JPH10136990A - Ｇ型肝炎ウイルスに対する抗体、ｈｇｖの診断検出のた めのおよび治療薬としてのその使用 - Google Patents
Ｇ型肝炎ウイルスに対する抗体、ｈｇｖの診断検出のた めのおよび治療薬としてのその使用Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 Ｇ型肝炎ウイルス表面抗原、特にＨＧＶのエ
ンベロープタンパク質Ｅ２に対する抗体、該抗体のフラ
グメント、生物学的分子に結合された該抗体または抗体
フラグメントを含むコンジュゲートを提供する。 【解決手段】 ＨＧＶ表面抗原をコードするＤＮＡ配列
を含有する発現ベクターで動物を免疫し、場合により、
膜上にＨＧＶ表面抗原を発現する細胞で該動物を追加免
疫し、免疫した動物からＨＧＶ表面抗原に特異的なポリ
クローナルまたはモノクローナル抗体を得る。 【効果】 本発明の抗体はＧ型肝炎ウイルスの診断検出
剤および治療薬として有用である。
ンベロープタンパク質Ｅ２に対する抗体、該抗体のフラ
グメント、生物学的分子に結合された該抗体または抗体
フラグメントを含むコンジュゲートを提供する。 【解決手段】 ＨＧＶ表面抗原をコードするＤＮＡ配列
を含有する発現ベクターで動物を免疫し、場合により、
膜上にＨＧＶ表面抗原を発現する細胞で該動物を追加免
疫し、免疫した動物からＨＧＶ表面抗原に特異的なポリ
クローナルまたはモノクローナル抗体を得る。 【効果】 本発明の抗体はＧ型肝炎ウイルスの診断検出
剤および治療薬として有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｇ型肝炎ウイルス
に対する抗体およびそのフラグメントに関する。本発明
はさらに、生物学的分子に結合された該抗体または抗体
フラグメントを含むコンジュゲートに関する。最後に、
本発明は、Ｇ型肝炎ウイルスの診断検出のための該抗体
の使用並びに細胞培養物に関する。
に対する抗体およびそのフラグメントに関する。本発明
はさらに、生物学的分子に結合された該抗体または抗体
フラグメントを含むコンジュゲートに関する。最後に、
本発明は、Ｇ型肝炎ウイルスの診断検出のための該抗体
の使用並びに細胞培養物に関する。
【０００２】
【従来の技術】これまで知られているＡ型肝炎ウイルス
（ＨＡＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に加え
て、最近、種々のウイルスファミリーに属する別の肝炎
関連ウイルスが特性決定された。それらはまったく異な
る様々な疾病を引き起こし、そのうちのいくつかは非常
に重症であって、可能なかぎり早期で確実な鑑別診断が
望まれている。通常、肝炎ウイルスはアルファベットの
連続文字を割り当てることで命名されている。また、既
知ウイルスを排除することによって新しい肝炎関連ウイ
ルスを命名することもできる。こうして、Ｃ型肝炎ウイ
ルス（ＨＣＶ）は非Ａ／非Ｂ型肝炎ウイルスとも呼ばれ
ている (Chooら, Science 244 (1989), 359-362)。本発
明はＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＤＶおよびＨＥＶによって表さ
れるウイルスファミリーのどれにも属さないウイルスに
関する。この新ウイルスの入手可能な情報は、それがＨ
ＣＶと同様にフラビウイルス (flaviviridae) ファミリ
ーに属することを示唆している〔Chambersら, Annu. Re
v. Microbiol. 44 (1990), 649-688〕。しかしながら、
これらのデータはまた、それがＨＣＶと著しく異なって
おり、それゆえそれ自体のウイルスグループに属するこ
とをはっきりと示している。かくして、この新ウイルス
はＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）と呼ばれる (Linnenら,
Science 271 (1996), 505-508)。
（ＨＡＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に加え
て、最近、種々のウイルスファミリーに属する別の肝炎
関連ウイルスが特性決定された。それらはまったく異な
る様々な疾病を引き起こし、そのうちのいくつかは非常
に重症であって、可能なかぎり早期で確実な鑑別診断が
望まれている。通常、肝炎ウイルスはアルファベットの
連続文字を割り当てることで命名されている。また、既
知ウイルスを排除することによって新しい肝炎関連ウイ
ルスを命名することもできる。こうして、Ｃ型肝炎ウイ
ルス（ＨＣＶ）は非Ａ／非Ｂ型肝炎ウイルスとも呼ばれ
ている (Chooら, Science 244 (1989), 359-362)。本発
明はＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＤＶおよびＨＥＶによって表さ
れるウイルスファミリーのどれにも属さないウイルスに
関する。この新ウイルスの入手可能な情報は、それがＨ
ＣＶと同様にフラビウイルス (flaviviridae) ファミリ
ーに属することを示唆している〔Chambersら, Annu. Re
v. Microbiol. 44 (1990), 649-688〕。しかしながら、
これらのデータはまた、それがＨＣＶと著しく異なって
おり、それゆえそれ自体のウイルスグループに属するこ
とをはっきりと示している。かくして、この新ウイルス
はＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）と呼ばれる (Linnenら,
Science 271 (1996), 505-508)。
【０００３】ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶおよびＨ
ＥＶのグループのどれにも割り当てられない肝炎関連ウ
イルスが WO 94/18217に記載されている。しかし、この
ウイルスのヌクレオチド配列は、本発明において開示し
たヌクレオチド配列とのいかなる類似性も持ち合わせて
いない。
ＥＶのグループのどれにも割り当てられない肝炎関連ウ
イルスが WO 94/18217に記載されている。しかし、この
ウイルスのヌクレオチド配列は、本発明において開示し
たヌクレオチド配列とのいかなる類似性も持ち合わせて
いない。
【０００４】ＨＧＶの核酸およびアミノ酸配列は WO 95
/21922に開示されており、大腸菌でのＨＧＶポリペプチ
ドの組換え発現が実施例１３、１９および２０に載って
いる。この出願において開示された配列に関して明快な
言及がなされている。
/21922に開示されており、大腸菌でのＨＧＶポリペプチ
ドの組換え発現が実施例１３、１９および２０に載って
いる。この出願において開示された配列に関して明快な
言及がなされている。
【０００５】さらに、ＨＧＶの核酸およびアミノ酸配列
は WO 95/32291にも開示されている。そして、大腸菌、
昆虫細胞およびワクシニアでのＨＧＶの組換え発現が実
施例１６に記載されている。この出願において開示され
た配列に関して明快な言及がなされている。
は WO 95/32291にも開示されている。そして、大腸菌、
昆虫細胞およびワクシニアでのＨＧＶの組換え発現が実
施例１６に記載されている。この出願において開示され
た配列に関して明快な言及がなされている。
【０００６】ウイルスの感染は、血清などの体液中の抗
原および／またはこれら抗原に対する抗体の有無により
検出されるのが普通である。ウイルス抗原を特異的に検
出するイムノアッセイで該抗原を検出するには抗体が必
要である。このような免疫学的試験を行うためには、適
当な抗体を十分量で供給することも必要である。
原および／またはこれら抗原に対する抗体の有無により
検出されるのが普通である。ウイルス抗原を特異的に検
出するイムノアッセイで該抗原を検出するには抗体が必
要である。このような免疫学的試験を行うためには、適
当な抗体を十分量で供給することも必要である。
【０００７】現在、ＨＧＶ抗原の産生方法およびＨＧＶ
診断検出のための該抗原の使用は、ドイツ特許出願第19
6 13 406.4により知られている。現在の技術水準はＨＧ
Ｖ抗原の新しい発現方法を提供する。ここでいう適当な
ＨＧＶ抗原とは、少なくとも１つの抗原性および／また
は免疫原性決定基を有するＨＧＶゲノム由来のポリペプ
チドである。推定上のエンベロープタンパク質Ｅ１およ
びＥ２をコードするＨＧＶ全ゲノムのＤＮＡ配列領域が
好適である。これらのエンベロープタンパク質は、機能
性ウイルス粒子の外側にあって宿主生物に侵入するとき
に決定的な役割を果たすアミノ末端の主要領域と、膜に
固着されているカルボキシ末端の短鎖疎水性領域から構
成されている。
診断検出のための該抗原の使用は、ドイツ特許出願第19
6 13 406.4により知られている。現在の技術水準はＨＧ
Ｖ抗原の新しい発現方法を提供する。ここでいう適当な
ＨＧＶ抗原とは、少なくとも１つの抗原性および／また
