JPH0984596A - ガラクトピラノシルモラノリン類の製法 - Google Patents
ガラクトピラノシルモラノリン類の製法Info
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- JPH0984596A JPH0984596A JP27041495A JP27041495A JPH0984596A JP H0984596 A JPH0984596 A JP H0984596A JP 27041495 A JP27041495 A JP 27041495A JP 27041495 A JP27041495 A JP 27041495A JP H0984596 A JPH0984596 A JP H0984596A
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- galactopyranosyl
- moranolin
- galactosidase
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明の目的は、医薬品として有用なシアリル
ルイス型糖鎖抗原誘導体の合成中間体であるガラクトピ
ラノシルモラノリン誘導体を得るための優れた方法を提
供するものである。 【解決手段】本発明は、ガラクトシダーゼを用いてモラ
ノリンにガラクトースを転移させ、得られたアイソマー
の混合物をイオン交換樹脂によって分離精製することか
ら構成される。
ルイス型糖鎖抗原誘導体の合成中間体であるガラクトピ
ラノシルモラノリン誘導体を得るための優れた方法を提
供するものである。 【解決手段】本発明は、ガラクトシダーゼを用いてモラ
ノリンにガラクトースを転移させ、得られたアイソマー
の混合物をイオン交換樹脂によって分離精製することか
ら構成される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、医薬品として有用
なシアリルルイス型糖鎖抗原誘導体の合成中間体である
ガラクトピラノシルモラノリン誘導体を酵素的に合成
し、得られたアイソマーをイオン交換樹脂によって分離
精製する方法に関する。
なシアリルルイス型糖鎖抗原誘導体の合成中間体である
ガラクトピラノシルモラノリン誘導体を酵素的に合成
し、得られたアイソマーをイオン交換樹脂によって分離
精製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】シアリルルイス型糖鎖誘導体は、細胞接
着阻害作用を有する医薬品として有用な物質である。そ
こで該誘導体に関する研究が世界中において活発になさ
れている。しかしながら、該誘導体は複雑な構造を有し
ているので、その合成には多数の工程を必要とし（国際
公開番号WO93/15098) 、より効率的な生産方法の開発が
望まれていた。先に本出願人らは、細胞接着阻害作用を
有する医薬品として有用なガラクトピラノシルモラノリ
ン誘導体を見いだし、例えば、下記スキームで示される
改善されたシアリルルイス型糖鎖誘導体の製法について
国際出願 (国際出願番号 PCT/JP94/01080) を行った。
着阻害作用を有する医薬品として有用な物質である。そ
こで該誘導体に関する研究が世界中において活発になさ
れている。しかしながら、該誘導体は複雑な構造を有し
ているので、その合成には多数の工程を必要とし（国際
公開番号WO93/15098) 、より効率的な生産方法の開発が
望まれていた。先に本出願人らは、細胞接着阻害作用を
有する医薬品として有用なガラクトピラノシルモラノリ
ン誘導体を見いだし、例えば、下記スキームで示される
改善されたシアリルルイス型糖鎖誘導体の製法について
国際出願 (国際出願番号 PCT/JP94/01080) を行った。
【化２】 純合成の反応スキーム (スキーム中、Cbz はカルボベンジルオキシ、Bnはベン
ジル、Bzはベンゾイル、Phはフェニル、Acはアセチル、
Etはエチルを表す)
ジル、Bzはベンゾイル、Phはフェニル、Acはアセチル、
Etはエチルを表す)
【０００３】一方、β−ガラクトシダーゼの転移反応を
利用して、グルコースにガラクトースを結合させるガラ
クトピラノシルグルコースの製法の報告がなされている
（Kazuo Sakai, etc; J. CARBOHYDRATE CHEMISTRY, 11
(5), 553-565 (1992)) 。しかしながら、その製法に用
いられるのは中性糖であるグルコースなので電荷を有し
ていない。従って、イオン交換樹脂による分離精製に供
することができず、アイソマーの分画を行うことはでき
なかった。
利用して、グルコースにガラクトースを結合させるガラ
クトピラノシルグルコースの製法の報告がなされている
（Kazuo Sakai, etc; J. CARBOHYDRATE CHEMISTRY, 11
(5), 553-565 (1992)) 。しかしながら、その製法に用
いられるのは中性糖であるグルコースなので電荷を有し
ていない。従って、イオン交換樹脂による分離精製に供
することができず、アイソマーの分画を行うことはでき
なかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、シアリルル
イス型糖鎖誘導体を合成するうえで有用な中間体を容易
に製造する方法を提供することを目的とする。
イス型糖鎖誘導体を合成するうえで有用な中間体を容易
