JPH089965A - ＤＨＯ−ＤＨａｓｅ等阻害剤耐性株を用いるバクテリアセルロースの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 セルロース生産性酢酸菌に属するＤＨＯ−Ｄ
Ｈａｓｅ等阻害剤耐性株及び該耐性株を培養し、培地中
にセルロース性物質を生成蓄積させ、該物質を回収する
ことから成る該セルロース性物質の製造方法。 【効果】 セルロース性物質を高収率かつ経済的に生産
することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アセトバクター属に属
しセルロース性物質を生産する能力を有する微生物（こ
の微生物を以後「セルロース生産性酢酸菌」と称する）
に属するＤＨＯ−ＤＨａｓｅ（ジヒドロキシオロト酸デ
ヒドロゲナーゼ）等阻害剤耐性株及び該株を用いるセル
ロース性物質（バクテリアセルロース：ＢＣ）の製造方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】セルロース性物質は可食性であり食品分
野で利用されるほか水系分散性に優れているので食品、
化粧品又は塗料等の粘度の保持、食品原料生地の強化、
水分の保持、食品安定性向上、低カロリー添加物又は乳
化安定化助剤としての産業上利用価値がある。また、該
セルロース性物質の離解物はミクロフィブリルの構造的
物理的特徴に基づき高分子、特に水系高分子用補強剤と
して各種の産業用用途がある。このようなセルロース性
離解物を紙状または固型状に固化した物質は高い引張弾
性率を示すので、ミクロフィブリルの構造的特徴に基づ
くすぐれた機械特性が期待され、各種産業用素材として
の応用がある。

【０００３】従来より、アセトバクター属に属する微生
物を培養して、セルロースを生産する方法は知られてい
る。例えば、特開昭６２−２６５９９０号公報、特開昭
６１−２２１２０１号公報等に、その記載がある。セル
ロース生産性酢酸菌の培養を行なう際に適当とされてい
る栄養培地としては、炭素源、ペプトン、酵母エキス、
燐酸ナトリウム及びクエン酸からなる Schramm／Hestri
n 培地（Schramm ら、J. General Biology, 11, pp.123
〜129, 1954 ）が知られている。しかしながら、上記栄
養培地で振盪もしくは通気攪拌培養を行なった場合、得
られるセルロース生産量は低く、生成速度も必ずしも満
足のいくものではなかった。また、上記栄養培地の他
に、コーンスチープリカー（ＣＳＬ）や麦芽エキス等を
加えた培地が知られているが、これら天然栄養素（ペプ
トン、酵母エキス、ＣＳＬ、麦芽エキスなど）に含まれ
る特定成分がセルロース生成促進に関与していることは
知られていない。培地中の特定栄養素によるセルロース
生成促進因子として、現在知られているものにはイノシ
トール、フィチン酸及びピロロキノリンキノン（ＰＱ
Ｑ）（特公平５−１７１８号公報；高井光男，紙パ技協
誌，第４２巻，第３号，第２３７〜２４４頁）等がある
が、セルロース生成量はまだ不十分であり、またこれら
の振盪もしくは通気攪拌培養における効果も明確ではな
かった。また、本出願人は、カルボン酸又はその塩（特
願平５−１９１４６７号）、インベルターゼ（特願平５
−３３１４９１号）及びメチオニン（特願平５−３３５
７６４号）を培地中に添加することによって、セルロー
ス性物質の生産性が向上することを見い出している。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、セル
ロース生産性酢酸菌を用いて、経済的かつ高収率でセル
ロース性物質を生産させる新たな方法を提供することに
ある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために種々の研究を行なった。特に、ＢＣ
生合成系を強化する為に、ＵＤＰ−Ｇの前駆体であるＵ
ＴＰの生合成系の強化を検討した。ジニトロフェノール
（ＤＮＰ）は図１に示すように、ジヒドロキシオロト酸
からオロト酸への反応を触媒するＤＨＯ−ＤＨａｓｅを
阻害することが知られている（JANE-JANE CHEN, et a
l., Arch. Biochem. Biophys., 1976)。

