器Ｂの吸引操作により所定量導入する。細菌試
料の導入量は、試料採取用部材Ｃに設けられている計量
目盛りを目安にすれば良い。

【００２６】ここで本発明を適用することができる試料
は、特に制限はなく、例えば尿を初めとして、切削油，
圧延油，熱処理油などの水溶性金属加工油、液体調味料
（醤油，ソースなど），液体飲食品（例えば発酵乳・乳
酸菌飲料など），酒類（例えばワイン，清酒など）など
の液状食品、粉末や固形食品（例えば野菜，魚肉など）
の場合には洗浄した試料、水溶性塗料等、さらには河川
水，池水，温泉水，水槽水，生活廃水などの水等にも幅
広く適用することができる。なお、試料は必要に応じ
て、適宜、希釈したり、或いは例えば固形食品などの場
合には破砕した後に、希釈したりするなどして測定用試
料とするとよい。請求項１に記載された測定方法は、こ
のような試料中に存在する細菌、例えば大腸菌（ Esche
richia Coli ），黄色ブドウ球菌（ Staphylococcus au
reus )，緑膿菌（ Pseudomonas aeruginosa ) などにつ
いて、その総数を迅速に測定しようとするものである。
特に請求項９記載の本発明の測定キットは、発酵乳や発
酵乳飲料における細菌数の迅速測定に有効に用いること
ができる。

【００２７】次に、上記のようにして細菌試料を注射器
Ｂの吸引操作により導入した後、色素液組成物Ｄに一旦
押し出して注入する。ここで色素液組成物Ｄは、図１に
示すように適当な容器（例えば、点眼ビン５など）に入
れられてキットとされており、さらに、約１回分の吸引
濾過操作に使用する量の色素液組成物Ｄを入れることの
できる適当な容器Ｅ、例えば０．５〜１．５ｍｌ容程度
のマイクロチューブが組み合わせられ、この中に色素液
組成物Ｄが入れられて細菌数の測定に供せられることと
なる。このような色素液組成物を入れる容器Ｅ（マイク
ロチューブなど）を組み合わせて使用し、この中に色素
液組成物Ｄを点眼ビン５などから、予め少量添加してお
き、次いで注射器Ｂに導入された細菌試料を一旦押し出
して、これに注入し、良く混和する。この結果、細菌試
料が色素液組成物Ｄにより染色される。

【００２８】ここで色素液組成物Ｄとしては、染色と洗
浄とを兼ねることのできる組成物が用いられ、具体的に
は細菌の染色に使用可能な色素と、水又は各種緩衝液、
さらに必要に応じて加える界面活性剤とからなるもので
ある。

【００２９】細菌の染色に使用可能な色素としては、例
えばサフラニン，フクシン，メチレンブルー，メチルグ
リーン，クリスタルバイオレット，ゲンチアナバイオレ
ット，ビクトリアブルーＢなどが挙げられ、特に判定の
し易さの点より、サフラニン，フクシン，メチレンブル
ー，メチルグリーンが好ましい。また、緩衝液の使用可
能ｐＨは４〜９であり、色素の安定性の点から好ましく
はｐＨ５〜７である。必要に応じて、エタノールなどの
防腐剤や界面活性剤等を添加することもできる。使用可
能な色素濃度は、フクシンの場合、通常、0.00005 〜0.
0004％（ｗ／ｖ）、好ましくは 0.0001 〜 0.0003 ％
（ｗ／ｖ）である。ここで色素の濃度が、0.00005 ％未
満であると着色が不充分となり、一方、色素液の濃度が
0.0004％を超えると過剰の色素の除去が困難となるた
め、いずれも好ましくない。

【００３０】なお、必要に応じて、エタノールなどの防
腐剤を添加する場合には 0.1〜 15％（ｖ／ｖ）添加す
ればよい。また、界面活性剤を添加する場合には、界面
活性剤を 0.001〜1.0 ％（ｗ／ｖ）の割合で添加すれば
よい。

【００３１】なお、１試料当りの色素液組成物量は、試
料の２〜５倍量が適当である。一方、試料の量は、通
常、50〜100 μｌである。従って、例えば試料の量が 1
00μｌの場合、色素液組成物は 200〜500 μｌ必要であ
る。但し、試料の５倍を超える量は必要ない。色素液組
成物の使用量は、色の対照表や検量線を作成する際の使
用量と、細菌数未知試料への使用量とを等量にすること
が、誤差を抑える意味で好ましい。