は免疫原性決定基を有するＨＧＶゲノム由来のポリペプ
チドである。推定上のエンベロープタンパク質Ｅ１およ
びＥ２をコードするＨＧＶ全ゲノムのＤＮＡ配列領域が
好適である。これらのエンベロープタンパク質は、機能
性ウイルス粒子の外側にあって宿主生物に侵入するとき
に決定的な役割を果たすアミノ末端の主要領域と、膜に
固着されているカルボキシ末端の短鎖疎水性領域から構
成されている。
【０００８】上記の特許出願は組換え細胞も開示してお
り、その組換え細胞は膜に結合された形でその表面上に
ＨＧＶ抗原、特に抗原Ｅ１および／またはＥ２またはそ
の免疫学的に適切な部分配列を提示する。
り、その組換え細胞は膜に結合された形でその表面上に
ＨＧＶ抗原、特に抗原Ｅ１および／またはＥ２またはそ
の免疫学的に適切な部分配列を提示する。
【０００９】この細胞は、例えばＦＡＣＳ分析またはＥ
ＬＩＳＡにより、ＨＧＶを検出するための診断剤として
使用可能である。そのためには、細胞表面にＨＧＶ抗原
を提示する細胞とサンプル液（例えばヒト血清）との反
応が調べられる。反応が起これば、試験サンプル中に抗
ＨＧＶ抗体が存在すると推論することができる。しかし
ながら、ＨＧＶエピトープに対する抗体はこれまで全く
存在していない。
ＬＩＳＡにより、ＨＧＶを検出するための診断剤として
使用可能である。そのためには、細胞表面にＨＧＶ抗原
を提示する細胞とサンプル液（例えばヒト血清）との反
応が調べられる。反応が起これば、試験サンプル中に抗
ＨＧＶ抗体が存在すると推論することができる。しかし
ながら、ＨＧＶエピトープに対する抗体はこれまで全く
存在していない。
【００１０】基本的に、抗体はマウスまたは他の動物を
抗原で免疫することにより得られる。その後、無制限の
生産と正確に規定された特異性といった利点を有するモ
ノクローナル抗体を、ハイブリドーマ技術により最初の
ポリクローナルプールから選択することができる (Kohl
er and Milstein, Nature 256 (1975), 495)。そのため
には、ミエローマ細胞が免疫した動物の脾細胞と融合さ
れる。
抗原で免疫することにより得られる。その後、無制限の
生産と正確に規定された特異性といった利点を有するモ
ノクローナル抗体を、ハイブリドーマ技術により最初の
ポリクローナルプールから選択することができる (Kohl
er and Milstein, Nature 256 (1975), 495)。そのため
には、ミエローマ細胞が免疫した動物の脾細胞と融合さ
れる。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】それゆえ、本発明の課
題は、ＨＧＶ表面抗原、特にＨＧＶのエンベロープタン
パク質Ｅ２に対する抗体、好ましくはモノクローナル抗
体をつくることである。本発明のさらなる課題は、ＨＧ
Ｖ検出用の診断剤としてこの抗体を使用することであ
る。
題は、ＨＧＶ表面抗原、特にＨＧＶのエンベロープタン
パク質Ｅ２に対する抗体、好ましくはモノクローナル抗
体をつくることである。本発明のさらなる課題は、ＨＧ
Ｖ検出用の診断剤としてこの抗体を使用することであ
る。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明はＨＧＶ表面抗原
に対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体を提
供する。さらに、本発明はＨＧＶのＥ２表面抗原に対す
るモノクローナルまたはポリクローナル抗体を提供す
る。
に対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体を提
供する。さらに、本発明はＨＧＶのＥ２表面抗原に対す
るモノクローナルまたはポリクローナル抗体を提供す
る。
【００１３】抗体を得るのに適した免疫原は、ＨＧＶゲ
ノム由来のポリペプチド、特に表面抗原 (WO 95/21922
およびWO 95/32291)または少なくとも１つの抗原性およ
び／または免疫原性決定基を有するその部分ペプチド配
列である。推定されるエンベロープタンパク質Ｅ２また
はその抗原性および／または免疫原性部分ペプチド配列
が特に好ましく、中でもそのアミノ末端領域に由来する
部分ペプチド配列が好ましい。さらに、推定されるエン
ベロープタンパク質Ｅ１および／またはその抗原性もし
くは免疫原性部分ペプチド配列（特にそのアミノ末端領
域に由来するもの）も免疫原として適している。ウイル
スエンベロープタンパク質を用いる免疫感作法は公知で
あり、例えばＨＢｓＡｇに関するMichelら, Bio/Techno
logy 3 (1985), 561-566およびＨＣＶのＥ２／ＮＳ１に
関するLesniewskiら, J. Med. Virol. 45 (1995), 415-
422 を参照のこと。
ノム由来のポリペプチド、特に表面抗原 (WO 95/21922
およびWO 95/32291)または少なくとも１つの抗原性およ
び／または免疫原性決定基を有するその部分ペプチド配
列である。推定されるエンベロープタンパク質Ｅ２また
はその抗原性および／または免疫原性部分ペプチド配列
が特に好ましく、中でもそのアミノ末端領域に由来する
部分ペプチド配列が好ましい。さらに、推定されるエン
ベロープタンパク質Ｅ１および／またはその抗原性もし
くは免疫原性部分ペプチド配列（特にそのアミノ末端領
域に由来するもの）も免疫原として適している。ウイル
スエンベロープタンパク質を用いる免疫感作法は公知で
あり、例えばＨＢｓＡｇに関するMichelら, Bio/Techno
logy 3 (1985), 561-566およびＨＣＶのＥ２／ＮＳ１に
関するLesniewskiら, J. Med. Virol. 45 (1995), 415-
422 を参照のこと。
【００１４】しかし、本発明による抗体はＤＮＡ免疫感
作を伴うマルチステップ免疫感作法により産生させるこ
とが特に好ましい (Daviesら, Ann. NY Acad. Sci. 772
(1995), 21-29) 。この方法では、表面抗原を可能なか
ぎりオーセンティック（真正）な形で、すなわち、正し
く翻訳後プロセシングされ、場合によりグリコシル化さ
れ、かつ細胞から分泌された形で、動物の免疫系に提示
することが可能である。本発明による免疫感作法の第１
ステップでは、免疫感作用抗原をコードするＤＮＡ配列
が真核生物の発現ベクターにクローン化され、この構築
物が実験動物（例：マウス、ラット、ウサギなど）の適
当な組織（例：骨格筋）に直接注入される。抗原をコー
ドするＤＮＡ配列は、それぞれの場合に用いられる実験
動物の組織内で活動することが知られているプロモータ
ーの制御下に置かれる。
作を伴うマルチステップ免疫感作法により産生させるこ
とが特に好ましい (Daviesら, Ann. NY Acad. Sci. 772
(1995), 21-29) 。この方法では、表面抗原を可能なか
ぎりオーセンティック（真正）な形で、すなわち、正し
く翻訳後プロセシングされ、場合によりグリコシル化さ
れ、かつ細胞から分泌された形で、動物の免疫系に提示
することが可能である。本発明による免疫感作法の第１
ステップでは、免疫感作用抗原をコードするＤＮＡ配列
が真核生物の発現ベクターにクローン化され、この構築
物が実験動物（例：マウス、ラット、ウサギなど）の適
当な組織（例：骨格筋）に直接注入される。抗原をコー
ドするＤＮＡ配列は、それぞれの場合に用いられる実験
動物の組織内で活動することが知られているプロモータ
ーの制御下に置かれる。
【００１５】エンベロープタンパク質Ｅ２をコードする
ＤＮＡ配列またはその部分配列は、ｐｃＤＮＡ３のよう
な発現ベクター中に正しいリーディングフレームで、ア
ミノ末端シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列およ
び場合によりマーカーエピトープ（例えば、いわゆるＦ
ＬＡＧエピトープ）をコードするＤＮＡ配列の隣にクロ
ーン化し、それをこれら２つの要素と一緒に融合タンパ
ク質として発現させることが特に好適である。シグナル
配列は例えばエリスロポエチンシグナル配列でありうる
(Jacobsら, Nature 313 (1985), 806-810) 。ＦＬＡＧ
エピトープはオクタペプチドであり (Hoppら, Bio/Tech
nology 6 (1988), 1204-1210) 、このエピトープに対す
るモノクローナル抗体が市販されていて、目的の発現産
物を同定したり、場合によっては精製するのに使用でき
る。
ＤＮＡ配列またはその部分配列は、ｐｃＤＮＡ３のよう
な発現ベクター中に正しいリーディングフレームで、ア
ミノ末端シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列およ
び場合によりマーカーエピトープ（例えば、いわゆるＦ
ＬＡＧエピトープ）をコードするＤＮＡ配列の隣にクロ
ーン化し、それをこれら２つの要素と一緒に融合タンパ
ク質として発現させることが特に好適である。シグナル
