JPH10114794A - ルシフェリンの再生に係わる蛋白質 - Google Patents
ルシフェリンの再生に係わる蛋白質Info
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- JPH10114794A JPH10114794A JP9219375A JP21937597A JPH10114794A JP H10114794 A JPH10114794 A JP H10114794A JP 9219375 A JP9219375 A JP 9219375A JP 21937597 A JP21937597 A JP 21937597A JP H10114794 A JPH10114794 A JP H10114794A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 オキシルシフェリンとＤ−システインに
作用してルシフェリンを再生する能力を有する蛋白質。 【効果】 本発明によれば、オキシルシフェリンとＤ−
システインに作用してルシフェリンを再生する能力を有
する蛋白質が提供され、該蛋白質をルシフェリン−ルシ
フェラーゼ反応系に添加すれば、発光を持続させること
ができ、また使用するルシフェラーゼ及びルシフェリン
の使用量が軽減される。
作用してルシフェリンを再生する能力を有する蛋白質。 【効果】 本発明によれば、オキシルシフェリンとＤ−
システインに作用してルシフェリンを再生する能力を有
する蛋白質が提供され、該蛋白質をルシフェリン−ルシ
フェラーゼ反応系に添加すれば、発光を持続させること
ができ、また使用するルシフェラーゼ及びルシフェリン
の使用量が軽減される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ルシフェリンの再
生に係わる蛋白質に関する。
生に係わる蛋白質に関する。
【０００２】
【従来の技術】生物発光は、酵素ルシフェラーゼが発光
基質であるルシフェリンの酸化を触媒する反応であり、
反応生成物としてオキシルシフェリンを生成する。この
オキシルシフェリンは、ルシフェラーゼの反応を阻害す
る物質として知られており、そのためルシフェリン−ル
シフェラーゼ反応は反応直後のフラッシュ発光の後、急
激に発光が減少することが知られている。
基質であるルシフェリンの酸化を触媒する反応であり、
反応生成物としてオキシルシフェリンを生成する。この
オキシルシフェリンは、ルシフェラーゼの反応を阻害す
る物質として知られており、そのためルシフェリン−ル
シフェラーゼ反応は反応直後のフラッシュ発光の後、急
激に発光が減少することが知られている。
【０００３】従来、オキシルシフェリンに作用し、発光
基質であるルシフェリンを再生させる蛋白質は、単離、
精製されてないのが実状である。このような蛋白質を見
出し、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応系に添加すれ
ば、発光持続性の向上が期待でき、また使用するルシフ
ェラーゼ、ルシフェリンの使用量の軽減等につながる。
基質であるルシフェリンを再生させる蛋白質は、単離、
精製されてないのが実状である。このような蛋白質を見
出し、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応系に添加すれ
ば、発光持続性の向上が期待でき、また使用するルシフ
ェラーゼ、ルシフェリンの使用量の軽減等につながる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、オキシルシ
フェリンとＤ−システインに作用してルシフェリンを再
生する能力を有する蛋白質を提供することを目的とす
る。
フェリンとＤ−システインに作用してルシフェリンを再
生する能力を有する蛋白質を提供することを目的とす
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者は、上
記課題について鋭意検討した結果、甲虫類生体内にオキ
シルシフェリンとＤ−システインに作用してルシフェリ
ンを再生する能力を有する蛋白質が存在することを見出
し、該蛋白質を単離、精製することに成功した。
記課題について鋭意検討した結果、甲虫類生体内にオキ
シルシフェリンとＤ−システインに作用してルシフェリ
ンを再生する能力を有する蛋白質が存在することを見出
し、該蛋白質を単離、精製することに成功した。
【０００６】すなわち、本発明は、以下の発明を提供す
るものである。 （１）オキシルシフェリンとＤ−システインに作用して