に製造する方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
に鑑み鋭意検討した結果、ガラクトシダーゼによる酵素
反応を利用してガラクトピラノシルモラノリンを合成
し、次に、その得られたガラクトピラノシルモラノリン
アイソマーをイオン交換樹脂で分画することにより、シ
アリルルイス型糖鎖誘導体を合成するうえにおいて有用
な出発物質であるガラクトピラノシルモラノリン誘導体
を容易に得る方法を見いだし、本発明を完成するに至っ
た。
に鑑み鋭意検討した結果、ガラクトシダーゼによる酵素
反応を利用してガラクトピラノシルモラノリンを合成
し、次に、その得られたガラクトピラノシルモラノリン
アイソマーをイオン交換樹脂で分画することにより、シ
アリルルイス型糖鎖誘導体を合成するうえにおいて有用
な出発物質であるガラクトピラノシルモラノリン誘導体
を容易に得る方法を見いだし、本発明を完成するに至っ
た。
【０００５】すなわち、本発明は、式〔Ｉ〕
【化３】 〔Ｉ〕（式中Ｒは、水素、炭素数１〜６の直鎖もしくは
分枝鎖状のアルキル、ハロゲンで置換されていてもよい
フェニル、又はフェニル低級アルキルを表す）で表され
るモラノリン誘導体に、ガラクトシダーゼを用いて、ガ
ラクトースを糖転移させてガラクトピラノシルモラノリ
ンを合成することにより、純合成で要する１０〜１２の
工程を、下記反応スキームに示すように、該酵素反応の
一工程だけでガラクトピラノシルモラノリンを合成させ
ることを可能とした。
分枝鎖状のアルキル、ハロゲンで置換されていてもよい
フェニル、又はフェニル低級アルキルを表す）で表され
るモラノリン誘導体に、ガラクトシダーゼを用いて、ガ
ラクトースを糖転移させてガラクトピラノシルモラノリ
ンを合成することにより、純合成で要する１０〜１２の
工程を、下記反応スキームに示すように、該酵素反応の
一工程だけでガラクトピラノシルモラノリンを合成させ
ることを可能とした。
【０００６】
【化４】 本発明においてガラクトース供与体とは、乳糖のように
ガラクトースを非還元末端にもったオリゴ糖や、１−Ｏ
−（ｏ−ニトロフェニル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ドのように、ガラクトースの一位に置換基がエーテル結
合したガラクトース誘導体のことであり、ガラクトシダ
ーゼによってモラノリンへガラクトースを転移させる
際、そのガラクトース供給源となることができるものを
いう。
ガラクトースを非還元末端にもったオリゴ糖や、１−Ｏ
−（ｏ−ニトロフェニル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ドのように、ガラクトースの一位に置換基がエーテル結
合したガラクトース誘導体のことであり、ガラクトシダ
ーゼによってモラノリンへガラクトースを転移させる
際、そのガラクトース供給源となることができるものを
いう。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明に用いうるガラクトシダー
ゼは植物由来、動物由来のどちらでもよく、とくに限定
はされない。本発明の方法によれば、反応温度は１５〜
５０℃が好ましく、とくに２０〜３０℃の好ましい温度
で３〜２０時間反応させることによりガラクトースの転
移反応を行うことができる。当該酵素で糖転移反応を行
うには、ｐＨ４〜９の適宜な範囲で行うことができる。
一方、本発明におけるガラクトシダーゼで生成されるガ
ラクトピラノシルモラノリンには、結合様式が異なるβ
−１，２、β−１，３、β−１，４、β−１，６の４種
類のアイソマーが混在しているので、それぞれのアイソ
マーに分画する必要がある。そこで本発明においてガラ
クトピラノシルモラノリンのアイソマーを陰イオン交換
樹脂に供したところ、意外にも、それぞれのアイソマー
を明瞭に分画できることを見いだした。
ゼは植物由来、動物由来のどちらでもよく、とくに限定
はされない。本発明の方法によれば、反応温度は１５〜
５０℃が好ましく、とくに２０〜３０℃の好ましい温度
で３〜２０時間反応させることによりガラクトースの転
移反応を行うことができる。当該酵素で糖転移反応を行
うには、ｐＨ４〜９の適宜な範囲で行うことができる。
一方、本発明におけるガラクトシダーゼで生成されるガ
ラクトピラノシルモラノリンには、結合様式が異なるβ
−１，２、β−１，３、β−１，４、β−１，６の４種
類のアイソマーが混在しているので、それぞれのアイソ
マーに分画する必要がある。そこで本発明においてガラ
クトピラノシルモラノリンのアイソマーを陰イオン交換
樹脂に供したところ、意外にも、それぞれのアイソマー
を明瞭に分画できることを見いだした。
【０００８】ガラクトピラノシルモラノリンは、その環
原子に窒素を含むので塩基性を示す。そこで、塩基性物
質であるガラクトピラノシルモラノリンを分画するには
陽イオン交換樹脂にトラップさせるのが定法である。に
もかかわらず、本発明において陰イオン交換樹脂を使用
し、水で展開したところ、ガラクトピラノシルモラノリ
ンアイソマーを都合よく分離できることを見いだした。
とくに、ルイスＸ型に使用するＯ−β−ガラクトピラノ
シル−（１→４）−モラノリンとルイスＡ型に使用する
Ｏ−β−ガラクトピラノシル−（１→３）−モラノリン
では、図３に示すように、溶出する位置が大きく異なる
ので、非常に容易に両者を分離することができる。
原子に窒素を含むので塩基性を示す。そこで、塩基性物
