JPH10136982A - 新規な遺伝子ならびにそれを用いた組換えタンパク質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 インスリン遺伝子の発現調節因子をコードす
る遺伝子を提供する。 【解決手段】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
ヒトＢＨＦ１をコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のう
ち、少なくともアミノ酸番号１〜３３８からなるアミノ
酸配列を有するタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、
少なくともアミノ酸番号１〜３３８からなるアミノ酸配
列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若
しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インス
リン遺伝子のｍＲＮＡの産生を調節するタンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、インスリン遺伝子
の転写調節活性を有するヒトタンパク質ＢＨＦ１（以
下、「ヒトＢＨＦ１タンパク質」あるいは単に「ｈＢＨ
Ｆ１」または「ヒトＢＨＦ１」と略記することがある）
をコードするＤＮＡ（以下、「ｈＢＨＦ１遺伝子」と略
記することがある）に関する。詳しくは、インスリン遺
伝子の転写調節活性を有する新規なヒトタンパク質ＢＨ
Ｆ１の遺伝子、少なくともｈＢＨＦ１を遺伝子組み換え
技術により発現させるために必要なプロモーター配列、
ｈＢＨＦ１をコードするＤＮＡ配列およびターミネータ
ー配列を有する発現ベクターにより形質転換された形質
転換体、さらにその形質転換体を培養することにより当
該タンパク質を発現させる方法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】糖尿
病は、インスリンの相対的あるいは絶対的不足により血
糖値が上昇し、多臓器に障害を引き起こす疾患である。
これは、インスリン分泌の不足またはインスリン感受性
の低下によって起こるが、いずれの原因も一部をのぞい
て不明であり、遺伝性要因と環境要因の２つの面からの
研究が行われている。近年、ヒトの糖尿病のうちインス
リン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）においては、遺伝要因に
関して少なくとも１８個の遺伝子座が関与していること
が明らかになった。第２染色体長腕に存在するＩＤＤＭ
７もその一つである。

【０００３】ラットＢＨＦ１（Biochemical and Biophy
sical Research Communications 221, 199-204 (199
6)）は、Basic helix-loop-helix(bHLH)として見い出さ
れたタンパク質であり、bHLHはmyogenesis（筋形成）と
neurogenesis（神経形成）に関与する転写因子である。
一方、bHLHはハムスターＢＥＴＡ２と高い相同性を有し
ている。ＢＥＴＡ２は、インスリン遺伝子の５’非翻訳
領域に存在する調節領域に結合し、インスリン遺伝子の
転写活性を上昇させることが知られている。したがっ
て、ＢＨＦ１遺伝子の変異は、インスリン遺伝子の転写
活性を低下させ、分泌されるインスリンの減少、消失が
おこり、糖尿病状態を惹起させることが予想された。ま
た、ＩＤＤＭ７の遺伝子座は、ＩＤＤＭ２の遺伝子座
（インスリン遺伝子の５’非翻訳領域）と遺伝学的に関
係することが知られており、インスリン遺伝子の５’領
域にＢＨＦ１が作用する可能性が強く示唆される。。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、糖尿病薬の
開発、糖尿病診断薬の開発を行う目的で糖尿病関連遺伝
子の探索を鋭意行った結果、ヒト小脳からヒトＢＨＦ１
遺伝子を分子クローニングすることに成功した。また、
ＢＨＦ１遺伝子が存在する位置が、第２染色体長腕のＩ
ＤＤＭ７と同じ遺伝子座に位置することを明らかにし、
本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち本発明の要旨は、下記（Ａ）又は
（Ｂ）に示すタンパク質ヒトＢＨＦ１をコードするＤＮ
Ａに存する。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のう
ち、少なくともアミノ酸番号１〜３３８からなるアミノ
酸配列を有するタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、
少なくともアミノ酸番号１〜３３８からなるアミノ酸配
列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若
しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インス
リン遺伝子のｍＲＮＡの産生を調節するタンパク質。

【０００６】上記ＤＮＡとしてさらに具体的には、下記
（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡが挙げられる。 （ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号１３８〜１１５１からなる塩基配列を
含むＤＮＡ。 （ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号１３８〜１１５１からなる塩基配列と
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイ
ンスリン遺伝子のｍＲＮＡの産生を調節するタンパク質
をコードするＤＮＡ。

【０００７】また本発明は、上記ＤＮＡを含有する組換
え発現ベクター、上記ＤＮＡを含み、かつ、ヒトＢＨＦ
Ｉの一部又は全部を発現し得る形質転換体、及び上記形
質転換体を培地で培養し、その培養物からヒトＢＨＦＩ
タンパク質の一部または全部を採取することを特徴とす
る、ヒトＢＨＦＩタンパク質の一部または全部を製造す
る方法、を提供する。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下本発明につき詳細に説明す
る。本発明のＤＮＡによりコードされるｈＢＨＦ１タン
パク質は、配列表の配列番号２においてアミノ酸番号１
〜３３８で表されるアミノ酸配列を有する。本発明のＤ
ＮＡによってコードされるｈＢＨＦ１には、上記アミノ
酸配列において、インスリン遺伝子のｍＲＮＡの産生を
調節する、いわゆる転写調節因子としての機能を損なわ
ない範囲で、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若
しくは付加されたアミノ酸配列を有するものも含まれ
る。

【０００９】本発明のＤＮＡは、上記（１）及び（２）
に示す理化学的性質を有するｈＢＨＦ１タンパク質をコ
ードするものであり、具体的には、配列番号２において
アミノ酸番号１〜３３８で表されるアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡが挙げられる。本発明のＤＮＡは、この配
列を有するものに限られず、配列番号２に示すアミノ酸
配列をコードするものは全て含まれる。さらに具体的に
は、例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列のう
ち、塩基番号１３８〜１１５１で表される塩基配列を有
するものが挙げられる。なお、配列表の配列番号１に示
す塩基配列は他の相補的な塩基配列を省略して一本鎖の
みを記載した。

【００１０】また、ｈＢＨＦ１の活性を損なわない範囲
で、配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも
アミノ酸番号１〜３３８からなるアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付
加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡも、本発明に
含まれる。このようなＤＮＡの一態様として、例えば、
配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、少なくと
も塩基番号１３８〜１１５１からなる塩基配列を有する
ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るＤＮＡであって、かつ、上記（１）及び（２）に示す
理化学的性質を有するｈＢＨＦ１タンパク質をコードす
るＤＮＡが挙げられる。

【００１１】本発明のＤＮＡを用い、遺伝子組換え技術
を利用して例えば配列表の配列番号２に示すアミノ酸配
列を有するｈＢＨＦ１タンパク質を発現することができ
る。尚、ｈＢＨＦ１タンパク質は、生体内ではシグナル
配列を含む前駆体として合成され、細胞から分泌される
際にはシグナル配列が切断されて、成熟タンパク質が産
生される。配列番号２に示すアミノ酸配列は、前駆体の
アミノ酸配列であり、アミノ酸番号−１８〜−１がシグ
ナル配列に相当し、１〜３３８が成熟タンパク質に相当
する。

【００１２】本発明のＤＮＡを利用してｈＢＨＦ１タン
パク質を発現させる場合には、成熟タンパク質（又はＮ
末端に翻訳開始のメチオニンが付加された）を直接発現
させてもよく、シグナル配列を含む前駆体として発現さ
せてもよい。その際、シグナル配列としてｈＢＨＦ１タ
ンパク質固有のシグナル配列を用いてもよく、また、他
のタンパク質のシグナル配列を利用してｈＢＨＦ１タン
パク質を産生させることも可能である。すなわち本発明
のｈＢＨＦ１をコードするＤＮＡは、例えば、配列表の
配列番号１の他に、発現効率を向上させるアミノ酸配
列、例えば、いわゆるシグナル配列に置き換えた物ある
いは発現を確認するために他のタンパク質と読み枠が変
わらないようにつなげた、いわゆるフュージョンタンパ
ク質として設計された物をコードするＤＮＡも含まれ
る。

【００１３】本発明においては、以下に示すような方法
で、上記ＤＮＡ又はその一部を含有してなる発現ベクタ
ーを作製し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換さ
せ、該形質転換体を培地で培養し、その培養物からｈＢ
ＨＦ１タンパク質の一部または全部を採取することによ
り、ｈＢＨＦ１タンパク質の一部または全部（以下、単
に「組換えｈＢＨＦ１」ということがある）を得ること
ができる。

【００１４】本発明のｈＢＨＦ１をコードする遺伝子
は、例えば、次のような方法によって得られる。まず本
発明のｈＢＨＦ１をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ
ライブラリーとしては、正常ヒト小脳から調製してきた
ＲＮＡを用いて公知の常法により作成したプラスミドｃ
ＤＮＡライブラリーもしくはファージｃＤＮＡライブラ
リーもしくはファージゲノミックライブラリーが利用で
きる。

