JP3145401B2 - ＴＮＦ―αに特異的な組換え抗体 - Google Patents

ＴＮＦ―αに特異的な組換え抗体

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、腫瘍壊死因子アルファ（TNF−α）の抗原
決定基に対する特異性を有する組換え（特にヒト化）抗
体分子、組換えDNA法を用いるその製造方法、およびそ
の治療への使用に関する。
本発明において、「組換え抗体分子」という用語は、
任意の組換えDNA技術を含む任意の方法により産生され
る抗体分子（天然の免疫グロブリンまたはその断片の任
意の類似物を含む）を意味する。
また本発明において、「ヒト化抗体分子」という用語
は、分子の抗原結合部位はヒト以外の種の免疫グロブリ
ン由来であり、分子の残りの免疫グロブリンはヒト免疫
グロブリン由来である分子を意味する。すなわち、ヒト
化抗体分子は、ヒト定常領域ドメインに結合した完全な
非ヒト重鎖および／または形鎖可変領域ドメインよりな
るヒト化キメラ抗体分子を含む。ヒト化抗体分子はまた
重鎖および／または軽鎖ヒト可変領域枠組み構造（fram
ework）に移植された非ヒト抗体からの１つまたはそれ
以上のCDRよりなる、CDR移植ヒト化抗体分子も含む。
抗体の抗原結合特異性は、可変領域の枠組み領域上に
存在する比較的短いペプチド配列である相補性決定領域
（CDR）により決定される。重鎖および軽鎖可変領域ド
メインのそれぞれには３つのCDR（CDR1、CDR2、およびC
DR3）がある。
モノクローナル抗体を表すのに略語「MAb」を使用す
る。本明細書において文献は番号で示され、これらの文
献は本説明の最後に番号順に記載されている。
発明の背景 天然の免疫グロブリンは酵素的切断により得られる、
種々の断片（例えばFab、Fv、（Fab′）２およびFc断
片）を有することはもう何年も知られている。天然の免
疫グロブリンは、一般に抗原結合部位が各腕（arm）の
末端あたりに存在するＹ字形の分子である。免疫グロブ
リンの残りの部分（特にＹ字形の幹の部分）は、免疫グ
ロブリンに関連するエフェクター機能を媒介する。
天然の免疫グロブリンは測定、診断、そして限定され
てはいるが治療にも使用されてきた。しかしこのような
使用（特に治療での使用）は、天然の免疫グロブリンが
ポリクローナル性であることにより最近まで邪魔されて
きた。治療薬としての免疫グロブリンの可能性の実現に
おける重要な進展は、一定の特異性を有するモノクロー
ナル抗体（MAb）の再現性のある産生方法発見である
（１）。
しかし多くのMAbは、齧歯類の脾臓細胞と齧歯類のミ
エローマ細胞の融合物であるハイブリドーマにより産生
される。従ってこれらは基本的に齧歯類の蛋白である。
ヒトMAbの産生についてはほとんど報告がない。
入手できるほとんどのMAbは齧歯類由来であるため、
それらはヒトにおいて抗原性を有し、ヒトに投与された
場合、HAMA（ヒト抗マウス抗体）と呼ばれる好ましくな
い免疫応答を引き起こす。従ってヒトは齧歯類のMAbに
対して免疫応答をして、それを完全に排除したりまたは
少なくともその有効性を低下させるため、ヒトにおける
齧歯類MAbの治療薬としての使用は本質的に限定され
る。実際には齧歯類に由来するMAbは、HANA応答がMAbの
有効性を低下させたり好ましくない反応を引き起こすた
め、１回または数回以上治療に使用することはできな
い。例えばＴ細胞リセプター−CD3複合体中の抗原を認
識するOKT3、マウスIgGa/KMAbは、急性同種移植片拒絶
の治療における免疫抑制剤として世界中の多くの国で使
用されてきた（チャテノウ（Chatenoud）ら（２）とジ
ェファーズ（Jeffers）ら（３）。しかしこの抗体や他
の類似のMAbが本質的に齧歯類のものであることから、
使用により主要な抗イディオタイプ成分を含むかなりの
免疫応答が蓄積する。従ってこの好ましくないHANA応答
を減弱または排除して、このような抗体の使用範囲を広
げることが好ましい。
従ってヒトにおいて非ヒトMAbのヒトにおける抗原性
を減弱させることが提唱されている。このような技術は
総称的に「ヒト化」法と呼ばれている。これらの方法は
典型的には組換えDNA法を用いて、抗体分子のポリペプ
チド鎖をコードするDNA配列を操作することよりなる。
MAbをヒト化する初期の方法は、１つの抗体の完全な
可変領域ドメインよりなる抗原結合部位が別の抗体由来
の定常領域に結合した、キメラ抗体の産生であった。こ
のようなキメラ化の方法は、ヨーロッパ特許0120694号
（セルテック社（Celltech Limited））、ヨーロッパ特
許0125023号（ジェネンティック社（Genentech Inc.）
とシティオブホープ（City of Hope））、ヨーロッパ特
許出願第0171496号（レス・デブ・コープ（Res.Dev.Cor
p.）、日本）、ヨーロッパ特許出願0173494号（スタン
フォード大学）およびWO86/01533号（セルテック社（Ce
lltech Limited））に記載されている。これらの先行特
許出願は、一般にマウスMAbの可変ドメインとヒト免疫
グロブリンの定常ドメインを有する抗体分子の調製法を
開示している。しかしこのようなキメラ抗体は、まだか
なりの部分の非ヒトアミノ酸配列（すなわち完全な非ヒ
ト可変ドメイン）を含み、従って特に長期に投与された
場合まだHANAを引き起こす可能性がある（ベジェント
（Begent）ら（文献４））。
ヨーロッパ特許出願第0239400号（ウィンター（Winte
r））記載の別の方法では、長いオリゴヌクレオチドを
用いて部位特異的突然変異誘発により、ヒト免疫グロブ
リンの可変ドメインの枠組み領域上に、マウスMAbの相
補性決定領域（CDR）が移植された。このようなCDR移植
ヒト化抗体は、ヒト化キメラ抗体より含有する非ヒトア
ミノ酸配列の割合が低いため、HANA応答を引き起こす可
能性ははるかに小さい。
CDR移植によりMAbをヒト化する初期の研究は、合成抗
原（例えばNP抗原またはNIP抗原）を認識するMAbについ
て行われた。しかしCDR移植によりライソゾームを認識
するマウスMAbとヒトＴ細胞上の抗原を認識するラットM
Abをヒト化する例は、ベレーエン（Verhoeyen）ら
（５）とリーチマン（Riechman）ら（６）によりそれぞ
れ記載されている。ヒトＴ細胞上の抗原に対するCDR移
植抗体の調製は、WO89/07452号にも記載されている（メ
ディカルリサーチカウンシル（Medical Research Counc
il））。
リーチマン（Riechman）ら／メディカルリサーチカウ
ンシルでは、CDR領域のみの移動（カバ（Kabat）により
規定されている、文献（７）と（８））は、CDR移植生
成物に満足できる抗原結合活性を与えるのに充分でない
ことが見いだされた。リーチマン（Riechman）らは、抗
原結合活性の改良されたCDR移植生成物を得るには、ヒ
ト重鎖配列の27位のセリン残基を対応するラットのフェ
ニルアラニン残基に変換することが必要であることを見
いだした。重鎖の27位のこの残基はCDR1に隣接した構造
ループ中にある。追加的に重鎖の30位のヒトセリンもラ
ットチロシンに変換した別の作成物は、27位のみのセリ
