ES2201289T3

ES2201289T3 - Expresion de antigenos de hgv y su utilizacion.

Info

Publication number: ES2201289T3
Application number: ES97918097T
Authority: ES
Inventors: Michael Tacke; Alfred Engel
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1996-04-03
Filing date: 1997-04-02
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2017-04-02
Also published as: WO1997038108A1; EP0891427B1; DE19613406A1; AU2635797A; DE59710308D1; ATE243255T1; JP2000510329A; EP0891427A1

Abstract

SE DESCRIBEN NUEVOS PROCEDIMIENTOS PARA LA PRODUCCION RECOMBINANTE DE ANTIGENOS DEL VIRUS DE LA HEPATITIS G, EN FORMA INCORPORADA A LA MEMBRANA O SOLUBLE, ASI COMO SU UTILIZACION PARA LA DETECCION DEL DIAGNOSTICO DEL HGV. PARA LA PREPARACION DE LOS ANTIGENOS SE UTILIZA PREFERIBLEMENTE UNA CELULA HOSPEDANTE EUCARIOTICA.

Description

Expresión de antígenos de HGV y su utilización.

El presente invento se refiere a nuevos procedimientos para la producción de antígenos de HGV y a su utilización para la detección como diagnóstico de HGV.

Junto a los virus de la hepatitis A (HAV) y a los virus de la hepatitis B (HBV), que ya son conocidos desde hace mucho tiempo, se caracterizaron en los últimos tiempos otros virus, que ciertamente están asociados con una hepatitis, pero que, no obstante, constituyen grupos autónomos de virus. Estos grupos de virus son designados usualmente de tal manera que a un nuevo grupo se le asigna siempre una letra consecutiva del alfabeto. Cada virus asociado con una hepatitis acabado de descubrir es delimitado también con respecto a los grupos de virus ya conocidos, de tal manera que es designado como no perteneciente al grupo de los virus conocidos hasta ahora. Así, el virus de la hepatitis C (HCV) fue designado como virus de la hepatitis no A / no B (Choo y colaboradores 1989, Science 244, 359 - 362). El presente invento se refiere a un virus, que no puede ser clasificado en el grupo de los virus HAV, HBV, HCV, HDV y HEV, y que se designa por consiguiente como virus de la hepatitis G (HGV).

En el documento de solicitud de patente internacional WO 94/18217 se describe un virus asociado con una hepatitis, que no puede ser asignado a ninguno de los grupos HAV, HBV, HCV, HDV y HEV. Este virus, sin embargo, no tiene en su secuencia de nucleótidos ninguna similaridad con la secuencia que se describe en el presente invento.

En el documento WO 95/21922 se describen las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de los HGV. En los Ejemplos 13, 19 y 20 se divulga la expresión recombinante de polipéptidos de HGV en E. coli. Se hace referencia expresamente a las secuencias divulgadas en esta solicitud.

En el documento WO 95/32291 se describen igualmente las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de los HGV. En el Ejemplo 16 se describe la expresión recombinante de HGV en E. coli, en células de insectos y en Vaccinia. Se hace referencia expresamente aquí a las secuencias divulgadas en esta solicitud.

El grupo de virus asociados con una hepatitis, designado como HGV en el presente invento, pertenece presuntamente a la familia de los Flaviviridae (Chambers y colaboradores 1990, Annu. Ref. Microbiol. 44, 649-688).

Las infecciones víricas son detectadas usualmente por medio de la presencia de antígenos víricos o/y de anticuerpos dirigidos contra estos antígenos en líquidos corporales tales como, por ejemplo, suero. Para la detección de los anticuerpos se pueden emplear polipéptidos víricos o fragmentos peptídicos de éstos como antígenos en un ensayo inmunológico. Para la realización de un ensayo inmunológico de este tipo es necesario poner a disposición apropiados constituyentes peptídicos o polipeptídicos inmunógenos de virus en una cantidad suficiente.

Hasta hoy en día no se conoce ningún método para el diagnóstico inmunológico rutinario de un HGV. Además de esto, se sabe que los péptidos sintéticos cortos así como los polipéptidos recombinantes procedentes de E. coli conocidos hasta ahora, no se han acreditado especialmente bien como reactivos para diagnósticos.

La misión en la que se basó el presente invento fue, por consiguiente, poner a disposición nuevos procedimientos para la expresión de antígenos de HGV y desarrollar nuevos procedimientos para la detección de una infección causada por los HGV.

El problema planteado por esta misión se resuelve mediante un nuevo procedimiento para la producción recombinante de antígenos procedentes de HGV en una forma fijada a una membrana o/y soluble. Como un antígeno de HGV en el sentido del presente invento son apropiados polipéptidos procedentes del genoma de HGV (documentos WO 95/21922 y WO 95/32291), que tienen por lo menos un determinante antigénico o inmunogénico. A partir del genoma global de un HGV se prefieren los sectores de secuencias de ADN que codifican las proteínas de envoltura putativas E1 y E2. Estas proteínas de envoltura se componen de un segmento principal situado en el extremo terminal de amino, que está localizado en el lado exterior de una partícula funcional de virus y que desempeña un cometido decisivo en el acoplamiento y enganche al organismo hospedante, y de un corto segmento hidrófobo situado en el extremo terminal de carboxi, que está anclado en la membrana.

