ES2287936T3 - Identificacion, purificacion y usos de leczimas y ligandos de carbohidratos. - Google Patents
Identificacion, purificacion y usos de leczimas y ligandos de carbohidratos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2287936T3 ES2287936T3 ES95943382T ES95943382T ES2287936T3 ES 2287936 T3 ES2287936 T3 ES 2287936T3 ES 95943382 T ES95943382 T ES 95943382T ES 95943382 T ES95943382 T ES 95943382T ES 2287936 T3 ES2287936 T3 ES 2287936T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- leczyme
- ligand
- heavy chain
- hla
- carbohydrate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 title abstract description 187
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title abstract description 170
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 title description 169
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 96
- 208000018565 Hemochromatosis Diseases 0.000 claims abstract description 39
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 29
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 claims description 28
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 claims description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 9
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 8
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 101000993059 Homo sapiens Hereditary hemochromatosis protein Proteins 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 102100028966 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain F Human genes 0.000 claims description 5
- 101000986080 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain F Proteins 0.000 claims description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 5
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 claims description 4
- 102100028967 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Human genes 0.000 claims description 4
- 108010024164 HLA-G Antigens Proteins 0.000 claims description 4
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 claims description 4
- 102100028970 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Human genes 0.000 claims description 3
- -1 HLA-J Proteins 0.000 claims description 3
- 101000986085 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Proteins 0.000 claims description 3
- 101000866971 Homo sapiens Putative HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain H Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 claims description 2
- 102100031498 Putative HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain H Human genes 0.000 claims 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 45
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 45
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 45
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 44
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 32
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 27
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 27
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 abstract description 15
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 15
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 abstract description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 133
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 111
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 70
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 47
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 36
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 34
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 34
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 29
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 27
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 27
- 230000006870 function Effects 0.000 description 23
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 22
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 19
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 16
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 16
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 16
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 15
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 15
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 15
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 13
- 108700005089 MHC Class I Genes Proteins 0.000 description 12
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 11
- 206010065973 Iron Overload Diseases 0.000 description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 7
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 5
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 5
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 5
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 5
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 230000010438 iron metabolism Effects 0.000 description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 5
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 4
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 4
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 4
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 4
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 4
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 4
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 4
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 210000001630 jejunum Anatomy 0.000 description 4
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- 102000000340 Glucosyltransferases Human genes 0.000 description 3
- 108010055629 Glucosyltransferases Proteins 0.000 description 3
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 3
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 3
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 3
- 102000054496 human HFE Human genes 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 2
- 108010046068 N-Acetyllactosamine Synthase Proteins 0.000 description 2
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009056 active transport Effects 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- YPJCVYYCWSFGRM-UHFFFAOYSA-H iron(3+);tricarbonate Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].[O-]C([O-])=O.[O-]C([O-])=O.[O-]C([O-])=O YPJCVYYCWSFGRM-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 235000000891 standard diet Nutrition 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 1
- 241001244729 Apalis Species 0.000 description 1
- 206010002961 Aplasia Diseases 0.000 description 1
- 208000036487 Arthropathies Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 1
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 231100000023 Cell-mediated cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 206010057250 Cell-mediated cytotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 208000006313 Delayed Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 240000002989 Euphorbia neriifolia Species 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 101001035782 Gallus gallus Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 description 1
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010086377 HLA-A3 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010048896 HLA-D Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000009485 HLA-D Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010010378 HLA-DP Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000015789 HLA-DP Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010062347 HLA-DQ Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 102100031180 Hereditary hemochromatosis protein Human genes 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 1
- 101000930801 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101000829958 Homo sapiens N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyl-transferase Proteins 0.000 description 1
- 208000028958 Hyperferritinemia Diseases 0.000 description 1
- 206010058359 Hypogonadism Diseases 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010022971 Iron Deficiencies Diseases 0.000 description 1
- 208000016286 Iron metabolism disease Diseases 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 101710141452 Major surface glycoprotein G Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 101150076359 Mhc gene Proteins 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 102100023315 N-acetyllactosaminide beta-1,6-N-acetylglucosaminyl-transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010069196 Neural Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102100023616 Neural cell adhesion molecule L1-like protein Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 201000011252 Phenylketonuria Diseases 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- QSHWIQZFGQKFMA-UHFFFAOYSA-N Porphobilinogen Natural products NCC=1NC=C(CCC(O)=O)C=1CC(O)=O QSHWIQZFGQKFMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 description 1
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 101000582398 Staphylococcus aureus Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 101150036021 Tl gene Proteins 0.000 description 1
- 108010019400 Tla antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100031142 Transcriptional repressor protein YY1 Human genes 0.000 description 1
- 101710122472 Transcriptional repressor protein YY1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000019997 adhesion receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010013985 adhesion receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 208000025341 autosomal recessive disease Diseases 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000008619 cell matrix interaction Effects 0.000 description 1
- 230000005890 cell-mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- OEUUFNIKLCFNLN-LLVKDONJSA-N chembl432481 Chemical compound OC(=O)[C@@]1(C)CSC(C=2C(=CC(O)=CC=2)O)=N1 OEUUFNIKLCFNLN-LLVKDONJSA-N 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 206010019692 hepatic necrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 201000003368 hypogonadotropic hypogonadism Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000037427 ion transport Effects 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 231100000149 liver necrosis Toxicity 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229940098006 multigen Drugs 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- YPHQRHBJEUDWJW-UHFFFAOYSA-N porphobilinogen Chemical compound NCC1=NC=C(CCC(O)=O)[C]1CC(O)=O YPHQRHBJEUDWJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 108010038196 saccharide-binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- 239000012475 sodium chloride buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 235000019505 tobacco product Nutrition 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4726—Lectins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Diabetes (AREA)
Abstract
EN DIVERSOS ASPECTOS DE LA PRESENTE INVENCION SE PROPORCIONAN LIGANDOS CARBOHIDRATO Y MIMETOPOS PEPTIDICOS DE DICHOS LIGANDOS QUE SE UNEN ESPECIFICAMENTE A LECZIMAS, ASI COMO SE PROPORCIONAN LECZIMAS QUE SE UNEN ESPECIFICAMENTE A LIGANDOS CARBOHIDRATO Y MIMETOPOS PEPTIDICOS. OTROS ASPECTOS DE LA INVENCION INCLUYEN METODOS PARA IDENTIFICAR, PURIFICAR Y PRODUCIR DICHOS CARBOHIDRATOS, MIMETOPOS Y LECZIMAS, Y EL USO DE DICHAS COMPOSICIONES EN EL TRATAMIENTO DE DIVERSAS ENFERMEDADES Y EN DIFERENTES MODIFICACIONES DE LAS FUNCIONES CELULARES. OTROS ASPECTOS ADICIONALES DE LA INVENCION SE REFIEREN AL DIAGNOSTICO DE DIVERSAS ENFERMEDADES QUE IMPLICAN LIGANDOS CARBOHIDRATO, MIMETOPOS PEPTIDICOS DE DICHOS LIGANDOS Y/O LECZIMAS.
