JPH10136986A - ＴＮＦ−αに特異的なキメラ抗体分子 - Google Patents

ＴＮＦ−αに特異的なキメラ抗体分子

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JPH10136986A
JPH10136986A JP9008037A JP803797A JPH10136986A JP H10136986 A JPH10136986 A JP H10136986A JP 9008037 A JP9008037 A JP 9008037A JP 803797 A JP803797 A JP 803797A JP H10136986 A JPH10136986 A JP H10136986A
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cdr
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ロバート アデイアー，ジョン
Diljeet Singh Athwal
シング アスウォル，ディルジート
John Spencer Emtage
スペンサー エムターゲ，ジョン
Mark William Bodmar
ウィリアム ボッドマー，マーク
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Celltech Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトの治療に使用することができる抗ヒトＴ
ＮＦ−α抗体の提供。 【解決手段】 ヒトＴＮＦ−αに対して特異性を有する
キメラ抗体分子。特に、軽鎖および重鎖の定常部がヒト
由来であり、可変ドメインが齧歯類由来である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、腫瘍壊死因子アル
ファ（ＴＮＦ−α）の抗原決定基に対する特異性を有す
る組換え（特にヒト化）抗体分子、組換えＤＮＡ法を用
いるその製造方法、およびその治療への使用に関する。
【０００２】本発明において、「組換え抗体分子」とい
う用語は、任意の組換えＤＮＡ技術を含む任意の方法に
より産生される抗体分子（天然の免疫グロブリンまたは
その断片の任意の類似物を含む）を意味する。
【０００３】また本発明において、「ヒト化抗体分子」
という用語は、分子の抗原結合部位はヒト以外の種の免
疫グロブリン由来であり、分子の残りの免疫グロブリン
はヒト免疫グロブリン由来である分子を意味する。すな
わち、ヒト化抗体分子は、ヒト定常領域ドメインに結合
した完全な非ヒト重鎖および／または軽鎖可変領域ドメ
インよりなるヒト化キメラ抗体分子を含む。ヒト化抗体
分子はまた重鎖および／または軽鎖ヒト可変領域枠組み
構造（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に移植された非ヒト抗体か
らの１つまたはそれ以上のＣＤＲよりなる、ＣＤＲ移植
ヒト化抗体分子も含む。
【０００４】抗体の抗原結合特異性は、可変領域の枠組
み領域上に存在する比較的短いペプチド配列である相補
性決定領域（ＣＤＲ）により決定される。重鎖および軽
鎖可変領域ドメインのそれぞれには３つのＣＤＲ（ＣＤ
Ｒ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）がある。
【０００５】モノクローナル抗体を表すのに略語「ＭＡ
ｂ」を使用する。本明細書において文献は番号で示さ
れ、これらの文献は本説明の最後に番号順に記載されて
いる。
【０００６】
【従来の技術】天然の免疫グロブリンは酵素的切断によ
り得られる、種々の断片（例えばＦａｂ、Ｆｖ、（Ｆａ
ｂ’）2 およびＦｃ断片）を有することはもう何年も知
られている。天然の免疫グロブリンは、一般に抗原結合
部位が各腕（ａｒｍ）の末端あたりに存在するＹ字形の
分子である。免疫グロブリンの残りの部分（特にＹ字形
の幹の部分）は、免疫グロブリンに関連するエフェクタ
ー機能を媒介する。
【０００７】天然の免疫グロブリンは測定、診断、そし
て限定されてはいるが治療にも使用されてきた。しかし
このような使用（特に治療での使用）は、天然の免疫グ
ロブリンがポリクローナル性であることにより最近まで
邪魔されてきた。治療薬としての免疫グロブリンの可能
性の実現における重要な進展は、一定の特異性を有する
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の再現性のある産生方法
発見である（１）。
【０００８】しかし多くのＭＡｂは、齧歯類の脾臓細胞
と齧歯類のミエローマ細胞の融合物であるハイブリドー
マにより産生される。従ってこれらは基本的に齧歯類の
蛋白である。ヒトＭＡｂの産生についてはほとんど報告
がない。
【０００９】入手できるほとんどのＭＡｂは齧歯類由来
であるため、それらはヒトにおいて抗原性を有し、ヒト
に投与された場合、ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）と呼
ばれる好ましくない免疫応答を引き起こす。従ってヒト
は齧歯類のＭＡｂに対して免疫応答をして、それを完全
に排除したりまたは少なくともその有効性を低下させる
ため、ヒトにおける齧歯類ＭＡｂの治療薬としての使用
は本質的に限定される。実際には齧歯類に由来するＭＡ
ｂは、ＨＡＮＡ応答がＭＡｂの有効性を低下させたり好
ましくない反応を引き起こすため、１回または数回以上
治療に使用することはできない。例えばＴ細胞リセプタ
ー−ＣＤ３複合体中の抗原を認識するＯＫＴ３、マウス
ＩｇＧａ／ＫＭＡｂは、急性同種移植片拒絶の治療にお
ける免疫抑制剤として世界中の多くの国で使用されてき
た（チャテノウ（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ）ら（２）とジェ
ファーズ（Ｊｅｆｆｅｒｓ）ら（３））。しかしこの抗
体や他の類似のＭＡｂが本質的に齧歯類のものであるこ
とから、使用により主要な抗イディオタイプ成分を含む
かなりの免疫応答が蓄積する。従ってこの好ましくない
ＨＡＮＡ応答を減弱または排除して、このような抗体の
使用範囲を広げることが好ましい。
【００１０】従ってヒトにおいて非ヒトＭＡｂのヒトに
おける抗原性を減弱させることが提唱されている。この
ような技術は総称的に「ヒト化」法と呼ばれている。こ
れらの方法は典型的には組換えＤＮＡ法を用いて、抗体
分子のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作す
ることよりなる。
【００１１】ＭＡｂをヒト化する初期の方法は、１つの
抗体の完全な可変領域ドメインよりなる抗原結合部位が
別の抗体由来の定常領域に結合した、キメラ抗体の産生
であった。このようなキメラ化の方法は、ヨーロッパ特
許０１２０６９４号（セルテック社（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ
Ｌｉｍｉｔｅｄ））、ヨーロッパ特許第０１２５０２
３号（ジェネンティック社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎ
ｃ．）とシティオブホープ（Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐ
ｅ））、ヨーロッパ特許出願第０１７１４９６号（レス
・デブ・コープ（Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｃｏｒｐ．）、日
本）、ヨーロッパ特許出願０１７３４９４号（スタンフ
ォード大学）およびＷＯ８６／０１５３３号（セルテッ
ク社（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ））に記載さ
れている。これらの先行特許出願は、一般にマウスＭＡ
ｂの可変ドメインとヒト免疫グロブリンの定常ドメイン
を有する抗体分子の調製法を開示している。しかしこの
ようなキメラ抗体は、まだかなりの部分の非ヒトアミノ
酸配列（すなわち完全な非ヒト可変ドメイン）を含み、
従って特に長期に投与された場合まだＨＡＮＡを引き起
こす可能性がある（ベジェント（Ｂｅｇｅｎｔ）ら（文
献４））。
【００１２】ヨーロッパ特許出願第０２３９４００号
（ウインター（Ｗｉｎｔｅｒ））記載の別の方法では、
長いオリゴヌクレオチドを用いて部位特異的突然変異誘
発により、ヒト免疫グロブリンの可変ドメインの枠組み
領域上に、マウスＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）が
移植された。このようなＣＤＲ移植ヒト化抗体は、ヒト
化キメラ抗体より含有する非ヒトアミノ酸配列の割合が
低いため、ＨＡＮＡ応答を引き起こす可能性ははるかに
小さい。
【００１３】ＣＤＲ移植によりＭＡｂをヒト化する初期
の研究は、合成抗原（例えばＮＰ抗原またはＮＩＰ抗