La meta del invento fue poner a disposición un sistema de expresión lo más auténtico que sea posible para antígenos de HGV, que garantice un correcto procesamiento (tratamiento) después de la traducción, eventualmente una glicosilación y la exportación desde el citoplasma. Para ello, la expresión se lleva a cabo particularmente en células de mamíferos, p.ej. en células CHO (de Chinese Hamster Ovary = de ovario de hámster chino). Allí la biosíntesis de proteínas tiene lugar junto a los ribosomas existentes en el citosol. Al realizar la expresión de los antígenos de HGV en unión operativa con secuencias de señal situadas en el extremo terminal de amino, p.ej. secuencias hidrófobas con una longitud de 20 a 30 aminoácidos, que son reconocidas durante la biosíntesis de proteínas en el citosol por las denominadas partículas de reconocimiento de señales (del inglés "signal recognition particles"), los ribosomas son dirigidos hacia el retículo endoplasmático (RE). Allí las cadenas de polipéptidos que se forman son sacadas a través de la membrana del RE, hasta que son detenidas en la membrana por secuencias de detención de transferencia. En el lumen del RE las proteínas son eventualmente glicosiladas y, a continuación, son modificadas ulteriormente en el aparato de Golgi. Finalmente, son seleccionadas para la exportación en dirección a una membrana plasmática.

De acuerdo con una primera forma de realización, el presente invento concierne a un procedimiento para la producción recombinante de un antígeno de HGV en forma fijada a una membrana, que comprende las siguientes etapas:

(a): introducir una secuencia de ADN en una célula hospedante, codificando la secuencia de ADN el antígeno con un dominio de anclaje a una membrana, funcionalmente activo, en unión operativa con un péptido de señal, induciendo el péptido de señal una exportación del antígeno desde el citoplasma,

(b): cultivar la célula hospedante procedente de la etapa (a) en unas condiciones en las que se efectúa una expresión de la secuencia de ADN introducida, siendo producido el antígeno en una forma fijada a una membrana, y

(c): obtener la célula hospedante que contiene el antígeno en su membrana.

Preferiblemente, las proteínas de envoltura E1 o/y E2 se producen en forma de antígenos fijados a una membrana. La secuencia de nucleótidos de un antígeno E1 de HGV es, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que se indica entre la posición 127 y la posición 681 de SEQ ID NO.1, que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos indicada entre las posiciones 39 y 223 de SEQ ID NO. 2. Una secuencia de nucleótidos, que codifica un antígeno E2 de HGV es, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos indicada entre las posiciones 127 y 1.290 de SEQ ID NO. 5. Esta secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos indicada entre las posiciones 39 y 426 de SEQ ID NO. 6. Junto a estas secuencias de nucleótidos o de aminoácidos indicadas específicamente, el presente invento abarca, no obstante, también otras variantes.

Es objeto del presente invento, por consiguiente, un procedimiento, en el que se produce un antígeno E1 fijado a una membrana, que es codificado por

(a): la secuencia de nucleótidos indicada entre las posiciones 127 y 681 de SEQ. ID NO. 1,

(b): una secuencia correspondiente a la secuencia de (a) dentro del marco de la degeneración del código genético o/y

(c): una secuencia de nucleótidos que se hibrida con las secuencias procedentes de (a) o/y (b) en condiciones rigurosas

Preferiblemente, el antígeno E1 fijado a una membrana comprende

(a): la secuencia de aminoácidos indicada entre las posiciones 39 y 223 de SEQ ID NO. 2 o

(b): una secuencia de aminoácidos homóloga con la secuencia procedente de (a) en por lo menos un 80% y en particular en por lo menos un 90%.

Otro objeto del presente invento es un procedimiento para la producción de un antígeno E2 fijado a una membrana, que es codificado por

(a): la secuencia de nucleótidos indicada entre las posiciones 127 y 1.290 de SEQ. ID NO. 5,

(b): una secuencia correspondiente a la secuencia procedente de (a) dentro del marco de la degeneración del código genético o/y

(c): una secuencia de nucleótidos que se hibrida con las secuencias procedentes de (a) o/y (b) en condiciones rigurosas.

Preferiblemente, el antígeno E2 fijado a una membrana comprende

(a): la secuencia de aminoácidos indicada entre las posiciones 39 y 426 de SEQ ID NO. 6 o

El concepto de "hibridación" de acuerdo con el presente invento se utiliza como en la cita bibliográfica de Sambrook y colaboradores (1989) en Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación molecular, un manual de laboratorio], Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1.101 - 1.104. Conforme a ello, se habla de una hibridación cuando, después de haber lavado durante una hora con 1 x SSC y SDS al 0,1% a 55ºC, preferiblemente a 62ºC, y de manera especialmente preferida a 68ºC, en particular durante 1 hora con 0,2 x SSC y SDS al 0,1% a 55ºC, preferiblemente a 62ºC, y de manera especialmente preferida a 68ºC, se observa todavía un señal de hibridación positiva.

Otro objeto del presente invento es una célula recombinante, en particular una célula de mamífero cultivada in vitro, tal como, por ejemplo, una célula CHO, que presenta junto a su superficie antígenos de HGV en una forma fijada a una membrana, en particular los antígenos E1 o/y E2 o secuencias parciales de éstos, relevantes inmunológicamente.

La célula de acuerdo con el invento se puede utilizar como reactivo de diagnóstico para la detección de los HGV, p.ej., mediante un análisis FACS o mediante un ELISA. Para ello, se determina la reacción de una célula, que presenta un antígeno de HGV junto a su superficie, con un líquido de muestra, p.ej. un suero humano. Al aparecer una reacción hay que partir del supuesto de que en la muestra analizada están contenidos anticuerpos anti-HGV.

