JPH10120570A - Ｈｓｐ６０ファミリーに属するタンパク質のエボジアミン誘導体含有合成抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 分子量５７キロダルトンから６８キロダルト
ンまでの間の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ６０ファミ
リー）がその発症に関与する自己免疫疾患（例えば、Ｉ
型糖尿病や慢性関節リウマチなど）の患者の生理学的状
態を有効に改善させ、前記病気を効果的に治療すること
ができる、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質の
合成抑制剤を提供する。 【解決手段】 下記一般式（Ｉ）で表されるエボジアミ
ン誘導体を有効成分として含有する。 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、エボジアミン誘導
体を有効成分として含有する、分子量が５７キロダルト
ン（ｋＤ）から６８ｋＤまでの間の熱ショックタンパク
質群（以下、ＨＳＰ６０ファミリーと称する）に属する
タンパク質の合成抑制剤に関する。本発明によるＨＳＰ
６０ファミリーに属するタンパク質の合成抑制剤は、特
に、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質の組織内
合成を抑制することにより、ＨＳＰ６０ファミリーに属
するタンパク質が発症に関与するものと考えられている
自己免疫疾患、例えば、Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチ
などの病気の患者の生理学的状態を有効に改善させ、Ｉ
型糖尿病や慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患を効果
的に治療することができる。

【０００２】

【従来の技術】近年、自己免疫疾患が大きな問題となっ
ている。自己免疫疾患とは、本来ならば自己の身体を構
成する成分に対しては攻撃しないはずの免疫系が、自己
の組織と反応して破壊してしまう病気であり、例えば、
Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチなどが含まれる。例え
ば、近年わが国では、経済・社会・文化の発達と、生活
水準の向上や生活様式の変化に伴って、糖尿病患者は著
しく増加し、病態も重症化、複雑化してきた。糖尿病学
の進歩によって、患者の予後は改善したとはいえ、特有
な網膜症、腎症及び神経障害が多発し、加えて動脈硬化
も促進され、健康と社会活動に多大な支障をきたしてい
る。糖尿病のうち、Ｉ型糖尿病（インスリン依存性糖尿
病；insulin-dependent diabetes mellitus ；ＩＤＤ
Ｍ）の発生率は、多くの国でこの数十年間に数倍に増加
し、現在生きているヒトの１％は７０才になるまでにＩ
型糖尿病に罹病するものと予想されている。

【０００３】Ｉ型糖尿病は、インスリン産生細胞である
膵臓ランゲルハンス島のβ細胞だけが自己免疫的に破壊
されるためにインスリン欠乏状態となる疾患で、臓器特
異的な自己免疫疾患である（Atkinson, M. A. et al.:
"Sci. Am.", 263 : 42-49, 1990; Todd JA.: "Immuno
l. Today", 11: 122-129, 1990)。Ｉ型糖尿病をおこす
自己免疫過程は、非常に厳密に膵臓だけに限られてお
り、しばしば大人になる前に発症してくることが多い。
Ｉ型糖尿病が臨床的に発症するときには、膵島の炎症
（膵島炎）があり、インスリンを産生しているβ細胞の
大半が特異的に失われる（Atkinson, M. A., et al.: "
Sci. Am.", 263 : 62-67, 1990)。糖尿病の臨床症状
は、β細胞の大部分（おそらく９０％以上）が再生でき
ない程度にまで破壊された後に初めて現れ、患者の生存
はインスリンの外的供給に依存することになる。即ち、
臨床診断によって発見することができる時期には、この
自己免疫反応が既に不可逆的な損傷を与えており、しか
もその多くは顕著な自覚症状を示さない等、Ｉ型糖尿病
は多くの問題を含んでいる。

【０００４】また、慢性関節リウマチは、関節滑膜を病
変の主座とする慢性炎症性疾患である。病変部位はとき
として関節滑膜のみにとどまらず、全身に及ぶこともま
れではない。関節滑膜に初発した炎症は、やがて滑膜増
殖、更に軟骨及び骨の破壊を起こし、関節組織の破壊が
引き起こされる。その結果、患者は社会的にも家庭的に
も著しく制限を受けるのみならず、経済的負担も無視で
きないものとなる。慢性関節リウマチの患者数は人口の
０．１〜０．３％とされる。これは慢性関節リウマチの
確診例であって、疑診例などや慢性関節リウマチの周辺
疾患を含めると患者数はその１０倍前後にも増えるもの
と思われる。