ンをフェニルアラニンへ変換したヒト化抗体に対して、
結合活性が有意に変化しているということはなかった。
これらの結果は、さらに複雑な抗原を認識するCDR移植
抗体について有効な抗原結合活性を得るには、CDR領域
以外のヒト配列（特に重鎖のCDR1に隣接する構造ループ
中）の残基の変換が必要なことがあることを示してい
る。しかしそれにしても得られた最高のCDR移植抗体の
結合親和性は、本来のMAbよりまだ有意に小さかった。
最近クイーン（Queen）ら（９）は、齧歯類のMAb（抗
Tac）のCDRをヒト免疫グロブリン枠組みと定常領域に結
合させて、インターロイキン２リセプターに結合するヒ
ト化抗体の調製を記載している。このヒト枠組み領域
は、抗TacMAb配列との相同性を最大にするために選ばれ
た。さらに、CDRまたは抗原と相互作用する可能性のあ
る枠組みアミノ酸残基を同定するためにコンピューター
モデリングが使用され、ヒト化抗体においてこれらの位
置でマウスのアミノ酸が使用された。
WO90/07861号においてクイーン（Queen）らは、ヒト
化免疫グロブリンをデザインするための４つの基準を提
唱している。第１の基準は、ヒトアクセプターとして、
ヒト化される非ヒトドナー免疫グロブリンに極めて相同
性のある枠組みを用いるか、または多くのヒト抗体から
のコンセンサス枠組み（consensus framework）を使用
することである。第２の基準は、枠組みの特定の残基で
ヒトアクセプター残基が通常ではなくてドナー残基がヒ
ト配列に典型的な場合は、アクセプターよりもドナーア
ミノ酸を使用することである。第３の基準は、CDRにす
ぐ隣接する位置ではアクセプターよりもドナー枠組みア
ミノ酸残基を使用することである。第４の基準は、３次
元の免疫グロブリンモデルにおいて、ドナーアミノ酸残
基の側鎖の原子がCDRの約３Å以内にあり、抗原または
ヒト化免疫グロブリンのCDRと相互作用することが予想
される枠組みの位置ではドナーアミノ酸を使用すること
である。第２、第３または第４の基準は第１の基準に加
えてまたはその代わりに使用することができ、単独でま
たは組合せて適用することができることが提唱されてい
る。
WO90/07861号は、単一のCDR移植ヒト化抗体である、
インターロイキン２リセプターのp55Tac蛋白に対して特
異性を有するヒト化抗体の調製について詳細に記載して
いる。このヒト化抗体のデザインに当たって上記の４つ
のすべての基準が使用され、ヒト抗体EU（７）の可変領
域枠組みがアクセプターとして使用された。得られたヒ
ト化抗体では、ドナーCDRはカバ（Kabat）ら（７と８）
により規定されているものであり、さらに可変領域枠組
みの、重鎖中の27、30、48、66、67、89、91、94、10
3、104、105および107位で、そして軽鎖の48、60および
63位でヒトアクセプター残基の代わりにマウスドナー残
基が使用された。得られたヒト化抗Tac抗体はp55に対し
て３×109M-1の親和性（齧歯類のMAbの約３分の１）を
有すると報告されている。
我々はさらに、CDR移植ヒト化抗体分子の調製を研究
し、満足できる結合親和性を有するCDR移植生成物を得
るのに残基のアミノ酸の種類が重要である、可変領域の
枠組み内（カバ（Kabat）CDRおよび可変領域の構造ルー
プの外）に位置のヒエラルキーがあることを同定した。
これにより我々は、ドナー免疫グロブリンとアクセプタ
ー枠組みの相同性のレベルに関係なく、満足できるCDR
移植生成物を得るための非常に広く適用できる方法を確
立することができた。我々が決定的に重要であると同定
した残基のセットは、クイーン（Queen）ら（９）の同
定した残基と重複するが全く同じではない。我々の同時
係属国際特許出願WO91/09967号は、任意の目的の特異性
を有するCDR移植（特にヒト化）抗体重鎖および軽鎖、
および完全な分子の調製の方法を記載している。国際特
許出願WO91/09967号の完全な開示は参考のため本明細書
中に引用されている。
テンペスト（Tempest）ら（10）はつい最近、インビ
ボでのヒト呼吸シンシチアルウイルス（respiratory sy
ncytial virus）（RSV）感染の阻害に使用する再構成し
たモノクローナル抗体の調製について記載している。こ
の再構成した抗体は、RSV感染を中和する齧歯類のMAbの
CDRをコードする合成合成オリゴヌクレオチドを、部位
特異的突然変異誘発により、ヒトIgG1モノクローナル抗
体の枠組みをコードするDNA中に移植することにより調
製された。しかしマウスとヒトの間でCDRのみを移した
この単純な再構成抗体は、RSVに対する結合は極めて弱
くバックグランドと有意差がなかった。結合能力を部分
的に回復させるために、重鎖のCDR3に隣接する枠組み領
域中で、さらにヒト残基からマウスの残基に変換するこ
とが必要であった。テンペスト（Tempest）らは、WO91/
09967号の方法で同定された重要な部位でヒト残基をマ
ウス残基に変換しなかった。
TNFαは免疫系の細胞により放出され相互作用するサ
イトカインである。すなわちTNFαはグラム陰性細菌の
リポ多糖類（LPS）により活性化されるマクロファージ
から放出される。このようなTNFαは、細菌性敗血症に
関連したエンドトキシンショックの進展と病因に関与し
ている最も重要な内因性メディエーターのようである
（ボイトラー（Beutler）ら（11））。しかし今日この
ような治療での使用に入手できるTNFαに対する抗体
は、典型的には齧歯類のMAbである。従って１回または
数回以上治療に使用されると好ましくないHAMA（ヒト抗
マウス抗体）応答を引き起こす可能性があることから、
これらのMAbはヒトでの治療への利用が限定される。し
かしヒトの治療に使用できるヒト化抗TNFα生成物を調
製することは、極めて好ましい目的である。
我々の同時係属国際特許出願WO91/09967号は、特にTN
Fαに対する特異性を有するヒト化CDR移植抗体生成物の
調製について記載している。特にWO91/09967号は、例５
において、61E71（またはCB0006としても知られてい
る）、hTNF1（またはCB0010としても知られている）、h
TNF3および101.4として同定されている齧歯類抗ヒトTNF
αMAb由来の、ヒトTNFαに対する特異的ヒト化CDR移植
抗体の調製について記載している。本出願は特に、ヒト
TNFαに対する組換え（特にヒト化）抗体に関し、WO91/
09967号に記載されているものおよび、hTNF1（DB0010）
や101.4齧歯類MAbに基づく、ヒトTNFαに対するさらに
改良されたヒト化CDR移植抗体を含む。種々の抗ヒトTNF
α齧歯類MAbのその後の研究は、hTNF1と101.4は抗TNF治
療での使用において特に好ましい性質を有していること
が明らかになった。
発明の概要 従って本発明は、ヒトTNFαに対する特異性を有する
組換え抗体分子を与える。
本発明の組換え抗体分子はTNF中和性である（すなわ
ちインビトロまたはインビボで測定したときヒトTNFα
の生物活性を阻害する）。
好ましくは本発明は、齧歯類MAbのCB0006、CB0010、h
TNF3または101.4（特に齧歯類MAbのCB0010または101.