El segundo aspecto del presente invento se refiere a un procedimiento para la producción recombinante de un antígeno de HGV, preferiblemente del antígeno E1 ó E2 en una forma soluble. Este procedimiento comprende las etapas de:

(a): introducir una secuencia de ADN en una célula hospedante, codificando la secuencia de ADN el antígeno con un dominio de anclaje a una membrana inactivo funcionalmente;

(b): cultivar la célula hospedante procedente de la etapa (a) en unas condiciones en las que se efectúa una expresión de la secuencia de ADN introducida, siendo producido el antígeno en una forma soluble, y

(c): obtener el antígeno.

Preferiblemente, el procedimiento se lleva a cabo de tal manera que la secuencia de ADN que codifica para el antígeno sea unida operativamente con una secuencia de señal. En este caso, es posible una obtención sencilla del antígeno a partir del material sobrenadante del cultivo, sin purificación ulterior. Preferiblemente, se utiliza una célula hospedante eucariótica, p.ej. una célula CHO.

Ejemplos de antígenos de HGV en una forma soluble, que son obtenibles mediante el procedimiento de acuerdo con el invento, son los antígenos E1 y E2 con un dominio de anclaje a una membrana desactivado funcionalmente por deleción. Un antígeno E1 soluble es codificado preferiblemente por

(a): la secuencia de nucleótidos indicada entre las posiciones 127 y 552 de SEQ. ID NO. 3,

(c): una secuencia de nucleótidos que se hibrida con las secuencias de (a) o/y (b) en condiciones rigurosas.

De manera especialmente preferida, el antígeno E1 soluble comprende

(a): la secuencia de aminoácidos indicada entre las posiciones 39 y 180 de SEQ ID NO. 4 o

Un antígeno E2 soluble preferido es codificado por

(a): la secuencia de nucleótidos indicada entre las posiciones 127 y 1.134 de SEQ. ID NO. 7 o

De manera especialmente preferida, un antígeno soluble E2 comprende

(a): la secuencia de aminoácidos indicada entre las posiciones 39 y 374 de SEQ ID NO. 8 o

Otro objeto del presente invento es un ácido nucleico, que codifica el antígeno E1 ó E2 de HGV con un dominio de anclaje a una membrana inactivo funcionalmente. Preferiblemente, este ácido nucleico comprende una secuencia tal como se ha definido anteriormente.

Todavía otro objeto del presente invento es un polipéptido codificado por el ácido nucleico, que para su utilización en un ensayo de diagnóstico lleva preferiblemente por lo menos un grupo de marcación o un grupo de fijación a una fase sólida. Como grupo de marcación entran en cuestión todos los grupos de marcación conocidos, que se pueden detectar en un sistema de ensayo, es decir grupos de marcación que son detectables directa o indirectamente. En este caso, por un grupo de marcación detectable directamente se ha de entender un grupo, que genera una señal detectable directamente, p.ej. un grupo radiactivo, un grupo enzimático o un grupo luminiscente. Se prefieren especialmente grupos enzimáticos y grupos luminiscentes, en particular grupos electro-quimioluminiscentes. Por otra parte, el grupo de marcación puede ser también un grupo detectable indirectamente, p.ej. un grupo de biotina o hapteno, que es detectable mediante reacción con un apropiado partícipe en una fijación (estreptavidina, avidina o un anticuerpo anti-hapteno), que por su parte lleva un grupo que genera una señal. Como grupo de marcación se puede utilizar igualmente un dominio de péptido o polipéptido heterólogo fusionado con el polipéptido de HGV de acuerdo con el invento, que reacciona específicamente con un apropiado partícipe en una fijación. Un ejemplo de esto es el epítopo de FLAG, que a causa de su reacción con un anticuerpo, puede servir como grupo de marcación.

Los grupos de péptidos, polipéptidos, haptenos o biotina se pueden emplear también como grupos de fijación a una fase sólida para la inmovilización de los antígenos junto a una fase sólida. El grupo de marcación o de fijación a una fase sólida puede ser acoplados, siempre y cuando que sea necesario, con el antígeno de una manera conocida, por ejemplo a través de un espaciador bifuncional. Tales procedimientos para el acoplamiento de grupos de marcación o de fijación a una fase sólida con polipéptidos, son conocidos por un experto en el sector de la inmunología y no necesitan ser ilustrados aquí más detalladamente.

Todavía un objeto adicional del presente invento es un vector recombinante, que contiene por lo menos una copia de un ácido nucleico que codifica un antígeno de HGV soluble. Este vector es preferiblemente un vector eucariótico, p.ej. un vector de levadura o un vector apropiado para células más desarrolladas (superiores), p.ej. un vector plasmídico o un vector vírico. Tales vectores son conocidos por un experto en la especialidad (compárese, p.ej., la cita de Sambrook y colaboradores, véase más arriba, capítulo 16).

Un objeto adicional del presente invento es una célula, que es transformada con una secuencia de ADN de acuerdo con el invento o con un vector de acuerdo con el invento. Esta célula es preferiblemente una célula eucariótica, en particular una célula de mamífero. Procedimientos para la transformación o transfección de células eucarióticas con secuencias exógenas de ácidos nucleicos son conocidos por un experto en el sector de la biología molecular y no necesitan ser ilustrados aquí con más detalle (compárese, p.ej. la cita de Sambrook y colaboradores, capítulo 16).

