JPH0989892A - 付着性抗原の測定方法 - Google Patents
付着性抗原の測定方法Info
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- JPH0989892A JPH0989892A JP26635895A JP26635895A JPH0989892A JP H0989892 A JPH0989892 A JP H0989892A JP 26635895 A JP26635895 A JP 26635895A JP 26635895 A JP26635895 A JP 26635895A JP H0989892 A JPH0989892 A JP H0989892A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 液中に存在するタンパク質のような担体物質
に付着した抗原を測定することができる方法を提供する
こと。 【解決手段】 液中に存在する担体物質に付着した測定
すべき抗原を測定する方法であって、前記担体物質に対
する抗体又はその抗原結合性断片と、前記測定すべき抗
原に対する抗体又はその抗原結合性断片とを用いた免疫
測定により前記測定すべき抗原を測定する、付着性抗原
の測定方法を提供した。
に付着した抗原を測定することができる方法を提供する
こと。 【解決手段】 液中に存在する担体物質に付着した測定
すべき抗原を測定する方法であって、前記担体物質に対
する抗体又はその抗原結合性断片と、前記測定すべき抗
原に対する抗体又はその抗原結合性断片とを用いた免疫
測定により前記測定すべき抗原を測定する、付着性抗原
の測定方法を提供した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、担体物質に付着し
た抗原を測定する方法に関する。
た抗原を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ハンガナッツゥ−ダイヘル（Hanganutzi
u-Deicher)抗原（以下、「ＨＤ抗原」と言うことがあ
る）は、動物の組織や血液中に存在するが、ヒト及びニ
ワトリの正常組織や正常血液中には存在しない。しかし
ながら、癌患者の組織や血液中に見出される。従って、
ＨＤ抗原に対する抗体（以下、「抗ＨＤ抗体」というこ
とがある）を用いて血清中のＨＤ抗原を測定することに
より癌の診断を行うことが提案されている（特開平７−
５３５９９号公報）。従来、尿中にＨＤ抗原が存在する
ことは知られていなかった。
u-Deicher)抗原（以下、「ＨＤ抗原」と言うことがあ
る）は、動物の組織や血液中に存在するが、ヒト及びニ
ワトリの正常組織や正常血液中には存在しない。しかし
ながら、癌患者の組織や血液中に見出される。従って、
ＨＤ抗原に対する抗体（以下、「抗ＨＤ抗体」というこ
とがある）を用いて血清中のＨＤ抗原を測定することに
より癌の診断を行うことが提案されている（特開平７−
５３５９９号公報）。従来、尿中にＨＤ抗原が存在する
ことは知られていなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本願発明者らは、鋭意
研究の結果、尿中にＨＤ抗原は存在するが、これが尿中
のアルブミンに付着して存在することを見出した。この
ように、ＨＤ抗原は尿中ではアルブミンに付着した状態
で存在するので、抗ＨＤ抗体を用いた通常のサンドイッ
チ法を行った場合、下部抗体がＨＤと結合すると、上部
抗体はアルブミンによる立体障害の故にＨＤ抗原と結合
することができない。従って、タンパク質のような担体
物質に付着した抗原を従来のサンドイッチ法により測定
することはできない。また、抗原に２個の抗体が結合す
ることができないので、ラテックス凝集法や免疫比濁法
による免疫測定も行うことができない。
研究の結果、尿中にＨＤ抗原は存在するが、これが尿中
のアルブミンに付着して存在することを見出した。この
ように、ＨＤ抗原は尿中ではアルブミンに付着した状態
で存在するので、抗ＨＤ抗体を用いた通常のサンドイッ
チ法を行った場合、下部抗体がＨＤと結合すると、上部
抗体はアルブミンによる立体障害の故にＨＤ抗原と結合
することができない。従って、タンパク質のような担体
物質に付着した抗原を従来のサンドイッチ法により測定
することはできない。また、抗原に２個の抗体が結合す
ることができないので、ラテックス凝集法や免疫比濁法
による免疫測定も行うことができない。
【０００４】従って、本発明の目的は、液中に存在する
タンパク質のような担体物質に付着した抗原を測定する
ことができる方法を提供することである。なお、測定す
べき抗原がタンパク質のような担体物質に付着して存在
する場合があるということは本願発明者らが見出した新
知見であるので、上記本発明の目的自身も新規性がある
ものである。
タンパク質のような担体物質に付着した抗原を測定する