4）由来の抗原結合部位を有する組換え抗体分子を与え
る。
好ましくは本発明の組換え抗体分子は、キメラヒト化
抗体分子およびCDR移植ヒト化抗体分子を含むヒト化抗
体分子である。
本発明において、「キメラヒト化抗体分子」とは、ヒ
ト定常ドメインに結合した完全な非ヒト（例えば齧歯類
MAb）可変ドメインよりなり、「CDR移植ヒト化抗体分
子」は、ヒトの重鎖および／または軽鎖可変領域枠組み
に移植された非ヒト抗体（例えば齧歯類MAb）からの１
つまたはそれ以上のCDRを含む抗体重鎖および／または
軽鎖よりなる。
本発明のCDR移植ヒト化抗TNFα抗体生成物は、WO91/0
9967号の発明の第１、第２、第３および第４の面に記載
された抗ヒトTNFα抗体重鎖および／または軽鎖および
分子生成物よりなる。
発明の詳細な説明 第１の実施態様において本発明は、ヒトアクセプター
枠組みとドナー抗原結合領域よりなる可変領域ドメイン
を有する、CDR移植ヒト化抗hTNFα抗体重鎖を与え、こ
こで枠組みは、６、23および／または24、48および／ま
たは49、71および／または73、75および／または76およ
び／または78、そして88および／または91位の少なくと
も１つでドナー残基を含む。
好ましくは第１の実施態様で、重鎖枠組みは、23、2
4、49、71、73および78位、または23、24および49位で
ドナー残基を含む。重鎖枠組みの71、73および78位の残
基は、好ましくはすべてアクセプターであるかまたはす
べてドナー残基である。
特にこれらの第１の実施態様において、重鎖枠組みは
さらに６、37、48および94位の１つ、いくつかまたはす
べてでドナー残基を含む。またドナーとアクセプターの
間で保存されていなくても、種間で普通保存されている
重鎖枠組みの位置（すなわち２、４、25、36、39、47、
93、103、104、106および107位）の残基は、ドナー残基
を追加的に含むことが好ましい。最も好ましくは重鎖枠
組みは２、４、６、25、36、37、39、47、48、93、94、
103、104、106および107位でドナー残基を追加的に含
む。
さらに重鎖枠組みは以下の位置の１つ、いくつかまた
はすべてでドナー残基を随時追加的に含む： １と３、 72と76、 69（ドナーとアクセプターの間で48が異なる場合）、 38と46（48がドナー残基である場合）、 80と20（69がドナー残基である場合）、 67、 82と18（67がドナー残基である場合）、 91、 88、および ９、11、41、87、108、110および112のうちの任意の１
つまたはそれ以上。
本発明の記載においてドナー抗体は典型的には、非ヒ
ト抗hTNFα抗体（例えば齧歯類MAb）であり、アクセプ
ター抗体はヒト抗体である。
本発明のCDR移植ヒト化抗hTNFα抗体では、ドナー抗
原結合領域は典型的にはドナー抗体からの少なくとも１
つのCDRを含む。通常ドナー抗原結合領域は、重鎖およ
び／または軽鎖可変領域のおのおのの、少なくとも２つ
好ましくは３つのCDRを含む。このCDRはカバ（Kabat）C
DR、構造ループCDRまたはカバ（Kabat）CDRと構造ルー
プCDRの組合せ、およびこれらの任意の組合せよりな
る。
好ましくはCDR移植重鎖可変ドメインの抗原結合領域
は、CDR2（50−65）とCDR3（残基95−102）でカバ（Kab
at）CDRを含み、CDR1（26−35）でカバ（Kabat）CDRと
構造ループCDRの組合せを含む。これらの好適なCDR名
は、好ましくは第１の好適な実施態様のCDR移植重鎖に
含まれる（すなわち残基26−30はCDR1に含まれる）。
上記および本発明の別のところに記載されるの残基名
は、カバ（Kabat）の番号付け（文献（７）と（８））
に従い番号が付けられている。すなわち残基名は必ずし
もアミノ酸配列の直線的番号付けと直接一致しない。実
際の直線的アミノ酸配列は、枠組みであろうとCDRであ
ろうと、基礎的な可変ドメイン構造生成物の短縮または
挿入により、厳しいカバ（Kabat）の番号付けよりもア
ミノ酸数が少ないまたは多いことがある。例えばクイー
ン（Queen）ら（９）に記載された抗Tac抗体の重鎖可変
領域は、カバ（Kabat）の番号付けで、CDR2の残基52の
後に１つのアミノ酸挿入体（残基52a）、枠組み残基82
の後に３つのアミノ酸挿入体（残基82a、82bおよび82
c）を含む。ある抗体について、残基の正しいカバ（Kab
at）番号は、「標準」カバ（Kabat）番号配列との、抗
体の配列の相同性領域での配向により決定される。
前述およびさらに本発明の別の場所で記載されるよう
に、本発明のCDR移植ヒト化抗体分子の実施態様が特定
のドナー／アクセプター抗体対に提供されるとき、ドナ
ー残基に変換すると決められた位置でドナーとアクセプ
ターのアミノ酸残基が同じことがあり、従ってアクセプ
ター枠組み残基に変換は必要でないことがあることは理
解されるであろう。
本発明は第２の好適な実施態様において、枠組みが１
および／または３、そして46および／または47位の少な
くとも１つでドナー残基を含むヒトアクセプター枠組み
とドナー抗原結合領域を有する、CDR移植ヒト化抗hTNF
α抗体軽鎖を与える。
好ましくは第２の好適な実施態様のCDR移植軽鎖は、4
6および／または47位にドナー残基を含む。
本発明はまた第３の好適な実施態様において、枠組み
が46、48、58および71位の少なくとも１つでドナー残基
を含むヒトアクセプター枠組みと、ドナー抗原結合領域
を有するCDR移植ヒト化抗hTNFα抗体軽鎖を与える。
第３の好適な実施態様において、好ましくは枠組み
は、46、48、58および71位にドナー残基を含む。
第２の特に好適な実施態様および第３の好適な実施態
様において、枠組みは追加的に36、44、47、85そして87
位にドナー残基を含む。たとえドナーとヒトアクセプタ
ー間で保存されていなくても、種間で普通保存されてい
る軽鎖枠組みの類似の位置、すなわち２、４、６、35、
49、62、64−69、98、99、101そして102位も追加的にド
ナーを含む。最も好ましくは軽鎖枠組みは、２、４、
６、35、36、38、44、47、49、62、64−69、85、87、9
8、99、101そして102位で、追加的にドナー残基を含
む。
さらに第２または第３の好適な実施態様の枠組みは、
以下の位置の１つ、いくつかまたはすべての位置で随時
ドナー残基を含む： １と３、 63、 60（60と54が電位差塩橋（potential saltbridge）を形
成することができる場合）、 70（70と24が電位差塩橋を形成することができる場
合）、 73と21（ドナーとアクセプター間で47が異なる場合）、 37と45（ドナーとアクセプター間で47が異なる場合）、 そして 10、12、40、80、103そして105のうちの任意の１つまた
はそれ以上。
好ましくはCDR移植軽鎖可変ドメインの抗原結合領域
（前述の第２または第３の好適な実施態様のものを含
む）は、CDR1（残基24−34）、CDR2（残基50−56）およ
びCDR3（残基89−97）でカバ（Kabat）CDRに対応するCD
Rを含む。
第４の実施態様において本発明は、本発明の第１と第
２または第１と第３の好適な実施態様の、少なくとも１
つのCDR移植重鎖と少なくとも１つのCDR移植軽鎖よりな
るCDR移植抗体分子を与える。
しかし第１の特に好適な実施態様において本発明は、
枠組みは12、27、30、38、46、48、66、67、69、71、7
3、76、83、89、91そして94位でhTNF1ドナー残基を含
む、ヒトアクセプター枠組み（特にEUヒトアクセプター
枠組み）とhTNF1ドナー抗原結合領域よりなる可変領域
ドメインを有する、CDR移植ヒト化抗体重鎖を与える。
EU重鎖枠組みは、ヒト重鎖枠組みにとっては変則であ
る重鎖の枠組み４（FR4）で残基を有する。従って好ま
しくは、重鎖のFR4のEU残基の代わりにヒトコンセンサ
ス残基（consensus residues）が使用される。特にヒト
コンセンサス残基のスレオニン（Ｔ）を108位で使用し
てもよい。偶然にも108位の齧歯類hTNF1残基もまたスレ
オニンである。
第２の特に好適な実施態様において本発明は、枠組み