El polipéptido de HGV soluble se puede utilizar como reactivo de diagnóstico para la detección de los HGV y, a causa de su efecto antigénico, se puede utilizar también para la preparación de una vacuna contra una infección causada por los HGV.

Antígenos de HGV, tanto solubles como también estables en membranas, se pueden producir como tales o como fusiones con otros componentes de péptidos o/y polipéptidos, p.ej. en forma de una fusión con un componente peptídico reactivo inmunológicamente, tal como por ejemplo el epítopo de FLAG.

La detección de los HGV se efectúa en particular mediante una determinación inmunológica de un anticuerpo dirigido contra HGV en un líquido de muestra, siendo incubado el líquido de muestra con por lo menos un polipéptido de HGV soluble de acuerdo con el invento y siendo detectado el anticuerpo a través de una fijación con el polipéptido. Este procedimiento inmunológico de determinación se puede efectuar de acuerdo con cualquier formato de ensayo conocido, p.ej. en un ensayo inmunológico homogéneo con una única fase de reacción o en un ensayo inmunológico heterogéneo con más de una fase de reacción. Preferiblemente, se utiliza un formato de ensayo heterogéneo, en el que la presencia de un anticuerpo se detecta en presencia de una fase sólida.

Una forma de realización de este formato de ensayo es el denominado concepto de ensayo de puente con doble antígeno. En este caso, el líquido de muestra se incuba con por lo menos dos polipéptidos de HGV P1 y P2, estando fijado el polipéptido P1 a una fase sólida o presentándose en una forma capaz de fijarse a una fase sólida y llevando el polipéptido P2 un grupo de marcación. El anticuerpo presente en el líquido de muestra se detecta mediante determinación de la marcación en la fase sólida o/y en la fase líquida, a través de un complejo inmunológico inmovilizado, es decir fijado a la fase sólida.

La realización del ensayo implica preferiblemente un mezclamiento del líquido de muestra con un antígeno P2 marcado, así como con un antígeno P1 situado junto a una fase sólida, para obtener un complejo inmovilizado y marcado, a base de un antígeno marcado, de un anticuerpo y de un antígeno fijado a la fase sólida. Mediante utilización de los polipéptidos de acuerdo con el invento en una forma soluble se consigue evitar aumentos del valor en vacío y una desfavorable relación de señal a ruido a causa de agregaciones del antígeno.

El polipéptido de HGV soluble de acuerdo con el invento se puede emplear, no obstante, también en otros formatos de ensayo, por ejemplo en un ensayo inmunológico indirecto para el reconocimiento de una inmunoglobulina específica mediante fijación a un antígeno específico por el lado de una pared y mediante detección indirecta a través de un conjugado con un segundo anticuerpo anti-HGV, que lleva preferiblemente una marcación.

Finalmente, el presente invento se refiere también a un reactivo para la determinación inmunológica de un anticuerpo dirigido contra un virus de la hepatitis G, que contiene, junto a otros componentes de detección, una célula recombinante con un antígeno de HGV fijado a una membrana o/y un antígeno de HGV soluble.

Además, el presente invento se describe por medio de los Ejemplos, los Protocolos de Secuencias y las Figuras siguientes.

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En ellas muestran:

la SEQ ID NO. 1:: una secuencia de nucleótidos, que codifica una proteína de fusión que contiene el antígeno E1 de HGV inclusive un dominio transmembranal (HGV-E1TM).

la SEQ ID NO. 2:: la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión,

la SEQ ID NO. 3:: una secuencia de nucleótidos, que codifica una proteína de fusión que contiene el antígeno E1 de HGV sin el dominio transmembranal (HGV-E1S),

la SEQ ID NO. 4:: la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión HGV-E1S,

la SEQ ID NO. 5:: una secuencia de nucleótidos, que codifica una proteína de fusión que contiene el antígeno E2 de HGV con un dominio transmembranal (HGV-E2TM),

la SEQ ID NO. 6:: la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión HGV-E2TM,

la SEQ ID NO. 7:: una secuencia de nucleótidos, que codifica una proteína de fusión que contiene el antígeno E2 de HGV sin el dominio transmembranal,

la SEQ ID NO. 8:: la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión HGV-E2S, y

la Figura 1: citogramas de flujo pasante representativos, que muestran la tinción de linajes celulares que expresan el antígeno E2 con sueros humanos.

Ejemplos Ejemplo 1 Clonación y expresión de antígenos de HGV

Para la manipulación de los ADN y para la expresión de polipéptidos se utilizaron métodos clásicos, tal como se describen en las citas de Sambrook y colaboradores (1989) en Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York y de Ausubel y colaboradores (1989) en Current Protocols Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York.

La manipulación de los ADN se llevó a cabo en la cepa K12 DH5\alpha de E. coli. La expresión de las proteínas recombinantes se efectuó en células CHO-DHFR, DSM ACC 126.

1.1 Como vector para la expresión en un sistema celular eucariótico se utilizó un derivado del vector pcDNA3 con el promotor de CMV (de citomegalovirus) y una señal de poli-adenilación BGH (entidad Invitrogen BV, NV Leek, Holanda). Para ello el vector pcDNA3 se modificó mediante el intercambio del gen de resistencia frente a neomicina por un gen de la dihidrofolato-reductasa (DHFR). Esto se efectuó mediante corte por restricción de pcDNA3 con Avr II y Bst1107I, aislamiento del fragmento de vector con una longitud de aproximadamente 4 kb e inserción de un fragmento de DHFR AvrII/Bst110707I con una longitud de aproximadamente 700 pb (pares de bases) (Setzer y colaboradores (1982), J. Biol. Chem. 257, 5.143-5.147; Crouse y colaboradores (1982), J. Biol. Chem. 257, 7.887-7.897).