Description
Identificación, purificación y usos de leczimas
y ligandos de carbohidratos.
Esta invención se refiere en general al campo de
la glicobiología.
El complejo mayor de histocompatibilidad (MHC)
codifica para una variedad de productos de genes, muchos de los
cuales tienen un rol central en la defensa del cuerpo contra
organismos patógenos. Tales moléculas incluyen los clásicos
antígenos de trasplantes y moléculas estructuralmente relacionadas,
proteínas para el transporte de péptidos extraños dentro de las
células, proteínas de complemento sérico, las linfocinas necrosis
tumoral \alpha y necrosis tumoral \beta, los citocromos y las
proteínas de shock térmico.
Los antígenos de trasplante clásicos,
codificados por genes en el MHC, son un grupo altamente polimorfo
de moléculas que fueron descubiertas originalmente por su rol en la
determinación del rechazo de tejidos y células extraños
transplantados. Un amplio trabajo experimental ha sostenido desde
entonces un rol para los antígenos de trasplante clásicos en el
auto-reconocimiento. En el paradigma comúnmente
aceptado, denominado a continuación el "viejo paradigma", los
antígenos de trasplante sirven para presentar péptidos derivados
tanto de proteínas propias como extrañas, para el reconocimiento por
las células del sistema inmunológico.
Dos grupos distintos de antígenos, los antígenos
clase I y clase II, son codificados por genes dentro del MHC. Los
antígenos clase I son expresados en prácticamente todas las células
nucleadas en el cuerpo y tienen un rol en la mediación de las
respuestas inmunológicas basadas en la destrucción de células
mediadas por linfocitos (T) citotóxicos derivados del timo. Los
linfocitos T citotóxicos tienen un rol en la destrucción de las
células infectadas por virus y las células tumorales. La molécula de
MHC clase I está compuesta por una cadena pesada de aproximadamente
45 kiloDalton (kDa) asociada en forma no covalente con una proteína
de 12 kDa conocida como microglobulina \beta_{2}
(\beta_{2}M). El viejo paradigma caracteriza a los antígenos
clase I como presentando fragmentos de péptidos derivados tanto de
proteínas propias como extrañas sintetizadas endógenamente dentro
de la célula.
Las moléculas clase I fueron descubiertas por su
rol en los trasplantes y fueron denominadas las moléculas clase I
"clásicas", para distinguirlas de un grupo de moléculas clase I
descubiertas más tarde denominadas las moléculas clase I "no
clásicas". Los genes que codifican las moléculas del MHC clase I
no clásicas consisten en la mayoría de los genes identificados
hasta ahora en el locus de MHC. Las moléculas del MHC clase I no
clásicas están relacionadas en general estructuralmente con los
antígenos de trasplante del MHC clase I clásico porque tienen una
amplia homología de secuencia y una cadena pesada asociada en forma
no covalente con la \beta_{2}M. Las moléculas del MHC clase I
no clásicas son, en general, menos polimorfas que las moléculas del
MHC clase I clásicas y están más circunscriptas en su distribución
tisular. Varios tipos de moléculas clase I no clásicas son
expresadas principalmente en el tracto gastrointestinal (GI),
planteando interrogantes con respecto a su función, si la tienen,
en el sistema inmunológico.
Los antígenos clase II del MHC son expresados
principalmente por células especializadas que presentan antígenos
en el cuerpo. Tales células están limitadas al linfocito B que
produce anticuerpos, así como también macrofágos y células
dendríticas distribuidas en varios tejidos del cuerpo. La molécula
clase II en la superficie celular está compuesta por una cadena
\alpha de 33 kDa y una cadena \beta de 28 kDa asociada en forma
no covalente. Las moléculas clase II, como se entienden bajo el
viejo paradigma, funcionan principalmente para presentar péptidos
derivados de proteínas propias o extrañas a una clase especializada
de linfocitos T que sostiene el desarrollo de linfocitos T
citotóxicos, provee inmunidad con respecto a infecciones fúngicas y
ayuda a los linfocitos B en la generación de respuestas protectoras
de los anticuerpos con respecto a infecciones bacterianas
encapsuladas. Los antígenos clase II del MHC presentan fragmentos de
péptidos derivados de proteínas captadas por células del ambiente
circundante, en contraste con las moléculas clase I clásicas, que
presentan péptidos derivados de proteínas sintetizadas
endógenamente.
Se ha demostrado que una variedad de
enfermedades autoinmunes humanas están asociadas más frecuentemente
en la población con individuos que heredan ciertos genes del MHC.
Para muchas de estas enfermedades, la asociación está localizada en
la región de los antígenos de histocompatibilidad clase II que
codifican el MHC. Estas enfermedades no son heredadas por simple
segregación Mendeliana de genes del MHC, ya que sólo uno de un par
de mellizos idénticos puede tener la enfermedad. Esta característica
sugiere que otros factores genéticos o ambientales tienen roles en
el desarrollo de la autoinmunidad, teniendo los genes del MHC una
parte significativa en el proceso.
El viejo paradigma para la función de los genes
del MHC provee varias teorías para explicar un rol para los genes
del MHC en enfermedades autoinmunes. Estas incluyen la expresión
inapropiada de moléculas del MHC clase II en células que provocan
la respuesta autoinmune response o el reconocimiento aberrante de
auto-péptidos por productos de genes del MHC
particulares. Tales teorías, sin embargo, tienen que ser probadas
aún. Además, el viejo paradigma no provee una hipótesis útil para
explicar la base para una enfermedad de acumulación de hierro
asociada con el MHC conocida como hemocromatosis. De estudios
animales y de la estructura genómica de varios genes clase I se
conoce que esta enfermedad involucra una molécula clase I codificada
por el MHC ya que la eliminación del gen \beta_{2}M en estos
animales da por resultado la enfermedad.
Se divulga en la presente un nuevo paradigma
referido a moléculas que reconocen carbohidratos que incluyen por
lo menos algunos antígenos de clase I, clase II, y otras moléculas
relacionadas, algunas de las cuales son del IgGSF. Este paradigma
sostiene que las moléculas que reconocen a los carbohidratos tienen
una función central para reconocer y modificar estructuras de
carbohidratos. Así, existe una necesidad de desarrollar nuevas
propuestas para el tratamiento de enfermedades asociadas con el MHC
y otras enfermedades que involucran problemas con reconocimiento de
carbohidratos, y en particular, una necesidad de proveer una
composición, un aparato y métodos para utilizar el nuevo
paradigma.