【０００５】一方、熱ショックタンパク質（heat shock
protein；ＨＳＰ、ストレスタンパク質ともいう）は、
細胞を何らかのストレス、例えば、熱、重金属、薬剤、
アミノ酸類似体、又は低酸素（低濃度酸素）などで刺激
することにより、細胞に発現される一群のタンパク質で
ある。熱ショックタンパク質は、自然界に普遍的に存在
しており、細菌、酵母、植物、昆虫、及びヒトを含む高
等動物により産生される。

【０００６】ＨＳＰは、その種類は多種多様であるが、
分子量の大きさからＨＳＰ９０ファミリー（例えば、９
０ｋＤ又は１１０ｋＤのＨＳＰなど）、ＨＳＰ７０ファ
ミリー（例えば、７０〜７３ｋＤのＨＳＰなど）、ＨＳ
Ｐ６０ファミリー（例えば、５７〜６８ｋＤのＨＳＰな
ど）、低分子ＨＳＰファミリー（例えば、２０ｋＤ、２
５〜２８ｋＤ、又は４７ｋＤのＨＳＰなど）の４ファミ
リーに大別することができる。なお、本明細書において
は、特定分子量を有するＨＳＰを、ＨＳＰとその直後に
記載する数字とによって示すものとし、例えば、分子量
６０ｋＤのＨＳＰを『ＨＳＰ６０』と称するものとす
る。以上のように、ＨＳＰには多くの種類が存在する
が、これらは分子量だけでなく、構造、機能、又は性質
などもそれぞれ異なるものである。ストレスへの応答に
加えて、これらのタンパク質の中には構成的に合成され
るものがあり、正常な環境の下で、タンパク質のフォー
ルディング、アンフォールディング、タンパク質サブユ
ニットの会合、タンパク質の膜輸送のような、必須の生
理的な役割を演じていることが示されている。熱ショッ
クタンパク質としてのこれらの機能は、分子シャペロン
と称される。

【０００７】自己免疫疾患の病因に関して注目されてい
ることのひとつに、分子相同性（molecular mimicry)が
ある。すなわち、自己抗原が微生物などの外来抗原と共
通抗原性をもっている場合、微生物感染によって生成さ
れる抗体や感作リンパ球が交叉反応によって自己の組織
を攻撃してしまう結果、自己免疫疾患が発症するものと
考えられている（Atkinson, M. A. et al.: "Sci. A
m.", 263 : 42-49, 1990;Shinha, A. A. et al.: "Scie
nce", 248 : 1380-1388, 1990)。例えば、細菌のＨＳＰ
６０ファミリーに属するタンパク質は、結核、らい病、
梅毒、在郷軍人病、又はライム病などの主たる抗原であ
り（Young, R. A. et al.: "Cell", 59:5-8, 1989)、
かつ、細菌のＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質
は強い免疫原性を有し、及び自己の（宿主であるヒト
の）タンパク質との分子相同性を有するために、感染症
がトリガーとなった分子相同性による自己免疫疾患が発
症するものと考えられている。

【０００８】例えば、糖尿病の患者やその家族の血中に
検出される６４ｋＤタンパク質と反応する抗体（６４ｋ
Ｄ自己抗体）はβ細胞特異的であるし、また糖尿病と診
断される直前によく出現しやすい。すなわち、Ｉ型糖尿
病において発症の原因と考えられている膵島細胞抗原
は、分子量６４ｋＤの糖タンパク質（Baekkeskov, S. e
t al.: "Nature", 298 : 167-169, 1982)である。６４
ｋＤタンパク質に対する抗体はヒトの糖尿病のみならず
（Atkinson, M. A. et al.: "Lancet", 335 : 1357-136
0, 1990)、ＢＢラット（Baekkeskov, S. et al.: "Scie
nce", 224 : 1348-1350, 1984)やＮＯＤマウス（Atkins
on, M. A. et al.: "Diabetes", 37: 1587-1590, 1988)
などのように、自然にＩ型糖尿病を発症し、ヒトのＩ型
糖尿病の多くの特徴を示す、Ｉ型糖尿病のモデル動物に
おいても検出される。Ｉ型糖尿病における膵臓β細胞の
６４ｋＤタンパク質は、サイトカインや熱刺激で誘導さ
れるので、熱ショックタンパク質である可能性がある。