配列は例えばエリスロポエチンシグナル配列でありうる
(Jacobsら, Nature 313 (1985), 806-810) 。ＦＬＡＧ
エピトープはオクタペプチドであり (Hoppら, Bio/Tech
nology 6 (1988), 1204-1210) 、このエピトープに対す
るモノクローナル抗体が市販されていて、目的の発現産
物を同定したり、場合によっては精製するのに使用でき
る。
【００１６】抗原が実験動物の組織で発現されるとき、
そのタンパク質の生合成は細胞質ゾル中のリボソーム上
で起こる。ＨＧＶ抗原がアミノ末端シグナル配列（例え
ば、細胞質ゾルでのタンパク質生合成中にいわゆるシグ
ナル認識粒子により認識される２０〜３０アミノ酸長の
疎水性配列）と機能的に連結された状態で発現される場
合は、そのリボソームが小胞体（endoplasmic reticulu
m:ＥＲ）に移行する。ここで、ポリペプチド鎖は、それ
らが輸送停止配列によって膜内に拘留されるまで、ＥＲ
膜を通って運ばれる。タンパク質は場合によりＥＲの内
腔でグリコシル化され、その後さらにゴルジ装置で修飾
される。最後に、それらは原形質膜の方向へ輸送するた
め選別される。この方法によると、抗原は可能なかぎり
オーセンティックな形で免疫系に提示され、高品質の抗
ＨＧＶ抗体の生成へと導くことができる。
そのタンパク質の生合成は細胞質ゾル中のリボソーム上
で起こる。ＨＧＶ抗原がアミノ末端シグナル配列（例え
ば、細胞質ゾルでのタンパク質生合成中にいわゆるシグ
ナル認識粒子により認識される２０〜３０アミノ酸長の
疎水性配列）と機能的に連結された状態で発現される場
合は、そのリボソームが小胞体（endoplasmic reticulu
m:ＥＲ）に移行する。ここで、ポリペプチド鎖は、それ
らが輸送停止配列によって膜内に拘留されるまで、ＥＲ
膜を通って運ばれる。タンパク質は場合によりＥＲの内
腔でグリコシル化され、その後さらにゴルジ装置で修飾
される。最後に、それらは原形質膜の方向へ輸送するた
め選別される。この方法によると、抗原は可能なかぎり
オーセンティックな形で免疫系に提示され、高品質の抗
ＨＧＶ抗体の生成へと導くことができる。
【００１７】本発明による免疫感作法はまた、対応する
ＨＧＶ表面抗原を膜上に発現する真核細胞を実験動物に
注入する追加（ブースター）免疫感作を含むことが好ま
しい。このような細胞の作製に関しては DE 196 13 40
6.6に言及されている。
ＨＧＶ表面抗原を膜上に発現する真核細胞を実験動物に
注入する追加（ブースター）免疫感作を含むことが好ま
しい。このような細胞の作製に関しては DE 196 13 40
6.6に言及されている。
【００１８】その後、ＨＧＶ表面抗原に対するポリクロ
ーナル抗体組成物またはモノクローナル抗体は免疫した
実験動物から単離される。ＨＧＶに特異的なポリクロー
ナル抗体組成物を得るためには、血清を精製することが
好ましく、例えば適当な抗原（例：Ｅ２抗原）をコーテ
ィングしたカラムでアフィニティークロマトグラフィー
を行う。
ーナル抗体組成物またはモノクローナル抗体は免疫した
実験動物から単離される。ＨＧＶに特異的なポリクロー
ナル抗体組成物を得るためには、血清を精製することが
好ましく、例えば適当な抗原（例：Ｅ２抗原）をコーテ
ィングしたカラムでアフィニティークロマトグラフィー
を行う。
【００１９】モノクローナル抗体を得るためには、Kohl
er & Milstein のハイブリドーマ技法またはその後の改
良法が用いられる。例えば、適当な抗体を産生するハイ
ブリドーマ細胞を作製するには、免疫した動物から得ら
れた脾細胞を、Galfre and Milstein, Meth. Enzymol.
73 (1981), 3-46 に記載されるミエローマ細胞と融合さ
せる。次いで、特異的抗体の合成について融合細胞の初
代培養物を試験する。特異的な初代培養物は蛍光活性化
セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いてマイクロタイタ
ープレートにクローン化することができる。
er & Milstein のハイブリドーマ技法またはその後の改
良法が用いられる。例えば、適当な抗体を産生するハイ
ブリドーマ細胞を作製するには、免疫した動物から得ら
れた脾細胞を、Galfre and Milstein, Meth. Enzymol.
73 (1981), 3-46 に記載されるミエローマ細胞と融合さ
せる。次いで、特異的抗体の合成について融合細胞の初
代培養物を試験する。特異的な初代培養物は蛍光活性化
セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いてマイクロタイタ
ープレートにクローン化することができる。
【００２０】それゆえ、本発明は、次のステップ：プロ
モーター、真核生物のシグナル配列、Ｇ型肝炎ウイルス
表面抗原をコードするＤＮＡ配列、および任意のマーカ
ー配列を含有する発現ベクターを用いて実験動物を免疫
すること、場合により、その実験動物を、細胞膜上にＨ
ＧＶ表面抗原を発現する細胞を用いて追加（ブースタ
ー）免疫すること、および免疫した実験動物からＧ型肝
炎ウイルス表面抗原に特異的なポリクローナルまたはモ
ノクローナル抗体を得ること、を含む方法により産生さ
れる、Ｇ型肝炎ウイルス表面抗原に対するポリクローナ
ルまたはモノクローナル抗体に関する。
モーター、真核生物のシグナル配列、Ｇ型肝炎ウイルス
表面抗原をコードするＤＮＡ配列、および任意のマーカ
ー配列を含有する発現ベクターを用いて実験動物を免疫
すること、場合により、その実験動物を、細胞膜上にＨ
ＧＶ表面抗原を発現する細胞を用いて追加（ブースタ
ー）免疫すること、および免疫した実験動物からＧ型肝
炎ウイルス表面抗原に特異的なポリクローナルまたはモ
ノクローナル抗体を得ること、を含む方法により産生さ
れる、Ｇ型肝炎ウイルス表面抗原に対するポリクローナ
ルまたはモノクローナル抗体に関する。
【００２１】提供されるＨＧＶ Ｅ２表面抗原に対する
抗体は、好ましくは、(a) 配列番号１に示される位置１
２７と１２９０の間のヌクレオチド配列、(b) 遺伝子コ
ードの縮重の範囲内で(a) の配列に一致するヌクレオチ
ド配列、および／または(c) ストリンジェント条件下で
(a) および／または(b) の配列とハイブリダイズするヌ
クレオチド配列、によりコードされるポリペプチドに対
して誘導されたものである。
抗体は、好ましくは、(a) 配列番号１に示される位置１
２７と１２９０の間のヌクレオチド配列、(b) 遺伝子コ
ードの縮重の範囲内で(a) の配列に一致するヌクレオチ
ド配列、および／または(c) ストリンジェント条件下で
(a) および／または(b) の配列とハイブリダイズするヌ
クレオチド配列、によりコードされるポリペプチドに対
して誘導されたものである。
【００２２】ＨＧＶ Ｅ２表面抗原に対する抗体のさら
なる特徴は、それが(a) 配列番号２に示される位置３９
と４２６の間のアミノ酸配列、または(b) (a) の配列に
少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列、を含むポリ
ペプチドに対して誘導されたものであることである。
なる特徴は、それが(a) 配列番号２に示される位置３９
と４２６の間のアミノ酸配列、または(b) (a) の配列に
少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列、を含むポリ
ペプチドに対して誘導されたものであることである。
【００２３】さらに、本発明によるモノクローナル抗Ｅ
２抗体を産生するハイブリドーマ細胞系が提供される。
これらのハイブリドーマ細胞系はブダペスト条約の規定
にしたがって“Deutsche Sammlung von Mikroorganisme
n und Zellkulturen GmbH (DSMZ)”(Mascheroder Weg 1
b, D-38124 Braunschweig)に寄託された。寄託日および
受託番号は次のとおりである。 クローン１１ DSM ACC 2280 1996年９月19日 クローン１７ DSM ACC 2284 1996年９月24日 クローン３０ DSM ACC 2285 1996年９月24日
２抗体を産生するハイブリドーマ細胞系が提供される。
これらのハイブリドーマ細胞系はブダペスト条約の規定
にしたがって“Deutsche Sammlung von Mikroorganisme
n und Zellkulturen GmbH (DSMZ)”(Mascheroder Weg 1
b, D-38124 Braunschweig)に寄託された。寄託日および
受託番号は次のとおりである。 クローン１１ DSM ACC 2280 1996年９月19日 クローン１７ DSM ACC 2284 1996年９月24日 クローン３０ DSM ACC 2285 1996年９月24日
【００２４】本発明はまた、上記の細胞系から得られる