En un aspecto de la invención, la hemocromatosis
puede ser diagnosticada detectando una mutación en una molécula del
MHC clase I que reduce su capacidad para asociarse con la
microglobulina \beta_{2}.
Como se usa en la presente, "leczima"
significa cualquier proteína celular que puede catalizar la
modificación química de un substrato que contiene carbohidratos,
dando por resultado un producto con carbohidrato adicional o
carbohidrato químicamente modificado, y que luego es capaz de
reconocer específicamente el substrato modificado. El término
"leczime" se deriva de la combinación de tener la actividad
ligante de lectina y la actividad enzimática en la misma molécula
base. La función de la leczima es característica de muchas moléculas
de reconocimiento de péptidos que son bien conocidas en el arte.
Tales moléculas incluyen por lo menos algunas de las moléculas
codificadas por el MHC clase I y clase II, junto con otros miembros
de la superfamilia de moléculas de genes de inmunoglobulina
(IgGSF), algunas de las cuales no son moléculas de
auto-reconocimiento. Leczimas ilustrativas incluyen
aquellas que catalizan la fosforilación, la acetilación, la
carboxilación y/o la sulfación de una molécula que contiene
carbohidratos. Las leczimas pueden funcionar dentro de una célula,
en la superficie celular, o pueden ser segregadas de una
célula.
célula.
Una leczima puede presentar actividad enzimática
y actividad ligante de carbohidratos en la misma isoforma de la
molécula o estas actividades pueden encontrarse separadamente en
diferentes isoformas de la molécula. Por ejemplo, un corte y
empalme de ARN diferencial de una leczima puede dar por resultado
una isoforma enzimáticamente activa de la leczima que contiene una
o más señales que dirigen a la leczima a sitios en la célula
normalmente asociados con glucosilación, tales como el retículo
endoplasmático o el complejo de Golgi. El corte y empalme de ARN
diferencial también puede dar por resultado una isoforma de la
leczima que presenta capacidad de reconocimiento de carbohidratos y
contiene una o más señales que dirigen el receptor a la superficie
celular o para salir de la célula. Alternativamente, una leczima
expresada o bien en la célula o en la superficie celular puede
contener tanto la actividad enzimática como también la capacidad de
reconocimiento de carbohidratos en la misma molécula.
En las moléculas clase I o clase II, y
posiblemente en otras leczimas, la función de la leczima puede
residir en la ranura formada en la parte superior de la molécula
codificada por el MHC. El viejo paradigma caracteriza la ranura
como una ranura que liga péptidos, pero el nuevo paradigma sostiene
que la ranura funciona principalmente para reconocer una estructura
de carbohidratos y su forma subsiguiente después de la modificación
por la leczima.
Se pueden aislar composiciones de ligandos de
carbohidratos substancialmente purificados que se ligan
específicamente a una leczima. Como se usa en la presente, el
término "ligando de carbohidratos" significa una molécula que
contiene carbohidratos en donde la parte de carbohidrato es una
parte del ligando que es reconocida por la leczima. Un ligando de
carbohidratos está compuesto por uno o más residuos de azúcar que
están ligados en una configuración o bien de cadena recta o de
cadena ramificada. Por lo tanto, un ligando de carbohidratos
incluye un monosacárido, un disacárido, un trisacárido, un
oligosacárido o un polisacárido.
Los ligandos de carbohidratos compuestos por
múltiples residuos de carbohidratos pueden variar en el tipo y la
ubicación de la unión entre cada residuo. Los residuos de
carbohidratos útiles para producir un ligando de carbohidratos
incluyen, por ejemplo, glucosa, galactosa, fucosa, manosa y ácido
siálico. Los residuos de carbohidratos de un ligando también pueden
ser acetilados, fosforilados y/o sulfatados por procedimientos
químicos bien conocidos en el arte. Un ligando de carbohidratos
también puede estar unido químicamente a otras moléculas tales como
un lípido, un glucolípido, una proteína, una glucoproteína, un
proteoglicano, un glucosaminoglicano o una molécula orgánica. Tales
moléculas adicionales pueden proveer al ligando de carbohidratos de
características tales como una mayor ligadura a la leczima o una
mayor estabilidad in vivo.
Un ligando de carbohidratos puede ser de
naturaleza multivalente teniendo más de un ligando de carbohidratos
unido a una estructura del esqueleto. La estructura del esqueleto
puede ser una proteína natural tal como una albúmina sérica o puede
ser una molécula sintética tal como un péptido sintético. Las
propuestas para unir múltiples ligandos de carbohidratos a una
estructura del esqueleto son conocidas en el arte e incluyen, por
ejemplo, la unión biotina-avidina (Rothenberg et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90:
11939-11943 (1993), que se incorpora en la presente
por referencia).
Existen una variedad de leczimas que difieren en
su capacidad para modificar tipos particulares de moléculas. Esta
diferencia resulta en parte de las diferencias en la especificidad
del sitio de ligadura de lectina que tienen las leczimas para su
substrato. Así, una parte de la estructura de la leczima es un sitio
de reconocimiento para el substrato. El sitio catalítico de una
leczima puede ser el mismo sitio que el sitio de reconocimiento del
substrato o puede ser un sitio diferente del sitio de reconocimiento
del substrato. Después de la modificación del substrato, la leczima
puede presentar una afinidad de ligadura similar o mayor por el
substrato modificado que por el substrato original debido a la
ligadura coordinada por el sitio de reconocimiento del substrato y
el sitio catalítico de la leczima o por multivalencia del
ligando.
Las leczimas provistas en la presente incluyen
un amplio grupo de moléculas relacionadas estructuralmente, muchas
de las cuales están contenidas dentro del IgGSF. La serie de genes
de IgGSF comparte una homología de evolución (es decir, un ancestro
común) pero no están relacionadas necesariamente funcionalmente,
ligadas genéticamente o reguladas en forma coordinada. Los
productos del IgGSF han sido definidos por la presencia de una o
más regiones homólogas con respecto a la unidad estructural básica
de la inmunoglobulina (Ig), conocida como la unidad de homología de
Ig. Estas unidades están caracterizadas por una secuencia de
aminoácidos primaria de aprox. 70-100 residuos de
longitud e incluye un puente disulfuro que esencialmente no varía,
que abarca 50-70 residuos de longitud y varios
otros residuos relativamente conservados que mantienen una
estructura terciaria conocida como el pliegue de la Ig (para un
panorama ver Hunkapiller y Hood, Adv. Immunol.,
44:1-63, (1989)).