ルシフェリンを再生する能力を有する蛋白質。 （２）発光能力を有する生体からの抽出物をクロマトグ
ラフ処理工程を含む精製工程により精製して得られる、
オキシルシフェリンとＤ−システインに作用してルシフ
ェリンを再生する能力を有する蛋白質。
るものである。 （１）オキシルシフェリンとＤ−システインに作用して
ルシフェリンを再生する能力を有する蛋白質。 （２）発光能力を有する生体からの抽出物をクロマトグ
ラフ処理工程を含む精製工程により精製して得られる、
オキシルシフェリンとＤ−システインに作用してルシフ
ェリンを再生する能力を有する蛋白質。
【０００７】（３）発光能力を有する生体が、甲虫類で
あることを特徴とする請求項２記載の蛋白質。 （４）発光能力を有する生体が、ホタルであることを特
徴とする請求項２記載の蛋白質。 （５）発光能力を有する生体が、北米産ホタルであるこ
とを特徴とする請求項２記載の蛋白質。
あることを特徴とする請求項２記載の蛋白質。 （４）発光能力を有する生体が、ホタルであることを特
徴とする請求項２記載の蛋白質。 （５）発光能力を有する生体が、北米産ホタルであるこ
とを特徴とする請求項２記載の蛋白質。
【０００８】（６）発光能力を有する生体が、日本産ホ
タルであることを特徴とする請求項２記載の蛋白質。 （７）発光能力を有する生体が、ゲンジボタルであるこ
とを特徴とする請求項２記載の蛋白質。 （８）発光能力を有する生体が、ヘイケボタルであるこ
とを特徴とする請求項２記載の蛋白質。
タルであることを特徴とする請求項２記載の蛋白質。 （７）発光能力を有する生体が、ゲンジボタルであるこ
とを特徴とする請求項２記載の蛋白質。 （８）発光能力を有する生体が、ヘイケボタルであるこ
とを特徴とする請求項２記載の蛋白質。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本蛋白質を製造する方法としては、如何なる方法
でもよく、例えば、以下の方法が挙げられる。本蛋白質
の製造のもととなるものは、本蛋白質を含有するもので
あれば如何なるものでも良く、例えば、ホタルをはじめ
とする甲虫類及び一般に市販されているホタルの粗酵素
抽出液、さらには遺伝子組み換えの手法を用いて生産さ
せた組み換え体等が挙げられる。
する。本蛋白質を製造する方法としては、如何なる方法
でもよく、例えば、以下の方法が挙げられる。本蛋白質
の製造のもととなるものは、本蛋白質を含有するもので
あれば如何なるものでも良く、例えば、ホタルをはじめ
とする甲虫類及び一般に市販されているホタルの粗酵素
抽出液、さらには遺伝子組み換えの手法を用いて生産さ
せた組み換え体等が挙げられる。
【００１０】次いで、本蛋白質を含有するものを、緩衝
液中で粉砕、溶菌もしくは溶解させる。緩衝液として
は、本蛋白質を失活させるものでなければ、如何なるも
のでも良く、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリ
シルグリシン緩衝液等が挙げられる。
液中で粉砕、溶菌もしくは溶解させる。緩衝液として
は、本蛋白質を失活させるものでなければ、如何なるも
のでも良く、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリ
シルグリシン緩衝液等が挙げられる。
【００１１】粉砕方法としては、乳鉢及び乳棒を用いる
方法、ホモゲナイザー、ワーニングブレンダー、フレン
チプレス等を用いる方法、溶菌方法としては、リゾチー
ム処理を施す方法等が挙げられる。
方法、ホモゲナイザー、ワーニングブレンダー、フレン
チプレス等を用いる方法、溶菌方法としては、リゾチー
ム処理を施す方法等が挙げられる。
【００１２】次いで、粉砕物、溶菌物及び溶解物等よ
り、通常の遠心分離あるいは濾過処理により残さを除去
して、粗酵素液を得るか、これに必要により硫安沈澱
法、アルコール沈澱法、アセトン沈澱法等を適宜選択し
て実施することにより粗酵素粉末を得る。
り、通常の遠心分離あるいは濾過処理により残さを除去
して、粗酵素液を得るか、これに必要により硫安沈澱
法、アルコール沈澱法、アセトン沈澱法等を適宜選択し
て実施することにより粗酵素粉末を得る。
【００１３】上記粗酵素液もしくは粗酵素粉末よりさら
に精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、
ウルトロゲルもしくはバイオゲル等を用いるゲル濾過
法、イオン交換体を用いる吸着溶出法、ポリアクリルア
ミドゲル等を用いる電気泳動法、ヒドロキシアパタイト