【００１５】例えばファージｃＤＮＡライブラリーの場
合、まずヒト小脳などの組織、あるいはヒト膵臓組織を
液体窒素中で粉砕しグアニジンイソチオシアネート水溶
液等中でホモジナイズし、Chirgwinらの方法［Biochemi
stry 18，5294-5299(1979)］に従って塩化セシウム平衡
密度勾配遠心法によって全ＲＮＡを沈澱として分離す
る。ＲＮＡの分離には市販のＲＮＡｚｏｌ（TelTest
社）などの抽出試薬を使用することもできる。分離後、
フェノール抽出、エタノール沈澱により全ＲＮＡを精製
し、これをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマトグ
ラフィーにかけて精製して目的のｈＢＨＦ１ｍＲＮＡを
含むポリ（Ａ）含有ｍＲＮＡ（ｐｏｌｙ(Ａ) ⁺ｍＲＮ
Ａ）を単離しｍＲＮＡ群を得ることができる。

【００１６】次に、上記で調製したｍＲＮＡ群と、例え
ば、デオキシチミジンが１２個から１８個つながったい
わゆるＯｌｉｇｏ（ｄＴ）配列そのもの、あるいは［Na
tureVol.329, 836-838(1987)］に記載されているような
Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）配列を含有するような合成ＤＮＡに
より構成されるプライマーＤＮＡをハイブリダイズさ
せ、逆転写酵素により１本鎖ｃＤＮＡを合成する。市販
のｃＤＮＡの合成キットにもこれに類する配列が利用さ
れている。例えばClontech社のMarathon^TM cDNA Amplif
ication kitの例では配列表の配列番号３で表されるＤ
ＮＡにより構成されるプライマーＤＮＡを利用してお
り、これを用いてｃＤＮＡの合成を行うこともできる。
その際、後述するＰＣＲ反応にはその市販のプライマー
に対するＰＣＲ反応用の合成ＤＮＡが添付されているの
でそれを用いてＰＣＲ反応を行えば良い。また、前述の
［Nature Vol.329, 836-838(1987)］に記載されている
ようなプライマーＤＮＡを用いる場合にはその配列に相
補的な配列を設計し、ＰＣＲ反応用のプライマーとして
あらかじめ用意しておくと良い。次に大腸菌のＤＮＡポ
リメラーゼＩ、大腸菌のＤＮＡリガーゼ、ＲＮａｓｅＨ
を用い常法に従い２本鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡの末端を平滑化
した後、いわゆるＥｃｏＲＩアダプター等の、制限酵素
により切断された形をなすＤＮＡの小断片をＴ４ＤＮＡ
リガーゼによりｃＤＮＡ鎖の両末端に付加する。

【００１７】この際、例えばＥｃｏＲＩメチレース等の
ＤＮＡメチレースでｃＤＮＡ中の制限酵素切断点を、具
体的にはＥｃｏＲＩメチレースの場合はＥｃｏＲＩ切断
点をメチル化し、制限酵素ＥｃｏＲＩの切断からｃＤＮ
Ａを保護しておき、次にｃＤＮＡの末端に、いわゆるＥ
ｃｏＲＩリンカー等をＴ４ＤＮＡリガーゼにより付加し
た後、制限酵素ＥｃｏＲＩでリンカーＤＮＡ部分のみを
切断しても同様な結果が得られる。ベクターのクローニ
ングサイトを例えばＢａｍＨＩなどの他の制限酵素の切
断点を選択する場合は前述の一連の末端処理の操作を、
例えばＢａｍＨＩアダプターの結合もしくはＢａｍＨＩ
メチレース、ＢａｍＨＩリンカー、ＢａｍＨＩ等の組み
合わせによる処理にする事により同様な結果を得ること
ができる。

【００１８】また、前述のMarathon^TM cDNA Amplificat
ion kitの場合ｃＤＮＡ末端にベクターの配列と相補的
な配列を導入したり、ＰＣＲ反応を行えるように工夫さ
れたできるアンカーＤＮＡを添付してあるのでそれを用
いて、適切なベクターにｃＤＮＡを挿入したり、ＰＣＲ
反応で増幅したりすることもできる。上記の様に末端処
理されたｃＤＮＡ鎖を市販のλファージベクター、例え
ばλＺＡＰ（PromegaBiotech社）等のλファージベクタ
ーまたはｐＧＥＭ２（PromegaBiotech社）等のプラスミ
ドベクターのＥｃｏＲＩ切断部位に常法に従い挿入して
組換えλファージＤＮＡ群または組換えプラスミドＤＮ
Ａ群を得る。あるいはMarathon^TM cDNA Amplification
kitの場合はメーカーが推賞するベクターとつなぐこと
により効率よく組み換え体を得ることができる。あるい
はＰＣＲ反応で断片を取得する場合はＰＣＲ反応により
増幅されたＤＮＡの断片がその末端に特異的にＡが付加
されるために、それに相補的にＴを付加したベクター、
例えばｐＣＲＩＩ（Invitrogen社）やｐＴ７（Novagen
社）などのベクターを用いることによりできる。

【００１９】このようにして得られた組換えλファージ
ＤＮＡ群を材料とし、市販の例えばギガパック・ゴール
ド（プロメガ・バイオテック社）などのイン・ビトロ・
パッケージング・キットを説明書に従い使用し、いわゆ
るイン・ビトロ・パッケージングを行い、組換えλファ
ージＤＮＡを有するλファージ粒子を得ることが出来
る。得られたλファージ粒子を常法、例えばT. Maniati
sらの方法（「MolecularCloning」 Cold Spring Harbor L
aboratories刊 1982年）に従い、宿主、例えば、大腸菌
に形質導入し、増殖させることによりファージｃＤＮＡ
ライブラリーを作ることが出来る。また、組換えプラス
ミドＤＮＡ群では常法に従い、宿主、例えば、大腸菌を
形質転換し、増殖させる。これにより、プラスミドｃＤ
ＮＡライブラリーを得ることができる。

【００２０】ｈＢＨＦ１ｃＤＮＡの取得は、既知のラッ
トＢＨＦ１遺伝子の配列（Biochemical and Biophysica
l Research Communications 221, 199-204 (1996)）を
基にＰＣＲプライマーを設計し、いわゆるＰＣＲ法にて
ヒトＢＨＦ１遺伝子の一部を取得することもできる。そ
の場合ＰＣＲ法に用いる鋳型には前述のファージｃＤＮ
Ａライブラリー、プラスミドｃＤＮＡライブラリーの他
にヒト小脳より抽出したＲＮＡを基に常法に従い合成し
たｃＤＮＡを直接用いることもできる。ＰＣＲ反応の反
応後、反応液をアガロースやポリアクリルアミドゲルで
解析し、二種類のプライマーにより増幅されるＤＮＡ断
片の中から、予想される大きさの断片を回収、精製し、
市販の、例えばｐＣＲＩＩの様なＰＣＲ断片を直接組み
込むことが出来るベクターにつなぎ、大腸菌を形質転換
することにより塩基配列の解析に供することができる。
さらに、得られたｈＢＨＦ１遺伝子の部分配列を基に新
たにＰＣＲプライマーを設計、合成し、これと、ｈＢＨ
Ｆ１の配列を基に設計したＰＣＲプライマー、あるいは
ｃＤＮＡを合成する際に用いるプライマーに対して相補
的な配列のプライマー、またはｃＤＮＡの両端に付加し
たアンカー配列に対応するＰＣＲ用プライマー、ｃＤＮ
Ａが組み込まれたベクターに対するプライマーとの間で
ＤＮＡの増幅を繰り返し行うことによりｈＢＨＦ１の全
長をコードする遺伝子を取得することもできる。

【００２１】また、ファージｃＤＮＡライブラリー、プ
ラスミドｃＤＮＡライブラリーを常法に従い、宿主、例
えば、大腸菌を形質転換し、増殖させる。次にこれらフ
ァージあるいは大腸菌を例えばジーンスクリーニングプ
ラス（Dupon社）などのナイロン膜あるいはニトロセル
ロース膜上に移し取り、アルカリ存在下で蛋白を除き、
λファージＤＮＡあるいはプラスミドＤＮＡにしたもの
に対して、前述の方法で増幅されたＣｈＭ遺伝子の部分
断片から常法に従い、あるいは市販のキット等により作
製した［³²Ｐ］標識プローブとこれらｃＤＮＡクローン
のＤＮＡ群とをハイブリダイズさせプラークハイブリダ
イゼーション法によって選択し、目的とするヒトＢＨＦ
１遺伝子をコードするｃＤＮＡクローンをの全部または
一部得ることもできる。