は３、42、そして49位でhTNF1ドナー残基を含む、ヒト
アクセプター枠組み（特にEUヒトアクセプター枠組み）
とhTNF1ドナー抗原結合領域よりなる可変ドメインを有
する、CDR移植ヒト化抗体軽鎖を与える。
48、83、106そして108位のEU残基はヒト抗体としては
変則であるため、軽鎖にEUヒト枠組みを使用する場合
は、これらの位置のEU残基を変換することが好ましい。
すなわちこれらの残基のいくつかまたは好ましくはすべ
てでヒトコンセンサス残基が使用される（すなわち、48
位でイソロイシン（Ｉ）、83位でバリン（Ｖ）、106位
でイソロイシン（Ｉ）そして108位でアルギニン
（Ｒ））。偶然にも、48位（Ｉ）、106位（Ｉ）および1
08位（Ｒ）で齧歯類hTNF1残基はヒトコンセンサス残基
と同じである。しかし83位のヒトコンセンサス残基バリ
ン（Ｖ）は、この場所でのEU残基（Ｆ）およびhTNF1残
基（Ｌ）とも異なる。
特に本発明は、第１の特に好適な実施態様の少なくと
も１つのCDR移植ヒト化重鎖と、第２の特に好適な実施
態様の少なくとも１つのCDR移植ヒト化軽鎖よりなる、C
DR移植ヒト化抗体分子よりなる。
また第３の特に好適な実施態様において本発明は、枠
組みは４、11、23、24、28、73、77、78、79、91、93そ
して94位で101.4ドナー残基を含む、ヒトアクセプター
枠組み（特にKOLヒトアクセプター枠組み）と101.4ドナ
ー抗原結合領域よりなる可変領域ドメインを有する、CD
R移植ヒト化抗体重鎖を与える。
重鎖の108位のKOL残基であるプロリン（Ｐ）はヒト抗
体にとって変則である。従ってヒトアクセプター枠組み
としてKOLを使用する場合は、この位置にヒトコンセン
サス残基であるロイシン（Ｌ）があることが好ましい。
偶然にも齧歯類101.4抗体はこの位置でヒトコンセンサ
ス残基（Ｌ）を持っている。
さらに第４の特に好適な実施態様において本発明は、
１、３、４そして73位でヒトアクセプター枠組み（特に
REIヒトアクセプター枠組み）と101.4ドナー残基を含む
可変領域ドメインを有する、CDR移植ヒト化抗体軽鎖を
与える。
REI軽鎖ヒト枠組みは、39位（スレオニン、Ｔ）,104
位（ロイシン、Ｌ）、105位（グルタミン、Ｑ）、そし
て107位（スレオニン、Ｔ）で、ヒト抗体にとって変則
である残基を有する。すなわちREIが軽鎖枠組みとして
使用される場合、39位（リジン、Ｋ）、104位（バリ
ン、Ｖ）、105位（グルタミン酸、Ｅ）そして107位（リ
ジン、Ｋ）でヒトコンセンサス残基が使用される。偶然
にも齧歯類101.4残基は39位（Ｋ）,105位（Ｅ）そして1
07位（Ｋ）でヒトコンセンサス残基と同じである。しか
し104位（Ｖ）のヒトコンセンサス残基は、この位置で
ロイシン（Ｌ）REIおよび齧歯類101.4残基と異なる。
特に本発明は、第３の特に好適な実施態様の少なくと
も１つのCDR移植ヒト化重鎖と、第４の特に好適な実施
態様の少なくとも１つのCDR移植ヒト化軽鎖よりなる、C
DR移植ヒト化抗体分子よりなる。
好ましくは前述した第１、第２、第３および第４の特
に好適な実施態様の、重鎖と軽鎖の両方のCDR（CDR1,CD
R2およびCDR3）のすべてについてカバ（Kabat）CDRが使
用される。
本発明の組換えおよびヒト化抗体分子と鎖は以下のも
のよりなっていてもよい：完全な長さの重鎖と軽鎖を有
する完全な抗体分子；その断片（例えばFab、Fab′、
（Fab′）２、またはFv断片）；軽鎖または重鎖モノマ
ーまたはダイマー；または単一鎖抗体（例えば重鎖と軽
鎖可変領域がペプチドリンカーで結合されている単一鎖
Fv）；または元々のドナー抗体と同じ特異性を有する他
の任意の組換え、キメラまたはCDR移植分子。同様に重
鎖と軽鎖可変領域は適宜他の抗体ドメインに結合してい
る。
また本発明の重鎖または軽鎖または組換えまたはヒト
化完全抗体分子は、エフェクターまたはレポーター分子
を結合していてもい。例えばそれは共有ブリッジ構造で
結合した、重金属原子またはリシンのような毒素をキレ
ートするための巨大環状物質でもよい。あるいは組換え
DNA技術を用いて、完全な免疫グロブリン分子のFc断片
またはCH3ドメインが、ペプチド結合により、機能性非
免疫グロブリン蛋白（例えば酵素または毒素分子）に代
替されているかまたは結合している、免疫グロブリン分
子を産生することもできる。
CB0010、101.4、CB0006およびhTNF3齧歯類MAb、それ
らのCDR移植変異体およびヒトアクセプター抗体の重鎖
および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ添
付の図１、２、３および４に記載されている。本発明の
組換えおよびヒト化抗体生成物は、組換えDNA技術（例
えば実質的にはWO91/09967号に記載されている）を用い
て調製することができる。
抗原結合領域が取られたドナー抗体のクラス／タイプ
に関係のある、任意の適当なヒトアクセプター可変領域
枠組み配列が使用できる。好ましくは使用されるヒトア
クセプター枠組みのタイプは、ドナー抗体と同じ／類似
のクラス／タイプである。特にCDRに近いまたは隣接す
る位置で、ドナー抗体配列との相同性を最大にする／最
適換する枠組みを選ぶことが便利である。しかし本発明
の適用において、ドナーとアクセプター配列間の高レベ
ルの相同性は決定的に重要ではない。本発明は、満足で
きる結合性を有するCDR移植抗体生成物を得るのに、ド
ナー残基が重要であるかまたは好ましい、枠組み残基位
置のヒエラルキーを同定する。CDR移植生成物は、普通
少なくとも105M-1、好ましくは少なくとも約108M-1、ま
たは特に好ましくは108−1012M-1の範囲の結合親和性を
有する。原理的に本発明は、配列間の相同性のレベルに
関係なく、任意の抗hTNFαドナーとヒトアクセプター抗
体の任意の組合せに適用できる。使用されるヒト枠組み
の例としては、KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAYお
よびPOM（文献７と８）などがある；例えば重鎖につい
てはKOLとNEWM、軽鎖についてはREI、そして重鎖と軽鎖
の両方についてはEU、LAYおよびPOMがある。
また本発明の生成物の定常領域ドメインは、抗体の考
えられる機能（特に、必要かも知れないエフェクター機
能）に関して選択される。例えば定常領域ドメインはヒ
トIgA、IgE、IgGまたはIgMドメインでもよい。ヒト化抗
体分子が治療目的に使用され抗体エフェクター機能が必
要な場合は、IgGヒト定常領域ドメイン（特にIgG1およ
びIgG3アイソタイプ）が使用される。またヒト化抗体分
子が治療目的に使用されるが抗体エフェクター機能が必
要でない場合は（例えば単にTNF活性を阻止する場
合）、IgG2およびIgG4をアイソタイプが使用される。
しかし抗体分子の残りの部分は、免疫グロブリンの蛋
白配列のみである必要はない。例えばヒト免疫グロブリ
ン鎖の一部をコードするDNA配列を、エフェクターまた
はレポーター分子のような機能性ポリペプチドのアミノ
酸配列をコードするDNA配列に融合された遺伝子を作成
してもよい。
さらに別の面において本発明はまた、組換えおよびヒ
ト化抗体（例えばCDR移植、重鎖および軽鎖）をコード
するDNA配列、DNA配列を含むクローニングベクターおよ
び発現ベクター、DNA配列で形質転換される宿主細胞を
包含し、さらに形質転換宿主細胞中でDNA配列を発現す
ることよりなる、組換えおよびヒト化（例えばCDR移
植）鎖や抗体分子を産生する方法を包含する。
ベクターの作成、トランスフェクション法および培養
法の一般的な方法は公知である。このような方法は例え
ば文献12と13に記載されている。
抗hTNFα抗体分子のアミノ酸配列をコードするDNA配
列は、当業者に公知の方法で得られる。例えば抗TNFコ
ード配列はゲノムクローニング、または適当な抗hTNFα
産生ハイブリドーマ細胞株からのcDNAクローニングによ
り得られる。陽性のクローンは、問題の重鎖および軽鎖
遺伝子の適当なプローブを用いてスクリーニングされ
る。またPCRクローニングを使用することもできる。抗
体重鎖および軽鎖の一部またはすべてをコードするDNA