【００３２】上記のように注入後、直ちに注射器Ｂの先
端に取付けられている試料採取用部材Ｃの先端に設けら
れている試料採取口４から、色素液組成物を入れる容器
Ｅ（マイクロチューブなど）に入れられている色素液組
成物と細菌試料との混合物を、注射器Ｂのピストン６を
引いて吸引濾過する。この吸引濾過操作により、細菌検
出用疎水性フィルター１への染色された細菌の捕集が行
なわれる。同時に、過剰色素の除去が行なわれる。即
ち、注射器Ｂのピストン６を引っ張って吸引すると、染
色された細菌試料を含む液（細菌試料液と色素液組成物
Ｄとの混和液）が細菌検出用疎水性フィルター１に捕集
され、これと同時に過剰色素が除去される。本発明の方
法によれば、このように染色された細菌の疎水性フィル
ターへの捕集と過剰色素の除去とを同時に行なうことが
でき、操作工程が簡便となる。

【００３３】請求項１記載の本発明の測定方法において
は、このようにして細菌検出用の疎水性フィルター１へ
の染色された細菌の捕集と過剰色素の除去とを同時に行
ない、細菌検出用の疎水性フィルター１の着色度から試
料中の細菌数を測定する。すなわち、このようにして細
菌検出用疎水性フィルター１への染色された細菌の捕集
を行なった後、注射器Ｂの先端に取付けられている試料
採取用部品Ｃを取外すと、濾過容器Ａの先端が露出した
形となる。この濾過容器Ａの先端に備えられている細菌
検出用疎水性フィルター１上に存在する細菌の着色度、
即ち色の強度を、例えば既知量の細菌数の試料を用いて
予め作成しておいた色の対照表Ｆと比較することによ
り、試料中の細菌数を測定する。なお、図１，図２に示
す色対照表Ｆは、色対照表の一例を示したものであっ
て、この色対照表中に記載されている数字（から）
は、『ｍｌ当たりの lognumber 』を示している。

【００３４】請求項１記載の本発明の測定方法において
は、このようにして細菌検出用の疎水性フィルターへの
染色された細菌の捕集と過剰色素の除去とを同時に行な
い、細菌検出用の疎水性フィルターの着色度から試料中
の細菌数を測定する。このように過剰の色素が除去され
た試料中の細菌の着色度から、試料中の細菌数を測定す
る。この細菌数の測定は、（１）色の対照表を用いて目
視により比較するのが一番簡便であるが、（２）光学密
度（Ｏ．Ｄ．）測定による比色定量法により行なうこと
もできる。目視判定の場合には、細菌検出用の疎水性フ
ィルターの表側の面のみならず、裏側の面の着色度よ
り、測定することもできる。これらの場合には、それぞ
れの側用の色対照表や、吸光度と細菌数の検量線を作成
すればよい。

【００３５】上記（１）の目視による細菌数の測定は、
具体的には、細菌捕集用の疎水性フィルター上に存在す
る細菌の着色度、即ち色の強度を、既知量の細菌数の試
料を用いて予め作成しておいた色の対照表と比較するこ
とにより行なえばよい。色の対照表は、細菌数が既知の
試料を用い、請求項１記載の測定方法で染色，洗浄した
細菌検出用の疎水性フィルターをカラー写真に撮ること
により、又は、この染色された細菌検出用の疎水性フィ
ルターと同程度に濾紙等を着色したり、或いは同程度の
色を紙に印刷することにより、作成することができる。

【００３６】例えば、尿中の細菌数を測定する場合に
は、次のようにして色の対照表を作成する。すなわち、
尿中細菌は健常人の尿にも低濃度〔多い場合でも１ｍｌ
（ミリリットル）当り１万個程度〕存在するが、総数で
１ｍｌ当り１０万個以上存在した場合には細菌尿症の疑
いありと判断され、１ｍｌ当り１００万個以上の場合に
は細菌感染（細菌尿症）が確定的である。従って、この
値の前後で検出できる色対照表を作成すれば良い。通
常、１千個／ｍｌ，１万個／ｍｌ，１０万個／ｍ
ｌ，１００万個／ｍｌ，１０００万個／ｍｌの５点
の場合の標準色対照表を作成すれば充分であるが、勿
論、これに限定されるものではない。

