JPH0975430A

JPH0975430A - 汚染除去方法

Info

Publication number: JPH0975430A
Application number: JP7274640A
Authority: JP
Inventors: Masashi Funayama; 政志船山
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-09-18
Filing date: 1995-09-18
Publication date: 1997-03-25

Abstract

(57)【要約】【目的】（１）抗菌剤を構成成分とする担体により、微
生物、および核酸に汚染された、細胞懸濁液または、生
理活性物質中の微生物、リポ多糖および核酸を除去す
る。（２）抗菌剤を構成成分とする担体により、微生物、お
よび核酸に汚染された、細胞懸濁液または、生理活性物
質中の微生物、リポ多糖および核酸を補足した後、当該
物質の定量方法により定量する。【構成】抗菌剤を構成成分とする担体および定量試薬よ
りなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、第一に、抗菌剤を構成
成分とすることを特徴とする不溶性担体を用いて、細胞
（主として浮遊性細胞および半吸着性細胞）懸濁液およ
び、生理活性物質溶液を汚染した微生物（ウイルスおよ
びマイコプラズマを含む）リポ多糖、および核酸を吸着
除去する方法に関する。更に、抗菌剤を構成成分とする
ことを特徴とする不溶性担体を用いて、細胞懸濁液およ
び生理活性物質溶液中の微生物、リポ多糖および核酸を
検出定量する方法に関する。第二に、抗菌剤を構成成分
とすることを特徴とする磁性粒子を用いて、細胞懸濁液
および生理活性物質溶液中の微生物、リポ多糖および核
酸を吸着除去する方法に関する。更に、抗菌剤を構成成
分とすることを特徴とする磁性粒子を用いて、細胞懸濁
液および生理活性物質溶液中の微生物、リポ多糖および
核酸を検出定量する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞培養培地が微生物により汚染された
場合には、（１）細胞培養培地を汚染している微生物を
同定する。（２）汚染された細胞培養培地を他の細胞培
養培地から隔離する。（３）インキュベーターおよびｌ
ａｍｉｎａｒｆｌｏｗｈｏｏｄを除菌剤で掃除し、
ＨＥＰＡフィルターを点検する。（４）抗菌剤（抗生物
質および抗真菌剤）により培養細胞が死滅することを防
止する為に、ｄｏｓｅｒｉｓｐｏｎｓｅテストを行な
う。という手順を踏んで汚染微生物を除去する。

【０００３】次に、抗菌剤（抗生物質および抗真菌剤）
の毒性濃度を決定し、細胞培養培地の微生物汚染を除去
する為には、（１）細胞を抗菌剤無添加の培地に分散さ
せ、細胞数を数えて細胞継代用の濃度に希釈する。
（２）細胞懸濁液をｍｕｌｔｉｗｅｌｌｃｕｌｔｕｒ
ｅｐｌａｔｅまたは、小さいフラスコに分注する。Ｆ
ｕｎｇｉｚｏｎｅ，ｔｙｌｏｃｉｎｅ等の抗菌剤を一定
濃度ｍｕｌｔｉｗｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｐｌａｔ
ｅの各ｗｅｌｌまたは、各フラスコに分注する。例えば
Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅの場合は、０．２５、０．５０、
１．０、２．０，４．０、８．０ｕｇ／ｍｌの濃度が選
択される。（３）ｍｕｌｔｉｗｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ
ｐｌａｔｅまたはフラスコ中の細胞を培養中、毎日
観察し、細胞内容物の抜けたもの、細胞の液胞が現われ
たもの、細胞のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙの低下したもの、
細胞が丸くなったもの等毒性の兆候を観察する。（４）
有害抗菌剤濃度を決定し、当該濃度の１〜１／２の濃度
の抗菌剤を添加した培地で、汚染細胞を２〜３代、継代
培養する。（５）抗菌剤無添加培地で、（４）の操作を
行なった細胞を１代培養する。（６）（４）の培地
で、（５）の操作を行なった細胞を４〜６代、継代培養
し、汚染の除去を確認する。という手順を踏まなければ
ならない。即ち、従来法は汚染の除去の為の操作手順が
極めて煩雑であるという欠点があった。

【０００４】リポ多糖（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｈａｒ
ｉｄｅ：ＬＰＳ）は、グラム陰性菌細胞壁の外膜を構成
し、生体内に侵入すると発熱やショック症状を惹起する
有害物質である。注射剤等の医薬品や人工腎臓等の医療
用具には、リポ多糖が混入することは許されない。医薬
品等からリポ多糖を除去する為に、イオンクロマトグラ
ソィー、ゲルクロマトグラソィー、アフィニティークロ
マトダラフィー等の方法が提案されている。然し乍ら、
これらの方法には、平衡吸着量が小さい、ｐＨ、イオン
強度、再生条件等の条件設定が難しく、実用的な方法で
はない。

【０００５】遺伝子工学による生理活性物質の生産で
は、大腸菌、枯草菌、培養動物細胞等に遺伝子を組み込
み、当該菌または、当該細胞に生理活性物質を産生させ
る。この際問題となるのは、産生した生理活性物質と遺
伝子（核酸）および大腸菌等のグラム陰性菌によって産
生されるエンドトキシンとの分離の問題である。