ことができる方法を提供することである。なお、測定す
べき抗原がタンパク質のような担体物質に付着して存在
する場合があるということは本願発明者らが見出した新
知見であるので、上記本発明の目的自身も新規性がある
ものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、担体物質に対する抗体と、前記測定すべき抗
原に対する抗体とを用いた免疫測定により担体物質に付
着した抗原を測定できることを見出し本発明を完成し
た。
究の結果、担体物質に対する抗体と、前記測定すべき抗
原に対する抗体とを用いた免疫測定により担体物質に付
着した抗原を測定できることを見出し本発明を完成し
た。
【０００６】すなわち、本発明は、液中に存在する担体
物質に付着した測定すべき抗原を測定する方法であっ
て、前記担体物質に対する抗体又はその抗原結合性断片
と、前記測定すべき抗原に対する抗体又はその抗原結合
性断片とを用いた免疫測定により前記測定すべき抗原を
測定する、付着性抗原の測定方法を提供する。
物質に付着した測定すべき抗原を測定する方法であっ
て、前記担体物質に対する抗体又はその抗原結合性断片
と、前記測定すべき抗原に対する抗体又はその抗原結合
性断片とを用いた免疫測定により前記測定すべき抗原を
測定する、付着性抗原の測定方法を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】上述のように、本発明の方法で
は、液中に存在する担体物質に付着した抗原を測定す
る。ここで、「液」とは、液体であれば特に限定される
ものではなく、血液や尿のような体液、飲料、食品、医
薬品、化粧品、その他各種用途の液体等を挙げることが
でき、また、液体以外のものを溶媒に溶解、分散又は懸
濁したものであってもよい。
は、液中に存在する担体物質に付着した抗原を測定す
る。ここで、「液」とは、液体であれば特に限定される
ものではなく、血液や尿のような体液、飲料、食品、医
薬品、化粧品、その他各種用途の液体等を挙げることが
でき、また、液体以外のものを溶媒に溶解、分散又は懸
濁したものであってもよい。
【０００８】本発明において、「担体物質」とは、測定
すべき抗原が付着する物質であり、抗原性を有するもの
であればいずれの物質でもよい。例として、タンパク
質、糖、糖タンパク質、糖脂質等を挙げることができ
る。例えば、尿中のＨＤ抗原はアルブミンに付着して存
在するが、この場合にはアルブミンが担体物質である。
すべき抗原が付着する物質であり、抗原性を有するもの
であればいずれの物質でもよい。例として、タンパク
質、糖、糖タンパク質、糖脂質等を挙げることができ
る。例えば、尿中のＨＤ抗原はアルブミンに付着して存
在するが、この場合にはアルブミンが担体物質である。
【０００９】また、本発明の方法により測定される抗原
も、上記担体物質に付着するものであればいずれの抗原
であってもよく、糖脂質、タンパク質、糖タンパク質、
糖等のいずれでもよい。下記実施例では、糖脂質である
ガングリオシドの一種であるＨＤ抗原を測定している
が、これに限定されるものではない。
も、上記担体物質に付着するものであればいずれの抗原
であってもよく、糖脂質、タンパク質、糖タンパク質、
糖等のいずれでもよい。下記実施例では、糖脂質である
ガングリオシドの一種であるＨＤ抗原を測定している
が、これに限定されるものではない。
【００１０】本発明の方法では、前記担体物質に対する
抗体又はその抗原結合性断片（以下、これらを便宜的に
「抗担体抗体」ということがある）と、前記測定すべき
抗原に対する抗体又はその抗原結合性断片（以下、これ
らを便宜的に「抗測定抗原抗体」ということがある）と
を用いる。ここで、「抗原結合性断片」とは、抗原との
結合性を有する抗体の断片であり、Ｆａｂフラグメント
やＦ（ａｂ’）2 フラグメント等を挙げることができ
る。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクロー
ナル抗体であってもよい。また、抗体の起源も何ら限定
されるものではなく、ヒト抗体、マウス抗体のような各
種哺乳動物抗体及びニワトリ抗体のような鳥類の抗体で
あってもよく、また、これらの混合物であってもよい。
抗体又はその抗原結合性断片（以下、これらを便宜的に
「抗担体抗体」ということがある）と、前記測定すべき
抗原に対する抗体又はその抗原結合性断片（以下、これ
らを便宜的に「抗測定抗原抗体」ということがある）と
を用いる。ここで、「抗原結合性断片」とは、抗原との
結合性を有する抗体の断片であり、Ｆａｂフラグメント
やＦ（ａｂ’）2 フラグメント等を挙げることができ
る。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクロー
ナル抗体であってもよい。また、抗体の起源も何ら限定
されるものではなく、ヒト抗体、マウス抗体のような各