モノクローナル抗体、および同等の結合特異性を有しか
つ好ましくは寄託された抗体と同じエピトープを認識す
る抗体に関する。さらに、本発明は上記抗体の一つの任
意のフラグメントに関する。
モノクローナル抗体、および同等の結合特異性を有しか
つ好ましくは寄託された抗体と同じエピトープを認識す
る抗体に関する。さらに、本発明は上記抗体の一つの任
意のフラグメントに関する。
【００２５】本発明のさらなる主題は、生物学的分子に
結合された、上記抗体の一つまたは対応する抗体フラグ
メントを含むコンジュゲートである。好適な実施態様に
おいて、コンジュゲートの生物学的分子はマーカー基を
含むものである。既知のマーカー基はどれも、試験系で
検出され得るマーカー基、すなわち直接または間接的に
検出可能なマーカー基である。直接検出可能なマーカー
基は、直接検出可能なシグナルを発生する基、例えば放
射性基、酵素基または発光基として理解される。酵素基
および発光基が特に好ましく、中でも電気化学発光基が
好適である。一方、マーカー基は間接的に検出可能なマ
ーカー基であってもよく、例えばシグナル発生基を担持
する適当な結合パートナー（ストレプトアビジン、アビ
ジンまたは抗ハプテン抗体）との反応により検出可能な
ビオチンまたはハプテン基である。ハプテンまたはビオ
チン基は抗体を固相に固定するための固相結合基として
も使用される。マーカーおよび固相結合基は公知の方法
で抗体に結合させることができる。
結合された、上記抗体の一つまたは対応する抗体フラグ
メントを含むコンジュゲートである。好適な実施態様に
おいて、コンジュゲートの生物学的分子はマーカー基を
含むものである。既知のマーカー基はどれも、試験系で
検出され得るマーカー基、すなわち直接または間接的に
検出可能なマーカー基である。直接検出可能なマーカー
基は、直接検出可能なシグナルを発生する基、例えば放
射性基、酵素基または発光基として理解される。酵素基
および発光基が特に好ましく、中でも電気化学発光基が
好適である。一方、マーカー基は間接的に検出可能なマ
ーカー基であってもよく、例えばシグナル発生基を担持
する適当な結合パートナー（ストレプトアビジン、アビ
ジンまたは抗ハプテン抗体）との反応により検出可能な
ビオチンまたはハプテン基である。ハプテンまたはビオ
チン基は抗体を固相に固定するための固相結合基として
も使用される。マーカーおよび固相結合基は公知の方法
で抗体に結合させることができる。
【００２６】本発明のさらなる主題は、例えばＦＡＣＳ
分析またはＥＬＩＳＡにより、ＨＧＶを検出するための
診断薬としての抗体の使用に関する。そのためには、抗
体とサンプル液（例えばヒト血清）との反応を調べる。
反応が起これば、試験サンプル中にＨＧＶ抗原が存在す
ると推論することができる。診断試験で使用するため
に、抗体には上記のようなマーカー基または固相結合基
を少なくとも１つ結合させることが好ましい。
分析またはＥＬＩＳＡにより、ＨＧＶを検出するための
診断薬としての抗体の使用に関する。そのためには、抗
体とサンプル液（例えばヒト血清）との反応を調べる。
反応が起これば、試験サンプル中にＨＧＶ抗原が存在す
ると推論することができる。診断試験で使用するため
に、抗体には上記のようなマーカー基または固相結合基
を少なくとも１つ結合させることが好ましい。
【００２７】ＨＧＶの検出は特にサンプル液中のＨＧＶ
抗原の免疫学的測定により行うことが好ましく、その場
合はサンプル液を少なくとも１種の本発明の抗体とイン
キュベートして、その結合を検出する。この免疫学的測
定法はどのような公知の試験フォーマットで行ってもよ
く、例えば単一の反応相を用いる均一系イムノアッセイ
または２以上の反応相を用いる不均一系イムノアッセイ
で行うことができる。好ましくは、抗原の有無が固相の
存在下で検出される不均一系の試験フォーマットを用い
る。
抗原の免疫学的測定により行うことが好ましく、その場
合はサンプル液を少なくとも１種の本発明の抗体とイン
キュベートして、その結合を検出する。この免疫学的測
定法はどのような公知の試験フォーマットで行ってもよ
く、例えば単一の反応相を用いる均一系イムノアッセイ
または２以上の反応相を用いる不均一系イムノアッセイ
で行うことができる。好ましくは、抗原の有無が固相の
存在下で検出される不均一系の試験フォーマットを用い
る。
【００２８】この試験フォーマットの一実施態様はいわ
ゆるブリッジ試験である（実施例５参照）。この実施態
様では、サンプル液を本発明による少なくとも２種の抗
体Ａ１およびＡ２とインキュベートする。その際、Ａ１
は固相に結合されるか、または固相に結合可能な形態
（いわゆる捕捉抗体）で存在し、Ａ２はマーカー基を担
持する（いわゆる検出抗体）。固相および／または液相
（好ましくは固相）中の標識を、固定化すなわち固相に
結合された免疫複合体を介して測定することで、サンプ
ル液中の抗原を検出する。試験手順は好ましくは、サン
プル液を標識抗体Ａ２および固相に結合されたまたは結
合可能な抗体Ａ１と混合することにより、標識抗体と抗
原と固相結合抗体からなる固定化された標識複合体を得
ることを含む。
ゆるブリッジ試験である（実施例５参照）。この実施態
様では、サンプル液を本発明による少なくとも２種の抗
体Ａ１およびＡ２とインキュベートする。その際、Ａ１
は固相に結合されるか、または固相に結合可能な形態
（いわゆる捕捉抗体）で存在し、Ａ２はマーカー基を担
持する（いわゆる検出抗体）。固相および／または液相
（好ましくは固相）中の標識を、固定化すなわち固相に
結合された免疫複合体を介して測定することで、サンプ
ル液中の抗原を検出する。試験手順は好ましくは、サン
プル液を標識抗体Ａ２および固相に結合されたまたは結
合可能な抗体Ａ１と混合することにより、標識抗体と抗
原と固相結合抗体からなる固定化された標識複合体を得
ることを含む。
【００２９】本発明による抗体の他の用途は治療用途で
ある。そのためには、本発明の抗体を精製された形で調
製し、次いで溶液または懸濁液のような注入可能な液体
として製剤化することが好ましい。追加の成分は例えば
水、塩溶液、グルコースまたはグリセロールである。ま
た、抗体をリポソーム内に保持させてもよい。抗体は通
常皮下または筋肉内注射により非経口的に投与される。
ある。そのためには、本発明の抗体を精製された形で調
製し、次いで溶液または懸濁液のような注入可能な液体
として製剤化することが好ましい。追加の成分は例えば
水、塩溶液、グルコースまたはグリセロールである。ま
た、抗体をリポソーム内に保持させてもよい。抗体は通
常皮下または筋肉内注射により非経口的に投与される。
【００３０】本発明を以下の実施例、配列表および図面
を用いてより詳細に説明することにする。配列番号１は
ＨＧＶ−Ｅ２およびアミノ末端融合部分をコードするＤ
ＮＡヌクレオチド配列を示す。配列番号２はＨＧＶ−Ｅ
２およびアミノ末端融合部分のアミノ酸配列を示す。
を用いてより詳細に説明することにする。配列番号１は
ＨＧＶ−Ｅ２およびアミノ末端融合部分をコードするＤ
ＮＡヌクレオチド配列を示す。配列番号２はＨＧＶ−Ｅ
２およびアミノ末端融合部分のアミノ酸配列を示す。
【００３１】
【実施例】実施例１ 発現構築物ＨＧＶ−Ｅ２のクローニング ＤＮＡを操作するためにSambrookら, Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborat
ory, New York (1989)および Ausubelら, Current Prot
ocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New
York (1989)に記載されるような標準方法を採用した。
ＤＮＡの操作は大腸菌Ｋ１２株ＤＨ５αで行った。
g: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborat
ory, New York (1989)および Ausubelら, Current Prot
ocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New
York (1989)に記載されるような標準方法を採用した。
ＤＮＡの操作は大腸菌Ｋ１２株ＤＨ５αで行った。
【００３２】ＤＮＡ免疫感作用の発現ベクターとして、
ＣＭＶプロモーターとＢＧＨポリアデニル化シグナルを
含有するベクターｐｃＤＮＡ３ (Invitrogen BV, NV Le
ek,Netherlands)の誘導体を使用した。そのために、ネ
オマイシン耐性遺伝子をデヒドロ葉酸レダクターゼ（Ｄ
ＨＦＲ）遺伝子で置換してベクターｐｃＤＮＡ３を改変
した。これはAvrII/Bst1107IによるｐｃＤＮＡ３の制限
開裂、鎖長が約４kbpのベクターフラグメントの単離、
および鎖長が約７００bpのAvrII/Bst1107IＤＨＦＲフラ
グメントの挿入により行った〔Setzerら (1982) J. Bio
l. Chem. 257,5143-5147; Crouse ら (1982) J. Biol.