原）を認識するＭＡｂについて行われた。しかしＣＤＲ
移植によりライソゾームを認識するマウスＭＡｂとヒト
Ｔ細胞上の抗原を認識するラットＭＡｂをヒト化する例
は、ベレーエン（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ）ら（５）とリー
チマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎ）ら（６）によりそれぞれ記
載されている。ヒトＴ細胞上の抗原に対するＣＤＲ移植
抗体の調製は、ＷＯ８９／０７４５２号にも記載されて
いる（メディカルリサーチカウンシル（Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ））。
【００１４】リーチマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎ）ら／メデ
ィカルリサーチカウンシルでは、ＣＤＲ領域のみの移動
（カバ（Ｋａｂａｔ）により規定されている、文献
（７）と（８））は、ＣＤＲ移植生成物に満足できる抗
原結合活性を与えるのに充分でないことが見いだされ
た。リーチマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎ）らは、抗原結合活
性の改良されたＣＤＲ移植生成物を得るには、ヒト重鎖
配列の２７位のセリン残基を対応するラットのフェニル
アラニン残基に変換することが必要であることを見いだ
した。重鎖の２７位のこの残基はＣＤＲ１に隣接した構
造ループ中にある。追加的に重鎖の３０位のヒトセリン
もラットチロシンに変換した別の作成物は、２７位のみ
のセリンをフェニルアラニンへ変換したヒト化抗体に対
して、結合活性が有意に変化しているということはなか
った。これらの結果は、さらに複雑な抗原を認識するＣ
ＤＲ移植抗体について有効な抗原結合活性を得るには、
ＣＤＲ領域以外のヒト配列（特に重鎖のＣＤＲ１に隣接
する構造ループ中）の残基の変換が必要なことがあるこ
とを示している。しかしそれにしても得られた最高のＣ
ＤＲ移植抗体の結合親和性は、本来のＭＡｂよりまだ有
意に小さかった。
【００１５】最近クイーン（Ｑｕｅｅｎ）ら（９）は、
齧歯類のＭＡｂ（抗Ｔａｃ）のＣＤＲをヒト免疫グロブ
リン枠組みと定常領域に結合させて、インターロイキン
２リセプターに結合するヒト化抗体の調製を記載してい
る。このヒト枠組み領域は、抗ＴａｃＭＡｂ配列との相
同性を最大にするために選ばれた。さらに、ＣＤＲまた
は抗原と相互作用する可能性のある枠組みアミノ酸残基
を同定するためにコンピューターモデリングが使用さ
れ、ヒト化抗体においてこれらの位置でマウスのアミノ
酸が使用された。
【００１６】ＷＯ９０／０７８６１号においてクイーン
（Ｑｕｅｅｎ）らは、ヒト化免疫グロブリンをデザイン
するための４つの基準を提唱している。第１の基準は、
ヒトアクセプターとして、ヒト化される非ヒトドナー免
疫グロブリンに極めて相同性のある枠組みを用いるか、
または多くのヒト抗体からのコンセンサス枠組み（ｃｏ
ｎｓｅｎｓｕｓ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）を使用すること
である。第２の基準は、枠組みの特定の残基でヒトアク
セプター残基が通常ではなくてドナー残基がヒト配列に
典型的な場合は、アクセプターよりもドナーアミノ酸を
使用することである。第３の基準は、ＣＤＲにすぐ隣接
する位置ではアクセプターよりもドナー枠組みアミノ酸
残基を使用することである。第４の基準は、３次元の免
疫グロブリンモデルにおいて、ドナーアミノ酸残基の側
鎖の原子がＣＤＲの約３Å以内にあり、抗原またはヒト
化免疫グロブリンのＣＤＲと相互作用することが予想さ
れる枠組みの位置ではドナーアミノ酸を使用することで
ある。第２、第３または第４の基準は第１の基準に加え
てまたはその代わりに使用することができ、単独でまた
は組合せて適用することができることが提唱されてい
る。
【００１７】ＷＯ９０／０７８６１号は、単一のＣＤＲ
移植ヒト化抗体である、インターロイキン２リセプター
のｐ５５Ｔａｃ蛋白に対して特異性を有するヒト化抗体
の調製について詳細に記載している。このヒト化抗体の
デザインに当たって上記の４つのすべての基準が使用さ
れ、ヒト抗体ＥＵ（７）の可変領域枠組みがアクセプタ
ーとして使用された。得られたヒト化抗体では、ドナー
ＣＤＲはカバ（Ｋａｂａｔ）ら（７と８）により規定さ
れているものであり、さらに可変領域枠組みの、重鎖中
の２７、３０、４８、６６、６７、８９、９１、９４、
１０３、１０４、１０５および１０７位で、そして軽鎖
の４８、６０および６３位でヒトアクセプター残基の代
わりにマウスドナー残基が使用された。得られたヒト化
抗Ｔａｃ抗体はｐ５５に対して３×１０9 Ｍ-1の親和性
（齧歯類のＭＡｂの約３分の１）を有すると報告されて
いる。
【００１８】我々はさらに、ＣＤＲ移植ヒト化抗体分子
の調製を研究し、満足できる結合親和性を有するＣＤＲ
移植生成物を得るのに残基のアミノ酸の種類が重要であ
る、可変領域の枠組み内（カバ（Ｋａｂａｔ）ＣＤＲお
よび可変領域の構造ループの外）に位置のヒエラルキー
があることを同定した。これにより我々は、ドナー免疫
グロブリンとアクセプター枠組みの相同性のレベルに関
係なく、満足できるＣＤＲ移植生成物を得るための非常
に広く適用できる方法を確立することができた。我々が
決定的に重要であると同定した残基のセットは、クイー
ン（Ｑｕｅｅｎ）ら（９）の同定した残基と重複するが
全く同じではない。我々の同時係属国際特許出願ＷＯ９
１／０９９６７号は、任意の目的の特異性を有するＣＤ
Ｒ移植（特にヒト化）抗体重鎖および軽鎖、および完全
な分子の調製の方法を記載している。国際特許出願ＷＯ
９１／０９９６７号の完全な開示は参照することにより
本明細書中に取込まれている。
【００１９】テンペスト（Ｔｅｍｐｅｓｔ）ら（１０）
はつい最近、インビボでのヒト呼吸シンシチアルウイル
ス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖ
ｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）感染の阻害に使用する再構成した
モノクローナル抗体の調製について記載している。この
再構成した抗体は、ＲＳＶ感染を中和する齧歯類のＭＡ
ｂのＣＤＲをコードする合成オリゴヌクレオチドを、部
位特異的突然変異誘発により、ヒトＩｇＧ１モノクロー
ナル抗体の枠組みをコードするＤＮＡ中に移植すること
により調製された。しかしマウスとヒトの間でＣＤＲの
みを移したこの単純な再構成抗体は、ＲＳＶに対する結
合は極めて弱くバックグランドと有意差がなかった。結
合能力を部分的に回復させるために、重鎖のＣＤＲ３に
隣接する枠組み領域中で、さらにヒト残基からマウスの
残基に変換することが必要であった。テンペスト（Ｔｅ
ｍｐｅｓｔ）らは、ＷＯ９１／０９９６７号の方法で同
定された重要な部位でヒト残基をマウス残基に変換しな
かった。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】ＴＮＦαは免疫系の細
胞により放出され相互作用するサイトカインである。す
なわちＴＮＦαはグラム陰性細菌のリポ多糖類（ＬＰ
Ｓ）により活性化されるマクロファージから放出され
る。このようなＴＮＦαは、細菌性敗血症に関連したエ
ンドトキシンショックの進展と病因に関与している最も
重要な内因性メディエーターのようである（ボイトラー
（Ｂｅｕｔｌｅｒ）ら（１１））。しかし今日このよう
な治療での使用に入手できるＴＮＦαに対する抗体は、
典型的には齧歯類のＭＡｂである。従って１回または数
回以上治療に使用されると好ましくないＨＡＭＡ（ヒト
抗マウス抗体）応答を引き起こす可能性があることか
ら、これらのＭＡｂはヒトでの治療への利用が限定され
る。しかしヒトの治療に使用できるヒト化抗ＴＮＦα生
成物を調製することは、極めて好ましい目的である。
【００２１】我々の同時係属国際特許出願ＷＯ９１／０
９９６７号は、特にＴＮＦαに対する特異性を有するヒ
ト化ＣＤＲ移植抗体生成物の調製について記載してい
る。特にＷＯ９１／０９９６７号は、例５において、６
１Ｅ７１（またはＣＢ０００６としても知られてい
る）、ｈＴＮＦ１（またはＣＢ００１０としても知られ
ている）、ｈＴＮＦ３および１０１．４として同定され
ている齧歯類抗ヒトＴＮＦαＭＡｂ由来の、ヒトＴＮＦ
αに対する特異的ヒト化ＣＤＲ移植抗体の調製について
記載している。本出願は特に、ヒトＴＮＦαに対する組
換え（特にヒト化）抗体に関し、ＷＯ９１／０９９６７
号に記載されているものおよび、ｈＴＮＦ１（ＤＢ００
１０）や１０１．４齧歯類ＭＡｂに基づく、ヒトＴＮＦ
αに対するさらに改良されたヒト化ＣＤＲ移植抗体を含
む。種々の抗ヒトＴＮＦα齧歯類ＭＡｂのその後の研究
は、ｈＴＮＦ１と１０１．４は抗ＴＮＦ治療での使用に
おいて特に好ましい性質を有していることが明らかにな