【０００６】

【発明が解決しようとする問題点】本発明の目的は、上
記実情に鑑みてなされたもので、細胞培養培地および生
理活性物質溶液を汚染した、微生物、リポ多糖および核
酸の除去手順が極めて単純な担体を提供することにあ
る。また、当該担体を用いた、リポ多糖、微生物および
核酸の検出定量方法を提供することにある。更にまた、
本発明に関わる抗菌剤を構成成分とすることを特徴とす
る磁性粒子を用いた、リポ多糖、微生物および核酸の除
去方法、検出定量方法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成する為、
本発明の発明者は鋭意検討した結果、（１）抗菌剤を構成成分とすることを特徴とする不溶性
担体が、細胞懸濁液および、生理活性物質溶液を汚染し
た微生物を容易に除去すること。（２）抗菌剤を構成成分とすることを特徴とする不溶性
担体が、細胞懸濁液および、生理活性物質溶液を汚染し
たリポ多糖を容易に除去すること。（３）抗菌剤を構成成分とすることを特徴とする不溶性
担体が、細胞懸濁液および、生理活性物質溶液を汚染し
た核酸を容易に除去すること。を見出し、本発明を完成した。本発明に関わる担体は、
吸着容量が大きく、ｐＨ、イオン強度、再生条件等の条
件設定が容易であり、微生物、リポ多糖、核酸を容易に
吸着することが可能である。更に、当該担体を用いるこ
とにより、前記物質の定量が可能となる。更にまた、当
該担体は、本発明に関わる溶媒により洗浄することによ
り、容易に再生が可能である。

【０００８】本発明の不溶性担体は、本発明に関わる抗
菌剤を結合または配合できる担体を意味する。該不溶性
担体の形状は、膜、繊維、中空糸、粒状物等が考えられ
る。本発明の不溶性担体の具体例を挙げると、（１）ポ
リテトラフルオロエチレン、（２）ポリエチレン、
（３）ポリイソプレン、（４）ポリブタジエン、（５）
ポリスチレン、（６）ポリアクリル酸メチル、（７）ポ
リ塩化ビニル、（８）セルロース系樹脂（再生セルロー
ス、アセチルセルロース、ニトロセルロース等）、
（９）ポリエチレンテレフタレート、（１０）ポリアク
リルニトリルル、（１１）ポリビニルアルコール、（１
２）アミノプロピルガラスビーズ等が挙げられるが、こ
れらに限定されるものではない。具体的な製品名として
は、シャーレ、フィルム、試験管、管、注射筒、カテー
テル、フラスコ、ゲル等が考えられる。

【０００９】本発明に関わる抗菌剤と担体との結合方式
には担体結合法、架橋法、包括法、グラフト法等が考え
られるが、通常、担体結合法を用いる。担体と抗菌剤と
は、直接結合してもスペーサーを介して結合してもよい
が、本発明にかかわる担体への細胞および生理活性物質
の非特異吸着、補体の活性化等を防止する為、スペーサ
ーとして、予め親水性基を導入することが望ましい。担
体と抗菌剤との結合方法は、共有結合、イオン結合、疎
水結合、配位結合等が考えられるが、抗菌剤の剥離の可
能性の低い共有結合が望ましい。共有結合の例としてア
ミド結合、エステル結合、エーテル結合、アミノ結合、
イミノ結合、スルフィド結合、ジスルフィド結合等が挙
げられる。担体に抗菌剤またはスペーサーを結合させる
方法として望ましいのは、ハロゲン化シアン、エポキシ
化合物、ハロゲノ有機ハロイド、ジアルデヒド、ベンゾ
キノン等により担体を活性化した後、抗菌剤または、ス
ペーサーを結合させる。スペーサーを介したリガンドの
結合方法には、エポキシ化法、還元アミノ化法、チオー
ル活性化法等が考えられる。また、担体に抗菌剤を練り
込む、練り込み法も本法に含まれる。更にまた、担体表
面に抗菌剤を塗布する方法も本法に含まれる。

【００１０】

【発明の効果】

（１）本発明にかかわる抗菌剤を構成成分とすることを
特徴とする不溶性担体により、細胞懸濁液および、生理
活性物質溶液を汚染した微生物、リポ多糖および核酸を
効率良く吸着除去することが可能となる。（２）本発明にかかわる抗菌剤を構成成分とすることを
特徴とする不溶性担体を用いて、細胞懸濁液および、生
理活性物質溶液を汚染した微生物、リボ多糖および核酸
の検出および定量を行なうことが可能となる。（３）本発明にかかわる抗菌剤を構成成分とすることを
特徴とする磁性粒子により、細胞懸濁液および、生理活
性物質溶液を汚染した微生物、リポ多糖、核酸を効率良
く吸着除去することが可能となる。（４）本発明にかかわる抗菌剤を構成成分とすることを
特徴とする磁性粒子を用いて、細胞懸濁液および、生理
活性物質溶液を汚染した微生物、リポ多糖、核酸の検出
および定量を行なうことが可能となる。

【００１１】

【実施例】本発明を実施例により更に詳細に説明する。
本発明は実施例により、何ら限定されるものではない。《実施例１．》 −ポリミキシンＢ固定化ガラス膜の調製− １）コーニング社製多孔質ガラス膜（Ｎａ_２Ｏ−Ｂ_２Ｏ
_３−ＳｉＯ_２系ガラス膜）をγ−グリシドキシプロピル
トリメトキシシランの０．５％水溶液に浸漬し、２時間
攪拌し、多孔質ガラス表面のシラノール基と、γ−グリ
シドキシプロピルトリメトキシシランとを反応させた。２）１）の操作をした多孔質ガラス膜の水分を除去し、
１２０℃で３時間乾燥させた。３）３０℃のｐＨ９．５の炭酸緩衝液に２％の割合でポ
リミキシンＢを溶解した溶液に２）の操作をし、室温に
戻した多孔質ガラス膜を浸漬し、静かに震盪し、４℃で
２４時間反応させた。４）３）の操作をした多孔質ガラス膜を精製水に浸漬
し、静かに震盪、洗浄した。５）４）の操作をした多孔質ガラス膜を２０％エタノー
ル溶液に溶解した０．２ＭＮａＯＨ溶液に浸漬し、静か
に震盪、洗浄した。６）５）の操作をした多孔質ガラス膜をパイロジェンフ
リーの精製水に浸漬し、精製水を交換しながら、洗浄液
のｐＨが７．０になるまで、静かに震盪、洗浄した。７）６）の操作をした多孔質ガラス膜を乾燥後、無菌、
パイロジェンフリーのプラスチック袋に入れ、保存し
た。