Las secuencias de ADN que codifican las proteínas de envoltura de HGV E1 y E2 se clonaron en el resultante vector pcDNA3-DHFR en unión operativa con una secuencia de péptido de señal, así como junto a una secuencia de ADN que codifica un denominado epítopo de FLAG, y se expresaron en común con ambos elementos en forma de una proteína de fusión. Como secuencia de señal se empleó la secuencia de señal de eritropoyetina (EPO) (Jacobs y colaboradores (1985) Nature 313, 806-810) en forma de un fragmento de EcoRI/EheI con una longitud de 93 pb (posiciones de 1a 93 de SEQ ID NO. 1).

El epítopo de FLAG es un péptido con una longitud de 8 aminoácidos (Hopp y colaboradores (1988), Bio/
Technology 6, 1.204-1.210), contra el que es obtenible comercialmente un anticuerpo monoclonal, que se puede emplear eventualmente para la purificación y la identificación del deseado producto de expresión. Para la producción de la secuencia de ADN que codifica el epítopo de FLAG se hibridaron uno con otro dos oligonucleótidos y, después de una cinasación, se emplearon como un engarzador (correspondientemente a las posiciones 94-125 de SEQ ID NO. 1).

Para la producción del vector de expresión de E1 ó E2, el plásmido pcDNA3-DHFR se digirió con EcoRI y NotI, el fragmento de vector con una longitud de 5,9 kb se aisló y se ligó en una ligación de 3 vías con el fragmento de secuencia de señal y con el engarzador de FLAG.

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El ADNc de HGV utilizado procedía de la entidad Genelabs Technologies Inc., Redwood City, CA, EE.UU. (documento WO 95/32291). El genoma de HGV casi completo se presentaba en forma de un fragmento de XbaI/EcoRI con una longitud de 9,3 kb, que había sido clonado en los correspondientes sitios de corte por restricción del vector pGEM3Z (entidad Promega Corp., Madison, WI, EE.UU.).

Se llevó a cabo una expresión de las proteínas de envoltura E1 y E2 con o sin una secuencia de anclaje transmembranal. Las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos se indican de la siguiente manera para las respectivas estructuras artificiales:

SEQ ID NO. 1 / 2 - antígeno E1 con una secuencia transmembranal (posiciones 13 - 93 péptido de señal; posiciones 94 - 126 secuencia de FLAG + engarzador de NotI; posiciones 127 - 681 secuencia de E1; posiciones 688 - 693 engarzador de XbaI).

SEQ ID NO. 3 / 4 - antígeno E1 sin ninguna secuencia transmembranal (posiciones 13 - 93 secuencia de señal; posiciones 94 - 126 secuencia de FLAG + engarzador; posiciones 127 - 552 secuencia de E1; posiciones 559 - 564 secuencia del engarzador).

SEQ ID NO. 5 / 6 - antígeno E2 con una secuencia transmembranal (posiciones 13 - 93 secuencia de EPO; posiciones 94 - 126 secuencia de FLAG + engarzador; posiciones 127 - 1.290 secuencia de E2; posiciones 1.297 - 1.302 secuencia del engarzador).

SEQ ID NO. 7 / 8 - antígeno E2 sin ninguna secuencia de anclaje transmembranal (posiciones 13 - 93 secuencia de señal; posiciones 94 - 126 secuencia de FLAG + engarzador; posiciones 127 - 1.134 secuencia de E2; posiciones 1.141 - 1.146 secuencia del engarzador).

La clonación de las estructuras artificiales antes citadas se efectuó mediante amplificación de las secuencias de ADN que codifican las proteínas de envoltura con oligonucleótidos apropiados mediante una PCR (reacción en cadena de polimerasa) y clonación en forma de fragmentos de NotI/XbaI dentro de marco (in frame) junto a las secuencias de ADN que codifican el péptido de señal y el epítopo de FLAG en el vector.

1.2 Expresión

Para la expresión de las proteínas de envoltura de HGV se introdujeron las estructuras artificiales de expresión descritas en el párrafo 1.1. mediando utilización del reactivo de transfección DOTAP (entidad Boehringer Mannheim GmbH, nº de catálogo 1202 375) en células CHO-DHFR. La selección de células transfectadas se efectuó en un medio MEM \alpha exento de nucleósidos (entidad Gibco BRL, nº de catálogo 22561-021), mezclado con 10% de suero de ternero fetal dializado (Gibco BRL, nº de catálogo 10110-070).

Mediante selección con DHFR la estructura artificial de expresión se amplificó adicionalmente en linajes celulares estables mediante adición de metotrexato (entidad Sigma-Aldrich GmbH, nº de catálogo M8407) al medio de crecimiento. Después de una selección durante 10 días, se entresacaron clones individuales y se analizaron mediante inmunofluorescencia, mediando utilización de anticuerpos M1 anti-FLAG (entidad Eastman Kodak Comp., nº de catálogo IB13001), en cuanto a la expresión del epítopo FLAG.