Chem. 257, 7887-7897 〕。
ＣＭＶプロモーターとＢＧＨポリアデニル化シグナルを
含有するベクターｐｃＤＮＡ３ (Invitrogen BV, NV Le
ek,Netherlands)の誘導体を使用した。そのために、ネ
オマイシン耐性遺伝子をデヒドロ葉酸レダクターゼ（Ｄ
ＨＦＲ）遺伝子で置換してベクターｐｃＤＮＡ３を改変
した。これはAvrII/Bst1107IによるｐｃＤＮＡ３の制限
開裂、鎖長が約４kbpのベクターフラグメントの単離、
および鎖長が約７００bpのAvrII/Bst1107IＤＨＦＲフラ
グメントの挿入により行った〔Setzerら (1982) J. Bio
l. Chem. 257,5143-5147; Crouse ら (1982) J. Biol.
Chem. 257, 7887-7897 〕。
【００３３】エンベロープタンパク質Ｅ２をコードする
ＤＮＡ配列は、シグナルペプチド配列およびいわゆるＦ
ＬＡＧエピトープをコードするＤＮＡ配列と機能的に連
結させた状態で、得られたベクターｐｃＤＮＡ３−ＤＨ
ＦＲにクローン化した。シグナル配列としてはエリスロ
ポエチンシグナル配列〔Jacobsら, Nature 313 (1985),
806-810〕を９３bpのEcoRI/EheIフラグメント（配列番
号１の位置１−９３）として用いた。ＦＬＡＧエピトー
プは短鎖のオクタペプチドであり〔Hoppら, Bio/Techno
logy 6 (1988), 1204-1210〕、このエピトープに対する
モノクローナル抗体である抗ＦＬＡＧ−Ｍ１ (Kodak Ea
stman)が市販されていて、目的の発現産物の同定および
精製に使用することができる。２つのオリゴヌクレオチ
ドを互いとハイブリダイズさせてＦＬＡＧエピトープを
コードするＤＮＡ配列を調製し、キナーゼ処理後にリン
カーとして用いた（配列番号１の位置９４−１２６に相
当する）。
ＤＮＡ配列は、シグナルペプチド配列およびいわゆるＦ
ＬＡＧエピトープをコードするＤＮＡ配列と機能的に連
結させた状態で、得られたベクターｐｃＤＮＡ３−ＤＨ
ＦＲにクローン化した。シグナル配列としてはエリスロ
ポエチンシグナル配列〔Jacobsら, Nature 313 (1985),
806-810〕を９３bpのEcoRI/EheIフラグメント（配列番
号１の位置１−９３）として用いた。ＦＬＡＧエピトー
プは短鎖のオクタペプチドであり〔Hoppら, Bio/Techno
logy 6 (1988), 1204-1210〕、このエピトープに対する
モノクローナル抗体である抗ＦＬＡＧ−Ｍ１ (Kodak Ea
stman)が市販されていて、目的の発現産物の同定および
精製に使用することができる。２つのオリゴヌクレオチ
ドを互いとハイブリダイズさせてＦＬＡＧエピトープを
コードするＤＮＡ配列を調製し、キナーゼ処理後にリン
カーとして用いた（配列番号１の位置９４−１２６に相
当する）。
【００３４】Ｅ２発現ベクターを作製するために、プラ
スミドｐｃＤＮＡ３−ＤＨＦＲをEcoRI とNotIで消化
し、約５.9 kbpのベクターフラグメントを単離して、こ
れをEcoRI/EheIシグナル配列フラグメントおよびＦＬＡ
Ｇリンカーと３ウェイライゲーションにより連結させ
た。
スミドｐｃＤＮＡ３−ＤＨＦＲをEcoRI とNotIで消化
し、約５.9 kbpのベクターフラグメントを単離して、こ
れをEcoRI/EheIシグナル配列フラグメントおよびＦＬＡ
Ｇリンカーと３ウェイライゲーションにより連結させ
た。
【００３５】用いたＨＧＶのｃＤＮＡは Genelabs Tech
nologies Inc., Redwood City, CA,USA (WO 95/32291)
から得られた。ほぼ完全なＨＧＶゲノムが約９.3 kbpの
XbaI/EcoRIフラグメントとして存在しており、このフラ
グメントはベクターｐＧＥＭ−３Ｚ (Promega Corp., M
adison, WI, USA)の対応する制限部位にクローン化され
ている。Ｅ２をコードするＤＮＡ配列（配列番号１の位
置１２７−１２９０）は適当なオリゴヌクレオチドを用
いてＰＣＲにより増幅し、シグナルペプチドとＦＬＡＧ
エピトープをコードするＤＮＡ配列の隣にリーディング
フレームを合わせて NotI/XbaIフラグメントとしてクロ
ーン化した。
nologies Inc., Redwood City, CA,USA (WO 95/32291)
から得られた。ほぼ完全なＨＧＶゲノムが約９.3 kbpの
XbaI/EcoRIフラグメントとして存在しており、このフラ
グメントはベクターｐＧＥＭ−３Ｚ (Promega Corp., M
adison, WI, USA)の対応する制限部位にクローン化され
ている。Ｅ２をコードするＤＮＡ配列（配列番号１の位
置１２７−１２９０）は適当なオリゴヌクレオチドを用
いてＰＣＲにより増幅し、シグナルペプチドとＦＬＡＧ
エピトープをコードするＤＮＡ配列の隣にリーディング
フレームを合わせて NotI/XbaIフラグメントとしてクロ
ーン化した。
【００３６】実施例２ ＨＧＶ−Ｅ２に対するモノクローナル抗体の産生 2.1. ＤＮＡ免疫感作 免疫感作のためにＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを用いた。未処
理筋よりも再生筋でのＤＮＡ取り込みの効率を約１０倍
増加させるために、動物をヘビ毒 Latoxan (Rosans, Fr
ance) で処理してから１回目の免疫感作を行った。その
ため、それぞれの場合にマウスの両脛骨筋に１０μM の
ヘビ毒溶液を８０μl 注射した。５日後免疫感作を開始
し、各マウスにプラスミドＤＮＡを５回（０、５、１
０、１１、１２週目）注入した。この方法では、各脛骨
筋に５０μg のＤＮＡ、すなわち１回の免疫感作につき
動物あたり１００μg のＤＮＡを投与した。プラスミド
ＤＮＡは Qiagen カラムで製造業者の説明書に従って精
製した。２０週目で脾臓を取り出す前に動物を追加免疫
した。そのために、細胞膜上にＨＧＶ−Ｅ２を発現する
１０7 個のＣＨＯ細胞を各動物に静脈内投与した。
理筋よりも再生筋でのＤＮＡ取り込みの効率を約１０倍
増加させるために、動物をヘビ毒 Latoxan (Rosans, Fr
ance) で処理してから１回目の免疫感作を行った。その
ため、それぞれの場合にマウスの両脛骨筋に１０μM の
ヘビ毒溶液を８０μl 注射した。５日後免疫感作を開始
し、各マウスにプラスミドＤＮＡを５回（０、５、１
０、１１、１２週目）注入した。この方法では、各脛骨
筋に５０μg のＤＮＡ、すなわち１回の免疫感作につき
動物あたり１００μg のＤＮＡを投与した。プラスミド
ＤＮＡは Qiagen カラムで製造業者の説明書に従って精
製した。２０週目で脾臓を取り出す前に動物を追加免疫
した。そのために、細胞膜上にＨＧＶ−Ｅ２を発現する
１０7 個のＣＨＯ細胞を各動物に静脈内投与した。
【００３７】2.2. 融合およびクローニング Galfre and Milstein (1981) Meth. Enzymol. 73, 3-46
の手順に従って、免疫したマウスの脾細胞をミエローマ
細胞と融合させた。この方法では、免疫したマウスの約
１０8 個の脾細胞を２×１０7 個のミエローマ細胞 (P3
X63-Ag8-653, ATCC CRL1580)と混合し、遠心した。次に
ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を１回洗
い、４００ｇで再度遠心した。上清を捨て、細胞沈降物
をとんとんと軽くたたいて穏やかに解離させ、これに１
mlのＰＥＧ（分子量 4000, LifeTechnologies, カタロ
グ番号14030035) を１分以内に加えて、３７℃の水浴中
で静かにスワーリング(swirling)させて細胞と混ぜ合わ
せた。その後５分以内にＦＣＳを含まないＲＰＭＩ１６
４０培地を５ml加え、３７℃の水浴中で連続スワーリン
グにより混合した。ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ１６４０
培地を２５ml加えた後、細胞を４００ｇで１０分遠心し
た。細胞ペレットをＲＰＭＩ１６４０培地、１０％ＦＣ
Ｓに取り上げ、ヒポキサンチン−アザセリン選択培地
（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ中の１００mmol/lヒ
ポキサンチン、１μg/mlアザセリン）に接種した。増殖
因子としてインターロイキン６ (Boehringer Mannheim,
カタログ番号1444 581) を培地に加えた。約１０日後、
Ｅ２特異的抗体の合成について初代培養物を試験した
（実施例３参照）。Ｅ２特異的初代培養物をマイクロタ
イタープレートで蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣ
Ｓ）によりクローン化した。そのために、増殖用添加剤
としてインターロイキン６を培地に加えた。マウスの腹
水からの抗体の精製およびビオチンまたはジゴキシゲニ
ンによる誘導体化は、タンパク質化学の標準方法に従っ
て行った。
の手順に従って、免疫したマウスの脾細胞をミエローマ
細胞と融合させた。この方法では、免疫したマウスの約