った。
【００２２】
【課題を解決するための手段】従って本発明は、ヒトＴ
ＮＦαに対する特異性を有する組換え抗体分子を与え
る。本発明の組換え抗体分子はＴＮＦ中和性である（す
なわちインビトロまたはインビボで測定したときヒトＴ
ＮＦαの生物活性を阻害する）。
【００２３】好ましくは本発明は、齧歯類ＭＡｂのＣＢ
０００６、ＣＢ００１０、ｈＴＮＦ３または１０１．４
（特に齧歯類ＭＡｂのＣＢ００１０または１０１．４）
由来の抗原結合部位を有する組換え抗体分子を与える。
好ましくは本発明の組換え抗体分子は、キメラヒト化抗
体分子およびＣＤＲ移植ヒト化抗体分子を含むヒト化抗
体分子である。
【００２４】より具体的には、本発明は、ヒトＴＮＦ−
αに対して特異性を有するキメラ抗体分子；検出するこ
とができるように標識された形態の上記キメラ抗体分
子；軽鎖及び重鎖の定常部がヒト由来である上記キメラ
抗体分子；軽鎖及び重鎖の可変ドメインが齧歯類由来で
ある上記キメラ抗体分子；前記可変ドメインが齧歯類モ
ノクローナル抗体６１Ｅ７１、ｈＴＮＦ１、ｈＴＮＦ３
及び１０１．４のいずれか一つから由来する上記キメラ
抗体分子；ヒトＴＮＦ−αの中和エピトープに結合する
上記キメラ抗体分子；上記キメラ抗体と薬剤学的に許容
可能な担体とを含む薬剤組成物；又はＴＮＦ−αにより
仲介される病態の処置に使用するための、上記キメラ抗
体分子又は上記薬剤組成物である。
【００２５】本発明において、「キメラヒト化抗体分
子」とは、ヒト定常ドメインに結合した完全な非ヒト
（例えば齧歯類ＭＡｂ）可変ドメインよりなり、「ＣＤ
Ｒ移植ヒト化抗体分子」は、ヒトの重鎖および／または
軽鎖可変領域枠組みに移植された非ヒト抗体（例えば齧
歯類ＭＡｂ）からの１つまたはそれ以上のＣＤＲを含む
抗体重鎖および／または軽鎖よりなる。
【００２６】本発明のＣＤＲ移植ヒト化抗ＴＮＦα抗体
生成物は、ＷＯ９１／０９９６７号の発明の第１、第
２、第３および第４の面に記載された抗ヒトＴＮＦα抗
体重鎖および／または軽鎖および分子生成物よりなる。
【００２７】
【発明の実施の形態】第１の実施態様において本発明
は、ヒトアクセプター枠組みとドナー抗原結合領域より
なる可変領域ドメインを有する、ＣＤＲ移植ヒト化抗ｈ
ＴＮＦα抗体重鎖を与え、ここで枠組みは、６、２３お
よび／または２４、４８および／または４９、７１およ
び／または７３、７５および／または７６および／また
は７８、そして８８および／または９１位の少なくとも
１つでドナー残基を含む。
【００２８】好ましくは第１の実施態様で、重鎖枠組み
は、２３、２４、４９、７１、７３および７８位、また
は２３、２４および４９位でドナー残基を含む。重鎖枠
組みの７１、７３および７８位の残基は、好ましくはす
べてアクセプターであるかまたはすべてドナー残基であ
る。
【００２９】特にこれらの第１の実施態様において、重
鎖枠組みはさらに６、３７、４８および９４位の１つ、
いくつかまたはすべてでドナー残基を含む。またドナー
とアクセプターの間で保存されていなくても、種間で普
通保存されている重鎖枠組みの位置（すなわち２、４、
２５、３６、３９、４７、９３、１０３、１０４、１０
６および１０７位）の残基は、ドナー残基を追加的に含
むことが好ましい。最も好ましくは重鎖枠組みは２、
４、６、２５、３６、３７、３９、４７、４８、９３、
９４、１０３、１０４、１０６および１０７位でドナー
残基を追加的に含む。
【００３０】さらに重鎖枠組みは以下の位置の１つ、い
くつかまたはすべてでドナー残基を随時追加的に含む：
１と３、７２と７６、６９（ドナーとアクセプターの間
で４８が異なる場合）、３８と４６（４８がドナー残基
である場合）、８０と２０（６９がドナー残基である場
合）、６７、８２と１８（６７がドナー残基である場
合）、９１、８８、および９、１１、４１、８７、１０
８、１１０および１１２のうちの任意の１つまたはそれ
以上。
【００３１】本発明の記載においてドナー抗体は典型的
には、非ヒト抗ｈＴＮＦα抗体（例えば齧歯類ＭＡｂ）
であり、アクセプター抗体はヒト抗体である。
【００３２】本発明のＣＤＲ移植ヒト化抗ｈＴＮＦα抗
体では、ドナー抗原結合領域は典型的にはドナー抗体か
らの少なくとも１つのＣＤＲを含む。通常ドナー抗原結
合領域は、重鎖および／または軽鎖可変領域のおのおの
の、少なくとも２つ好ましくは３つのＣＤＲを含む。こ
のＣＤＲはカバ（Ｋａｂａｔ）ＣＤＲ、構造ループＣＤ
Ｒまたはカバ（Ｋａｂａｔ）ＣＤＲと構造ループＣＤＲ
の組合せ、およびこれらの任意の組合せよりなる。
【００３３】好ましくはＣＤＲ移植重鎖可変ドメインの
抗原結合領域は、ＣＤＲ２（５０−６５）とＣＤＲ３
（残基９５−１０２）でカバ（Ｋａｂａｔ）ＣＤＲを含
み、ＣＤＲ１（２６−３５）でカバ（Ｋａｂａｔ）ＣＤ
Ｒと構造ループＣＤＲの組合せを含む。これらの好適な
ＣＤＲ名は、好ましくは第１の好適な実施態様のＣＤＲ
移植重鎖に含まれる（すなわち残基２６−３０はＣＤＲ
１に含まれる）。
【００３４】上記および本発明の別のところに記載され
るの残基名は、カバ（Ｋａｂａｔ）の番号付け（文献
（７）と（８））に従い番号が付けられている。すなわ
ち残基名は必ずしもアミノ酸配列の直線的番号付けと直
接一致しない。実際の直線的アミノ酸配列は、枠組みで
あろうとＣＤＲであろうと、基礎的な可変ドメイン構造
生成物の短縮または挿入により、厳しいカバ（Ｋａｂａ
ｔ）の番号付けよりもアミノ酸数が少ないまたは多いこ
とがある。例えばクイーン（Ｑｕｅｅｎ）ら（９）に記
載された抗Ｔａｃ抗体の重鎖可変領域は、カバ（Ｋａｂ
ａｔ）の番号付けで、ＣＤＲ２の残基５２の後に１つの
アミノ酸挿入体（残基５２ａ）、枠組み残基８２の後に
３つのアミノ酸挿入体（残基８２ａ、８２ｂおよび８２
ｃ）を含む。ある抗体について、残基の正しいカバ（Ｋ
ａｂａｔ）番号は、「標準」カバ（Ｋａｂａｔ）番号配
列との、抗体の配列の相同性領域での配向により決定さ
れる。
【００３５】前述およびさらに本発明の別の場所で記載
されるように、本発明のＣＤＲ移植ヒト化抗体分子の実
施態様が特定のドナー／アクセプター抗体対に提供され
るとき、ドナー残基に変換すると決められた位置でドナ
ーとアクセプターのアミノ酸残基が同じことがあり、従
ってアクセプター枠組み残基に変換は必要でないことが
あることは理解されるであろう。
【００３６】本発明は第２の好適な実施態様において、
枠組みが１および／または３、そして４６および／また
は４７位の少なくとも１つでドナー残基を含むヒトアク
セプター枠組みとドナー抗原結合領域を有する、ＣＤＲ
移植ヒト化抗ｈＴＮＦα抗体軽鎖を与える。
【００３７】好ましくは第２の好適な実施態様のＣＤＲ
移植軽鎖は、４６および／または４７位にドナー残基を
含む。
【００３８】本発明はまた第３の好適な実施態様におい
て、枠組みが４６、４８、５８および７１位の少なくと
も１つでドナー残基を含むヒトアクセプター枠組みと、
ドナー抗原結合領域を有するＣＤＲ移植ヒト化抗ｈＴＮ
Ｆα抗体軽鎖を与える。
【００３９】第３の好適な実施態様において、好ましく
は枠組みは、４６、４８、５８および７１位にドナー残
基を含む。
【００４０】第２の特に好適な実施態様および第３の好
適な実施態様において、枠組みは追加的に３６、４４、
４７、８５そして８７位にドナー残基を含む。たとえド
ナーとヒトアクセプター間で保存されていなくても、種
間で普通保存されている軽鎖枠組みの類似の位置、すな
わち２、４、６、３５、４９、６２、６４−６９、９
８、９９、１０１そして１０２位も追加的にドナーを含
む。最も好ましくは軽鎖枠組みは、２、４、６、３５、
３６、３８、４４、４７、４９、６２、６４−６９、８
５、８７、９８、９９、１０１そして１０２位で、追加
的にドナー残基を含む。
【００４１】さらに第２または第３の好適な実施態様の
枠組みは、以下の位置の１つ、いくつかまたはすべての
位置で随時ドナー残基を含む：１と３、６３、６０（６
０と５４が電位差塩橋（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｓａｌｔ
ｂｒｉｄｇｅ）を形成することができる場合）、７０
（７０と２４が電位差塩橋を形成することができる場
合）、７３と２１（ドナーとアクセプター間で４７が異
なる場合）、３７と４５（ドナーとアクセプター間で４
７が異なる場合）、そして１０、１２、４０、８０、１
０３そして１０５のうちの任意の１つまたはそれ以上。
【００４２】好ましくはＣＤＲ移植軽鎖可変ドメインの
抗原結合領域（前述の第２または第３の好適な実施態様
のものを含む）は、ＣＤＲ１（残基２４−３４）、ＣＤ
Ｒ２（残基５０−５６）およびＣＤＲ３（残基８９−９
７）でカバ（Ｋａｂａｔ）ＣＤＲに対応するＣＤＲを含
む。
【００４３】第４の実施態様において本発明は、本発明
の第１と第２または第１と第３の好適な実施態様の、少
なくとも１つのＣＤＲ移植重鎖と少なくとも１つのＣＤ
Ｒ移植軽鎖よりなるＣＤＲ移植抗体分子を与える。
【００４４】しかし第１の特に好適な実施態様において
