JPH10155496A - コニフエリルアルコール、コニフエリルアルデヒド、フエルラ酸、バニリン及びバニリン酸の製造のための合成用酵素、並びにこれらの使用 - Google Patents
コニフエリルアルコール、コニフエリルアルデヒド、フエルラ酸、バニリン及びバニリン酸の製造のための合成用酵素、並びにこれらの使用Info
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- JPH10155496A JPH10155496A JP9343875A JP34387597A JPH10155496A JP H10155496 A JPH10155496 A JP H10155496A JP 9343875 A JP9343875 A JP 9343875A JP 34387597 A JP34387597 A JP 34387597A JP H10155496 A JPH10155496 A JP H10155496A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 バニリン等の合成用酵素。
【解決手段】 コニフェリルアルコール、コニフェリル
アルデヒド、フェルラ酸、バニリン及びバニリン酸の製
造のための合成用酵素、コニフェリルアルコール、コニ
フェリルアルデヒド、フェルラ酸、バニリン及びバニリ
ン酸の製造のためのこれらの使用、これらの酵素をコー
ドしているＤＮＡ、並びにこのＤＮＡで形質転換された
微生物。
アルデヒド、フェルラ酸、バニリン及びバニリン酸の製
造のための合成用酵素、コニフェリルアルコール、コニ
フェリルアルデヒド、フェルラ酸、バニリン及びバニリ
ン酸の製造のためのこれらの使用、これらの酵素をコー
ドしているＤＮＡ、並びにこのＤＮＡで形質転換された
微生物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、コニフェリルアル
コール、コニフェリルアルデヒド、フェルラ酸、バニリ
ン及びバニリン酸の製造のための合成用酵素、コニフェ
リルアルコール、コニフェリルアルデヒド、フェルラ
酸、バニリン及びバニリン酸の製造のためのこれらの使
用、前述の酵素をコードしているＤＮＡ、並びにそのＤ
ＮＡで形質転換された微生物に関する。
コール、コニフェリルアルデヒド、フェルラ酸、バニリ
ン及びバニリン酸の製造のための合成用酵素、コニフェ
リルアルコール、コニフェリルアルデヒド、フェルラ
酸、バニリン及びバニリン酸の製造のためのこれらの使
用、前述の酵素をコードしているＤＮＡ、並びにそのＤ
ＮＡで形質転換された微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】オイゲノールの分解に関する最初の論文
は、１９７７年にＴａｄａｓａにより書かれた（Ｄｅｇ
ｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｇｅｎｏｌ ｂｙ ａ
ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．４１、９２５−９２９）。この論文は、コリ
ネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種
であると推定される土壌単離物でのオイゲノールの分解
を記述している。この工程において、フェルラ酸及びバ
ニリンが中間分解生成物として同定され、そしてそれに
続く分解は、バニリン酸及びプロトカテク酸を経て進む
と考えられた。
は、１９７７年にＴａｄａｓａにより書かれた（Ｄｅｇ
ｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｇｅｎｏｌ ｂｙ ａ
ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．４１、９２５−９２９）。この論文は、コリ
ネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種
であると推定される土壌単離物でのオイゲノールの分解
を記述している。この工程において、フェルラ酸及びバ
ニリンが中間分解生成物として同定され、そしてそれに
続く分解は、バニリン酸及びプロトカテク酸を経て進む
と考えられた。
【０００３】１９８３年に、今度はシュードモナス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種であると同定された土壌単離
別物でのオイゲノール分解の最初の工程に関して、Ｔａ
ｄａｓａ及びＫｙａｈａｒａによる別の論文（Ｉｎｉｔ
ｉａｌ Ｓｔｅｐｓ ｏｆＥｕｇｅｎｏｌ Ｄｅｇｒａ
ｄａｔｉｏｎ Ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ａ Ｍｉｃｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍ．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
４７、２６３９−２６４０）が出版された。この論文に
おいて、酸化オイゲノール、コニフェリルアルコール及
びコニフェリルアルデヒドが、フェルラ酸の形成のため
の中間体として記述された。
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種であると同定された土壌単離
別物でのオイゲノール分解の最初の工程に関して、Ｔａ
ｄａｓａ及びＫｙａｈａｒａによる別の論文（Ｉｎｉｔ
ｉａｌ Ｓｔｅｐｓ ｏｆＥｕｇｅｎｏｌ Ｄｅｇｒａ
ｄａｔｉｏｎ Ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ａ Ｍｉｃｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍ．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
４７、２６３９−２６４０）が出版された。この論文に
おいて、酸化オイゲノール、コニフェリルアルコール及
びコニフェリルアルデヒドが、フェルラ酸の形成のため
の中間体として記述された。
【０００４】１９８３年にまた、ストレプトミセス セ
トニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｅｔｏｎｉｉ）に
よるケイ皮酸、ｐ−クマル酸及びフェルラ酸の代謝に関
して、Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ等による報告（Ｍｅｔａｂ
ｏｌｉｓｍ ｏｆ ｃｉｎｎａｍｉｃ，ｐ−ｃｏｕｍａ
ｒｉｃ，ａｎｄ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄｓ ｂｙ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｅｔｏｎｉｉ．Ｃａｎ．
Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９、１２５３−１２５７）
が出版された。この工程において、フェルラ酸は、バニ
リン、バニリン酸及びプロトカテク酸を経て分解され、
そして環開裂酵素、カテコール１，２−ジオキシゲナー
ゼ及びプロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼが無細
胞抽出物において間接的に同定された。
トニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｅｔｏｎｉｉ）に
よるケイ皮酸、ｐ−クマル酸及びフェルラ酸の代謝に関
して、Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ等による報告（Ｍｅｔａｂ
ｏｌｉｓｍ ｏｆ ｃｉｎｎａｍｉｃ，ｐ−ｃｏｕｍａ
ｒｉｃ，ａｎｄ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄｓ ｂｙ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｅｔｏｎｉｉ．Ｃａｎ．
Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９、１２５３−１２５７）
が出版された。この工程において、フェルラ酸は、バニ
リン、バニリン酸及びプロトカテク酸を経て分解され、
そして環開裂酵素、カテコール１，２−ジオキシゲナー
ゼ及びプロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼが無細
胞抽出物において間接的に同定された。
【０００５】１９８５年に、腐食している樹皮から単離
されたエシェリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）の株によるフェルラ酸の分解に関して、Ｏｅ
ｔｕｅｋが報告した（Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｆｅｒｕｌｉｃ Ａｃｉｄｓｂｙ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏ
ｌ．６３、５０１−５０６）。ここでも同様に、バニリ
ン、バニリン酸及びプロトカテク酸が分解生成物として
見いだされた。
されたエシェリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）の株によるフェルラ酸の分解に関して、Ｏｅ
ｔｕｅｋが報告した（Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｆｅｒｕｌｉｃ Ａｃｉｄｓｂｙ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏ
ｌ．６３、５０１−５０６）。ここでも同様に、バニリ
ン、バニリン酸及びプロトカテク酸が分解生成物として
見いだされた。
【０００６】１９８７年に、アルスロバクター グロビ
フォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆ
ｏｒｍｉｓ）の突然変異体を用いたオイゲノールからの
コニフェリルアルデヒドの製造方法に関して、ＢＡＳＦ
によるドイツ特許出願［「Ｖｅｒｆａｈｒｅｎ ｚｕｒ
Ｇｅｗｉｎｎｕｎｇ ｖｏｎ Ｃｏｎｉｆｅｒｙｌａ
ｌｄｅｈｙｄ ｕｎｄ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｕ
ｓ ｄａｆｕｅｒ」（Ａ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｏ
ｂｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｎｉｆｅｒｙｌａｌｄｅｈｙｄ
ｅ ａｎｄ ａ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｔｈｅ
ｒｅｆｏｒ）；ＤＥ−Ａ３ ６０６ ３９８号］が公に
なった。その目的は、天然のバニリンを得ることであっ
た。
フォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆ
ｏｒｍｉｓ）の突然変異体を用いたオイゲノールからの
コニフェリルアルデヒドの製造方法に関して、ＢＡＳＦ
によるドイツ特許出願［「Ｖｅｒｆａｈｒｅｎ ｚｕｒ
Ｇｅｗｉｎｎｕｎｇ ｖｏｎ Ｃｏｎｉｆｅｒｙｌａ
ｌｄｅｈｙｄ ｕｎｄ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｕ
ｓ ｄａｆｕｅｒ」（Ａ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｏ
ｂｔａｉｎｉｎｇ ｃｏｎｉｆｅｒｙｌａｌｄｅｈｙｄ
ｅ ａｎｄ ａ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｔｈｅ
ｒｅｆｏｒ）；ＤＥ−Ａ３ ６０６ ３９８号］が公に
なった。その目的は、天然のバニリンを得ることであっ
た。
【０００７】Ａｂｒａｈａｍ等は、「Ｂｉｏｆｌａｖｏ
ｒ ’８７」で、様々な微生物によるオイゲノールの代
謝に関して報告した（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｏｍｅ ｔｅｒｐｅｎ
ｏｉｄｓ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ
ｓ：Ｂｉｏｆｌａｖｏｕｒ ’８７、３９９−４１３
頁）。真菌が用いられた場合、二量体が顕著に見いださ
れ、そしてイソオイゲノールが用いられた場合にのみ、
アスペルギルス ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ）ＡＴＣＣ ９１４２はバニリンも形成し
た。
ｒ ’８７」で、様々な微生物によるオイゲノールの代
謝に関して報告した（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｏｍｅ ｔｅｒｐｅｎ
ｏｉｄｓ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ
ｓ：Ｂｉｏｆｌａｖｏｕｒ ’８７、３９９−４１３
頁）。真菌が用いられた場合、二量体が顕著に見いださ
れ、そしてイソオイゲノールが用いられた場合にのみ、
アスペルギルス ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ）ＡＴＣＣ ９１４２はバニリンも形成し
た。
【０００８】１９８８年に、Ｏｍｏｒｉ等は、シュード
モナス種ＨＦ−１の突然変異体でプロトカテク酸を得る
ための工程を記述した（Ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕｉｃ
ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｒａ
ｎｓ−ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｓｐ．ＨＦ−１ ｍｕｔａｎｔｓ ｄｅｆ
ｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕｉｃ
ａｃｉｄ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９、４９７−５
００）。記述された唯一の中間体は、バニリン酸であっ
た。
モナス種ＨＦ−１の突然変異体でプロトカテク酸を得る
ための工程を記述した（Ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕｉｃ
ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｒａ
ｎｓ−ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｓｐ．ＨＦ−１ ｍｕｔａｎｔｓ ｄｅｆ
ｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕｉｃ
ａｃｉｄ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９、４９７−５
００）。記述された唯一の中間体は、バニリン酸であっ
た。
【０００９】１９８９年に、二つの真菌、パエシロミセ
ス バリオチイ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉ
ｏｔｉｉ）及びペスタロチア パルマルム（Ｐｅｓｔａ
ｌｏｔｉａ ｐａｌｍａｒｕｍ）によるフェルラ酸の代
謝が、Ｒａｈｏｕｔｉ等により記述された（Ｍｅｔａｂ
ｏｌｉｓｍ ｏｆ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ｂｙＰ
ａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ ａｎｄ
Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ ｐａｌｍａｒｕｍ．Ａｐｐｌ．
Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５、２３９１
−２３９８）。バニリン酸を形成するための分解が４−
ビニルグアイアコール及びバニリンを経て進むことが主
張された。
ス バリオチイ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉ
ｏｔｉｉ）及びペスタロチア パルマルム（Ｐｅｓｔａ
ｌｏｔｉａ ｐａｌｍａｒｕｍ）によるフェルラ酸の代
謝が、Ｒａｈｏｕｔｉ等により記述された（Ｍｅｔａｂ
ｏｌｉｓｍ ｏｆ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ｂｙＰ
ａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ ａｎｄ
Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ ｐａｌｍａｒｕｍ．Ａｐｐｌ．
Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５、２３９１
−２３９８）。バニリン酸を形成するための分解が４−
ビニルグアイアコール及びバニリンを経て進むことが主
張された。
【００１０】１９９０年に、新規なシュードモナス種及
びジオキシゲナーゼ酵素に関して（Ｎｏｖｅｌ Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ａｎｄ ｄｉｏｘｙｇｅｎａ
ｓｅｅｎｚｙｍｅ．０５５１１１としてＪＰ２１９５−
８７１：２５．１０．８８−ＪＰ−２６７ ２８４
（２．８．９０）９．３．８９）、並びに例えばバニリ
ンのようなアルデヒドの製造のための新規な方法に関し
て（Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒ
ｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｄｅｈｙｄｅｅ．ｇ．
ｖａｎｉｌｌｉｎ．０５５１１２としてＪＰ２２００−
１９２：２５．１０．８８−ＪＰ−２６７ ２８５
（８．８．９０）９．３．８９）、Ｈａｓｅｇａｗａに
よる二つの日本特許出願が公表された。しかしながら、
この方法は、オイゲノールではなく、イソオイゲノール
及びコニフェリルアルコールのような様々な開始化合物
に基づく。また、前述の特許出願において特許請求され
たジオキシゲナーゼ及び本出願において特許請求された
酵素の間にいかなる類似点もない。
びジオキシゲナーゼ酵素に関して（Ｎｏｖｅｌ Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ａｎｄ ｄｉｏｘｙｇｅｎａ
ｓｅｅｎｚｙｍｅ．０５５１１１としてＪＰ２１９５−
８７１：２５．１０．８８−ＪＰ−２６７ ２８４
（２．８．９０）９．３．８９）、並びに例えばバニリ
ンのようなアルデヒドの製造のための新規な方法に関し
て（Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒ
ｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｄｅｈｙｄｅｅ．ｇ．
ｖａｎｉｌｌｉｎ．０５５１１２としてＪＰ２２００−
１９２：２５．１０．８８−ＪＰ−２６７ ２８５
（８．８．９０）９．３．８９）、Ｈａｓｅｇａｗａに
よる二つの日本特許出願が公表された。しかしながら、
この方法は、オイゲノールではなく、イソオイゲノール
及びコニフェリルアルコールのような様々な開始化合物
に基づく。また、前述の特許出願において特許請求され
たジオキシゲナーゼ及び本出願において特許請求された
酵素の間にいかなる類似点もない。
【００１１】オイゲノール及びイソオイゲノールの微生
物の酸化のために、属セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、
エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）または
クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）のバクテリア