【００３７】また、上記（２）の光学密度（Ｏ．Ｄ．）
測定による比色定量は、細菌検出用の疎水性フィルター
上に存在する細菌を着色した色素を、有機溶剤を用いて
溶出させ、溶出液の着色度を吸光度により測定し、予め
作成した光学密度（Ｏ．Ｄ．）と細菌数との検量線と照
合して定量すればよい。吸光度測定時の波長は、用いる
色素により、適宜定めればよい。ここで有機溶剤として
は、各種アルコール類を使用することができるが、特に
エタノールが好ましい。

【００３８】なお、検量線の作成は、例えば次のように
して行なえばよい。即ち、色素としてフクシンを用いた
場合には、各種の濃度に希釈した試料の着色度を、マイ
クロプレートリーダーを用いて、着色度を４９２ｎｍの
光学密度（Ｏ．Ｄ．）により測定しておき、一方、各種
の濃度に希釈した試料と同一試料の試料溶液中の細菌数
を、寒天平板培養法のコロニー数の計数により算出して
おき、両者の結果から細菌数と光学密度の検量線を作成
すればよい。

【００３９】

【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。実施例１（１）尿中細菌数測定用色対照表の作成細菌として、大腸菌（ Escherichia coli )( ATCC 11
303 ) および黄色ブドウ球菌（ Staphylococcus aure
us )（ IFO 3183 ) を用いて、以下の実験を行なった。
肉汁ブイヨン培地に菌種を接種し、３７℃で２４時間の
静置培養を行ない、培養液を標準試料用菌懸濁液とし
た。一方、健常人男子の放出尿を採取して、濾過孔径が
０．５μｍのポリテトラフルオロエチレン製メンブレン
フィルター（東洋濾紙製）で濾過して、細菌希釈用液を
調製した。上記標準試料用菌懸濁液に所定量のこの細菌
希釈用液を添加して、各細菌数が１千個／ｍｌ程度、
１万個／ｍｌ程度、１０万個／ｍｌ程度、１００
万個／ｍｌ程度、１０００万個／ｍｌ程度の濃度とな
るように、５種の標準試料を調製した。なお、培養法に
よる細菌数はＣＬＥＤ寒天平板培地で、３７℃、２４時
間培養した際のコロニー数により計数した。

【００４０】図１，図２に示す細菌数測定キットを実験
に使用した。寸法及び色素液組成物は以下の通りであっ
た。・色素液組成物Ｄ：フクシンを 0.0002 ％、食塩を 0.8
5 ％、ツィーン20を0.05％の割合で含む液・濾過容器Ａ：外径４．６ｍｍ、内径４ｍｍ、長さ２０
ｍｍ、ポリプロピレン製のチューブ・試料採取用部材Ｃ：１０，５０，１００μｌの計量目
盛り付きチップ、広口側の内径５ｍｍ（米国クオリティ
ー社製）・マイクロチューブ（色素液組成物を入れる容器Ｅ）：
１．５ｍｌ容、ポリプロピレン製（米国クオリティー社
製）・細菌検出用疎水性フィルター１：ポリテトラフルオロ
エチレン製メンブレンフィルター（孔径３μｍ、着色面
積直径１．５ｍｍ）・フィルター支持体２：シリコーンチューブ（外径４ｍ
ｍ、内径１．５ｍｍ）を長さ７ｍｍに切断したもの・点眼ビン５：１０ｍｌ容、ポリプロピレン製・プレフィルター３：直径４ｍｍ、長さ４ｍｍ、ポリビ
ニルアルコール製、濾過孔径＝６０μｍ

【００４１】図２に示したように、濾過容器Ａの一端
に、３ｍｌ容の注射器Ｂを装着し、一方、濾過容器Ａの
他端（細菌検出用疎水性フィルター１を備えた側）に、
内部にプレフィルター３を装着した試料採取用部材Ｃを
取外し自在に嵌合し、この試料採取用部材Ｃの先端に設
けられている試料採取口４から、上記細菌試料１００μ
ｌを注射器Ｂの吸引操作により採取した。次に、上記の
ようにして細菌試料を注射器Ｂの吸引操作により導入し
た後、３５０μｌ（７〜８滴）の色素液組成物Ｄを入れ
た容器Ｅ（マイクロチューブ）に一旦押し出して注入し
た。

