JPH10139682A - 骨吸収促進剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 骨吸収促進剤を提供する。 【解決手段】 アンジオゲニンを有効成分とする。好ま
しくは、該アンジオゲニンはヒト由来である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アンジオゲニン
（angiogenin）を有効成分とする骨吸収促進剤に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】アンジオゲニンは、もともとヒト結腸癌
（ＨＴ−２９細胞株）から単離され、血管新生を促進す
る活性を有する蛋白質として同定された。その後、血清
中、及び乳中にも存在することが確認されており、活性
的にも血管新生促進活性、即ち、血管内皮細胞培養系に
て、ＤＮＡ合成を促進する活性、及び血管内皮細胞の管
膣形成を促進する活性を有し、さらに、リボヌクレアー
ゼ（ＲＮａｓｅ）活性をも有することが明らかとなって
いる。その分子量は１４，０００ドルトン（ヒト型：１
２３アミノ酸残基、ウシ型：１２５アミノ酸残基）で、
糖鎖は存在しない。また、そのアミノ酸配列及びジスル
フィド結合位置は、膵臓由来ＲＮａｓｅに高い相同性を
示す（Fett,J.W.,Strydom,D.J.,Lobb,R.R.,Alderman,E.
M.,Bethne,J.L.,Riordan,J.F.,&Vallee,B.L.(1985)Bioc
hemistry 24,5480-5486、Shapiro,R.,&Vallee,B.L.(198
7)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,2238-2241、及びKurac
hi,K.,Davie,E.W.,Strydom,D.J.,Riordan,J.F.,&Valle
e,B.L.(1985) Biochemistry 24,5494-5499 参照）。

【０００３】ところで、破骨細胞は造血幹細胞由来の単
核細胞に由来し、血行を介して骨表面に運ばれた細胞が
分化して形成される細胞である。一方、骨芽細胞は、間
葉由来の未分化細胞や線維芽細胞、間質細胞などの基質
形成細胞系に属する前駆細胞から分化し、骨基質を形成
する。このように、破骨細胞は、骨芽細胞とは系列の異
なる前駆細胞に由来する。その特徴は、終末分化して多
核となった増殖能の乏しい巨細胞であること、多数のカ
ルシトニン受容体及び酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活
性を発現することである。また、骨や象牙質などの石灰
化組織を吸収することが出来る。

【０００４】ここで、破骨細胞の形成に関しては、その
前駆細胞である造血幹細胞由来の単核細胞をＭ−ＣＳＦ
やＧＭ−ＣＳＦが増殖させ、さらに、骨芽細胞様のスト
ロマ細胞(stromal cell)との細胞接触により破骨細胞へ
と分化すると考えられている。破骨細胞の活性化には、
１ａ，２５（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃や副甲状腺ホルモン
（ＰＴＨ）、ＰＴＨ関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）、各種
プロスタグランジン及びインターロイキン１の様な骨吸
収促進因子の添加が効果的である。

【０００５】一方、骨吸収促進活性を有する内因性の蛋
白及びペプチド性因子に関しては、コンドロモジュリン
−IIタンパク質が骨吸収促進活性を有することが見出さ
れている（特開平８−２７０２０号公報）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】破骨細胞は骨のモデリ
ング等、骨代謝に於て重要な機能を有する細胞であり、
骨粗鬆症等の代謝性疾患に直接関与すると考えられてい
る。しかし、その細胞起源、形成機序等に関しては未だ
不明な点が多く、骨代謝及び疾患への重要な関与は予想
されているが、その機構解明には至っていない。ここ
で、破骨細胞の分化あるいは活性化等、骨吸収に関与す
る新規な因子をさらに明らかにできれば、破骨細胞の形
成機序及び骨代謝への関与を究明する指針を得ることが
でき、代謝性骨疾患治療の確立に貢献できると考えられ
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、骨吸収促
進活性を有する因子を得るべく鋭意検討を重ね、ウシ胎
仔軟骨抽出物のヘパリン結合画分に、コンドロモジュリ
ン−IIとは異なる因子を見出すとともに、この因子が上
記で述べた血管新生促進活性を有する蛋白質として公知
のアンジオゲニンであることを見出し、本発明を完成す
るに至った。