【００１２】《実施例２．》 −ポリミキシンＢ固定化多孔質ガラス膜による緑膿菌の
除去− ＲＰＭＩ−１６４０を主成分とする１０％牛血清添加培
地に、ナマルバ細胞を１．２ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
の濃度で懸濁し、その２０ｍｌを、エチレンオキサイド
ガス滅菌した容量３０ｍｌのシャーレに分取した。次
に、当該シャーレに、緑膿菌を含有するＲＰＭＩ−１６
４０を主成分とする１０％牛血清添加培地（Ｐ．ａｅｒ
ｕｇｉｎｏｓａ５．０×１０^２／ｍｌ含有）２ｍｌを添
加した。新規に用意した容量３０ｍｌのシャーレに、実
施例１で調製したポリミキシンＢ固定化多孔質ガラス膜
を入れた。続いて、前記の緑膿菌およよナマルバ細胞を
含有するＲＰＭＩ−１６４０を主成分とする１０％牛血
清添加培地全量を添加し、炭酸ガス培養器で３７℃で６
時間培養した。当該シャーレを静かに震盪した後、その
上清を更に、新規に用意した、実施例１で調製したポリ
ミキシンＢ固定化多孔質ガラス膜を入れた容量３０ｍｌ
のシャーレに分取し、３７℃で６時間培養した。６時間
後に、その上清を容量５０ｍｌの細胞培養フラスコに分
取し、光学顕微鏡で鏡検した。その結果、当該細胞培養
液中には、緑膿菌は観察されなかった。また、ナマルパ
細胞は１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ生存していた。

【００１３】《実施例３．》 −ポリミキシンＢ固定化多孔質ガラス膜による各種微生
物の除去− 実施例２の緑膿菌に代えて、黄色ブドウ球菌、大腸菌、
バシラス菌、クレブシエラ属細菌、エンテロバクター属
細菌、サルモネラ菌、シトロバクター属細菌、変形菌、
エンテロバクター属細菌、ウイルス、マイコプラズマの
何れか１種類を用いて、同様の操作を行なった（添加し
た微生物の量は何れも１０^３ｃｅｌｌｓ）。その結果、
実施例２と同様に、最終細胞培養液中には、何れの菌も
観察されなかった。

【００１４】《実施例４．》 −ポリミキシンＢ固定化多孔質ガラス膜による緑膿菌由
来ＬＰＳの除去− ＲＰＭＩ−１６４０を主成分とする１０％牛血清添加培
地に、ナマルバ細胞を１．２ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
の濃度で懸濁し、その２０ｍｌを、エチレンオキサイド
ガス滅菌した容量３０ｍｌのシャーレに分取した。次
に、当該シャーレに、緑膿菌を含有するＲＰＭＩ−１６
４０を主成分とする１０％牛血清添加培地（Ｐａｅｒｕ
ｇｉｎｏｓａ５．０×１０^２／ｍｌ含有）２ｍｌを添加
した。新規に用意した容量３０ｍｌのシャーレに、実施
例１で調製したポリミキシンＢ固定化多孔質ガラス膜を
入れた。続いて、前記の緑膿菌およびナマルバ細胞を含
有するＲＰＭＩ−１６４０を主成分とする１０％牛血清
添加培地全量を添加し、炭酸ガス培養器で３７℃で６時
間培養した。当該シャーレを静かに震盪した後、その上
清を更に、新規に用意した、実施例１で調製したポリミ
キシンＢ固定化多孔質ガラス膜を入れた容量３０ｍｌの
シャールに分取し、３７℃で６時間培養した。６時間後
に、その上清を容量１５ｍｌのエチレンオキサイドガス
滅菌したポリスチレン製試験管に分取し、その１００μ
ｌを用いて、生化学工業製エンドトキシン定量試薬パイ
ロディックにより、緑膿菌由来エンドトキシン（ＬＰ
Ｓ）の定量を行なった。その結果、当該細胞培養液中に
は、緑膿菌由来エンドトキシン（ＬＰＳ）は検出されな
かった。また、ナマルバ細胞は１．０×１０^４ｃｅｌｌ
ｓ／ｍｌ生存していた。