【０００９】Ｉ型糖尿病のモデル動物であるＮＯＤマウ
スにおける膵臓ランゲルハンス島β細胞の６４ｋＤタン
パク質は、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のＨ
ＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質に対する抗体と
免疫学的に交叉反応性を示す自己抗原であることが示さ
れている。このように、ＨＳＰ６０ファミリーに属する
タンパク質と６４ｋＤタンパク質自己抗原との間に免疫
学的交叉が観察されることにより、膵臓β細胞の６４ｋ
Ｄタンパク質がＨＳＰ６０ファミリーの一員である可能
性があり、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質の
エピトープと交叉する自己免疫の機序が、Ｉ型糖尿病の
発症に関与することが示唆されている。また、結核菌の
ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質に特異性を有
するＴリンパ球のクローンを移入すると、幼若ＮＯＤマ
ウスにランゲルハンス島炎と高血糖を引き起こす。ま
た、結核菌のＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質
を免疫原性のある投与方法、すなわちアジュバントとと
もにＮＯＤマウスに注射すると、糖尿病を早期に発症さ
せ得る（Elias, D. et al.: "Proc. Natl. Acad. Sci.
USA", 87: 1576-1580, 1990)。マイコバクテリアのＨＳ
Ｐ６０ファミリーに属するタンパク質に対する動物の免
疫反応がＩ型糖尿病を引き起こすというこれらの事実
は、マイコバクテリアのＨＳＰ６０ファミリーに属する
タンパク質に対する抗体と交叉反応する抗原に対する免
疫系による攻撃が、β細胞に障害を与えることを示して
いる。

【００１０】また、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタン
パク質は、慢性関節リウマチの動物モデルであるラット
のアジュバント関節炎や、ヒトのリウマチ関節炎に関連
していることが知られている。例えば、慢性関節リウマ
チの場合、細菌の菌体タンパク質である熱ショックタン
パク質のなかでもＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパ
ク質は、関節軟骨に存在するプロテオグリカンと分子相
同性をもっていることが明らかとなっている。ラットの
アジュバント関節炎ではＨＳＰ６０ファミリーに属する
タンパク質反応性Ｔリンパ球の関与が示されている（"C
urr. Top. Microbiol. Immunol.", 145 : 27-83, 198
9)。この疾患は、放射線照射を受けた免疫学的に無防備
の（ｎａｔｉｖｅ）ラットに、結核菌のＨＳＰ６０ファ
ミリーに属するタンパク質に対して反応性のＴリンパ球
のクローンを移入することにより、前記ラットに移すこ
とができることが見出された（"Science", 219 : 56-5
8, 1983; "Nature", 331: 171-173, 1988)。このＴリ
ンパ球は同時に関節のプロテオグリカンとも交叉反応性
を示す（"Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 82: 5117-512
0, 1985)。このＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク
質で誘導される調節性Ｔリンパ球は、溶連菌やプリステ
インによる関節炎でも認められている。従って、アジュ
バント関節炎は、抗ＨＳＰ６０ファミリーに属するタン
パク質Ｔリンパ球により引き起こされる自己免疫疾患の
ようである。また、ヒトの若年性関節リウマチでもＨＳ
Ｐ６０ファミリーに属するタンパク質反応性Ｔリンパ球
の関与が考えられている。