Los genes del IgGSF codifican muchas moléculas
con función inmunológica conocida, tales como las inmunoglobulinas,
los receptores de linfocitos T, las moléculas del MHC clásicas y no
clásicas, varias moléculas de la superficie celular de los
linfocitos B y los linfocitos T o la \beta_{2}M. Además, el
IgGSF codifica varias moléculas de la superficie celular que se
conoce que funcionan como receptores para la adhesión
célula-célula. Tales moléculas de adhesión
incluyen, por ejemplo, la molécula de adhesión celular neural del
antígeno carcinoembriónico. Por supuesto, estas moléculas del IgGSF
que o bien no modifican la parte de carbohidrato del ligando de
carbohidrato, o que no reconocen el producto modificado no son
leczimas.
Las leczimas del IgGSF incluyen aquellas
codificadas por genes ubicados dentro de la región del MHC. En los
seres humanos, el MHC se encuentra en una banda continua de ADN
ubicada en el brazo corto del cromosoma 6. El MHC completo en los
seres humanos es denominado el complejo HLA. En ratones, el MHC está
ubicado en el cromosoma 17 y contiene los complejos
H-2, Q, T y M. Como se usa en la presente, el
término "producto de gen derivado del MHC" significa cualquier
molécula que contiene por lo menos un polipéptido codificado por un
gen ubicado dentro del MHC. Las leczimas que son productos de genes
derivados del MHC incluyen las moléculas de clase I y de clase II.
Las moléculas de clase I y de clase II que son leczimas en los seres
humanos son codificadas por genes dentro de la región
HLA-D tales como HLA-DP,
HLA-DN, HLA-DM,
HLA-DO, HLA-DQ o
HLA-DR, o los diversos alelos de los loci
HLA-A, HLA-B y
HLA-C, o los genes HLA-X,
HLA-E, HLA-J, HLA-H,
HLA-G y
HLA-F.
HLA-F.
Las leczimas que son moléculas del MHC clase I
contienen una cadena pesada polimorfa de aproximadamente 45 kDa o
una cadena \alpha asociada en forma no covalente con una proteína
pequeña no polimorfa denominada \beta_{2}M. La cadena pesada es
un producto de gen codificado por el MHC ubicado en, o cerca de, las
regiones A, B o C del complejo HLA humano y dentro, o cerca de, las
regiones K o D/L del complejo H-2 del ratón. Aunque
la \beta_{2}M es codificada por un gen ubicado fuera del MHC y
en un cromosoma diferente, la cadena pesada de la molécula clase I
es codificada por un gen ubicado dentro del MHC, incluyendo de este
modo una molécula clase I dentro de la definición de un producto de
gen codificado por el MHC.
Las leczimas que son moléculas del MHC clase II
incluyen aquellos productos de genes derivados del MHC compuestos
por una cadena \alpha de 34 kDa asociada en forma no covalente con
una cadena \beta de 28 kDa. Una cadena adicional denominada la
cadena invariable está asociada transitoriamente con el heterodímero
clase II durante el transporte a la membrana plasmática de la
célula.
Las leczimas pueden ser expresadas en la
superficie celular porque tienen una región transmembrana y una
cola citoplasmática, como en el caso de los antígenos de trasplante
clásicos. Las leczimas también pueden ser ligadas a la superficie
celular de una manera similar a las moléculas clase I no clásicas.
Por ejemplo, muchas de las moléculas Qa y Tia clase I no clásicas
están ligadas a la superficie celular por una unión
fosfatidilinositol (PI), y el producto del gen Q10 parece ser
segregado (Devlin et al., EMBO J. 4:369-374
(1985)). La mayoría de los antígenos Qa y Tia no tienen los exones
citoplasmáticos clase I clásicos incluyendo el sitio de
fosforilación en el exón siete (Thor et al., J. Immunol.,
151:211-224 (1993)), aunque el dominio transmembrana
y el séptimo exón están presentes en los productos de genes Q1 y
Q2.
La cadena pesada de clase I del MHC está
organizada en tres dominios externos (\alpha1, \alpha2 y
\alpha3), cada uno conteniendo aprox. 90 aminoácidos, un dominio
transmembrana de aprox. 40 aminoácidos y un segmento de anclaje
citoplasmático de aprox. 30 aminoácidos. La \beta_{2}M es
similar en tamaño y en organización al dominio externo \alpha3 de
la cadena pesada. El análisis cristalográfico de rayos X de la
parte extracelular de la molécula clase I del MHC muestra que los
dominios \alpha1 y \alpha2 interactúan y son más externos con
respecto a la membrana celular, mientras que los dominios \alpha3
y \beta_{2}M interactúan y están más próximos a la membrana
celular. Los dominios \alpha1 y \alpha2 que interactúan forman
una plataforma que contiene una ranura profunda o hendidura ubicada
en la superficie superior de la molécula.
El viejo paradigma para la función de la
molécula del MHC clase I clásica interpreta la ranura en la parte
superior de la molécula como un sitio de ligadura de péptidos. El
sitio es suficientemente grande como para ligar un péptido de
aprox. 8-20 residuos de longitud y presentar tanto
péptidos derivados propios como extraños para el reconocimiento por
ciertas células linfoides T. Una amplia investigación ha mostrado
que la molécula clase I clásica del MHC puede ligar un péptido de
aproximadamente la longitud de la ranura. Además, el análisis
cristalográfico de rayos X de una molécula clase I clásica
purificada de una célula indicó que había un péptido en la ranura.
Sin embargo, como se describió más arriba, el nuevo paradigma en la
presente invención sostiene que la ranura que liga péptidos de la
molécula del MHC clase I clásica también es adecuada para ligar un
ligando de carbohidratos.
Las leczimas que son una molécula del MHC clase
II incluyen aquellas que comparten características estructurales
significativas con una molécula clase I. La molécula clase II es una
glucoproteína ligada a la membrana que contiene dominios externos,
un segmento transmembrana, y un segmento de anclaje citoplasmático.
La cadena \alpha contiene dos dominios externos marcados \alpha1
y \alpha2 y la cadena \beta contiene dos dominios externos
\beta1 y \beta2. La cristalografía de rayos X muestra que los
dominios \alpha2 y \beta2 interactúan como una estructura
próxima de la membrana análogamente a la interacción del dominio
\alpha3 y el dominio \beta_{2}M de la molécula clase I. Los
dominios \alpha2 y \beta2 de la molécula clase II forman juntos
una hendidura en la parte superior de la molécula que es muy similar
a la hendidura formada por los dominios \alpha2 y \alpha3 de
una cadena pesada de clase I. Una amplia evidencia indica que la
ranura en la molécula clase II puede ligarse y presentar tanto
péptidos propios como extraños para el reconocimiento por las
células T linfoides. Se han aislado péptidos de la molécula clase II
que tienen 13-18 aminoácidos de longitud, levemente
más largos que los péptidos octoméricos o monoméricos aislados
comúnmente de las moléculas clase I clásicas del MHC. Como se
comentó más arriba, el nuevo paradigma de la presente invención
sostiene que la ranura que liga péptidos en la molécula del MHC
clase II, como la ranura en la molécula del MHC clase I clásica,
también es adecuada para ligar un ligando de carbohidratos.
