JPH10165184A

JPH10165184A - 抗体、遺伝子及びキメラ抗体の製法

Info

Publication number: JPH10165184A
Application number: JP8335743A
Authority: JP
Inventors: Kenji Miyata; 堅司宮田; Masayuki Anzai; 政幸安斎; Katsumi Shigeta; 勝美繁田
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1996-12-16
Filing date: 1996-12-16
Publication date: 1998-06-23

Abstract

(57)【要約】【課題】シアル酸およびフコースを含む構造を認識する
抗体をコードする遺伝子などを提供する。【解決手段】シアル酸及びフコースを含む構造を認識す
る抗体のＨ鎖Ｖ領域またはＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝
子を、キメラ抗体発現プラスミドに挿入し、該プラスミ
ドで形質転換した宿主を培養し、生産された抗体を回収
することにより、キメラ抗体を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、シアル酸及びフコ
ースを含む構造を認識する抗体の遺伝子等に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】癌細胞が産生する特異的な糖鎖を認識す
る抗体は、癌の血清診断に利用されている（屋嘉比ら，
最新検査２巻，ｐ６１，１９８４年）。癌特異的な糖
鎖を認識する抗体は、癌細胞（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉら，
ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌＧｅｎｅｔ，５巻，ｐ９５
７，１９７９年）、組織抽出複合糖質（特開平２−１０
４２９４号）または合成糖鎖（特開平３−２８０８９４
号）を抗原としてマウス等に免疫し、ハイブリドーマを
作製し、モノクローナル化することにより作製される。
この様にして得られるモノクローナル抗体は抗原との結
合性、親和性に基づいて特徴づけられる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】胎児期に消化管上皮細
胞で発現し胎便中に排出される糖鎖は、癌細胞膜上に発
現される糖鎖に構造が類似しており、シアル酸およびフ
コースを含む構造であるといわれている。したがって、
シアル酸およびフコースを含む構造を認識する抗体は、
癌関連性の抗原を認識することが期待される。又シアル
酸を含む糖鎖を持つ抗原は血中から消失しにくいので、
それを認識する抗体は、血清診断への応用が期待され
る。

【０００４】従って本発明は、シアル酸およびフコース
を含む構造を認識する抗体をコードする遺伝子などを提
供することを目的とするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
に鑑みて、シアル酸およびフコースを含む構造を認識す
る抗体のＶ領域をコードする遺伝子について鋭意検討を
重ねた結果、本発明に到達した。

【０００６】即ち本発明は、シアル酸及びフコースを含
む構造を認識する抗体のＨ鎖Ｖ領域またはＬ鎖Ｖ領域を
コードすることを特徴とする遺伝子である。また本発明
は、配列番号１又は２のアミノ酸配列で表されることを
特徴とする抗体のＨ鎖Ｖ領域またはＬ鎖Ｖ領域である。
さらに本発明は、上述の遺伝子をキメラ抗体発現プラス
ミドに挿入し、該プラスミドで形質転換した宿主を培養
し、生産された抗体を回収することを特徴とするキメラ
抗体の製法である。以下、本発明をさらに詳細に説明す
る。

【０００７】本発明による遺伝子は、シアル酸及びフコ
ースを含む構造を認識する抗体のＨ鎖Ｖ領域またはＬ鎖
Ｖ領域をコードする物である。シアル酸及びフコースを
含む糖鎖抗原として、例えばシアリルルイスａ抗原、シ
アリルルイスｘ抗原などがあげられるが、これらに限定
されるものではない。これらは、癌細胞膜上に発現され
る糖鎖に構造が類似しているといわれ、胎便より抽出す
ることができる。酸性糖脂質を胎便より抽出する方法に
は特に限定はなく、各種溶媒による抽出、カラムクロマ
トグラフィーによる精製などを適宜採用すればよい。

【０００８】そのようなシアル酸及びフコースを含む構
造を認識する抗体としては特に限定なく、常法により調
製することができる。一例をあげると、特開平２−１０
４２９４号公報に記載のハイブリドーマ２Ｄ３が産生す
る抗体を例示することができる。