種哺乳動物抗体及びニワトリ抗体のような鳥類の抗体で
あってもよく、また、これらの混合物であってもよい。
【００１１】また、本明細書において、「測定」とは、
定性的な検出及び定量の両者を包含する。
定性的な検出及び定量の両者を包含する。
【００１２】本発明の方法における免疫測定は、例えば
サンドイッチ法により行うことができる。サンドイッチ
法では、上記抗担体抗体及び抗測定抗原抗体のいずれか
を下部抗体として用い、他方を上部抗体として用いる。
どちらを下部抗体として用いてもよい。サンドイッチ法
では、先ず、例えばマイクロタイタープレートのウェル
のような担体に下部抗体を不動化する。洗浄後、非特異
的吸着を防止するために、例えばカゼイン、ウシ血清ア
ルブミン又はスキムミルクのようなタンパク質でブロッ
キングを行う。洗浄後、検体を加え、抗原抗体反応を行
わせる。洗浄後、上部抗体を加え、抗原抗体反応を行わ
せる。上部抗体を標識しておき、洗浄後、該標識を測定
する。あるいは、上部抗体に対する標識抗体をさらに反
応させて該標識を測定する。標識は、酵素標識（ＥＬＩ
ＳＡ）、放射標識（ＲＩＡ）、蛍光標識（ＦＩＡ）、化
学発光標識、ビオチン標識等のいずれであってもよい。
なお、サンドイッチ法自体は免疫測定の分野において周
知の方法であり、下記実施例にもその１例が詳細に記載
されている。
サンドイッチ法により行うことができる。サンドイッチ
法では、上記抗担体抗体及び抗測定抗原抗体のいずれか
を下部抗体として用い、他方を上部抗体として用いる。
どちらを下部抗体として用いてもよい。サンドイッチ法
では、先ず、例えばマイクロタイタープレートのウェル
のような担体に下部抗体を不動化する。洗浄後、非特異
的吸着を防止するために、例えばカゼイン、ウシ血清ア
ルブミン又はスキムミルクのようなタンパク質でブロッ
キングを行う。洗浄後、検体を加え、抗原抗体反応を行
わせる。洗浄後、上部抗体を加え、抗原抗体反応を行わ
せる。上部抗体を標識しておき、洗浄後、該標識を測定
する。あるいは、上部抗体に対する標識抗体をさらに反
応させて該標識を測定する。標識は、酵素標識（ＥＬＩ
ＳＡ）、放射標識（ＲＩＡ）、蛍光標識（ＦＩＡ）、化
学発光標識、ビオチン標識等のいずれであってもよい。
なお、サンドイッチ法自体は免疫測定の分野において周
知の方法であり、下記実施例にもその１例が詳細に記載
されている。
【００１３】なお、上記の方法において、検量線を作成
する場合には、担体物質と測定すべき抗原との付着複合
体を標準物質として調製する。これは、既知濃度の担体
物質を含む液と既知濃度の測定すべき抗原を含む液とを
混合し、例えば２℃〜８℃で一夜若しくは一昼夜、又は
室温若しくは３０℃〜３７℃で１〜１０時間（好ましく
は１〜２時間）放置することにより調製することができ
る。
する場合には、担体物質と測定すべき抗原との付着複合
体を標準物質として調製する。これは、既知濃度の担体
物質を含む液と既知濃度の測定すべき抗原を含む液とを
混合し、例えば２℃〜８℃で一夜若しくは一昼夜、又は
室温若しくは３０℃〜３７℃で１〜１０時間（好ましく
は１〜２時間）放置することにより調製することができ
る。
【００１４】従来のサンドイッチ法では、上部抗体及び
下部抗体の両者ともが抗測定抗原抗体であったので、担
体物質のために上部抗体が測定抗原と結合できず、測定
すべき抗原を測定することができなかった。一方、本発
明の方法は、抗測定抗原抗体及び抗担体抗体を下部抗体
及び上部抗体として用いるので、担体物質と測定すべき
抗原から成る付着複合体を確実に挟み込むことができ、
従って、確実に測定すべき抗原を測定することができ
る。
下部抗体の両者ともが抗測定抗原抗体であったので、担
体物質のために上部抗体が測定抗原と結合できず、測定
すべき抗原を測定することができなかった。一方、本発
明の方法は、抗測定抗原抗体及び抗担体抗体を下部抗体
及び上部抗体として用いるので、担体物質と測定すべき
抗原から成る付着複合体を確実に挟み込むことができ、
従って、確実に測定すべき抗原を測定することができ
る。
【００１５】免疫測定は、上記サンドイッチ法以外にも
ラテックス凝集法や免疫比濁法により行うこともでき
る。ラテックス凝集法では、ラテックス粒子に上記の抗
担体抗体及び抗測定抗原抗体を不動化したものと検体を
反応させ、凝集を測定する。抗担体抗体及び抗測定抗原
抗体は単一の粒子に不動化することもできるし、別々の
粒子に不動化し、これらを混合して用いることもでき
る。凝集は、目視による判定又は濁度計による濁度測定
により測定することができる。同様に、免疫比濁法で
も、上記抗担体抗体と抗測定抗原抗体とを検体と反応さ
せ、濁度を測定することにより測定すべき抗原を測定す
ることができる。ラテックス凝集法及び免疫比濁法自体
は免疫測定の分野において周知である。
ラテックス凝集法や免疫比濁法により行うこともでき
る。ラテックス凝集法では、ラテックス粒子に上記の抗