Las leczimas también pueden ser codificadas por
genes clase I no clásicos. En el ratón, los genes que codifican a
las leczimas están ubicados en las regiones Q, T y M del MHC
corriente debajo de los antígenos de histocompatibilidad clásicos.
Hay regiones similares en los seres humanos que codifican para
moléculas clase I no clásicas conocidas tales como
HLA-F y HLA-G. Los genes clase I no
clásicos son en general menos polimorfos que los genes clase I
clásicos y muestran diferentes modelos de expresión. Los genes del
complejo Q, T y M de ratones consisten en aproximadamente 45 genes,
que codifican para los antígenos de diferenciación no polimorfos
con distribución tisular limitada.
Las leczimas conocidas que son moléculas del MHC
clase I no clásicas presentan una distribución tisular limitada en
comparación con las leczimas que son moléculas del MHC clase I
clásicas. Por ejemplo, los antígenos Qa y Tia, los productos de los
genes Q y T, son expresados en subpoblaciones de linfocitos (para un
panorama, ver Flaherty et al. Critical Reviews in
Immunology, 10:131-175 (1990)). Previamente, no se
asignó ninguna función convincente a los productos de genes de
clase I no clásicos, aunque han sido sugeridos como posibles
elementos de restricción para células T \gamma\delta (Hershberg
et al. Proc. Nat. Acad. Sci (USA), 87:9727-31
(1993)). Se ha informado también que los antígenos Qa y TLa son
expresados en el epitelio intestinal (Wu et al., J. Exp.
Med., 174:213-218 (1991); Hershberg et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 9727-97231 (1990);
Wang et al., Immunogenet., 38:370-372 (1993))
en donde su función era desconocida. El nuevo paradigma de la
presente invención sostiene que por lo menos algunas de estas
moléculas clase I no clásicas son leczimas.
La molécula Q2 clase I no clásica, producida por
un gen dentro del MHC de ratón, es un ejemplo de una leczima que
está involucrada en el transporte del hierro (ver Ejemplo I). En
este caso una mucina u otra molécula que contiene carbohidratos
actúa como un quelador de hierro, y a su vez también contiene el
ligando para leczimas expresado del gen Q2. El gen para Q2 está
ubicado en una relación cabeza a cabeza con otro gen que codifica
más probablemente a una mucina. Ambos genes comparten una sola
región promotora, ubicada entre los genes, siendo el promotor
análogo en estructura al promotor de la
\beta-globina involucrado en el metabolismo del
hierro. La regulación coordinada de estos dos genes puede ser
entendida fácilmente en vista de las interacciones ligando/receptor
y receptor/substrato definidas como función leczima en el nuevo
paradigma. Es interesante, que el gen Q2 se distingue de otros
genes de clase I no clásicos por ser altamente polimorfo con
moléculas de Q2 de diferentes cepas de ratones que difieren
significativamente en la secuencia de aminoácidos. A pesar de estas
diferencias, las moléculas de Q2 de cepas separadas de ratones
funcionan todas como un receptor para su producto de gen
corregulado ya que, como una leczima, el Q2 puede modificar
enzimáticamente su ligando/substrato de acuerdo con el
reconocimiento de lectina y la función enzimática de cada producto
de gen Q2 y puede reconocer el producto resultante. Así, la
capacidad enzimática/de reconocimiento combinada de una leczima como
se definió en el nuevo paradigma mantiene las relaciones
receptor/ligando frente a un amplio polimorfismo genético.
Existen leczimas con una variedad de actividades
enzimáticas. Por ejemplo, una leczima puede tener una actividad
enzimática glucosiltransferasa que da por resultado la transferencia
catalítica de un grupo glucosilo (mono o carbohidrato) de un
glucosilnucleótido a una molécula aceptora tal como una proteína, un
carbohidrato o un lípido. Sin embargo, no todas las
glucosiltransferasas son leczimas.
Existe actualmente solo una glucosiltransferasa
(\beta1,4-galactosiltransferasa) que se sabe
previamente que se expresa en el citoplasma y en la célula (para un
panorama ver Shur, Curr. Opin. in Cell Biol.,
5:854-863 (1993)). Esta enzima tiene la capacidad
de reconocimiento de carbohidratos y la actividad catalítica de
carbohidratos y ha sido involucrada en una variedad de
interacciones célula-célula y
célula-matriz. Una característica de la forma
expresada en la superficie celular de la
\beta1,4-galactosiltransferasa es que ya no
retiene más la actividad ligante del producto que genera después de
la modificación enzimática (Miller et al., Nature,
357:590-593 (1992)). Así, esta transferasa
particular no es una leczima porque no presenta el reconocimiento
de su producto enzimático.
Una leczima del IgGSF puede ser codificada por
un gen ubicado fuera del MHC. Por ejemplo, el CD-1
es un producto del gen IgGSF que está relacionado en estructura con
la molécula del MHC clase I, pero la cadena pesada
CD-1 es codificada por un gen fuera del MHC. La
molécula T-6 CD-1 es expresada por
una célula especializada que presenta antígenos en la piel (célula
de Langerhans) y puede ser internalizada en la célula junto con el
antígeno clase II del MHC, indicando una función inmunológica para
T-6.
Se puede preparar una composición que comprende
un ligando de carbohidratos substancialmente purificado que está
ligado específicamente por una leczima. Como se usa en la presente,
el término "substancialmente purificado" significa un ligando
de carbohidratos que está relativamente libre de otras moléculas
contaminantes tales como lípidos, proteínas, ácidos nucleicos,
carbohidratos u otras moléculas que no están asociadas normalmente
con el ligando de carbohidratos. También, como se usa en la
presente, el término "ligado específicamente" significa que
tiene suficiente complementariedad para lograr una concentración de
substrato no ligado en la presencia de suficiente leczima de por lo
menos 10^{-4} molar, y preferentemente 10^{-6} molar o mayor.
Un ligando de carbohidratos substancialmente purificado se puede
obtener, por ejemplo, usando métodos bioquímicos bien conocidos de
purificación de una fuente de carbohidratos o por síntesis química o
enzimática.