【００１１】また、慢性関節リウマチの患者の滑液中か
らマイコバクテリア由来のＨＳＰ６０ファミリーに属す
るタンパク質に対して、特異的に反応するＴリンパ球が
取り出されている（"Lancet", II: 478-480, 1988; "Na
ture", 339 : 226, 1989; "Annu. Rev. Immunol.", 1
1: 637, 1993)。このように、マイコバクテリアのＨＳ
Ｐ６０ファミリーに属するタンパク質と交叉反応性を示
すタンパク質が高濃度に慢性関節リウマチの軟骨／パン
ヌス接合部に認められるのに対し、正常な組織や他の疾
患による慢性の炎症を呈する組織においては認められな
い（"Scand. J. Immunol.", 31: 283-288, 1990)。更
に、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質に対する
抗体がヒト及びラットの慢性関節リウマチで検出される
（Kaufmann,S. H. E., et al.: "Immunol. Today", 11:
129-136, 1990)ことからも、慢性関節リウマチの病因
がマイコバクテリアのＨＳＰ６０ファミリーに属するタ
ンパク質と構造の類似した自己抗原に対する自己免疫で
あるという可能性がある。従ってＨＳＰ６０ファミリー
に属するタンパク質に対する免疫応答の存在はラット及
びヒトの両方の関節炎に関連している。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記事
情に鑑み、Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチなどの自己免
疫疾患の患者の生理学的状態を有効に改善することがで
き、それらの自己免疫疾患を効果的に治療することので
きる方法を開発するために、ＨＳＰ６０ファミリーに属
するタンパク質に対して合成抑制作用を示す化合物に関
して種々検討を重ねてきた。その結果、本発明者らは、
意外にも、呉茱萸の成分であるエボジアミン、又はその
誘導体が、病態を示す組織の細胞におけるＨＳＰ６０フ
ァミリーに属するタンパク質の合成を特異的に抑制する
ことを見出した。すなわち、エボジアミン誘導体を投与
することにより、細胞内でのＨＳＰ６０ファミリーに属
するタンパク質の合成が抑制され、従って、Ｉ型糖尿病
や慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患の治療が可能で
あることを見出したのである。本発明はこうした知見に
基づくものであり、Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチなど
の自己免疫疾患を効果的に治療することのできる、ＨＳ
Ｐ６０ファミリーに属するタンパク質の合成抑制剤を提
供することを目的とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、式
（Ｉ）：

【化３】 （式中、Ｒは炭素数１〜３のアルキル基である）で表さ
れるエボジアミン誘導体を有効成分として含有すること
を特徴とする、分子量５７キロダルトンから６８キロダ
ルトンまでの間の熱ショックタンパク質（すなわち、Ｈ
ＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質）の合成抑制剤
に関する。

【００１４】本明細書において、「ＨＳＰ６０ファミリ
ー」とは、前記のとおり、分子量が５７ｋＤ〜６８ｋＤ
の熱ショックタンパク質群を意味する。また、ＨＳＰ６
０ファミリーに属するタンパク質としては、例えば、Ｈ
ＳＰ６０（すなわち、分子量６０ｋＤの熱ショックタン
パク質）、ＨＳＰ５８（すなわち、分子量５８ｋＤの熱
ショックタンパク質）、ＨＳＰ６５（すなわち、分子量
６５ｋＤの熱ショックタンパク質）、又はＧｒｏＥＬ
（すなわち、原核生物、例えば、大腸菌などの分子量約
６４ｋＤの熱ショックタンパク質）などを挙げることが
できる。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明の合成抑制剤は、有効成分として前記式
（Ｉ）で表されるエボジアミン誘導体を含有する。炭素
数１〜３のアルキル基とは、例えば、メチル基、エチル
基、ｎ−プロピル基、又はｉ−プロピル基である。前記
式（Ｉ）で表されるエボジアミン誘導体には、立体異性
体が存在し、それらの任意の純粋の立体異性体又はそれ
らの混合物を、本発明の合成抑制剤の有効成分として用
いることができる。

【００１６】本発明の合成抑制剤において有効成分とし
て使用することのできるエボジアミン誘導体としては、
式（II）：

【化４】 で表されるエボジアミン（ｅｖｏｄｉａｍｉｎｅ）が好
ましい。エボジアミンは、例えば、呉茱萸（ごしゅゆ）
等の生薬に含まれている。

【００１７】本発明の合成抑制剤に含有されるエボジア
ミン誘導体は、化学合成によって、又は天然物から抽出
して精製することによって、調製することができる。あ
るいは、市販品を用いてもよい。本発明の合成抑制剤に
おいて有効成分として用いるエボジアミン誘導体を、天
然物から抽出する場合には、例えば、エボジアミン誘導
体を含有する植物の全体又は一部分（例えば、全草、
葉、根、根茎、茎、根皮、花、若しくは果実）をそのま
ま用いて、又は簡単に加工処理（例えば、乾燥、切断、
湯通し、蒸気加熱、若しくは粉末化）したもの（例え
ば、生薬）を用いて抽出する。抽出条件は一般的に植物
抽出に用いられる条件ならば特に制限はない。エボジア
ミンを含有する植物としては、これに限定するものでは
ないが、例えば、ゴシュユ（Ｅｖｏｄｉａ ｒｕｔａｅ
ｃａｒｐａ Ｂｅｎｔｈａｍ）又は石虎（Ｅｖｏｄｉａ
ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｄｏｄｅ）等を使用するこ
とができる。