【００１５】《実施例５．》 −メタクリル酸グリシジル−ジビニルベンゼン球状共重
合体にホスホニウム残基を導入した樹脂の合成− 野中らの方法（日本化学会誌、１０９７〜、１９９４
年）に従い、メタクリル酸グリシジル−１，４−ジビニ
ルベンゼン球状共重合体に塩化水素を反応させた後、ア
ルキルホスソィンを反応させることにより、（ａ）トリ
オクチルホスフィン（ＴＯＰ）を導入したホスホニウム
樹脂、（ｂ）アルキルジメチルホスフィン（炭素数１０
〜１６）を導入したホスホニウム樹脂、（ｃ）（３−ア
ミノプロピル）ホスフィン（ＴＡＰＰ）を導入したホス
ホニウム樹脂を合成した。即ち、以下の（１）〜（３）
の手順に従い含成した。（１）グリシジルメタクリラートー１，４−ジビニルベ
ンゼン球状共重合体の合成１ｗｔ／ｗｏｌ％ゼラチン水溶液５０ｍｌ、無水硫酸ナ
トリウム６ｇ、精製水４５０ｍｌを耐圧ガラスオートク
レーブに取り、静かに攪拌し、分散浴を調製した。当該
分散浴と、予め調製したグリシジルメタクリラートモノ
マーおよび、１，４−ジビニルベンゼンモノマーおよ
び、酢酸イソブチルの混合液を一時間窒素置換した。続
いて、当該溶液にモノマー溶液に溶解した過酸化ベンゾ
イル０．５ｇを添加した。引き続いて、当該溶液の温度
を上げずに、２８０ｒｐｍの回転速度で３０分攪拌し
た。続いて、一時間をかけ、当該溶液の温度を７８℃に
上げ、当該温度で一時間重合させた。更に、１．５時間
をかけ、当該溶液の温度を９０℃に上げ、９０℃で２時
間熟成を行ない、重合を完了させた。次に当該溶液を放
冷、吸引ろ過し、重合体を大量の精製水に浸漬し、ドラ
フト内で煮沸しゼラチンを溶解した。続いて、吸引ろ過
し、メタノールに浸漬し、希釈剤を除去、乾燥した。続
いて、３２〜６０メッシユ大きさの球状重合体を篩で分
けた。（２）２−クロロ−３−ヒドロキシプロピル基を有する
樹脂の合成耐圧試験管に減圧下で充分に乾燥したグリシジルメタク
リラート−１，４−ジビニルベンゼン球状共重合体１ｇ
と０．４ＭＨＣｌ−１，４−ジオキサン２０ｍｌとを取
り、一夜放置し充分に膨潤させた後密栓し、７０℃で３
時間油浴中で反応させ、精製水で充分に洗浄した。これ
を充分に乾燥させ、２−クロロ−３−ヒドロキシプロピ
ル基を有する樹脂を得た。（３）ホスホニウム残基を有する樹脂の合成耐圧試験管に減圧下で充分に乾燥した、２−クロロ−３
−ヒドロキシプロピル基を有する樹脂１ｇを入れ、Ｃｌ
基に対して４倍量のトリオクチルホスフィン（ＴＯＰ）
を窒素雰囲気下で添加、密栓し、１００℃の油浴中で４
０時間反応させた。続いて、メタノール、精製水で洗浄
し、１ＭＨＣｌに浸漬した後、メチルオレンジが変色
しなくなる迄精製水で充分に洗浄した。更に、ソックス
レー抽出器で１５時間抽出した。次に、風乾、減圧下で
充分に乾燥し、トリオクチルホスフィンを有する樹脂
（Ｃｌ型樹脂）を合成した。得られたＣｌ型樹脂を１Ｍ
ＮａＯＨに浸漬し、１ＭＮａＯＨ溶液を５回交換し
た後、洗浄液のｐＨが中性になる迄精製水で洗浄した。
続いて樹脂を風乾し、更に真空乾燥器中で充分に乾燥
し、トリオクチルホスフィンを有する樹脂（ＯＨ型樹
脂）を得た。また、同様の操作を行なうことにより、ア
ルキルジメチルホスフィンを有する樹脂（炭素数１０〜
１６）、（３−アミノプロピル）ホスフィン（ＴＡＰ
Ｐ）を導入したホスホニウム樹脂（Ｃｌ型樹脂およびＯ
Ｈ型樹脂）を合成した。

【００１６】《実施例６．》 −ホスホニウム樹脂による黄色ブドウ球菌の除去− ＲＩＴＣ５７−１培地に、Ｂａｌｌ−１細胞を１．２×
１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で懸濁し、その２０ｍｌ
を、エチレンオキサイドガス滅菌した容量３０ｍｌのシ
ャーレに分取した。次に、当該シャーレに、黄色ブドウ
球菌を含有するＲＩＴＣ５７−１培地（Ｓ．ａｕｒｅｕ
ｓ：ＩＦＯ１３２７６：５．０×１０^２／ｍｌ含有）
２ｍｌを添加した。新規に用意した容量１５０ｍｌの細
胞培養フラスコに、予めエチレンオキサイドガス滅菌し
た、実施例５で調製した（３−アミノプロピル）ホスフ
ィン（ＴＡＰＰ）を導入したホスホニウム型浮遊性樹脂
（ＯＨ型樹脂）２ｇを入れた。続いて、前記の黄色ブド
ウ球菌およびＢａｌｌ−１細胞を含有するＲＩＴＣ５７
−１培地全量を添加し、静かに震盪しながら、炭酸ガス
培養器で３７℃で６時間培養した。６時間後に、その上
清を容量１５０ｍｌの細胞培養フラスコに分取し、光学
顕微鏡で鏡検した。その結果、当該細胞培養液中には、
黄色ブドウ球菌は観察されなかった。また、Ｂａｌｌ−
１細胞は１．１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ生存してい
た。

【００１７】《実施例７．》 −ホスホニウム樹脂による各種微生物の除去− 実施例６の緑膿菌に代えて、黄色ブドウ球菌、大腸菌、
バシラス菌、クレブシエラ属細菌、エンテロバクター属
細菌、サルモネラ菌、シトロバクター属細菌、変形菌、
エンテロバクター属細菌、ウイルス、マイコプラズマの
何れか１種類を用いて、同様の操作を行なった（添加し
た微生物の量は何れも１０^３ｃｅｌｌｓ）。その結果、
実施例６と同様に、最終細胞培養液中には、何れの菌も
観察されなかった。