【００２２】ＰＣＲ反応の反応後、ＤＮＡの断片はアガ
ロースやポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動によ
り解析、回収、精製し、前述の例えばｐＣＲ−ＩＩの様
なＰＣＲ断片を直接組み込むことが出来るベクターに挿
入後に大腸菌を形質転換し、常法に従いＤＮＡを調製
し、Sangerらのジデオキシ法［Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol.74, 5463(1977)］によって目的ＤＮＡ断片の
塩基配列が決定できる。配列の決定はＡＢＩ３７３Ａ
（アプライド・バイオ・システムズ社）の様な自動シー
クエンサーによって行うこともできる。

【００２３】またファージライブラリーやプラスミドラ
イブラリーから得られたクローンの場合、自動シークエ
ンサーが塩基配列を決定できる長さには限界があるた
め、ベクターに挿入されたｃＤＮＡの全領域を一度に解
析することは難しい。そこで、断片を適当な制限酵素で
切断し、ゲル電気泳動で分離、回収し、回収された断片
を然るべきベクターに挿入し直すことにより解析を容易
にすることができる。このような操作をサブクローニン
グと呼ぶが、サブクローニング以外にも、自動シークエ
ンサーが決定した塩基配列の中から適当な配列を選び、
新たなプライマーを設計し、そこから先を継続して解析
する事ができる。このようにして決定されるＤＮＡ断片
の配列を互いに重なるように、かつ、コード領域の全長
をカバーするようにつなぎ合わせることにより、３５６
個のアミノ酸からなるｈＢＨＦ１前駆体タンパク質をコ
ードするＤＮＡが得られる。前述したように、本発明の
ＤＮＡを利用してｈＢＨＦ１タンパク質を発現させる場
合は、この前駆体タンパク質を発現させてもよく、３３
８アミノ酸からなる成熟タンパク質を直接発現させても
よい。

【００２４】さらに、本発明によるＤＮＡ断片は配列表
の配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするものに限
らず、インスリン遺伝子のｍＲＮＡの産生を調節する活
性を持つ限りは、そのアミノ酸配列を改変したものも含
まれる。そのような改変されたＤＮＡは、例えば部位特
異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置
換若しくは付加されるように本発明のＤＮＡの塩基配列
を改変することによって得られる。

【００２５】また、本発明のＤＮＡ又はこれを有する細
胞に変異処理を行い、これらのＤＮＡ若しくは細胞か
ら、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のう
ち、少なくとも塩基番号１３８〜１１５１からなる塩基
配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズするＤＮＡを選択することによっても、改変
されたＤＮＡを得ることができる。ここでいう「ストリ
ンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッ
ドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない
条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難で
あるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば
完全にマッチしたハイブリッドのＴｍ±１５℃、あるい
は７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダ
イズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイ
ズしない条件が挙げられる。

【００２６】上記のようにして得られる、特定の部位又
は未知の部位が変異した改変ＤＮＡ断片を、適当な細胞
で発現させ、その発現産物について、インスリン遺伝子
のｍＲＮＡの産生を調節する活性を調べ、この活性を有
するタンパク質をコードするＤＮＡを選択することによ
り、目的のＤＮＡを取得することができる。

【００２７】上記のようにして得られる、ｈＢＨＦ１蛋
白の一部または全部をコードするＤＮＡ断片は、その両
端あるいはどちらかの末端を改変し、またはそのまま、
公知の発現ベクターにそれ自体公知の方法でプロモータ
ーの下流に挿入され、次いで上記のＤＮＡが挿入された
発現ベクターは、大腸菌、酵母、動物細胞宿主等、公知
の細胞中にそれ自体公知の方法により導入される。

【００２８】本発明のｈＢＨＦ１タンパク質の産生方法
につき詳細に説明すると、発現ベクターとしては上記の
ようにして得られたｈＢＨＦ１タンパク質をコードする
ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している
ものが使用される。ｈＢＨＦ１の工業生産のためには、
安定した宿主−ベクター系を構築すること、さらに生物
学的に活性の有するｈＢＨＦ１を発現しうる系を用いる
必要がある。ｈＢＨＦ１は多くのシステインを含み、そ
のリフォールディングが生理活性の獲得に重要である。
一般的にはリフォールディングを考慮した場合、宿主と
しては動物細胞を用いることが多い。しかし、天然のｈ
ＢＨＦ１は糖蛋白質ではないこと、また生産量の優位性
から、生理活性を確保できるのであれば大腸菌での生産
も可能である。

【００２９】動物細胞としては例えばＣＨＯ細胞、ＣＯ
Ｓ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、マウスＦ
Ｍ３Ａ細胞等が挙げられる。またこれらの細胞を宿主と
する場合は、前駆体タンパク質の形でｈＢＨＦ１遺伝子
を導入することにより、成熟型になったｈＢＨＦ１が分
泌生産されるという利点が期待される。これらの細胞を
宿主とした発現用プラスミドは、プロモーターとしては
ＳＶ４０プロモーターまたはメタロチオネイン遺伝子の
プロモーターが好ましい。この下流にシグナル配列を含
むｈＢＨＦ１遺伝子を５’側から挿入する。またｈＢＨ
Ｆ１の生産量を上げるためｈＢＨＦ１遺伝子を５’側か
ら２〜３個つなげたものを挿入してもよいし、各ｈＢＨ
Ｆ１遺伝子の５’側にＳＶ４０などのプロモーターを挿
入したものを２〜３個つなげてもよい。このｈＢＨＦ１
遺伝子の下流にはポリアデニル化部位が含まれる。例え
ばＳＶ４０ＤＮＡ、β−グロビン遺伝子またはメタロチ
オネイン遺伝子由来のものが挙げられる。

【００３０】この発現ベクターには動物細胞例えばＣＨ
Ｏ細胞に形質転換した際の選択マーカーを有している場
合とそうでない場合の両者があげられる。選択マーカー
としては、メトトレキセート耐性を与えるＤＨＦＲ遺伝
子、３’―デオキシストレプタミン抗生物質Ｇ−４１８
などが挙げられ、各耐性遺伝子の５’側には例えばＳＶ
４０由来のプロモーターが挿入されており、各耐性遺伝
子の３’側には、ポリアデニル化部位が含まれる。ｈＢ
ＨＦ１の発現ベクターにこれらの耐性遺伝子を挿入する
場合、ｈＢＨＦ１遺伝子のポリアデニル化部位下流に挿
入すればよい。かかる発現ベクターは、形質転換体の選
択マーカーがなくてもよい。この場合、ｈＢＨＦ１の発
現ベクターと共に形質転換体の選択のマーカーを有する
ベクター例えばｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＭ
ＴＶｄｈｆｒなどを二重形質転換してやればよい。

【００３１】この二重形質転換法によってｈＢＨＦ１発
現ベクターで形質転換した動物細胞を選択するために
は、上記した選択マーカーの発現による表現形質によ
り、ｈＢＨＦ１形質転換細胞を選択することが可能であ
る。さらにｈＢＨＦ１の発現量の上昇を目的として、二
重形質転換法にてｈＢＨＦ１の発現が確認された細胞に
対し、選択マーカーを変更し二重形質転換を繰り返して
もよい。発現ベクターに使用されるプラスミドベクター
の具体例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、ウサギ
のβ−グロビン遺伝子に由来するスプライス配列ＤＮ
Ａ、ウサギのβ−グロビン遺伝子からのポリアデニル化
部位、ＳＶ４０初期領域からのポリアデニル化部位、並
びにｐＢＲ３２２由来の複製開始点およびアンピシリン
耐性遺伝子を含有するｐＫＣＲ（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,78,1528 (1981)）などが挙げられる。

【００３２】発現ベクターの動物細胞への移入はリン酸
カルシウムによるトランスフェクション法が一般的であ
る。形質転換された動物細胞の培養は、常法により浮遊
培養または付着培養で行うことができる。培地として
は、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０などを用い、５〜１０％
血清存在下もしくは適当量のインスリン、デキサメサゾ
ン、トランスフェリンの存在下、もしくは無血清下にて
培養する。ｈＢＨＦ１を発現している動物細胞はその培
養上清中にｈＢＨＦ１を分泌するものと考えられ、かか
る組換え体の培養上清を用いｈＢＨＦ１の分離精製を行
うことが可能である。生産されたｈＢＨＦ１を含む培養
上清は各種クロマトグラフィー例えば、ヘパリンセファ
ロースもしくはブルーセファロース等を用いたクロマト
グラフィーにより精製可能である。