【００１８】本発明におけるエボジアミンを生薬から抽
出する場合、これに限定するものではないが、例えば、
呉茱萸から抽出することが好ましい。呉茱萸（Ｅｖｏｄ
ｉａＦｒｕｉｔ；Ｅｖｏｄｉａｅ Ｆｒｕｃｔｕｓ）と
は、ゴシュユ又は石虎の果実を意味し、それらの部分を
単独であるいは任意に組み合わせて使用することができ
る。なお、本明細書においては、便宜上、植物としての
『ゴシュユ』と、生薬としての『呉茱萸』とを、カタカ
ナと漢字で区別して表記する。

【００１９】本発明による合成抑制剤において有効成分
として用いることのできる呉茱萸抽出物は、前記のエボ
ジアミンを含有していればよく、従って、呉茱萸の粗抽
出物を用いることができる。本発明で用いることのでき
る呉茱萸抽出物の製造方法としては、呉茱萸を、水（例
えば、冷水、温水、又は熱湯）によって抽出するか、又
は有機溶媒を用いて抽出することによって、得ることが
できる。有機溶媒としては、例えば、アルコール（例え
ば、メチルアルコール、エチルアルコール、ｎ−プロピ
ルアルコール、イソプロピルアルコール、若しくはブチ
ルアルコール）、エステル（例えば、酢酸メチル、酢酸
エチル、酢酸プロピル、若しくは酢酸ブチル）、ケトン
（例えば、アセトン若しくはメチルイソブチルケト
ン）、エーテル、石油エーテル、ｎ−ヘキサン、シクロ
ヘキサン、トルエン、ベンゼン、炭化水素のハロゲン誘
導体（例えば、四塩化炭素、ジクロロメタン、若しくは
クロロホルム）、ピリジン、グリコール（例えば、プロ
ピレングリコール、若しくはブチレングリコール）、ポ
リエチレングリコール、又はアセトニトリルなどを用い
ることができ、これらの有機溶媒を単独、又は適宜組み
合わせ、一定の比率で混合し、更には無水又は含水状態
で用いることができる。好ましくは、メチルアルコール
及び／又はジクロロメタン等が望ましい。水抽出又は有
機溶媒抽出の方法としては、通常の生薬抽出に用いられ
る方法を用いることができ、例えば、（乾燥）呉茱萸１
重量部に対し、水又は有機溶媒３〜３００重量部を用い
て、攪拌しながら、その沸点以下の温度で加熱還流、常
温で超音波抽出、あるいは冷浸することが望ましい。抽
出工程は、通常は５分〜７日間、好ましくは１０分〜６
０時間実施し、必要に応じて、攪拌等の補助的手段を加
えることにより、抽出時間を短縮することができる。

【００２０】抽出工程終了後、濾過又は遠心分離等の適
当な方法により、水又は有機溶媒抽出液から、不溶物を
分離して粗抽出物を得ることができる。なお、本発明の
合成抑制剤において、天然物より抽出、分画したエボジ
アミンを用いる場合には、前記の粗抽出物を特に精製す
ることなく、そのまま使用してもよい。常法による水抽
出物又は有機溶媒抽出物の他に、前記の粗抽出物を各種
有機溶媒又は吸着剤等により、更に処理した精製抽出物
も、本発明の合成抑制剤の有効成分として用いることが
できる。これらの粗抽出物及び各種の精製処理を終えた
精製抽出物を含む呉茱萸抽出物は、抽出したままの溶液
を用いても、溶媒を濃縮したエキスを用いても良いし、
溶媒を留去し乾燥した粉末、更には結晶化して精製した
もの、あるいは粘性のある物質を用いても良く、またそ
れらの希釈液を用いることもできる。こうして得られた
呉茱萸抽出物は、呉茱萸に含まれるエボジアミンを含
み、同時に原料の呉茱萸に由来する不純物を含んでい
る。