【０００６】従って、ＤＮＰのような、ＤＨＯ−ＤＨａ
ｓｅ等のオロチジル酸生合成に関与する酵素（以下、単
に「ＤＨＯ−ＤＨａｓｅ等」という。）に対する阻害剤
に耐性を有する変異株ではカルバモイリリン酸からオロ
チジル酸に至る生合成系が強化され、その結果、Ｇｌｎ
＋２ＡＴＰ＋ＨＣＯ₃ ^- からのＵＴＰ生合成系が強化さ
れている可能性がある訳である。驚くべきことに、各種
実験の結果、本発明者は、ＤＮＰ等のＤＨＯ−ＤＨａｓ
ｅ等阻害剤に耐性を有するセルロース生産性酢酸菌の変
異株が大変優れたセルロース性物質の生産性を示すこと
を見出した。即ち、本発明は、セルロース生産性酢酸菌
に属するＤＨＯ−ＤＨａｓｅ等阻害剤耐性株、該耐性株
を培養し、培地中にセルロース、セルロース性物質を生
成蓄積せしめ該物質を採取することから成るセルロース
性物質の製造方法及び該製造方法により得ることのでき
るセルロース性物質を提供する。

【０００７】本発明において使用されるＤＨＯ−ＤＨａ
ｓｅ等阻害剤耐性株は、セルロース生産性酢酸菌、例え
ば、ＢＰＲ２００１に代表されるアセトバクター・キシ
リナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタンス
（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｍ ｓｕｂｓ
ｐ．ｓｕｃｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、アセトバクタ
ー・キシリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎ
ｕｍ）ＡＴＣＣ２３７６８、アセトバクター・キシリナ
ムＡＴＣＣ２３７６９、アセトバクターパスツリアヌス
（Ａ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）ＡＴＣＣ１０２４
５、アセトバクターキシリナムＡＴＣＣ１４８５１、ア
セトバクターキシリナムＡＴＣＣ１１１４２及びアセト
バクター・キシリナムＡＴＣＣ１０８２１等、並びにそ
れらの菌株より各種突然変異処理及び遺伝子組み換え技
術などによって誘導・育種して得られた菌株等にＮＴＧ
（ニトロソグアニジン）を用いて公知の方法によって化
学的変異処理することにより創製することができる。

【０００８】この中でも、ＢＰＲ２００１株と命名され
た株は、形態は桿菌、グラム染色性は陰性、胞子形成能
は陰性、酸素に対する態度は好気性、カタラーゼ反応陽
性、オキシダーゼ反応陰性、エタノールからの酢酸生成
は陽性、酢酸塩の酸化は陽性、乳酸塩の酸化は陽性とい
う、菌類学的性を有しており、本発明のＤＨＯ−ＤＨａ
ｓｅ等阻害剤耐性株の創製に好適である。尚、ＢＰＲ２
００１株は、平成５年２月２４日に通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄
託され（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３４６６）、その後
１９９４年２月７日付で特許手続上の寄託の国際的承認
に関するブダペスト条約に基づく寄託（受託番号ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４５４５）に移管されている。

【０００９】ＮＴＧ等の変異剤を用いての化学的変異処
理方法には、例えば、Bio Factors,Vol. 1, p.297−302
(1988), J. Gen. Microbiol, Vol. 135, p.2917−292
9 (1989) 及び FEMS Microbiol Lett., Vol. 71, p.33
7−343 (1990)等に記載されているものがある。従っ
て、当業者であればこれら公知の方法に基づき本発明の
ＤＨＯ−ＤＨａｓｅ等阻害剤耐性株を得ることができ
る。本発明のＤＨＯ−ＤＨａｓｅ等阻害剤耐性株は他の
変異方法、例えば放射線照射等によっても得ることがで
きる。本発明の一例であるＤＮＰ耐性株であるＢＰＲ３
００１Ｎ株は１９９４年６月１０日付で通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター
に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４３６１を付さ
れている。尚、本発明の範囲が寄託されたこの菌株に限
定されないことは言うまでもなく、該株は本発明の一具
体例にすぎないものである。セルロース生産性酢酸菌に
属し、オロチジル酸生合成に関与する酵素に対する阻害
剤に実質的に耐性な株であれば、本発明の「セルロース
生産性酢酸菌に属するＤＨＯ−ＤＨａｓｅ等阻害剤耐性
株」に包合されるものである。その他の例として、例え
ば同様にＢＰＲ２００１株から得られたＢＰＲ３００１
Ｌ株及びＢＰＲ３００１Ｍ株がある。