【００４２】注入後、直ちに注射器Ｂの先端に取付けら
れている試料採取用部材Ｃの先端に設けられている試料
採取口４から、容器Ｅ（前記マイクロチューブ）に入れ
られている色素液組成物と細菌試料との混合物を、注射
器のピストン６を引いて吸引濾過した。この吸引濾過操
作により、細菌検出用疎水性フィルター１への染色され
た細菌の捕集が行なわれると同時に、過剰色素の除去が
行なわれた。このようにして細菌検出用疎水性フィルタ
ー１への染色された細菌の捕集を行なった後、注射器Ｂ
の先端に取付けられている試料採取用部材Ｃを取外し、
濾過容器Ａの先端を露出させ、この濾過容器Ａの先端に
備えられている細菌検出用疎水性フィルター１上に存在
する細菌の着色度を目視により観察した結果、下記の第
１表の通りであった。

【００４３】

【表１】

【００４４】これらの着色したフィルターを、標準サン
プルとしてカラー写真にとり、色の対照表とした。な
お、大腸菌と黄色ブドウ球菌との間で着色の程度に大差
はなかった。

【００４５】（２）尿中細菌数の測定健常人の放出尿と各種患者の放出尿とを試料として、上
記（１）の尿中細菌測定用色対照表の作成に示したと同
様の操作を行ない、上記（１）で作成した色対照表と比
較して、目視による判定により、尿中細菌数を測定し
た。結果を第２表に示す。なお、比較のために、ＣＬＥ
Ｄ寒天平板培地で、３７℃、２４時間培養して測定した
細菌数も併せて表示した。

【００４６】

【表２】

【００４７】実施例２（１）発酵乳飲料中の細菌数測定用色対照表の作成市販のヨーグルト（全農直販製造、商品名：すりおろし
リンゴ）を、水で、細菌数が 10⁵個／ｍｌ程度、 1
0⁶個／ｍｌ程度、10⁷個／ｍｌ程度となるように希釈
して、それぞれ３種類の標準試料を調製した。なお、培
養法による細菌数の測定は、ＢＣＰ加プレートカウント
寒天培地（栄研化学製）で、３７℃、７２時間培養した
際のコロニー数により計数した。

【００４８】細菌数測定キットは、実施例１で用いた測
定キット中から、プレフィルターを除いたものを使用
し、試薬、器具、操作法は実施例１と同様であった。

【００４９】前記標準試料１００μｌを実施例１と同様
な操作で染色操作を行ない、吸引濾過し、次いで細菌検
出用疎水性フィルター１上に存在する細菌の着色度を目
視により観察した結果、下記の第３表の通りであった。

【００５０】

【表３】

【００５１】これらの着色したフィルターを、標準サン
プルとしてカラー写真にとり、色の対照表とした。

【００５２】（２）発酵乳飲料中の細菌数の測定所定期間冷蔵庫で保存した３種のヨーグルト（全農直販
製造、商品名：すりおろしリンゴ，プレーンタイプ，す
りおろしキャロット）を水で１０００倍に希釈して試料
とした。上記（１）の標準試料の場合と同様に、それぞ
れ１００μｌについて染色操作を行ない、吸引濾過し
た。この操作で、細菌検出用疎水性フィルター１への染
色された細菌の捕集と過剰色素の除去とを同時に行なっ
た。この細菌検出用疎水性フィルター１上に存在する細
菌の着色度を目視により観察し、上記（１）で作成した
色の対照表と比較して、目視による判定を行なった。ヨ
ーグルト中の細菌数を測定するために、希釈倍率の１０
００倍（１０³）を乗じて細菌数を測定した。なお、測
定時間は６０秒であった。結果を第４表に示す。なお、
比較のために、培養法（ＢＣＰ加プレートカウント寒天
培地、栄研化学製、３７℃、７２時間培養）で測定した
細菌数も併せて表示した。