Una muestra que contiene un ligando de
carbohidratos substancialmente purificado se puede obtener de una
variedad de fuentes tales como de fluidos, tejidos o células. Estas
fuentes pueden ser de cualquier especie de plantas o cualquier
animal tal como un mamífero o cualquier organismo. Una fuente de
ligando de carbohidratos puede incluir también una célula que ha
sido modificada introduciendo en la célula un vector de expresión
que codifica una leczima o una proteína, la cual cuando es expresada
contiene un ligando de carbohidratos.
Una muestra que contiene un ligando de
carbohidratos se puede obtener de una biblioteca de carbohidratos
producida químicamente. Tales bibliotecas pueden ser preparadas
mezclando carbohidratos de fuentes naturales y de fuentes
producidas enzimáticamente. Además, los carbohidratos individuales
de la biblioteca pueden ser marcados con un marcador detectable tal
como un marcador fluorescente para ayudar a la determinación
estructural del ligando de carbohidratos.
Una muestra que contiene un ligando de
carbohidratos puede ser procesada para purificar adicionalmente el
ligando por métodos bien conocidos en el arte. Tales métodos
incluyen, por ejemplo, purificación de glucoconjugados, marcado de
glucoconjugados por medios químicos o metabólicos, liberación de
carbohidratos de glucoconjugados y caracterización de la estructura
del carbohidrato liberado (ver, por ejemplo, Ausabal et al.,
En "Current Protocols in Molecular Biology", Vol. 2, capítulo
17, (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, Nueva
York, 1994); Fukuda y Kobata, "Glycobiology: A practical
Approach", (IRL Press, Nueva York, 1993), ambos incorporados a
la presente por referencia). Además, estos métodos son útiles para
la caracterización estructural, incluyendo la secuenciación del
ligando de carbohidratos. La elucidación de la estructura de un
ligando de carbohidratos purificado de un tejido o una célula puede
permitir la producción futura del ligando por síntesis química
directa o síntesis enzimática o purificación a partir de una fuente
natural.
Un ligando de carbohidratos que se puede ligar a
una leczima puede ser identificado por varios métodos. En un
método, una muestra que contiene un ligando de carbohidratos se pone
en contacto con una leczima de la que sospecha que se liga al
ligando bajo condiciones adecuadas para permitir la ligadura
específica del ligando a la leczima. Las condiciones adecuadas
incluyen, por ejemplo, una concentración de búfer y un pH y un
tiempo y temperatura apropiados que permiten la ligadura de la
leczima particular y el ligando de carbohidratos. Después de un
período de reacción adecuado, la cantidad de ligando de
carbohidratos ligado a la leczima puede ser determinada, por
ejemplo, adhiriendo una parte detectable tal como un radionúclido o
un marcador fluorescente al ligando de carbohidratos y midiendo la
cantidad de marcador que está asociada con la leczima después que
se ha retirado cualquier ligando de carbohidratos del complejo
ligando-leczima.
Como se usa en la presente, "marcador
detectable" significa una molécula cuya presencia puede ser
detectada debido a una característica física, química o biológica
de la molécula. Los marcadores detectables incluyen, por ejemplo,
radioisótopos, moléculas fluorescentes, sistemas de
enzima/substrato, o moléculas visualmente detectables. Los métodos
para marcar en forma detectable una molécula de carbohidratos son
bien conocidos en el arte, e incluyen, por ejemplo, reducción con
NaB(^{3}H)_{4} o síntesis con carbohidratos
radiomarcados (ver, por ejemplo, Varki, supra, 1994 y
Rothenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 90:
11939-11943 (1993), ambos incorporados a la
presente por referencia, y Fukuda y Kobata, supra 1993).
Además, kits para la preparación de una molécula de carbohidrato
marcada se pueden obtener comercialmente de fuentes tales como
Oxford GlycoSystems (Rosedale,
NY).
NY).
Los métodos para retirar un ligando marcado no
ligado del complejo ligando-leczima pueden depender,
por ejemplo, de la unión de la leczima a un soporte sólido. Los
soportes sólidos útiles en la presente invención y los métodos para
unir las proteínas a tales soportes son bien conocidos en el arte
(ver, por ejemplo, Harlow y Lane, "Antibodies: A laboratory
Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
Nueva York, 1988), que se incorpora a la presente por referencia).
Tales soportes sólidos incluyen, por ejemplo, sefarosa, agarosa o
poliestireno.
Después de un período de reacción adecuado y
después que se ha retirado cualquier marcador no ligado, por
ejemplo, por lavado, la cantidad de marcador adherida al soporte
sólido provee una medición directa de la cantidad de ligando de
carbohidratos unida a la leczima en el soporte. Alternativamente, la
cantidad de ligando de carbohidratos marcado unida al soporte puede
ser determinada indirectamente después del período de reacción
midiendo la cantidad de marcador no unido y substrayendo esta de la
cantidad de marcador agregada al comienzo de la reacción.
Para determinar con exactitud la cantidad de
ligando marcado que se liga específicamente a la leczima, se puede
realizar una reacción de control en donde todas las condiciones son
las mismas que en la reacción de ligadura entre el ligando marcado
y la leczima excepto que la leczima no está incluida en la reacción
de control o la leczima es reemplazada por una proteína irrelevante
tal como una albúmina sérica. La reacción de control determina la
cantidad de ligadura del ligando de carbohidratos marcado que ocurre
no específicamente tal como la cantidad de ligando marcado que se
liga al soporte sólido más que a la leczima en el soporte sólido.
Así, es necesario substraer el valor de ligadura no específica
obtenido de la reacción de control, del valor de ligadura obtenido
de la reacción que incluía el ligando de carbohidratos marcado y la
leczima para determinar la cantidad de ligando que se liga
específicamente a la leczima bajo las condiciones de ensayo.
Una ventaja de usar un soporte sólido es que el
ligando marcado puede ser agregado en exceso con relación a la
leczima, haciendo posible identificar niveles más bajos de afinidad
de ligadura entre el ligando de carbohidratos y la leczima. Métodos
tales como el análisis de Scatchard son bien conocidos en el arte
para determinar la afinidad de ligadura entre dos moléculas, las
cuales pueden estar en solución o una de las cuales puede estar
unida a un soporte sólido. La diálisis de equilibrio es un ejemplo
de un método en donde la ligadura de un ligando a la leczima puede
ser determinada cuando ambas moléculas están en solución.