配列は、決定されたDNA配列から、または対応するアミ
ノ酸配列を基礎にして、必要に応じて合成することがで
きる。
アクセプター（例えばヒトアクセプター）の配列をコ
ードするDNAは適当な方法で得られる。例えばKOL、RE
I、EUおよびNEWMのような好ましいヒトアクセプター枠
組みをコードするDNA配列は、当業者には広く入手可能
であるか、またはそのアミノ酸配列に基づいて容易に合
成することができる（文献７と８を参照）。
キメラおよびCDR移植ヒト化抗体生成物をコードするD
NA配列の調製には、分子生物学の標準的方法が利用でき
る。目的のDNA配列のすべてまたは一部は、オリゴヌク
レオチド合成技術を用いて合成される。部位特異的突然
変異誘発やポリメラーゼチェイン反応（PCR）法が適宜
使用される。例えばジョーンズ（Jones）ら（文献14）
の記載するオリゴヌクレオチド指令合成が使用できる。
また例えばベレーエン（Verhoeyen）ら（文献５）また
はリーチマン（Riechamn）ら（文献６）の記載する、あ
らかじめ存在する可変領域のオリゴヌクレオチド指令突
然変異誘発を使用することもできる。また例えばクイー
ン（Queen）ら（文献９）の記載する、T4DNAポリメラー
ゼを用いた、ギャップトオリゴヌクレオチド（gapped o
ligonucleotide）の酵素的充填法を使用することもでき
る。
組換え、キメラおよびCDR移植ヒト化抗体重鎖および
軽鎖をコードするDNA配列の発現には、任意の適当な宿
主細胞／ベクター系を使用することができる。Fabや（F
ab′）２断片、および特にFv断片や１本鎖抗体断片（例
えば１本鎖Fv）などの抗体断片の発現に、細菌（例えば
大腸菌）や他の微生物系を使用してもよい。大きいCDR
移植抗体生成物（完全な抗体分子を含む）の産生に、お
よび／またはグリコシル化生成物が必要な場合は、真核
（例えば哺乳動物）宿主細胞発現系を使用することもで
きる。適当な哺乳動物宿主細胞には、CHO細胞やミエロ
ーマまたはハイブリドーマ細胞株がある。
すなわち本発明はさらに別の面において、以下のステ
ップよりなる組換えまたはヒト化抗hTNFα抗体生成物の
産生法を与える： （ａ）発現ベクター中で、抗hTNFα抗体重鎖をコードす
るDNA配列を有するオペロンを産生させる；および／ま
たは （ｂ）発現ベクター中で、相補的抗hTNFα抗体軽鎖をコ
ードするDNA配列を有するオペロンを産生させる； （ｃ）宿主細胞をそのベクターまたは各ベクターでトラ
ンスフェクションさせる； （ｄ）トランスフェクションさせた細胞株を培養して組
換え抗hTNFα抗体生成物を産生させる。
組換えまたはヒト化抗hTNFα生成物は、重鎖または軽
鎖由来ポリペプチドのみよりなり、この場合重鎖または
軽鎖ポリペプチドのコード配列を用いて宿主細胞をトラ
ンスフェクションする。重鎖と軽鎖の両方からなる生成
物の産生には、細胞株を２つのベクターでトランスフェ
クションし、最初のベクターは軽鎖由来ポリペプチドを
コードするオペロンを含有し、２番目のベクターは重鎖
由来ポリペプチドをコードするオペロンを含有する。コ
ード配列と選択マーカーに関する以外は、各ポリペプチ
ド鎖ができるだけ等しく発現されるように、好ましくは
これらのベクターは同一である。あるいは軽鎖由来およ
び重鎖由来ポリペプチドの両方をコードする配列よりな
るベクターである、単一のベクターを使用することもで
きる。
軽鎖および重鎖のコード配列中のDNAは、cDNAまたは
ゲノムDNAまたはその両方よりなる。
本発明はまた、本発明の組換えおよびヒト化抗体生成
物よりなる治療用および診断用組成物を包含し、そして
治療や診断でのこれらの生成物や組成物の使用を包含す
る。
さらに別の面において本発明は、薬剤として許容され
る賦形剤、希釈剤または担体とともに、本発明の組換え
またはヒト化抗体よりなる治療用または診断用組成物を
与える。
本発明はまた、薬剤として許容される賦形剤、希釈剤
または担体に、本発明の組換えまたはヒト化抗体を混合
物することよりなる治療用または診断用組成物の調製法
を与える。
組換えまたはヒト化抗体は治療用または診断用組成物
中の唯一の活性成分であるか、または他の抗体成分（例
えば抗Ｔ細胞、抗IFNγまたは抗LPS抗体）、または非抗
体成分（例えばキサンチン）よりなる１つまたはそれ以
上の活性成分と一緒に存在してもよい。治療用または診
断用組成物は単回服用型でもよく、この場合各単回投与
量は本発明の組換えまたはヒト化抗体の有効量よりな
る。
さらに本発明は、ヒトまたは動物対象に本発明の組換
えまたはヒト化抗体の有効量を投与することよりなる、
治療と診断の方法を与える。
ヒトまたは動物の体内のTNFのレベルを低下させるこ
とが好ましい任意の治療に、この抗体と組成物を使用す
ることができる。TNFは体内を循環しているか、または
体の特定の部位に有害な高いレベルで局在して存在する
ことがある。
例えば高レベルのTNFは、免疫制御性および炎症性疾
患、および敗血症ショック、またはエンドトキシンショ
ックや心循環系ショックで見られる。この抗体または組
成物は、敗血症、敗血症ショックまたはエンドトキシン
ショック、悪液質、成人性呼吸不全症候群、エイズ、ア
レルギー、乾癬、結核、炎症性骨疾患、血液凝固疾患、
火傷、臓器または組織移植後の拒絶反応や自己免疫疾患
（例えば甲状腺炎のような臓器特異的疾患、またはリウ
マチ様関節炎や変形骨関節炎のような非臓器特異的疾
患）などの病状の治療に使用される。
さらにこの抗体や組成物は、新生物治療時のTNF産生
に関連する副作用を緩和したり、抗リンパ級抗体の使用
による移植片拒絶の治療や防止に関連する症状に関連す
るショックを排除または緩和したり、または多臓器不全
（MOF）の治療に使用される。
本発明の組換えおよびヒト化抗体および組成物は、好
ましくは敗血症、または敗血症／エンドトキシンショッ
クの治療に使用される。
この抗体や組成物は、その治療法に応じた適当な型と
量で投与される。これは、例えばTNFレベルが高くなる
ことが予想される場合のための予防用で用いるか、また
はTNFが有害な高いレベルに達したかまたはレベルが上
昇しつつある場合にそれを低下させるのに使用すること
もできる。
この治療または診断用組成物は、投与用には任意の適
当な型でよく、好ましくは非経口投与（例えば薬物全量
の１回の注射または連続的点滴のような注射または点
滴）に適した型である。生成物が注射または点滴用の場
合、油性または水性賦形剤中の懸濁液または溶液または
エマルジョン型であり、懸濁剤、保存剤、安定化剤およ
び／または分散剤などの製剤上の媒体を含有してもよ
い。
あるいはこの抗体や組成物は、使用前に適当な無菌の
液体で復元するための乾燥型でもよい。
この抗体や組成物が経口投与に適している場合（例え
ば抗体断片の場合）、この製剤には活性成分以外に以下
のような添加物を含んでいてもよい：デンプン−例えば
ジャガイモ、トウモロコシまたは小麦デンプン、または
セルロース−または微結晶セルロースのようなデンプン
誘導体；シリカ；種々の糖（例えば乳糖）；炭酸マグネ
シウムおよび／またはリン酸カルシウム。製剤が経口投
与用の場合、患者の消化器系が許容できるものであるこ
とが好ましい。このために製剤中に粘液形成剤や樹脂を
含ませることが好ましい。また胃液中で不溶性のカプセ
ル中に抗体や組成物を調製して許容性を改善することも
好ましい。また放出調節製剤中に抗体や組成物を入れる
ことも好ましい。
本発明のさらに別の面において、有害なほど高いTNF
レベルに関連する疾患またはその疾患の危険のあるヒト
または動物対象の治療法が与えられ、この方法は対象に
有効量の本発明の抗体や組成物を与えることよりなる。
特にヒトまたは動物対象は、敗血症、または敗血症ショ
ックまたはエンドトキシンショックにかかっているかま
たはかかる危険性があるものでもよい。
投与すべき抗体の量は、治療すべき病状、中和すべき
TNFが好ましいレベルより高いか高いと予想される程
度、および抗体が予防的に使用されるか、または現状の
症状を治療するのに使用されるかにより、異なる。投与
量はまた、患者の年齢や病状に応じて選択される。
従って例えば生成物が敗血症ショックの治療または予
防に使用される場合、TNFに対する抗体の適当な投与量