【０００９】このような抗体のＨ鎖Ｖ領域またはＬ鎖Ｖ
領域をコードする遺伝子としては特に限定はないが、例
えばそのような抗体を産生するハイブリドーマからｍＲ
ＮＡを抽出し、常法によりｃＤＮＡに変換した後、ＰＣ
ＲなどによりそのＤＮＡを増幅することにより調製する
ことができる。例えばハイブリドーマ２Ｄ３が産生する
抗体のＨ鎖Ｖ領域またはＬ鎖Ｖ領域の遺伝子配列とし
て、配列番号１または２で表される塩基配列を例示する
ことができる。またこの塩基配列から抗体のＨ鎖Ｖ領域
またはＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列を推定することがで
き、例えば、ハイブリドーマ２Ｄ３が産生する抗体のＨ
鎖Ｖ領域またはＬ鎖Ｖ領域としては、配列番号１または
２で表されるアミノ酸配列を例示することができる。さ
らに配列番号１または２で表されるアミノ酸配列をコー
ドする核酸配列もまた本願の発明に含まれるものであ
る。

【００１０】このような本発明の遺伝子を用いて、キメ
ラ抗体を製造することができる。例えば本発明の遺伝子
をキメラ抗体を発現しうるプラスミドに挿入し、該プラ
スミドで宿主を形質転換し、その宿主を培養し、生産さ
れたキメラ抗体を回収すればよい。これらの具体的条件
については、特に限定はなく、常法により行うことがで
きる。

【００１１】

【実施例】以下、本発明を更に詳細に説明するために実
施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。

【００１２】実施例１２Ｄ３細胞抗体遺伝子の単離特開平２−１０４２９４号公報に従い、胎便より抽出さ
れた酸性糖脂質を免疫原としてハイブリドーマ２Ｄ３を
作製した。ＲＰＭＩ１６４０（ギブコ製）で培養した
１×１０⁶個のハイブリドーマ２Ｄ３細胞から、ｍＲＮ
Ａ抽出キット（ファルマシア製）により、２Ｄ３細胞の
ｍＲＮＡを調製し、常法に従ってｃＤＮＡに変換した。

【００１３】次に、このｃＤＮＡを鋳型とし、オリゴヌ
クレオチドプライマーＶＨ１ＢＡＣＫ；配列番号３、及
びＶＨＦＯＲ２ＳＡＬ１；配列番号４の塩基配列を用い
てポリメレースチェーンリアクション（ＰＣＲ）を行
い、抗体のＨ鎖のＶ領域をコードするＤＮＡ断片を増幅
し、制限酵素ＳｍａＩで消化したプラスミドｐＵＣ１９
に挿入した。一方、同ｃＤＮＡを鋳型とし、オリゴヌク
レオチドプライマーＶκ１ＢＡＣＫ；配列番号５、及び
Ｖκ１ＦＯＲ；配列番号６の塩基配列を用いてＰＣＲを
行って、抗体のＬ鎖のＶ領域をコードするＤＮＡ断片を
増幅し、制限酵素ＳｍａＩで消化したプラスミドｐＵＣ
１９に挿入した。

【００１４】実施例２２Ｄ３細胞抗体遺伝子の塩基配
列の決定実施例１で作製したプラスミドｐＵＣ１９にクローニン
グしたＨ鎖のＶ領域及びＬ鎖のＶ領域をコードする塩基
配列を、蛍光ＤＮＡシーケンサＭｏｄｅｌ３７３Ａ（ア
プライドバイオシステム）、Ｔａｑダイターミネーター
サイクルシークエンシングキット（アプライドバイオシ
ステム）を使用し決定した。Ｈ鎖及びＬ鎖の各Ｖ領域の
塩基配列及び当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列
を、それぞれ配列番号１及び配列番号２に示す。