を用いる吸着溶出法、蔗糖密度勾配遠心等の沈降法、等
電点の違いによる分離法、アフィニティクロマト法、分
子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜
選択して実施することにより、精製された蛋白質標品を
得ることが出来る。
に精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、
ウルトロゲルもしくはバイオゲル等を用いるゲル濾過
法、イオン交換体を用いる吸着溶出法、ポリアクリルア
ミドゲル等を用いる電気泳動法、ヒドロキシアパタイト
を用いる吸着溶出法、蔗糖密度勾配遠心等の沈降法、等
電点の違いによる分離法、アフィニティクロマト法、分
子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜
選択して実施することにより、精製された蛋白質標品を
得ることが出来る。
【００１４】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明する。 〔実施例１〕２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン−塩酸緩衝液に、１００ｍＭ塩化ナトリウム、
１ｍＭジチオスレイトール及び１ｍＭエチレンジアミン
４酢酸２ナトリウムを添加し、さらにグリセロールを１
０％（Ｗ／Ｖ）となる如く添加して得た緩衝液Ａ（ｐＨ
７．０）２００ｍｌを用い、ホタル発光器抽出物（fire
fly lantern extract；ＳＩＧＭＡ社製）４ｇを溶解さ
せた。
説明する。 〔実施例１〕２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン−塩酸緩衝液に、１００ｍＭ塩化ナトリウム、
１ｍＭジチオスレイトール及び１ｍＭエチレンジアミン
４酢酸２ナトリウムを添加し、さらにグリセロールを１
０％（Ｗ／Ｖ）となる如く添加して得た緩衝液Ａ（ｐＨ
７．０）２００ｍｌを用い、ホタル発光器抽出物（fire
fly lantern extract；ＳＩＧＭＡ社製）４ｇを溶解さ
せた。
【００１５】このようにして得た溶液を、常法により硫
酸アンモニウムを用いて塩析し、４０〜６０％飽和で生
成した沈澱を２０ｍｌの緩衝液Ａに溶解させた。次い
で、この溶液を、緩衝液Ａで平衡化したウルトロゲル
（Ultrogel）ＡｃＡ３４（ＩＢＦ社製）カラム中に通過
させてゲル濾過クロマトグラフィーを行い活性画分を得
た。
酸アンモニウムを用いて塩析し、４０〜６０％飽和で生
成した沈澱を２０ｍｌの緩衝液Ａに溶解させた。次い
で、この溶液を、緩衝液Ａで平衡化したウルトロゲル
（Ultrogel）ＡｃＡ３４（ＩＢＦ社製）カラム中に通過
させてゲル濾過クロマトグラフィーを行い活性画分を得
た。
【００１６】このようにして得られた画分を、５ｍＭト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液に
１ｍＭジチオスレイトール及び１ｍＭエチレンジアミン
４酢酸２ナトリウムを添加し、更に５％（Ｗ／Ｖ）グリ
セロール及び１ｍＭ塩化ナトリウムを添加した緩衝液Ｂ
（ｐＨ６．５）で透析した。
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液に
１ｍＭジチオスレイトール及び１ｍＭエチレンジアミン
４酢酸２ナトリウムを添加し、更に５％（Ｗ／Ｖ）グリ
セロール及び１ｍＭ塩化ナトリウムを添加した緩衝液Ｂ
（ｐＨ６．５）で透析した。
【００１７】得られた溶液を、緩衝液Ｂで平衡化させた
Ｓ−セファロース ＦＦ（S-Sepharose FF；ファルマシ
ア バイオテク社製）カラムに吸着させ、１〜１００ｍ
Ｍまで塩化ナトリウムによるリニアグラジエント溶出を
行い、活性画分を得た。
Ｓ−セファロース ＦＦ（S-Sepharose FF；ファルマシ
ア バイオテク社製）カラムに吸着させ、１〜１００ｍ
Ｍまで塩化ナトリウムによるリニアグラジエント溶出を
行い、活性画分を得た。
【００１８】このようにして得られた活性画分を、緩衝
液Ｃ（緩衝液Ｂと同じ組成のｐＨ８．０の溶液）で透析
後、緩衝液Ｃで平衡化させたイオン交換ＨＰＬＣカラム
（東ソー社製、TSKgel SuperQ-5PW）に吸着させ、１〜
１００ｍＭまで塩化ナトリウムによるリニアグラジエン
ト溶出を行い、活性画分を得た。
液Ｃ（緩衝液Ｂと同じ組成のｐＨ８．０の溶液）で透析
後、緩衝液Ｃで平衡化させたイオン交換ＨＰＬＣカラム
（東ソー社製、TSKgel SuperQ-5PW）に吸着させ、１〜