質であるガラクトピラノシルモラノリンを分画するには
陽イオン交換樹脂にトラップさせるのが定法である。に
もかかわらず、本発明において陰イオン交換樹脂を使用
し、水で展開したところ、ガラクトピラノシルモラノリ
ンアイソマーを都合よく分離できることを見いだした。
とくに、ルイスＸ型に使用するＯ−β−ガラクトピラノ
シル−（１→４）−モラノリンとルイスＡ型に使用する
Ｏ−β−ガラクトピラノシル−（１→３）−モラノリン
では、図３に示すように、溶出する位置が大きく異なる
ので、非常に容易に両者を分離することができる。
【０００９】Ｏ- β- ガラクトピラノシル−（１→４）
−モラノリンは前に溶出するＯ- β- ガラクトピラノシ
ル−（１→６）−モラノリンとその後に溶出するＯ- β
- ガラクトピラノシル−（１→２）−モラノリンと重な
る部分が少なく、Ｏ- β- ガラクトラノシル−（１→
４）−モラノリンを純粋に取り出すことができる。一
方、Ｏ- β- ガラクトピラノシル−（１→３）−モラノ
リンはＯ- β- ガラクトピラノシル−（１→４）−モラ
ノリンとかけ離れた後に溶出されるが、構造未同定の３
糖類と思われる物質と大部分が重なり合い、純度が50-6
0%のＯ- β- ガラクトピラノシル−（１→３）−モラノ
リンしか得られない場合が多い。しかし、シアリルルイ
スＡ型の化合物の出発原料としてＯ- β- ガラクトピラ
ノシル−（１→３）−モラノリンを用いる時、この純度
の原料を用いて、その最初の工程であるＯ- β- ガラク
トピラノシル−（１→３）−モラノリンをカルボベンゾ
キシクロライドで処理する工程でＯ- β- ガラクトピラ
ノシル−（１→３）−モラノリンのＮ−カルボベンジル
オキシ誘導体のみが結晶として析出し、他の不純物と分
別できるので、この方法で得られる純度のものでも実際
には支障はない。
−モラノリンは前に溶出するＯ- β- ガラクトピラノシ
ル−（１→６）−モラノリンとその後に溶出するＯ- β
- ガラクトピラノシル−（１→２）−モラノリンと重な
る部分が少なく、Ｏ- β- ガラクトラノシル−（１→
４）−モラノリンを純粋に取り出すことができる。一
方、Ｏ- β- ガラクトピラノシル−（１→３）−モラノ
リンはＯ- β- ガラクトピラノシル−（１→４）−モラ
ノリンとかけ離れた後に溶出されるが、構造未同定の３
糖類と思われる物質と大部分が重なり合い、純度が50-6
0%のＯ- β- ガラクトピラノシル−（１→３）−モラノ
リンしか得られない場合が多い。しかし、シアリルルイ
スＡ型の化合物の出発原料としてＯ- β- ガラクトピラ
ノシル−（１→３）−モラノリンを用いる時、この純度
の原料を用いて、その最初の工程であるＯ- β- ガラク
トピラノシル−（１→３）−モラノリンをカルボベンゾ
キシクロライドで処理する工程でＯ- β- ガラクトピラ
ノシル−（１→３）−モラノリンのＮ−カルボベンジル
オキシ誘導体のみが結晶として析出し、他の不純物と分
別できるので、この方法で得られる純度のものでも実際
には支障はない。
【００１０】このようにイオン交換樹脂を用いた精製
法、あるいは誘導体化による分別法を用いて目的物を得
ることができる。しかしながら、一般に精製工程では、
精製すべき目的物質以外の物質の存在比が少なく、目的
物質の存在比が大きな試料をチャージする方が、精製を
容易にすることは明らかである。そこで、本発明者ら
は、目的とするＯ−β−１，４−D −ガラクトシルモラ
ノリンとＯ−β−１，３−D −ガラクトシルモラノリン
をそれぞれ反応液中にその存在比が大きい状態をもたら
すことを目的として鋭意研究を重ねた結果、それぞれの
目的物を豊富に含有する試料の調製法をも完成するに至
った。すなわち、Ｏ−β−１，４−D −ガラクトシルモ
ラノリンを豊富に含有する試料を調製するためには、β
−ガラクトシダーゼ反応液そのもの、あるいは、それか
ら得た塩基性画分にＯ−β−１，３−D −ガラクトシル
モラノリンを優先的に加水分解するβ−ガラクトシダー
ゼを反応させることができる。例としてアスペルギルス
属の糸状菌由来のβ−ガラクトシダーゼをあげることが
できる。また、Ｏ−β−１，３−D −ガラクトシルモラ
ノリンを豊富に含有するβ−ガラクトシダーゼ反応液を
得るには、反応液のpHを調節することにより、β−ガラ
クトシダーゼの種類によっては、Ｏ−β−１，３−D −
ガラクトシルモラノリンを優先的に生成する現象を見い
だし、これを用いて目的を達成することができた。例と
してバチルス サーキュランス由来のβ−ガラクトシダ
ーゼは、塩酸、硫酸、あるいは酢酸でpHを4.7 から5.1
まで低下させると反応液中にＯ−β−１，３−D −ガラ
クトシルモラノリンが優先的に生成され、Ｏ−β−１，
４−D −ガラクトシルモラノリンや他の生成物が著しく
抑制される。このようにして、精製に有利なそれぞれの
目的物を豊富に含有する試料を得ることが可能になっ
た。
法、あるいは誘導体化による分別法を用いて目的物を得
ることができる。しかしながら、一般に精製工程では、
精製すべき目的物質以外の物質の存在比が少なく、目的
物質の存在比が大きな試料をチャージする方が、精製を
容易にすることは明らかである。そこで、本発明者ら
は、目的とするＯ−β−１，４−D −ガラクトシルモラ
ノリンとＯ−β−１，３−D −ガラクトシルモラノリン
をそれぞれ反応液中にその存在比が大きい状態をもたら
すことを目的として鋭意研究を重ねた結果、それぞれの