【００１５】実施例３マウス・ヒトキメラ抗体の作製実施例１で作製したＨ鎖のＶ領域をクローニングしたｐ
ＵＣ１９を制限酵素ＰｓｔＩ及びＳａｌＩで消化し、消
化後のＤＮＡ断片を、制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ及びＳ
ａｌＩで消化したキメラ抗体Ｈ鎖発現プラスミドｐＥｄ
ＨＣＧ１（特開平８−５１９９５号公報参照）に挿入し
て、ｐＥｄＨＣＧ１−２Ｄ３を構築した。実施例１で作
製したＬ鎖のＶ領域をクローニングしたｐＵＣ１９を制
限酵素ＰｖｕＩＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、消化後のＤ
ＮＡ断片を、制限酵素ＰｖｕＩＩ及びＢｃｌＩで消化し
たキメラ抗体Ｌ鎖発現プラスミドｐＥｄＨＣκ（特開平
８−５１９９５号公報参照）に挿入して、ｐＥｄＨＣκ
−２Ｄ３を構築した。尚ここで使用したプラスミドは、
マウス・ヒトキメラ抗体を培養上清中に産生することを
特徴とするものである。

【００１６】ＣＯＳ細胞での一過性発現を以下の手順で
確認した。ｐＥｄＨＣＧ１−２Ｄ３及びｐＥｄＨＣκ−
２Ｄ３を、リン酸カルシウム法によりＣＯＳ細胞にコト
ランスフェクションし、３日後に培養上清を回収した。
同様の操作をＤＮＡ無しで行い、回収した培養上清を対
照として用いた。回収した培養上清中のキメラ抗体価を
測定した。

【００１７】培養上清中のキメラ抗体価の測定は以下の
如くして行った。抗ヒトＩｇＧ１抗体を固相化した９６
穴イムノプレートを０. ５％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生
理食塩水（ＰＢＳ）でブロッキングを行った。ＰＢＳで
プレートを洗浄後、培養上清１００μｌを加え２時間室
温に静置した。ＰＢＳでプレートを洗浄後、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇκ抗体を加
え２時間室温で静置した。ＰＢＳでプレートを洗浄後、
市販の発色試薬（ＡＢＴＳ、大日本製薬（株）製）を加
え、発色の程度を市販の測定装置（マイクロタイタープ
レートリーダーＭＰＲ４ｉ、東ソー（株）製）で測定し
た。その結果、培養上清中に約４０ｎｇ／ｍｌのキメラ
抗体が産生されていることがわかった。

【００１８】実施例４シアリルルイスａ抗原への反応
性実施例３で回収したコトランスフェクションしたＣＯＳ
細胞培養上清がシアル酸及びフコ−スを含む構造を認識
することを以下の操作で確認した。対照試料としては、
実施例３で用いたＤＮＡを導入していないＣＯＳ細胞の
培養上清及び抗Ｔ３キメラ抗体を約６０ｎｇ／ｍｌ含む
ＣＯＳ細胞培養上清を用いた。

【００１９】シアリルルイスａ抗原を固相化した９６穴
イムノプレ−トを０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッ
キングを行った。ＰＢＳでプレ−トを洗浄後培養上清１
００μｌを加え２時間室温に静置した。ＰＢＳでプレ−
トを洗浄後、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇκ抗体を加え２時間
室温で静置した。ＰＢＳでプレ−トを洗浄後ＡＢＴＳを
加え、発色の程度をマイクロタイタ−プレ−トリ−ダ−
ＭＰＲ４ｉで測定した。結果を図１に示す。縦軸は４１
５ｎｍでの吸光度を、横軸はシアリルルイスａ抗原の濃
度（ｎｇ／ウエル）の対数値をそれぞれ示す。図中、黒
丸はキメラ抗体を、白丸は対照を示す。その結果、本キ
メラ抗体はシアル酸及びフコ−スを含むシアリルルイス
ａ抗原に結合した。

【００２０】

【発明の効果】本発明で提供される、シアル酸およびフ
コースを含む構造を認識する抗体のＨ鎖のＶ領域および
Ｌ鎖のＶ領域をコードする遺伝子を、キメラ抗体発現プ
ラスミドに挿入し、該プラスミドで形質転換した宿主を
培養することにより、シアル酸およびフコースを含む構
造を認識する抗体を大量に生産することが可能である。