１００ｍＭまで塩化ナトリウムによるリニアグラジエン
ト溶出を行い、活性画分を得た。
【００１９】このようにして得られた活性画分を、緩衝
液Ａで平衡化させたゲル濾過ＨＰＬＣカラム（東ソー社
製、TSKgel G3000SWXL）に通過させて、純化させること
に成功した。なお、ゲル濾過の通過画分を、Laemmli 法
(Laemmli, U.K.: Nature, 227, 680, (1970))により、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、本純化蛋白質の分子
量は、約40,000であった。
液Ａで平衡化させたゲル濾過ＨＰＬＣカラム（東ソー社
製、TSKgel G3000SWXL）に通過させて、純化させること
に成功した。なお、ゲル濾過の通過画分を、Laemmli 法
(Laemmli, U.K.: Nature, 227, 680, (1970))により、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、本純化蛋白質の分子
量は、約40,000であった。
【００２０】さらに本蛋白質の反応至適ｐＨ、反応至適
温度は、夫々ｐＨ７〜８及び温度３５〜５０℃であっ
た。また、本蛋白質は、５０℃、３０分の熱処理後にお
いても、８０％以上の残存活性を保持していた。
温度は、夫々ｐＨ７〜８及び温度３５〜５０℃であっ
た。また、本蛋白質は、５０℃、３０分の熱処理後にお
いても、８０％以上の残存活性を保持していた。
【００２１】〔実施例２〕緩衝液Ａ１５mlに、ゲンジボ
タル（西武百貨店より購入）の発光器 200 匹分を添加
し、ヒスコトロン〔（株）日音医理科機器製作所製〕を
用いて破砕したものを、12,000 r.p.m.で２０分間遠心
処理し、上清１４mlを得た。このようにして得た粗酵素
溶液を常法により硫酸アンモニウムを用いて塩析し、３
０〜６０％飽和で生成した沈澱を、12,000 r.p.m.で１
０分間遠心分離処理し、その沈澱を２０ ml の緩衝液Ａ
に溶解させて溶液を得た。
タル（西武百貨店より購入）の発光器 200 匹分を添加
し、ヒスコトロン〔（株）日音医理科機器製作所製〕を
用いて破砕したものを、12,000 r.p.m.で２０分間遠心
処理し、上清１４mlを得た。このようにして得た粗酵素
溶液を常法により硫酸アンモニウムを用いて塩析し、３
０〜６０％飽和で生成した沈澱を、12,000 r.p.m.で１
０分間遠心分離処理し、その沈澱を２０ ml の緩衝液Ａ
に溶解させて溶液を得た。
【００２２】次いで、この溶液を、緩衝液Ａで平衡化し
たウルトロゲル（Ultrogel）ＡｃＡ３４（ＩＢＦ社製）
カラム中に通過させてゲル濾過クロマトグラフィーを行
い活性画分を得た。このようにして得られた画分を、緩
衝液Ｂ（ｐＨ６．５）で透析後、緩衝液Ｂで平衡化させ
たＳ−セファロース ＦＦ（S-Sepharose FF；ファルマ
シア バイオテク社製）カラムに吸着させ、１〜１００
ｍＭまで塩化ナトリウムによるリニアグラジエント溶出
を行い、活性画分を得た。
たウルトロゲル（Ultrogel）ＡｃＡ３４（ＩＢＦ社製）
カラム中に通過させてゲル濾過クロマトグラフィーを行
い活性画分を得た。このようにして得られた画分を、緩
衝液Ｂ（ｐＨ６．５）で透析後、緩衝液Ｂで平衡化させ
たＳ−セファロース ＦＦ（S-Sepharose FF；ファルマ
シア バイオテク社製）カラムに吸着させ、１〜１００
ｍＭまで塩化ナトリウムによるリニアグラジエント溶出
を行い、活性画分を得た。
【００２３】このようにして得られた活性画分を、緩衝
液Ｃ（緩衝液Ｂと同じ組成のｐＨ８．０の溶液）で透析
後、緩衝液Ｃで平衡化させたイオン交換ＨＰＬＣカラム
（東ソー社製、TSKgel SuperQ-5PW）に吸着させ、１〜
１００ｍＭまで塩化ナトリウムによるリニアグラジエン
ト溶出を行い、活性画分を得た。
液Ｃ（緩衝液Ｂと同じ組成のｐＨ８．０の溶液）で透析
後、緩衝液Ｃで平衡化させたイオン交換ＨＰＬＣカラム
（東ソー社製、TSKgel SuperQ-5PW）に吸着させ、１〜
１００ｍＭまで塩化ナトリウムによるリニアグラジエン
ト溶出を行い、活性画分を得た。
【００２４】このようにして得られた活性画分を、緩衝
液Ａで平衡化させたゲル濾過ＨＰＬＣカラム（東ソー社
製、TSKgel G3000SWXL）に通過させて、純化させること
に成功した。なお、本蛋白質の反応至適ｐＨ、反応至適
温度は、夫々ｐＨ７〜８及び温度３５〜５０℃であっ
た。また、本蛋白質は、５０℃、３０分の熱処理後にお