目的物を豊富に含有する試料の調製法をも完成するに至
った。すなわち、Ｏ−β−１，４−D −ガラクトシルモ
ラノリンを豊富に含有する試料を調製するためには、β
−ガラクトシダーゼ反応液そのもの、あるいは、それか
ら得た塩基性画分にＯ−β−１，３−D −ガラクトシル
モラノリンを優先的に加水分解するβ−ガラクトシダー
ゼを反応させることができる。例としてアスペルギルス
属の糸状菌由来のβ−ガラクトシダーゼをあげることが
できる。また、Ｏ−β−１，３−D −ガラクトシルモラ
ノリンを豊富に含有するβ−ガラクトシダーゼ反応液を
得るには、反応液のpHを調節することにより、β−ガラ
クトシダーゼの種類によっては、Ｏ−β−１，３−D −
ガラクトシルモラノリンを優先的に生成する現象を見い
だし、これを用いて目的を達成することができた。例と
してバチルス サーキュランス由来のβ−ガラクトシダ
ーゼは、塩酸、硫酸、あるいは酢酸でpHを4.7 から5.1
まで低下させると反応液中にＯ−β−１，３−D −ガラ
クトシルモラノリンが優先的に生成され、Ｏ−β−１，
４−D −ガラクトシルモラノリンや他の生成物が著しく
抑制される。このようにして、精製に有利なそれぞれの
目的物を豊富に含有する試料を得ることが可能になっ
た。
【００１１】
【実施例】以下に実施例を挙げ、さらに本発明を詳細に
説明する。 実施例１ β−ガラクトシダーゼによるＯ- β-D- ガラ
クトピラノシルモラノリンの酵素合成 10ml容蓋付ネジ口試験管に水1.5ml 、乳糖300mg 、モラ
ノリン30mgを加え、加温溶解させ、pHを調整することな
くβ−ガラクトシダーゼ（大和化成（株）製 ビオラク
タN5抽出液(127ユニット／ml))を100 μl 加えて、40℃で18
時間反応させた。この反応液を5ml のDOWEX 50WX2 に吸
着させ、十分に水洗した後、1N- アンモニア水で溶出す
る画分を濃縮乾固して白色粉末を得た。このもののHPLC
チャートを図１に示す。このときのβ−１，３、β−
１，４、β−１，２、β−１，６それぞれのアイソマー
の生成比は、HPLC面積比にして、29.9(%):44.0(%):9.9
(%):16.2(%)であった。HPLC条件：カラム, Shodex asa
hipak NH2P-50 4E, 5 μm, 4.6φx250mm、溶離液 ア
セトニトリル：水＝80:20 、流速1 ml/min、40℃、検出
器: 日立655-A30 RI検出器
説明する。 実施例１ β−ガラクトシダーゼによるＯ- β-D- ガラ
クトピラノシルモラノリンの酵素合成 10ml容蓋付ネジ口試験管に水1.5ml 、乳糖300mg 、モラ
ノリン30mgを加え、加温溶解させ、pHを調整することな
くβ−ガラクトシダーゼ（大和化成（株）製 ビオラク
タN5抽出液(127ユニット／ml))を100 μl 加えて、40℃で18
時間反応させた。この反応液を5ml のDOWEX 50WX2 に吸
着させ、十分に水洗した後、1N- アンモニア水で溶出す
る画分を濃縮乾固して白色粉末を得た。このもののHPLC
チャートを図１に示す。このときのβ−１，３、β−
１，４、β−１，２、β−１，６それぞれのアイソマー
の生成比は、HPLC面積比にして、29.9(%):44.0(%):9.9
(%):16.2(%)であった。HPLC条件：カラム, Shodex asa
hipak NH2P-50 4E, 5 μm, 4.6φx250mm、溶離液 ア
セトニトリル：水＝80:20 、流速1 ml/min、40℃、検出
器: 日立655-A30 RI検出器
【００１２】実施例２ β- ガラクトシダーゼによるＯ
- β-D- ガラクトピラノシルモラノリンの酵素合成（ス
ケールアップ） ジャーファーメンター（400L容）にイオン交換水250Lを
注入し、さらに乳糖50kg、モラノリン5kg を投入して加
温溶解させた。その後、漕内の温度を40℃に設定して、
ビオラクタN5の抽出液（127ユニット ／ml）250ml を添加し
て18時間撹拌を続けた(200r.p.m.）。この時、最終的な
液量は300Lであった。この反応液を100Lのダイアイオン
SK-104のカラムにかけてその後、十分水洗して、さらに
400Lの1N-アンモニア水で溶出して、固形分の多い画分2
00Lを濃縮し、8.28 kg のモラノリンと転移物の混合物
を得た。このもののHPLCチャートを図２に示す。HPLC条
件は実施例１と同じである。
- β-D- ガラクトピラノシルモラノリンの酵素合成（ス
ケールアップ） ジャーファーメンター（400L容）にイオン交換水250Lを
注入し、さらに乳糖50kg、モラノリン5kg を投入して加
温溶解させた。その後、漕内の温度を40℃に設定して、
ビオラクタN5の抽出液（127ユニット ／ml）250ml を添加し
て18時間撹拌を続けた(200r.p.m.）。この時、最終的な
液量は300Lであった。この反応液を100Lのダイアイオン
SK-104のカラムにかけてその後、十分水洗して、さらに
400Lの1N-アンモニア水で溶出して、固形分の多い画分2
00Lを濃縮し、8.28 kg のモラノリンと転移物の混合物
を得た。このもののHPLCチャートを図２に示す。HPLC条
件は実施例１と同じである。
【００１３】実施例３ β- ガラクトシダーゼによるＯ
- β-D- ガラクトピラノシル−Ｎ置換モラノリンの酵素
合成 実施例１と全く同様に、10ml容蓋付ネジ口試験管に水1.