【００１０】本発明の製造方法に用いる培地の組成物
中、炭素源としてはシュクロース、グルコース、フラク
トース、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、
マルトース、エリスリット、グリセリン、エチレングリ
コール、エタノール等を単独或いは併用して使用するこ
とができる。更にはこれらのものを含有する澱粉水解
物、シトラスモラセス、ビートモラセス、ビート搾汁、
サトウキビ搾汁、柑橘類を始めとする果汁等をシューク
ロスに加えて使用することもできる。 また、窒素源と
しては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素等有機或
いは無機の窒素源を使用することができ、或いはＢａｃ
ｔ−Ｐｅｐｔｏｎｅ、Ｂａｃｔ−Ｓｏｙｔｏｎｅ、Ｙｅ
ａｓｔ−Ｅｘｔｒａｃｔ、豆濃などの含窒素天然栄養源
を使用してもよい。有機微量栄養素としてアミノ酸、ビ
タミン、脂肪酸、核酸、２，７，９−トリカルボキシ−
１Ｈピロロ〔２，３−５〕−キノリン−４，５−ジオン
を添加してもよい。生育にアミノ酸等を要求する栄養要
求性変異株を使用する場合には、要求される栄養素を補
添することが必要である。無機塩類としてはリン酸塩、
マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、コ
バルト塩、モリブデン酸塩、赤血塩、キレート金属類等
が使用される。

【００１１】培養のｐＨは３ないし７に、好ましくは５
付近に制御する。培養温度は１０〜４０℃、好ましくは
２５〜３５℃の範囲で行う。培養槽に供給する酸素濃度
は１〜１００％、望ましくは２１〜８０％であれば良
い。これら培地中の各成分の組成割合及び培地に対する
菌体の接種等は培養方法に応じて当業者が適宜選択し得
るものである。本発明の製造方法に於いてＤＨＯ−ＤＨ
ａｓｅ等阻害剤耐性株を使用することにより、従来の方
法と比較してセルロース性物質の収率が向上することが
判明した。本発明方法では、培養方法に制限を受けず、
静置、振盪もしくは通気攪拌培養のいずれでもよい。振
盪もしくは通気攪拌下での培養であってもセルロース生
産性に影響を及ぼさないことも本発明方法の特徴の１つ
である。また、いわゆる回分発酵法、フィード回分発酵
法、反復回分発酵法及び連続発酵法のいずれも使用する
ことができる。更に攪拌手段としては従来公知の手段、
例えばインペラー、エアーリフト発酵槽、発酵ブロスの
ポンプ駆動循環、及びこれら手段の組合せ等から任意に
選択することができる。

【００１２】本発明の方法によって生成されるセルロー
ス性物質はそのまま回収してもよく、さらに本物質中に
含まれる菌体を始めとするセルロース性物質以外の物質
を取り除く処理をほどこしてもよい。不純物を取り除く
ためには水洗、加圧脱水、希酸洗浄、アルカリ洗浄トル
エン及び酢酸エチルなどの極性有機溶媒による処理、次
亜塩素酸ソーダ及び過酸化水素などの漂白剤による処
理、リゾチームなどの菌体溶解酵素による処理、ラウリ
ル硫酸ソーダ、デオキシコール酸などの界面活性剤によ
る処理、常温から２００℃の範囲の加熱洗浄などを単独
及び併用してほどこすことによりセルロース性物質から
不純物を除去することができる。このようにして得られ
た本発明でいうセルロース性物質とは、セルロース及
び、セルロースを主鎖としたヘテロ多糖を含むもの及び
β−１，３、β−１，２等のグルカンを含むものであ
る。ヘテロ多糖の場合のセルロース以外の構成成分はマ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、キシロース、
アラビノース、ラムノース、グルクロン酸等の六炭糖、
五炭糖及び有機酸等である。なおこれ等の多糖が単一物
質である場合もあるし２種以上の多糖が水素結合等によ
り混在してもよい。