本発明は、枠組みは１２、２７、３０、３８、４６、４
８、６６、６７、６９、７１、７３、７６、８３、８
９、９１そして９４位でｈＴＮＦ１ドナー残基を含む、
ヒトアクセプター枠組み（特にＥＵヒトアクセプター枠
組み）とｈＴＮＦ１ドナー抗原結合領域よりなる可変領
域ドメインを有する、ＣＤＲ移植ヒト化抗体重鎖を与え
る。
【００４５】ＥＵ重鎖枠組みは、ヒト重鎖枠組みにとっ
ては変則である重鎖の枠組み４（ＦＲ４）で残基を有す
る。従って好ましくは、重鎖のＦＲ４のＥＵ残基の代わ
りにヒトコンセンサス残基（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｒｅ
ｓｉｄｕｅｓ）が使用される。特にヒトコンセンサス残
基のスレオニン（Ｔ）を１０８位で使用してもよい。偶
然にも１０８位の齧歯類ｈＴＮＦ１残基もまたスレオニ
ンである。
【００４６】第２の特に好適な実施態様において本発明
は、枠組みは３、４２、そして４９位でｈＴＮＦ１ドナ
ー残基を含む、ヒトアクセプター枠組み（特にＥＵヒト
アクセプター枠組み）とｈＴＮＦ１ドナー抗原結合領域
よりなる可変ドメインを有する、ＣＤＲ移植ヒト化抗体
軽鎖を与える。
【００４７】４８、８３、１０６そして１０８位のＥＵ
残基はヒト抗体としては変則であるため、軽鎖にＥＵヒ
ト枠組みを使用する場合は、これらの位置のＥＵ残基を
変換することが好ましい。すなわちこれらの残基のいく
つかまたは好ましくはすべてでヒトコンセンサス残基が
使用される（すなわち、４８位でイソロイシン（Ｉ）、
８３位でバリン（Ｖ）、１０６位でイソロイシン（Ｉ）
そして１０８位でアルギニン（Ｒ））。偶然にも、４８
位（Ｉ）、１０６位（Ｉ）および１０８位（Ｒ）で齧歯
類ｈＴＮＦ１残基はヒトコンセンサス残基と同じであ
る。しかし８３位のヒトコンセンサス残基バリン（Ｖ）
は、この場所でのＥＵ残基（Ｆ）およびｈＴＮＦ１残基
（Ｌ）とも異なる。
【００４８】特に本発明は、第１の特に好適な実施態様
の少なくとも１つのＣＤＲ移植ヒト化重鎖と、第２の特
に好適な実施態様の少なくとも１つのＣＤＲ移植ヒト化
軽鎖よりなる、ＣＤＲ移植ヒト化抗体分子よりなる。
【００４９】また第３の特に好適な実施態様において本
発明は、枠組みは４、１１、２３、２４、２８、７３、
７７、７８、７９、９１、９３そして９４位で１０１．
４ドナー残基を含む、ヒトアクセプター枠組み（特にＫ
ＯＬヒトアクセプター枠組み）と１０１．４ドナー抗原
結合領域よりなる可変領域ドメインを有する、ＣＤＲ移
植ヒト化抗体重鎖を与える。
【００５０】重鎖の１０８位のＫＯＬ残基であるプロリ
ン（Ｐ）はヒト抗体にとって変則である。従ってヒトア
クセプター枠組みとしてＫＯＬを使用する場合は、この
位置にヒトコンセンサス残基であるロイシン（Ｌ）があ
ることが好ましい。偶然にも齧歯類１０１．４抗体はこ
の位置でヒトコンセンサス残基（Ｌ）を持っている。
【００５１】さらに第４の特に好適な実施態様において
本発明は、１、３、４そして７３位でヒトアクセプター
枠組み（特にＲＥＩヒトアクセプター枠組み）と１０
１．４ドナー残基を含む可変領域ドメインを有する、Ｃ
ＤＲ移植ヒト化抗体軽鎖を与える。
【００５２】ＲＥＩ軽鎖ヒト枠組みは、３９位（スレオ
ニン、Ｔ），１０４位（ロイシン、Ｌ）、１０５位（グ
ルタミン、Ｑ）、そして１０７位（スレオニン、Ｔ）
で、ヒト抗体にとって変則である残基を有する。すなわ
ちＲＥＩが軽鎖枠組みとして使用される場合、３９位
（リジン、Ｋ）、１０４位（バリン、Ｖ）、１０５位
（グルタミン酸、Ｅ）そして１０７位（リジン、Ｋ）で
ヒトコンセンサス残基が使用される。偶然にも齧歯類１
０１．４残基は３９位（Ｋ），１０５位（Ｅ）そして１
０７位（Ｋ）でヒトコンセンサス残基と同じである。し
かし１０４位（Ｖ）のヒトコンセンサス残基は、この位
置でロイシン（Ｌ）ＲＥＩおよび齧歯類１０１．４残基
と異なる。
【００５３】特に本発明は、第３の特に好適な実施態様
の少なくとも１つのＣＤＲ移植ヒト化重鎖と、第４の特
に好適な実施態様の少なくとも１つのＣＤＲ移植ヒト化
軽鎖よりなる、ＣＤＲ移植ヒト化抗体分子よりなる。
【００５４】好ましくは前述した第１、第２、第３およ
び第４の特に好適な実施態様の、重鎖と軽鎖の両方のＣ
ＤＲ（ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）のすべてに
ついてカバ（Ｋａｂａｔ）ＣＤＲが使用される。
【００５５】本発明の組換えおよびヒト化抗体分子と鎖
は以下のものよりなっていてもよい：完全な長さの重鎖
と軽鎖を有する完全な抗体分子；その断片（例えばＦａ
ｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）2 、またはＦｖ断片）；軽
鎖または重鎖モノマーまたはダイマー；または単一鎖抗
体（例えば重鎖と軽鎖可変領域がペプチドリンカーで結
合されている単一鎖Ｆｖ）；または元々のドナー抗体と
同じ特異性を有する他の任意の組換え、キメラまたはＣ
ＤＲ移植分子。同様に重鎖と軽鎖可変領域は適宜他の抗
体ドメインに結合している。
【００５６】また本発明の重鎖または軽鎖または組換え
またはヒト化完全抗体分子は、エフェクターまたはレポ
ーター分子を結合していてもよい。例えばそれは共有ブ
リッジ構造で結合した、重金属原子またはリシンのよう
な毒素をキレートするための巨大環状物質でもよい。あ
るいは組換えＤＮＡ技術を用いて、完全な免疫グロブリ
ン分子のＦｃ断片またはＣＨ３ドメインが、ペプチド結
合により、機能性非免疫グロブリン蛋白（例えば酵素ま
たは毒素分子）に代替されているかまたは結合してい
る、免疫グロブリン分子を産生することもできる。
【００５７】ＣＢ００１０、１０１．４、ＣＢ０００６
およびｈＴＮＦ３齧歯類ＭＡｂ、それらのＣＤＲ移植変
異体およびヒトアクセプター抗体の重鎖および軽鎖可変
ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ添付の図１、２、
３および４に記載されている。本発明の組換えおよびヒ
ト化抗体生成物は、組換えＤＮＡ技術（例えば実質的に
はＷＯ９１／０９９６７号に記載されている）を用いて
調製することができる。
【００５８】抗原結合領域が取られたドナー抗体のクラ
ス／タイプに関係のある、任意の適当なヒトアクセプタ
ー可変領域枠組み配列が使用できる。好ましくは使用さ
れるヒトアクセプター枠組みのタイプは、ドナー抗体と
同じ／類似のクラス／タイプである。特にＣＤＲに近い
または隣接する位置で、ドナー抗体配列との相同性を最
大にする／最適化する枠組みを選ぶことが便利である。
しかし本発明の適用において、ドナーとアクセプター配
列間の高レベルの相同性は決定的に重要ではない。本発
明は、満足できる結合性を有するＣＤＲ移植抗体生成物
を得るのに、ドナー残基が重要であるかまたは好まし
い、枠組み残基位置のヒエラルキーを同定する。ＣＤＲ
移植生成物は、普通少なくとも１０5 Ｍ-1、好ましくは
少なくとも約１０8 Ｍ-1、または特に好ましくは１０8
−１０12Ｍ-1の範囲の結合親和性を有する。原理的に本
発明は、配列間の相同性のレベルに関係なく、任意の抗
ｈＴＮＦαドナーとヒトアクセプター抗体の任意の組合
せに適用できる。使用されるヒト枠組みの例としては、
ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、Ｌ
ＡＹおよびＰＯＭ（文献７と８）などがある；例えば重
鎖についてはＫＯＬとＮＥＷＭ、軽鎖についてはＲＥ
Ｉ、そして重鎖と軽鎖の両方についてはＥＵ、ＬＡＹお
よびＰＯＭがある。
【００５９】また本発明の生成物の定常領域ドメイン
は、抗体の考えられる機能（特に、必要かも知れないエ
フェクター機能）に関して選択される。例えば定常領域
ドメインはヒトＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭド
メインでもよい。ヒト化抗体分子が治療目的に使用され
抗体エフェクター機能が必要な場合は、ＩｇＧヒト定常
領域ドメイン（特にＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイ
プ）が使用される。またヒト化抗体分子が治療目的に使
用されるが抗体エフェクター機能が必要でない場合は
（例えば単にＴＮＦ活性を阻止する場合）、ＩｇＧ２お
よびＩｇＧ４アイソタイプが使用される。
【００６０】しかし抗体分子の残りの部分は、免疫グロ
ブリンの蛋白配列のみである必要はない。例えばヒト免
疫グロブリン鎖の一部をコードするＤＮＡ配列を、エフ
ェクターまたはレポーター分子のような機能性ポリペプ
チドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に融合され
た遺伝子を作成してもよい。
【００６１】さらに別の面において本発明はまた、組換
えおよびヒト化抗体（例えばＣＤＲ移植、重鎖および軽
鎖）をコードするＤＮＡ配列、ＤＮＡ配列を含むクロー