【００２１】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：３４５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ起源セルライン：ハイブリドーマ２Ｄ３配列 GTC CAG CTG CAG GAG TCT GGA GGA GGC TTG GTG CAA CCT GGA GGA 45 Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 TCC ATG AAA CTC TCT TGT GCT GCC TCT GGA TTC ACT TTT AGT GAC 90 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp 20 25 30 GCC TGG ATG GAC TGG GTC CGC CAG TCT CCA GAG AAG GGG CTT GAG 135 Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu 35 40 45 TGG GTT GCT GAA ATT TAT AAC AAA GCT GGT AAT CAT GCA ACA TTC 180 Trp Val Ala Glu Ile Tyr Asn Lys Ala Gly Asn His Ala Thr Phe 50 55 60 TAT GCT GAG TCT GGG AAA GGG AGG TTC ACC ATC TCA AGA GAT GAT 225 Tyr Ala Glu Ser Gly Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp 65 70 75 TCC AAA AGT AGT GTC TAC CTG CAA ATG AAC AGC TTG AGA GCT GAA 270 Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 80 85 90 GAC GCT GGC ATT TAT TAC TGT ACC TCC CGG TTT GCT TAC TGG GGC 315 Asp Ala Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Ser Arg Phe Ala Tyr Trp Gly 95 100 105 CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GCG 345 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 110 115 。

【００２２】配列番号：２配列の長さ：３１８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ起源セルライン：ハイブリドーマ２Ｄ３配列 GAC ATT CAG CTG ACC CAG TCT CCA TCT TCC ATG TAT GCA TCT CTA 45 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu 1 5 10 15 GGA GAG AGA GTC ACT ATC ACT TGC AAG GCG AGT CAG GAC ATT AAT 90 Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn 20 25 30 AGG TAT TTA AGC TGG TTC CAG CAT AAA CCA GGG AAA TCT CCT AAG 135 Ser Tyr Leu Ser Trp Phe Gln His Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys 35 40 45 ACC CTG ATC TAT CGT GCA AAC AGA TTG GTA GAT GGG GTC CCA TCA 180 Thr Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser 50 55 60 AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG CAA GAT TAT TCT CTC ACC ATC 225 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile 65 70 75 AGC AGC CTG GAG TAT GAA GAT ATG GGA ATT TAT TAC TGT CTA CAG 270 Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln 80 85 90 TAT GAT GAG TCT CCT CGG ACG TTC GGT GGA GGG ACC AAG CTG GAG 315 Tyr Asp Glu Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105 ATC 318 Ile 106 。

【００２３】配列番号：３配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGGTSMARCT GCAGSAGTCW GG 22 。

【００２４】配列番号：４配列の長さ：４６配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GGGGGTCGAC GCTGAGGAGA CGGTGACCGT GGTCCCTTGG CCCCAC 46 。

【００２５】配列番号：５配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GACATTCAGC TGACCCAGTC TCCA 24 。

【００２６】配列番号：６配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GTTAGATCTC CAGCTTGGTC CC 22 。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例４で行った、キメラ抗体とシアリルルイ
スａ抗原との反応性を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】シアル酸及びフコースを含む構造を認識す
る抗体のＨ鎖Ｖ領域またはＬ鎖Ｖ領域をコードすること
を特徴とする遺伝子。
【請求項２】請求項１において、シアル酸及びフコース
を含む構造が、酸性糖脂質中に存在することを特徴とす
る遺伝子。
【請求項３】請求項２において、酸性糖脂質が胎便より
抽出されることを特徴とする遺伝子。
【請求項４】請求項１〜３いずれかの項において、配列
番号１又は２のアミノ酸配列をコードすることを特徴と
する遺伝子。
【請求項５】請求項１〜４いずれかの項において、配列
番号１又は２の塩基配列で表されることを特徴とする遺
伝子。
【請求項６】配列番号１又は２のアミノ酸配列で表され
ることを特徴とする抗体のＨ鎖Ｖ領域またはＬ鎖Ｖ領
域。
【請求項７】請求項１〜５いずれかの項に記載の遺伝子
をキメラ抗体発現プラスミドに挿入し、該プラスミドで
形質転換した宿主を培養し、生産された抗体を回収する
ことを特徴とするキメラ抗体の製法。