は0.001−30mg/kg/日の範囲、好ましくは0.01−10mg/kg
/日、そして特に好ましくは0.1−2mg/kg/日である。
この抗体生成物は診断（例えばインビボ診断）や高TN
Fレベルを含む疾患状態のイメージングに使用される。
添付の図（図１−６）を参照して、本発明をさらに以
下の例で例示のためにのみ記載する。
図面の簡単な説明 図１は、ヒトアクセプター抗体EU（1EU）重鎖および
軽鎖、齧歯類MAbのCB0010（htnf1）およびヒト化CDR移
植軽鎖（gEU）および重鎖（2hEUg）の、可変ドメインの
アミノ酸配列を示す。
図２は、ヒトアクセプター抗体REI（1rei）（軽鎖）
とKOL（KOL）（重鎖）、齧歯類MAbの101.4（101/4）の
重鎖と軽鎖、およびヒト化移植軽鎖と重鎖（いずれもg1
014）の可変領域ドメインのアミノ酸配列である。
図３は、ヒトアクセプター抗体REI（REI）（軽鎖）と
KOL（KOL）（重鎖）、齧歯類MAbのCB0006（CB6）の重鎖
と軽鎖、およびヒト化移植軽鎖と重鎖（いずれもgCB6）
の可変領域ドメインのアミノ酸配列である。
図４は、ヒトアクセプター抗体REI（REI）（軽鎖）と
KOL（KOL）（重鎖）、齧歯類MAbのHTNF3の重鎖（HTNF
3）と軽鎖（hTNF3）、およびヒト化移植軽鎖（gHTNF3）
と重鎖（ghTNF3）の可変領域ドメインのアミノ酸配列で
ある。
図５は、齧歯類CB0010（hTNF1）とCDR移植CB0010（Gr
hTNF1;CDP571）が、組換えヒトTNFαに対する結合につ
いて、HRP−結合齧歯類HTNF1と競合する能力を比較した
グラフである。
図６は、齧歯類HTNF1（CB0010）とCDR移植HTNF1（CP5
71）が、L929バイオアッセイで組換えTNFαを中和する
能力を比較したグラフである。
本発明の実施態様の詳細な説明 例１ 齧歯類抗TNFα抗体のCDR移植 いくつかの齧歯類抗ヒトTNFαMAbを、齧歯類抗CD3抗
体OKT3のCDR移植について実質的にWO91/09967号に詳細
に記載した方法でCDR移植した。本例および以下の実施
例で、キメラおよびCDR移植ヒト化抗体は、実質的にWO9
1/09967号中でγ４キメラおよびCDR移植OKT3抗体の調製
について記載された、IgG4定常領域ドメインを用いて調
製した。しかし他のタイプおよびイソタイプ（例えばIg
G1、IgG2、IgG3）のヒト定常領域ドメインも、記載した
方法を有意に変更することなく使用されることを理解す
べきである。
これらの抗hTNFα抗体は、齧歯類MAbである、CB0006
（61E71としても知られている）、CB0010（hTNF1として
も知られている）、hTNF3および101.4を含んでいた。こ
れらの抗体のそれぞれのCDR移植の簡単な要約を以下に
記す。
CB0006 CB0006についてWO91/09967号の実施例、第12.1.節に
記載されたものと同様の解析を行い、重鎖について10個
の枠組み残基を23、24、48、49、68、69、71、73、75お
よび88位で齧歯類として保持する残基を同定した。この
抗体、およびhTNF3と101.4抗体のCDR移植のために選ば
れたヒト枠組みは、軽鎖についてはRE1で、重鎖につい
てはKOLであった。齧歯類CB0006（CB6）（重鎖と軽鎖）
のアミノ酸配列、REI（REI（軽鎖）およびKOL（KOL）重
鎖可変領域ドメインのアミノ酸配列は図３に記載されて
いる。
３つの遺伝子を作成し、その第１は齧歯類残基として
アミノ酸残基23、24、48、49、71および73（gH341
（６））をコードしていた。この第１の遺伝子にコード
される可変ドメインのアミノ酸配列は、図３に重鎖要約
中のgCB6として示されている。第２の遺伝子も齧歯類残
基（gH341（８））として75と88位のアミノ酸残基を有
していたが、第３の遺伝子は齧歯類残基（gH341（1
0））として68、69、75と88位のアミノ酸残基を追加的
に有していた。それぞれgL221で同時発現され、図３の
重鎖要約では最小の移植軽鎖（CDRのみ）はgCB6として
示されている。gL221/gH341（６）およびgL221/gH341
（８）抗体のいずれも齧歯類61E71と同様にTNFに結合し
た。gL221/gH341（10）抗体は発現せず、以後この組合
せは取り上げなかった。
次にgL221/gH341（６）抗体を、抗体が溶液中のTNFに
対してL929細胞上のTNFリセプターと競合する、L929細
胞競合測定法で評価した。この測定法でgL221/gH341
（６）抗体は齧歯類CB0006の約10％の活性であった。
CB0010（hTNF1としても知られている） CB0010はヒトTNFαのエピトープを認識するモノクロ
ーナル抗体である。重鎖および軽鎖可変ドメインの両方
のCDR移植にEUヒト枠組みを使用した。EU（EU）、CB001
0（htnf1）およびCB0010の移植したもの（gEU、軽鎖;2h
EUg、重鎖）の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列
は図１に記載されている。
重鎖 CDR移植重鎖で、26−35（CDR1）、50−65（CDR2）、
および95−102（CDR3）位でマウスCDRを使用した。48、
67、69、71、73、76、89、91、94および108位で枠組み
中にマウス残基を使用した。TNF1マウス重鎖とEUヒト重
鎖残基を比較すると、23、24、29および78位でこれらは
同一であることが明らかである。
軽鎖 CDR移植軽鎖で、24−34（CDR1）、50−56（CDR2）お
よび89−97（CDR3）位でマウスCDRを使用した。さらに
３、42、48、49、83、106および108位で枠組み中にマウ
ス残基を使用した。hTNF1マウス軽鎖とEUヒト軽鎖残基
を比較すると、46、58および71位でこれらは同一である
ことが明らかである。
移植したCB0010重鎖はキメラ軽鎖と同時発現され、TF
N結合測定法でその生成物の結合能をキメラ軽鎖／キメ
ラ重鎖生成物と比較した。移植した重鎖生成物は、完全
なキメラ生成物よりTNFより結合能は少し良いようであ
った。
同様に移植重鎖／移植軽鎖生成物を同時発現させ、完
全なキメラ生成物と比較した結果、キメラ生成物とほぼ
同様の結合能を有していた。しかし移植重鎖／移植軽鎖
生成物をL929測定法（例４参照）で測定したとき、活性
はキメラ生成物の半分のみであった。従って実施例２に
記載するようにさらにCDR移植実験を行った。
hTNF3 hTNF3はヒトTNFα上のエピトープを認識する。hTNF3
はCB0006と比較すると軽鎖および重鎖可変領域で21個の
み異なり、軽鎖で10個（CDRの50、96位で２つ、枠組み
の１、19、40、45、46、76、103および106位で８つ）、
重鎖で11個（CDR領域の52、60および95位で３つ、枠組
みの１、10、38、40、67、73、87および105位で８つ）
である。hTNF3（Htnf3、軽鎖;hTNF3、重鎖）、CDR移植h
TNF3（gHTNF3、軽鎖;ghTNF3、重鎖）およびREI（REI、
軽鎖）とKOL（KOL、重鎖）の軽鎖と重鎖の可変ドメイン
アミノ酸配列は、図４に示してある。CB0006とhTNF3キ
メラ抗体の軽鎖と重鎖は、直接結合測定法での活性を失
うことなく交換できる。しかしCB0006はhTNF3に比較し
て、TNFαに対するL929上のTNFリセプターとの競合で
は、オーダーの大きさで小さい。CB0006CDR移植データ
に基づきgL221とgH341（マウスとして＋23、24、48、4
9、71および73）遺伝子をhTNF3に対して作成し、試験し
た結果、得られた移植抗体はTNF−αによく結合する
が、L929測定法ではわずかしか競合しない。図４に示す
ように、gL221遺伝子はgHTNF3をコードし、gH341遺伝子
はghTNF3可変ドメイン配列をコードする。この場合この
抗体の競合結合能を改良するために他の枠組み残基を変
換する必要があるかも知れない。
101.4 101.4はヒトTNF−αを認識するさらに別の齧歯類MAb
である。この抗体の重鎖はKOLと良好な相同性を示し、
従って軽鎖はRE1で重鎖はKOLに基づいてCDR移植を行っ