【００１８】《実施例８．》 −ホスホニウム樹脂による緑膿菌由来ＬＰＳの除去− ＲＩＴＣ５７−１培地に、Ｂａｌｌ−１細胞を１．２×
１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で懸濁し、その２０ｍｌ
を、エチレンオキサイドガス滅菌した容量３０ｍｌのシ
ャーレに分取した。次に、当該シャーレに、緑膿菌を含
有するＲＩＴＣ５７−１培地（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓ
ａ５．０×１０^２／ｍｌ含有）２ｍｌを添加した。新規
に用意した容量１５０ｍｌの細胞培養フラスコに、予め
エチレンオキサイドガス滅菌した、実施例５で調製した
（３−アミノプロピル）ホスフィン（ＴＡＰＰ）を導入
したホスホニウム浮遊性樹脂（ＯＨ型樹脂）２ｇを入れ
た。続いて、前記の緑膿菌およびＢａｌｌ−１細胞を含
有するＲＩＴＣ５７−１培地全量を添加し、静かに震盪
しながら、炭酸ガス培養器で３７℃で６時間培養した。
６時間後に，その上清を容量１５ｍｌのエチレンオキサ
イドガス滅菌したポリスチレン製試験管に分取し、その
１００μｌを用いて、生化学工業製エンドトキシン定量
試薬パイロディックにより、緑膿菌由来のエンドトキシ
ン（ＬＰＳ）の定量を行なった。その結果、当該細胞培
養液中には、緑膿菌由来のヱソドトキシン（ＬＰＳ）は
検出されなかった。また、Ｂａｌｌ−１細胞は１．０×
１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ生存していた。

【００１９】《実施例９．》 −ホスホニウム樹脂による大腸菌由来のＬＰＳの除去− 容量１５ｍｌのカラムに実施例５で調製した（３−アミ
ノプロピル）ホスフィン（ＴＡＰＰ）を導入したホスホ
ニウム樹脂（ＯＨ型樹脂）１０ｍｌを充填し、１％デオ
キシコール酸ナトリウム溶液１００ｍｌおよび注射用蒸
留水１００ｍｌで洗浄した。次に、当該カラムにＥ．ｃ
ｏｌｉ０１１１由来のＬＰＳ溶液（１０ＥＵ／ｍｌ）８
ｍｌをａｐｐｌｙし、コックを閉じて室温で２時間ｉｎ
ｃｕｂａｔｅした。続いて、当該カラムに注射用蒸留水
１０ｍｌをａｐｐｌｙし、流速１ｍｌ／ｍｉｎで流下さ
せ、流出画分を１ｍｌづつ１５ｍｌ迄分画した。各画分
について、生化学工業製エンドトキシン定量試薬パイロ
ディックにより、大腸菌由来のエンドトキシン（ＬＰ
Ｓ）の定量を行なった。その結果、当該細胞培養液中に
は、大腸菌由来のエンドトキシン（ＬＰＳ）は検出され
なかった。

【００２０】《実施例１０．》 −（３−アミノプロピル）ホスフィン共有結合ポリエチ
レンテレフタレートフィルムによる大腸菌由来のＬＰＳ
の定量− 厚さ１ｍｍのポリエチレンテレフタレート製フィルムの
表面に、エチルメチルケトンに溶解した（３−アミノプ
ロピル）ホスフィン（ＴＡＰＰ）を塗布し、５ｕｍの皮
膜を形成した。次に、当該フィルムを１ｃｍｘ１ｃｍの
大きさに切断した。続いて、当該フィルムをエチレンオ
キサイドガス滅菌し、容量５ｍｌのエチレンオキサイド
ガス滅菌したポリスチレン製試験管に分取した。当該ポ
リスチレン製試験管に、１％パイロジェンフリー・アル
ブミンおよびＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ０１１１由来）を
含する精製水３ｍｌを分取し、静かに震盪しながら、３
７℃で３０分ｉｎｃｕｂａｔｅした。３０分後に当該操
作をしたポリスチレン製試験管をパイロジェンフリー燐
酸緩衝液３ｍｌで３回洗浄した。新規に準備した、容量
５ｍｌのエチレンオキサイドガス滅菌したポリスチレン
製試験管に、生化学工業製エンドトキシン定量試薬（パ
イロディック試薬）を各１００μｌ分取した。前記操作
をしたポリエチレンテレフタレート製フィルムを、無菌
操作により当該試験管に入れ、３７℃で３０分ｉｎｃｕ
ｂａｔｅした。３０分後に当該ポリスチレン製試験管に
０．６Ｎ酢酸各１ｍｌを添加し、４０５ｎｍの吸光度を
測定した。標準ＬＰＳを用いて同様の操作を行ない、検
量線を描いた。描いた検量線から、検体中のＬＰＳ量を
求めた。

【００２１】《実施例１１．》 −アミカシン結合磁性粒子の調製− ドラフト内で、エチレンオキサイドガス滅菌した容量５
０ｍｌのポリスチレン製フラスコに、ＢｉｏＭａｇ（磁
性粒子：ＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
社製）１０ｍｌを分取した。続いて、当該フラスコにカ
ップリングバッファー３５ｍｌを添加、攪拌後、Ｍａｇ
ｎｅｔｉｃＳｅｐａｒａｔｏｒで磁性粒子を分離する
洗浄操作を５回繰り返した。当該操作をした磁性粒子の
入ったフラスコに、５％グルタルアルデヒド溶液２０ｍ
ｌを添加し、５分間激しく攪拌した。引き続いて、当該
フラスコを３時間静かに攪拌した。攪拌後Ｍａｇｎｅｔ
ｉｃＳｅｐａｒａｔｏｒで磁性粒子を分離した。続い
て、当該操作をした磁性粒子の入ったフラスコに、カッ
プリングバッファー３５ｍｌを添加攪拌後、Ｍａｇｎｅ
ｔｉｃＳｅｐａｒａｔｏｒで磁性粒子を分離する洗浄
操作を５回繰り返した。続いて、当該操作をした磁性粒
子の入ったフラスコに、カップリングバッファーに溶解
したアミカシン溶液（アミカシン濃度：５ｍｇ／ｍｌ）
１０ｍｌを添加し、５分間激しく攪拌した。続いて、当
該フラスコを室温で２４時間静かに攪拌した。攪拌後、
ＭａｇｎｅｔｉｃＳｅｐａｒａｔｏｒで磁性粒子を分
離した。当該操作をした磁性粒子の入ったフラスコに、
５％グリシン溶液３５ｍｌを添加し、５分間激しく攪拌
した。続いて、当該フラスコを１時間静かに攪拌した。
攪拌後、ＭａｇｎｅｔｉｃＳｅｐａｒａｔｏｒで磁性
粒子を分離した。続いて、当該操作をした磁性粒子の入
ったフラスコに、洗浄バッファー３５ｍｌを添加、攪拌
後、ＭａｇｎｅｔｉｃＳｅｐａｒａｔｏｒで磁性粒子
を分離する洗浄操作を５回繰り返し、アミカシン結合磁
性粒子を調製した。アミカシン結合磁性粒子は４℃で保
存した。