１０8 個の脾細胞を２×１０7 個のミエローマ細胞 (P3
X63-Ag8-653, ATCC CRL1580)と混合し、遠心した。次に
ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を１回洗
い、４００ｇで再度遠心した。上清を捨て、細胞沈降物
をとんとんと軽くたたいて穏やかに解離させ、これに１
mlのＰＥＧ（分子量 4000, LifeTechnologies, カタロ
グ番号14030035) を１分以内に加えて、３７℃の水浴中
で静かにスワーリング(swirling)させて細胞と混ぜ合わ
せた。その後５分以内にＦＣＳを含まないＲＰＭＩ１６
４０培地を５ml加え、３７℃の水浴中で連続スワーリン
グにより混合した。ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ１６４０
培地を２５ml加えた後、細胞を４００ｇで１０分遠心し
た。細胞ペレットをＲＰＭＩ１６４０培地、１０％ＦＣ
Ｓに取り上げ、ヒポキサンチン−アザセリン選択培地
（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ中の１００mmol/lヒ
ポキサンチン、１μg/mlアザセリン）に接種した。増殖
因子としてインターロイキン６ (Boehringer Mannheim,
カタログ番号1444 581) を培地に加えた。約１０日後、
Ｅ２特異的抗体の合成について初代培養物を試験した
（実施例３参照）。Ｅ２特異的初代培養物をマイクロタ
イタープレートで蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣ
Ｓ）によりクローン化した。そのために、増殖用添加剤
としてインターロイキン６を培地に加えた。マウスの腹
水からの抗体の精製およびビオチンまたはジゴキシゲニ
ンによる誘導体化は、タンパク質化学の標準方法に従っ
て行った。
【００３８】実施例３ 産生された抗体の特異性の検討 ハイブリドーマ細胞の培養上清中の抗体の特異性を検討
するために、膜上にＦＬＡＧ−Ｅ２融合タンパク質また
はヒトウロキナーゼ受容体（これもアミノ末端ＦＬＡＧ
配列を提供する）を発現するＣＨＯ細胞との反応を、並
行して行った２つのＥＬＩＳＡ実験で調べた。そのため
に、実験の前日にマイクロタイタープレートの各ウェル
に約４×１０4 の密度で細胞を接種した。翌日、ウェル
につき２００μl のＲＰＭＩ１６４０培地、１０％ＦＣ
Ｓ、１％ BycoCとともに２時間インキュベートして、最
初に非特異的結合部位をブロックした。次に、各ウェル
に１００μl の細胞培養上清を分注して室温で６０分イ
ンキュベートした。ダルベッコＰＢＳ、0.02％ Tween 2
0 で３回洗った後、抗マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼ
Ｆａｂフラグメント (Boehringer Mannheim,カタログ番
号1500 686) を５０mU/ml の濃度および１００μl の容
量で細胞に加えた。室温で６０分インキュベートし、ダ
ルベッコＰＢＳ、0.02％ Tween 20 で３回洗った後、基
質としてＡＢＴＳR を加えて、３０〜６０分後にＥＬＩ
ＳＡリーダーを使って４０５／４９０nmで色の変化を測
定した。
するために、膜上にＦＬＡＧ−Ｅ２融合タンパク質また
はヒトウロキナーゼ受容体（これもアミノ末端ＦＬＡＧ
配列を提供する）を発現するＣＨＯ細胞との反応を、並
行して行った２つのＥＬＩＳＡ実験で調べた。そのため
に、実験の前日にマイクロタイタープレートの各ウェル
に約４×１０4 の密度で細胞を接種した。翌日、ウェル
につき２００μl のＲＰＭＩ１６４０培地、１０％ＦＣ
Ｓ、１％ BycoCとともに２時間インキュベートして、最
初に非特異的結合部位をブロックした。次に、各ウェル
に１００μl の細胞培養上清を分注して室温で６０分イ
ンキュベートした。ダルベッコＰＢＳ、0.02％ Tween 2
0 で３回洗った後、抗マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼ
Ｆａｂフラグメント (Boehringer Mannheim,カタログ番
号1500 686) を５０mU/ml の濃度および１００μl の容
量で細胞に加えた。室温で６０分インキュベートし、ダ
ルベッコＰＢＳ、0.02％ Tween 20 で３回洗った後、基
質としてＡＢＴＳR を加えて、３０〜６０分後にＥＬＩ
ＳＡリーダーを使って４０５／４９０nmで色の変化を測
定した。
【００３９】全部で８個のハイブリドーマクローン（抗
ＨＧＶ−Ｅ２クローン３、５、６、１１、１３、１７、
１９、３０）が同定され、これらのモノクローナル抗体
（モノクローナル抗体３、５、６、１１、１３、１７、
１９、３０）はＨＧＶ−Ｅ２を発現するＣＨＯ細胞を特
異的に認識した。
ＨＧＶ−Ｅ２クローン３、５、６、１１、１３、１７、
１９、３０）が同定され、これらのモノクローナル抗体
（モノクローナル抗体３、５、６、１１、１３、１７、
１９、３０）はＨＧＶ−Ｅ２を発現するＣＨＯ細胞を特
異的に認識した。
【００４０】実施例４ ＨＧＶ−Ｅ２を発現するＣＨＯ細胞を用いるＦＡＣＳ分
析 この方法では、膜上にＦＬＡＧ−Ｅ２融合タンパク質を
発現するＣＨＯ細胞をＥ２特異的モノクローナル抗体の
一つおよび抗ＦＬＡＧ−Ｍ１で順次染色した。両エピト
ープは一つの分子上に位置しているので、この実験は起
こりうるエピトープのオーバーラップに関する情報、ひ
いてはＥ２特異的抗体の結合に及ぼすＦＬＡＧエピトー
プの影響に関する情報を提供する。
析 この方法では、膜上にＦＬＡＧ−Ｅ２融合タンパク質を
発現するＣＨＯ細胞をＥ２特異的モノクローナル抗体の
一つおよび抗ＦＬＡＧ−Ｍ１で順次染色した。両エピト
ープは一つの分子上に位置しているので、この実験は起
こりうるエピトープのオーバーラップに関する情報、ひ
いてはＥ２特異的抗体の結合に及ぼすＦＬＡＧエピトー
プの影響に関する情報を提供する。
【００４１】0.02％ＥＤＴＡ／ＰＢＳを用いて細胞を培
養容器から分離させ、ＰＢＳで洗った。それぞれの場合
に２×１０5 個の細胞を１００μl ダルベッコＰＢＳ、
０.2％ウシ血清アルブミン、0.02％ＮａＮ3 中に懸濁し
て、モノクローナル抗体３、５、６、１１、１３、１
７、１９または３０（それぞれ２μg/ml）とともに氷上
で１５分インキュベートし、同一緩衝液で２回洗い、さ
らに抗マウスＩｇ−フルオレセイン（Ｆａｂ’）2 フラ
グメント (Boehringer Mannheim,カタログ番号1295 75
0) とともに１５分インキュベートした。２回洗浄した
後、細胞を１０μg/mlの濃度のマウスＩｇＧ (Sigma)と
ともに氷上で１５分インキュベートして遊離の抗マウス
ＩｇＧ結合部位をブロックした。続いて、この混合物に
ビオチン化抗ＦＬＡＧ−Ｍ１を0.35μg/mlの濃度で加え
た。１５分インキュベートした後、氷上で２回洗い、ス
トレプトアビジン−Ｒ−フィコエリスリン (Boehringer
Mannheim,カタログ番号1428 560) で蛍光的に標識した
第２モノクローナル抗体を加え、氷上で１５分インキュ
ベートした。２回洗浄した後、細胞をフローサイトメー
ターで分析した（図１）。二重染色はそれぞれの場合に
異なる勾配をもつ直線をもたらした。４５°の勾配（モ
ノクローナル５、１７および３０の場合）が２つの独立
したエピトープの認識にとって典型的である。モノクロ
ーナル３、１１、１３および１９の場合のように４５°
と異なる勾配は結合の相互立体障害を示しうる。
養容器から分離させ、ＰＢＳで洗った。それぞれの場合
に２×１０5 個の細胞を１００μl ダルベッコＰＢＳ、
０.2％ウシ血清アルブミン、0.02％ＮａＮ3 中に懸濁し
て、モノクローナル抗体３、５、６、１１、１３、１
７、１９または３０（それぞれ２μg/ml）とともに氷上
で１５分インキュベートし、同一緩衝液で２回洗い、さ
らに抗マウスＩｇ−フルオレセイン（Ｆａｂ’）2 フラ
グメント (Boehringer Mannheim,カタログ番号1295 75
0) とともに１５分インキュベートした。２回洗浄した
後、細胞を１０μg/mlの濃度のマウスＩｇＧ (Sigma)と
ともに氷上で１５分インキュベートして遊離の抗マウス
ＩｇＧ結合部位をブロックした。続いて、この混合物に
ビオチン化抗ＦＬＡＧ−Ｍ１を0.35μg/mlの濃度で加え
た。１５分インキュベートした後、氷上で２回洗い、ス
トレプトアビジン−Ｒ−フィコエリスリン (Boehringer
Mannheim,カタログ番号1428 560) で蛍光的に標識した
第２モノクローナル抗体を加え、氷上で１５分インキュ
ベートした。２回洗浄した後、細胞をフローサイトメー
ターで分析した（図１）。二重染色はそれぞれの場合に
異なる勾配をもつ直線をもたらした。４５°の勾配（モ
ノクローナル５、１７および３０の場合）が２つの独立
したエピトープの認識にとって典型的である。モノクロ
ーナル３、１１、１３および１９の場合のように４５°
と異なる勾配は結合の相互立体障害を示しうる。
【００４２】ＣＨＯ細胞への抗Ｅ２モノクローナル抗体
の非特異的結合を排除するため、追加のＣＨＯ細胞も陰
性対照として染色した。この場合には、抗ＦＬＡＧ−Ｍ