た。101.4（101/4）と101.4のCDR移植したもの（g101
4）の重鎖および軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とREI軽
鎖（lrei）とKOL重鎖（KOL）可変ドメインは図２に示し
てある。いくつかの移植重鎖遺伝子をCDR（gH341）につ
いて控え目な選択で作成し、これは73、78、または77−
79位にマウスアミノ酸として１つまたは小数の非CDR残
基を有していた。これらは、キメラ軽鎖またはカバ（Ka
bat）CDR移植軽鎖とともに同時発現させた。すべての場
合にキメラ抗体に相当するTNF結合を示し、cLと同時発
現させると得られた抗体はL929測定法で充分競合するこ
とができた。しかしgL221では、得られた抗体は、L929
細胞上のTNFリセプターとの競合では、TNFに対して少な
くとも１オーダー弱かった。
重鎖中の他の位置でのマウス残基（例えば23と24が一
緒、または76位）は、L929測定法で移植抗体の競合能を
改良することはなかった。
例２ 齧歯類抗ヒトTNFα抗体CB0010と101.4のさらなるCDR移
植 齧歯類抗ヒトTNFαモノクローナル抗体CB0010と101.4
を、実質的にWO91/09967号に記載された方法でさらにCD
R移植した。
CB0010 CB0010はヒトTNFα上のエピトープを認識するモノク
ローナル抗体である。重鎖および軽鎖両方の可変ドメイ
ンのCDR移植にEUヒト枠組みを使用した。
EUアクセプター、CB0010（htnf1）齧歯類ドナーおよ
びCDR移植（gEU、軽鎖と2hEUg、重鎖）抗体の重鎖およ
び軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は図１に示してあ
る。
重鎖 CDR移植重鎖（2hEUg）では、マウスCDRを31−35（CDR
1）、50−65（CDR2）および95−102（CDR3）位で使用し
た。
また枠組みでマウス残基を12、27、30、38、46、48、
66、67、69、71、73、76、83、89、91、94および108位
で使用した。CB0010マウス重鎖残基とEUヒト重鎖残基を
比較すると、23、24、29および78位で同一であることが
わかる。
軽鎖 CDR移植軽鎖（gEU）では、マウスCDRを24−34（CDR
1）、50−65（CDR2）および89−97（CDR3）位で使用し
た。さらに枠組みでマウス残基を３、42、48、49、106
および108位で使用した。83位でヒトコンセンサス残基
（バリン）を使用した。CB0010マウス軽鎖残基とEUヒト
軽鎖残基を比較すると、46、58および71位で同一である
ことがわかる。
移植したCB0010重鎖はキメラ軽鎖と同時発現され、TN
F結合測定法でその生成物の結合能をキメラ軽鎖／キメ
ラ重鎖生成物と比較した。移植した重鎖生成物は、完全
なキメラ生成物よりTNFに対して結合能は少し良いよう
であった。
同様に移植重鎖／移植軽鎖生成物を同時発現させ、完
全なキメラ生成物と比較した結果、キメラ生成物とほぼ
同様の結合能を有していた。移植軽鎖（gEU）と移植重
鎖（2hEUg）の特異的組合せで、図１に示すように、CDP
571として知られている抗体が得られる。齧歯類CB0010
（CB0010）、キメラCB0010（キメラCB0010）そして移植
重鎖／移植軽鎖生成物（CDP571）を、標準的測定法でヒ
トTNFαに対する結合を比較した。得られた結果を以下
の表に、各抗体について測定されたKD（pM）で表示し
た。
抗体 KD（pM） CB0010 80 キメラCB0010 81 CDP571 87 この完全に移植された抗体生成物（CDP571）は、現在
敗血症と急性移植拒絶の治療について前臨床開発中であ
る。
101.4 101.4はヒトTNFα上を認識するさらに別のモノクロー
ナル抗体である。この抗体の重鎖はKOLと良好な相同性
を示し、従ってCDR移植は軽鎖についてはREIそして重鎖
についてはKOLに基づいている。改良されたCDR移植生成
物が調製された。REI（rei、軽鎖）、KOL（KOL、重鎖）
齧歯類101.4（101/4、重鎖および軽鎖）そして完全に移
植された抗体（g1014、重鎖と軽鎖）の可変ドメインの
アミノ酸配列は図２に示してある。
重鎖 CDR移植重鎖（g1014）では、マウスCDRを31−35（CDR
1）、50−65（CDR2）および95−102（CDR3）位で使用し
た。また枠組みでマウス残基を４、11、23、24、28、7
3、77、78、79、91、93、94および108位で使用した。
軽鎖 CDR移植軽鎖（g1014）では、マウスCDRを24−34（CDR
1）、50−56（CDR2）および89−97（CDR3）位で使用し
た。さらに枠組みでマウス残基を１、３、４、39、73、
105および107位で使用した。104位でヒトコンセンサス
残基（バリン）を使用した。
完全に移植した重鎖と軽鎖（g1014）は同時発現さ
れ、TNFに対する結合能を、齧歯類およびキメラ101.4と
そして完全移植された（gEU/2hEUg、CDP571）CB0010抗
体と比較した。完全に移植した101.4抗体は、齧歯類、
キメラおよび移植CB0010抗体と同様のTNF−αに対する
結合性を有していた。
例３ 齧歯類およびCDR移植抗体のインビトロの比較 A.齧歯類CB0010とCDP571の親和性測定材料と方法 材料： PBS/BSA:ダルベッコーPBS＋１％（W/V）ウシ血清アルブ
ミン。
TNF:PBS/BSA中50nM組換えヒトTNFアルファ（ビッセンド
ルフバイオケミカルズ（Bissendorf Biochemicla
s））、0.85μg/ml。
保存125I−TNF:5μCi、185kBq（アマシャムインターナ
ショナル（Amersham International））を500μｌの水
に溶解させ−70℃で保存。
使用溶液125I−TNF:力価測定曲線で−62pMでスキャチャ
ード解析で124pM、PBS/BSA中。
抗体：精製齧歯類CB0010（mHTNF1）とCDP571をA280nm
（Ｅ1mg/ml、280nm＝1.4）で定量し、力価測定用の１μ
g/mlに、またはスキャチャード解析用に200ng/mlに希釈
した。
イムノビーズ：ヤギ抗齧歯類IgG全分子−アガロースま
たはヤギ抗ヒトIgG全分子−アガロース（シグマ（Sigm
a））を希釈しないで使用した。
方法： 抗体力価測定:mHTNF1とCDP571を２倍希釈系列（各100μ
ｌ）で力価測定して全部で16個の試料を作成し125I−TN
F（100μｌ、62pM）を加えた。抗体の最終の最大濃度は
500ng/mlであり125I−TNFは31pMであった。対照試験管
（８）は125I−TNFとPBS/BSAのみであった。試料を放置
して一晩撹拌して平衡化させた。平衡化後、25μｌのヤ
ギ抗マウス−アガロースをmHTNF1試料に加え、総125I−
TNF対照を除いてCDP571に50μｌのヤギ抗ヒトビーズを
加えた。対照の４つにビーズを加え、これらの試料の上
澄液のカウントをビーズの代わりにPBS/BSAを含む試料
のカウントと比較して、アガロースビーズに対する125I
−TNFの非特異的吸着を補正した。室温で１時間平衡化
した後、PBS/BSA（0.5ml）を加え、試料を20℃で1500rp
mで10分間遠心分離した。上澄液（0.5ml）を取り、ガン
マカウンター中で放射能を測定した。
125I−TNFと非標識TNF（25％と75％125I−TNFで）混
合物の存在下で同じ総濃度で抗体力価測定を行い、この
測定法で125I−TNFは非標識物質と同じ挙動をすること
を確認した。
スキャチャード解析：両方の抗体について非標識TNF（1
00μｌ、50nM）を13の二倍希釈系列で２重測定で力価測
定した。各抗体についてTNFの代わりにPBS/BSAを含有す
る１つの試料を含めた。各試料に125I−TNF（50μｌ、1
24Pm）を加えた。次に力価測定曲線から求められる一定
量の抗体（50μｌ、200ng/ml）を加えた。
こうして以下の最終濃度が得られた：抗体、50ng/ml;
TNF、25nMの最高濃度;125I−TNF、31pM。試料を一晩放