【００２２】《実施例１２．》 −アミカシン結合磁性粒子による緑膿菌の除去− ＲＩＴＣ５７−１培地に、ＥＢウイルス変異ヒトＢリン
パ球様細胞株を１．２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度
で懸濁し、その２０ｍｌを、エチレンオキサイドガス滅
菌した容量３０ｍｌのシャーレに分取した。次に、当該
シャーレに、緑膿菌含有ＲＩＴＣ５７−１培地（Ｐ．
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ５．０×１０^２／ｍｌ含有）２ｍ
ｌを添加した。新規に用意した容量１５０ｍｌの細胞培
養フラスコに、予め、１％デオキシコール酸ナトリウム
溶液およびパイロジェンフリー精製水で洗浄した、実施
例１１で調製したアミカシン結合磁性粒子５ｍｌを分取
した。続いて、前記の緑膿菌およびＥＢウイルス変異ヒ
トＢリンパ球様細胞株を含有するＲＩＴＣ５７−１培地
全量を添加し、静かに震盪しながら、炭酸ガス培養器で
３７℃で６時間培養した。６時間後にＭａｇｎｅｔｉｃ
Ｓｅｐａｒａｔｏｒで磁性粒子を分離した。分離した
溶液を容量１５０ｍｌの細胞培養フラスコに分取し、光
学顕微鏡で鏡検した。その結果、当該細胞培養液中に
は、緑膿菌は観察されなかった。また、ＥＢウイルス変
異ヒトＢリンパ球様細胞株は１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ
／ｍｌ生存していた。

【００２３】《実施例１３．》 −アミカシン結合磁性粒子による大腸菌由来ＬＰＳの除
去− ＲＰＭＩ−１６４０を主成分とする１０％牛血清添加培
地に、ナマルバ細胞を１．２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
の濃度で懸濁し、その２０ｍｌを、エチレンオキサイド
ガス滅菌した容量３０ｍｌのシャーレに分取した。次
に、当該シャーレに、大腸菌含有ＲＰＭＩ−１６４０を
主成分とする１０％牛血清添加培地（Ｅ．ｃｏｌｉ５．
０×１０^２／ｍｌ含有）２ｍｌを添加した。新規に用意
した容量１５０ｍｌの細胞培養フラスコに、予め、１％
デオキシコール酸ナトリウム溶液およびパイロジェンフ
リー精製水で洗浄した、実施例１１で調製したアミカシ
ン結合磁性粒子５ｍｌを分取した。続いて、前記の大腸
菌およびナマルバ細胞を含有するＲＰＭＩ−１６４０を
主成分とする１０％牛血清添加培地全量を添加し、静か
に震盪しながら、炭酸ガス培養器で３７℃で６時間培養
した。６時間後にＭａｇｎｅｔｉｃＳｅｐａｒａｔｏ
ｒで磁性粒子を分離した。分離した溶液を容量１５０ｍ
ｌの細胞培養フラスコに分取した。当該溶液１００μｌ
について、生化学工業製エンドトキシン定量試薬パイロ
ディックによりエンドトキシンの定量を行なった。その
結果、当該細胞培養液中には、大腸菌由来のエンドトキ
シンは検出されなかった。また、ナマルバ細胞は１．０
×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ生存していた。

【００２４】《実施例１４．》 −アミカシン結合磁性粒子による大腸菌由来ＬＰＳの定
量− 予め、１％デオキシコール酸ナトリウム溶液およびパイ
ロジェンフリー精製水で洗浄した、実施例１１で調製し
たアミカシン結合磁性粒子１ｍｌを容量５ｍｌのエチレ
ンオキサイドガス滅菌したポリスチレン製試験管に分取
した。当該ポリスチレン製試験管に、１％アルブミンお
よびＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ０１１１由来）を含有する精
製水３ｍｌを分取し、静かに震盪しながら、３７℃で３
０分ｉｎｃｕｂａｔｅした。３０分後にＭａｇｎｅｔｉ
ｃＳｅｐａｒａｔｏｒで磁性粒子を分離した。次に、
当該操作をしたアミカシン結合磁性粒子をパイロジェン
フリー水３ｍｌで３回洗浄した。次に、当該操作をした
アミカシン結合磁性粒子の入ったポリスチレン製試験管
に、生化学工業製エンドトキシン定量試薬（パイロディ
ック試薬）を各１００μｌ分取し、３７℃で３０分ｉｎ
ｃｕｂａｔｅした。３０分後に当該操作をしたポリスチ
レン製試験管に０．６Ｎ酢酸各１ｍｌを添加し、４０５
ｎｍの吸光度を測定した。標準ＬＰＳを用いて同様の操
作を行ない、検量線を描いた。描いた検量線から、検体
中のＬＰＳ量を求めた。