が、ＥＰ−Ａ第４０５ １９７号（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｖａｎｉｌｌｉｎ ｂｙｍ
ｉｃｒｏｂｉａｌ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｇ
ｅｎｏｌ ｏｒ ｉｓｏｅｕｇｅｎｏｌ）において用い
られた。しかしながら、イソオイゲノールが用いられた
場合にのみ、この方法は高い転化率を生じ、オイゲノー
ルを用いるとその結果は非常に劣った。
物の酸化のために、属セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、
エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）または
クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）のバクテリア
が、ＥＰ−Ａ第４０５ １９７号（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｖａｎｉｌｌｉｎ ｂｙｍ
ｉｃｒｏｂｉａｌ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｇ
ｅｎｏｌ ｏｒ ｉｓｏｅｕｇｅｎｏｌ）において用い
られた。しかしながら、イソオイゲノールが用いられた
場合にのみ、この方法は高い転化率を生じ、オイゲノー
ルを用いるとその結果は非常に劣った。
【００１２】１９９１年に、ＥＰ−Ａ４５３ ３６８号
［「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｄｅｖａｎｉｌｌｉｎｅ
ｐａｒ ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｄｅ ｐｒｅｃ
ｕｒｓｅｕｒｓ ｂｅｎｚｅｎｉｑｕｅｓ」（Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｎｉｌｌｉｎ ｂｙ ｔｈｅ
ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｂｅｎｚｅｎｅ
ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）］が公表され、その中で、担
子菌−ピクノポルスシンナバリヌス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒ
ｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）ＣＮＣＭ Ｉ−９３
７及びＩ−９３８を用いてバニリン酸及びフェルラ酸か
らバニリンを形成する反応が見られた。
［「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｄｅｖａｎｉｌｌｉｎｅ
ｐａｒ ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｄｅ ｐｒｅｃ
ｕｒｓｅｕｒｓ ｂｅｎｚｅｎｉｑｕｅｓ」（Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｎｉｌｌｉｎ ｂｙ ｔｈｅ
ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｂｅｎｚｅｎｅ
ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）］が公表され、その中で、担
子菌−ピクノポルスシンナバリヌス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒ
ｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）ＣＮＣＭ Ｉ−９３
７及びＩ−９３８を用いてバニリン酸及びフェルラ酸か
らバニリンを形成する反応が見られた。
【００１３】１９９２年に、シュードモナス突然変異体
を用いたオイゲノールからのバニリン、コニフェリルア
ルコール、コニフェリルアルデヒド、フェルラ酸及びバ
ニリルアルコールの調製に関して、Ｔａｋａｓａｇｏ
Ｐｅｒｆｕｍｅｒｙ Ｃｏｍｐａｎｙは、日本特許（Ｐ
ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｎｉｌｌｉｎ，ｃｏ
ｎｉｆｅｒｙｌ−ａｌｃｏｈｏｌ ａｎｄ −ａｌｄｅ
ｈｙｄｅ，ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｖａｎ
ｉｌｌｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ−ｂｙ ｃｕｌｔｕｒｉｎ
ｇ ｍｕｔａｎｔ ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ ｔｏ Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｅｎｕｓ ｉｎ ｐｒｅｓｅｎｃ
ｅ ｏｆ ｅｕｇｅｎｏｌ ｗｈｉｃｈｉｓ ｏｘｉｄ
ａｔｉｖｅｌｙ ｄｅｃｏｍｐｏｓｅｄ；ＪＰ０５ ２
２７９８０ ２１．１．１９９２）を認められた。
を用いたオイゲノールからのバニリン、コニフェリルア
ルコール、コニフェリルアルデヒド、フェルラ酸及びバ
ニリルアルコールの調製に関して、Ｔａｋａｓａｇｏ
Ｐｅｒｆｕｍｅｒｙ Ｃｏｍｐａｎｙは、日本特許（Ｐ
ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｎｉｌｌｉｎ，ｃｏ
ｎｉｆｅｒｙｌ−ａｌｃｏｈｏｌ ａｎｄ −ａｌｄｅ
ｈｙｄｅ，ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｖａｎ
ｉｌｌｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ−ｂｙ ｃｕｌｔｕｒｉｎ
ｇ ｍｕｔａｎｔ ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ ｔｏ Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｅｎｕｓ ｉｎ ｐｒｅｓｅｎｃ
ｅ ｏｆ ｅｕｇｅｎｏｌ ｗｈｉｃｈｉｓ ｏｘｉｄ
ａｔｉｖｅｌｙ ｄｅｃｏｍｐｏｓｅｄ；ＪＰ０５ ２
２７９８０ ２１．１．１９９２）を認められた。
【００１４】１９９２年にまた、Ｌａｂｕｄａ等（Ｋｒ
ａｆｔ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｆｏｏｄｓ）による米国特許
番号第５，１２８，２５３号（Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉ
ｏｎｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ ｖａｎｉｌｌｉｎ）が認められ、その中
で、バニリンの製造のための生体内代謝の方法が記述さ
れた。ここでも同様に、開始物質はフェルラ酸であり、
そして用いられた微生物はアスペルギルス ニジェー
ル、ロードトルラ グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌ
ａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）及びコリネバクテリウム グル
タミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔ
ａｍｉｃｕｍ）であった。重要な特徴は、培地中のフル
フィドリル成分（例えば、ジチオトレイトール）の使用
であった。１９９３年に、この特許の内容は、出版物の
形態においても公表された（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｂｉ
ｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔ
ｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｎｉｌｌｉ
ｎ；Ｐｒｏｇ．Ｆｌａｖｏｕｒ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ
Ｓｔｕｄ．Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ．１９９２、４
７７−４８２）。
ａｆｔ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｆｏｏｄｓ）による米国特許
番号第５，１２８，２５３号（Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉ
ｏｎｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ ｖａｎｉｌｌｉｎ）が認められ、その中
で、バニリンの製造のための生体内代謝の方法が記述さ
れた。ここでも同様に、開始物質はフェルラ酸であり、
そして用いられた微生物はアスペルギルス ニジェー
ル、ロードトルラ グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌ
ａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ）及びコリネバクテリウム グル
タミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔ
ａｍｉｃｕｍ）であった。重要な特徴は、培地中のフル
フィドリル成分（例えば、ジチオトレイトール）の使用
であった。１９９３年に、この特許の内容は、出版物の
形態においても公表された（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｂｉ
ｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔ
ｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｎｉｌｌｉ
ｎ；Ｐｒｏｇ．Ｆｌａｖｏｕｒ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ
Ｓｔｕｄ．Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ．１９９２、４
７７−４８２）。
【００１５】ＥＰ−Ａ５４２ ３４８号（Ｐｒｏｃｅｓ
ｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｈｅｎｙｌａｌｄｅｈｙｄｅｓ）は、酵素リポキシゲ
ナーゼの存在下でのフェニルアルデヒドの製造方法を記
述している。例えば、オイゲノール及びイソオイゲノー
ルが基質として用いられる。我々は、オイゲノールを用
いてこの方法を再現しようと試みたが、反応の結果を確
認することに成功しなかった。
ｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｈｅｎｙｌａｌｄｅｈｙｄｅｓ）は、酵素リポキシゲ
ナーゼの存在下でのフェニルアルデヒドの製造方法を記
述している。例えば、オイゲノール及びイソオイゲノー
ルが基質として用いられる。我々は、オイゲノールを用
いてこの方法を再現しようと試みたが、反応の結果を確
認することに成功しなかった。
【００１６】ＤＥ−Ａ４ ２２７ ０７６号［Ｖｅｒｆ
ａｈｒｅｎ ｚｕｒ Ｈｅｒｓｔｅｌｌｕｎｇ ｓｕｂ
ｓｔｉｔｕｔｉｅｒｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏ
ｌｅｕｎｄ ｄａｆｕｅｒ ｇｅｅｉｇｎｅｔｅｒ Ｍ
ｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｕｓ（Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｓｔ
ｉｔｕｔｅｄ ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｌｓ ａｎｄ
ａ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｓｕｉｔａｂｌｅ
ｆｏｒ ｓａｉｄ ｐｒｏｃｅｓｓ）］は、新規なシ
ュードモナス種での置換されたメトキシフェノールの製
造を記述している。用いられた出発物質はオイゲノール
であり、そして生成物はフェルラ酸、バニリン酸、コニ
フェリルアルコール及びコニフェリルアルデヒドであ
る。
ａｈｒｅｎ ｚｕｒ Ｈｅｒｓｔｅｌｌｕｎｇ ｓｕｂ
ｓｔｉｔｕｔｉｅｒｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏ
ｌｅｕｎｄ ｄａｆｕｅｒ ｇｅｅｉｇｎｅｔｅｒ Ｍ
ｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｕｓ（Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｓｔ
ｉｔｕｔｅｄ ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｌｓ ａｎｄ
ａ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｓｕｉｔａｂｌｅ
ｆｏｒ ｓａｉｄ ｐｒｏｃｅｓｓ）］は、新規なシ
ュードモナス種での置換されたメトキシフェノールの製
造を記述している。用いられた出発物質はオイゲノール
であり、そして生成物はフェルラ酸、バニリン酸、コニ
フェリルアルコール及びコニフェリルアルデヒドであ
る。
【００１７】１９９５年にまた、フェルラ酸を用いた生
体内代謝の可能な方法に関して、Ｒｏｓａｚｚａ等によ
る包括的な総説（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒａｎ
ｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉ
ｄ：ａｎ ａｂｕｎｄａｎｔａｒｏｍａｔｉｃ ｎａｔ
ｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ；Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．１５、４５７−４７１）が出版された。
体内代謝の可能な方法に関して、Ｒｏｓａｚｚａ等によ
る包括的な総説（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒａｎ
ｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉ
ｄ：ａｎ ａｂｕｎｄａｎｔａｒｏｍａｔｉｃ ｎａｔ
ｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ；Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．１５、４５７−４７１）が出版された。
【００１８】
【発明の構成】本発明は、オイゲノールからのコニフェ
リルアルコール、コニフェリルアルデヒド、フェルラ
酸、バニリン及びバニリン酸の製造のための合成用酵素
に関する。
リルアルコール、コニフェリルアルデヒド、フェルラ
酸、バニリン及びバニリン酸の製造のための合成用酵素
に関する。
【００１９】本発明の合成用酵素は、例えば、 ａ）オイゲノールヒドロキシラーゼ、 ｂ）コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼ、 ｃ）コニフェリルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、 ｄ）フェルラ酸デアシラーゼ、及び ｅ）バニリンデヒドロゲナーゼ、 である。
【００２０】本発明はまた、前述の酵素をコードしてい
るＤＮＡ及びこのＤＮＡを含んでいるコスミドクロー
ン、並びにこのＤＮＡを含んでいるベクター及びそのＤ
ＮＡまたはベクターで形質転換された微生物にも関す
る。本発明はまた、コニフェリルアルコール、コニフェ
リルアルデヒド、フェルラ酸、バニリン及びバニリン酸
の製造のための微生物の形質転換のためのＤＮＡの使用
にも関する。本発明はまた、ＤＮＡの部分配列及び機能
的同等物にも関する。機能的同等物は、個々の核酸塩基
がいかなる機能的変化も生じずに置換される（ゆらぎ置
換）誘導体であると理解される。タンパク質に関して、
アミノ酸もまた、いかなる機能的変化も生じずに置換さ
れることができる。
るＤＮＡ及びこのＤＮＡを含んでいるコスミドクロー
ン、並びにこのＤＮＡを含んでいるベクター及びそのＤ
ＮＡまたはベクターで形質転換された微生物にも関す
る。本発明はまた、コニフェリルアルコール、コニフェ
リルアルデヒド、フェルラ酸、バニリン及びバニリン酸
の製造のための微生物の形質転換のためのＤＮＡの使用
にも関する。本発明はまた、ＤＮＡの部分配列及び機能
的同等物にも関する。機能的同等物は、個々の核酸塩基
がいかなる機能的変化も生じずに置換される（ゆらぎ置
換）誘導体であると理解される。タンパク質に関して、
アミノ酸もまた、いかなる機能的変化も生じずに置換さ
れることができる。
【００２１】本発明はまた、オイゲノールからのコニフ
ェリルアルコール、コニフェリルアルデヒド、フェルラ
酸、バニリン及びバニリン酸の製造のための個々の工
程、すなわち、具体的に言えば、 ａ）オイゲノールヒドロキシラーゼの存在下で行われる
オイゲノールからのコニフェリルアルコールの製造方
法、 ｂ）コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼの存在下
で行われるコニフェリルアルコールからのコニフェリル
アルデヒドの製造工程、 ｃ）コニフェリルアルデヒドデヒドロゲナーゼの存在下
で行われるコニフェリルアルデヒドからのフェルラ酸の
製造方法、 ｄ）フェルラ酸デアシラーゼの存在下で行われるフェル
ラ酸からのバニリンの製造方法、 ｅ）バニリンデヒドロゲナーゼの存在下で行われるバニ
リンからのバニリン酸の製造方法、 にも関する。
ェリルアルコール、コニフェリルアルデヒド、フェルラ
酸、バニリン及びバニリン酸の製造のための個々の工
程、すなわち、具体的に言えば、 ａ）オイゲノールヒドロキシラーゼの存在下で行われる
オイゲノールからのコニフェリルアルコールの製造方
法、 ｂ）コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼの存在下
で行われるコニフェリルアルコールからのコニフェリル
アルデヒドの製造工程、 ｃ）コニフェリルアルデヒドデヒドロゲナーゼの存在下
で行われるコニフェリルアルデヒドからのフェルラ酸の
製造方法、 ｄ）フェルラ酸デアシラーゼの存在下で行われるフェル
ラ酸からのバニリンの製造方法、 ｅ）バニリンデヒドロゲナーゼの存在下で行われるバニ
リンからのバニリン酸の製造方法、 にも関する。
【００２２】ＮＭＧ突然変異誘発後、オイゲノールを利
用するシュードモナス種の株ＨＲ１９９（ＤＳＭ７０６
３）からオイゲノールの分解代謝の個々の段階に欠陥を
有する突然変異体が得られた。広い宿主範囲を有し、そ
してシュードモナス菌中でも安定な形態で複製されるこ
とができるｐＶＫ１００コスミドにおいて、ＥｃｏＲＩ
で部分消化された野生型シュードモナス種ＨＲ１９９の
全ＤＮＡを用いて遺伝子ライブラリーが構築された。λ
−ファージ粒子にパッケージング後、ハイブリッドコス
ミドは大腸菌Ｓ１７−１に形質導入された。遺伝子ライ
ブラリーは、１３３０個の組み換え大腸菌Ｓ１７−１ク
ローンを含んでなった。各クローンのハイブリッドコス
ミドは、シュードモナス種ＨＲ１９９株のオイゲノール
を拒絶する２つの突然変異体（突然変異体６１６４及び
６１６５）中へ接合により導入され、可能な相補性能力
に関して試験された。この試験において、２つのハイブ
リッドコスミド（ｐＥ２０７及びｐＥ１１５）が同定さ
れ、これらの獲得は、突然変異体６１６５のオイゲノー
ルを利用する能力を回復した。１つのハイブリッドコス
ミド（ｐＥ５−１）は、突然変異体６１６４の相補性を
もたらした。
用するシュードモナス種の株ＨＲ１９９（ＤＳＭ７０６
３）からオイゲノールの分解代謝の個々の段階に欠陥を
有する突然変異体が得られた。広い宿主範囲を有し、そ
してシュードモナス菌中でも安定な形態で複製されるこ
とができるｐＶＫ１００コスミドにおいて、ＥｃｏＲＩ