【００２１】本発明の合成抑制剤は、エボジアミン誘導
体、エボジアミン誘導体を含有する植物の抽出物、例え
ば、エボジアミン誘導体を含有する生薬の抽出物（特に
は、呉茱萸抽出物）を、それ単独で、又は好ましくは製
剤学的若しくは獣医学的に許容することのできる通常の
担体と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）
に投与することができる。投与剤型としては、特に限定
がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセ
ル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス
剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、
軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬な
どの非経口剤を挙げることができる。これらの経口剤
は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、
コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、
カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニ
ルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ
糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウ
ム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無
水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、
結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、
希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保
湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従っ
て製造することができる。例えば、エボジアミン１重量
部と乳糖９９重量部とを混合して充填したカプセル剤な
どである。

【００２２】非経口投与方法としては、注射（皮下、静
脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなか
で、注射剤が最も好適に用いられる。例えば、注射剤の
調製においては、有効成分としてのエボジアミン誘導
体、又はエボジアミン誘導体を含有する植物の抽出物、
例えば、エボジアミン誘導体を含有する生薬の抽出物
（特には、呉茱萸抽出物）の他に、例えば、生理食塩水
若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂
肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化
ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐
剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることがで
きる。また、本発明の合成抑制剤は、徐放性ポリマーな
どを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。
例えば、本発明の合成抑制剤をエチレンビニル酢酸ポリ
マーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療す
べき組織中に外科的に移植することができる。

【００２３】本発明の合成抑制剤は、これに限定される
ものではないが、エボジアミン誘導体を、０．０１〜９
９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有す
ることができる。また、エボジアミン誘導体を含有する
植物の抽出物、例えば、エボジアミン誘導体を含有する
生薬の抽出物（特には、呉茱萸抽出物）を有効成分とし
て含有する本発明の合成抑制剤は、その中に含まれるエ
ボジアミン誘導体が前記の量範囲になるように適宜調整
して、調製することができる。なお、エボジアミン誘導
体を含有する植物の抽出物、例えば、エボジアミン誘導
体を含有する生薬の抽出物（特には、呉茱萸抽出物）を
有効成分として含有する合成抑制剤を、経口投与用製剤
とする場合には、製剤学的に許容することのできる担体
を用いて、製剤化することが好ましい。

【００２４】本発明の合成抑制剤を用いる場合の投与量
は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程
度、又は投与方法などにより異なり、特に制限はない
が、エボジアミン誘導体量として通常成人１人当り１ｍ
ｇ〜１０ｇ程度を、１日１〜４回程度にわけて、経口的
に又は非経口的に投与する。更に、用途も医薬品に限定
されるものではなく、種々の用途、例えば、機能性食品
や健康食品として飲食物の形で与えることも可能であ
る。

【００２５】

【作用】上記したように、本発明の合成抑制剤に含有さ
れるエボジアミン誘導体は、細胞内のＨＳＰ６０ファミ
リーに属するタンパク質の合成を特異的に抑制する作用
があるので、前記エボジアミン誘導体を投与すると細胞
でのＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質の生合成
が特異的に減少する。従って、前記エボジアミン誘導体
は、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質がその発
症に関連する自己免疫疾患、例えば、Ｉ型糖尿病や慢性
関節リウマチなどの予防及び治療に使用することができ
る。すなわち、本発明は、前記式（Ｉ）で表されるエボ
ジアミン誘導体を有効成分として含有することを特徴と
する、自己免疫疾患治療剤、例えば、Ｉ型糖尿病治療剤
又は慢性関節リウマチ治療剤にも関する。また、本発明
は、前記式（Ｉ）で表されるエボジアミン誘導体を含有
する植物の抽出物を有効成分として含有することを特徴
とする、自己免疫疾患治療剤、例えば、Ｉ型糖尿病治療
剤又は慢性関節リウマチ治療剤にも関する。更に、本発
明は、呉茱萸の抽出物を有効成分として含有することを
特徴とする、自己免疫疾患治療剤、例えば、Ｉ型糖尿病
治療剤又は慢性関節リウマチ治療剤にも関する。

【００２６】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：ヒト培養癌細胞のＨＳＰ発現量の測定 （１）ヒト培養癌細胞の培養 以下の各種ヒト培養癌細胞を、５％二酸化炭素条件下
で、熱ショック処理時以外は、３７℃で培養した。胃癌
細胞株ＫＡＴＯ III （ＡＴＣＣ ＨＴＢ １０３）
は、１０％非働化ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと略称す
る）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。子宮癌
細胞株ＨｅＬａ Ｓ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２．２）
は、１０％非働化ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて培養し
た。