【００２５】《実施例１５．》 −メタクリル酸グリシジル−ジビニルベンゼン球状共重
合体に第四級アンモニウム塩を導入した樹脂の合成− 野中らの方法（日本化学会誌、１０９７〜、１９９４
年）に従い、メタクリル酸グリシジル−１，４−ジビニ
ルベンゼン球状共重合体に、四級アンモニウム塩（３−
（トリメトキシシリル）−プロピルオクタデシルジメチ
ルアンモニウムクロライドを反応させることにより第四
級アンモニウム塩を導入した樹脂を合成した。即ち、実
施例５に準じてＣｌ型樹脂およびＯＨ型樹脂を合成し
た。

【００２６】《実施例１６．》 −第四級アンモニウム塩結合メタクリル酸グリシジル−
ジビニルルベンゼン球状共重合体による大腸菌由来のＬ
ＰＳ、ＤＮＡおよびＲＡＮの除去− 容量１５ｍｌのカラムに実施例１３で調製した（３−
（トリメトキシシリル）−プロピルオクタデシルジメチ
ルアンモニウムクロライドを導入した樹脂（ＯＨ型樹
脂）１０ｍｌを充填し、１％デオキシコール酸ナトリウ
ム溶液１００ｍｌおよび注射用蒸留水１００ｍｌで洗浄
した。次に、当該カラムにＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１由
来の菌体抽出液（ＤＮＡ含量３０μｇ／ｍｌ，ＲＡＮ含
量５２０μｇ／ｍｌ，ＬＰＳ含量２０ＥＵ／ｍｌ）８ｍ
ｌをａｐｐｌｙし、室温で２時間ｉｎｃｕｂａｔｅし
た。続いて、当該カラムに注射用蒸留水１０ｍｌをａｐ
ｐｌｙし、流速１ｍｌ／ｍｉｎで流下させ、流出画分を
１ｍｌづつ１５ｍｌ迄分画した。各画分について、生化
学工業製エンドトキシン定量試薬パイロディックによ
り、大腸菌由来のエンドトキシン（ＬＰＳ）の定量を行
なった。その結果、当該細胞培養液中には、大腸菌由来
のエンドトキシンは検出されなかった。また、当該画分
について、ＤＮＡ量、ＲＡＮ量の定量を行なったが、何
れの画分にもＤＮＡおよびＲＡＮは検出されなかった。

【００２７】《実施例１７．》 −アミカシン結合磁性粒子の界面活性剤および抗菌剤に
よる再生− 実施例９で調製したアミカシン結合磁性粒子１ｍｌを容
量５０ｍｌのエチレンオキサイドガス滅菌したポリスチ
レン製フラスコに分取した。当該ポリスチレン製フラス
コに、１％アルブミンおよびＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ０１
１１由来：１００ＥＵ／ｍｌ）を含有する精製水３０ｍ
ｌを分取し、静かに震盪しながら、３７℃で２時間ｉｎ
ｃｕｂａｔｅした。２時間後にＭａｇｎｅｔｉｃＳｅ
ｐａｒａｔｏｒでアミカシン結合磁性粒子を分離した。
次に、当該磁性粒子を１％デオキシコール酸ナトリウム
溶液４０ｍｌで３回、パイロジェンフリー精製水４０ｍ
ｌで３回洗浄した。次に、当該磁性粒子を、容量５ｍｌ
のエチレンオキサイドガス滅菌したポリスチレン製試験
管に、無菌操作により分取した。次に、当該ポリスチレ
ン製試験管に、生化学工業製エンドトキシン定量試薬
（パイロディック試薬）を各１００μｌ分取し、３７℃
で３０分間ｉｎｃｕｂａｔｅした。３０分後に当該操作
をしたポリスチレン製試験管に０．６Ｎ酢酸各１ｍｌを
添加し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、当
該磁性粒子からは、Ｅ．ｃｏｌｉ０１１１由来ＬＰＳ
は検出されず、デオキシコール酸ナトリウム溶液による
洗浄効果が確認された。当該磁性粒子を５％ストレプト
マイシン溶液で洗浄した場合にも、同様に洗浄効果が確
認された。

【００２８】《実施例１８．》 −プラディマシン誘導体共有結合担体による大腸菌由来
のＬＰＳ、ＤＮＡおよびＲＡＮの除去− 容量１５ｍｌのカラムにプラディマシン誘導体（プラデ
ィマシンＥ）共有結合担体１０ｍｌを充填し、１％デオ
キシコール酸ナトリウム溶液１００ｍｌおよび注射用蒸
留水１００ｍｌで洗浄した。次に、当該カラムにＥ．ｃ
ｏｌｉＨＢ１０１由来の菌体抽出液（ＤＮＡ含量３０
μｇ／ｍｌ，ＲＡＮ含量５２０μｇ／ｍｌ、ＬＰＳ含量
２０ＥＵ／ｍｌ）８ｍｌをａｐｐｌｙし、カラムを停止
して室温で２時間ｉｎｃｕｂａｔｅした。続いて、当該
カラムに注射用蒸留水２０ｍｌをａｐｐｌｙし、流速１
ｍｌ／ｍｉｎで流下させ、流出画分を１ｍｌづつ１５ｍ
ｌ迄分画した。各画分について、生化学工業製エンドト
キシン定量試薬パイロディックにより、大腸菌由来のヱ
ンドトキシン（ＬＰＳ）の定量を行なった。その結果、
当該細胞培養液中には、大腸菌由来のエンドトキシンは
検出されなかった。また、当該画分について、ＤＮＡ
量、ＲＡＮ量の定量を行なったが、何れの画分にもＤＮ
ＡおよびＲＡＮは検出されなかった。