置して平衡化させた後、抗体力価測定試料と全く同様に
処理した。
計算： 力価測定曲線 結合125I−TNFcpm＝NSBcpm−上澄液cpm NSB＝非特異的吸着ブランク、上澄液cpm 総＝125I−TNFのみの総カウント B/Tを抗体濃度に対してプロットし、スキャチャード
解析の使用に適した抗体濃度をB/T＝0.6で選んだ スキャチャード解析 ２重測定の平均を用いた。
NSB＝総cpm−NSB上澄液cpm 遊離cpm＝試料cpm＋NSB 遊離TNFの比率＝遊離／総（F/T）＝ 結合TNFに対してB/Fをプロットし−1/Kdを求め、そこか
らKdを計算した。
結果 齧歯類CB0010とCDP571の解離定数 抗体 Kd・Ｍ 齧歯類HTNF1 1.3×10-10 CDP571 1.4×10-10 B.HRP結合した齧歯類CB0010（Muhtnf1）とCDP571（GrhT
NF1）の齧歯類CB0010中でのrhuTNFへの結合に対する競
合 方法 96穴マイクロタイタープレート（ヌンク（Nunc）、マ
キシソルブ（Maxisorb））を100μl/ウェルTNFを0.5μg
/mlで被覆した。
齧歯類または移植抗体の連続希釈をPBS/1％BSA希釈液
で、200μg/mlから0.1μg/mlに調製した。各ウェルに50
μｌの抗体を加えた後、50μｌのHRP−齧歯類CB0010を
３つの濃度（0.625、0.315そして0.16μg/ml）で加え
た。プレートを室温で２時間撹拌してインキュベート
し、PBSで４回洗浄し、100μｌのTMB基質を加えた。光
学密度（OD）を測定し、抗体濃度に対してODをプロット
した。
結論 齧歯類抗体（MuhTNF1）と移植抗体（GrhTNF1）の曲線
は重ね合わせることができ、両抗体がTNFへの結合に対
して同様の親和性を有することを示していた（図５参
照）。
例４ 齧歯類CB0010とCDR移植CDP571抗体のバイオアッセイと
動物モデル実験での比較 A.L929測定法でのCB0010とCDP571によるTNFの中和 親の齧歯類抗体CB0010（hTNF1）とCDR移植抗体CDP571
が組換えヒトTNFを中和する能力を、L929バイオアッセ
イを用いて求めた。この測定法では、TNFにより殺され
るL929マウス繊維芽細胞様細胞株を使用した。この測定
は１μg/mlアクチノミオシンＤ（これは細胞をTNFに対
してより感受性にする）の存在下で行われる。２つの抗
体の連続希釈液を一定量の組換えヒトTNF（100pg/ml）
と混合し、96穴ウェルの平底プレート中のモノレーヤー
に加えた。16時間のインキュベート後、TNFで殺されな
かった細胞はクリスタルバイオレット染色で見えるよう
にした。中和されなかった見かけのTNF（残存TNF）量
は、組換えTNF標準曲線と比較して求めた。残存TNFを抗
体濃度に対してプロットした代表的実験の結果を図６に
示す。CB0010とCDP571は同様の中和活性を有することが
わかる。
B.ヒヒの敗血症モデルに対するCDP571の効果 この研究ではCDP571で前前処理する場合の、重症敗血
症（死亡を含む）の生理への影響を評価した。CDP571は
ヒヒのTNFを中和することが知られているため、研究す
べき関連の種としてヒヒを選んだ。
雄の大人のヒヒ（パピオウルシヌス（Papio ursinu
s））（体重20−25kg）を、塩酸ケタミンとペンタバル
ビトンナトリウムで麻酔し、血圧、心臓指数（サーモヂ
リューション（thrmodilution）による）、心電図およ
び右心房充填圧測定のために装置を取り付けた。食塩水
のみまたは抗体の灌流を2.5ml/kg/時間の速度で120分間
行い、次に同じ速度でさらに120分間生きた大腸菌を灌
流した。使用した細菌株はヒンショーのB7株（Hinshaw'
s srain B7）（［086a:61］、ATCC33985）で、対数増殖
期のものを２×109CFU/mlで投与し、灌流の最後の血漿
中濃度は２−2.5×105CFU/mlであった。この120分の
後、動物を元のケージに帰し、食物と飲物は自由に与
え、心循環系の変化を日に２回３日間追跡した。必要な
場合は充分な右心房充填圧を維持するために調整した、
一定量の液体の5ml/kg/時間の代替灌流をすべての動物
に行った。治療中に死亡したヒヒまたは72時間の実験期
間を生き延びた後殺したヒヒを死体解剖した。半定量ス
ケールで肉眼病理学的傷害をすべての臓器について評価
した（＋＋＋が最も重症である）。
動物はランダムに４つの処理群の１つに割り当てた； −食塩水のみ −CDP571 0.1mg/kg −CDP571 1.0mg/kg −CB0010 0.1mg/kg（親齧歯類抗体） 生存および累積臓器傷害スコアを表１に示す。このモ
デルで1.0mg/kgのCDP571は死亡を防ぎ、臓器傷害の発生
率を有意に（Ｐ＜0.005）減少させた。さらにこれらの
効果は濃度依存性であった（Ｐ＜0.005）。さらにCB001
0で見られた生存率と臓器傷害スコアは、同じ投与量でC
DP571と同じであり、その親齧歯類抗体に比較してCDP57
1の維持されたインビボ活性を示していた。
ヒヒの敗血症実験 食塩水またはCDP571の後２×109CFU/mlの大腸菌を２時
間静脈内投与した後の生存率 文献 1. Kohler ＆ Milstein,Nature,265,295−497,1975. 2. Chatenoud et al,（1986）,J.Immunol.137,830−8
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ion,Blackwell,Oxford,1980. 14. Jones et al,（1986）,Nature,321,522.
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 エムターゲ，ジョン スペンサー イギリス国エスエル７ １エスキュー バックス，マーロウ，テムプル，テムプ ル ミル アイランド，49 (72)発明者 ボッドマー，マーク ウィリアム イギリス国オウエックス１ ５エイエス オックスフォード，サウス ヒンクシ ィ，マノー ロード，５，ローズ コテ ッジ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/08 A61K 39/395 ADU A61K 49/00 C12N 15/09 G01N 33/53 G01N 33/577 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】重鎖及び軽鎖を含むヒトTNFαに対し特異
    性を有する抗体分子であって、該重鎖が 重鎖可変領域： 重鎖可変領域： 重鎖可変領域： 重鎖可変領域： からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変領域
    を有する、上記抗体分子。
  2. 【請求項２】重鎖及び軽鎖を含むヒトTNFαに対し特異
    性を有する抗体分子であって、該軽鎖が 軽鎖可変領域： 軽鎖可変領域： 軽鎖可変領域： 軽鎖可変領域： からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変領域
    を有する、上記抗体分子。
  3. 【請求項３】該軽鎖が、 軽鎖可変領域： 軽鎖可変領域： 軽鎖可変領域： 軽鎖可変領域： からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含む
    可変領域を有する、請求項１に記載の抗体分子。
  4. 【請求項４】請求項１から３のいずれか一項に記載の抗
    体分子のFv、scFv、Fab又はＦ（ab′）２断片。
  5. 【請求項５】請求項１〜３のいずれか一項に記載の重鎖
    または軽鎖、あるいわ請求項４に記載の断片の少なくと
    も一つをコードするDNA配列。
  6. 【請求項６】請求項５に記載のDNA配列を含む、クロー
    ニング又は発現ベクター。
  7. 【請求項７】請求項５に記載のDNA配列により形質転換
    された宿主細胞。
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