で部分消化された野生型シュードモナス種ＨＲ１９９の
全ＤＮＡを用いて遺伝子ライブラリーが構築された。λ
−ファージ粒子にパッケージング後、ハイブリッドコス
ミドは大腸菌Ｓ１７−１に形質導入された。遺伝子ライ
ブラリーは、１３３０個の組み換え大腸菌Ｓ１７−１ク
ローンを含んでなった。各クローンのハイブリッドコス
ミドは、シュードモナス種ＨＲ１９９株のオイゲノール
を拒絶する２つの突然変異体（突然変異体６１６４及び
６１６５）中へ接合により導入され、可能な相補性能力
に関して試験された。この試験において、２つのハイブ
リッドコスミド（ｐＥ２０７及びｐＥ１１５）が同定さ
れ、これらの獲得は、突然変異体６１６５のオイゲノー
ルを利用する能力を回復した。１つのハイブリッドコス
ミド（ｐＥ５−１）は、突然変異体６１６４の相補性を
もたらした。
【００２３】プラスミドｐＥ２０７及びｐＥ１１５の相
補能力は、２３ｋｂｐ ＥｃｏＲＩフラグメント（Ｅ２
３０）に起因すると考えられた。このフラグメントの物
理的地図が作成され、そしてこのフラグメントは完全に
シークエンスされた。バニリン酸デメチラーゼをコード
する遺伝子ｖａｎＡ及びｖａｎＢが、１１．２ｋｂｐＨ
ｉｎｄIIIサブフラグメント（Ｈ１１０）に位置付けら
れた。他の読み枠（ＯＲＦ）が、エシェリキア コリに
より生産されるγ−グルタミルシステインシンテターゼ
に相同であることが見いだされた。ホルムアルデヒドデ
ヒドロゲナーゼに相同なさらなるＯＲＦが、前述のＯＲ
Ｆ及びｖａｎＢ遺伝子の間に同定された。２つのさらな
るＯＲＦが、それぞれ、シュードモナス プチダ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）により生産される
ｐ−クレゾールメチルヒドロキシラーゼのチトクロムＣ
サブユニットまたはフラボタンパク質サブユニットに相
同であることが見いだされた。シュードモナス種ＨＲ１
９９株において、これらのＯＲＦは、ｐ−クレゾールメ
チルヒドロキシラーゼの反応機構に類似した方法によ
り、キノンメチド誘導体を経てコニフェリルアルコール
にオイゲノールを転化する新規な以前に記述されていな
いオイゲノールヒドロキシラーゼをコードしている。未
知の機能の他のＯＲＦが、オイゲノールヒドロキシラー
ゼの２つのサブユニットの遺伝子の間に同定された。リ
グノスチルベン−α，β−ジオキシゲナーゼに相同なＯ
ＲＦが、５．０ｋｂｐ ＨｉｎｄIIIサブフラグメント
（Ｈ５０）中に同定された。さらに、アルコールデヒド
ロゲナーゼに相同な１つのＯＲＦが同定された。バニリ
ンデヒドロゲナーゼの構造遺伝子ｖｄｈが、３．８ｋｂ
ｐＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩサブフラグメント中に同定
された。この遺伝子の上流に、様々な微生物により生産
されるエノイル−ＣｏＡヒドラターゼに相同なＯＲＦが
位置付けられた。
補能力は、２３ｋｂｐ ＥｃｏＲＩフラグメント（Ｅ２
３０）に起因すると考えられた。このフラグメントの物
理的地図が作成され、そしてこのフラグメントは完全に
シークエンスされた。バニリン酸デメチラーゼをコード
する遺伝子ｖａｎＡ及びｖａｎＢが、１１．２ｋｂｐＨ
ｉｎｄIIIサブフラグメント（Ｈ１１０）に位置付けら
れた。他の読み枠（ＯＲＦ）が、エシェリキア コリに
より生産されるγ−グルタミルシステインシンテターゼ
に相同であることが見いだされた。ホルムアルデヒドデ
ヒドロゲナーゼに相同なさらなるＯＲＦが、前述のＯＲ
Ｆ及びｖａｎＢ遺伝子の間に同定された。２つのさらな
るＯＲＦが、それぞれ、シュードモナス プチダ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）により生産される
ｐ−クレゾールメチルヒドロキシラーゼのチトクロムＣ
サブユニットまたはフラボタンパク質サブユニットに相
同であることが見いだされた。シュードモナス種ＨＲ１
９９株において、これらのＯＲＦは、ｐ−クレゾールメ
チルヒドロキシラーゼの反応機構に類似した方法によ
り、キノンメチド誘導体を経てコニフェリルアルコール
にオイゲノールを転化する新規な以前に記述されていな
いオイゲノールヒドロキシラーゼをコードしている。未
知の機能の他のＯＲＦが、オイゲノールヒドロキシラー
ゼの２つのサブユニットの遺伝子の間に同定された。リ
グノスチルベン−α，β−ジオキシゲナーゼに相同なＯ
ＲＦが、５．０ｋｂｐ ＨｉｎｄIIIサブフラグメント
（Ｈ５０）中に同定された。さらに、アルコールデヒド
ロゲナーゼに相同な１つのＯＲＦが同定された。バニリ
ンデヒドロゲナーゼの構造遺伝子ｖｄｈが、３．８ｋｂ
ｐＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩサブフラグメント中に同定
された。この遺伝子の上流に、様々な微生物により生産
されるエノイル−ＣｏＡヒドラターゼに相同なＯＲＦが
位置付けられた。
【００２４】プラスミドｐＥ５−１の相補能力は、１．
２及び１．８ｋｂｐ ＥｃｏＲＩフラグメント（Ｅ１２
及びＥ１８）の同時獲得に起因すると考えられた。フラ
グメントＥ１２は完全に、そしてフラグメントＥ１８は
部分的にシークエンスされた。ＥｃｏＲＩ切断部位を含
むコニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼの構造遺伝
子ｃａｄｈが、これらのフラグメントに位置付けられ
た。クロマトグラフィーの方法を用いて、この酵素は、
オイゲノール中で生育されたシュードモナス種ＨＲ１９
９の細胞の未精製抽出物の可溶性画分から単離された。
オリゴヌクレオチド配列が、特異的なＮ−末端アミノ酸
配列から推定された。対応するＤＮＡプローブは、Ｎ−
末端をコードしているｃａｄｈ遺伝子の領域が位置付け
られるフラグメントＥ１２とハイズリダイズした。
２及び１．８ｋｂｐ ＥｃｏＲＩフラグメント（Ｅ１２
及びＥ１８）の同時獲得に起因すると考えられた。フラ
グメントＥ１２は完全に、そしてフラグメントＥ１８は
部分的にシークエンスされた。ＥｃｏＲＩ切断部位を含
むコニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼの構造遺伝
子ｃａｄｈが、これらのフラグメントに位置付けられ
た。クロマトグラフィーの方法を用いて、この酵素は、
オイゲノール中で生育されたシュードモナス種ＨＲ１９
９の細胞の未精製抽出物の可溶性画分から単離された。
オリゴヌクレオチド配列が、特異的なＮ−末端アミノ酸
配列から推定された。対応するＤＮＡプローブは、Ｎ−
末端をコードしているｃａｄｈ遺伝子の領域が位置付け
られるフラグメントＥ１２とハイズリダイズした。
【００２５】オイゲノール及びフェルラ酸を拒絶する突
然変異体（突然変異体６１６７）は、ハイブリッドコス
ミドｐＥ５−１の９．４ｋｂｐ ＥｃｏＲＩフラグメン
ト（Ｅ９４）を獲得することにより補足された。このフ
ラグメントの物理的地図が作成された。相補能力は、
１．９ｋｂｐ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIサブフラグメン
トに位置付けられた。このフラグメントは、様々な微生
物のアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ及び
シュードモナス オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）により生産される「中鎖
アシル−ＣｏＡシンテターゼ」に相同である不完全なＯ
ＲＦ（これらはＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII切断部位を
越えて続いた）を有した。フラグメントＥ９４は、完全
にシークエンスされた。前述のＯＲＦの下流に、β−ケ
トチオラーゼに相同なＯＲＦが位置付けられた。コニフ
ェリルアルデヒドデヒドロゲナーゼの構造遺伝子（ｃａ
ｌｄｈ）が、フラグメントＥ９４の中心の位置に位置付
けられた。クロマトグラフィーの方法を用いて、この酵
素は、オイゲノール中で生育されたシュードモナス種Ｈ
Ｒ１９９の細胞の未精製抽出物の可溶性画分から単離さ
れた。
然変異体（突然変異体６１６７）は、ハイブリッドコス
ミドｐＥ５−１の９．４ｋｂｐ ＥｃｏＲＩフラグメン
ト（Ｅ９４）を獲得することにより補足された。このフ
ラグメントの物理的地図が作成された。相補能力は、
１．９ｋｂｐ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIサブフラグメン
トに位置付けられた。このフラグメントは、様々な微生
物のアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ及び
シュードモナス オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）により生産される「中鎖
アシル−ＣｏＡシンテターゼ」に相同である不完全なＯ
ＲＦ（これらはＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII切断部位を
越えて続いた）を有した。フラグメントＥ９４は、完全
にシークエンスされた。前述のＯＲＦの下流に、β−ケ
トチオラーゼに相同なＯＲＦが位置付けられた。コニフ
ェリルアルデヒドデヒドロゲナーゼの構造遺伝子（ｃａ
ｌｄｈ）が、フラグメントＥ９４の中心の位置に位置付
けられた。クロマトグラフィーの方法を用いて、この酵
素は、オイゲノール中で生育されたシュードモナス種Ｈ
Ｒ１９９の細胞の未精製抽出物の可溶性画分から単離さ
れた。
【００２６】非常に多数のシュードモナス株中へのハイ
ブリッドコスミドｐＥ２０７の接合導入は、得られた導
入接合体において、ｖａｎＡ、ｖａｎＢ及びｖｄｈ遺伝
子、並びにオイゲノール−ヒドロキシラーゼ遺伝子の異
種起源の発現をもたらした。１つの株のプラスミドの獲
得は、それが、炭素及びエネルギー源としてオイゲノー
ルを用いて生育することを可能にした。
ブリッドコスミドｐＥ２０７の接合導入は、得られた導
入接合体において、ｖａｎＡ、ｖａｎＢ及びｖｄｈ遺伝
子、並びにオイゲノール−ヒドロキシラーゼ遺伝子の異
種起源の発現をもたらした。１つの株のプラスミドの獲
得は、それが、炭素及びエネルギー源としてオイゲノー
ルを用いて生育することを可能にした。
【００２７】材料及び方法 バクテリアの生育条件 大腸菌の株は、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ま
たはＭ９ミネラル培地中で３７℃で生育された（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ、Ｊ．Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第
二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。シュードモナス
種及びアルカリゲネス ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇ
ｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）の株は、栄養素を含む
培地（ＮＢ、重量で０．８％）またはミネラル培地（Ｍ
Ｍ）中で３０℃で生育された（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ、Ｈ．
Ｇ．等、１９６１、Ａｒｃｈ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．３
８：２０９−２２２）。フェルラ酸、バニリン、バニリ
ン酸及びプロトカテク酸は、ジメチルスルホキシド中に
溶解され、重量で０．１％の最終濃度でそれぞれの培地
に加えられた。オイゲノールは、０．１容量％の最終濃
度で直接培地に加えられるか、またはＭＭ寒天プレート
の蓋に濾紙（円形フィルター５９５、Ｓｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）上で添加された。シュードモナス種の導入接合体
の生育のために、テトラサイクリン及びカナマイシン
が、それぞれ、２５μｇ／ｍｌ及び３００μｇ／ｍｌの
最終濃度で用いられた。
たはＭ９ミネラル培地中で３７℃で生育された（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ、Ｊ．Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第
二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。シュードモナス
種及びアルカリゲネス ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇ
ｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）の株は、栄養素を含む
培地（ＮＢ、重量で０．８％）またはミネラル培地（Ｍ
Ｍ）中で３０℃で生育された（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ、Ｈ．
Ｇ．等、１９６１、Ａｒｃｈ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．３
８：２０９−２２２）。フェルラ酸、バニリン、バニリ
ン酸及びプロトカテク酸は、ジメチルスルホキシド中に
溶解され、重量で０．１％の最終濃度でそれぞれの培地
に加えられた。オイゲノールは、０．１容量％の最終濃
度で直接培地に加えられるか、またはＭＭ寒天プレート
の蓋に濾紙（円形フィルター５９５、Ｓｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）上で添加された。シュードモナス種の導入接合体
の生育のために、テトラサイクリン及びカナマイシン
が、それぞれ、２５μｇ／ｍｌ及び３００μｇ／ｍｌの
最終濃度で用いられた。
【００２８】ニトロソグアニジン突然変異誘発 Ｍｉｌｌｅｒ（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｊ．Ｈ．１９７２、Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）の修正した方法を用い
て、シュードモナス種ＨＲ１９９のニトロソグアニジン
突然変異誘発が行われた。クエン酸バッファーの代わり
に、リン酸カリウム（ＰＰ）バッファー（１００ｍＭ、
ｐＨ ７．０）が用いられた。Ｎ−メチル−Ｎ’−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジンの最終濃度は、２００μｇ
／ｍｌであった。得られた突然変異体は、生育基質とし
てオイゲノール、フェルラ酸、バニリン及びバニリン酸
を利用する能力の喪失に関して選別された。
ｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）の修正した方法を用い
て、シュードモナス種ＨＲ１９９のニトロソグアニジン
突然変異誘発が行われた。クエン酸バッファーの代わり
に、リン酸カリウム（ＰＰ）バッファー（１００ｍＭ、
ｐＨ ７．０）が用いられた。Ｎ−メチル−Ｎ’−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジンの最終濃度は、２００μｇ
／ｍｌであった。得られた突然変異体は、生育基質とし
てオイゲノール、フェルラ酸、バニリン及びバニリン酸
を利用する能力の喪失に関して選別された。
【００２９】培養上清中の代謝中間体の定性及び定量検
出 培養上清が、直接または２回蒸留水での希釈後のいずれ
かで、高速液体クロマトグラフィー（Ｋｎａｕｅｒ Ｈ
ＰＬＣ）により分析された。Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ−１０
０ Ｃ１８（７μｍ、２５０ ｘ ４ｍｍ）でクロマトグ
ラフィーが行われた。用いられた溶媒は、０．１容量％
ギ酸及びアセトニトリルであった。
出 培養上清が、直接または２回蒸留水での希釈後のいずれ
かで、高速液体クロマトグラフィー（Ｋｎａｕｅｒ Ｈ
ＰＬＣ）により分析された。Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ−１０
０ Ｃ１８（７μｍ、２５０ ｘ ４ｍｍ）でクロマトグ
ラフィーが行われた。用いられた溶媒は、０．１容量％
ギ酸及びアセトニトリルであった。
【００３０】コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼ
及びコニフェリルアルデヒドデヒドロゲナーゼの精製 精製方法は、４℃で行われた。
及びコニフェリルアルデヒドデヒドロゲナーゼの精製 精製方法は、４℃で行われた。
【００３１】未精製抽出物 オイゲノール中で生育されたシュードモナス種ＨＲ１９
９の細胞は、７．５のｐＨを有する１０ｍＭリン酸ナト
リウムバッファー中で洗浄され、同じバッファー中に再
懸濁され、そして１，０００ｐｓｉの圧力で２回フレン
チプレス（Ａｍｉｃｏｎ、Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎ
ｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）に通されることにより
破砕された。細胞ホモジネートは、超遠心（１時間、１
００，０００ ｘ ｇ、４℃）に供され、そして未精製抽
出物の可溶性画分が上清として得られた。
９の細胞は、７．５のｐＨを有する１０ｍＭリン酸ナト
リウムバッファー中で洗浄され、同じバッファー中に再
懸濁され、そして１，０００ｐｓｉの圧力で２回フレン
チプレス（Ａｍｉｃｏｎ、Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎ
ｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）に通されることにより
破砕された。細胞ホモジネートは、超遠心（１時間、１
００，０００ ｘ ｇ、４℃）に供され、そして未精製抽
出物の可溶性画分が上清として得られた。
【００３２】ＤＥＡＥセファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）
での陰イオン交換クロマトグラフィー 未精製抽出物の可溶性画分は、１００ｍＭ ＮａＣｌを
含んでいる７．５のｐＨの１０ｍＭリン酸ナトリウムバ
ッファーに対して一晩透析された。透析物は、０．８ｍ
ｌ／分の流速で、１００ｍＭ ＮａＣｌを含んでいる
７．５のｐＨの１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで
平衡化されたＤＥＡＥセファセルカラム（２．６ｃｍ
ｘ ３５ｃｍ、ベッド容量［ＢＶ］：１８６ｍｌ）に添
加された。カラムは、２ベッド容量の１００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌを含んでいる７．５のｐＨの１０ｍＭリン酸ナトリ
ウムバッファーで洗浄された。コニフェリルアルコール
デヒドロゲナーゼ（ＣＡＤＨ）及びコニフェリルアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼ（ＣＡＬＤＨ）の溶出は、７．５
のｐＨの１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中の１０
０ないし５００ｍＭ ＮａＣｌの直線的な塩濃度勾配で
行われた（２ ｘ １５０ｍｌ）。５ｍｌの画分が集めら
れた。高いＣＡＤＨ及びＣＡＬＤＨ活性を有する画分
が、それぞれ、対応するＤＥＡＥプールに合わせられ
た。
での陰イオン交換クロマトグラフィー 未精製抽出物の可溶性画分は、１００ｍＭ ＮａＣｌを
含んでいる７．５のｐＨの１０ｍＭリン酸ナトリウムバ
ッファーに対して一晩透析された。透析物は、０．８ｍ
ｌ／分の流速で、１００ｍＭ ＮａＣｌを含んでいる
７．５のｐＨの１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで
平衡化されたＤＥＡＥセファセルカラム（２．６ｃｍ
ｘ ３５ｃｍ、ベッド容量［ＢＶ］：１８６ｍｌ）に添
加された。カラムは、２ベッド容量の１００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌを含んでいる７．５のｐＨの１０ｍＭリン酸ナトリ