5ml 、ラクトース300mg、N-置換モラノリン30mgを加
え、加温溶解させ、pHを調整することなくビオラクタN5
抽出液を100 μl 加えて、40℃で18時間反応させた。こ
の反応液を5ml のDOWEX WX2 に吸着させ、十分に水洗し
た後、1N- アンモニア水で溶出する画分を濃縮乾固して
白色粉末を得た。各N-置換型モラノリンの反応率は添加
したN-置換型モラノリンに対する消費されたN-置換型モ
ラノリン（HPLC定量）の割合で示した。HPLC条件は実施
例１と同じである。結果を表１に示す。
- β-D- ガラクトピラノシル−Ｎ置換モラノリンの酵素
合成 実施例１と全く同様に、10ml容蓋付ネジ口試験管に水1.
5ml 、ラクトース300mg、N-置換モラノリン30mgを加
え、加温溶解させ、pHを調整することなくビオラクタN5
抽出液を100 μl 加えて、40℃で18時間反応させた。こ
の反応液を5ml のDOWEX WX2 に吸着させ、十分に水洗し
た後、1N- アンモニア水で溶出する画分を濃縮乾固して
白色粉末を得た。各N-置換型モラノリンの反応率は添加
したN-置換型モラノリンに対する消費されたN-置換型モ
ラノリン（HPLC定量）の割合で示した。HPLC条件は実施
例１と同じである。結果を表１に示す。
【表１】
【００１４】実施例４ Ｏ- β-D- ガラクトピラノシル
モラノリン類の分画精製（小スケール） 実施例１に準じた方法で得たモラノリンとその転移物の
混合物の620 mgを1ml の純水に溶解させ、DOWEX 1x2 の
40 ml を48cmx φ1cm のカラムに充填したものにチャー
ジして、純水で展開した。分画は1.16g ／チューフ゛で行っ
た。全フラクションTLC を図３に示す。TLC 条件は展開
溶媒がn-プロパノール：アンモニア水：水＝6:1:3 で0.
5%硫酸液を噴霧して加熱発色した。β-1,4とβ-1,3型の
Ｏ- β-D-ガラクトピラノシルモラノリンはそれぞれシ
アリルルイスX 型とA 型の誘導体合成において重要な中
間原料であるが、図３で明かなように両者は極めて明瞭
に分画された。β-1,6とβ-1,2型のＯ- β-D- ガラクト
ピラノシルモラノリンは生成量は少なく、Ｏ- β-1,4-D
- ガラクトピラノシルモラノリンは実際には大部分が純
粋に回収できた。
モラノリン類の分画精製（小スケール） 実施例１に準じた方法で得たモラノリンとその転移物の
混合物の620 mgを1ml の純水に溶解させ、DOWEX 1x2 の
40 ml を48cmx φ1cm のカラムに充填したものにチャー
ジして、純水で展開した。分画は1.16g ／チューフ゛で行っ
た。全フラクションTLC を図３に示す。TLC 条件は展開
溶媒がn-プロパノール：アンモニア水：水＝6:1:3 で0.