ニングベクターおよび発現ベクター、ＤＮＡ配列で形質
転換される宿主細胞を包含し、さらに形質転換宿主細胞
中でＤＮＡ配列を発現することよりなる、組換えおよび
ヒト化（例えばＣＤＲ移植）鎖や抗体分子を産生する方
法を包含する。
【００６２】ベクターの作成、トランスフェクション法
および培養法の一般的な方法は公知である。このような
方法は例えば文献１２と１３に記載されている。
【００６３】抗ｈＴＮＦα抗体分子のアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡ配列は、当業者に公知の方法で得られ
る。例えば抗ＴＮＦコード配列はゲノムクローニング、
または適当な抗ｈＴＮＦα産生ハイブリドーマ細胞株か
らのｃＤＮＡクローニングにより得られる。陽性のクロ
ーンは、問題の重鎖および軽鎖遺伝子の適当なプローブ
を用いてスクリーニングされる。またＰＣＲクローニン
グを使用することもできる。抗体重鎖および軽鎖の一部
またはすべてをコードするＤＮＡ配列は、決定されたＤ
ＮＡ配列から、または対応するアミノ酸配列を基礎にし
て、必要に応じて合成することができる。
【００６４】アクセプター（例えばヒトアクセプター）
の配列をコードするＤＮＡは適当な方法で得られる。例
えばＫＯＬ、ＲＥＩ、ＥＵおよびＮＥＷＭのような好ま
しいヒトアクセプター枠組みをコードするＤＮＡ配列
は、当業者には広く入手可能であるか、またはそのアミ
ノ酸配列に基づいて容易に合成することができる（文献
７と８を参照）。
【００６５】キメラおよびＣＤＲ移植ヒト化抗体生成物
をコードするＤＮＡ配列の調製には、分子生物学の標準
的方法が利用できる。目的のＤＮＡ配列のすべてまたは
一部は、オリゴヌクレオチド合成技術を用いて合成され
る。部位特異的突然変異誘発やポリメラーゼチェイン反
応（ＰＣＲ）法が適宜使用される。例えばジョーンズ
（Ｊｏｎｅｓ）ら（文献１４）の記載するオリゴヌクレ
オチド指令合成が使用できる。また例えばベレーエン
（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ）ら（文献５）またはリーチマン
（Ｒｉｅｃｈｍａｎ）ら（文献６）の記載する、あらか
じめ存在する可変領域のオリゴヌクレオチド指令突然変
異誘発を使用することもできる。また例えばクィーン
（Ｑｕｅｅｎ）ら（文献９）の記載する、Ｔ４ＤＮＡポ
リメラーゼを用いた、ギャップトオリゴヌクレオチド
（ｇａｐｐｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の
酵素的充填法を使用することもできる。
【００６６】組換え、キメラおよびＣＤＲ移植ヒト化抗
体重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列の発現には、
任意の適当な宿主細胞／ベクター系を使用することがで
きる。Ｆａｂや（Ｆａｂ’）2 断片、および特にＦｖ断
片や１本鎖抗体断片（例えば１本鎖Ｆｖ）などの抗体断
片の発現に、細菌（例えば大腸菌）や他の微生物系を使
用してもよい。大きいＣＤＲ移植抗体生成物（完全な抗
体分子を含む）の産生に、および／またはグリコシル化
生成物が必要な場合は、真核（例えば哺乳動物）宿主細
胞発現系を使用することもできる。適当な哺乳動物宿主
細胞には、ＣＨＯ細胞やミエローマまたはハイブリドー
マ細胞株がある。
【００６７】すなわち本発明はさらに別の面において、
以下のステップよりなる組換えまたはヒト化抗ｈＴＮＦ
α抗体生成物の産生法を与える： （ａ）発現ベクター中で、抗ｈＴＮＦα抗体重鎖をコー
ドするＤＮＡ配列を有するオペロンを産生させる；およ
び／または （ｂ）発現ベクター中で、相補的抗ｈＴＮＦα抗体軽鎖
をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを産生させ
る； （ｃ）宿主細胞をそのベクターまたは各ベクターでトラ
ンスフェクションさせる； （ｄ）トランスフェクションさせた細胞株を培養して組
換え抗ｈＴＮＦα抗体生成物を産生させる。
【００６８】組換えまたはヒト化抗ｈＴＮＦα生成物
は、重鎖または軽鎖由来ポリペプチドのみよりなり、こ
の場合重鎖または軽鎖ポリペプチドのコード配列を用い
て宿主細胞をトランスフェクションする。重鎖と軽鎖の
両方からなる生成物の産生には、細胞株を２つのベクタ
ーでトランスフェクションし、最初のベクターは軽鎖由
来ポリペプチドをコードするオペロンを含有し、２番目
のベクターは重鎖由来ポリペプチドをコードするオペロ
ンを含有する。コード配列と選択マーカーに関する以外
は、各ポリペプチド鎖ができるだけ等しく発現されるよ
うに、好ましくはこれらのベクターは同一である。ある
いは軽鎖由来および重鎖由来ポリペプチドの両方をコー
ドする配列よりなるベクターである、単一のベクターを
使用することもできる。
【００６９】軽鎖および重鎖のコード配列中のＤＮＡ
は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたはその両方よりな
る。本発明はまた、本発明の組換えおよびヒト化抗体生
成物よりなる治療用および診断用組成物を包含し、そし
て治療や診断でのこれらの生成物や組成物の使用を包含
する。
【００７０】さらに別の面において本発明は、薬剤とし
て許容される賦形剤、希釈剤または担体とともに、本発
明の組換えまたはヒト化抗体よりなる治療用または診断
用組成物を与える。
【００７１】本発明はまた、薬剤として許容される賦形
剤、希釈剤または担体に、本発明の組換えまたはヒト化
抗体を混合することよりなる治療用または診断用組成物
の調製法を与える。
【００７２】組換えまたはヒト化抗体は治療用または診
断用組成物中の唯一の活性成分であるか、または他の抗
体成分（例えば抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγまたは抗ＬＰＳ抗
体）、または非抗体成分（例えばキサンチン）よりなる
１つまたはそれ以上の活性成分と一緒に存在してもよ
い。治療用または診断用組成物は単回服用型でもよく、
この場合各単回投与量は本発明の組換えまたはヒト化抗
体の有効量よりなる。
【００７３】さらに本発明は、ヒトまたは動物対象に本
発明の組換えまたはヒト化抗体の有効量を投与すること
よりなる、治療と診断の方法を与える。
【００７４】ヒトまたは動物の体内のＴＮＦのレベルを
低下させることが好ましい任意の治療に、この抗体と組
成物を使用することができる。ＴＮＦは体内を循環して
いるか、または体の特定の部位に有害な高いレベルで局
在して存在することがある。
【００７５】例えば高レベルのＴＮＦは、免疫制御性お
よび炎症性疾患、および敗血症ショック、またはエンド
トキシンショックや心循環系ショックで見られる。この
抗体または組成物は、敗血症、敗血症ショックまたはエ
ンドトキシンショック、悪液質、成人性呼吸不全症候
群、エイズ、アレルギー、乾癬、結核、炎症性骨疾患、
血液凝固疾患、火傷、臓器または組織移植後の拒絶反応
や自己免疫疾患（例えば甲状腺炎のような臓器特異的疾
患、またはリウマチ様関節炎や変形骨関節炎のような非
臓器特異的疾患）などの病状の治療に使用される。
【００７６】さらにこの抗体や組成物は、新生物治療時
のＴＮＦ産生に関連する副作用を緩和したり、抗リンパ
級抗体の使用による移植片拒絶の治療や防止に関連する
症状に関連するショックを排除または緩和したり、また
は多臓器不全（ＭＯＦ）の治療に使用される。
【００７７】本発明の組換えおよびヒト化抗体および組
成物は、好ましくは敗血症、または敗血症／エンドトキ
シンショックの治療に使用される。
【００７８】この抗体や組成物は、その治療法に応じた
適当な型と量で投与される。これは、例えばＴＮＦレベ
ルが高くなることが予想される場合のための予防用で用
いるか、またはＴＮＦが有害な高いレベルに達したかま
たはレベルが上昇しつつある場合にそれを低下させるの
に使用することもできる。
【００７９】この治療または診断用組成物は、投与用に
は任意の適当な型でよく、好ましくは非経口投与（例え
ば薬物全量の１回の注射または連続的点滴のような注射
または点滴）に適した型である。生成物が注射または点
適用の場合、油性または水性賦形剤中の懸濁液または溶
液またはエマルジョン型であり、懸濁剤、保存剤、安定
化剤および／または分散剤などの製剤上の媒体を含有し
てもよい。
【００８０】あるいはこの抗体や組成物は、使用前に適
当な無菌の液体で復元するための乾燥型でもよい。
【００８１】この抗体や生成物が経口投与に適している
場合（例えば抗体断片の場合）、この製剤には活性成分
以外に以下のような添加物を含んでいてもよい：デンプ
ン−例えばジャガイモ、トウモロコシまたは小麦デンプ
ン、またはセルロース−または微結晶セルロースのよう
なデンプン誘導体；シリカ；種々の糖（例えば乳糖）；
炭酸マグネシウムおよび／またはリン酸カルシウム。製
剤が経口投与用の場合、患者の消化器系が許容できるも
のであることが好ましい。このために製剤中に粘液形成