担体抗体及び抗測定抗原抗体を不動化したものと検体を
反応させ、凝集を測定する。抗担体抗体及び抗測定抗原
抗体は単一の粒子に不動化することもできるし、別々の
粒子に不動化し、これらを混合して用いることもでき
る。凝集は、目視による判定又は濁度計による濁度測定
により測定することができる。同様に、免疫比濁法で
も、上記抗担体抗体と抗測定抗原抗体とを検体と反応さ
せ、濁度を測定することにより測定すべき抗原を測定す
ることができる。ラテックス凝集法及び免疫比濁法自体
は免疫測定の分野において周知である。
【００１６】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。
に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではない。
【００１７】実施例１ ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とＨＤ抗原とをそれぞれ
終濃度１ｍｇ／ｍｌになるように等量混合し（溶媒はリ
ン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、４℃にて一夜放置す
ることにより標準物質を作製し、後述のように検量線の
作成に用いた。一方、抗ＨＤ抗原モノクローナル抗体
（特開平７−５３５９９号、該モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマは工業技術院生命工学工業技術研
究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４３８５として寄託）を常法に
よりパパイン分解して得たＦａｂフラグメントを１０μ
ｇ／ｍｌの濃度（溶媒：ＰＢＳ）で９６穴マイクロタイ
タープレートに固相化（３０℃、２時間）後、洗浄し、
カゼイン溶液（ブロックエース（商品名）、雪印乳業社
製）の４倍希釈物でブロッキングを行った（４℃、一
夜）。次いで、上記標準物質を１ｍｇ／ｍｌＨＳＡ含有
ＰＢＳで既知濃度に低減希釈したものと、尿検体（健常
人１４例、各種癌患者２４例）をＰＢＳで２倍希釈した
ものをそれぞれ１００μｌずつ、上記のＦａｂ固相化ウ
ェルに加えた。３０℃で２時間反応させた後、洗浄し、
ペルオキシダーゼ標識抗ＨＳＡ抗体（カッペル社製）を
１０μｇ／ｍｌに希釈したものを１００μｌずつウェル
に添加した。３０℃で１．５時間反応させた後、洗浄
し、発色剤（ＡＢＴＳ溶液、タウンズ社製）を添加、発
色後、停止液を加え、４１５ｎｍの吸光度を測定した。
終濃度１ｍｇ／ｍｌになるように等量混合し（溶媒はリ
ン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、４℃にて一夜放置す
ることにより標準物質を作製し、後述のように検量線の
作成に用いた。一方、抗ＨＤ抗原モノクローナル抗体
（特開平７−５３５９９号、該モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマは工業技術院生命工学工業技術研
究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４３８５として寄託）を常法に
よりパパイン分解して得たＦａｂフラグメントを１０μ
ｇ／ｍｌの濃度（溶媒：ＰＢＳ）で９６穴マイクロタイ
タープレートに固相化（３０℃、２時間）後、洗浄し、
カゼイン溶液（ブロックエース（商品名）、雪印乳業社
製）の４倍希釈物でブロッキングを行った（４℃、一
夜）。次いで、上記標準物質を１ｍｇ／ｍｌＨＳＡ含有
ＰＢＳで既知濃度に低減希釈したものと、尿検体（健常
人１４例、各種癌患者２４例）をＰＢＳで２倍希釈した
ものをそれぞれ１００μｌずつ、上記のＦａｂ固相化ウ
ェルに加えた。３０℃で２時間反応させた後、洗浄し、
ペルオキシダーゼ標識抗ＨＳＡ抗体（カッペル社製）を
１０μｇ／ｍｌに希釈したものを１００μｌずつウェル
に添加した。３０℃で１．５時間反応させた後、洗浄
し、発色剤（ＡＢＴＳ溶液、タウンズ社製）を添加、発
色後、停止液を加え、４１５ｎｍの吸光度を測定した。
【００１８】得られた検量線を図１に、また、尿検体の
測定値を表１及び図２に示す。図１から明らかなよう
に、抗ＨＤ抗原抗体と抗ＨＳＡ抗体によるＨＤ抗原−Ｈ
ＳＡ複合物の測定は、バックグランドも低く、ＨＤ抗原
の増加に伴い良好な直線性を示す検量線が得られた。ま
た、表１及び図２の測定値から、健常人ではほとんどＨ
Ｄ−ＨＳＡ複合体が見られないのに対し、癌、特に泌尿
器系の癌で高率のＨＤ−ＨＳＡ複合体が尿中に出現して
いることが確認された。
測定値を表１及び図２に示す。図１から明らかなよう
に、抗ＨＤ抗原抗体と抗ＨＳＡ抗体によるＨＤ抗原−Ｈ
ＳＡ複合物の測定は、バックグランドも低く、ＨＤ抗原
の増加に伴い良好な直線性を示す検量線が得られた。ま
た、表１及び図２の測定値から、健常人ではほとんどＨ