いても、８０％以上の残存活性を保持していた。
液Ａで平衡化させたゲル濾過ＨＰＬＣカラム（東ソー社
製、TSKgel G3000SWXL）に通過させて、純化させること
に成功した。なお、本蛋白質の反応至適ｐＨ、反応至適
温度は、夫々ｐＨ７〜８及び温度３５〜５０℃であっ
た。また、本蛋白質は、５０℃、３０分の熱処理後にお
いても、８０％以上の残存活性を保持していた。
【００２５】〔実施例３〕緩衝液Ａ１５mlに、ヘイケボ
タル（西武百貨店より購入）の発光器 300匹分を添加
し、ヒスコトロン〔（株）日音医理科機器製作所製〕を
用いて破砕したものを、12,000 r.p.m.で２０分間遠心
処理し、上清１３mlを得た。このようにして得られた粗
酵素液は、実施例２と同様の操作により純化させること
に成功した。
タル（西武百貨店より購入）の発光器 300匹分を添加
し、ヒスコトロン〔（株）日音医理科機器製作所製〕を
用いて破砕したものを、12,000 r.p.m.で２０分間遠心
処理し、上清１３mlを得た。このようにして得られた粗
酵素液は、実施例２と同様の操作により純化させること
に成功した。
【００２６】なお、本蛋白質の反応至適ｐＨ、反応至適
温度は、夫々ｐＨ８〜９及び温度５０〜７０℃であっ
た。また、本蛋白質は、５０℃、３０分の熱処理後にお
いても、８０％以上の残存活性を、６０℃、３０分の熱
処理後においても６０％以上の残存活性を保持してい
た。
温度は、夫々ｐＨ８〜９及び温度５０〜７０℃であっ
た。また、本蛋白質は、５０℃、３０分の熱処理後にお
いても、８０％以上の残存活性を、６０℃、３０分の熱
処理後においても６０％以上の残存活性を保持してい
た。
【００２７】〔実施例４〕実施例１により精製した蛋白
質のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に及ぼす影響を
調べた。０．５μｇ／ｍｌ アメリカボタルルシフェラ
ーゼ １０μｌ、1ｍＭ ルシフェリン ４０μｌ、１０ｍ
Ｍ Ｄ−システイン ４０μｌ、活性測定用緩衝液［２５
ｍＭグリシルグリシン＋５．４ｍＭ硫酸マグネシウム、
（ｐＨ７．８）］３００μｌを加えたものに、実施例１
により精製した蛋白質１０ μｌを添加した。この溶液
中に、１０ｍＭＡＴＰを１００μｌ注入し、発光量を１
０秒間隔で１分間測定した結果を表１に示した。なお、
蛋白質の代わりに活性測定用緩衝液１０μｌを添加した
ものを、コントロールとし、比較した。その結果、本蛋
白質を添加することにより、発光持続性が向上すること
が判明した。
質のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に及ぼす影響を
調べた。０．５μｇ／ｍｌ アメリカボタルルシフェラ
ーゼ １０μｌ、1ｍＭ ルシフェリン ４０μｌ、１０ｍ
Ｍ Ｄ−システイン ４０μｌ、活性測定用緩衝液［２５
ｍＭグリシルグリシン＋５．４ｍＭ硫酸マグネシウム、
（ｐＨ７．８）］３００μｌを加えたものに、実施例１
により精製した蛋白質１０ μｌを添加した。この溶液
中に、１０ｍＭＡＴＰを１００μｌ注入し、発光量を１
０秒間隔で１分間測定した結果を表１に示した。なお、
蛋白質の代わりに活性測定用緩衝液１０μｌを添加した
ものを、コントロールとし、比較した。その結果、本蛋
白質を添加することにより、発光持続性が向上すること
が判明した。
【００２８】
【表１】
【００２９】なお、実施例２及び３により精製した蛋白
質においても、同様の効果が確認できた。 活性測定法 活性測定用緩衝液［２５ｍＭグリシルグリシン＋５．４
ｍＭ硫酸マグネシウム、（ｐＨ７．８）］８．５ｍｌ
に、０．０１ｍＭ Ｄ−システイン１ｍｌ及び１ｍＭオ
キシルシフェリン０．５ｍｌを添加し、基質混合液を作
成した。
質においても、同様の効果が確認できた。 活性測定法 活性測定用緩衝液［２５ｍＭグリシルグリシン＋５．４
ｍＭ硫酸マグネシウム、（ｐＨ７．８）］８．５ｍｌ
に、０．０１ｍＭ Ｄ−システイン１ｍｌ及び１ｍＭオ
キシルシフェリン０．５ｍｌを添加し、基質混合液を作
成した。
【００３０】上記混合液１００μｌに、測定サンプル１
０μｌを加え、３７℃で４時間反応させた。この反応液
１０μｌを活性測定用緩衝液２００μｌに添加した後、
ＡＴＰ、ルシフェラーゼ混合液（１０ｍＭＡＴＰ溶液
に、ルシフェラーゼを０．５ｍｇ／ｍｌとなるよう添加
した溶液）を１００μｌ注入し、発光量を５秒間積算し
た。
０μｌを加え、３７℃で４時間反応させた。この反応液
１０μｌを活性測定用緩衝液２００μｌに添加した後、
ＡＴＰ、ルシフェラーゼ混合液（１０ｍＭＡＴＰ溶液