剤や樹脂を含ませることが好ましい。また胃液中で不溶
性のカプセル中に抗体や組成物を調製して許容性を改善
することも好ましい。また放出調節製剤中に抗体や組成
物を入れることも好ましい。
【００８２】本発明のさらに別の面において、有害なほ
ど高いＴＮＦレベルに関連する疾患またはその疾患の危
険のあるヒトまたは動物対象の治療法が与えられ、この
方法は対象に有効量の本発明の抗体や組成物を与えるこ
とよりなる。特にヒトまたは動物対象は、敗血症、また
は敗血症ショックまたはエンドトキシンショックにかか
っているかまたはかかる危険性があるものでもよい。
【００８３】投与すべき抗体の量は、治療すべき病状、
中和すべきＴＮＦが好ましいレベルより高いか高いと予
想される程度、および抗体が予防的に使用されるか、ま
たは現状の症状を治療するのに使用されるかにより、異
なる。投与量はまた、患者の年齢や病状に応じて選択さ
れる。
【００８４】従って例えば生成物が敗血症ショックの治
療または予防に使用される場合、ＴＮＦに対する抗体の
適当な投与量は０．００１−３０ｍｇ／ｋｇ／日の範
囲、好ましくは０．０１−１０ｍｇ／ｋｇ／日、そして
特に好ましくは０．１−２ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００８５】この抗体生成物は診断（例えばインビボ診
断）や高ＴＮＦレベルを含む疾患状態のイメージングに
使用される。
【００８６】添付の図（図１−６）を参照して、本発明
をさらに以下の例で例示のためにのみ記載する。
【００８７】
【実施例】例１ 齧歯類抗ＴＮＦα抗体のＣＤＲ移植 いくつかの齧歯類抗ヒトＴＮＦαＭＡｂを、齧歯類抗Ｃ
Ｄ３抗体ＯＫＴ３のＣＤＲ移植について実質的にＷＯ９
１／０９９６７号に詳細に記載した方法でＣＤＲ移植し
た。本例および以下の実施例で、キメラおよびＣＤＲ移
植ヒト化抗体は、実質的にＷＯ９１／０９９６７号中で
γ4 キメラおよびＣＤＲ移植ＯＫＴ３抗体の調製につい
て記載された、ＩｇＧ４定常領域ドメインを用いて調製
した。しかし他のタイプおよびイソタイプ（例えばＩｇ
Ｇ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３）のヒト定常領域ドメイン
も、記載した方法を有意に変更することなく使用される
ことを理解すべきである。
【００８８】これらの抗ｈＴＮＦα抗体は、齧歯類ＭＡ
ｂである、ＣＢ０００６（６１Ｅ７１としても知られて
いる）、ＣＢ００１０（ｈＴＮＦ１としても知られてい
る）、ｈＴＮＦ３および１０１．４を含んでいた。これ
らの抗体のそれぞれのＣＤＲ移植の簡単な要約を以下に
記す。
【００８９】ＣＢ０００６ ＣＢ０００６についてＷＯ９１／０９９６７号の実施
例、第１２．１．節に記載されたものと同様の解析を行
い、重鎖について１０個の枠組み残基を２３、２４、４
８、４９、６８、６９、７１、７３、７５および８８位
で齧歯類として保持する残基を同定した。この抗体、お
よびｈＴＮＦ３と１０１．４抗体のＣＤＲ移植のために
選ばれたヒト枠組みは、軽鎖についてはＲＥ１で、重鎖
についてはＫＯＬであった。齧歯類ＣＢ０００６（ＣＢ
６）（重鎖と軽鎖）のアミノ酸配列、ＲＥＩ（ＲＥＩ
（軽鎖）およびＫＯＬ（ＫＯＬ）重鎖可変領域ドメイン
のアミノ酸配列は図３に記載されている。
【００９０】３つの遺伝子を作成し、その第１は齧歯類
残基としてアミノ酸残基２３、２４、４８、４９、７１
および７３（ｇＨ３４１（６））をコードしていた。こ
の第１の遺伝子にコードされる可変ドメインのアミノ酸
配列は、図３に重鎖要約中のｇＣＢ６として示されてい
る。第２の遺伝子も齧歯類残基（ｇＨ３４１（８））と
して７５と８８位のアミノ酸残基を有していたが、第３
の遺伝子は齧歯類残基（ｇＨ３４１（１０））として６
８、６９、７５と８８位のアミノ酸残基を追加的に有し
ていた。それぞれｇＬ２２１で同時発現され、図３の重
鎖要約では最小の移植軽鎖（ＣＤＲのみ）はｇＣＢ６と
して示されている。ｇＬ２２１／ｇＨ３４１（６）およ
びｇＬ２２１／ｇＨ３４１（８）抗体のいずれも齧歯類
６１Ｅ７１と同様にＴＮＦに結合した。ｇＬ２２１／ｇ
Ｈ３４１（１０）抗体は発現せず、以後この組合せは取
り上げなかった。
【００９１】次にｇＬ２２１／ｇＨ３４１（６）抗体
を、抗体が溶液中のＴＮＦに対してＬ９２９細胞上のＴ
ＮＦリセプターと競合する、Ｌ９２９細胞競合測定法で
評価した。この測定法でｇＬ２２１／ｇＨ３４１（６）
抗体は齧歯類ＣＢ０００６の約１０％の活性であった。
【００９２】ＣＢ００１０（ｈＴＮＦ１としても知られ
ている） ＣＢ００１０はヒトＴＮＦαのエピトープを認識するモ
ノクローナル抗体である。重鎖および軽鎖可変ドメイン
の両方のＣＤＲ移植にＥＵヒト枠組みを使用した。ＥＵ
（ＥＵ）、ＣＢ００１０（ｈｔｎｆｌ）およびＣＢ００
１０の移植したもの（ｇＥＵ、軽鎖；２ｈＥＵｇ、重
鎖）の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は図１に
記載されている。
【００９３】重鎖 ＣＤＲ移植重鎖で、２６−３５（ＣＤＲ１）、５０−６
５（ＣＤＲ２）、および９５−１０２（ＣＤＲ３）位で
マウスＣＤＲを使用した。４８、６７、６９、７１、７
３、７６、８９、９１、９４および１０８位で枠組み中
にマウス残基を使用した。ＴＮＦ１マウス重鎖とＥＵヒ
ト重鎖残基を比較すると、２３、２４、２９および７８
位でこれらは同一であることが明らかである。
【００９４】軽鎖 ＣＤＲ移植軽鎖で、２４−３４（ＣＤＲ１）、５０−５
６（ＣＤＲ２）および８９−９７（ＣＤＲ３）位でマウ
スＣＤＲを使用した。さらに３、４２、４８、４９、８
３、１０６および１０８位で枠組み中にマウス残基を使
用した。ｈＴＮＦ１マウス軽鎖とＥＵヒト軽鎖残基を比
較すると、４６、５８および７１位でこれらは同一であ
ることが明らかである。
【００９５】移植したＣＢ００１０重鎖はキメラ軽鎖と
同時発現され、ＴＮＦ結合測定法でその生成物の結合能
をキメラ軽鎖／キメラ重鎖生成物と比較した。移植した
重鎖生成物は、完全なキメラ生成物よりＴＮＦより結合
能は少し良いようであった。
【００９６】同様に移植重鎖／移植軽鎖生成物を同時発
現させ、完全なキメラ生成物と比較した結果、キメラ生
成物とほぼ同様の結合能を有していた。しかし移植重鎖
／移植軽鎖生成物をＬ９２９測定法（例４参照）で測定
したとき、活性はキメラ生成物の半分のみであった。従
って実施例２に記載するようにさらにＣＤＲ移植実験を
行った。
【００９７】ｈＴＮＦ３ ｈＴＮＦ３はヒトＴＮＦα上のエピトープを認識する。
ｈＴＮＦ３はＣＢ０００６と比較すると軽鎖および重鎖
可変領域で２１個のみ異なり、軽鎖で１０個（ＣＤＲの
５０、９６位で２つ、枠組みの１、１９、４０、４５、
４６、７６、１０３および１０６位で８つ）、重鎖で１
１個（ＣＤＲ領域の５２、６０および９５位で３つ、枠
組みの１、１０、３８、４０、６７、７３、８７および
１０５位で８つ）である。ｈＴＮＦ３（Ｈｔｎｆ３、軽
鎖；ｈＴＮＦ３、重鎖）、ＣＤＲ移植ｈＴＮＦ３（ｇＨ
ＴＮＦ３、軽鎖；ｇｈＴＮＦ３、重鎖）およびＲＥＩ
（ＲＥＩ、軽鎖）とＫＯＬ（ＫＯＬ、重鎖）の軽鎖と重
鎖の可変ドメインアミノ酸配列は、図４に示してある。
ＣＢ０００６とｈＴＮＦ３キメラ抗体の軽鎖と重鎖は、
直接結合測定法での活性を失うことなく交換できる。し
かしＣＢ０００６はｈＴＮＦ３に比較して、ＴＮＦαに
対するＬ９２９上のＴＮＦリセプターとの競合では、オ
ーダーの大きさで小さい。ＣＢ０００６ＣＤＲ移植デー
タに基づきｇＬ２２１とｇＨ３４１（マウスとして＋２
３、２４、４８、４９、７１および７３）遺伝子をｈＴ
ＮＦ３に対して作成し、試験した結果、得られた移植抗
体はＴＮＦ−αによく結合するが、Ｌ９２９測定法では
わずかしか競合しない。図４に示すように、ｇＬ２２１
遺伝子はｇＨＴＮＦ３をコードし、ｇＨ３４１遺伝子は
ｇｈＴＮＦ３可変ドメイン配列をコードする。この場合
この抗体の競合結合能を改良するために他の枠組み残基
を変換する必要があるかも知れない。
【００９８】１０１．４ １０１．４はヒトＴＮＦ−αを認識するさらに別の齧歯
類ＭＡｂである。この抗体の重鎖はＫＯＬと良好な相同
性を示し、従って軽鎖はＲＥ１で重鎖はＫＯＬに基づい
てＣＤＲ移植を行った。１０１．４（１０１／４）と１
０１．４のＣＤＲ移植したもの（ｇ１０１４）の重鎖お
よび軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とＲＥＩ軽鎖（ｌｒ
ｅｉ）とＫＯＬ重鎖（ＫＯＬ）可変ドメインは図２に示
してある。いくつかの移植重鎖遺伝子をＣＤＲ（ｇＨ３
４１）について控え目な選択で作成し、これは７３、７
８、または７７−７９位にマウスアミノ酸として１つま
たは小数の非ＣＤＲ残基を有していた。これらは、キメ
ラ軽鎖またはカバ（Ｋａｂａｔ）ＣＤＲ移植軽鎖ととも
に同時発現させた。すべての場合にキメラ抗体に相当す
るＴＮＦ結合を示し、ｃＬと同時発現させると得られた
抗体はＬ９２９測定法で充分競合することができた。し