Alternativamente a esto, se analizaron, mediante citometría de flujo pasante, los clones, que deberían presentar secuencias de E1 y E2 con un anclaje transmembranal sobre la membrana celular (HGV-E1TM y HGV-E2TM), después de haberlos teñido con anticuerpos M1 y con el fragmento (Fab')_{2} de Ig-fluoresceína anti-ratón (Boehringer Mannheim GmbH, nº de catálogo 1214 616), (véase el Ejemplo 2). Los clones que expresaban el epítopo de FLAG se subclonaron y utilizaron para el análisis de sueros humanos (véase la analítica de FACS, Ejemplo 2).

Los clones, que expresan las estructuras artificiales de expresión HGV-E1s y HGV-E2s, no presentan los antígenos situados en la membrana, sino que segregan a éstos sin anclaje transmembranal directamente en el material sobrenadante de cultivo. Estos antígenos se pueden emplear en ensayos inmunológicos clásicos. Para ello, no es ni siquiera necesaria una purificación, sino que en vez de ello éstos se acoplan directamente desde el material sobrenadante de cultivo exento de suero con placas para ELISA revestidas con anticuerpos M1.

Ejemplo 2 Analítica de FACS con el antígeno HGV-E2TM fijado a una membrana

En este procedimiento se utilizaron células CHO, que expresan una proteína de fusión FLAG-E2TM recombinante situada junto a una membrana, como sustancia de captura para anticuerpos específicos para HGV en sueros humanos. En este caso, la proteína de fusión FLAG-E2TM recombinante, expresada, estaba a disposición en forma nativa como sustancia de captura para anticuerpos. De esta manera, se conservaron inalterados los epítopos dependientes de la conformación, por lo que este método es ideal para investigar sueros humanos en cuanto a la presencia de anticuerpos específicos para HGV.

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Las células que expresan la FLAG-E2TM fueron para ello separadas del recipiente de cultivo mediante disolución en EDTA al 0,04% en PBS y se lavaron en PBS. En cada caso 200.000 células se suspendieron renovadamente en 100 \mul de PBS, CaCl_{2} 1 mM, albúmina de suero bovino al 0,2% y NaN_{3} al 0,02%, se incubaron con 1-5 \mul de suero humano durante 30 min sobre hielo, se lavaron dos veces con el mismo tampón y se incubaron durante otros 30 min con un fragmento (Fab')_{2} de Ig-fluoresceína anti-humana (Boehringer Mannheim GmbH, no de catálogo 1295750), con el fin de hacer a los anticuerpos fijados a HGV detectables por la citometría de flujo pasante Después de haber lavado de nuevo dos veces, se analizaron las células en el citómetro de flujo pasante.

Para excluir una fijación inespecífica de anticuerpos de suero a células CHO o una fijación solamente al epítopo de FLAG, se pueden teñir adicionalmente, como referencia negativa, células CHO, que habían sido transfectadas con una proteína de fusión con FLAG irrelevante (p.ej. el receptor humano para la urocinasa, que está provisto igualmente de una secuencia de FLAG situada en el extremo terminal de amino).

La Figura 1-1 muestra la tinción de dos clones de CHO, que expresan el receptor para urocinasa con una secuencia de FLAG situada en el extremo terminal de amino (3UR8, Fig. 1-1a) o que expresan la E2TM con una secuencia de FLAG situada en el extremo terminal de amino (2E2TM12, Fig. 1-1b). Ambos clones se tiñeron con el anticuerpo M1 específico para FLAG (curva rellena). Las curvas no rellenas representan el isotipo testigo. Se observa una gran amplitud de expresión de FLAG en 3UR8 o en el caso de 2E2TM12, es decir, que aproximadamente 2/3 de las células del clon expresan la proteína de fusión recombinante.

La Figura 1-2 muestra la tinción con un suero humano, que contiene anticuerpos específicos para HGV. Se tiñeron con este suero 2/3 de las células 2E2TM12 (Fig. 1-2b), análogamente a la tinción con el anticuerpo M1 (Fig. 1-1b). Por el contrario, no se encontró ninguna tinción de las células 3UR8 (Fig. 1-2a), a pesar de que éstas expresan el epítopo de FLAG. La tinción de las células 2E2TM12 no puede estar basada, por lo tanto, en una fijación de anticuerpos de suero a células de CHO o al epítopo de FLAG, sino solamente en una fijación específica a la porción E2TM de la proteína de fusión recombinante. El procedimiento es, por consiguiente, apropiado para detectar anticuerpos específicos para E2TM en sueros humanos.

La Figura 1-3 muestra finalmente la tinción con un suero humano, que no contiene anticuerpos específicos para HGV. Ni las células 2E2TM12 (Fig. 1-3a) ni las células 3UR8 (Fig. 1-3b) fueron teñidas con este suero. Esto muestra que la expresión fijada a una membrana de proteínas de envoltura de HGV es un instrumento de diagnóstico específico para la detección de anticuerpos dirigidos contra HGV en un suero humano.