5%硫酸液を噴霧して加熱発色した。β-1,4とβ-1,3型の
Ｏ- β-D-ガラクトピラノシルモラノリンはそれぞれシ
アリルルイスX 型とA 型の誘導体合成において重要な中
間原料であるが、図３で明かなように両者は極めて明瞭
に分画された。β-1,6とβ-1,2型のＯ- β-D- ガラクト
ピラノシルモラノリンは生成量は少なく、Ｏ- β-1,4-D
- ガラクトピラノシルモラノリンは実際には大部分が純
粋に回収できた。
【００１５】実施例５ Ｏ- β-D- ガラクトピラノシル
モラノリン類の分画精製（スケールアップ） 20L容のガラスカラムに10L のDOWEX 1X2 を充填し、実
施例２で得たモラノリンとその転移物の混合物の300gを
500ml の純水に溶解させたものをチャージして純水で展
開し、1Lずつ分画した。全フラクションのTLC を図４に
示す。TLC 条件は実施例４と同じである。純粋なＯ- β
-1,4-D- ガラクトピラノシルモラノリンを38.1g と３糖
類の混じったＯ- β-1,3-D- ガラクトピラノシルモラノ
リンを54.2g 得た。他の結合型Ｏ- β-D- ガラクトピラ
ノシルモラノリンが混合している画分は再クロマト分画
した。実施例５で得られた各結合型のＯ- β-D- ガラク
トピラノシルモラノリンの物性値を以下に示す。
モラノリン類の分画精製（スケールアップ） 20L容のガラスカラムに10L のDOWEX 1X2 を充填し、実
施例２で得たモラノリンとその転移物の混合物の300gを
500ml の純水に溶解させたものをチャージして純水で展
開し、1Lずつ分画した。全フラクションのTLC を図４に
示す。TLC 条件は実施例４と同じである。純粋なＯ- β
-1,4-D- ガラクトピラノシルモラノリンを38.1g と３糖
類の混じったＯ- β-1,3-D- ガラクトピラノシルモラノ
リンを54.2g 得た。他の結合型Ｏ- β-D- ガラクトピラ
ノシルモラノリンが混合している画分は再クロマト分画
した。実施例５で得られた各結合型のＯ- β-D- ガラク
トピラノシルモラノリンの物性値を以下に示す。
【００１６】１．Ｏ- β-D- ガラクトピラノシル-(１→
３)-モラノリン HPLC保持時間：13.5 min （条件は実施例１と同じ） 比旋光度：〔α〕 D 20＝36.68 ゜（Ｈ2 Ｏ、ｃ＝0.976
） 元素分析：C12H23NO9 として 計算値：Ｈ，7.12% ；Ｃ，44.30%；Ｎ，4.30% 測定値：Ｈ，7.08% ；Ｃ，44.10%；Ｎ，4.45% 融点：226-227 ℃
３)-モラノリン HPLC保持時間：13.5 min （条件は実施例１と同じ） 比旋光度：〔α〕 D 20＝36.68 ゜（Ｈ2 Ｏ、ｃ＝0.976
） 元素分析：C12H23NO9 として 計算値：Ｈ，7.12% ；Ｃ，44.30%；Ｎ，4.30% 測定値：Ｈ，7.08% ；Ｃ，44.10%；Ｎ，4.45% 融点：226-227 ℃
【００１７】２．Ｏ- β-D- ガラクトピラノシル-(１→
４)-モラノリン HPLC保持時間：14.9 min （条件は実施例１と同じ） 比旋光度：〔α〕 D 20＝42.44 ゜（Ｈ2 Ｏ、ｃ＝1.112
） 元素分析：C12H23NO9 として 計算値： Ｈ，7.12% ；Ｃ，44.30%；Ｎ，4.30% 測定値： Ｈ，6.98% ；Ｃ，44.07%；Ｎ，4.33% 融点：247-248 ℃
４)-モラノリン HPLC保持時間：14.9 min （条件は実施例１と同じ） 比旋光度：〔α〕 D 20＝42.44 ゜（Ｈ2 Ｏ、ｃ＝1.112
） 元素分析：C12H23NO9 として 計算値： Ｈ，7.12% ；Ｃ，44.30%；Ｎ，4.30% 測定値： Ｈ，6.98% ；Ｃ，44.07%；Ｎ，4.33% 融点：247-248 ℃
【００１８】３．Ｏ- β-D- ガラクトピラノシル-(１→
２)-モラノリン HPLC保持時間：16.7 min （条件は実施例１と同じ） 比旋光度：〔α〕 D 20＝21.17 ゜（Ｈ2 Ｏ、ｃ＝1.124
） 元素分析：C12H23NO9 ・H2O として 計算値： Ｈ，6.99% ；Ｃ，41.94%；Ｎ，４．０７％ 測定値： Ｈ，7.13% ；Ｃ，41.70%；Ｎ，4.03% 融点：176-179 ℃
２)-モラノリン HPLC保持時間：16.7 min （条件は実施例１と同じ） 比旋光度：〔α〕 D 20＝21.17 ゜（Ｈ2 Ｏ、ｃ＝1.124
） 元素分析：C12H23NO9 ・H2O として 計算値： Ｈ，6.99% ；Ｃ，41.94%；Ｎ，４．０７％ 測定値： Ｈ，7.13% ；Ｃ，41.70%；Ｎ，4.03% 融点：176-179 ℃
【００１９】４．Ｏ- β-D- ガラクトピラノシル-(１→
６)-モラノリン HPLC保持時間：18.2 min （条件は実施例１と同じ） 比旋光度：〔α〕 D 20＝12.99 ゜（Ｈ2 Ｏ、ｃ＝0.993
） 元素分析：C12H23NO9 として 計算値： Ｈ，7.12% ；Ｃ，44.30%；Ｎ，4.30% 測定値： Ｈ，6.97% ；Ｃ，44.09%；Ｎ，4.37% 融点：215-217 ℃
６)-モラノリン HPLC保持時間：18.2 min （条件は実施例１と同じ） 比旋光度：〔α〕 D 20＝12.99 ゜（Ｈ2 Ｏ、ｃ＝0.993
） 元素分析：C12H23NO9 として 計算値： Ｈ，7.12% ；Ｃ，44.30%；Ｎ，4.30% 測定値： Ｈ，6.97% ；Ｃ，44.09%；Ｎ，4.37% 融点：215-217 ℃