かしｇＬ２２１では、得られた抗体は、Ｌ９２９細胞上
のＴＮＦリセプターとの競合では、ＴＮＦに対して少な
くとも１オーダー弱かった。
【００９９】重鎖中の他の位置でのマウス残基（例えば
２３と２４が一緒、または７６位）は、Ｌ９２９測定法
で移植抗体の競合能を改良することはなかった。
【０１００】例２ 齧歯類抗ヒトＴＮＦα抗体ＣＢ００１０と１０１．４の
さらなるＣＤＲ移植 齧歯類抗ヒトＴＮＦαモノクローナル抗体ＣＢ００１０
と１０１．４を、実質的にＷＯ９１／０９９６７号に記
載された方法でさらにＣＤＲ移植した。
【０１０１】ＣＢ００１０ ＣＢ００１０はヒトＴＮＦα上のエピトープを認識する
モノクローナル抗体である。重鎖および軽鎖両方の可変
ドメインのＣＤＲ移植にＥＵヒト枠組みを使用した。
【０１０２】ＥＵアクセプター、ＣＢ００１０（ｈｔｎ
ｆ１）齧歯類ドナーおよびＣＤＲ移植（ｇＥＵ、軽鎖と
２ｈＥＵｇ、重鎖）抗体の重鎖および軽鎖可変ドメイン
のアミノ酸配列は図１に示してある。
【０１０３】重鎖 ＣＤＲ移植重鎖（２ｈＥＵｇ）では、マウスＣＤＲを３
１−３５（ＣＤＲ１）、５０−６５（ＣＤＲ２）および
９５−１０２（ＣＤＲ３）位で使用した。
【０１０４】また枠組みでマウス残基を１２、２７、３
０、３８、４６、４８、６６、６７、６９、７１、７
３、７６、８３、８９、９１、９４および１０８位で使
用した。ＣＢ００１０マウス重鎖残基とＥＵヒト重鎖残
基を比較すると、２３、２４、２９および７８位で同一
であることがわかる。
【０１０５】軽鎖 ＣＤＲ移植軽鎖（ｇＥＵ）では、マウスＣＤＲを２４−
３４（ＣＤＲ１）、５０−６５（ＣＤＲ２）および８９
−９７（ＣＤＲ３）位で使用した。さらに枠組みでマウ
ス残基を３、４２、４８、４９、１０６および１０８位
で使用した。８３位でヒトコンセンサス残基（バリン）
を使用した。ＣＢ００１０マウス軽鎖残基とＥＵヒト軽
鎖残基を比較すると、４６、５８および７１位で同一で
あることがわかる。
【０１０６】移植したＣＢ００１０重鎖はキメラ軽鎖と
同時発現され、ＴＮＦ結合測定法でその生成物の結合能
をキメラ軽鎖／キメラ重鎖生成物と比較した。移植した
重鎖生成物は、完全なキメラ生成物よりＴＮＦに対して
結合能は少し良いようであった。
【０１０７】同様に移植重鎖／移植軽鎖生成物を同時発
現させ、完全なキメラ生成物と比較した結果、キメラ生
成物とほぼ同様の結合能を有していた。移植軽鎖（ｇＥ
Ｕ）と移植重鎖（２ｈＥＵｇ）の特異的組合せで、図１
に示すように、ＣＤＰ５７１として知られている抗体が
得られる。齧歯類ＣＢ００１０（ＣＢ００１０）、キメ
ラＣＢ００１０（キメラＣＢ００１０）そして移植重鎖
／移植軽鎖生成物（ＣＤＰ５７１）を、標準的測定法で
ヒトＴＮＦαに対する結合を比較した。得られた結果を
以下の表に、各抗体について測定されたＫD （ｐＭ）で
表示した。
【表１】 抗体 ＫD （ｐＭ） ＣＢ００１０ ８０ キメラＣＢ００１０ ８１ ＣＤＰ５７１ ８７
【０１０８】この完全に移植された抗体生成物（ＣＤＰ
５７１）は、現在敗血症と急性移植拒絶の治療について
前臨床開発中である。
【０１０９】１０１．４ １０１．４はヒトＴＮＦα上を認識するさらに別のモノ
クローナル抗体である。この抗体の重鎖はＫＯＬと良好
な相同性を示し、従ってＣＤＲ移植は軽鎖についてはＲ
ＥＩそして重鎖についてはＫＯＬに基づいている。改良
されたＣＤＲ移植生成物が調製された。ＲＥＩ（ｒｅ
ｉ、軽鎖）、ＫＯＬ（ＫＯＬ、重鎖）齧歯類１０１．４
（１０１／４、重鎖および軽鎖）そして完全に移植され
た抗体（ｇ１０１４、重鎖と軽鎖）の可変ドメインのア
ミノ酸配列は図２に示してある。
【０１１０】重鎖 ＣＤＲ移植重鎖（ｇ１０１４）では、マウスＣＤＲを３
１−３５（ＣＤＲ１）、５０−６５（ＣＤＲ２）および
９５−１０２（ＣＤＲ３）位で使用した。また枠組みで
マウス残基を４、１１、２３、２４、２８、７３、７
７、７８、７９、９１、９３、９４および１０８位で使
用した。
【０１１１】軽鎖 ＣＤＲ移植軽鎖（ｇ１０１４）では、マウスＣＤＲを２
４−３４（ＣＤＲ１）、５０−６５（ＣＤＲ２）および
８９−９７（ＣＤＲ３）位で使用した。さらに枠組みで
マウス残基を１、３、４、３９、７３、１０５および１
０７位で使用した。１０４位でヒトコンセンサス残基
（バリン）を使用した。
【０１１２】完全に移植した重鎖と軽鎖（ｇ１０１４）
は同時発現され、ＴＮＦに対する結合能を、齧歯類およ
びキメラ１０１．４とそして完全移植された（ｇＥＵ／
２ｈＥＵｇ、ＣＤＰ５７１）ＣＢ００１０抗体と比較し
た。完全に移植した１０１．４抗体は、齧歯類、キメラ
および移植ＣＢ００１０抗体と同様のＴＮＦ−αに対す
る結合性を有していた。
【０１１３】例３ 齧歯類およびＣＤＲ移植抗体のインビトロの比較 Ａ．齧歯類ＣＢ００１０とＣＤＰ５７１の親和性測定 材料と方法 材料 ： ＰＢＳ／ＢＳＡ： ダルベッコーＰＢＳ＋１％（Ｗ／
Ｖ）ウシ血清アルブミン。 ＴＮＦ ： ＰＢＳ／ＢＳＡ中５０ｎＭ組換えヒトＴＮＦ
アルファ（ビッセンドルフバイオケミカルズ（Ｂｉｓｓ
ｅｎｄｏｒｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃｌａｓ））、０．８
５μｇ／ｍｌ。保存 125Ｉ−ＴＮＦ ： ５μＣｉ、１８５ｋＢｑ（アマ
シャムインターナショナル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））を５００μｌの水に溶解させ
−７０℃で保存。使用溶液 125Ｉ−ＴＮＦ ： 力価測定曲線で−６２ｐＭ
でスキャチャード解析で１２４ｐＭ、ＰＢＳ／ＢＳＡ
中。抗体 ： 精製齧歯類ＣＢ００１０（ｍＨＴＮＦ１）とＣ
ＤＰ５７１をＡ２８０ｎｍ（Ｅ1mg/ml,280nm＝１．４）
で定量し、力価測定用の１μｇ／ｍｌに、またはスキャ
チャード解析用に２００ｎｇ／ｍｌに希釈した。イムノビーズ ： ヤギ抗齧歯類ＩｇＧ全分子−アガロー
スまたはヤギ抗ヒトＩｇＧ全分子−アガロース（シグマ
（Ｓｉｇｍａ））を希釈しないで使用した。
【０１１４】方法：抗体力価測定 ： ｍＨＴＮＦ１とＣＤＰ５７１を２倍希
釈系列（各１００μｌ）で力価測定して全部で１６個の
試料を作成し 125Ｉ−ＴＮＦ（１００μｌ、６２ｐＭ）
を加えた。抗体の最終の最大濃度は５００ｎｇ／ｍｌで
あり 125Ｉ−ＴＮＦは３１ｐＭであった。対照試験管
（８）は 125Ｉ−ＴＮＦとＰＢＳ／ＢＳＡのみであっ
た。試料を放置して一晩攪拌して平衡化させた。平衡化
後、２５μｌのヤギ抗マウス−アガロースをｍＨＴＮＦ
１試料に加え、総 125Ｉ−ＴＮＦ対照を除いてＣＤＰ５
７１に５０μｌのヤギ抗ヒトビーズを加えた。対照の４
つにビーズを加え、これらの試料の上澄液のカウントを
ビーズの代わりにＰＢＳ／ＢＳＡを含む試料のカウント
と比較して、アガロースビーズに対する 125Ｉ−ＴＮＦ
の非特異的吸着を補正した。室温で１時間平衡化した
後、ＰＢＳ／ＢＳＡ（０．５ｍｌ）を加え、試料を２０
℃で１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄液
（０．５ｍｌ）を取り、ガンマカウンター中で放射能を
測定した。
【０１１５】125Ｉ−ＴＮＦと非標識ＴＮＦ（２５％と
７５％ 125Ｉ−ＴＮＦで）の混合物の存在下で同じ総濃
度で抗体力価測定を行い、この測定法で 125Ｉ−ＴＮＦ
は非標識物質と同じ挙動をすることを確認した。
【０１１６】スキャチャード解析： 両方の抗体につい
て非標識ＴＮＦ（１００μｌ、５０ｎＭ）を１３の二倍
希釈系列で２重測定で力価測定した。各抗体についてＴ
ＮＦの代わりにＰＢＳ／ＢＳＡを含有する１つの試料を
含めた。各試料に 125Ｉ−ＴＮＦ（５０μｌ、１２４Ｐ
ｍ）を加えた。次に力価測定曲線から求められる一定量
の抗体（５０μｌ、２００ｎｇ／ｍｌ）を加えた。
【０１１７】こうして以下の最終濃度が得られた： 抗
体、５０ｎｇ／ｍｌ；ＴＮＦ、２５ｎＭの最高濃度；
125Ｉ−ＴＮＦ、３１ｐＭ。試料を一晩放置して平衡化
させた後、抗体力価測定試料と全く同様に処理した。
【０１１８】計算：力価測定曲線
【数１】 Ｂ／Ｔを抗体濃度に対してプロットし、スキャチャード
解析の使用に適した抗体濃度をＢ／Ｔ＝０．６で選ん
だ。
【０１１９】スキャチャード解析 ２重測定の平均を用いた。
【数２】 結合ＴＮＦに対してＢ／Ｆをプロットし−１／Ｋd を求
め、そこからＫd を計算した。
【０１２０】結果 齧歯類ＣＢ００１０とＣＤＰ５７１の解離定数
【表２】 抗体 Ｋd ・Ｍ 齧歯類ＨＴＮＦ１ １．３×１０-10 ＣＤＰ５７１ １．４×１０-10
【０１２１】Ｂ．ＨＲＰ結合した齧歯類ＣＢ００１０
（Ｍｕｈｔｎｆｌ）とＣＤＰ５７１（ＧｒｈＴＮＦ１）
の齧歯類ＣＢ００１０中でのｒｈｕＴＮＦへの結合に対
する競合方法 ９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク（Ｎｕｎ
ｃ）、マキシソルブ（Ｍａｘｉｓｏｒｂ））を１００μ
ｌ／ウェルＴＮＦを０．５μｇ／ｍｌで被覆した。齧歯