【００５３】

【表４】

【００５４】比較例１特開平４−２１８３９２号に記載された方法に従って、
尿中の細菌数を測定したところ、測定時間は３分であっ
た。

【００５５】

【発明の効果】請求項１記載の本発明の方法によれば、
検体採取にスポイトなどの用具を使用せず、注射器によ
る１段階の吸引濾過操作で疎水性フィルターへの染色さ
れた細菌の捕集と過剰色素の除去を同時に行なうことが
でき、試料中の細菌数を迅速、かつ、簡便に測定するこ
とができる。請求項１記載の本発明の方法によれば、通
常、１分以内（慣れれば３０秒程度）で判定可能であ
る。また、請求項１記載の本発明の方法によれば、専門
的な技術や知識を必要とせずに、試料中の細菌数を測定
することができる。しかも請求項１記載の本発明の方法
によれば、細菌の培養なしに、細菌の有無が分かるの
で、病院の細菌検査の検体スクリーニングに活用するこ
とができ、患者及び病院の経費軽減に貢献することがで
きる。また、請求項１記載の本発明の方法においては、
特別な機器を必要としないので、小規模な病院や診療
所、或いは一般の人でも測定することができる。さら
に、請求項１記載の本発明の方法は、疎水性フィルター
の濾過孔径を選択することにより、多くの細菌に適用で
きるので、応用範囲も極めて広い。請求項１記載の本発
明の方法によれば、食品（ヨーグルトなど）の出荷前に
細菌数が分かるので、食品の品質管理に貢献することが
できる。

【００５６】請求項８，９記載の本発明の細菌数測定キ
ットによれば、スポイトなどによる試料の採取、試薬瓶
による試薬の滴下などの操作が不要であり、注射器によ
る１段階の濾過操作で済むので、操作が極めて簡便であ
る。また、熟練を必要とせず、設備が不要であるので、
測定に場所を選ばない。また、請求項８，９記載の本発
明の細菌数測定キットは、極めて簡単、かつ、安価なも
のであって、特別な機器を必要としないので、どのよう
な現場においても使用することができるという利点があ
る。特に、一般の素人も使用することができるため、簡
単に河川水，池水，海水，温泉水などの身の回りの水質
の検査が可能となり、環境保全に貢献することができる
ばかりか、液状食品や固形食品などの食品における細菌
数の検査等が可能となるという特質がある。さらに、請
求項８，９記載の本発明の細菌数測定キットによれば、
測定終了後、細菌の同定が必要な試料は、吸引により採
取することができ、細管を加熱処理などによって封印す
れば、検査室への輸送容器ともなる。従って、本発明
は、尿検査分野（診断領域）や金属加工分野をはじめ、
各種検査に広く利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、請求項８に記載された本発明の細菌数
測定キットの１態様を示す説明図である。

【図２】図２は、請求項８に記載された本発明の細菌数
測定キットを市販の注射器と組み合わせて、細菌数測定
の準備をした状態を示す説明図である。

【符合の説明】

Ａ濾過容器Ｂ注射器Ｃ試料採取用部材Ｄ色素液組成物Ｅ色素液組成物を入れる容器Ｆ色対照表１細菌検出用疎水性フィルター２フィルター支持体３プレフィルター４試料採取口５点眼ビン６ピストン

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の細菌数を測定する方法におい
て、細菌検出用疎水性フィルターを内部に有する濾過容
器に、細菌試料を吸引操作により導入した後、色素液組
成物に押し出して注入し、次いで吸引濾過して、前記細
菌検出用疎水性フィルターへの染色された細菌の捕集を
行ない、前記細菌検出用疎水性フィルターの着色度から
試料中の細菌数を測定することを特徴とする細菌数の迅
速測定方法。
【請求項２】色素液組成物が、色素、緩衝液及び界面
活性剤からなる請求項１記載の方法。
【請求項３】色素液組成物中の色素濃度が、0.00005
〜0.0004％（ｗ／ｖ）である請求項１記載の方法。
【請求項４】色素液組成物中の界面活性剤濃度が、0.
001 〜1.0 ％（ｗ／ｖ）である請求項１記載の方法。
【請求項５】濾過容器として、プレフィルターを内装
した試料採取用部品を先端に取付けたものを用いる請求
項１記載の方法。
【請求項６】試料が尿である請求項１〜５のいずれか
に記載の方法。
【請求項７】試料が発酵乳又は発酵乳飲料である請求
項１記載の方法。
【請求項８】細菌検出用疎水性フィルターとフィルタ
ー支持体を内部に有する濾過容器、プレフィルターを内
装した、前記濾過容器の先端に装着しうる試料採取用部
材、色素液組成物、前記色素液組成物を入れる容器及び
色対照表からなる細菌数測定キット。
【請求項９】細菌検出用疎水性フィルターとフィルタ
ー支持体を内部に有する濾過容器、前記濾過容器の先端
に装着しうる試料採取用部材、色素液組成物、前記色素
液組成物を入れる容器及び色対照表からなる細菌数測定
キット。