【００２０】実施例６ Ｏ- β-D- ガラクトピラノシル−（１→３）−モラノリ
ンのＣｂｚ化による精製 純度57% のＯ- β-D- ガラクトピラノシル−（１→３）
−モラノリン、100gを水１Ｌに溶解させ、NaHCO3 38.7
g とクロロホルム１Ｌを加えて、氷冷下でカルボベンゾ
キシクロライド132ml を撹拌しながら添加して、その後
室温で一夜放置して、水層を２度クロロホルムで洗い、
pHを4 に調整して、水層をエバポレーターで濃縮した。
得られたシロップにメタノール 500ml を加え、懸濁液
として、不溶の物質を濾過し、8 ℃で一夜放置して得ら
れた析出結晶を濾別してほぼ純粋のＯ- β-D- ガラクト
ピラノシル−（１→３）−モラノリンのＮ−カルボベン
ジルオキシ誘導体57.7g を得た。
ンのＣｂｚ化による精製 純度57% のＯ- β-D- ガラクトピラノシル−（１→３）
−モラノリン、100gを水１Ｌに溶解させ、NaHCO3 38.7
g とクロロホルム１Ｌを加えて、氷冷下でカルボベンゾ
キシクロライド132ml を撹拌しながら添加して、その後
室温で一夜放置して、水層を２度クロロホルムで洗い、
pHを4 に調整して、水層をエバポレーターで濃縮した。
得られたシロップにメタノール 500ml を加え、懸濁液
として、不溶の物質を濾過し、8 ℃で一夜放置して得ら
れた析出結晶を濾別してほぼ純粋のＯ- β-D- ガラクト
ピラノシル−（１→３）−モラノリンのＮ−カルボベン
ジルオキシ誘導体57.7g を得た。
【００２１】実施例７ β−ガラクトシダーゼ反応液の
塩基性画分をアルペルギルス属由来の酵素で処理してＯ
−β−１，４，−D −ガラクトシルモラノリンの存在比
を大きくすることによる精製 実施例１と同様にて得られた塩基性画分30mgを 950μl
の0.1M酢酸緩衝液(pH5.0)に溶解させ、されに50μl の
アスペルギルス オリゼ由来のβ−ガラクトシダーゼ液
（粉末、9000ユニット/gの等量水抽出液) を加え、４０℃で
２時間反応させた。反応産物のＨＰＬＣ図を図５に示
す。ＨＰＬＣの条件は実施例１と同じである。Ｏ−β−
１，３，−D −ガラクトシルモラノリンとＯ−β−１，
２，−D −ガラクトシルモラノリンが速やかに加水分解
され、それらが消失した結果、Ｏ−β−１，４，−D −
ガラクトシルモラノリンの存在比が高まったことがわか
る。チャージした試料中、４種類の２糖類全体に対する
Ｏ−β−１，４，−D −ガラクトシルモラノリンの存在
比は49.3% であったが、この操作により、反応後は81.9
% にまで大きくなった。
塩基性画分をアルペルギルス属由来の酵素で処理してＯ
−β−１，４，−D −ガラクトシルモラノリンの存在比
を大きくすることによる精製 実施例１と同様にて得られた塩基性画分30mgを 950μl
の0.1M酢酸緩衝液(pH5.0)に溶解させ、されに50μl の
アスペルギルス オリゼ由来のβ−ガラクトシダーゼ液
（粉末、9000ユニット/gの等量水抽出液) を加え、４０℃で
２時間反応させた。反応産物のＨＰＬＣ図を図５に示
す。ＨＰＬＣの条件は実施例１と同じである。Ｏ−β−
１，３，−D −ガラクトシルモラノリンとＯ−β−１，
２，−D −ガラクトシルモラノリンが速やかに加水分解
され、それらが消失した結果、Ｏ−β−１，４，−D −
ガラクトシルモラノリンの存在比が高まったことがわか
る。チャージした試料中、４種類の２糖類全体に対する
Ｏ−β−１，４，−D −ガラクトシルモラノリンの存在
比は49.3% であったが、この操作により、反応後は81.9
% にまで大きくなった。
【００２２】実施例８ β−ガラクトシダーゼ反応時の
pHを低下させて、反応液中のＯ−β−１，３，−D −ガ
ラクトシルモラノリンの存在比を大きくすることによる
精製。 実施例１と同様にしてバチルス サーキュランス由来の
酵素を用いて転移反応を行う時、反応液にあらかじめ 1
N-HCL 200 μl を加え、pHを4.9 から5.0 に調整して40
℃で18時間反応させた。ＨＰＬＣ図を図６に示す。ＨＰ
ＬＣ条件は実施例１と同じである。図からもわかるよう
に、反応液はＯ−β−１，３，−D −ガラクトシルモラ
ノリンが優先的に生成されている。４種類の２糖類全体
に対するＯ−β−１，３，−D −ガラクトシルモラノリ
ンの存在比は、pH無調整のとき30.5% であったが、pHを
調整することにより78.5% と大きくすることができた。
pHを低下させて、反応液中のＯ−β−１，３，−D −ガ
ラクトシルモラノリンの存在比を大きくすることによる
精製。 実施例１と同様にしてバチルス サーキュランス由来の
酵素を用いて転移反応を行う時、反応液にあらかじめ 1
N-HCL 200 μl を加え、pHを4.9 から5.0 に調整して40
℃で18時間反応させた。ＨＰＬＣ図を図６に示す。ＨＰ
ＬＣ条件は実施例１と同じである。図からもわかるよう
に、反応液はＯ−β−１，３，−D −ガラクトシルモラ
ノリンが優先的に生成されている。４種類の２糖類全体
に対するＯ−β−１，３，−D −ガラクトシルモラノリ
ンの存在比は、pH無調整のとき30.5% であったが、pHを
調整することにより78.5% と大きくすることができた。
【図１】図１は、実施例１で得られたガラクトピラノシ
ルモラノリンのHPLCチャートである。縦軸は保持時間
（分）を表す。
ルモラノリンのHPLCチャートである。縦軸は保持時間
（分）を表す。
【図２】図２は、実施例２で得られたガラクトピラノシ
ルモラノリンのHPLCチャートである。縦軸は保持時間
（分）を表す。