【００２７】（２）エボジアミン処理及び熱ショック処
理 播種２日後の胃癌細胞株ＫＡＴＯ III の培地中に、最
終濃度２０μＭになるように前記式（II）で表されるエ
ボジアミン（松浦薬業）を添加し、２４時間培養した。
また、播種２日後の子宮癌細胞株ＨｅＬａ Ｓ３の培地
中に、最終濃度１μＭになるように前記エボジアミンを
添加し、２４時間培養した。その後、４５℃にて１５分
間熱ショック処理をしてから、３７℃にて終夜培養し
た。対照試験は、エボジアミンを添加しないこと以外は
前記と同様に実施した。

【００２８】（３）ヒト培養癌細胞でのＨＳＰ発現量の
測定 前項（２）で処理した各細胞を、以下に示す方法により
ホモジナイズし、ＨＳＰ発現量をウェスタンブロット法
にて測定した。すなわち、前項（２）で処理した細胞
を、リン酸緩衝生理食塩水〔組成：ＫＣｌ＝０．２ｇ／
ｌ，ＫＨ₂ ＰＯ₄ ＝０．２ｇ／ｌ，ＮａＣｌ＝８ｇ／
ｌ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄ （無水）＝１．１５ｇ／ｌ；以下、
ＰＢＳ（−）と称する〕で洗浄した後、ライシスバッフ
ァー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）〔１．０％ＮＰ−４
０、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ−ＥＤＴＡ、２ｍＭ−Ｎ−エ
チルマレイミド、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフル
オリド、２μｇ／ｍｌロイペプチン及び２μｇ／ｍｌペ
プスタチン〕１ｍｌを加え、氷上で２０分間静置した。
その後、４℃で１２０００ｒｐｍにて、２０分間、遠心
を行った。遠心後の上清１０μｌをＰＢＳ（−）７９０
μｌに加え、更にプロテインアッセイ染色液（Dye Reag
ent Concentrate : バイオラッド，カタログ番号500-00
06）２００μｌを加えた。５分間、室温にて静置した
後、５９５ｎｍで吸光度を測定してタンパク質定量を行
った。

【００２９】タンパク質定量を行った試料を用いて、Ｌ
ａｅｍｍｌｉのバッファー系（Laemmli, N. K., "Natur
e", 283 : pp. 249-256, 1970)にて、等量のタンパク質
を含むライセートのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行った。電気泳動後、ブロッティング及びそれに
続くブロッキングを行った。すなわち、タンパク質転写
装置（Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell：バ
イオ・ラッド，カタログ番号170-3946）を用いて、室温
にて１００Ｖにて、０．４５μｍニトロセルロース膜
（Schleicher & Schuell，カタログ番号401196）にゲル
を密着させ、３時間ブロッティングを行った。ブロッテ
ィングバッファーとしては、０．０２５Ｍトリス及び
０．１９２ＭグリシンよりなりｐＨ８．５に調整された
トリスグリシンバッファー（Tris Gly Running and Blo
tting Buffer；Enprotech, 米国マサチューセッツ州，
カタログ番号 SA100034)にメチルアルコールを２０％に
なるように加えて調製したバッファーを用いた。ブロッ
ティング後、ニトロセルロース膜を１０％スキムミルク
（雪印乳業）−ＰＢＳ（−）溶液に室温にて３０分間、
インキュベートし非特異的結合をブロックした。

【００３０】ブロッキング後、ニトロセルロース膜の上
で、抗ヒトＨＳＰ６０マウスモノクローナル抗体（Stre
ssGen, Victoria, B.C., Canada, カタログ番号 SPA-8
06）により、１次抗体反応を行った。この抗ヒトＨＳＰ
６０マウスモノクローナル抗体は、大腸菌を用いるリコ
ンビナントＤＮＡ法により作製したヒトＨＳＰ６０を免
疫原として作製した抗体であり（"J. Exp. Med." 175
, 1805-1810, 1992)、哺乳類ＨＳＰ６０（霊長類ＨＳ
Ｐ６０、マウスＨＳＰ６０、ラットＨＳＰ６０、及びハ
ムスターＨＳＰ６０）と特異的に反応する（"J. Exp. M
ed." 175 , 1805-1810, 1992)。この抗ヒトＨＳＰ６０
マウスモノクローナル抗体が認識するエピトープは、ヒ
トＨＳＰ６０アミノ酸配列の第３８３番目〜第４４７番
目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列中に局在す
る（"J. Exp. Med." 175 , 1805-1810,1992)。１次抗
体反応後、ＰＢＳ（−）で５分間ずつ、溶液を取り替え
て２回の洗浄をスロー・ロッキング・シェイカーによっ
て行い、更にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
（バイオ・ラッド，カタログ番号170-6531）溶液で１５
分間ずつ、溶液を取り替えて４回の洗浄を行った。最終
的に、ＰＢＳ（−）で５分間ずつ、２回の洗浄を行っ
た。