【００１３】

【実施例】以下の実施例により、本発明をさらに詳細に
説明する。実施例１ 以下に記載する方法で、ＢＰＲ２００１株を用いて本発
明のＤＨＯ−ＤＨａｓｅ等阻害剤耐性株を創製した。ＢＰＲ２００１株の変異処理 菌体をＣＳＬ−Ｆｒｕ培地⁽¹⁾ で２８℃、３時間培養
し、菌体を増した。この前培養液を集菌後、１０mM燐酸
緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄し、１０μｇNTG/ml（１０
mM燐酸緩衝液）中で３０℃、３０分間で変異処理した。
変異処理した菌体を集菌し、前記のように洗浄し、次に
ＣＳＬ−Ｆｒｕ培地で２８℃、一夜培養し変異を固定化
した。この結果、生存率約０．２４％で変異株を得た。ＤＨＯ−ＤＨａｓｅ等阻害剤耐性株の取得 上記で変異処理したＢＰＲ２００１株（約４０，０００
コロニー）を最小培地⁽²⁾ １リットル当たり０．５mmol
のＤＮＰを含むプレートに塗抹した。（約３，０００コ
ロニー／プレート） ２８℃、７日間培養し出現したコロニー６７株のうち、
明らかに生育の悪いもの（コロニーの小さいもの）、Ｂ
Ｃの生産が低いもの（副生多糖を多量に生産しコロニー
が透明なもの）を除き、３４株を得た。

【００１４】実施例２ 実施例１で得られた３４株につき、以下の方法で培養を
行ない、ＢＣ蓄積量及び対消費糖収率を求めた。前培養
として、５０mlＣＳＬ−Ｆｒｕ培地の入った２５０ml容
ルーフラスコに菌株を植菌し、２８℃、３日間静置培養
した。次に、ルーフラスコを良く振り菌膜から菌体を剥
し、この菌液を７５mlＣＳＬ−Ｆｒｕ培地の入った３０
０ml容三角フラスコ（バッフル付き）に７．５ml植菌し
た。２８℃、４日間、１５０rpm で振盪することによっ
て本培養した。この結果、以下に示すように、これらの
ＤＮＰ耐性株がＢＰＲ２００１株に較べて優れたＢＣ生
産性を示すことが判った。

【００１５】

【表１】

【００１６】

【表２】

【００１７】

【表３】 ビタミン混合物 化合物 ｍｇ／Ｌ イノシトール ２００ ナイアシン ４０ ピリドキシンＨＣｌ ４０ チアミンＨＣｌ ４０ パントテン酸カルシウム ２０ リボフラビン ２０ ｐ−アミノ安息香酸 ２０ 葉 酸 ０．２ ビオチン ０．２

【００１８】

【表４】 上記の無機培地１００mlに当たり２．０ｇの寒天を加え
た物をプレートとする。

【００１９】尚、上の表２中、ＢＣ蓄積量（ｇ／ｌ）
は、培養終了後、培養液中の固形物を集積し、水洗して
培地成分を除去した後、ＩＮＮａＯＨ水溶液中で８０
℃、２０分間処理して菌体を除去した。さらに、洗浄液
が中性付近になるまで生成セルロースを水洗した後、８
０℃で１２時間真空乾燥して乾燥重量を測定することで
求めた。また収率（％）は以下のようにして求めた。 対消費糖収率（％）の計算 対消費糖収率は、対消費糖収率として以下のように計算
した。

【数１】Ｙ_BC＝ＢＣ／（ＲＣ_MF−ＲＣ_BF）＊１００ Ｙ_BC ：対消費糖収率（％） ＢＣ ：ＢＣ蓄積量（ｇ／ｌ） ＲＣ_MF：培地の糖濃度（ｇ／ｌ） ＲＣ_BF：培養後の培地の糖濃度（ｇ／ｌ）

【００２０】

【発明の効果】本発明方法によるセルロース性物質の生
産において、セルロース生産性酢酸菌のＤＨＯ−ＤＨａ
ｓｅ等阻害剤耐性株を用いることによって、セルロース
性物質の生産性が従来法と比べて著しく向上する。この
ことは、本発明方法がセルロース性物質を効率よくかつ
安価に製造できることを示している。

【図面の簡単な説明】

【図１】核酸（ピリミジン）合成経路を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:02）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 セルロース生産性酢酸菌に属するＤＨＯ
   −ＤＨａｓｅ等阻害剤耐性株。
2. 【請求項２】 セルロース生産性酢酸菌に属するＤＮＰ
   耐性株。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載の耐性株を培養
   し、培地中にセルロース性物質を生成蓄積させ、該物質
   を回収することから成る該セルロース性物質の製造方
   法。
4. 【請求項４】 請求項３の方法によって得ることのでき
   るセルロース性物質。