【００３３】また大腸菌、枯草菌等の微生物を宿主とす
るときには、発現ベクターはプロモーター、リボゾーム
結合（ＳＤ）配列、ｈＢＨＦ１タンパク質遺伝子、転写
終結配列、およびプロモーターを制御する遺伝子より成
ることが好ましい。プロモーターとしては、大腸菌、フ
ァージ等由来のもの、例えばトリプトファン合成酵素
（ｔｒｐ）、ラクトースオペロン（ｌａｃ）、ラムダフ
ァージＰＬ、ＰＲ、Ｔ５ファージの初期遺伝子のプロモ
ーターであるＰ２５、Ｐ２６プロモーター等が挙げられ
る。また、これらは例えばｐａｃプロモーター［Agric.
Biol.Chem., Vol.52, 983-988(1988)］のように独自に
改変、設計された配列でも良い。

【００３４】リボゾーム結合配列としては、大腸菌、フ
ァージ等由来のものでも良いが、ＤＮＡ合成により作成
した１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端領域に相補的な
配列を４塩基以上連続してもつコンセンサス配列を持っ
たものでも良い。転写終結配列は必ずしも必要ではない
が、ρ非依存性のもの、例えばリボプロテインターミネ
ーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等を有している
方が好ましい。

【００３５】更にこれらの発現に必要な因子の発現プラ
スミド上での配列順序は、５’上流から、プロモータ
ー、ＳＤ配列、ｈＢＨＦ１タンパク質遺伝子、転写終結
因子の順に並ぶ事が望ましい。また発現ベクター上のＳ
Ｄ配列とｈＢＨＦ１タンパク質遺伝子とのユニットを複
数個同方向に挿入することにより、ベクター上の転写単
位のコピー数を増加させる方法（特開平１−９５７９８
号公報）を用いることもできる。

【００３６】組換え蛋白の大腸菌からの回収、精製を容
易にするために種々のアフィニティーカラムを利用する
こともできる。例えばヒスチジンが６個以上並んだアミ
ノ酸配列、いわゆるヒスチジンタグを有する蛋白質がキ
レートカラムに結合する性質を利用し、プロモーターの
下流にこのヒスチジンが６個以上並んだアミノ酸配列を
置き、その下流にｈＢＨＦ１をつなぐことにより蛋白の
発現後キレートカラムにより容易に精製が可能となる。
さらにヒスチジン配列とｈＢＨＦ１の配列の間に例えば
ＴＥＶプロテアーゼや第１０因子により特異的に切断さ
れる配列を組み込むことによりキレートカラム精製後に
蛋白質を天然型と同じ配列に戻し回収することができ
る。プロテアーゼによる切断後はＨＰＬＣ等により分
離、精製することができる。

【００３７】発現ベクターとして使用できるものとして
は、ｐＵＡＩ２（特開平１−９５７９８号公報）や市販
のｐＫＫ２３３−２（Pharmacia社）等がある。また、
融合蛋白として発現させる発現ベクターｐＧＥＸシリー
ズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ヒスチジン配列を利用し
た精製が可能なベクターとしてはｐＰＲＯＥＸ−Ｉが同
様にして使用できる。宿主の形質転換法としては、常法
に従い行うことができる。

【００３８】形質転換体の培養は、公知の常法に従って
行うことができる。培養温度としては、２８℃〜４２℃
が適当である。ラクトースオペロン（ｌａｃ）のプロモ
ーターを利用する場合は、菌体培養液の６００ｎｍの波
長における吸光度がおよそ０．５になったところで、終
濃度が１ｍＭ程度になるようにＩＰＴＧを加え発現誘導
を行うことが必要である。

【００３９】昆虫細胞としては、例えばＩｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ社のバキュロウイルス発現マニュアルであるマッ
クスバック（MAXBAC^TM； BACULOVIRUS EXPRESSION SYST
EM MANUAL VERSION 1.4）に従い、このキットを使用す
る。この時、発現量を上げるためにポリヘドリンのプロ
モーターから開始コドンまでの距離を変えることが好ま
しい。

【００４０】上記形質転換体を培養して得られるｈＢＨ
Ｆ１タンパク質は、公知の方法で宿主から単離・精製さ
れる。大腸菌等の微生物、昆虫細胞、および動物細胞で
発現させて得られる該組換えポリペプチドは、例えばｈ
ＢＨＦ１の一部配列を含む合成ペプチドに対するウサギ
抗血清との免疫学的反応性によりｈＢＨＦ１であること
が確認される。かかる方法としては、常法であるウェス
タンブロッティング法が利用できる。

【００４１】本発明のｈＢＨＦ１は、医薬組成物とし
て、具体的にはそれ自体、糖尿病治療薬として用いられ
る。また、ｈＢＨＦ１の活性を利用して糖尿病治療薬の
開発の為のインスリン生産能の測定系を作製することが
できる。さらに、ｈＢＨＦ１遺伝子の塩基配列から適当
なプライマーＤＮＡやプローブＤＮＡを作製することに
より該遺伝子の異常に伴う糖尿病の診断、あるいは中枢
神経系の疾患の診断を行うことができる。

【００４２】

【実施例】以下の実施例により、本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実
施例によって限定されるものではない。

【００４３】実施例１ ヒト小脳ｃＤＮＡライブラリー
の作製 ＲＮＡの調製は、Chirgwinらの方法を若干変更して行っ
た。すなわち、ヒト小脳２０ｇを液体窒素中で粉砕し、
グアニジンイソチオシアネート溶液（６Ｍ グアニジン
イソチオシアネート（和光純薬）、５ｍＭ クエン酸ナ
トリウム（和光純薬）、０．１Ｍ ２−メルカプトエタ
ノール、０．５％ザルコシン酸ナトリウム（和光純
薬）、 ｐＨ７．０］中でホモジナイズした。ホモジネ
ート２．５ｍｌあたり１ｇの塩化セシウム（和光純薬）
を加え、溶解した。あらかじめ、ホモジネート２５ｍｌ
に対して１５ｍｌの塩化セシウム溶液（５．７Ｍ塩化セ
シウム、０．１Ｍ ＥＤＴＡ）を遠沈管に用意した。こ
れに、前述のホモジネートを積層した。これを５５、０
００×ｇで遠心分離してトータルＲＮＡを沈澱として回
収した。回収したトータルＲＮＡを滅菌脱塩水に溶解
し、フェノ−ル／クロロホルム抽出を行った。すなわ
ち、トータルＲＮＡ溶液と等容量のフェノ−ル（和光純
薬）／クロロホルム（和光純薬）／イソアミルアルコー
ル（和光純薬）混液（２４対２５対１、体積比）を混和
し、１５、０００×ｇ、１０分間の遠心分離により上清
の水層を回収した。回収した水層と１／１０容量の３Ｍ
酢酸ナトリウム（和光純薬）溶液を混和後、２倍容量の
エタノールを添加して１５、０００×ｇ、１０分間の遠
心分離を行い、エタノール沈澱によるトータルＲＮＡの
回収を行った。回収したトータルＲＮＡを乾燥させた
後、１０ｍｌの滅菌脱塩水に溶解した。

【００４４】ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡの精製は、以下の
ように行った。すなわち、１０ｍｇのトータルＲＮＡを
終濃度が１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ
７．５）になるように調製し、７０℃、５分間の熱処理
後、氷上で急冷した。これに、５ＭＮａＣｌ溶液を終濃
度が０．５Ｍになるように加えて、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）
セルロースカラム（ｔｙｐｅ７、１ｃｍ×１ｃｍ、Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ社）に展開し、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび
０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）でカラムを洗浄後、滅菌脱塩水にて結合
分画を溶出して約１００μｇのｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡ
を得た。

【００４５】ｃＤＮＡの合成は、ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮ
Ａ １０ mｇを鋳型に用いた。反応は、cDNA synthesis
module（Amersham社）に添付された逆転写酵素、リボヌ
クリアーゼＨ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼにて説明書に
従って行い、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、同じく
cDNA synthesis module（Amersham社）に添付されたＴ
４ＤＮＡポリメラーゼにてｃＤＮＡ末端の平滑化を行っ
た。反応後、フェノ−ル／クロロホルム抽出を行い、上
清の水層を回収した。回収した水層と等容量の５Ｍ酢酸
アンモニウム溶液を添加後、２倍容量のエタノールを混
和した。次に、１５、０００×ｇ、１０分間の遠心分離
を行い、エタノール沈澱によるｃＤＮＡの回収を行っ
た。回収したｃＤＮＡを乾燥した後、２０ mｌの滅菌脱
塩水に溶解した。次に、１０ mｌのｃＤＮＡ（約２ m
ｇ）を分取して、その末端にＥｃｏＲＩアダプター（宝
酒造）を付加した。すなわち、２０ mｌのＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ反応液「６６ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．６）、６．６ｍＭＭｇＣｌ２（和光純薬）、１０ｍ
Ｍ ジチオスレイトール（ＤＴＴ、和光純薬）、６６マ
イクロＭ アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ、ＳＩＧ
ＭＡ社）」中で３５０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒
造）と１６℃、２時間インキュベーションして、２００
ｐｍｏｌのＥｃｏＲＩアダプターをｃＤＮＡの末端に
結合した。