【００２９】《実施例１９．》 −第四級アンモニウム塩固定化不織布による大腸菌由来
のＬＰＳの除去− ポリエステル製不織布（東洋紡績製：６デニール）に親
水性基（メタクリル酸）をグラフト重合し、更に第四級
アンモニウム塩抗菌剤、（３−（トリメトキシシリル）
−プロピルオクタデシルジメチルアンモニウムクロライ
ド（ダウコーニング社製）を結合させることにより、第
四級アンモニウム塩を固定化した不織布を調製した。当
該不織布を、５ｃｍ×５ｃｍの大きさに切断し、エチレ
ンオキサイドガス滅菌した。ＲＰＭＩ−１６４０を主成
分とする１０％牛血清添加培地に、ナマルバ細胞を１．
２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で懸濁し、その２０
ｍｌを、エチレンオキサイドガス滅菌した容量３０ｍｌ
のシャーレに分取した。次に、当該シャーレに、大腸菌
含有ＲＰＭＩ−１６４０を主成分とする１０％牛血清添
加培地（Ｅ．ｃｏｌｉ５．０×１０^２／ｍｌ含有）２ｍ
ｌを添加した。新規に用意した容量１５０ｍｌの細胞培
養フラスコに、予め、エチレンオキサイドガス滅菌した
上記不織布を分取した。続いて、前記の大腸菌およびナ
マルバ細胞を含有するＲＰＭＩ−１６４０を主成分とす
る１０％牛血清添加培地全量を添加し、静かに震盪しな
がら、炭酸ガス培養器で３７℃ で６時間培養した。６
時間後に不織布を無菌的に除去した。不織布の分離によ
り得られた溶液を容量１５０ｍｌの細胞培養フラスコに
分取した。当該溶液１００μｌについて、生化学工業製
エンドトキシン定量試薬パイロディックによりエンドト
キシンの定量を行なった。その結果、当該細胞培養液中
には、大腸菌由来のエンドトキシンは検出されなかっ
た。また、ナマルバ細胞は１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／
ｍｌ生存していた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/567 Ｇ０１Ｎ 33/567 33/569 33/569 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｊ 11/00 11/00

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗菌剤を構成成分とすることを特徴とする
不溶性担体。
【請求項２】抗菌剤がペニシリン系抗生物質、セフェム
系抗生物質、モノバクタム系抗生物質、テトラサイクリ
ン系抗生物質、クロラムフェニコール系抗生物質、マク
ロライド系抗生物質、アミノダリコシド系抗生物質、ポ
リペプチド系抗生物質、ピリドンカルボン酸系合成抗菌
薬、抗真菌剤、抗ウイルス剤、サルファ剤、ピリジニウ
ム化合物、ホスホニウム化合物、第四級アンモニウム
塩、プラディマイシン群抗生物質の中から選択されたこ
とを特徴とする請求項１記載の不溶性担体。
【請求項３】不溶性担体が磁性粒子である請求項１記載
の不溶性担体。
【請求項４】請求項１記載の不溶性担体を用いて、微生
物に汚染された細胞懸濁液中の微生物および、微生物に
汚染された生理活性物質溶液中の微生物を吸着除去する
方法。
【請求項５】請求項１記載の不溶性担体を用いて、リポ
多糖に汚染された細胞懸濁液中のリポ多糖および、リポ
多糖に汚染された生理活性物質溶液中のリポ多糖を吸着
除去する方法。
【請求項６】請求項１記載の不溶性担体に、リポ多糖に
汚染された細胞懸濁液中のリポ多糖および、リポ多糖に
汚染された生理活性物質溶液中のリポ多糖を吸着させた
後、リポ多糖の検出定量方法によりリポ多糖を検出定量
する方法。
【請求項７】請求項３記載の不溶性担体を用いて、微生
物に汚染された細胞懸濁液中の微生物および、微生物に
汚染された生理活性物質溶液中の微生物を吸着除去する
方法。
【請求項８】請求項３記載の不溶性担体を用いて、リポ
多糖に汚染された細胞懸濁液中のリポ多糖および、リポ
多糖に汚染された生理活性物質溶液中のリポ多糖を吸着
除去する方法。
【請求項９】請求項３記載の不溶性担体に、微生物に汚
染された細胞懸濁液中の微生物および、微生物に汚染さ
れた生理活性物質溶液中の微生物を吸着させた後、微生
物の検出定量方法により、微生物を検出定量する方法。
【請求項１０】請求項３記載の不溶性担体に、リポ多糖
に汚染された細胞懸濁液中のリポ多糖および、リポ多糖
に汚染された生理活性物質溶液中のリポ多糖を吸着させ
た後、リポ多糖の検出定量方法によりリポ多糖を検出定
量する方法。
【請求項１１】請求項３記載の不溶性担体を用いて、核
酸に汚染された細胞懸濁液中の核酸および、核酸に汚染
された生理活性物質溶液中の核酸を吸着除去する方法。
【請求項１２】請求項３記載の不溶性担体に、核酸に汚
染された細胞懸濁液中の核酸および、核酸に汚染された
生理活性物質溶液中の核酸を吸着させた後、核酸の検出
定量方法により、核酸を検出定量する方法。
【請求項１３】界面活性剤含有溶液を用いて、請求項３
記載の不溶性担体を洗浄、再生する方法。
【請求項１４】抗菌剤を含有する溶液を用いて、請求項
３記載の不溶性担体を洗浄、再生する方法。
【請求項１５】請求項３記載の不溶性担体の吸着活性を
洗浄、再生する為の界面活性剤を含有する溶液。
【請求項１６】請求項３記載の不溶性担体の吸着活性を
洗浄、再生する為の抗菌剤を含有する溶液。