Ejemplo 3 Analítica por ELISA con el antígeno HGV-E2TM

En este procedimiento, la proteína de fusión FLAG-E2TM se aisló a partir de los clones de CHO y se utilizó como sustancia de captura para anticuerpos específicos para HGV en el formato clásico de ELISA. El antígeno se fijó en este caso a través del epítopo de FLAG a un anticuerpo M1 biotinilado, que estaba acoplado, por su parte, a una placa para ELISA revestida con estreptavidina. También en este forma fue presentada en forma nativa la proteína de fusión FLAG-E2TM que había sido expresada de manera recombinante, y los epítopos dependientes de la conformación permanecieron inalterados.

a): Preparación previa de las placas para ELISA: Placas de microtitulación por ELISA, revestidas con estreptavidina (entidad Microcode, Streptavidin MTP F8), se incubaron durante 60 min con 25 \mul de anticuerpos M1 biotinilados, específicos para FLAG (2,5 \mug/ml en PBS, con albúmina de suero bovino al 0,2%), y, seguidamente, se lavaron tres veces con NaCl al 0,9%, Tween 20 al 0,05%. A continuación, se bloqueó durante 30 min con PBS, albúmina de suero bovino al 0,2% y Tween 20 al 0,05%, y se lavó nuevamente como se ha descrito precedentemente.

b): Lisis de las células: Las células que expresaban la FLAG-E2TM se separaron del recipiente de cultivo por disolución en EDTA al 0,04% en PBS y se lavaron en PBS. A continuación, las células se lisaron en PBS, Nonidet P40 al 0,5%, mezcla de proteasas (entidad Boehringer Mannheim GmbH, nº de catálogo 1206 893). Para ello, en cada caso 10^{7} células/ml de una solución para solubilización se incubaron durante dos horas sobre hielo. El material no disuelto se separó mediante centrifugación.

c): Acoplamiento de los antígenos y ensayo: Con el material lisado celular (diluido en PBS, Nonidet P40 al 0,1%) se incubaron las placas para ELISA preparadas (véase el apartado a) durante una hora a temperatura ambiente. Después de haber lavado tres veces con PBS, Nonidet P40 al 0,1%, se añadió finalmente el suero humano en una dilución apropiada (1:30 - 1:50) y se incubó a la temperatura ambiente durante 90 min. Después de haber lavado múltiples veces, primero con PBS, Nonidet P40 al 0,1% y luego con NaCl al 0,9%, Tween 20 al 0,05%, se incubó finalmente durante una hora con el fragmento (Fab')_{2} de Ig-POD anti-humana (Boehringer Mannheim GmbH, nº de catálogo 1089 196). Después de haber lavado intensamente con NaCl al 0,9%, Tween al 0,05%, se empleó ABTS® como substrato y se midió la modificación del color después de 30 a 60 minutos en un lector por ELISA a 405 nm.

Resultado

Primeramente, se emplearon en este ensayo como muestras nulas (en vacío) materiales lisados de CHO, que no expresaban la E2TM recombinante. Con éstos se observaron unos valores de extinción situados en el intervalo promedio de 100 a 140 mE en un colectivo de donantes de sangre. Por consiguiente, se consideraron como positivas las muestras que tenían una extinción de por lo menos 250 mE y una relación de señales de E2/CHO de por lo menos 2,0. De esta manera, resultó un solapamiento muy bueno con los resultados procedentes de la analítica por FACS (Ejemplo 2), que se han de clasificar como muy específicos.

Dentro de un panel de donantes de sangre, eran positivas 7 de 80 muestras (9%) en lo que respecta a la presencia de anticuerpos dirigidos contra el antígeno E2.

Dentro de un panel de grupos de riesgo, que consta de 122 drogodependientes (los denominados "usuarios indebidos de drogas por vía intravenosa"), eran positivas 40 muestras (33%) en el ELISA de E2.

Además de esto, se observaron en una serie de sueros evolutivos (extraídos en cada caso de un paciente con una hepatitis C posterior a la transfusión, con una hepatitis no B no C posterior a la transfusión, con una hepatitis B posterior a la transfusión, así como con una hepatitis B aguda esporádica) seroconversiones desde negativas para HGV-E2 hasta positivas para HGV-E2.

Se obtuvieron unos resultados comparables también en un procedimiento ELISA homogéneo. En este caso, los materiales lisados que contenían E2TM se incubaron en común con el anticuerpo M1 biotinilado y con sueros (en una dilución 1 : 50) durante 2 horas a temperatura ambiente en placas de microtitulación revestidas con estreptavidina (Microcode, Streptavidin MTP F8), y, a continuación, se lavaron primeramente con PBS, Nonidet P40 al 0,1% y luego con NaCl al 0,9%, Tween 20 al 0,05%, seguido por una incubación durante una hora con el fragmento (Fab')_{2} de
Ig-POD anti-humana (Boehringer Mannheim GmbH, nº de catálogo 1089 196). Después de haber lavado intensamente con NaCl al 0,9%, Tween 20 al 0,05%, se empleó ABTS® como substrato y se midió la modificación del color después de 30 a 60 min en el lector por ELISA a 405 nm.

(1) DATOS GENERALES:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE: Boehringer Mannheim GbmH

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CALLE: Sandhofer Str. 112-132

\vskip0.333000\baselineskip

(C): LOCALIDAD: Mannheim

\vskip0.333000\baselineskip

(E): PAÍS: DE (Alemania)

\vskip0.333000\baselineskip

(F): NÚMERO DE CÓDIGO POSTAL: 68305

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): DESIGNACION DEL INVENTO: Expresión de antígenos de HGV y su utilización

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 8

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): REDACCIÓN LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): SOPORTE DE DATOS: Disquete

\vskip0.333000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATORIO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D): SISTEMA LÓGICO - SOFTWARE:

\hskip1.6cm

Patentin Release nº 1.0, versión nº 1.30 (EPA)

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 693 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): FORMA DE CADENA: ambas

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Virus de la hepatitis G

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): PROCEDENCIA INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON (E) : E1TM

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 13...681

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

1

1000

2

20

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 223 Aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

3

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 564 Pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): FORMA DE CADENA: ambas

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Virus de la hepatitis G

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): PROCEDENCIA INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON (E) : E1S