１による染色を省略した（図２）。この実験において、
モノクローナル抗体３０だけがＣＨＯ細胞とのわずかな
非特異的反応を示したが、他の７つのモノクローナル抗
体の場合にはバックグラウンド染色がまったく検出され
なかった。
の非特異的結合を排除するため、追加のＣＨＯ細胞も陰
性対照として染色した。この場合には、抗ＦＬＡＧ−Ｍ
１による染色を省略した（図２）。この実験において、
モノクローナル抗体３０だけがＣＨＯ細胞とのわずかな
非特異的反応を示したが、他の７つのモノクローナル抗
体の場合にはバックグラウンド染色がまったく検出され
なかった。
【００４３】実施例５ エピトープオーバーラップの試験 この試験は、Ｅ２特異的モノクローナル抗体を特徴づけ
るため、抗原として単離ＨＧＶ−Ｅ２を用いてブリッジ
試験として行った。抗原をビオチン化Ｅ２特異的捕捉抗
体を介してストレプトアビジンをコーティングしたＥＬ
ＩＳＡプレートに結合させた。 ａ）ＥＬＩＳＡプレートの作製： ストレプトアビジンをコーティングしたＥＬＩＳＡマイ
クロタイタープレート(Microcode, ストレプトアビジン
MTP F8)を５０μl のビオチン化モノクローナル抗体
（ダルベッコＰＢＳ、０．２％ウシ血清アルブミン中２
μg/ml）とともに６０〜１２０分インキュベートし、次
に０.9％ＮａＣｌ、0.05％ Tween 20 で３回洗った。
るため、抗原として単離ＨＧＶ−Ｅ２を用いてブリッジ
試験として行った。抗原をビオチン化Ｅ２特異的捕捉抗
体を介してストレプトアビジンをコーティングしたＥＬ
ＩＳＡプレートに結合させた。 ａ）ＥＬＩＳＡプレートの作製： ストレプトアビジンをコーティングしたＥＬＩＳＡマイ
クロタイタープレート(Microcode, ストレプトアビジン
MTP F8)を５０μl のビオチン化モノクローナル抗体
（ダルベッコＰＢＳ、０．２％ウシ血清アルブミン中２
μg/ml）とともに６０〜１２０分インキュベートし、次
に０.9％ＮａＣｌ、0.05％ Tween 20 で３回洗った。
【００４４】ｂ）細胞溶解： ＨＧＶ−Ｅ２を発現する細胞を0.02％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ
で培養容器から分離させ、ＰＢＳで洗った。次に細胞を
ＰＢＳ、０.5％ Nonidet P40、プロテアーゼミックス
(Boehringer Mannheim,カタログ番号1206 893) 中で溶
解した。そのために、溶解液１mlあたり１０7 個の細胞
を氷上で２時間インキュベートした。未溶解物質を遠心
により分離した。
で培養容器から分離させ、ＰＢＳで洗った。次に細胞を
ＰＢＳ、０.5％ Nonidet P40、プロテアーゼミックス
(Boehringer Mannheim,カタログ番号1206 893) 中で溶
解した。そのために、溶解液１mlあたり１０7 個の細胞
を氷上で２時間インキュベートした。未溶解物質を遠心
により分離した。
【００４５】ｃ）抗原の結合およびアッセイ： ａ）に従って作製したＥＬＩＳＡプレートを細胞溶解物
（ＰＢＳ、０.1％ Nonidet P40で希釈した）とともに室
温で６０分インキュベートした。ＰＢＳ、０.1％ Nonid
et P40で３回洗った後、ジゴキシゲニンで標識した第２
モノクローナル抗体を加え、室温で９０分インキュベー
トした。ＰＢＳ、０.1％ Nonidet P40で数回洗った後、
次に抗ジゴキシゲニンＩｇＧ−ＰＯＤとともに１時間イ
ンキュベートした。ＰＢＳ、０.1％ Nonidet P40で十分
に洗った後、ＡＢＴＳR を基質として加えて、３０〜６
０分後にＥＬＩＳＡリーダーを使って４０５／４９０nm
で色の変化を測定した。
（ＰＢＳ、０.1％ Nonidet P40で希釈した）とともに室
温で６０分インキュベートした。ＰＢＳ、０.1％ Nonid
et P40で３回洗った後、ジゴキシゲニンで標識した第２
モノクローナル抗体を加え、室温で９０分インキュベー
トした。ＰＢＳ、０.1％ Nonidet P40で数回洗った後、
次に抗ジゴキシゲニンＩｇＧ−ＰＯＤとともに１時間イ
ンキュベートした。ＰＢＳ、０.1％ Nonidet P40で十分
に洗った後、ＡＢＴＳR を基質として加えて、３０〜６
０分後にＥＬＩＳＡリーダーを使って４０５／４９０nm
で色の変化を測定した。
【００４６】モノクローナル抗体３、５、１１、１３、
１７、１９、３０をあらゆる可能な組合せでビオチン化
捕捉抗体およびジゴキシゲニン標識検出抗体として使用
した。上記のＥＬＩＳＡフォーマットでは全ての反応ス
テップが逐次進行するので、良好な捕捉抗体にとっては
低い解離定数が不可欠である。この前提条件はモノクロ
ーナル抗体５、１１、１７および３０によって満たされ
る。対照的に、モノクローナル抗体３、１３および１９
は検出抗体としてのみ使用できる。捕捉および検出抗体
としてのモノクローナル抗体の同時使用は、抗原の１価
コンホメーションを示すこの試験では不可能であった。
１７、１９、３０をあらゆる可能な組合せでビオチン化
捕捉抗体およびジゴキシゲニン標識検出抗体として使用
した。上記のＥＬＩＳＡフォーマットでは全ての反応ス
テップが逐次進行するので、良好な捕捉抗体にとっては
低い解離定数が不可欠である。この前提条件はモノクロ
ーナル抗体５、１１、１７および３０によって満たされ
る。対照的に、モノクローナル抗体３、１３および１９
は検出抗体としてのみ使用できる。捕捉および検出抗体
としてのモノクローナル抗体の同時使用は、抗原の１価
コンホメーションを示すこの試験では不可能であった。
【００４７】この試験はまた、個々のモノクローナル抗
体の可能なエピトープオーバーラップの試験を可能にす
る。モノクローナル抗体５および１７は、この組合せが
ブリッジ試験でシグナルに結びつかなかったので、明ら
かに同一のエピトープを認識する。これに対して、モノ
クローナル抗体５および１７はモノクローナル抗体１１
または３０と競合しなかった。このことはＨＧＶ−Ｅ２
上の少なくとも３つの異なるエピトープがこれらのモノ
クローナル抗体により認識されることを示している。
体の可能なエピトープオーバーラップの試験を可能にす
る。モノクローナル抗体５および１７は、この組合せが
ブリッジ試験でシグナルに結びつかなかったので、明ら
かに同一のエピトープを認識する。これに対して、モノ
クローナル抗体５および１７はモノクローナル抗体１１
または３０と競合しなかった。このことはＨＧＶ−Ｅ２
上の少なくとも３つの異なるエピトープがこれらのモノ
クローナル抗体により認識されることを示している。
【００４８】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１３０２ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Ｇ型肝炎ウイルス 直接の起源 クローン名：Ｅ１ＴＭ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：13..1290 配列
【００４９】
【化１】
【００５０】配列番号：２ 配列の長さ：４２６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００５１】
【化２】
【図１】ＦＬＡＧ−Ｅ２を発現するＣＨＯ細胞の、抗Ｆ
ＬＡＧ−Ｍ１および抗Ｅ２モノクローナル抗体３、５、
６、１１、１３、１７、１９、３０による染色を示す図
である。
ＬＡＧ−Ｍ１および抗Ｅ２モノクローナル抗体３、５、
６、１１、１３、１７、１９、３０による染色を示す図
である。
【図２】ＣＨＯ細胞（中実エリア）およびＦＬＡＧ−Ｅ
２を発現するＣＨＯ細胞（中空エリア）の、抗Ｅ２モノ
クローナル抗体３、５、６、１１、１３、１７、１９、
３０による染色を示す図である。
２を発現するＣＨＯ細胞（中空エリア）の、抗Ｅ２モノ
クローナル抗体３、５、６、１１、１３、１７、１９、
３０による染色を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/08 33/576 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/576 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/02 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 クリスタ フーブナー−パラジスズ ドイツ連邦共和国 ディー−82327 トゥ ツィング，マリエンシュトラーセ 11 (72)発明者 アルフレッド エンゲル ドイツ連邦共和国 ディー−82377 ペン ツバーグ，フィリップシュトラーセ 12 エー (72)発明者 ベアトゥス オフェンロック−ヘーンレ ドイツ連邦共和国 ディー−82398 ポー リング， ジョルグ−ルッカート−シュト ラーセ 17
Claims (15)
- 【請求項１】 Ｇ型肝炎ウイルス表面抗原に対するモノ
クローナル抗体。 - 【請求項２】 Ｇ型肝炎ウイルス表面抗原に対するポリ
クローナル抗体組成物。 - 【請求項３】 Ｇ型肝炎ウイルスＥ２表面抗原に対する
モノクローナル抗体。 - 【請求項４】 Ｇ型肝炎ウイルスＥ２表面抗原に対する
ポリクローナル抗体組成物。 - 【請求項５】 抗体が(a) 配列番号１に示される位置１