【００４６】反応物を常法に従いＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ
−２００カラム（１ｃｍＸ４ｃｍ）に展開し、１ｍＭ
ＥＤＴＡと０．５ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ トリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて、末端にＥｃｏＲＩアダ
プターを付加したｃＤＮＡを溶出した。溶出したｃＤＮ
Ａをエタノール沈澱で回収し、沈澱を乾燥後、２ mｌの
滅菌脱塩水に溶解した。次に、あらかじめ制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ（宝酒造）で消化後、末端を脱リン酸化したλｇ
ｔ１０ファージＤＮＡ（Clontech社） １ mｇと、Ｅｃ
ｏＲＩアダプターを付加したｃＤＮＡ ４００ｎｇを、
５ mｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ反応液中で、１６℃、１８
時間インキュベーションしてＴ４ ＤＮＡリガーゼにて
結合した。さらに、ｃＤＮＡと結合したλｇｔ１０ファ
ージＤＮＡをＧｉｇａｐａｃｋ ＩＩ Ｇｏｌｄ（Strata
gene社）を用いてファージ粒子へパッケージングした。

【００４７】得られたファージ粒子を常法に従い大腸菌
Ｃ６００ｈｆｌＡ株に感染、増幅を行い、ファージ粒子
を回収した。一連の操作により、１００ ｎｇのｃＤＮ
Ａ あたり約２００万のファージクローンを得た。

【００４８】実施例２ ライブラリーのスクリーニング 前述のライブラリーのスクリーニングを常法に従って行
った。すなわち、２４．５ｃｍ×２４．５ｃｍのシャー
レ内の１．５％ＮＺＹ寒天培地に重層されたＮＺＹ軟寒
天培地（［ＮＺＹ培地；１％ＮＺ−アミン、０．５％イ
ーストイクストラクト、０．５％塩化ナトリウム溶液を
ｐＨ７．５に調整し、０．２５％硫酸マグネシウムを加
えたもの］、［１．５％ＮＺＹ寒天培地；ＮＺＹ培地に
１．５％になるように寒天沫を加えオートクレーブした
もの］、［ＮＺＹ軟寒天培地；ＮＺＹ培地に０．７％に
なるように寒天沫を加えオートクレイブしたもの］）中
で約１００万クローンのファージを、シャーレ一枚あた
り２０万クローンの割合で大腸菌Ｃ６００ｈｆｌＡ株に
感染させ３７℃で一晩培養した。次に市販のニトロセル
ロース膜であるＢＡ８５（Ｓ＆Ｓ社）を軟寒天培地上に
かぶせて静かにはがすことにより培地中のλファージク
ローンをニトロセルロース膜上に移し取り、以下に説明
するプラークハイブリダイゼーションを行った。

【００４９】すなわち、一枚のシャーレあたりニトロセ
ルロース膜２枚の割合で前述の軟寒天培地上にかぶせフ
ァージ粒子を移し取り、培地との間に印をつけておい
た。この印は２枚のニトロセルロース膜で等しくつけて
おいた。その様にしてできたニトロセルロース膜を０．
２Ｍ水酸化ナトリウム−１．５Ｍ塩化ナトリウムが染み
込んだろ紙上に２分間静置し、別に用意した乾いたろ紙
上で水分を除いた後、次に、同様に２×ＳＳＣＰ（２倍
の濃度のＳＳＣＰ溶液のこと、以下同様の表記方法をと
る。１０×ＳＳＣＰは１．２Ｍ塩化ナトリウム、１５０
ｍＭクエン酸ナトリウム、１３０ｍＭ燐酸二水素カリウ
ム、１ｍＭＥＤＴＡ ｐＨ７．２）− ０．２Ｍトリス
−塩酸（ｐＨ７．４）を染み込ませたろ紙上で、このニ
トロセルロース膜を静置し、乾いたろ紙上で風乾した
後、同じ操作を再び繰り返した。

【００５０】このようにして処理したニトロセルロース
膜を８０℃で２時間加熱することにより膜上に核酸を固
定した。次に膜を３×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは２０倍の
濃度のＳＳＣ溶液；３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエ
ン酸ナトリウム）−０．１％ＳＤＳで６０℃１５分間２
回洗浄し、次にニトロセルロース膜１枚当り５ｍｌのハ
イブリダイゼーション液（３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤ
Ｓ、１０×Ｄｅｎｈａｌｔ［５０×Ｄｅｎｈａｌｔは５
０倍の濃度のＤｅｎｈａｌｔ溶液；１％牛血清アルブミ
ン、１％ポリビニルピロリドン、および１％フィコール
４００］、２０μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡ、１０％硫酸デ
キストラン）に６５℃で３時間保温した。

【００５１】次に、既に川上らにより全構造が決定され
ている（Biochemical and Biophysical Research Commu
nications 221, 199-204 (1996)）ラットＢＨＦ１ｃＤ
ＮＡを鋳型に常法に従って作製した³²Ｐ標識ＤＮＡを、
鋳型ＤＮＡ換算で５ｎｇ／ｍｌの濃度になるようハイブ
リダイゼーション液に加えた後、５５℃で１８時間保温
した。その後、ニトロセルロース膜を取り出し、３×Ｓ
ＳＣ−０．１％ＳＤＳ溶液中で室温で３０分間洗いこれ
を２回繰り返した。次に、０．２×ＳＳＣ−０．１％Ｓ
ＤＳ溶液で５５℃で１５分間洗い、これを２回繰り返し
た後に膜を乾かしオートラジオグラフィーをとった。こ
のようにして、２枚１組のニトロセルロース膜のオート
ラジオグラフィー上のシグナルが一致したものは１個あ
った。

【００５２】得られたシグナルに相当するクローンを単
離するために、これらシグナルと一致する軟寒天培地上
のプラークをガラス管で打ち抜き、５０μｌのクロロフ
ォルム存在下１ｍｌのＴＭＧ緩衝液［５０ｍＭトリス−
塩酸ｐＨ７．５、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ
塩化マグネシウムおよび０．０１％ゼラチン］中でファ
ージ粒子を一晩抽出し、常法に従い大腸菌Ｃ６００ｈｆ
ｌＡ株に感染させ、９ｃｍシャーレ中で適当量培養し、
前述の方法の様にプラークハイブリダイゼーションを行
った。この一連の操作を繰り返すことによりシグナルに
相当するクローンを純化することができた。その結果、
独立した１個のクローンλｈＢＨＦ１Ｓを得た。

【００５３】実施例３ λｈＢＨＦ１ＳファージＤＮＡ
からのコード領域を含むＤＮＡ断片のサブクローニング
および塩基配列の決定 （１）コード領域を含むＤＮＡ断片のサブクローニング 前述の実施例２で得られたファージクローンλｈＢＨＦ
１Ｓから以下のようにＤＮＡを抽出し、プラスミドベク
ターｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９にＤＮＡ断片をサブクロー
ニングした。即ち、５００ｍｌの三角フラスコ中の２０
０ｍｌのＮＺＹ培地中において、２００μｌのＴＭＧ溶
液に懸濁してあるλファージクローン２×１０⁷p.f.u.
（p.f.u.；プラーク形成単位）と４０μｌの大腸菌Ｐ２
−３９２株２×１０⁸個を３７℃１５分置くことにより
感染させた。１５分後さらに１ｍｌの１Ｍ塩化カルシウ
ムを加え一晩、概ね１４時間ほど培養した。次に、２ｍ
ｌのクロロフォルムを加え１０分ほど置き、１５．８ｇ
の塩化ナトリウムを加えて溶かし、それらを４℃におい
て日立冷却遠心機ＳＣＲ２０ＢＢで、ローターＲＰＲ９
−２を用いて６０００回転２０分間遠心した上清に２０
ｇのポリエチレングリコール６０００を加えて十分に溶
解した後に、氷中で１時間静置した。

【００５４】これを日立冷却遠心機ＳＣＲ２０ＢＢで、
ローターＲＰＲ９−２を用いて６０００回転２０分間遠
心し、沈澱を６ｍｌのＡ緩衝液［０．５％ ＮＰ４０(No
nidet P40)、３６ｍＭ塩化カルシウム、３０ｍＭトリス
−塩酸ｐＨ７．５ ５０ｍＭ塩化マグネシウム、１２５
ｍＭ塩化カリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５％
ＤＯＣ、０．６ｍＭメルカプトエタノール］に懸濁し、
ここに１００μｌの１０ｍｇ／ｍｌのデオキシリボヌク
レアーゼＩと１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌのリボヌクレア
ーゼＡを加え３０℃で３０分間保温することにより大腸
菌由来の核酸を分解した。その後上記反応液に等量のク
ロロフォルムを加え良く撹はんした後に、トミー遠心機
ＬＣ−０６、ローター ＴＳ−７で３０００回転１０分
間遠心し、上清を取った。