類または移植抗体の連続希釈をＰＢＳ／１％ＢＳＡ希釈
液で、２００μｇ／ｍｌから０．１μｇ／ｍｌに調製し
た。各ウェルに５０μｌの抗体を加えた後、５０μｌの
ＨＲＰ−齧歯類ＣＢ００１０を３つの濃度（０．６２
５、０．３１５そして０．１６μｇ／ｍｌ）で加えた。
プレートを室温で２時間攪拌してインキュベートし、Ｐ
ＢＳで４回洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質を加えた。
光学密度（ＯＤ）を測定し、抗体濃度に対してＯＤをプ
ロットした。
【０１２２】結論 齧歯類抗体（ＭｕｈＴＮＦ１）と移植抗体（ＧｒｈＴＮ
Ｆ１）の曲線は重ね合わせることができ、両抗体がＴＮ
Ｆへの結合に対して同様の親和性を有することを示して
いた（図５参照）。
【０１２３】例４ 齧歯類ＣＢ００１０とＣＤＲ移植ＣＤＰ５７１抗体のバ
イオアッセイと動物モデル実験での比較 Ａ．Ｌ９２９測定法でのＣＢ００１０とＣＤＰ５７１に
よるＴＮＦの中和 親の齧歯類抗体ＣＢ００１０（ｈＴＮＦ１）とＣＤＲ移
植抗体ＣＤＰ５７１が組換えヒトＴＮＦを中和する能力
を、Ｌ９２９バイオアッセイを用いて求めた。この測定
法では、ＴＮＦにより殺されるＬ９２９マウス繊維芽細
胞様細胞株を使用した。この測定は１μｇ／ｍｌアクチ
ノミオシンＤ（これは細胞をＴＮＦに対してより感受性
にする）の存在下で行われる。２つの抗体の連続希釈液
を一定量の組換えヒトＴＮＦ（１００ｐｇ／ｍｌ）と混
合し、９６穴ウェルの平底プレート中のモノレーヤーに
加えた。１６時間のインキュベート後、ＴＮＦで殺され
なかった細胞はクリスタルバイオレット染色で見えるよ
うにした。中和されなかった見かけのＴＮＦ（残存ＴＮ
Ｆ）量は、組換えＴＮＦ標準曲線と比較して求めた。残
存ＴＮＦを抗体濃度に対してプロットした代表的実験の
結果を図６に示す。ＣＢ００１０とＣＤＰ５７１は同様
の中和活性を有することがわかる。
【０１２４】Ｂ．ヒヒの敗血症モデルに対するＣＤＰ５
７１の効果 この研究ではＣＤＰ５７１で前前処理する場合の、重症
敗血症（死亡を含む）の生理への影響を評価した。ＣＤ
Ｐ５７１はヒヒのＴＮＦを中和することが知られている
ため、研究すべき関連の種としてヒヒを選んだ。
【０１２５】雄の大人のヒヒ（パピオウルシヌス（Ｐａ
ｐｉｏ ｕｒｓｉｎｕｓ））（体重２０−２５ｋｇ）
を、塩酸ケタミンとペンタバルビトンナトリウムで麻酔
し、血圧、心臓指数（サーモヂリューション（ｔｈｒｍ
ｏｄｉｌｕｔｉｏｎ）による）、心電図および右心房充
填圧測定のために装置を取り付けた。食塩水のみまたは
抗体の灌流を２．５ｍｌ／ｋｇ／時間の速度で１２０分
間行い、次に同じ速度でさらに１２０分間生きた大腸菌
を灌流した。使用した細菌株はヒンショーのＢ７株（Ｈ
ｉｎｓｈａｗ’ｓ ｓｒａｉｎ Ｂ７）（〔０８６ａ：
６１〕、ＡＴＣＣ３３９８５）で、対数増殖期のものを
２×１０9 ＣＦＵ／ｍｌで投与し、灌流の最後の血漿中
濃度は２−２．５×１０5 ＣＦＵ／ｍｌであった。この
１２０分の後、動物を元のケージに帰し、食物と飲物は
自由に与え、心循環系の変化を日に２回３日間追跡し
た。必要な場合は充分な右心房充填圧を維持するために
調整した、一定量の液体の５ｍｌ／ｋｇ／時間の代替灌
流をすべての動物に行った。治療中に死亡したヒヒまた
は７２時間の実験期間を生き延びた後殺したヒヒを死体
解剖した。半定量スケールで肉眼病理学的傷害をすべて
の臓器について評価した（＋＋＋が最も重症である）。
【０１２６】動物はランダムに４つの処理群の１つに割
り当てた； −食塩水のみ −ＣＤＰ５７１ ０．１ｍｇ／ｋｇ −ＣＤＰ５７１ １．０ｍｇ／ｋｇ −ＣＢ００１０ ０．１ｍｇ／ｋｇ（親齧歯類抗体）
【０１２７】生存および累積臓器傷害スコアを表１に示
す。このモデルで１．０ｍｇ／ｋｇのＣＤＰ５７１は死
亡を防ぎ、臓器傷害の発生率を有意に（Ｐ＜０．００
５）減少させた。さらにこれらの効果は濃度依存性であ
った（Ｐ＜０．００５）。さらにＣＢ００１０で見られ
た生存率と臓器傷害スコアは、同じ投与量でＣＤＰ５７
１と同じであり、その親齧歯類抗体に比較してＣＤＰ５
７１の維持されたインビボ活性を示していた。
【０１２８】ヒヒの敗血症実験 食塩水またはＣＤＰ５７１の後２×１０9 ＣＦＵ／ｍｌ
の大腸菌を２時間静脈内投与した後の生存率
【表３】
【０１２９】文献 1. Kohler & Milstein, Nature, 265, 295-497, 197
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【０１３０】
【発明の効果】本発明のキメラ抗体分子はヒトＴＮＦα
に対して特異性を有するヒト化抗体であり、ヒトの治療
に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトアクセプター抗体ＥＵ（１ＥＵ）重鎖およ
び軽鎖、齧歯類ＭＡｂのＣＢ００１０（ｈｔｎｆｌ）お
よびヒト化ＣＤＲ移植軽鎖（ｇＥＵ）および重鎖（２ｈ
ＥＵｇ）の、可変ドメインのアミノ酸配列。
【図２】ヒトアクセプター抗体ＲＥＩ（１ｒｅｉ）（軽
鎖）とＫＯＬ（ＫＯＬ）（重鎖）、齧歯類ＭＡｂの１０
１．４（１０１／４）の重鎖と軽鎖、およびヒト化移植
軽鎖と重鎖（いずれもｇ１０１４）の可変領域ドメイン
のアミノ酸配列。
【図３】ヒトアクセプター抗体ＲＥＩ（ＲＥＩ）（軽
鎖）とＫＯＬ（ＫＯＬ）（重鎖）、齧歯類ＭＡｂのＣＢ
０００６（ＣＢ６）の重鎖と軽鎖、およびヒト化移植軽
鎖と重鎖（いずれもｇＣＢ６）の可変領域ドメインのア
ミノ酸配列。
【図４】ヒトアクセプター抗体ＲＥＩ（ＲＥＩ）（軽
鎖）とＫＯＬ（ＫＯＬ）（重鎖）、齧歯類ＭＡｂのＨＴ
ＮＦ３の重鎖（ＨＴＮＦ３）と軽鎖（ｈＴＮＦ３）、お
よびヒト化移植軽鎖（ｇＨＴＮＦ３）と重鎖（ｇｈＴＮ
Ｆ３）の可変領域ドメインのアミノ酸配列。
【図５】齧歯類ＣＢ００１０（ｈＴＮＦ１）とＣＤＲ移
植ＣＢ００１０（ＧｒｈＴＮＦ１；ＣＤＰ５７１）が、
組換えヒトＴＮＦαに対する結合について、ＨＲＰ−結
合齧歯類ＨＴＮＦ１と競合する能力を比較したグラフ。
【図６】齧歯類ＨＴＮＦ１（ＣＢ００１０）とＣＤＲ移
植ＨＴＮＦ１（ＣＰ５７１）が、Ｌ９２９バイオアッセ
イで組換えＴＮＦαを中和する能力を比較したグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＡ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＡ ＡＤＳ ＡＤＳ ＡＤＹ ＡＤＹ ＡＤＺ ＡＤＺＤ ＡＧＡ ＡＧＡ ＡＧＺ ＡＧＺＮ Ｃ０７Ｋ 16/24 Ｃ０７Ｋ 16/24 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/577 33/577 Ｂ (72)発明者 エムターゲ，ジョン スペンサー イギリス国エスエル７ １エスキュー バ ックス，マーロウ，テムプル，テムプル ミル アイランド，49 (72)発明者 ボッドマー，マーク ウィリアム イギリス国オウエックス１ ５エイエス オックスフォード，サウス ヒンクシィ, マノー ロード，５，ローズ コテッジ

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒトＴＮＦ−αに対して特異性を有する
    キメラ抗体分子。
  2. 【請求項２】 検出することができるように標識された
    形態の請求項１記載のキメラ抗体分子。
  3. 【請求項３】 軽鎖及び重鎖の定常部がヒト由来である
    請求項１又は請求項２記載のキメラ抗体分子。
  4. 【請求項４】 軽鎖及び重鎖の可変ドメインが齧歯類由
    来である請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラ抗
    体分子。
  5. 【請求項５】 前記可変ドメインが齧歯類モノクローナ
    ル抗体６１Ｅ７１、ｈＴＮＦ１、ｈＴＮＦ３及び１０
    １．４のいずれか一つから由来する請求項４記載のキメ
    ラ抗体分子。
  6. 【請求項６】 ヒトＴＮＦ−αの中和エピトープに結合
    する請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラ抗体分
    子。
  7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか一項に記載のキ
    メラ抗体と薬剤学的に許容可能な担体とを含む薬剤組成
    物。
  8. 【請求項８】 ＴＮＦ−αにより仲介される病態の処置
    に使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載
    のキメラ抗体分子。
  9. 【請求項９】 ＴＮＦ−αにより仲介される病態の処置
    に使用するための、請求項７記載の薬剤組成物。
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