【０００８】即ち、本発明の要旨は、アンジオゲニンを
有効成分とする骨吸収促進剤、および、該アンジオゲニ
ンがヒト由来である前記骨吸収促進剤に存する。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下本発明をさらに詳細に説明す
る。本発明の有効成分となり得るアンジオゲニンは、上
記したように血管新生を促進する活性を有する蛋白質と
して知られており、Biochemistry,24,5480-5486(1985)
及び Biochemistry,25,3527-3532(1986) に記載された
ように取得しかつ精製することができる。また、Bioche
mistry,24,5494-5499(1985)に記載された、アンジオゲ
ニンをコードするｃＤＮＡ及び遺伝子に基づいて、組換
えＤＮＡ技術を用いて取得し、かつ精製したものを使用
することができる。該組換えＤＮＡ技術を用いた方法で
は、上記ｃＤＮＡまたは遺伝子は通常使用され得る発現
ベクターから発現させることができ、また、公知の方法
により、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物
細胞、昆虫細胞、動物（特に哺乳動物）細胞等の宿主で
発現させることができる。さらに、化学的に合成したも
のも使用することができる。

【００１０】アンジオゲニンの精製法の例としては、以
下で述べる実施例のように、ウシ胎仔軟骨抽出物から、
限外濾過法、ゲル濾過法、ヘパリンアフィニティークロ
マトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ法により精製する方法が
挙げられる。

【００１１】本発明に使用するアンジオゲニンは、骨吸
収促進作用を損なわない範囲で、アミノ酸の一部を除
去、置換、修飾または追加するなどの改変がされていて
もよい。また、この改変の結果、骨吸収促進作用以外
の、アンジオゲニンが本来有する活性が失われても差し
支えなく、このような改変アンジオゲニンも本発明に使
用できるアンジオゲニンに含まれる。

【００１２】改変の方法としては、組換えＤＮＡ技術を
用いてアンジオゲニンを取得する際に部位特異的突然変
異誘発を用いる方法、化学的合成による方法などが挙げ
られる。改変されたアンジオゲンの活性は当業者に公知
の方法によって評価できる。

【００１３】本発明に使用するアンジオゲニンは、ヒト
患者の治療を考慮した場合には、ヒト由来のアンジオゲ
ニンであることが好ましい。本発明において、アンジオ
ゲニンの骨吸収促進活性は、例えば、以下のようにして
測定することができる。すなわち、ウサギ大腿骨から分
離した５％ウシ胎仔血清を含む骨細胞を、滅菌処理した
象牙質スライス上に添加しその骨吸収活性を見るアッセ
イ系に、アンジオゲニンを例えば０．３〜３０ｎｇ／ｍ
ｌの濃度で添加し、その骨吸収促進活性を検討する。こ
の測定方法では、下記の製造例の方法で得られたアンジ
オゲニンの場合、１ｎｇ／ｍｌのアンジオゲニン濃度で
活性が検出され、１０ｎｇ／ｍｌで最大活性を示した。

【００１４】この骨吸収促進活性は、破骨細胞形成促進
作用（分化の促進および／または活性化）に基づくもの
と推定される。本発明の骨吸収促進剤は、例えば骨形成
が盛んであり、その成長を押さえる必要があるような疾
患の場合には、アンジオゲニンをそのまま、あるいは常
法により製剤化すなわち医薬組成物化して投与すること
ができる。具体的には、アンジオゲニン１ｎｇ〜１００
μｇを、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒ
アルロン酸、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、骨セ
メント、ハイドロキシアパタイト、セラミックス、炭素
繊維、フィブリン糊等の外科手術用生体接着剤等の生体
適合性担体に混合、含浸または塗布し、軟骨疾患部位に
局所的に外科手術によって投与する。