Ｄ−ＨＳＡ複合体が見られないのに対し、癌、特に泌尿
器系の癌で高率のＨＤ−ＨＳＡ複合体が尿中に出現して
いることが確認された。
【００１９】
【００２０】
【発明の効果】本発明により、測定すべき抗原がタンパ
ク質等の担体物質に付着して存在する場合があるという
新知見が得られ、また、従来の免疫測定法では測定が不
可能であったこのような付着性抗原の測定が本発明によ
り初めて可能になった。従って、本発明は、癌診断等の
診断分野やその他の免疫測定分野において大いに貢献す
るものと期待される。
ク質等の担体物質に付着して存在する場合があるという
新知見が得られ、また、従来の免疫測定法では測定が不
可能であったこのような付着性抗原の測定が本発明によ
り初めて可能になった。従って、本発明は、癌診断等の
診断分野やその他の免疫測定分野において大いに貢献す
るものと期待される。
【手続補正書】
【提出日】平成８年１月１８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】追加
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例において得られた検量線を示す
図である。
図である。
【図２】本発明の実施例において得られた、各種癌患者
の尿検体の測定値を示す図である。
の尿検体の測定値を示す図である。
Claims (11)
- 【請求項１】 液中に存在する担体物質に付着した測定
すべき抗原を測定する方法であって、前記担体物質に対
する抗体又はその抗原結合性断片と、前記測定すべき抗
原に対する抗体又はその抗原結合性断片とを用いた免疫
測定により前記測定すべき抗原を測定する、付着性抗原
の測定方法。 - 【請求項２】 前記免疫測定は、サンドイッチ法、ラテ
ックス凝集法又は免疫比濁法により行われる請求項１記
載の方法。 - 【請求項３】 前記免疫測定は、前記担体物質に対する
抗体又はその抗原結合性断片を下部抗体又は上部抗体と
して用い、前記測定すべき抗原に対する抗体又はその抗
原結合性断片を上部抗体又は下部抗体として用いるサン
ドイッチ法により行われる請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 前記サンドイッチ法は、ＥＬＩＳＡ法に
より行われる請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 前記液は体液である請求項１ないし４の
いずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】 前記体液は尿である請求項５記載の方
法。 - 【請求項７】 前記担体物質はタンパク質である請求項
１ないし６のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項８】 前記タンパク質はアルブミンである請求
項７記載の方法。 - 【請求項９】 前記測定すべき抗原が糖脂質である請求
項１ないし８のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１０】 前記測定すべき抗原がガングリオシド
である請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 前記測定すべき抗原がハンガナッツゥ
−ダイヘル抗原である請求項１０記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26635895A JPH0989892A (ja) | 1995-09-20 | 1995-09-20 | 付着性抗原の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26635895A JPH0989892A (ja) | 1995-09-20 | 1995-09-20 | 付着性抗原の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0989892A true JPH0989892A (ja) | 1997-04-04 |
Family
ID=17429839
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26635895A Pending JPH0989892A (ja) | 1995-09-20 | 1995-09-20 | 付着性抗原の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0989892A (ja) |
-
1995
- 1995-09-20 JP JP26635895A patent/JPH0989892A/ja active Pending
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