Métodos para medir la ligadura de un ligando de
carbohidratos marcado a una leczima también pueden ser realizados
cuando la leczima está asociada con una célula. De una manera
análoga al uso de soportes sólidos, las células que expresan la
leczima en la superficie celular pueden ligar el ligando de
carbohidratos marcado y, después de un período de reacción
adecuado, las células pueden ser separadas del ligando no ligado por
métodos bien conocidos en el arte tales como por centrifugación o
filtración. Las células que expresan una leczima en el citoplasma
también se pueden usar para detectar la ligadura de un ligando de
carbohidratos a la leczima siempre que la membrana celular haya
sido suficientemente permeabilizada para permitir el acceso del
ligando de carbohidratos a la leczima en la célula. Métodos que usan
células en ensayos de ligadura tales como los ensayos de ligadura
antígeno-anticuerpo son bien conocidos en el arte
(ver, por ejemplo, Harlow y Lane supra, 1988) y se pueden
aplicar en general a los ensayos de ligadura entre un ligando de
carbohidratos y una leczima.
Una célula que expresa una leczima puede ser una
célula que expresa naturalmente la leczima, tal como un linfocito
que expresa una leczima codificada por el MHC clase I o clase II.
Una célula que expresa una leczima también puede ser una célula que
expresa la leczima como resultado de introducir un vector de
expresión que codifica a la leczima en la célula. Las células que
expresan leczimas pueden ser obtenidas de fuentes in vivo
por métodos bien conocidos en el arte tales como disrupción mecánica
del tejido o digestión del tejido por enzimas para liberar a las
células de su matriz circundante (ver, por ejemplo, Freshney,
"Culture of Animal Cells" (Alan R. Liss, Nueva York, 1993),
que se incorpora a la presente por referencia). Una célula que
expresa una leczima puede ser una línea celular que se puede obtener
de depósitos públicos de células tales como de la "American Type
Culture Collection".
Es bien conocido en el arte que la ligadura
entre dos moléculas se puede realizar cuando cualquiera de las dos
moléculas contiene un marcador detectable. Así, la identificación de
un ligando de carbohidratos marcado en forma detectable que se liga
a una leczima unida a un soporte sólido o una célula también se
puede realizar si la leczima contiene el marcador detectable y el
ligando de carbohidratos está unido a un soporte sólido o es
expresado por una célula. Una leczima se puede marcar en forma
detectable usando métodos para marcar una proteína, que son bien
conocidos en el arte e incluyen, por ejemplo, biotinilación o
incorporación de precursores marcados con radioisótopos. Una célula
que expresa un ligando de carbohidratos puede ser una célula
obtenida de tejidos u órganos o puede ser una línea celular tal como
una línea celular que se puede obtener de un depósito público.
Los métodos para unir un ligando de
carbohidratos a un soporte sólido dependen de la naturaleza química
del ligando. Así, la unión puede lograrse a través de la parte
carbohidrato u otra molécula unida al ligando de carbohidratos a
través de la unión química adecuada para unir estructuras de
carbohidratos, péptidos o lípidos a un soporte sólido. Métodos para
unir carbohidratos, proteínas o lípidos a varios tipos de soporte
sólidos son bien conocidos en el
arte.
arte.
La ligadura de un ligando de carbohidratos a una
leczima puede ser determinada sin necesidad de un marcador
detectable midiendo una característica física o bien del ligando o
de la leczima, tal como absorción de radiación ultravioleta. Tales
métodos para cuantificar una proteína o carbohidrato por
características físicas son bien conocidos en el arte. La capacidad
de seguir una característica física del ligando o la leczima se
puede aplicar a ensayos de ligadura que usan un soporte sólido o una
célula que expresa, o cuando ambas moléculas están en solución. La
ligadura de un ligando de carbohidratos a una leczima también puede
ser evaluada si el ligando es un substrato para la actividad
enzimática de la leczima. En este caso, la ligadura puede ser
medida siguiendo la cinética de conversión de substratos medida, por
ejemplo, por la ecuación de Michaelis-Menten
(Devlin, "Textbook of Biochemistry" (Wiley-Liss
Inc., Nueva York, 1992), que se incorpora a la presente por
referencia).
Los métodos para identificar un ligando de
carbohidratos que se liga a una leczima se pueden realizar usando
un solo ligando de carbohidratos purificado o un número limitado de
ligandos de carbohidratos, que pueden ser purificados por
procedimientos convencionales como se describió más arriba o pueden
ser purificados por ligadura a un reactivo de ligadura. Como se usa
en la presente, "reactivo de ligadura" significa una molécula
química o biológica que se puede ligar específicamente a un ligando
de carbohidratos. Por ejemplo, una leczima que se liga a un ligando
de carbohidratos es un reactivo que se puede usar para purificar ese
ligando. También, un anticuerpo puede ser un reactivo si puede
reaccionar específicamente con la parte de carbohidrato, proteína o
lípido de un ligando de carbohidratos.
Un ligando de carbohidratos purificado también
puede ser marcado en forma detectable por los métodos divulgados en
la presente. Un ligando de carbohidratos que no es purificado, tal
como uno que se encuentra en una muestra que contiene otras
moléculas, se puede usar en un ensayo de ligadura siempre que esté
unido a un soporte sólido o sea expresado por una célula y la
ligadura sea determinada detectando la ligadura de una leczima. En
este caso, si el ligando de carbohidratos no purificado puede ligar
a la leczima, la muestra que contiene el ligando puede ser sometida
a purificación y ensayos de ligadura subsiguientes para obtener el
ligando de carbohidratos en un estado purificado.
Las leczimas purificadas se pueden obtener de
células por métodos clásicos para purificación de proteínas o
glucoproteínas tales como los métodos conocidos en el arte para
purificar las moléculas clase I o clase II. Las leczimas también
pueden ser obtenidas de células que han sido modificadas por
técnicas de biología molecular para permitir la expresión de una
leczima. Un gen que codifica una leczima puede ser clonado en un
vector de expresión y luego introducido en una célula huésped. Los
vectores son bien conocidos en el arte e incluyen, por ejemplo,
vectores de clonación y vectores de expresión, así como también
plásmidos o vectores virales (ver, por ejemplo, Goedell,
"Methods in Enzymology", vol. 185 (Academic Press, Nueva York, 1990), que se incorpora a la presente por referencia). Un vector baculovirus es un ejemplo de un vector que se puede usar para expresar una leczima en células de insectos y da por resultado la expresión de nuevos ligandos de carbohidratos en la célula.
"Methods in Enzymology", vol. 185 (Academic Press, Nueva York, 1990), que se incorpora a la presente por referencia). Un vector baculovirus es un ejemplo de un vector que se puede usar para expresar una leczima en células de insectos y da por resultado la expresión de nuevos ligandos de carbohidratos en la célula.
Un vector que comprende una molécula de ácido
nucleico que codifica una leczima también puede contener un
elemento promotor o intensificador, que puede ser constitutivo o
inducible y, si se desea, puede ser específico del tejido. Las
células huésped también son conocidas en el arte y una célula
huésped apropiada puede ser seleccionada para el vector particular
que se usará. Por ejemplo, se puede usar un vector de transferencia
de baculovirus con ADN de baculovirus para infectar líneas celulares
de insectos tales como células SF21. La clonación de tales células
transformadas para producir una línea celular estable puede proveer
una fuente de la leczima expresada o puede proveer una fuente de
ligando de carbohidratos modificada por la leczima expresada.