２７と１２９０の間のヌクレオチド配列、(b) 遺伝子コ
ードの縮重の範囲内で(a) の配列に一致するヌクレオチ
ド配列、および／または(c) ストリンジェント条件下で
(a) および／または(b) の配列とハイブリダイズするヌ
クレオチド配列、によりコードされるポリペプチドに対
して誘導されたものである、請求項３または４に記載の
抗体。 - 【請求項６】 抗体が(a) 配列番号２に示される位置３
９と４２６の間のアミノ酸配列、または(b) (a) の配列
に少なくとも８０％相同であるアミノ酸配列、を含むポ
リペプチドに対して誘導されたものである、請求項３、
４または５に記載の抗体。 - 【請求項７】 次のステップ：プロモーター、真核生物
のシグナル配列、Ｇ型肝炎ウイルス表面抗原をコードす
るＤＮＡ配列、および場合によりマーカー配列を含有す
る発現ベクターを用いて実験動物を免疫すること、 場合により、その実験動物を、細胞膜上にＨＧＶ表面抗
原を発現する細胞を用いて追加免疫すること、および免
疫した実験動物からＧ型肝炎ウイルス表面抗原に特異的
なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を得るこ
と、を含む方法により産生される、Ｇ型肝炎ウイルス表
面抗原に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗
体。 - 【請求項８】 細胞系“１１”（DSM ACC 2280）から得
られる請求項３、５、６または７に記載の抗体または同
等の結合特異性を有する抗体。 - 【請求項９】 細胞系“１７”（DSM ACC 2284）から得
られる請求項３、５、６または７に記載の抗体または同
等の結合特異性を有する抗体。 - 【請求項１０】 細胞系“３０”（DSM ACC 2285）から
得られる請求項３、５、６または７に記載の抗体または
同等の結合特異性を有する抗体。 - 【請求項１１】 生物学的分子に結合された請求項１〜
１０のいずれか１項に記載の抗体または該抗体のフラグ
メントを含むコンジュゲート。 - 【請求項１２】 ＨＧＶ検出用の診断剤としての請求項
１〜１０のいずれか１項に記載の抗体または請求項１１
に記載のコンジュゲートの使用。 - 【請求項１３】 受託番号DSM ACC 2280を有する細胞培
養物。 - 【請求項１４】 受託番号DSM ACC 2284を有する細胞培
養物。 - 【請求項１５】 受託番号DSM ACC 2285を有する細胞培
養物。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19638133 | 1996-09-18 | ||
| DE19638133:9 | 1996-10-22 | ||
| DE19643650:8 | 1996-10-22 | ||
| DE19643650A DE19643650A1 (de) | 1996-09-18 | 1996-10-22 | Antikörper gegen Hepatitis G-Virus und deren Verwendung zum diagnostischen Nachweis von HGV sowie als Therapeutikum |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10136990A true JPH10136990A (ja) | 1998-05-26 |
Family
ID=26029521
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9253310A Pending JPH10136990A (ja) | 1996-09-18 | 1997-09-18 | Ｇ型肝炎ウイルスに対する抗体、ｈｇｖの診断検出のた めのおよび治療薬としてのその使用 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6020195A (ja) |
| EP (1) | EP0832901A1 (ja) |
| JP (1) | JPH10136990A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009502880A (ja) * | 2005-07-28 | 2009-01-29 | サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック（セーエヌエールエス） | 毒素に対する電気移動による遺伝子免疫法および前記方法によって得られる抗血清 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1187356C (zh) | 2000-11-22 | 2005-02-02 | 南宁枫叶药业有限公司 | 高获得率提取替曲朵辛的系统 |
| WO2004108159A2 (en) * | 2003-06-05 | 2004-12-16 | The University Of Iowa Research Foundation | Gb virus c (hepatitis g virus) for the treatment of hiv |
| US7951531B2 (en) | 2005-02-17 | 2011-05-31 | University Of Iowa Research Foundation | Flavivirus NS5A proteins for the treatment of HIV |
| EP2215981B1 (de) * | 2009-02-04 | 2013-04-03 | Stryker Leibinger GmbH & Co. KG | Chirurgisches Elektrowerkzeug, Betriebsverfahren und Betätigungsbaugruppe hierfür |
| EP2215980B1 (de) * | 2009-02-04 | 2012-12-19 | Stryker Leibinger GmbH & Co. KG | Chirurgisches Elektrowerkzeug und Betätigungsbaugruppe hierfür |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5308750A (en) * | 1989-12-22 | 1994-05-03 | Abbott Laboratories | Monoclonal antibodies to putative HCV E2/NS1 proteins and methods for using same |
| WO1994018217A1 (en) * | 1993-02-03 | 1994-08-18 | Abbott Laboratories | Non-a, non-b, non-c, non-d, non-e hepatitis reagents and methods for their use |
| US5824507A (en) * | 1994-05-20 | 1998-10-20 | Genelabs Technologies, Inc. | Hepatitis G virus and molecular cloning thereof |
| DK0763114T3 (da) * | 1994-05-20 | 2002-04-02 | Genelabs Tech Inc | Hepatitis G-virus og molekylær kloning deraf |
| AU2594195A (en) * | 1994-05-20 | 1995-12-18 | Genelabs Technologies, Inc. | Detection of viral antigens coded by reverse-reading frames |
-
1997
- 1997-09-18 JP JP9253310A patent/JPH10136990A/ja active Pending
- 1997-09-18 US US08/932,823 patent/US6020195A/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-09-18 EP EP97116260A patent/EP0832901A1/de not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009502880A (ja) * | 2005-07-28 | 2009-01-29 | サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック（セーエヌエールエス） | 毒素に対する電気移動による遺伝子免疫法および前記方法によって得られる抗血清 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6020195A (en) | 2000-02-01 |
| EP0832901A1 (de) | 1998-04-01 |
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