【００５５】一方、予め日立超遠心機ローターＲＰＳ４
０Ｔ用遠心管に４０％グリセロール溶液［０．５％ＮＰ
４０、３０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５、１２５ｍＭ塩
化カリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．６ｍＭメルカ
プトエタノール、４０％グリセロール］を１ｍｌ入れて
おき、その上に３ｍｌの１０％グリセロール溶液［０．
５％ＮＰ４０、３０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５ 、１
２５ｍＭ塩化カリウム、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．６
ｍＭメルカプトエタノール、１０％グリセロール］を重
層して準備しておいた上に、先ほどのヌクレアーゼ処理
をしたファージ懸濁液を重層し、日立超遠心機７０Ｐ７
２、ローターＲＰＳ４０Ｔで３５０００回転１時間遠心
した。遠心後、沈澱として落ちてきたファージ粒子を
０．４ｍｌの４０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５、１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、２％ＳＤＳに懸濁し４μｌの１０ｍｇ／
ｍｌのプロテナーゼＫを加えて５５℃１時間保温を行っ
た。その後溶液をエッペンド ルフチューブに移し、等
量のフェノール／クロロフォルムにてファージＤＮＡを
抽出しエタノール沈澱を行うことにより、目的とするフ
ァージＤＮＡを２００μｇ得ることが出来た。

【００５６】このファージＤＮＡ１０μｇ（１０μｌ）
を２０ユニットの制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造）にて、
メーカーの指定する制限酵素緩衝液中で３７℃で３時間
反応させた後、常法に従いアガロース電気泳動法を行っ
た。その結果ベクターＤＮＡ以外に１本のインサートＤ
ＮＡを確認した。泳動後、アガロースゲルから挿入ＤＮ
Ａ断片を常法に従い回収することにより、目的とするＤ
ＮＡ断片を分離精製することが出来た。このＤＮＡ断片
約１００ｎｇを、予め常法に従い制限酵素ＥｃｏＲＩに
よって切断しておいたｐＵＣ１９プラスミドベクター２
００ｎｇと１０μｌの反応液［６６ｍＭトリス−塩酸ｐ
Ｈ７．６、６．６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチ
オスレイトール、６６μＭＡＴＰ、基質ＤＮＡ］中で
３５０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合し、そ
の反応液１μｌを用いて、東洋紡績社製の大腸菌ＪＭ１
０９株のコンピテントセル（ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ ＨＩ
ＧＨ）をトランスフォームし、直径９ｃｍのシャーレ中
の寒天培地に菌液を塗布した。この際、寒天培地として
は、アンピシリン（アンピシリン、和光純薬）を終濃度
５０ μｇ／ｍｌ、５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ、Si
gma社）を終濃度０．００４％、イソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Sigma社）を終
濃度１ｍＭの濃度で含有した１．５％ ＬＢ寒天培地
［１．５％ 寒天（和光純薬）、１％ バクトトリプトン
（Difco社）、０．５％ 酵母抽出物（Difco社）、０．
５％ ＮａＣｌ］（以下、Ｘ−Ｇａｌ−ＩＰＴＧ−ＬＢ
−アンピシリン寒天培地という）を用いた。培養は３７
℃で１８時間行った。培養後、Ｘ−Ｇａｌ−ＩＰＴＧ−
ＬＢ−アンピシリン寒天培地上に出現した耐性菌で、か
つＸ−Ｇａｌにより発色していないコロニーを１００個
選択し、各々５ｍｌの、５０ μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含むＬＢ培地（１％ バクトトリプトン、０．５％
酵母抽出物、０．５％ＮａＣｌ）中で３７℃、１２時
間、振とう培養した。

【００５７】次に、常法に従い、プラスミドＤＮＡを調
製した。すなわち、菌体を１０，０００×ｇ、１０分間
の遠心分離により回収した。回収した菌体を、培地の１
／２５容量の、１ ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（生化学工
業）を含む溶液Ｉ ［５０ｍＭＤ（＋）−グルコース
（和光純薬）、２５ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ］に懸濁した。菌体懸濁液を
氷上に１０分間静置後、溶液Ｉの２倍容量の溶液II（１
％ ＳＤＳ、０．２ Ｎ ＮａＯＨ）を添加し、穏やかに
混和後、氷上にさらに１０分間静置した。次に、溶液Ｉ
の１．５倍容量の溶液III（６０ｍｌの５Ｍ酢酸カリウ
ムに１１．５ｍｌの酢酸と２８．５ｍｌの滅菌脱塩水を
混和した溶液）を添加し、氷上に１５分間静置した。静
置後、１０，０００×ｇ、１０分間の遠心分離により上
清を回収し、上清の２／３容量のイソプロパノールを混
和して、氷上にさらに１０分間静置した。静置後、１
０，０００×ｇ、１０分間の遠心分離を行い、核酸を回
収した。核酸を乾燥後、培地の１／２５容量の、０．１
ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（Sigma社）を含むＴ
Ｅ緩衝 液 ［１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ］に溶解し、３７℃、３０分間インキュベーシ
ョンした。

【００５８】インキュベーション後、等容量のポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）溶液 ［２０％ ＰＥＧ ６０
００（和光純薬）、１．５Ｍ ＮａＣｌ］を混和し、ド
ライアイス上で３０分間静置した。次に、１５，０００
×ｇ 、１５分間遠心分離を行い、プラスミドＤＮＡを
回収した。回収したプラスミドＤＮＡを７０％ エタノ
ールで２回洗浄し、乾燥後、培地の１／５０容量のＴＥ
緩衝液に溶解し、フェノ−ル／クロロホルム抽出、エタ
ノール沈澱を行い、プラスミドＤＮＡを精製した。精製
したプラスミドＤＮＡ ０．５ μｇを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで消化し、１％ アガロース（岩井化学）ゲル電気泳
動で解析した。その結果、約１６５０ｂｐのｃＤＮＡ断
片を有する組換え体ｐｈＢＨＦ１Ｓを得た。

【００５９】（２）塩基配列の決定 組換え体ｐｈＢＨＦ１Ｓを４０ｍｌのＬＢ培地に播種
し、３７℃で１５時間培養して調製した培養液から、Ａ
ＢＩ社のシークエンサーの説明書に従いプラスミドＤＮ
Ａを調製した。調製したプラスミドＤＮＡを用いて、Ａ
ＢＩ３７３Ａ シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にてＳａｎｇｅｒ法による塩基配
列の決定を行った。なお、以下に行う塩基配列の決定は
全て本法を用いて行った。塩基配列の決定の結果、配列
表の配列番号１に記載の塩基配列を得た。

【００６０】（３）完全長ｈＢＨＦ１ｃＤＮＡの取得−
下流配列の取得（５’−ＲＡＣＥ法） ｐｈＢＨＦ１ＳのｃＤＮＡの解析の結果、ｐｈＢＨＦ１
Ｓは完全長ｃＤＮＡをコードしていないことが判明した
ので、完全長ｃＤＮＡを取得する目的で以下のRapid Am
plification of cDNA Ends（ＲＡＣＥ）法によるｃＤＮ
Ａの増幅を行った。

【００６１】ＲＮＡの調製は以下のように行った。ま
ず、ヒト小脳約２０ ｇを液体窒素中で粉砕し、１００
ｍｌのＲＮＡｚｏｌ溶液（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ社）中でホ
モジナイズした。次に、ホモジネートの１／１０容量の
クロロホルムを混和し、１０，０００×ｇで１０分間遠
心分離し、水層を回収した。水層と等容量のイソプロパ
ノールを混和し、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離
を行い、トータルＲＮＡを回収した。回収したトータル
ＲＮＡを乾燥させた後、１０ｍｌの滅菌脱塩水に溶解し
た。約２００ ｇの組織から約２０ ｍｇのトータルＲＮ
Ａを抽出した。次に、常法に従いＲＮＡの精製を行い、
１０ ｍｇのトータルＲＮＡから約１００μｇのｐｏｌ
ｙ（Ａ）⁺ＲＮＡを得た。

【００６２】得られたｍＲＮＡを鋳型に、Marathon^TM c
DNA Amplification kit（Clontech社）を用いて、ＲＡ
ＣＥ法によるｃＤＮＡの増幅を行った。以下の反応にお
いて、合成ＤＮＡプライマーは、MarathonTM cDNA Amp
lification kitに添付されたプライマー以外は、既に川
上らにより全構造が決定されている（Biochemical and
Biophysical Research Communications 221, 199-204
(1996)）ラットＢＨＦ１遺伝子の配列を基に、ＡＢＩ３
９４ ＤＮＡ合成機を用いて合成した。反応は、Maratho
n^TM cDNA Amplification kitに添付された緩衝液および
ｄＮＴＰを用いて行った。