ウムバッファーで洗浄された。コニフェリルアルコール
デヒドロゲナーゼ（ＣＡＤＨ）及びコニフェリルアルデ
ヒドデヒドロゲナーゼ（ＣＡＬＤＨ）の溶出は、７．５
のｐＨの１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中の１０
０ないし５００ｍＭ ＮａＣｌの直線的な塩濃度勾配で
行われた（２ ｘ １５０ｍｌ）。５ｍｌの画分が集めら
れた。高いＣＡＤＨ及びＣＡＬＤＨ活性を有する画分
が、それぞれ、対応するＤＥＡＥプールに合わせられ
た。
【００３３】セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２
００でのゲル濾過クロマトグラフィー ＣＡＤＨ ＤＥＡＥプールは、２９０ｋＰａの圧力で、
Ｄｉａｆｌｏ限外濾過膜ＰＭ３０を通して５０ｍｌのＡ
ｍｉｃｏｎ限外濾過筒（ｃｈａｍｂｅｒ）（両方ともＡ
ＭＩＣＯＮ ＣＯＲＰ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡか
ら）中でセファデックスＧ２００−ＢＶの約２％に相当
する容量まで濃縮された。濃縮されたタンパク質溶液
は、１００ｍＭ ＮａＣｌを含んでいる７．５のｐＨの
１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで平衡化されたセ
ファデックスＧ２００カラム（ＢＶ：１３８ｍｌ）に添
加され、そして０．２ｍｌ／分の流速で同じバッファー
で溶出された。２ｍｌの画分が集められた。高いＣＡＤ
Ｈ活性を有する画分が、セファデックスＧ２００プール
に合わせられた。
００でのゲル濾過クロマトグラフィー ＣＡＤＨ ＤＥＡＥプールは、２９０ｋＰａの圧力で、
Ｄｉａｆｌｏ限外濾過膜ＰＭ３０を通して５０ｍｌのＡ
ｍｉｃｏｎ限外濾過筒（ｃｈａｍｂｅｒ）（両方ともＡ
ＭＩＣＯＮ ＣＯＲＰ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡか
ら）中でセファデックスＧ２００−ＢＶの約２％に相当
する容量まで濃縮された。濃縮されたタンパク質溶液
は、１００ｍＭ ＮａＣｌを含んでいる７．５のｐＨの
１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで平衡化されたセ
ファデックスＧ２００カラム（ＢＶ：１３８ｍｌ）に添
加され、そして０．２ｍｌ／分の流速で同じバッファー
で溶出された。２ｍｌの画分が集められた。高いＣＡＤ
Ｈ活性を有する画分が、セファデックスＧ２００プール
に合わせられた。
【００３４】ブチルセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ）４Ｂでの疎水性相互作用クロマトグラフィー ＣＡＤＨセファデックスＧ２００プールは、３Ｍ Ｎａ
Ｃｌに調整され、次に、３Ｍ ＮａＣｌを含んでいる
７．５のｐＨの１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで
平衡化されたブチルセファロース４Ｂカラム（ＢＶ：４
８ｍｌ）に添加された（流速：０．５ｍｌ／分）。次
に、カラムは、２ＢＶの３Ｍ ＮａＣｌを含んでいる
７．５のｐＨの１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで
洗浄された（流速：１．０ｍｌ／分）。ＣＡＤＨは、
７．５のｐＨの１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中
の３ないし０Ｍ ＮａＣｌの直線的に減少するＮａＣｌ
濃度勾配で溶出された（２ ｘ ５０ｍｌ）。４ｍｌの画
分が集められた。高いＣＡＤＨ活性を有する画分がＨＩ
Ｃプールに合わせられ、上記のように濃縮された。
ｅ）４Ｂでの疎水性相互作用クロマトグラフィー ＣＡＤＨセファデックスＧ２００プールは、３Ｍ Ｎａ
Ｃｌに調整され、次に、３Ｍ ＮａＣｌを含んでいる
７．５のｐＨの１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで
平衡化されたブチルセファロース４Ｂカラム（ＢＶ：４
８ｍｌ）に添加された（流速：０．５ｍｌ／分）。次
に、カラムは、２ＢＶの３Ｍ ＮａＣｌを含んでいる
７．５のｐＨの１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで
洗浄された（流速：１．０ｍｌ／分）。ＣＡＤＨは、
７．５のｐＨの１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中
の３ないし０Ｍ ＮａＣｌの直線的に減少するＮａＣｌ
濃度勾配で溶出された（２ ｘ ５０ｍｌ）。４ｍｌの画
分が集められた。高いＣＡＤＨ活性を有する画分がＨＩ
Ｃプールに合わせられ、上記のように濃縮された。
【００３５】ヒドロキシアパタイトでのクロマトグラフ
ィー ＣＡＬＤＨ ＤＥＡＥプールは、２９０ｋＰａの圧力
で、Ｄｉａｆｌｏ限外濾過膜ＰＭ３０を通して５０ｍｌ
のＡｍｉｃｏｎ限外濾過筒（ｃｈａｍｂｅｒ）（両方と
もＡＭＩＣＯＮ ＣＯＲＰ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＵＳ
Ａから）中で１０ｍｌまで濃縮された。濃縮されたタン
パク質溶液は、バッファー（７．０のｐＨの１０ｍＭリ
ン酸ナトリウムバッファー中１０ｍＭ ＮａＣｌ）で平
衡化されたヒドロキシアパタイトカラム（ＢＶ：８０ｍ
ｌ）に添加された（流速：２ｍｌ／分）。次に、カラム
は２．５ベッド容量のバッファーで洗浄された（流速：
２ｍｌ／分）。ＣＡＬＤＨは、１０ないし４００ｍＭ
ＮａＰの直線的に増加するリン酸ナトリウム濃度勾配で
溶出された。１０ｍｌの画分が集められた。高いＣＡＬ
ＤＨ活性を有する画分が、ＣＡＬＤＨ ＨＡプールに合
わせられた。
ィー ＣＡＬＤＨ ＤＥＡＥプールは、２９０ｋＰａの圧力
で、Ｄｉａｆｌｏ限外濾過膜ＰＭ３０を通して５０ｍｌ
のＡｍｉｃｏｎ限外濾過筒（ｃｈａｍｂｅｒ）（両方と
もＡＭＩＣＯＮ ＣＯＲＰ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＵＳ
Ａから）中で１０ｍｌまで濃縮された。濃縮されたタン
パク質溶液は、バッファー（７．０のｐＨの１０ｍＭリ
ン酸ナトリウムバッファー中１０ｍＭ ＮａＣｌ）で平
衡化されたヒドロキシアパタイトカラム（ＢＶ：８０ｍ
ｌ）に添加された（流速：２ｍｌ／分）。次に、カラム
は２．５ベッド容量のバッファーで洗浄された（流速：
２ｍｌ／分）。ＣＡＬＤＨは、１０ないし４００ｍＭ
ＮａＰの直線的に増加するリン酸ナトリウム濃度勾配で
溶出された。１０ｍｌの画分が集められた。高いＣＡＬ
ＤＨ活性を有する画分が、ＣＡＬＤＨ ＨＡプールに合
わせられた。
【００３６】スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）Ｈ
Ｒ２００ １０／３０でのゲル濾過クロマトグラフィー ＣＡＬＤＨ ＨＡプールは、２００μｌまで濃縮され
（Ａｍｉｃｏｎ限外濾過チャンバー、膜限外濾過ＰＭ３
０）、そして７．０のｐＨの１０ｍＭリン酸ナトリウム
バッファーで平衡化されたスーパーデックスＨＲ２００
１０／３０カラム（ＢＶ：２３．６ｍｌ）に添加され
た。ＣＡＬＤＨは、０．５ｍｌ／分の流速で同じバッフ
ァーで溶出された。２５０μｌの画分が集められた。高
いＣＡＬＤＨ活性を有する画分が、ＣＡＬＤＨスーパー
デックスプールに合わせられた。
Ｒ２００ １０／３０でのゲル濾過クロマトグラフィー ＣＡＬＤＨ ＨＡプールは、２００μｌまで濃縮され
（Ａｍｉｃｏｎ限外濾過チャンバー、膜限外濾過ＰＭ３
０）、そして７．０のｐＨの１０ｍＭリン酸ナトリウム
バッファーで平衡化されたスーパーデックスＨＲ２００
１０／３０カラム（ＢＶ：２３．６ｍｌ）に添加され
た。ＣＡＬＤＨは、０．５ｍｌ／分の流速で同じバッフ
ァーで溶出された。２５０μｌの画分が集められた。高
いＣＡＬＤＨ活性を有する画分が、ＣＡＬＤＨスーパー
デックスプールに合わせられた。
【００３７】コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼ
活性の測定 ＣＡＤＨ活性は、ＴＥ変換装置（ＺＥＩＳＳ、Ｏｂｅｒ
ｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙから）及び記録装置の備
わったＺＥＩＳＳ ＰＭ４分光光度計（ＺＥＩＳＳ、Ｏ
ｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙから）を用いて、
Ｊａｅｇｅｒ等の光学酵素試験（Ｊａｅｇｅｒ、Ｅ．、
Ｌ．Ｅｇｇｅｌｉｎｇ及びＨ．Ｓａｈｍ、１９８２、Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．６：３３３
−３３６）により３０℃で測定された。１ｍｌの容量を
有する反応混合物は、０．２ｍｍｏｌのＴｒｉｓ／ＨＣ
ｌ（ｐＨ ９．０）、０．４μｍｏｌのコニフェリルア
ルコール、２μｍｏｌのＮＡＤ、０．１ｍｍｏｌのセミ
カルバジド、及び酵素の溶液を含んだ（「Ｔｒｉｓ」＝
トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）。ＮＡＤ
の還元が、λ＝３４０ｎｍ（ε＝６，３ｃｍ2／μｍｏ
ｌ）で調べられた。酵素活性はユニット（Ｕ）単位で記
録され、１Ｕは、１分当たりに１μｍｏｌの基質を代謝
する酵素の量に相当した。サンプル中のタンパク質濃度
は、Ｌｏｗｒｙ等により記述された方法（Ｌｏｗｒｙ、
Ｏ．Ｈ．、Ｎ．Ｊ．Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ、Ａ．Ｌ．Ｆ
ａｒｒ及びＲ．Ｊ．Ｒａｎｄａｌｌ、１９５１、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５−２７５）により測
定された。
活性の測定 ＣＡＤＨ活性は、ＴＥ変換装置（ＺＥＩＳＳ、Ｏｂｅｒ
ｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙから）及び記録装置の備
わったＺＥＩＳＳ ＰＭ４分光光度計（ＺＥＩＳＳ、Ｏ
ｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙから）を用いて、
Ｊａｅｇｅｒ等の光学酵素試験（Ｊａｅｇｅｒ、Ｅ．、
Ｌ．Ｅｇｇｅｌｉｎｇ及びＨ．Ｓａｈｍ、１９８２、Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．６：３３３
−３３６）により３０℃で測定された。１ｍｌの容量を
有する反応混合物は、０．２ｍｍｏｌのＴｒｉｓ／ＨＣ
ｌ（ｐＨ ９．０）、０．４μｍｏｌのコニフェリルア
ルコール、２μｍｏｌのＮＡＤ、０．１ｍｍｏｌのセミ
カルバジド、及び酵素の溶液を含んだ（「Ｔｒｉｓ」＝
トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）。ＮＡＤ
の還元が、λ＝３４０ｎｍ（ε＝６，３ｃｍ2／μｍｏ
ｌ）で調べられた。酵素活性はユニット（Ｕ）単位で記
録され、１Ｕは、１分当たりに１μｍｏｌの基質を代謝
する酵素の量に相当した。サンプル中のタンパク質濃度
は、Ｌｏｗｒｙ等により記述された方法（Ｌｏｗｒｙ、
Ｏ．Ｈ．、Ｎ．Ｊ．Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ、Ａ．Ｌ．Ｆ
ａｒｒ及びＲ．Ｊ．Ｒａｎｄａｌｌ、１９５１、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５−２７５）により測
定された。
【００３８】コニフェリルアルデヒドデヒドロゲナーゼ
活性の測定 ＣＡＬＤＨ活性は、ＴＥ変換装置（ＺＥＩＳＳ、Ｏｂｅ
ｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙから）及び記録装置の
備わったＺＥＩＳＳ ＰＭ４分光光度計（ＺＥＩＳＳ、
Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙから）を用い
て、光学酵素試験により３０℃で測定された。１ｍｌの
容量の反応混合物は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッ
ファー（ｐＨ ８．８）、５．６ｍＭコニフェリルアル
デヒド、３ｍＭ ＮＡＤ、及び酵素の溶液を含んだ。フ
ェルラ酸を形成するコニフェリルアルデヒドの酸化が、
λ＝４００ｎｍ（ε＝３４ｃｍ2／μｍｏｌ）で調べら
れた。酵素活性はユニット（Ｕ）単位で記録され、１Ｕ
は、１分当たりに１μｍｏｌの基質を代謝する酵素の量
に相当する。サンプル中のタンパク質濃度は、Ｌｏｗｒ
ｙ等により記述された方法（Ｌｏｗｒｙ、Ｏ．Ｈ．、
Ｎ．Ｊ．Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ、Ａ．Ｌ．Ｆａｒｒ及び
Ｒ．Ｊ．Ｒａｎｄａｌｌ、１９５１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．１９３：２６５−２７５）により測定された。
活性の測定 ＣＡＬＤＨ活性は、ＴＥ変換装置（ＺＥＩＳＳ、Ｏｂｅ
ｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙから）及び記録装置の
備わったＺＥＩＳＳ ＰＭ４分光光度計（ＺＥＩＳＳ、
Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙから）を用い
て、光学酵素試験により３０℃で測定された。１ｍｌの
容量の反応混合物は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッ
ファー（ｐＨ ８．８）、５．６ｍＭコニフェリルアル
デヒド、３ｍＭ ＮＡＤ、及び酵素の溶液を含んだ。フ
ェルラ酸を形成するコニフェリルアルデヒドの酸化が、
λ＝４００ｎｍ（ε＝３４ｃｍ2／μｍｏｌ）で調べら
れた。酵素活性はユニット（Ｕ）単位で記録され、１Ｕ
は、１分当たりに１μｍｏｌの基質を代謝する酵素の量
に相当する。サンプル中のタンパク質濃度は、Ｌｏｗｒ
ｙ等により記述された方法（Ｌｏｗｒｙ、Ｏ．Ｈ．、
Ｎ．Ｊ．Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ、Ａ．Ｌ．Ｆａｒｒ及び
Ｒ．Ｊ．Ｒａｎｄａｌｌ、１９５１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．１９３：２６５−２７５）により測定された。
【００３９】電気泳動法 タンパク質を含んでいる抽出物の分離は、Ｓｔｅｇｅｍ
ａｎｎ等により記述された方法（Ｓｔｅｇｅｍａｎｎ
等、１９７３、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．２８ｃ：
７２２−７３２）により非変性条件下で重量で７．４％
のポリアクリルアミドゲル中で、そしてＬａｅｍｍｌｉ
により記述された方法（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ．Ｋ．１９
７０、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２２７：６８０−
６８５）により重量で１１．５％のポリアクリルアミド
ゲル中で変性条件下で行われた。Ｓｅｒｖａ Ｂｌｕｅ
Ｒが、非特異的なタンパク質染色のために用いられた。
コニフェリルアルコール、コニフェリルアルデヒド、及
びバニリンデヒドロゲナーゼを特異的に染色するため
に、ゲルは、新しい１００ｍＭ ＰＰバッファー（ｐＨ
７．０）中に２０分間置かれ、次に、重量で０．０８％
のＮＡＤ、重量で０．０４％の塩化ｐ−ニトロブルー−
テトラゾリウム、重量で０．００３％のメト硫酸フェナ
ジン、及び１ｍＭの各基質が加えられた同じバッファー
中で、対応する着色したバンドが現れるまで３０℃でイ
ンキュベートされた。
ａｎｎ等により記述された方法（Ｓｔｅｇｅｍａｎｎ
等、１９７３、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．２８ｃ：
７２２−７３２）により非変性条件下で重量で７．４％
のポリアクリルアミドゲル中で、そしてＬａｅｍｍｌｉ
により記述された方法（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ．Ｋ．１９
７０、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２２７：６８０−
６８５）により重量で１１．５％のポリアクリルアミド
ゲル中で変性条件下で行われた。Ｓｅｒｖａ Ｂｌｕｅ
Ｒが、非特異的なタンパク質染色のために用いられた。
コニフェリルアルコール、コニフェリルアルデヒド、及
びバニリンデヒドロゲナーゼを特異的に染色するため
に、ゲルは、新しい１００ｍＭ ＰＰバッファー（ｐＨ
７．０）中に２０分間置かれ、次に、重量で０．０８％
のＮＡＤ、重量で０．０４％の塩化ｐ−ニトロブルー−
テトラゾリウム、重量で０．００３％のメト硫酸フェナ
ジン、及び１ｍＭの各基質が加えられた同じバッファー
中で、対応する着色したバンドが現れるまで３０℃でイ
ンキュベートされた。
【００４０】ポリアクリルアミドゲルからＰＶＤＦ膜へ
のタンパク質の移行 タンパク質は、製造業者の使用説明書に従って、セミド
ライファーストブロット装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、Ｇｏ
ｅｔｔｉｎｇｅｎ、ＧｅｒｍａｎｙからのＢ３２／３
３）を用いて、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルからＰＶ
ＤＦ膜（Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏ
ｒｄ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）へ移された。
のタンパク質の移行 タンパク質は、製造業者の使用説明書に従って、セミド
ライファーストブロット装置（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、Ｇｏ
ｅｔｔｉｎｇｅｎ、ＧｅｒｍａｎｙからのＢ３２／３
３）を用いて、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルからＰＶ
ＤＦ膜（Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏ
ｒｄ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）へ移された。
【００４１】Ｎ−末端アミノ酸配列の決定 Ｎ−末端アミノ酸配列の決定は、製造業者の使用説明書
に従って、（型４７７Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＵＳＡの）タン
パク質ペプチドシークエンサー及びＰＴＨ分析器を用い
て行われた。
に従って、（型４７７Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＵＳＡの）タン
パク質ペプチドシークエンサー及びＰＴＨ分析器を用い
て行われた。
【００４２】ＤＮＡの単離及び操作 ゲノムＤＮＡの単離は、Ｍａｒｍｕｒにより記述された
方法（Ｍａｒｍｕｒ、Ｊ．、１９６１、Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．３：２０８−２１８）により行われた。メガプラス
ミドＤＮＡは、Ｎｉｅｓ等により記述された方法（Ｎｉ
ｅｓ、Ｄ．等、１９８７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
６９：４８６５−４８４８）により単離された。他のプ
ラスミドＤＮＡまたはＤＮＡ制限フラグメントの単離及
び分析、λ−ファージ粒子へのハイブリッドコスミドの
パッケージング、及び大腸菌の形質導入は、標準的な方
法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及
びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎ
ｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）により
行われた。
方法（Ｍａｒｍｕｒ、Ｊ．、１９６１、Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．３：２０８−２１８）により行われた。メガプラス
ミドＤＮＡは、Ｎｉｅｓ等により記述された方法（Ｎｉ
ｅｓ、Ｄ．等、１９８７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
６９：４８６５−４８４８）により単離された。他のプ
ラスミドＤＮＡまたはＤＮＡ制限フラグメントの単離及
び分析、λ−ファージ粒子へのハイブリッドコスミドの
パッケージング、及び大腸菌の形質導入は、標準的な方
法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及
びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎ
ｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）により
行われた。
【００４３】ＤＮＡの導入 大腸菌のコンピテントセルの調製及び形質転換は、Ｈａ
ｎａｈａｎにより記述された方法（Ｈａｎａｈａｎ、
Ｄ．、１９８３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５
７−５８０）により行われた。プラスミドを含んでいる
大腸菌Ｓ１７−１株（供与体）並びにシュードモナス種
株（受容体）及びアルカリゲネス ユートロフス（受容
体）間の接合プラスミド導入は、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ等
により記述された方法（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ、Ｂ．等、
１９８１、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４７：１９８−
２０５）によりＮＢ寒天プレート上で、または炭素源と
しての重量で０．５％のグルコン酸塩及び２５μｇ／ｍ
ｌのテトラサイクリンまたは３００μｇ／ｍｌのカナマ
イシンを用いてＭＭ寒天プレート上で「ミニ相補性法」
により行われた。この方法において、受容体の細胞は、
接種線の形態で一方向に添加された。次に、５分後に、
供与体株の細胞が、受容体の接種線を横切る接種線の形
態で添加された。３０℃で４８時間インキュベーション
後、導入接合体は、交差点の直接下で生育し、一方、供
与体または受容体株はいずれも生育できなかった。ハイブリダイゼーション実験 ＤＮＡ制限フラグメントは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０
ｍＭホウ酸、及び１．２５ｍＭ ＥＤＴＡバッファー
（ｐＨ ８．５）中、重量で０．８％のアガロースゲル
中で電気泳動により分離された（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、
Ｊ．Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：
ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。ゲルから正に荷電したナ
イロン膜（孔径：０．４５μｍ、Ｐａｌｌ Ｆｉｌｔｒ
ａｔｉｏｎｓｔｅｃｈｎｉｋ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、Ｇｅ
ｒｍａｎｙ）への変性したＤＮＡの移行、それに続くビ
オチン化したまたは32Ｐ−標識したＤＮＡプローブとの
ハイブリダイゼーション、及びこれらのＤＮＡプローブ
の生成は、標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．Ｅ．
Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８
９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ）により行われた。
ｎａｈａｎにより記述された方法（Ｈａｎａｈａｎ、
Ｄ．、１９８３、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５
７−５８０）により行われた。プラスミドを含んでいる
大腸菌Ｓ１７−１株（供与体）並びにシュードモナス種
株（受容体）及びアルカリゲネス ユートロフス（受容
体）間の接合プラスミド導入は、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ等
により記述された方法（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ、Ｂ．等、
１９８１、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４７：１９８−
２０５）によりＮＢ寒天プレート上で、または炭素源と
しての重量で０．５％のグルコン酸塩及び２５μｇ／ｍ
ｌのテトラサイクリンまたは３００μｇ／ｍｌのカナマ
イシンを用いてＭＭ寒天プレート上で「ミニ相補性法」
により行われた。この方法において、受容体の細胞は、
接種線の形態で一方向に添加された。次に、５分後に、
供与体株の細胞が、受容体の接種線を横切る接種線の形
態で添加された。３０℃で４８時間インキュベーション
後、導入接合体は、交差点の直接下で生育し、一方、供
与体または受容体株はいずれも生育できなかった。ハイブリダイゼーション実験 ＤＮＡ制限フラグメントは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０
ｍＭホウ酸、及び１．２５ｍＭ ＥＤＴＡバッファー
（ｐＨ ８．５）中、重量で０．８％のアガロースゲル
中で電気泳動により分離された（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、
Ｊ．Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：
ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。ゲルから正に荷電したナ
イロン膜（孔径：０．４５μｍ、Ｐａｌｌ Ｆｉｌｔｒ
ａｔｉｏｎｓｔｅｃｈｎｉｋ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、Ｇｅ
ｒｍａｎｙ）への変性したＤＮＡの移行、それに続くビ
オチン化したまたは32Ｐ−標識したＤＮＡプローブとの
ハイブリダイゼーション、及びこれらのＤＮＡプローブ
の生成は、標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．Ｅ．
Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８
９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ）により行われた。
【００４４】オリゴヌクレオチドの合成 開始物質としてデオキシヌクレオシドホスホルアミダイ
トを用いて、オリゴヌクレオチドが０．２μｍｏｌ規模
で合成された（Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｓ．Ｌ．及びＭ．
Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、１９８１、Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２）。合成
は、製造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ、Ｕｐｐｓ
ａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）の使用説明書に従って、Ｇｅｎ
ｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ Ｐｌｕｓで行われた。保護基
の除去は、２５容量％のアンモニア水溶液中５５℃で１
５時間のインキュベーションにより行われた。最後に、
これらのオリゴヌクレオチドは、ＮＡＰ−５カラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄ
ｅｎ）で精製された。
トを用いて、オリゴヌクレオチドが０．２μｍｏｌ規模
で合成された（Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｓ．Ｌ．及びＭ．
Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、１９８１、Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２）。合成
は、製造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ、Ｕｐｐｓ
ａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）の使用説明書に従って、Ｇｅｎ
ｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ Ｐｌｕｓで行われた。保護基
の除去は、２５容量％のアンモニア水溶液中５５℃で１
５時間のインキュベーションにより行われた。最後に、
これらのオリゴヌクレオチドは、ＮＡＰ−５カラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄ
ｅｎ）で精製された。
【００４５】ＤＮＡシークエンシング ［α−35Ｓ］ｄＡＴＰ及びＴ７ポリメラーゼシークエン
シングキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）を用い
て、Ｓａｎｇｅｒ等により記述されたジデオキシチェイ
ンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ等、１９７７、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：
５４６３−５４６７）により、ヌクレオチド配列の決定
が行われた。７−デアザグアノシン−５’−三リン酸が
ｄＧＴＰの代わりに用いられた（Ｍｉｚｕｓａｗａ、
Ｓ．等、１９８６、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１４：１３１９−１３２４）。シークエンシング反
応の生成物は、重量で４２％の尿素を含んでいる１００
ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、８３ｍＭホウ酸、及び１ｍＭ
ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ ８．３）中、重量で６％の
ポリアクリルアミドゲル中で分離され、Ｓ２シークエン
シング装置（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＧｍｂ
Ｈ、Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が製造業
者の使用説明書に従って用いられた。電気泳動後、ゲル
は、１０容量％の酢酸中で３０分間インキュベートさ
れ、水中でしばらくの間洗浄後、８０℃で２時間乾燥さ
れた。Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲ Ｘ線フィルム
（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏ
ｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）が、乾燥したゲルのオ
ートラジオグラフィーのために用いられた。さらに、Ｄ
ＮＡ配列は、各場合において製造業者の使用説明書に従
って、「７−デアザ−ｄＧＴＰを用いたＴｈｅｒｍｏシ
ークエナーゼ蛍光標識プライマーサイクルシークエンシ
ングキット」（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ ｐｌｃ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃ
ｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を用い
て、「ＬＩ−ＣＯＲ ＤＮＡシークエンサーモデル４０
００Ｌ」（ＬＩ−ＣＯＲ Ｉｎｃ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｎ
Ｅ、ＵＳＡ）により「非放射能的」にも決定された。
シングキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）を用い
て、Ｓａｎｇｅｒ等により記述されたジデオキシチェイ
ンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ等、１９７７、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：
５４６３−５４６７）により、ヌクレオチド配列の決定
が行われた。７−デアザグアノシン−５’−三リン酸が
ｄＧＴＰの代わりに用いられた（Ｍｉｚｕｓａｗａ、
Ｓ．等、１９８６、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１４：１３１９−１３２４）。シークエンシング反
応の生成物は、重量で４２％の尿素を含んでいる１００
ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、８３ｍＭホウ酸、及び１ｍＭ
ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ ８．３）中、重量で６％の
ポリアクリルアミドゲル中で分離され、Ｓ２シークエン
シング装置（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＧｍｂ
Ｈ、Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が製造業
者の使用説明書に従って用いられた。電気泳動後、ゲル
は、１０容量％の酢酸中で３０分間インキュベートさ
れ、水中でしばらくの間洗浄後、８０℃で２時間乾燥さ
れた。Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲ Ｘ線フィルム
（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏ
ｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）が、乾燥したゲルのオ
ートラジオグラフィーのために用いられた。さらに、Ｄ
ＮＡ配列は、各場合において製造業者の使用説明書に従
って、「７−デアザ−ｄＧＴＰを用いたＴｈｅｒｍｏシ
ークエナーゼ蛍光標識プライマーサイクルシークエンシ
ングキット」（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ ｐｌｃ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃ
ｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を用い
て、「ＬＩ−ＣＯＲ ＤＮＡシークエンサーモデル４０
００Ｌ」（ＬＩ−ＣＯＲ Ｉｎｃ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｎ
Ｅ、ＵＳＡ）により「非放射能的」にも決定された。
【００４６】様々なシークエンシング方法が用いられ、
合成オリゴヌクレオチドを用いてＳｔｒａｕｓｓ等によ
り記述された「プライマーホッピング法」（Ｓｔｒａｕ
ｓｓ、Ｅ．Ｃ．等、１９８６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、１５４：３５３−３６０）によりシークエンシング
が行われた。「ユニバーサル」及び「リバースプライマ
ー」のみが用いられる場合、ハイブリッドプラスミドが
「鋳型ＤＮＡ」として用いられ、その挿入ＤＮＡフラグ
メントは、製造業者の使用説明書に従って、「ＥｘｏII
I／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎヌクレアーゼ欠失」キット（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌ．、ＵＳＡ）を用いて一
方向に長さを短くされた。
合成オリゴヌクレオチドを用いてＳｔｒａｕｓｓ等によ
り記述された「プライマーホッピング法」（Ｓｔｒａｕ
ｓｓ、Ｅ．Ｃ．等、１９８６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、１５４：３５３−３６０）によりシークエンシング
が行われた。「ユニバーサル」及び「リバースプライマ
ー」のみが用いられる場合、ハイブリッドプラスミドが
「鋳型ＤＮＡ」として用いられ、その挿入ＤＮＡフラグ
メントは、製造業者の使用説明書に従って、「ＥｘｏII
I／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎヌクレアーゼ欠失」キット（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌ．、ＵＳＡ）を用いて一
方向に長さを短くされた。
【００４７】化学薬品、生化学物質及び酵素 制限酵素、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、ラムダＤＮＡ、並び
に光学酵素試験のための酵素及び基質は、Ｃ．Ｆ．Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ ＆ Ｓｏｅｈｎｅ（Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ Ｇｅｒｍａｎｙ）から、またはＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ
（Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入さ
れた。［α−35Ｓ］ｄＡＴＰ及び［γ−32Ｐ］ＡＴＰ
は、Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｂｕｃｈｌｅｒ（Ｂｒａｕｎｓ
ｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入された。ＮＡ
−型アガロースは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ（Ｕｐ
ｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から購入された。全ての他
の化学薬品は、Ｈａａｒｍａｎｎ ＆ Ｒｅｉｍｅｒ
（Ｈｏｌｚｍｉｎｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｅ．Ｍｅ
ｒｃｋ ＡＧ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃ（Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉ
ｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｓｅｒｖａ Ｆｅｉｎｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）、またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｅ（Ｄｅｉｓｅｎ
ｈｏｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からであった。