【００１５】また本発明の骨吸収促進剤は、新たな骨疾
患治療剤を探索する上においても有用である。すなわち
同薬剤に対して阻害作用を有する物質は、破骨細胞の形
成を抑制し、骨吸収を抑制する効果があると考えられ
る。したがって適当な評価系を用いてアンジオゲニンの
生物活性を阻害する物質をスクリーニングすることによ
り、骨粗鬆症等の骨疾患に対する薬剤が簡便に得られ
る。

【００１６】

【実施例】以下の実施例により、本発明をさらにより詳
細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り以
下の実施例によって限定されるものではない。

【００１７】

【製造例１】数ｍｍ角に破砕したウシ胎児軟骨５ｋｇを
１０倍量（体積／重量）の緩衝液Ａ（１Ｍグアニジン塩
酸、０．１Ｍ ６-アミノ-ｎ-カプロン酸、０．０２Ｍ
２-（Ｎ-モルホリノ）エタンスルホン酸、ｐＨ６．０）
と共にポリトロンを用いてホモゲナイズした。このホモ
ゲネートを４℃で４８時間撹拌して抽出を行った後、１
０，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清を回収し
た。この上清に冷アセトンを終濃度４５％になるように
ゆっくりと加え、生じた沈殿を４,０００ｒ．ｐ．
ｍ．、３０分間の遠心分離で除去した。この上清に終濃
度６５％になるように冷アセトンをゆっくりと加え、生
じた沈殿を４,０００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間の遠心分
離により回収した。このアセトン４５〜６５％画分のペ
レットを６Ｌ（リットル）の緩衝液Ｂ（４Ｍグアニジン
塩酸、０．１Ｍ ６-アミノ-ｎ-カプロン酸、１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、０．０２Ｍトリス塩酸、ｐＨ８．０）に４℃で溶
解した。１０,０００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間の遠心分
離により不溶物を沈殿させて除去し、上清をアミコンＸ
Ｍ３００限外濾過膜（アミコン社製）にて分画した。限
外濾過膜通過画分を次にアミコンＸＭ５０限外濾過膜
（アミコン社製）にて分画し、通過画分をさらにアミコ
ンＹＭ１０限外濾過膜（アミコン社製）にて５００ｍｌ
まで濃縮した。

【００１８】この濃縮液３０ｍｌをＳｅｐｈａｃｒｙｌ
Ｓ２００カラム（直径２．６ｃｍ、長さ１００ｃｍ）
を使い、溶出液に緩衝液Ｂを用いて分子篩クロマトグラ
フィーを行い分画した。溶出液２３０ｍｌから３１０ｍ
ｌの間の活性画分を集め、蒸留水に対して４℃で２日間
透折した。

【００１９】透折が終了した液を緩衝液Ｃ（０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、０．０３％ＣＨＡＰＳ（界面活性剤）、
０．０２５Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．４）で平衡化し
たヘパリン-Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムにて分画した。
すなわち、緩衝液Ｃにてカラムを十分洗浄した後、０．
５Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｃで溶出した。この０．５
Ｍ溶出画分を０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含
む３０％アセトニトリル／イソプロピルアルコール（７
／３、体積／体積）で平衡化したＹＭＣｐａｃｋＣ４カ
ラム（ＡＰ−８０２ Ｓ−５ ３００Ａ Ｃ４、０．４
６×１５ｃｍ）に添加し、同有機溶媒濃度２０％から７
０％まで４０分間の濃度勾配溶出を行い、各ピークを分
取した。骨吸収促進活性のある画分を真空状態で乾燥し
た。この標品を０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．０２５
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４に溶解した後、
０．１％ＴＦＡを含む２０％アセトニトリルで平衡化し
たＹＭＣｐａｃｋＣ８カラム（ＡＰ−２０２ Ｓ−５
３００Ａ Ｃ８、０．４６×１５ｃｍ）に添加し、同有
機溶媒濃度２０％から４０％まで３０分間の濃度勾配溶
出を行い、各ピークを分取した。骨吸収促進活性のある
画分を真空状態で乾燥した。この標品を用いてアミノ酸
配列の解析を行った。