ルモラノリンのHPLCチャートである。縦軸は保持時間
（分）を表す。
【図３】図３は、実施例４で得られたガラクトピラノシ
ルモラノリンのTLC チャートである。横軸はフラクショ
ンナンバーを表し、縦軸はTLC のRf値を表す。
ルモラノリンのTLC チャートである。横軸はフラクショ
ンナンバーを表し、縦軸はTLC のRf値を表す。
【図４】図４は、実施例５で得られたガラクトピラノシ
ルモラノリンのTLC チャートである。横軸は溶出量を表
し、縦軸はTLC のRf値を表す。
ルモラノリンのTLC チャートである。横軸は溶出量を表
し、縦軸はTLC のRf値を表す。
【図５】図５は、実施例７で得られたガラクトピラノシ
ルモラノリンのHPLCチャートである。縦軸は保持時間
（分）を表す。
ルモラノリンのHPLCチャートである。縦軸は保持時間
（分）を表す。
【図６】図６は、実施例８で得られたガラクトピラノシ
ルモラノリンのHPLCチャートである。縦軸は保持時間
（分）を表す。
ルモラノリンのHPLCチャートである。縦軸は保持時間
（分）を表す。
Claims (4)
- 【請求項１】式〔Ｉ〕 【化１】 〔Ｉ〕（Ｒは、水素、炭素数１〜６の直鎖もしくは分枝
鎖状の低級アルキル、ハロゲンで置換されていてもよい
フェニル、又はフェニル低級アルキルを表す）で表され
るモラノリン誘導体とガラクトース供与体の混合物にβ
−ガラクトシダーゼを作用させ、得られるβ−１，２、
β−１，３、β−１，４、及びβ−１，６結合を有する
ガラクトピラノシルモラノリンが混在する混合物を、イ
オン交換樹脂により前述の各結合様式をもったガラクト
ピラノシルモラノリンアイソマーにそれぞれ分離精製す
ることを特徴とする、ガラクトピラノシルモラノリン誘
導体の製法。 - 【請求項２】β−ガラクトシダーゼを作用させた後イオ
ン交換樹脂にチャージする前に、目的とする結合様式を
有するガラクトピラノシルモラノリン以外のガラクトピ
ラノシルモラノリンを優先的に加水分解するβ−ガラク
トシダーゼを作用させ、目的とする結合様式を有するガ
ラクトピラノシルモラノリンの存在比を高めた後、その
混合物をイオン交換樹脂にチャージする請求項１記載の
製法。 - 【請求項３】請求項１においてβガラクトシダーゼを作
用させる際、ｐＨを調整することにより目的とする結合
様式を有するガラクトピラノシルモラノリンの存在比を
高めた混合物を調製し、その混合物をイオン交換樹脂に
チャージする請求項１記載の製法。 - 【請求項４】ガラクトース供与体が乳糖である請求項１
記載の製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27041495A JPH0984596A (ja) | 1995-03-24 | 1995-10-19 | ガラクトピラノシルモラノリン類の製法 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6546295 | 1995-03-24 | ||
| JP7-178673 | 1995-07-14 | ||
| JP17867395 | 1995-07-14 | ||
| JP7-65462 | 1995-07-14 | ||
| JP27041495A JPH0984596A (ja) | 1995-03-24 | 1995-10-19 | ガラクトピラノシルモラノリン類の製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0984596A true JPH0984596A (ja) | 1997-03-31 |
Family
ID=27298802
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27041495A Pending JPH0984596A (ja) | 1995-03-24 | 1995-10-19 | ガラクトピラノシルモラノリン類の製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0984596A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007015567A1 (ja) * | 2005-08-01 | 2007-02-08 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | 環状アミン化合物 |
-
1995
- 1995-10-19 JP JP27041495A patent/JPH0984596A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007015567A1 (ja) * | 2005-08-01 | 2007-02-08 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | 環状アミン化合物 |
| JPWO2007015567A1 (ja) * | 2005-08-01 | 2009-02-19 | 武田薬品工業株式会社 | 環状アミン化合物 |
| US8592452B2 (en) | 2005-08-01 | 2013-11-26 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Cyclic amine compound |
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