に、ルシフェラーゼを０．５ｍｇ／ｍｌとなるよう添加
した溶液）を１００μｌ注入し、発光量を５秒間積算し
た。
【００３１】
【発明の効果】本発明によれば、オキシルシフェリンと
Ｄ−システインに作用してルシフェリンを再生する能力
を有する蛋白質が提供され、該蛋白質をルシフェリン−
ルシフェラーゼ反応系に添加すれば、発光を持続させる
ことができ、また使用するルシフェラーゼ及びルシフェ
リンの使用量が軽減される。
Ｄ−システインに作用してルシフェリンを再生する能力
を有する蛋白質が提供され、該蛋白質をルシフェリン−
ルシフェラーゼ反応系に添加すれば、発光を持続させる
ことができ、また使用するルシフェラーゼ及びルシフェ
リンの使用量が軽減される。
Claims (8)
- 【請求項１】 オキシルシフェリンとＤ−システインに
作用してルシフェリンを再生する能力を有する蛋白質。 - 【請求項２】 発光能力を有する生体からの抽出物をク
ロマトグラフ処理工程を含む精製工程により精製して得
られる、オキシルシフェリンとＤ−システインに作用し
てルシフェリンを再生する能力を有する蛋白質。 - 【請求項３】 発光能力を有する生体が、甲虫類である
ことを特徴とする請求項２記載の蛋白質。 - 【請求項４】 発光能力を有する生体が、ホタルである
ことを特徴とする請求項２記載の蛋白質。 - 【請求項５】 発光能力を有する生体が、北米産ホタル
であることを特徴とする請求項２記載の蛋白質。 - 【請求項６】 発光能力を有する生体が、日本産ホタル
であることを特徴とする請求項２記載の蛋白質。 - 【請求項７】 発光能力を有する生体が、ゲンジボタル
であることを特徴とする請求項２記載の蛋白質。 - 【請求項８】 発光能力を有する生体が、ヘイケボタル
であることを特徴とする請求項２記載の蛋白質。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2467196P | 1996-08-22 | 1996-08-22 | |
| US60/024,671 | 1996-08-22 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10114794A true JPH10114794A (ja) | 1998-05-06 |
| JP3636867B2 JP3636867B2 (ja) | 2005-04-06 |
Family
ID=21821789
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21937597A Expired - Fee Related JP3636867B2 (ja) | 1996-08-22 | 1997-08-14 | ルシフェリンの再生に係わる蛋白質 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5814504A (ja) |
| EP (1) | EP0825257B1 (ja) |
| JP (1) | JP3636867B2 (ja) |
| AT (1) | ATE307197T1 (ja) |
| DE (1) | DE69734378T2 (ja) |
| DK (1) | DK0825257T3 (ja) |
| ES (1) | ES2249794T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011064690A (ja) * | 2000-06-09 | 2011-03-31 | Promega Corp | 発光アッセイ感度を高める方法 |
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|---|---|---|---|---|
| JP2001103972A (ja) * | 1999-10-06 | 2001-04-17 | Kikkoman Corp | ルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及びルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質の製造法 |
| JP3891323B2 (ja) * | 2000-07-28 | 2007-03-14 | キッコーマン株式会社 | ルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、組み換え体ｄｎａ及びルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質の製造法 |