に光学酵素試験のための酵素及び基質は、Ｃ．Ｆ．Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ ＆ Ｓｏｅｈｎｅ（Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ Ｇｅｒｍａｎｙ）から、またはＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ
（Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入さ
れた。［α−35Ｓ］ｄＡＴＰ及び［γ−32Ｐ］ＡＴＰ
は、Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｂｕｃｈｌｅｒ（Ｂｒａｕｎｓ
ｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入された。ＮＡ
−型アガロースは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ（Ｕｐ
ｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から購入された。全ての他
の化学薬品は、Ｈａａｒｍａｎｎ ＆ Ｒｅｉｍｅｒ
（Ｈｏｌｚｍｉｎｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｅ．Ｍｅ
ｒｃｋ ＡＧ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃ（Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉ
ｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｓｅｒｖａ Ｆｅｉｎｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）、またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｅ（Ｄｅｉｓｅｎ
ｈｏｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からであった。
【００４８】
【実施例】実施例１ オイゲノールの代謝に欠陥を有するシュードモナス種Ｈ
Ｒ１９９株の突然変異体の単離 オイゲノールの代謝に欠陥を有する突然変異体を単離す
るために、シュードモナス種ＨＲ１９９株をニトロソグ
アニジン突然変異誘発に供した。得られた突然変異体
を、炭素及びエネルギー源としてオイゲノール、フェル
ラ酸、及びバニリンを利用する能力により分類した。突
然変異体６１６４及び６１６５は、野生型の場合におけ
るように、フェルラ酸及びバニリンを利用することはで
きるけれども、炭素及びエネルギー源としてもはやオイ
ゲノールを利用することはできなかった。突然変異体６
１６７及び６２０２は、野生型の場合におけるように、
バニリンを利用することはできるけれども、炭素及びエ
ネルギー源としてもはやオイゲノール及びフェルラ酸を
利用することはできなかった。前述の突然変異体を次の
分子生物学的分析に用いた。
Ｒ１９９株の突然変異体の単離 オイゲノールの代謝に欠陥を有する突然変異体を単離す
るために、シュードモナス種ＨＲ１９９株をニトロソグ
アニジン突然変異誘発に供した。得られた突然変異体
を、炭素及びエネルギー源としてオイゲノール、フェル
ラ酸、及びバニリンを利用する能力により分類した。突
然変異体６１６４及び６１６５は、野生型の場合におけ
るように、フェルラ酸及びバニリンを利用することはで
きるけれども、炭素及びエネルギー源としてもはやオイ
ゲノールを利用することはできなかった。突然変異体６
１６７及び６２０２は、野生型の場合におけるように、
バニリンを利用することはできるけれども、炭素及びエ
ネルギー源としてもはやオイゲノール及びフェルラ酸を
利用することはできなかった。前述の突然変異体を次の
分子生物学的分析に用いた。
【００４９】実施例２ コスミドベクターｐＶＫ１００におけるシュードモナス
種ＨＲ１９９遺伝子ライブラリーの構築 シュードモナス種ＨＲ１９９株のゲノムＤＮＡを単離
し、ＥｃｏＲＩでの部分制限消化に供した。このように
して得られたＤＮＡ調製物を、ＥｃｏＲＩにより切断さ
れたベクターｐＶＫ１００と連結した。コンカテマーの
連結生成物の形成を促進するために、ＤＮＡ濃度は比較
的高かった。連結物質をλ−ファージ粒子にパッケージ
ングし、続いてこれらを大腸菌Ｓ１７−１の形質導入の
ために用いた。形質導入体の選択をテトラサイクリンを
含んでいるＬＢ寒天プレート上で行った。このようにし
て、様々なハイブリッドコスミドを含む１３３０個の形
質導入体を得た。
種ＨＲ１９９遺伝子ライブラリーの構築 シュードモナス種ＨＲ１９９株のゲノムＤＮＡを単離
し、ＥｃｏＲＩでの部分制限消化に供した。このように
して得られたＤＮＡ調製物を、ＥｃｏＲＩにより切断さ
れたベクターｐＶＫ１００と連結した。コンカテマーの
連結生成物の形成を促進するために、ＤＮＡ濃度は比較
的高かった。連結物質をλ−ファージ粒子にパッケージ
ングし、続いてこれらを大腸菌Ｓ１７−１の形質導入の
ために用いた。形質導入体の選択をテトラサイクリンを
含んでいるＬＢ寒天プレート上で行った。このようにし
て、様々なハイブリッドコスミドを含む１３３０個の形
質導入体を得た。
【００５０】実施例３ オイゲノール分解代謝の必須遺伝子を含んでいるハイブ
リッドコスミドの同定 ミニ相補性法により、１３３０個の形質同定体のハイブ
リッドコスミドを突然変異体６１６４及び６１６５へ接
合により導入した。オイゲノール中で再び生育する能力
（各突然変異体の相補性）に関して、得られた導入接合
体をオイゲノールを含んでいるＭＭプレート上で調べ
た。突然変異体６１６４は、クローン化された形態で
１．２ｋｂｐ、１．８ｋｂｐ、３ｋｂｐ、５．８ｋｂ
ｐ、及び９．４ｋｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントを含む
ハイブリッドコスミドｐＥ５−１の獲得により補足され
た。このハイブリッドコスミドを含んでいる大腸菌Ｓ１
７−１株を、番号ＤＳＭ１０４４０のもとに「Ｄｅｕｔ
ｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ
ＧｍｂＨ」（ＤＳＭ）に寄託した。突然変異体６１６５
は、ハイブリッドコスミドｐＥ２０７またはｐＥ１１５
それぞれの獲得により補足された。相補能力は、２３ｋ
ｂｐ ＥｃｏＲＩフラグメントに起因すると考えられ、
このフラグメントは、唯一のＥｃｏＲＩフラグメントと
してハイブリッドコスミドｐＥ２０７にクローン化され
た形態で含まれ、一方、ハイブリッドコスミドｐＥ１１
５は、さらに３ｋｂｐ及び６ｋｂｐのＥｃｏＲＩフラグ
メントを含んだ。ハイブリッドコスミドｐＥ２０７を含
んでいる大腸菌Ｓ１７−１を、番号ＤＳＭ１０４３９の
もとにＤＳＭに寄託した。
リッドコスミドの同定 ミニ相補性法により、１３３０個の形質同定体のハイブ
リッドコスミドを突然変異体６１６４及び６１６５へ接
合により導入した。オイゲノール中で再び生育する能力
（各突然変異体の相補性）に関して、得られた導入接合
体をオイゲノールを含んでいるＭＭプレート上で調べ
た。突然変異体６１６４は、クローン化された形態で
１．２ｋｂｐ、１．８ｋｂｐ、３ｋｂｐ、５．８ｋｂ
ｐ、及び９．４ｋｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントを含む
ハイブリッドコスミドｐＥ５−１の獲得により補足され
た。このハイブリッドコスミドを含んでいる大腸菌Ｓ１
７−１株を、番号ＤＳＭ１０４４０のもとに「Ｄｅｕｔ
ｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ
ＧｍｂＨ」（ＤＳＭ）に寄託した。突然変異体６１６５
は、ハイブリッドコスミドｐＥ２０７またはｐＥ１１５
それぞれの獲得により補足された。相補能力は、２３ｋ
ｂｐ ＥｃｏＲＩフラグメントに起因すると考えられ、
このフラグメントは、唯一のＥｃｏＲＩフラグメントと
してハイブリッドコスミドｐＥ２０７にクローン化され
た形態で含まれ、一方、ハイブリッドコスミドｐＥ１１
５は、さらに３ｋｂｐ及び６ｋｂｐのＥｃｏＲＩフラグ
メントを含んだ。ハイブリッドコスミドｐＥ２０７を含
んでいる大腸菌Ｓ１７−１を、番号ＤＳＭ１０４３９の
もとにＤＳＭに寄託した。
【００５１】実施例４ ハイブリッドコスミドｐＥ２０７の２３ｋｂｐ Ｅｃｏ
ＲＩフラグメント（Ｅ２３０）の分析Ｅｃｏ ＲＩ消化したハイブリッドコスミドｐＥ２０７か
らフラグメントＥ２３０を調製単離し、そしてＥｃｏＲ
Ｉで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ-ＤＮＡに連
結した。連結物質を用いて、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを
形質転換した。Ｘ−Ｇａｌ及びＩＰＴＧを含んでいるＬ
Ｂ−Ｔｃ−Ａｍｐ寒天プレート上での「青−白」選別
後、「白色」の形質転換体を得、そのハイブリッドプラ
スミドｐＳＫＥ２３０は、クローン化された形態でフラ
グメントＥ２３０を含んだ。このプラスミドを用い、そ
して様々な制限酵素を用いることにより、フラグメント
Ｅ２３０の物理的地図を作成した（図１）。
ＲＩフラグメント（Ｅ２３０）の分析Ｅｃｏ ＲＩ消化したハイブリッドコスミドｐＥ２０７か
らフラグメントＥ２３０を調製単離し、そしてＥｃｏＲ
Ｉで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ-ＤＮＡに連
結した。連結物質を用いて、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを
形質転換した。Ｘ−Ｇａｌ及びＩＰＴＧを含んでいるＬ
Ｂ−Ｔｃ−Ａｍｐ寒天プレート上での「青−白」選別
後、「白色」の形質転換体を得、そのハイブリッドプラ
スミドｐＳＫＥ２３０は、クローン化された形態でフラ
グメントＥ２３０を含んだ。このプラスミドを用い、そ
して様々な制限酵素を用いることにより、フラグメント
Ｅ２３０の物理的地図を作成した（図１）。
【００５２】両方とも広い宿主範囲を有し、そしてシュ
ードモナス菌中でも安定であるベクターｐＶＫ１０１及
びｐＭＰ９２にＥ２３０のサブフラグメントをクローン
化し、続いて突然変異体６１６５中へ接合導入すること
により、突然変異体６１６５を補足する領域を１．８ｋ
ｂｐ ＫｐｎＩフラグメント（Ｋ１８）に位置付けた。
このフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ-にク
ローン化した後、ヌクレオチド配列を決定し、オイゲノ
ールヒドロキシラーゼのチトクロムＣサブユニットの遺
伝子を同定した。１１７アミノ酸の遺伝子産物は、Ｎ−
末端リーダーペプチド（ＭＭＮＶＮＹＫＡＶＧＡＳＬＬ
ＬＡＦＩＳＱＧＡＷＡ）及びシュードモナス プチダに
より生産されるｐ−クレゾールメチルヒドロキシラーゼ
（ＭｃＩｎｔｉｒｅ等、１９８６、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ２５：５９７５−５９８１）のチトクロムＣサ
ブユニットと（８２アミノ酸の領域にわたって）３２．
９％の同一性を有した。
ードモナス菌中でも安定であるベクターｐＶＫ１０１及
びｐＭＰ９２にＥ２３０のサブフラグメントをクローン
化し、続いて突然変異体６１６５中へ接合導入すること
により、突然変異体６１６５を補足する領域を１．８ｋ
ｂｐ ＫｐｎＩフラグメント（Ｋ１８）に位置付けた。
このフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ-にク
ローン化した後、ヌクレオチド配列を決定し、オイゲノ
ールヒドロキシラーゼのチトクロムＣサブユニットの遺
伝子を同定した。１１７アミノ酸の遺伝子産物は、Ｎ−
末端リーダーペプチド（ＭＭＮＶＮＹＫＡＶＧＡＳＬＬ
ＬＡＦＩＳＱＧＡＷＡ）及びシュードモナス プチダに
より生産されるｐ−クレゾールメチルヒドロキシラーゼ
（ＭｃＩｎｔｉｒｅ等、１９８６、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ２５：５９７５−５９８１）のチトクロムＣサ
ブユニットと（８２アミノ酸の領域にわたって）３２．
９％の同一性を有した。
【００５３】Ｋ１８に隣接するＥ２３０のＫｐｎＩサブ
フラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ-にクロー
ン化し、そしてシークエンシングすることにより、さら
なる読み枠（ＯＲＦ）を同定し、これらの一つは、オイ
ゲノールヒドロキシラーゼのフラボタンパク質サブユニ
ットをコードし、そしてシュードモナス プチダにより
生産されるｐ−クレゾールメチルヒドロキシラーゼのフ
ラボタンパク質サブユニットに非常に類似していた。さ
らなるＯＲＦが、エシェリキア コリにより生産される
γ−グルタミルシステインシンテターゼ（グルタチオン
の生合成における最初の酵素）（Ｗａｔａｎａｂｅ等、
１９８６、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４：
４３９３−４４００）に非常に類似していることを見い
だした。 ポリアクリルアミドゲルにおける特異的活性
染色により、大腸菌（ｐＳＫＥ２３０）の未精製抽出物
の可溶性画分中にバニリンデヒドロゲナーゼを検出し
た。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ-にサブクローン化
し、得られた形質転換体の未精製抽出物の可溶性画分を
分析することにより、バニリンデヒドロゲナーゼ遺伝子
（ｖｄｈ）をＥ２３０の３．８ｋｂｐ ＨｉｎｄIII／Ｅ
ｃｏＲＩサブフラグメントに位置付けた。このフラグメ
ントの完全なヌクレオチド配列を決定した。バニリンデ
ヒドロゲナーゼの分子量は、ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により確認されたように５０，７７９であ
った。アミノ酸配列は、様々な起源の他のアルデヒドデ
ヒドロゲナーゼに非常に類似していた。
フラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ-にクロー
ン化し、そしてシークエンシングすることにより、さら
なる読み枠（ＯＲＦ）を同定し、これらの一つは、オイ
ゲノールヒドロキシラーゼのフラボタンパク質サブユニ
ットをコードし、そしてシュードモナス プチダにより
生産されるｐ−クレゾールメチルヒドロキシラーゼのフ
ラボタンパク質サブユニットに非常に類似していた。さ
らなるＯＲＦが、エシェリキア コリにより生産される
γ−グルタミルシステインシンテターゼ（グルタチオン
の生合成における最初の酵素）（Ｗａｔａｎａｂｅ等、
１９８６、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４：
４３９３−４４００）に非常に類似していることを見い
だした。 ポリアクリルアミドゲルにおける特異的活性
染色により、大腸菌（ｐＳＫＥ２３０）の未精製抽出物
の可溶性画分中にバニリンデヒドロゲナーゼを検出し
た。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ-にサブクローン化
し、得られた形質転換体の未精製抽出物の可溶性画分を
分析することにより、バニリンデヒドロゲナーゼ遺伝子
（ｖｄｈ）をＥ２３０の３．８ｋｂｐ ＨｉｎｄIII／Ｅ
ｃｏＲＩサブフラグメントに位置付けた。このフラグメ
ントの完全なヌクレオチド配列を決定した。バニリンデ
ヒドロゲナーゼの分子量は、ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により確認されたように５０，７７９であ
った。アミノ酸配列は、様々な起源の他のアルデヒドデ
ヒドロゲナーゼに非常に類似していた。
【００５４】ｖｄｈ遺伝子の上流に、エノイル−ＣｏＡ
ヒドラターゼに相同なさらなるＯＲＦを同定した。２
７、２９７の計算上の分子量をＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により確認した。
ヒドラターゼに相同なさらなるＯＲＦを同定した。２
７、２９７の計算上の分子量をＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により確認した。
【００５５】ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ-にクローン
化したＥ２３０の５．０ｋｂｐ ＨｉｎｄIIIサブフラグ
メントをシークエンスすることにより、シュードモナス
ポーシモビリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉ
ｍｏｂｉｌｉｓ）により生産されるリグノスチルベン−
α，β−ジオキシゲナーゼに非常に類似したＯＲＦを同
定した。フラグメントＥ２３０の完全なシークエンシン
グにより、ホルムアルデヒド−デヒドロゲナーゼ（ｆｄ
ｈ）及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）に相同
である２つのさらなるＯＲＦを同定した（図１参照）。
化したＥ２３０の５．０ｋｂｐ ＨｉｎｄIIIサブフラグ
メントをシークエンスすることにより、シュードモナス
ポーシモビリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉ
ｍｏｂｉｌｉｓ）により生産されるリグノスチルベン−
α，β−ジオキシゲナーゼに非常に類似したＯＲＦを同
定した。フラグメントＥ２３０の完全なシークエンシン
グにより、ホルムアルデヒド−デヒドロゲナーゼ（ｆｄ
ｈ）及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）に相同
である２つのさらなるＯＲＦを同定した（図１参照）。
【００５６】実施例５ 突然変異体６１６４を補足するハイブリッドコスミドｐ
Ｅ５−１の領域の分析 突然変異体６１６４は、クローン化された形態で１．２
ｋｂｐ（Ｅ１２）、１．８ｋｂｐ（Ｅ１８）、３ｋｂｐ
（Ｅ３０）、５．８ｋｂｐ（Ｅ５８）、及び９．４ｋｂ
ｐ（Ｅ９４）のＥｃｏＲＩフラグメントを含むハイブリ
ッドコスミドｐＥ５−１（図１）の獲得により補足され
た。ｐＥ５−１をＥｃｏＲＩで消化し、続いて再連結す
ることにより、フラグメントＥ１２、Ｅ１８、及びＥ３
０のみを含む、このハイブリッドコスミドの誘導体（ｐ
Ｅ１０６）を得た。突然変異体６１６４中への接合導入
後、このプラスミドは、やはり後者を補足することがで
き、この結果、対応する導入接合体は、炭素及びエネル
ギー源としてオイゲノール中で再び生育できた。
Ｅ５−１の領域の分析 突然変異体６１６４は、クローン化された形態で１．２
ｋｂｐ（Ｅ１２）、１．８ｋｂｐ（Ｅ１８）、３ｋｂｐ
（Ｅ３０）、５．８ｋｂｐ（Ｅ５８）、及び９．４ｋｂ
ｐ（Ｅ９４）のＥｃｏＲＩフラグメントを含むハイブリ
ッドコスミドｐＥ５−１（図１）の獲得により補足され
た。ｐＥ５−１をＥｃｏＲＩで消化し、続いて再連結す
ることにより、フラグメントＥ１２、Ｅ１８、及びＥ３
０のみを含む、このハイブリッドコスミドの誘導体（ｐ
Ｅ１０６）を得た。突然変異体６１６４中への接合導入
後、このプラスミドは、やはり後者を補足することがで
き、この結果、対応する導入接合体は、炭素及びエネル
ギー源としてオイゲノール中で再び生育できた。
【００５７】プラスミドｐＥ１０６をＥｃｏＲＩで消化
し、重量で０．８％のアガロースゲル中で消化物質をゲ
ル電気泳動で分離し、そしてＤＮＡをナイロン膜へ移し
た後、以下の配列、 ＡＴＧ ＣＡＡ ＣＴＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＴＣ ＧＴ−３’ Ｇ Ｇ Ｃ Ｔ Ｇ Ｇ Ｔ Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ Ｇ Ｔ Ｇ Ｇ Ｇ Ｇ Ｇ Ｇ Ｔ Ｇ Ｇ の32Ｐ−標識したオリゴヌクレオチドプローブでハイブ
リダイゼーションを行った。
し、重量で０．８％のアガロースゲル中で消化物質をゲ
ル電気泳動で分離し、そしてＤＮＡをナイロン膜へ移し
た後、以下の配列、 ＡＴＧ ＣＡＡ ＣＴＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＴＣ ＧＴ−３’ Ｇ Ｇ Ｃ Ｔ Ｇ Ｇ Ｔ Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ Ｇ Ｔ Ｇ Ｇ Ｇ Ｇ Ｇ Ｇ Ｔ Ｇ Ｇ の32Ｐ−標識したオリゴヌクレオチドプローブでハイブ