【００６３】まず、ｃＤＮＡの合成を行った。精製した
ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡ １ μｇと、ｃＤＮＡ合成プラ
イマー、5'-TTCTAGAATTCAGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTT(G/A/C)(G/A/C/T)-3'（配列表配列番号３；
５２ヌクレオチド）を逆転写酵素にて３７℃で処理し、
第１鎖ｃＤＮＡを合成した。第２鎖伸長反応、末端の平
滑化を行い、ｃＤＮＡの両端へアダプタープライマー、
［5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-
3'（配列表配列番号４；４４ヌクレオチド）と5'-PO₄-A
CCTGCCC-NH₂-3'(８ヌクレオチド）］の結合を行った。
最終反応の反応液１０ μｌを希釈し５０ μｌとして、
以後の増幅反応に１ μｌを用いた。

【００６４】増幅反応は、ｈＢＨＦ１ ｃＤＮＡの配列
の一部と相補的なプライマー、５’−TGCAATCAGTCAGAGG
GCTTTCA-3'（配列表配列番号５；２３ヌクレオチド）お
よび５’末端に付加したアダプタープライマーと相補的
なプライマー、5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'
（配列表配列番号６；２７ヌクレオチド）を用い、Ｔａ
ｑ ＤＮＡポリメラーゼにて行った。反応液は、全量で
５０ μｌとした。反応は、９４℃、１分間のインキュ
ベーションの後、９４℃、３０秒間、６０℃、３０秒
間、６８℃、５分間のインキュベーションを３０サイク
ル行い、最後に７２℃、７分間のインキュベーションを
行って反応を終了した。反応液の１／１０を５％ ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）にて解析し
た。また、上記反応液のうち５μｌを５０倍希釈し、そ
の５ μｌを用いて２回目の増幅反応を行った。

【００６５】２回目の増幅反応は、１回目の増幅反応に
準じて行った。希釈反応液５ μｌを鋳型に、１回目の
増幅反応に用いたプライマーより内側に位置するプライ
マー、5'-TAGGGGTGTACAGGGAAGGAAGC-3'（配列表配列番
号７；２３ヌクレオチド）および5'-ACTCACTATAGGGCTCG
AGCGGC-3'（配列表配列番号８；２３ヌクレオチド）を
用いて、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼにて増幅反応を行
った。反応液は、全量で５０ μｌとした。反応は、９
４℃、１分間のインキュベーションの後、９４℃、３０
秒間、６０℃、３０秒間、６８℃、５分間のインキュベ
ーションを３０サイクル行い、最後に７２℃、７分間の
インキュベーションを行い反応を終了した。反応終了
後、反応液の１／１０を５％ ＰＡＧＥにて解析した。

【００６６】次に、約７５０ｂｐ付近に位置するゲル断
片から、増幅したｃＤＮＡ断片を回収、精製し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼにてプラスミドベクターｐＣＲＩＩ（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のクローニング部位に挿入して、
大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。Ｘ−Ｇａｌ−ＩＰ
ＴＧ−ＬＢ−アンピシリン寒天培地上に出現した耐性菌
で、かつＸ−Ｇａｌにより発色していない３つの形質転
換体について、常法に従いプラスミドＤＮＡを調製し、
解析を行った。さらに、調製したプラスミドＤＮＡを用
いて、ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。その結果、約８
０ｂｐの５’非翻訳領域の塩基配列を有するｈＢＨＦ１
の５’ｃＤＮＡ断片（約７２０ｂｐ）を持つ組換え体ｐ
ｈＢＨＦ１−５を得た。

【００６７】ｐｈＢＨＦ１−５の塩基配列を決定した結
果、翻訳開始コドンＡＴＧ（Ｍｅｔ）の存在を確認する
とともに、ＡＴＧ（Ｍｅｔ）の下流にｈＢＨＦ１配列を
確認した。ｐｈＢＨＦ１−５、ｐｈＢＨＦ１Ｓの配列か
ら、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の解明に成功
し、本発明のｈＢＨＦ１遺伝子の取得に至った。その結
果、シグナルペプチドを含むｈＢＨＦ１の全アミノ酸配
列は、配列表の配列番号２に示される配列であることが
確認された。

【００６８】

【発明の効果】本発明のｈＢＨＦ１遺伝子は新規な遺伝
子であり、それを用いることにより組換えｈＢＨＦ１を
安定に供給することができる。ｈＢＨＦ１は、種々の遺
伝子の転写調節に関与していることから、医薬品として
の利用が期待される。またｈＢＨＦ１の配列は糖尿病、
中枢神経系の疾患の診断に利用することができる。

【００６９】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：1844 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 生物名：ウシ（Bos taurus） 直接の起源 クローン名：ｐｈＢＨＦ１Ｓ、ｐｈＢＨＦ１−５ 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：84..1151 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：sig_peptide 存在位置：84..137 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：mat_peptide 存在位置：138..1151 特徴を決定した方法：S 配列 CGCAGGAGGC ACGGCGTCCG GAGGCCCCAG GGTTATGAGA CTATCACTGC TCAGGACCTA 60 CTAACAACAA AGGAAATCGA AAC ATG ACC AAA TCG TAC AGC GAG AGT GGG 110 Met Thr Lys Ser Tyr Ser Glu Ser Gly -18 -15 -10 CTG ATG GGC GAG CCT CAG CCC CAA GGT CCT CCA AGC TGG ACA GAC GAG 158 Leu Met Gly Glu Pro Gln Pro Gln Gly Pro Pro Ser Trp Thr Asp Glu -5 1 5 TGT CTC AGT TCT CAG GAC GAG GAG CAC GAG GCA GAC AAG AAG GAG GAC 206 Cys Leu Ser Ser Gln Asp Glu Glu His Glu Ala Asp Lys Lys Glu Asp 10 15 20 GAC CTC GAA GCC ATG AAC GCA GAG GAG GAC TCA CTG AGG AAC GGG GGA 254 Asp Leu Glu Ala Met Asn Ala Glu Glu Asp Ser Leu Arg Asn Gly Gly 25 30 35 GAG GAG GAG GAC GAA GAT GAG GAC CTG GAA GAG GAG GAA GAA GAG GAA 302 Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 40 45 50 55 GAG GAG GAT GAC GAT CAA AAG CCC AAG AGA CGC GGC CCC AAA AAG AAG 350 Glu Glu Asp Asp Asp Gln Lys Pro Lys Arg Arg Gly Pro Lys Lys Lys 60 65 70 AAG ATG ACT AAG GCT CGC CTG GAG CGT TTT AAA TTG AGA CGC ATG AAG 398 Lys Met Thr Lys Ala Arg Leu Glu Arg Phe Lys Leu Arg Arg Met Lys 75 80 85 GCT AAC GCC CGG GAG CGG AAC CGC ATG CAC GGA CTG AAC GCG GCG CTA 446 Ala Asn Ala Arg Glu Arg Asn Arg Met His Gly Leu Asn Ala Ala Leu 90 95 100 GAC AAC CTG CGC AAG GTG GTG CCT TGC TAT TCT AAG ACG CAG AAG CTG 494 Asp Asn Leu Arg Lys Val Val Pro Cys Tyr Ser Lys Thr Gln Lys Leu 105 110 115 TCC AAA ATC GAG ACT CTG CGC TTG GCC AAG AAC TAC ATC TGG GCT CTG 542 Ser Lys Ile Glu Thr Leu Arg Leu Ala Lys Asn Tyr Ile Trp Ala Leu 120 125 130 135 TCG GAG ATC CTG CGC TCA GGC AAA AGC CCA GAC CTG GTC TCC TTC GTT 590 Ser Glu Ile Leu Arg Ser Gly Lys Ser Pro Asp Leu Val Ser Phe Val 140 145 150 CAG ACG CTT TGC AAG GGC TTA TCC CAA CCC ACC ACC AAC CTG GTT GCG 638 Gln Thr Leu Cys Lys Gly Leu Ser Gln Pro Thr Thr Asn Leu Val Ala 155 160 165 GGC TGC CTG CAA CTC AAT CCT CGG ACT TTT CTG CCT GAG CAG AAC CAG 686 Gly Cys Leu Gln Leu Asn Pro Arg Thr Phe Leu Pro Glu Gln Asn Gln 170 175 180 GAC ATG CCC CCC CAC CTG CCG ACG GCC AGC GCT TCC TTC CCT GTA CAC 734 Asp Met Pro Pro His Leu Pro Thr Ala Ser Ala Ser Phe Pro Val His 185 190 195 CCC TAC TCC TAC CAG TCG CCT GGG CTG CCC AGT CCG CCT TAC GGT ACC 782 Pro Tyr Ser Tyr Gln Ser Pro Gly Leu Pro Ser Pro Pro Tyr Gly Thr 200 205 210 215 ATG GAC AGC TCC CAT GTC TTC CAC GTT AAG CCT CCG CCG CAC GCC TAC 830 Met Asp Ser Ser His Val Phe His Val Lys Pro Pro Pro His Ala Tyr 220 225 230 AGC GCA GCG CTG GAG CCC TTC TTT GAA AGC CCT CTG ACT GAT TGC ACC 878 Ser Ala Ala Leu Glu Pro Phe Phe Glu Ser Pro Leu Thr Asp Cys Thr 235 240 245 AGC CCT TCC TTT GAT GGA CCC CTC AGC CCG CCG CTC AGC ATC AAT GGC 926 Ser Pro Ser Phe Asp Gly Pro Leu Ser Pro Pro Leu Ser Ile Asn Gly 250 255 260 AAC TTC TCT TTC AAA CAC GAA CCG TCC GCC GAG TTT GAG AAA AAT TAT 974 Asn Phe Ser Phe Lys His Glu Pro Ser Ala Glu Phe Glu Lys Asn Tyr 265 270 275 GCC TTT ACC ATG CAC TAT CCT GCA GCG ACA CTG GCA GGG GCC CAA AGC 1022 Ala Phe Thr Met His Tyr Pro Ala Ala Thr Leu Ala Gly Ala Gln Ser 280 285 290 295 CAC GGA TCA ATC TTC TCA GGC ACC GCT GCC CCT CGC TGC GAG ATC CCC 1070 His Gly Ser Ile Phe Ser Gly Thr Ala Ala Pro Arg Cys Glu Ile Pro 300 305 310 ATA GAC AAT ATT ATG TCC TTC GAT AGC CAT TCA CAT CAT GAG CGA GTC 1118 Ile Asp Asn Ile Met Ser Phe Asp Ser His Ser His His Glu Arg Val 315 320 325 ATG AGT GCC CAG CTC AAT GCC ATA TTT CAT GAT TAGAGGCACG CCAGTTTCAC 1171 Met Ser Ala Gln Leu Asn Ala Ile Phe His Asp 330 335 CATTTCCGGG AAACGAACCC ACTGTGCTTA CAGTGACTGT CGTGTTTACA AAAGGCAGCC 1231 CTTTGGGTAC TACTGCTGCA AAGTGCAAAT ACTCCAAGCT TCAAGTGATA TATGTATTTA 1291 TTGTCATTAC TGCCTTTGGA AGAAACAGGG GATCAAAGTT CCTGTTCACC TTATGTATTA 1351 TTTTCTATAG CTCTTCTATT TAAAAAATAA AAAAATACAG TAAGTTTTAA AAAATACACC 1411 ACGAATTTGG TGTGGCTGTA TTCAGATCGT ATTAATTATC TGATCGGGAT AACAAAATCA 1471 CAAGCAATAA TTAGGATCTA TGCAATTTTT AAACTAGTAA TGGGCCAATT AAAATATATA 1531 TAAATATATA TTTTTCAACC AGCATTTTAC TACTTGTTAC CTTTCCCATG CTGAATTATT 1591 TTGTTGTGAT TTTGTACAGA ATTTTTAATG ACTTTTTATA ATGTGGATTT CCTATTTTAA 1651 AACCATGCAG CTTCATCAAT TTTTATACAT ATCAGAAAAG TAGAATTATA TCTAATTTAT 1711 ACAAAATAAT TTAACTAATT TAAACCAGCA GAAAAGTGCT TAGAAAGTTA TTGTGTTGCC 1771 TTAGCACTTC TTTCCTCTCC AATTGTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1831 AAAAAAAAAA AAA 1844