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 13...552

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

4

40

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 180 Aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4

5

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1.302 Pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): FORMA DE CADENA: ambas

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Virus de la hepatitis G

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): PROCEDENCIA INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON (E) : E2TM

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 13...1290

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

6

7

8

80

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 426 Aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

9

90

10

100

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1.146 Pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): FORMA DE CADENA: ambas

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Virus de la hepatitis G

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): PROCEDENCIA INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CLON (E):E2S

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 13...1334

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

11

110

12

120

13

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 374 Aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8

\sa{Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu}

\sac{Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Asp Tyr Lys Asp Asp}

14

140

15

150

Claims

1. Procedimiento para la producción recombinante de un antígeno de HGV en una forma fijada a una membrana, que comprende las etapas de:

a): introducir una secuencia de ADN en una célula hospedante, codificando la secuencia de ADN un antígeno con un dominio de anclaje a una membrana, activo funcionalmente en unión operativa con un péptido de señal, induciendo el péptido de señal la exportación del antígeno desde el citoplasma,

(b): cultivar de la célula hospedante procedente de la etapa (a) en unas condiciones, a las que tiene lugar una expresión de la secuencia de ADN introducida, siendo

: producido el antígeno en una forma fijada a una membrana, y

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1,

caracterizado porque

se produce un antígeno E1 fijado a una membrana, que es codificado por

b): una secuencia correspondiente a la secuencia de (a) dentro del marco de la degeneración del código genético o/y

(c): una secuencia de nucleótidos que se hibrida con las secuencias procedentes de (a) o/y (b) en condiciones rigurosas, efectuándose una hibridación después de haber lavado durante una hora con 1x SSC y SDS al 0,1% a 55ºC.

3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 2,

caracterizado porque

se produce un antígeno E1 fijado a una membrana, que comprende

(a): la secuencia de aminoácidos indicada entre las posiciones 39 y 223 de SEQ ID. NO. 2 o

(b): una secuencia de aminoácidos que es homóloga con la secuencia procedente de (a) en por lo menos un 80%.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 2,

caracterizado porque

se produce un antígeno E2 fijado a una membrana, que es codificado por

(c): una secuencia de nucleótidos que se hibrida con las secuencias procedentes de (a) o/a (b) en condiciones rigurosas, efectuándose una hibridación después de haber lavado durante 1 hora con 1 x SSC y SDS al 0,1% a 55ºC.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 4,

caracterizado porque

se produce un antígeno E2 fijado a una membrana, que comprende

(a): la secuencia de aminoácidos indicada entre las posiciones 39 y 426 de SEQ ID. NO. 6 o

6. Célula recombinante,

caracterizada porque

presenta junto a su superficie los antígenos E1 o/y E2 de HGV en una forma fijada a una membrana.

7. Utilización de una célula de acuerdo con la reivindicación 6 como reactivo para diagnóstico para la detección de HGV.

8. Procedimiento para la producción recombinante del antígeno E1 de HGV en una forma disuelta, que comprende las siguientes etapas:

(a): introducir una secuencia de ADN en una célula hospedante, codificando la secuencia de ADN un antígeno que tiene un dominio de anclaje a una membrana inactivo funcionalmente, estando la secuencia de ADN unida operativamente con una secuencia de señal, que induce una exportación del antígeno desde el citoplasma de la célula hospedante.

(b): cultivar la célula hospedante de la etapa (a) en unas condiciones, en las que tiene lugar una expresión de la secuencia de ADN introducida, siendo producido el antígeno en una forma soluble, y

(c): obtener el antígeno a partir del material sobrenadante de cultivo.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8,

caracterizado porque

se produce un antígeno E1 soluble, que es codificado por

(c): una secuencia de nucleótidos que se hibrida con las secuencias de (a) o/y (b) en condiciones rigurosas, efectuándose una hibridación después de haber lavado durante una hora con 1 x SSC y SDS al 0,1% a 55ºC.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9,

caracterizado porque

se produce un antígeno E1 soluble, que comprende

(b): una secuencia de aminoácidos homóloga con la secuencia procedente de (a) en por lo menos un 80%.

11. Ácido nucleico,

caracterizado porque

codifica el antígeno E1 de HGV con un dominio de anclaje a una membrana inactivo funcionalmente y que está unido operativamente con una secuencia de señal, que induce una exportación del antígeno desde el citoplasma de una célula hospedante.

12. Ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11,

caracterizado porque

comprende

(a): la secuencia de nucleótidos indicada en SEQ. ID NO. 3 desde la posición 127 a la 552,

\newpage

(c): una secuencia de nucleótidos que se hibrida con las secuencias procedentes de (a) o/y (b) en condiciones rigurosas, efectuándose una hibridación después de haber lavado durante 1 hora con 1 x SSC y SDS al 0,1% a 55ºC.

13. Polipéptido,

caracterizado porque

es codificado por un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12.

14. Vector recombinante,

caracterizado porque

contiene por lo menos una copia de un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12.

15. Célula recombinante,

caracterizada porque

es transformada con un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12 o con un vector de acuerdo con la reivindicación 14.

16. Utilización de un polipéptido preparado mediante un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 hasta 10, o de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 13 como reactivo para diagnóstico para la detección in vitro de HGV.

17. Estuche de reactivos para la detección de HGV,

caracterizado porque

junto a otros componentes de detección contiene

(a): una célula recombinante de acuerdo con la reivindicación 7 o/y

(b): un polipéptido preparado mediante un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 hasta 10 o un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 13.