【００２０】尚、上記の精製工程において、骨吸収促進
活性は後述の実施例１に記載の方法で測定した。上記で
精製したアンジオゲニンを５０％ＴＦＡ水溶液に溶解
し、ポリブレン処理したグラスファイバーフィルターに
添加し、島津製作所製ＰＰＳＱ−１０プロティンシーケ
ンサーでエドマン分解し、Ｎ末端域のアミノ酸配列を決
定した。この結果、このタンパク質のＮ末端アミノ酸配
列は下記に示す通りであり、文献記載のウシアンジオゲ
ニンのそれと一致した。

【００２１】

【化１】Ala-Gln-Asp-Asp-Tyr-Arg-Tyr-Ile-His-Phe- Leu-Thr-Gln-His-Tyr-Asp-Ala-Lys-Pro-Lys- Gly-Arg-Asn-Asp-Glu-Tyr-Xaa-Pro-Asn-Met （配列番
号１） （Xaa：システイン又は糖鎖修飾アミノ酸）

【００２２】また、この精製したアンジオゲニンを１５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析したとこ
ろ、分子量１４，０００ドルトンを示し、文献値と一致
していることが確認された。

【００２３】

【実施例１】１５０μｍ厚の象牙質スライスを直径６ｍ
ｍの円盤状に切断し、７０％アルコール中で超音波処理
することにより滅菌した。α−ＭＥＭで洗浄した後、各
スライスを９６ウェルプレートのウェル中に移し、５％
ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と別に調製したウサギ骨細胞
１．２５×１０⁵個とを含むα−ＭＥＭ ２５０μｌを
その上に添加し、ＣＯ₂インキュベーター中（５％Ｃ
Ｏ₂、９５％空気）３７℃で２時間インキュベートし
た。２時間後、５％ＦＢＳと各濃度のアンジオゲニンを
含むα−ＭＥＭ １００μｌを加えＣＯ₂インキュベータ
ー中（１０％ＣＯ₂、９０％空気）３７℃で１５時間イ
ンキュベートした後、象牙質スライスからハンディーエ
ンジンにより骨細胞を取り除き、酸性ヘマトキシリンに
て３分間染色し、顕微鏡下、ピット形成を測定し破骨細
胞の骨吸収活性とする。

【００２４】図１は、本アッセイ系を用いて上記製造例
１で得られた精製ウシアンジオゲニンの骨吸収性の検定
を行ったものである。横軸にアンジオゲニンの濃度（ｎ
ｇ／ｍｌ）を、縦軸にウェル当たり（象牙質スライス当
たり）のメッシュの数を示してある。尚、ｃｏｎｔは対
照を、Ｄ３は１ａ，２５（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃をそれぞ
れ示す。アンジオゲニン１ｎｇ／ｍｌから活性が検出さ
れ、濃度依存的に活性の促進が観察され、１０ｎｇ／ｍ
ｌで最大活性を示した。この結果よりアンジオゲニンが
低濃度で骨吸収促進活性を示すことは明らかである。こ
の活性は、破骨細胞の分化促進、あるいは活性化促進作
用に基づくと推定される。

【００２５】

【発明の効果】本発明により、アンジオゲニンが骨吸収
促進活性を有することが判明した。本発明によれば、現
在まで有効な治療法のなかった代謝性骨疾患に対して有
効な治療法を、さらには骨疾患に対する治療薬の新しい
スクリーニング法を提供することができる。

【００２６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Gln Asp Asp Tyr Arg Tyr Ile His Phe Leu Thr Gln His Tyr Asp 1 5 10 15 Ala Lys Pro Lys Gly Arg Asn Asp Glu Tyr Xaa Pro Asn Met 20 25 30

【図面の簡単な説明】

【図１】精製ウシアンジオゲニンの骨吸収促進活性の検
定の結果を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アンジオゲニンを有効成分とする骨吸収
   促進剤。
2. 【請求項２】 前記アンジオゲニンがヒト由来である請
   求項１記載の骨吸収促進剤。