リダイゼーションを行った。
【００５８】この遺伝子プローブの配列は、シュードモ
ナス種ＨＲ１９９から精製したコニフェリルアルコール
デヒドロゲナーゼ（ＣＡＤＨ）（以下参照）のＮ−末端
アミノ酸配列から推定された。このプローブを用いて、
ＣＡＤＨのＮ−末端をコードしているｃａｄｈ遺伝子の
領域をフラグメントＥ１２に位置付けた。このフラグメ
ント及び隣接するフラグメントＥ１８の一部もシークエ
ンスし、ｃａｄｈ遺伝子の完全な配列をこのようにして
決定した。ｃａｄｈから推定したアミノ酸配列は、（Ｍ
ａｔｔｈｅｗ及びＦｅｗｓｏｎ、１９９４、Ｃｒｉｔｉ
ｃａｌ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０（１）：１
３−５６による）Ｉ類、II群の他のアルコールデヒドロ
ゲナーゼに相同であった。
ナス種ＨＲ１９９から精製したコニフェリルアルコール
デヒドロゲナーゼ（ＣＡＤＨ）（以下参照）のＮ−末端
アミノ酸配列から推定された。このプローブを用いて、
ＣＡＤＨのＮ−末端をコードしているｃａｄｈ遺伝子の
領域をフラグメントＥ１２に位置付けた。このフラグメ
ント及び隣接するフラグメントＥ１８の一部もシークエ
ンスし、ｃａｄｈ遺伝子の完全な配列をこのようにして
決定した。ｃａｄｈから推定したアミノ酸配列は、（Ｍ
ａｔｔｈｅｗ及びＦｅｗｓｏｎ、１９９４、Ｃｒｉｔｉ
ｃａｌ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０（１）：１
３−５６による）Ｉ類、II群の他のアルコールデヒドロ
ゲナーゼに相同であった。
【００５９】実施例６ コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼの精製及び特
性化 シュードモナス種ＨＲ１９９をオイゲノール中で生育し
た。これらの細胞を集め、洗浄し、そしてフレンチプレ
スを用いて破砕した。限外濾過後に得られた未精製抽出
物の可溶性画分は、０．２４Ｕ／ｍｇタンパク質の比活
性を有した。ＤＥＡＥセファセルでのクロマトグラフィ
ーにより、ＣＡＤＨの１１．７倍の濃縮を８３．７％の
収率で得た。セファデックスＧ２００でのクロマトグラ
フィーにより、ＣＡＤＨの６．８倍の濃縮を１１．２％
の収率で得た。ブチルセファロース４Ｂでのクロマトグ
ラフィーにより、ＣＡＤＨの７０．６倍の濃縮を７．８
％の収率で得た。
性化 シュードモナス種ＨＲ１９９をオイゲノール中で生育し
た。これらの細胞を集め、洗浄し、そしてフレンチプレ
スを用いて破砕した。限外濾過後に得られた未精製抽出
物の可溶性画分は、０．２４Ｕ／ｍｇタンパク質の比活
性を有した。ＤＥＡＥセファセルでのクロマトグラフィ
ーにより、ＣＡＤＨの１１．７倍の濃縮を８３．７％の
収率で得た。セファデックスＧ２００でのクロマトグラ
フィーにより、ＣＡＤＨの６．８倍の濃縮を１１．２％
の収率で得た。ブチルセファロース４Ｂでのクロマトグ
ラフィーにより、ＣＡＤＨの７０．６倍の濃縮を７．８
％の収率で得た。
【００６０】この方法を用いて、ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により２７ｋＤａでバンドを示す調製
物を得た。精製率は６４で、収率は０．８％であった。
ミドゲル電気泳動により２７ｋＤａでバンドを示す調製
物を得た。精製率は６４で、収率は０．８％であった。
【００６１】至適温度及び熱安定性 ＣＡＤＨで触媒される反応の至適温度は、４２℃であっ
た。しかしながら、この酵素は、熱感受性であった。半
減期は、以下のとおり、Ｔ1/2（３４℃）＝５分、Ｔ1/2
（３９℃）＝１分、Ｔ1/2（４２℃）＜１分であった。
た。しかしながら、この酵素は、熱感受性であった。半
減期は、以下のとおり、Ｔ1/2（３４℃）＝５分、Ｔ1/2
（３９℃）＝１分、Ｔ1/2（４２℃）＜１分であった。
【００６２】至適ｐＨ ＣＡＤＨにより触媒される反応の至適ｐＨは、２５ｍＭ
ＭＯＰＳバッファー中で１０．９であった。より高い
ｐＨ値で、変性による活性の減少が見られた。 みかけの分子量 ＦＰＬＣを用いて、スーパーデックス２００ＨＲ １０
／３０でのゲル濾過により、天然のＣＡＤＨの分子量が
５４．９ｋＤａで測定され、これはα2サブユニット構
造を示唆した。
ＭＯＰＳバッファー中で１０．９であった。より高い
ｐＨ値で、変性による活性の減少が見られた。 みかけの分子量 ＦＰＬＣを用いて、スーパーデックス２００ＨＲ １０
／３０でのゲル濾過により、天然のＣＡＤＨの分子量が
５４．９ｋＤａで測定され、これはα2サブユニット構
造を示唆した。
【００６３】Ｎ−末端アミノ酸配列 精製したタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列の決定は、
以下の結果、 １ ５ 10 15 20 ＭＱＬＴＮＫＫＩＶＶＶ（Ｇ）Ｖ（Ｓ）？（Ｒ）（Ｉ）？（Ａ）（Ｅ） （Ｖ） （Ｖ） （一文字コードでの配列；？：特定が可能でな
い；（）：確かでない；第二列には、当てはまることも
できるアミノ酸を記述する）を示した。
以下の結果、 １ ５ 10 15 20 ＭＱＬＴＮＫＫＩＶＶＶ（Ｇ）Ｖ（Ｓ）？（Ｒ）（Ｉ）？（Ａ）（Ｅ） （Ｖ） （Ｖ） （一文字コードでの配列；？：特定が可能でな
い；（）：確かでない；第二列には、当てはまることも
できるアミノ酸を記述する）を示した。
【００６４】実施例７ コニフェリルアルデヒドデヒドロゲナーゼの精製及び特
性化 シュードモナス種ＨＲ１９９をオイゲノール中で生育し
た。これらの細胞を集め、洗浄し、そしてフレンチプレ
スを用いて破砕した。限外濾過後に得られた未精製抽出
物の可溶性画分は、０．４３Ｕ／ｍｇタンパク質の比活
性を示した。ＤＥＡＥセファセルでのクロマトグラフィ
ーにより、ＣＡＬＤＨの６．６倍の濃縮を６５．３％の
収率で得た。ヒドロキシアパタイトでのクロマトグラフ
ィーにより、ＣＡＬＤＨの６３倍の濃縮を３３％の収率
で得た。スーパーデックスＨＲ２００でのクロマトグラ
フィーにより、ＣＡＬＤＨの８１倍の濃縮を１３％の収
率で得た。この方法を用いて、ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により約４９ｋＤａでバンドを示す調製
物を得た。
性化 シュードモナス種ＨＲ１９９をオイゲノール中で生育し
た。これらの細胞を集め、洗浄し、そしてフレンチプレ
スを用いて破砕した。限外濾過後に得られた未精製抽出
物の可溶性画分は、０．４３Ｕ／ｍｇタンパク質の比活
性を示した。ＤＥＡＥセファセルでのクロマトグラフィ
ーにより、ＣＡＬＤＨの６．６倍の濃縮を６５．３％の
収率で得た。ヒドロキシアパタイトでのクロマトグラフ
ィーにより、ＣＡＬＤＨの６３倍の濃縮を３３％の収率
で得た。スーパーデックスＨＲ２００でのクロマトグラ
フィーにより、ＣＡＬＤＨの８１倍の濃縮を１３％の収
率で得た。この方法を用いて、ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により約４９ｋＤａでバンドを示す調製
物を得た。
【００６５】至適温度及び熱安定性 ＣＡＬＤＨにより触媒される反応の至適温度は、２６℃
であった。この酵素は、熱感受性であった。半減期は、
以下のとおり、Ｔ1/2（３１℃）＝５分、Ｔ1/2（３４
℃）＝２．５分、Ｔ1/2（３８℃）＝１分であった。
であった。この酵素は、熱感受性であった。半減期は、
以下のとおり、Ｔ1/2（３１℃）＝５分、Ｔ1/2（３４
℃）＝２．５分、Ｔ1/2（３８℃）＝１分であった。
【００６６】至適ｐＨ ＣＡＬＤＨにより触媒される反応の至適ｐＨは、１００
ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー中で８．８であっ
た。しかしながら、このｐＨ値で、この酵素はすでに不
安定である（５分以内に活性の８７％の減少）。より低
いｐＨ値で、この酵素は、より安定である（例えば、ｐ
Ｈ ６．０：４時間以内に活性の５０％の減少）。
ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー中で８．８であっ
た。しかしながら、このｐＨ値で、この酵素はすでに不
安定である（５分以内に活性の８７％の減少）。より低
いｐＨ値で、この酵素は、より安定である（例えば、ｐ
Ｈ ６．０：４時間以内に活性の５０％の減少）。
【００６７】基質特異性 この酵素は、基質として、コニフェリルアルデヒド（１
００％）だけでなく、トランスシンナムアルデヒド（９
６．７％）、シナピルアルデヒド（７６．７％）、ｐ−
アニスアルデヒド（２３．１％）、ベンズアルデヒド
（１７．８％）、３，５−ジメトキシ−ベンズアルデヒ
ド（７．６％）、及び３−ヒドロキシ−ベンズアルデヒ
ド（１．７％）も受け入れる。
００％）だけでなく、トランスシンナムアルデヒド（９
６．７％）、シナピルアルデヒド（７６．７％）、ｐ−
アニスアルデヒド（２３．１％）、ベンズアルデヒド
（１７．８％）、３，５−ジメトキシ−ベンズアルデヒ
ド（７．６％）、及び３−ヒドロキシ−ベンズアルデヒ
ド（１．７％）も受け入れる。
【００６８】コニフェリルアルデヒドに対するＣＡＬＤ
ＨのＫM値は、約９ないし１５Ｕ／ｍｌのＶmaxで、０．
００７及び０．０１２ｍＭの間の範囲にある。ＮＡＤに
対するＣＡＬＤＨのＫM値は、１４．２Ｕ／ｍｌのＶmax
で、０．３３４ｍＭである。ＮＡＤと比較して、ＮＡＤ
Ｐは、４．３％の割合で受け入れられる。
ＨのＫM値は、約９ないし１５Ｕ／ｍｌのＶmaxで、０．
００７及び０．０１２ｍＭの間の範囲にある。ＮＡＤに
対するＣＡＬＤＨのＫM値は、１４．２Ｕ／ｍｌのＶmax
で、０．３３４ｍＭである。ＮＡＤと比較して、ＮＡＤ
Ｐは、４．３％の割合で受け入れられる。
【００６９】Ｎ−末端アミノ酸配列 精製したタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列の決定は、
以下の結果、 ＩＳＩＬＧＬＮＧＡＰＶＧＡＥＱＬＧＳＡＬ（Ｄ）２０ （一文字コードでの配列；（）：確かでない）を示し
た。
以下の結果、 ＩＳＩＬＧＬＮＧＡＰＶＧＡＥＱＬＧＳＡＬ（Ｄ）２０ （一文字コードでの配列；（）：確かでない）を示し
た。
【００７０】実施例８ コニフェリルアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｃａ
ｌｄｈ）の位置決定及びシークエンシング Ｎ−末端アミノ酸配列は、プラスミドｐＥ５−１のフラ
グメントＥ９４のＤＮＡ配列から推定したアミノ酸配列
に完全に当てはまった。従って、ＣＡＬＤＨの構造遺伝
子ｃａｌｄｈをＥ９４に位置付けた。ｃａｌｄｈから推
定したアミノ酸配列は、他のアルデヒドデヒドロゲナー
ゼに相同であった。
ｌｄｈ）の位置決定及びシークエンシング Ｎ−末端アミノ酸配列は、プラスミドｐＥ５−１のフラ
グメントＥ９４のＤＮＡ配列から推定したアミノ酸配列
に完全に当てはまった。従って、ＣＡＬＤＨの構造遺伝
子ｃａｌｄｈをＥ９４に位置付けた。ｃａｌｄｈから推
定したアミノ酸配列は、他のアルデヒドデヒドロゲナー
ゼに相同であった。
【００７１】実施例９ ハイブリッドコスミドｐＥ２０７及びｐＥ５−１を用い
た、オイゲノールの分解代謝に欠陥を示す他の突然変異
体の相補性 ＮＭＧ突然変異誘発後、炭素及びエネルギー源としても
はやオイゲノール及びフェルラ酸を利用できない突然変
異体６１６７及び６２０２を得た（上記参照）。プラス
ミドｐＥ２０７の獲得は、接合導入後、突然変異体６２
０２が前述の基質を再び利用できることを意味した。こ
の突然変異体は、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼに相同
な遺伝子により補足される。
た、オイゲノールの分解代謝に欠陥を示す他の突然変異
体の相補性 ＮＭＧ突然変異誘発後、炭素及びエネルギー源としても
はやオイゲノール及びフェルラ酸を利用できない突然変
異体６１６７及び６２０２を得た（上記参照）。プラス
ミドｐＥ２０７の獲得は、接合導入後、突然変異体６２
０２が前述の基質を再び利用できることを意味した。こ
の突然変異体は、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼに相同
な遺伝子により補足される。
【００７２】プラスミドｐＥ５−１の獲得は、接合導入
後、突然変異体６１６７が前述の基質を再び利用できる
ことを意味した。ｐＨＰ１０１４にｐＥ５−１のＥｃｏ
ＲＩフラグメントを個々にクローニングし、そしてこれ
らのプラスミドを突然変異体６１６７中へ接合導入する
ことにより、相補特性をフラグメントＥ９４に位置付け
た。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ-にクローニングし、
そして様々な制限酵素で消化した後、フラグメントＥ９
４の物理的地図を作成した。ベクタ−ｐＶＫ１０１及び
ｐＭＰ９２にＥ９４のサブフラグメントをクローニング
し、続いて突然変異体６１６７中へ接合導入することに
より、突然変異体６１６７を補足する領域を１．９ｋｂ
ｐ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメント（ＥＨ１９）
に位置付けた。このフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ ＳＫ-にクローニングし、そしてシークエンスした
後、シュードモナス オレオボランスにより生産される
アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ及び「中
鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ」に相同な２つのＯＲＦ
を同定した。フラグメントＥ９４を完全にシークエンス
することにより、調節タンパク質及び走化性タンパク質
に相同なさらなるＯＲＦを同定した（図１参照）。
後、突然変異体６１６７が前述の基質を再び利用できる
ことを意味した。ｐＨＰ１０１４にｐＥ５−１のＥｃｏ
ＲＩフラグメントを個々にクローニングし、そしてこれ
らのプラスミドを突然変異体６１６７中へ接合導入する
ことにより、相補特性をフラグメントＥ９４に位置付け
た。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ-にクローニングし、
そして様々な制限酵素で消化した後、フラグメントＥ９
４の物理的地図を作成した。ベクタ−ｐＶＫ１０１及び
ｐＭＰ９２にＥ９４のサブフラグメントをクローニング
し、続いて突然変異体６１６７中へ接合導入することに
より、突然変異体６１６７を補足する領域を１．９ｋｂ
ｐ ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメント（ＥＨ１９）
に位置付けた。このフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ ＳＫ-にクローニングし、そしてシークエンスした
後、シュードモナス オレオボランスにより生産される
アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ及び「中
鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ」に相同な２つのＯＲＦ
を同定した。フラグメントＥ９４を完全にシークエンス
することにより、調節タンパク質及び走化性タンパク質
に相同なさらなるＯＲＦを同定した（図１参照）。
【００７３】実施例１０ シュードモナス種ＨＲ１９９におけるオイゲノールの分
解代謝の遺伝子の染色体コーディングの決定 シュードモナス種ＨＲ１９９は、約３５０ｋｂｐの大き
さのメガプラスミドを有するので、オイゲノールの分解
代謝の遺伝子がこのメガプラスミドまたは染色体のいず
れに位置付けられるかを調べるために、ハイブリダイゼ
ーション実験を行った。この目的のために、野生型及び
突然変異体のメガプラスミド調製物を重量で０．８％の
アガロースゲルで分離した。染色体及びメガプラスミド
ＤＮＡをナイロン膜上にブロットし、次に、ビオチン化
ＨＥ３８ＤＮＡプローブでハイズリダイズした。ハイブ
リダイゼーションシグナルは、染色体ＤＮＡでのみ得ら
れ、メガプラスミドＤＮＡでは得られなかった。従っ
て、シュードモナス種ＨＲ１９９におけるオイゲノール
の分解代謝の遺伝子は、染色体中にコードされる。
解代謝の遺伝子の染色体コーディングの決定 シュードモナス種ＨＲ１９９は、約３５０ｋｂｐの大き
さのメガプラスミドを有するので、オイゲノールの分解
代謝の遺伝子がこのメガプラスミドまたは染色体のいず
れに位置付けられるかを調べるために、ハイブリダイゼ
ーション実験を行った。この目的のために、野生型及び
突然変異体のメガプラスミド調製物を重量で０．８％の
アガロースゲルで分離した。染色体及びメガプラスミド
ＤＮＡをナイロン膜上にブロットし、次に、ビオチン化
ＨＥ３８ＤＮＡプローブでハイズリダイズした。ハイブ
リダイゼーションシグナルは、染色体ＤＮＡでのみ得ら
れ、メガプラスミドＤＮＡでは得られなかった。従っ
て、シュードモナス種ＨＲ１９９におけるオイゲノール
の分解代謝の遺伝子は、染色体中にコードされる。
【００７４】実施例１１ 他のシュードモナス株及びアルカリゲネス ユートロプ
スにおけるシュードモナス種ＨＲ１９９からのオイゲノ
ールの分解代謝の遺伝子の異種発現 フラグメントＨ１１０（ｐＶＫＨ１１０）を含んでいる
プラスミドｐＥ２０７及びｐＶＫ１０１ハイブリッドプ
ラスミドを、オイゲノール、バニリン、またはバニリン
酸を代謝できないアルカリゲネス ユートロプス及びシ
ュードモナス株中へ接合導入した。得られた導入接合体
を、オイゲノール、バニリン、またはバニリン酸を含ん
でいるＭＭ寒天プレート上で生育する能力に関して調べ
ただけでなく、いくつかの導入接合体をＭＭ液体培地中
でオイゲノールと共にインキュベートもした。培養上清
のＨＰＬＣ分析により、導入接合体のいくつかが、オイ
ゲノールを代謝することを見いだした。
スにおけるシュードモナス種ＨＲ１９９からのオイゲノ
ールの分解代謝の遺伝子の異種発現 フラグメントＨ１１０（ｐＶＫＨ１１０）を含んでいる
プラスミドｐＥ２０７及びｐＶＫ１０１ハイブリッドプ
ラスミドを、オイゲノール、バニリン、またはバニリン
酸を代謝できないアルカリゲネス ユートロプス及びシ
ュードモナス株中へ接合導入した。得られた導入接合体
を、オイゲノール、バニリン、またはバニリン酸を含ん
でいるＭＭ寒天プレート上で生育する能力に関して調べ
ただけでなく、いくつかの導入接合体をＭＭ液体培地中
でオイゲノールと共にインキュベートもした。培養上清
のＨＰＬＣ分析により、導入接合体のいくつかが、オイ
ゲノールを代謝することを見いだした。
【００７５】この分析において、シュードモナス スツ
ツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス ア
スプレニイ（Ｐ．ａｓｐｌｅｎｉｉ）、シュードモナス
種ＤＳＭ１３、シュードモナス種ＤＳＭ１５ａ、及びシ
ュードモナス種Ｄ１におけるｖｄｈ遺伝子の機能的発現
を測定した。
ツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス ア
スプレニイ（Ｐ．ａｓｐｌｅｎｉｉ）、シュードモナス
種ＤＳＭ１３、シュードモナス種ＤＳＭ１５ａ、及びシ
ュードモナス種Ｄ１におけるｖｄｈ遺伝子の機能的発現
を測定した。
【００７６】プラスミドｐＥ２０７を含む株シュードモ
ナス種Ｄ１の導入接合体は、炭素及びエネルギー源とし
てオイゲノールを用いて生育することができた。シュー
ドモナス テストステロニ（Ｐ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏ
ｎｉ）ＬＭＤ３３２４、シュードモナス フルオレセン
ス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）型Ｂ、シュードモナ
ス スツツェリＤＳＭ５００２７、シュードモナス種Ｄ
ＳＭ１４５５、及びシュードモナス フラギ（Ｐ．ｆｒ
ａｇｉ）ＤＳＭ３４５６の対応する導入接合体では、オ
イゲノールヒドロキシラーゼ遺伝子の機能的発現も見ら
れ、これは、培養培地中へのオイゲノールの分解代謝中
間体（コニフェリルアルコール、コニフェリルアルデヒ
ド、フェルラ酸、バニリン、バニリン酸）の分泌をもた