【００７０】配列番号：２ 配列の長さ: 356 配列の型: アミノ酸 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: タンパク質 配列 Met Thr Lys Ser Tyr Ser Glu Ser Gly Leu Met Gly Glu Pro Gln Pro -18 -15 -10 -5 Gln Gly Pro Pro Ser Trp Thr Asp Glu Cys Leu Ser Ser Gln Asp Glu 1 5 10 Glu His Glu Ala Asp Lys Lys Glu Asp Asp Leu Glu Ala Met Asn Ala 15 20 25 30 Glu Glu Asp Ser Leu Arg Asn Gly Gly Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu 35 40 45 Asp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Asp Gln Lys 50 55 60 Pro Lys Arg Arg Gly Pro Lys Lys Lys Lys Met Thr Lys Ala Arg Leu 65 70 75 Glu Arg Phe Lys Leu Arg Arg Met Lys Ala Asn Ala Arg Glu Arg Asn 80 85 90 Arg Met His Gly Leu Asn Ala Ala Leu Asp Asn Leu Arg Lys Val Val 95 100 105 110 Pro Cys Tyr Ser Lys Thr Gln Lys Leu Ser Lys Ile Glu Thr Leu Arg 115 120 125 Leu Ala Lys Asn Tyr Ile Trp Ala Leu Ser Glu Ile Leu Arg Ser Gly 130 135 140 Lys Ser Pro Asp Leu Val Ser Phe Val Gln Thr Leu Cys Lys Gly Leu 145 150 155 Ser Gln Pro Thr Thr Asn Leu Val Ala Gly Cys Leu Gln Leu Asn Pro 160 165 170 Arg Thr Phe Leu Pro Glu Gln Asn Gln Asp Met Pro Pro His Leu Pro 175 180 185 190 Thr Ala Ser Ala Ser Phe Pro Val His Pro Tyr Ser Tyr Gln Ser Pro 195 200 205 Gly Leu Pro Ser Pro Pro Tyr Gly Thr Met Asp Ser Ser His Val Phe 210 215 220 His Val Lys Pro Pro Pro His Ala Tyr Ser Ala Ala Leu Glu Pro Phe 225 230 235 Phe Glu Ser Pro Leu Thr Asp Cys Thr Ser Pro Ser Phe Asp Gly Pro 240 245 250 Leu Ser Pro Pro Leu Ser Ile Asn Gly Asn Phe Ser Phe Lys His Glu 255 260 265 270 Pro Ser Ala Glu Phe Glu Lys Asn Tyr Ala Phe Thr Met His Tyr Pro 275 280 285 Ala Ala Thr Leu Ala Gly Ala Gln Ser His Gly Ser Ile Phe Ser Gly 290 295 300 Thr Ala Ala Pro Arg Cys Glu Ile Pro Ile Asp Asn Ile Met Ser Phe 305 310 315 Asp Ser His Ser His His Glu Arg Val Met Ser Ala Gln Leu Asn Ala 320 325 330 Ile Phe His Asp 335

【００７１】配列番号：３ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号： 存在位置： 特徴を決定した方法： その他の情報：ＮはＧ、Ａ、ＣまたはＴを表す。 配列 TTCTAGAATT CAGCGGCCGC TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT VN 52

【００７２】配列番号：４ 配列の長さ：４４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTAATACGAC TCACTATAGG GCTCGAGCGG CCGCCCGGGC AGGT 44

【００７３】配列番号：５ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGCAATCAGT CAGAGGGCTT TCA 23

【００７４】配列番号：６ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC 27

【００７５】配列番号：７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TAGGGGTGTA CAGGGAAGGA AGC 23

【００７６】配列番号：８ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC 23

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/43 ＡＤＰ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
   ヒトＢＨＦ１をコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列のう
   ち、少なくともアミノ酸番号１〜３３８からなるアミノ
   酸配列を有するタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、
   少なくともアミノ酸番号１〜３３８からなるアミノ酸配
   列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若
   しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インス
   リン遺伝子のｍＲＮＡの産生を調節するタンパク質。
2. 【請求項２】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
   る請求項１記載のＤＮＡ。 （ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうち、少
   なくとも塩基番号１３８〜１１５１からなる塩基配列を
   含むＤＮＡ。 （ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうち、少
   なくとも塩基番号１３８〜１１５１からなる塩基配列と
   ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつイ
   ンスリン遺伝子のｍＲＮＡの産生を調節するタンパク質
   をコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載のＤＮＡを含有す
   る組換え発現ベクター。
4. 【請求項４】 請求項１又は２に記載のＤＮＡを含み、
   かつ、ヒトＢＨＦＩの一部又は全部を発現し得る形質転
   換体。
5. 【請求項５】 請求項４記載の形質転換体を培地で培養
   し、その培養物からヒトＢＨＦＩタンパク質の一部また
   は全部を採取することを特徴とする、ヒトＢＨＦＩタン
   パク質の一部または全部を製造する方法。
6. 【請求項６】 ヒトＢＨＦ１タンパク質の一部または全
   部を有効成分とする医薬組成物。