| JP4158956B2 (ja) * | 2000-07-28 | 2008-10-01 | キッコーマン株式会社 | ルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、組み換え体ｄｎａ及びルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質の製造法 |
| EP1468284B1 (en) * | 2001-11-14 | 2008-08-06 | The Secretary of State for Defence | Method for measuring intracellular atp and/or gene expression |
| US7663022B1 (en) | 2002-07-15 | 2010-02-16 | Bruce Eric Hudkins | Transgenic bioluminescent plants |
| US7049483B1 (en) * | 2002-07-15 | 2006-05-23 | Bruce Eric Hudkins | Transgenic bioluminescent plants |
| GB0505763D0 (en) * | 2005-03-22 | 2005-04-27 | Enigma Diagnostics Ltd | Polymorphism detection method |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH088863B2 (ja) * | 1987-11-30 | 1996-01-31 | キッコーマン株式会社 | ルシフェラーゼ |
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1997
- 1997-06-05 US US08/869,996 patent/US5814504A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-14 JP JP21937597A patent/JP3636867B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-08-21 DK DK97306406T patent/DK0825257T3/da active
- 1997-08-21 EP EP97306406A patent/EP0825257B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-21 DE DE69734378T patent/DE69734378T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-08-21 AT AT97306406T patent/ATE307197T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-08-21 ES ES97306406T patent/ES2249794T3/es not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011064690A (ja) * | 2000-06-09 | 2011-03-31 | Promega Corp | 発光アッセイ感度を高める方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5814504A (en) | 1998-09-29 |
| ATE307197T1 (de) | 2005-11-15 |
| DE69734378T2 (de) | 2006-07-06 |
| DK0825257T3 (da) | 2006-01-23 |
| EP0825257A3 (en) | 1999-09-08 |
| EP0825257B1 (en) | 2005-10-19 |
| DE69734378D1 (de) | 2005-11-24 |
| EP0825257A2 (en) | 1998-02-25 |
| JP3636867B2 (ja) | 2005-04-06 |
| ES2249794T3 (es) | 2006-04-01 |
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