らした。しかしながら、これらの導入接合体のオイゲノ
ール中での生育は、見られなかった。
ナス種Ｄ１の導入接合体は、炭素及びエネルギー源とし
てオイゲノールを用いて生育することができた。シュー
ドモナス テストステロニ（Ｐ．ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏ
ｎｉ）ＬＭＤ３３２４、シュードモナス フルオレセン
ス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）型Ｂ、シュードモナ
ス スツツェリＤＳＭ５００２７、シュードモナス種Ｄ
ＳＭ１４５５、及びシュードモナス フラギ（Ｐ．ｆｒ
ａｇｉ）ＤＳＭ３４５６の対応する導入接合体では、オ
イゲノールヒドロキシラーゼ遺伝子の機能的発現も見ら
れ、これは、培養培地中へのオイゲノールの分解代謝中
間体（コニフェリルアルコール、コニフェリルアルデヒ
ド、フェルラ酸、バニリン、バニリン酸）の分泌をもた
らした。しかしながら、これらの導入接合体のオイゲノ
ール中での生育は、見られなかった。
【００７７】本発明の特徴及び態様を示せば以下のとお
りである。
りである。
【００７８】１． オイゲノールからのコニフェリルア
ルコール、コニフェリルアルデヒド、フェルラ酸、バニ
リン、及びバニリン酸の製造のための合成用酵素。
ルコール、コニフェリルアルデヒド、フェルラ酸、バニ
リン、及びバニリン酸の製造のための合成用酵素。
【００７９】 ２． ａ）オイゲノールヒドロキシラーゼ、 ｂ）コニフェリルアルコールデヒドロゲナーゼ、 ｃ）コニフェリルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、 ｄ）フェルラ酸デアシラーゼ、及び、 ｅ）バニリンデヒドロゲナーゼ、 を含んでなる群から選択される上記１に記載の合成用酵
素。
素。
【００８０】３． 上記１及び２に記載の酵素をコード
しているＤＮＡ、並びにその部分配列及び機能的同等
物。
しているＤＮＡ、並びにその部分配列及び機能的同等
物。
【００８１】４． 上記３に記載のＤＮＡを含んでいる
コスミドクローン。
コスミドクローン。
【００８２】５． 上記３に記載のＤＮＡを含んでいる
ベクター。
ベクター。
【００８３】６， 上記３に記載のＤＮＡで形質転換さ
れた微生物。
れた微生物。
【００８４】７． 微生物の形質転換のための上記３に
記載のＤＮＡの使用。
記載のＤＮＡの使用。
【００８５】８． コニフェリルアルコール、コニフェ
リルアルデヒド、フェルラ酸、バニリン及びバニリン酸
の製造のための上記６に記載の微生物の使用。
リルアルデヒド、フェルラ酸、バニリン及びバニリン酸
の製造のための上記６に記載の微生物の使用。
【００８６】９． オイゲノールヒドロキシラーゼの存
在下で反応が行われることを特徴とする、オイゲノール
からのコニフェリルアルコールの製造方法。
在下で反応が行われることを特徴とする、オイゲノール
からのコニフェリルアルコールの製造方法。
【００８７】１０． コニフェリルアルコールデヒドロ
ゲナーゼの存在下で反応が行われることを特徴とする、
コニフェリルアルコールからのコニフェリルアルデヒド
の製造方法。
ゲナーゼの存在下で反応が行われることを特徴とする、
コニフェリルアルコールからのコニフェリルアルデヒド
の製造方法。
【００８８】１１． コニフェリルアルデヒドデヒドロ
ゲナーゼの存在下で反応が行われることを特徴とする、
コニフェリルアルデヒドからのフェルラ酸の製造方法。
ゲナーゼの存在下で反応が行われることを特徴とする、
コニフェリルアルデヒドからのフェルラ酸の製造方法。
【００８９】１２． フェルラ酸デアシラーゼの存在下
で反応が行われることを特徴とする、フェルラ酸からの
バニリンの製造方法。
で反応が行われることを特徴とする、フェルラ酸からの
バニリンの製造方法。
【００９０】１３． バニリンデヒドロゲナーゼの存在
下で反応が行われることを特徴とする、バニリンからの
バニリン酸の製造方法。
下で反応が行われることを特徴とする、バニリンからの
バニリン酸の製造方法。
【００９１】
【００９２】
【表１】
【００９３】
【表２】
【００９４】
【表３】
【００９５】
【表４】
【００９６】
【表５】
【００９７】
【表６】
【００９８】
【表７】
【００９９】
【表８】
【０１００】
【表９】
【０１０１】
【表１０】
【０１０２】
【表１１】
【０１０３】
【表１２】
【０１０４】
【表１３】
【０１０５】
【表１４】
【０１０６】
【表１５】
【０１０７】
【表１６】
【０１０８】
【表１７】
【０１０９】
【表１８】
【０１１０】
【表１９】
【０１１１】
【表２０】
【０１１２】
【表２１】
【０１１３】
【表２２】
【０１１４】
【表２３】
【０１１５】
【表２４】
【０１１６】
【表２５】
【０１１７】
【表２６】
【０１１８】
【表２７】
【０１１９】
【表２８】
【０１２０】
【表２９】
【０１２１】
【表３０】
【０１２２】
【表３１】
【０１２３】
【表３２】
【０１２４】
【表３３】
【０１２５】
【表３４】
【０１２６】
【表３５】
【０１２７】
【表３６】
【０１２８】
【表３７】
【０１２９】
【表３８】
【０１３０】
【表３９】
【０１３１】
【表４０】
【０１３２】
【表４１】
【０１３３】
【表４２】
【０１３４】
【表４３】
【０１３５】
【表４４】
【０１３６】
【表４５】
【０１３７】
【表４６】
【０１３８】
【表４７】
【０１３９】
【表４８】
【０１４０】
【表４９】
【０１４１】
【表５０】
【０１４２】
【表５１】
【０１４３】
【表５２】
【０１４４】
【表５３】
【０１４５】
【表５４】
【０１４６】
【表５５】
【０１４７】
【表５６】
【０１４８】
【表５７】
【０１４９】
【表５８】
【０１５０】
【表５９】
【０１５１】
【表６０】
【０１５２】
【表６１】
【０１５３】
【表６２】
【０１５４】
【表６３】
【０１５５】
【表６４】
【０１５６】
【表６５】
【０１５７】
【表６６】
【０１５８】
【表６７】
【０１５９】
【表６８】
【０１６０】
【表６９】
【０１６１】
【表７０】
【０１６２】
【表７１】
【０１６３】
【表７２】
【０１６４】
【表７３】
【０１６５】
【表７４】
【０１６６】
【表７５】
【０１６７】
【表７６】
【０１６８】
【表７７】
【０１６９】
【表７８】
【０１７０】
【表７９】
【０１７１】
【表８０】
【０１７２】
【表８１】
【０１７３】
【表８２】
【０１７４】
【表８３】
【０１７５】
【表８４】
【０１７６】
【表８５】
【０１７７】
【表８６】
【０１７８】
【表８７】
【０１７９】
【表８８】
【０１８０】
【表８９】
【０１８１】
【表９０】
【０１８２】
【表９１】
【０１８３】
【表９２】
【０１８４】
【表９３】
【０１８５】
【表９４】
【０１８６】
【表９５】
【０１８７】
【表９６】
【図１】クローン化されたフラグメント、サブフラグメ
ント、及びシークエンスされた領域を示す。
ント、及びシークエンスされた領域を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｐ 7/40 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ユルゲン・ラベンホルスト ドイツ37671ヘクスター・ベゼルブリツク 13
Claims (12)
- 【請求項１】 オイゲノールからのコニフェリルアルコ
ール、コニフェリルアルデヒド、フェルラ酸、バニリン
及びバニリン酸の製造のための合成用酵素。 - 【請求項２】 請求項１に記載の酵素をコードしている
ＤＮＡ、並びにその部分配列及び機能的同等物。 - 【請求項３】 請求項２に記載のＤＮＡを含んでいるコ
スミドクローン。 - 【請求項４】 請求項２に記載のＤＮＡを含んでいるベ
クター。 - 【請求項５】 請求項２に記載のＤＮＡで形質転換され
た微生物。 - 【請求項６】 微生物の形質転換のための、請求項２に
記載のＤＮＡの使用。 - 【請求項７】 コニフェリルアルコール、コニフェリル
アルデヒド、フェルラ酸、バニリン及びバニリン酸の製
造のための、請求項５に記載の微生物の使用。 - 【請求項８】 オイゲノールヒドロキラーゼの存在下で
反応が行われることを特徴とする、オイゲノールからの
コニフェリルアルコールの製造方法。 - 【請求項９】 コニフェリルアルコールデヒドロゲナー
ゼの存在下で反応が行われることを特徴とする、コニフ
ェリルアルコールからのコニフェリルアルデヒドの製造
方法。 - 【請求項１０】 コニフェリルアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼの存在下で反応が行われることを特徴とする、コニ
フェリルアルデヒドからのフェルラ酸の製造方法。 - 【請求項１１】 フェルラ酸デアシラーゼの存在下で反
応が行われることを特徴とする、フェルラ酸からのバニ
リンの製造方法。 - 【請求項１２】 バニリンデヒドロゲナーゼの存在下で
反応が行われることを特徴とする、バニリンからのバニ
リン酸の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19649655.1 | 1996-11-29 | ||
| DE19649655A DE19649655A1 (de) | 1996-11-29 | 1996-11-29 | Syntheseenzyme für die Herstellung von Coniferylalkohol, Coniferylaldehyd, Ferulasäure, Vanillin und Vanillinsäure und deren Verwendung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10155496A true JPH10155496A (ja) | 1998-06-16 |
Family
ID=7813219
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9343875A Pending JPH10155496A (ja) | 1996-11-29 | 1997-11-28 | コニフエリルアルコール、コニフエリルアルデヒド、フエルラ酸、バニリン及びバニリン酸の製造のための合成用酵素、並びにこれらの使用 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6524831B2 (ja) |
| EP (1) | EP0845532A3 (ja) |
| JP (1) | JPH10155496A (ja) |
| DE (1) | DE19649655A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999049068A1 (fr) * | 1998-03-24 | 1999-09-30 | Chisso Corporation | Procede de production de 1-substitues-3-methoxy-4-oxybenzenes |
| JP2015535181A (ja) * | 2012-11-05 | 2015-12-10 | エヴォルヴァ エスアー．Ｅｖｏｌｖａ Ｓａ． | バニリンシンターゼ |
| JP2016540522A (ja) * | 2013-11-04 | 2016-12-28 | ビージーエヌ テック エルエルシーＢｇｎ Ｔｅｃｈ Ｌｌｃ | 植物デヒドロゲナーゼを用いるオイゲノールからのフェルラ酸の微生物発酵を介してバニリンを製造する方法 |
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|---|---|---|---|---|
| GB9606187D0 (en) | 1996-03-23 | 1996-05-29 | Inst Of Food Research | Production of vanillin |
| DE19850242A1 (de) * | 1998-10-31 | 2000-05-04 | Haarmann & Reimer Gmbh | Konstruktion von Produktionsstämmen für die Herstellung von substituierten Phenolen durch gezielte Inaktivierung von Genen des Eugenol- und Ferulasäure-Katabolismus |
| DE19928158C2 (de) * | 1999-06-19 | 2003-09-04 | Haarmann & Reimer Gmbh | Verfahren zur Herstellung von aromatischen Carbonylverbindungen aus Styrolen |
| DE19960106A1 (de) * | 1999-12-14 | 2001-06-21 | Haarmann & Reimer Gmbh | Enzyme und Gene für die Herstellung von Vanillin |
| KR101163542B1 (ko) | 2010-02-05 | 2012-07-06 | 광주과학기술원 | 이소유제놀로부터 생물전환된 바닐린 제조방법 |
| GB201507170D0 (en) | 2015-04-24 | 2015-06-10 | Givaudan Sa | Process |
| GB201507207D0 (en) | 2015-04-24 | 2015-06-10 | Givaudan Sa | Enzymes and applications thereof |
| GB201618090D0 (en) | 2016-10-26 | 2016-12-07 | Givaudan Sa | Product |
| GB201917694D0 (en) | 2019-12-04 | 2020-01-15 | Givaudan Sa | Enzyme mediated process |
| GB201917688D0 (en) | 2019-12-04 | 2020-01-15 | Givaudan Sa | SHC enzymes and enzyme variants |
| CN111019995B (zh) | 2019-12-31 | 2021-04-27 | 厦门欧米克生物科技有限公司 | 一种以丁香酚为底物发酵生成香兰素的方法 |
| GB202005468D0 (en) | 2020-04-15 | 2020-05-27 | Givaudan Sa | Enzyme-media process |
| EP4613868A3 (en) | 2020-09-02 | 2025-12-17 | International Flavors & Fragrances Inc. | Squalene hopene cyclase derivatives and use thereof for producing ambrox |
| EP4032900A1 (en) * | 2021-01-21 | 2022-07-27 | Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen | New enzymes and methods for vanillic acid-related metabolic pathways |
| IL312203A (en) | 2021-10-21 | 2024-06-01 | Givaudan Sa | Improved methods and enzymes |
| CN119137269A (zh) | 2022-03-17 | 2024-12-13 | 奇华顿股份有限公司 | Shc酶和酶变体 |
| CN116948833A (zh) * | 2022-04-18 | 2023-10-27 | 上海凯赛生物技术股份有限公司 | 一种宛氏拟青霉及其应用 |
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| DE3920039A1 (de) | 1989-06-20 | 1991-01-03 | Haarmann & Reimer Gmbh | Verfahren zur herstellung von natuerlichem vanillin |
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| EP0542348B1 (en) | 1991-11-11 | 1997-06-18 | Quest International B.V. | Process for the preparation of phenylaldehydes |
| US5712132A (en) | 1992-07-24 | 1998-01-27 | V. Mane Fils S.A. | Method for the enzymatic preparation of aromatic substances |
| FR2694020B1 (fr) * | 1992-07-24 | 1994-10-14 | Mane Fils Sa V | Procédé de préparation de substances aromatiques par voie enzymatique. |
| DE4227076A1 (de) * | 1992-08-17 | 1994-02-24 | Haarmann & Reimer Gmbh | Verfahren zur Herstellung substituierter Methoxyphenole und dafür geeignete Mikroorganismen |
| US5721125A (en) * | 1993-07-06 | 1998-02-24 | Quest International B.V. | Enzymatic process for producing 4-hydroxy-cinnamyl alcohols |
| DE19532317A1 (de) * | 1995-09-01 | 1997-03-06 | Haarmann & Reimer Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Vanillin und dafür geeignete Mikroorganismen |
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- 1996-11-29 DE DE19649655A patent/DE19649655A1/de not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-11-17 EP EP97120058A patent/EP0845532A3/de not_active Withdrawn
- 1997-11-21 US US08/976,063 patent/US6524831B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-11-28 JP JP9343875A patent/JPH10155496A/ja active Pending
-
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- 2000-12-28 US US09/750,986 patent/US20030228670A1/en not_active Abandoned
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|---|---|
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| EP0845532A3 (de) | 2000-01-05 |
| DE19649655A1 (de) | 1998-06-04 |
| EP0845532A2 (de) | 1998-06-03 |
| US20030228670A1 (en) | 2003-12-11 |
| US20020182697A1 (en) | 2002-12-05 |
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