【００３１】洗浄終了後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
マウスＩｇＧ抗体（CAPPEL，カタログ番号55550)を、２
％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）溶液で５０００倍に
希釈して調製した抗体溶液５ｍｌを用いて、２時間、２
次抗体反応を行った。反応終了後、ニトロセルロース膜
に関して、ＰＢＳ（−）溶液で５分間ずつ溶液を変えて
２回、更にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液
で１５分間ずつ溶液を変えて５回の洗浄をスロー・ロッ
キング・シェイカーにより行った。最後にＰＢＳ（−）
溶液で５分間ずつ２回の洗浄を行った。余分なＰＢＳ
（−）溶液を除去した後、ウェスタンブロッティング検
出試薬（ECL Western blotting detectionreagent；Ame
rsham，カタログ番号RPN2106)をニトロセルロース膜上
に振りかけ、１分間インキュベートした後、余分な検出
試薬を除去し、ニトロセルロース膜をラップに包み、反
応面をＸ線フィルム（コダック X-OMAT, AR, カタログ
番号165 1454）に密着させて露光し、現像してＨＳＰ６
０の有無の検討を行った。結果を表１に示す。表中、
「↓」は、対照に比べて、エボジアミン処理によりＨＳ
Ｐ６０発現量が減少したことを意味する。

【００３２】

【表１】 癌種 癌細胞 ＨＳＰ６０発現量変化 胃 ＫＡＴＯ III ↓ 子宮 ＨｅＬａ Ｓ３ ↓

【００３３】対照試験、すなわち、エボジアミンを添加
しなかった細胞では、子宮癌細胞株ＨｅＬａ Ｓ３、及
び胃癌細胞株ＫＡＴＯ III において、分子量約６０ｋ
Ｄのバンドが一本検出された。なお、分子量は、前記抗
ヒトＨＳＰ６０マウスモノクローナル抗体との結合、及
び分子量マーカー（卵白オバルブミン及びウシ血清アル
ブミン）により決定した。表１に示すとおり、エボジア
ミンを添加した子宮癌細胞株ＨｅＬａ Ｓ３、及び胃癌
細胞株ＫＡＴＯ III では、分子量約６０ｋＤのバンド
の濃度が対照試験に比べて有意に薄くなった。すなわ
ち、エボジアミンは、ＨＳＰ６０の発現を抑制する合成
抑制剤の活性を有するものと結論することができる。

【００３４】

【発明の効果】以上詳述したように、エボジアミン誘導
体は、細胞内のＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク
質の発現を抑制する合成抑制剤の活性を有する。従っ
て、エボジアミン誘導体を投与することにより、例え
ば、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質が発症に
関与する自己免疫疾患（例えば、Ｉ型糖尿病や慢性関節
リウマチなど）の患者の生理学的状態を有効に改善さ
せ、前記病気を効果的に治療することができる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（Ｉ）： 【化１】 （式中、Ｒは炭素数１〜３のアルキル基である）で表さ
   れるエボジアミン誘導体を有効成分として含有すること
   を特徴とする、分子量５７キロダルトンから６８キロダ
   ルトンまでの間の熱ショックタンパク質の合成抑制剤。
2. 【請求項２】 式（Ｉ）： 【化２】 （式中、Ｒは炭素数１〜３のアルキル基である）で表さ
   れるエボジアミン誘導体を含有する植物の抽出物を有効
   成分として含有することを特徴とする、分子量５７キロ
   ダルトンから６８キロダルトンまでの間の熱ショックタ
   ンパク質の合成抑制剤。
3. 【請求項３】 呉茱萸の抽出物を有効成分として含有す
   ることを特徴とする、分子量５７キロダルトンから６８
   キロダルトンまでの間の熱ショックタンパク質の合成抑
   制剤。