El gen que codifica una leczima puede ser
expresado como una proteína de fusión para ayudar a la purificación
o en otros procesamientos corriente abajo de la leczima. Por
ejemplo, la leczima puede ser producida como una proteína quimérica
fusionada al dominio CH2 o CH3 que constituye la región ligante de
Fe de una molécula de inmunoglobulina, como se realizó previamente
para expresar la lectina CD22\beta (Stamenkovic et al.,
Cell, 66:1133-1144 (1991)). El uso de la Proteína A
de Staphylococcus aureus ligada a un soporte sólido, que se
puede obtener fácilmente de fuentes comerciales, se puede usar para
purificar la leczima quimérica que contiene Fe. Además, el soporte
sólido que contiene la leczima quimérica se puede usar directamente
para evaluar una ligadura de un ligando de carbohidratos.
Los métodos que se describieron más arriba para
identificar a un ligando de carbohidratos que se liga a una leczima
también se pueden usar para identificar a una leczima que se liga a
un ligando de carbohidratos. Por ejemplo, una muestra que contiene
una leczima se pone en contacto con un ligando de carbohidratos del
que se sospecha que se liga a la leczima bajo condiciones adecuadas
para permitir la ligadura específica del ligando a la leczima. Las
leczimas a ser identificadas para la ligadura incluyen, por ejemplo,
una leczima purificada o una leczima contenida dentro de una mezcla
compleja tal como una mezcla de proteínas expresada de una
biblioteca de expresión de cADN. Los métodos para producir una
biblioteca de expresión de cADN son bien conocidos en el arte (ver,
por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A
laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),
que se incorpora a la presente por referencia).
Un ligando de carbohidratos también puede ser
purificado por una columna de afinidad y tecnologías relacionadas.
Por ejemplo, Una muestra que contiene el ligando de carbohidratos se
puede poner en contacto con el reactivo de ligadura bajo
condiciones adecuadas para permitir la formación de un complejo de
ligando-reactivo ligante. Las condiciones adecuadas
incluyen, por ejemplo, una concentración de búfer y pH y tiempo y
temperatura apropiados que permiten la ligadura del ligando de
carbohidratos al reactivo ligante. El complejo de
ligando-reactivo ligante es separado luego del
resto de la muestra por un método de separación tal como por lavado,
y el ligando es disociado del complejo.
Como otro ejemplo, una leczima que se liga a un
ligando de carbohidratos puede comprender un reactivo ligante usado
para purificar ese ligando. Un anticuerpo puede comprender también
un reactivo ligante si éste puede reaccionar específicamente con la
parte de carbohidrato, proteína o lípido de un ligando de
carbohidratos.
La purificación del ligando de carbohidratos se
puede lograr si el reactivo ligante se une a un soporte sólido tal
como agarosa, sefarosa o plástico. Los métodos para acoplar una
proteína o un carbohidrato a un soporte sólido, divulgados más
arriba para detectar la ligadura de un ligando de carbohidratos a
una leczima, también son útiles para unir un reactivo ligante a un
soporte sólido.
Los métodos para disociar un ligando de
carbohidratos de un complejo de ligando-reactivo
ligante pueden depender de la naturaleza del reactivo ligante. Por
ejemplo, si el reactivo ligante es una leczima, entonces un método
para disociar el complejo puede involucrar la inhibición competitiva
del complejo con una estructura de carbohidrato que tiene una
afinidad de ligadura por el mismo sitio en la leczima que liga el
ligando de carbohidratos. Otros tratamientos bien conocidos que son
útiles para disociar un ligando de carbohidratos de un reactivo
ligante incluyen, por ejemplo, extremos en pH, alta concentración de
sales o agentes caotrópicos (ver, por ejemplo, Harlow y Lane,
supra, 1988), que se incorpora a la presente por referencia,
y Varki, supra, 1994). Los ligandos de carbohidratos
purificados por los métodos divulgados más arriba son adecuados
para el análisis estructural como se describió más arriba, para
permitir la producción futura del ligando por síntesis química o
enzimática.
Un anticuerpo que se liga específicamente a un
ligando de carbohidratos del tipo oligosacárido o polisacárido
puede ser producido con respecto a la parte carbohidrato, o a una
parte de proteína o una parte de lípido si tales partes están
unidas al ligando. Un anticuerpo específico para el esqueleto de
péptidos del ligando de carbohidratos tal como el esqueleto de
péptidos de una mucina puede ser útil para purificar una fuente de
mucina de diferentes células o de diferentes individuos, ya que el
esqueleto de péptidos se puede conservar más entre carbohidratos
que contienen péptidos que las partes de carbohidrato de esas
moléculas. Métodos para producir anticuerpos tales como anticuerpos
policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos o
similares, que son específicos para proteínas, carbohidratos o
lípidos son bien conocidos en el arte (ver, por ejemplo, Harlow y
Lane, supra,
1988).
1988).
Una leczima puede ser purificada usando métodos
en donde la leczima se liga específicamente a un ligando de
carbohidratos. En estos métodos, una muestra que contiene la leczima
se pone en contacto con un ligando de carbohidratos bajo
condiciones adecuadas para permitir la formación de un complejo de
ligando-leczima. Las condiciones adecuadas
incluyen, por ejemplo, una concentración de búfer y pH y tiempo y
temperatura apropiados que permiten la ligadura de la leczima y el
carbohidrato. El complejo de ligando-reactivo
ligante se separa luego del resto de la muestra por un método tal
como por lavado, y la leczima es disociada del complejo.
La purificación de la leczima se puede lograr si
el ligando de carbohidratos se une a un soporte sólido tal como
agarosa, sefarosa o plástico. Los métodos para acoplar un ligando de
carbohidratos a un soporte sólido, tales como aquellos divulgados
más arriba para detectar la ligadura de un ligando de carbohidratos
a una leczima, son útiles para unir un ligando de carbohidratos a
un soporte sólido. Los métodos para disociar la leczima del
complejo de ligando-leczima pueden utilizar los
métodos divulgados en la presente para disociar un ligando de
carbohidratos de un complejo de ligando-leczima.
Como se usa en la presente, "función" con
referencia a una célula incluye cualquier actividad que puede ser
detectada para una célula. La función de una célula puede variar con
la naturaleza de la célula en cuestión. Por ejemplo, la función de
un linfocito T puede incluir actividades tales como la producción de
ciertas citoquinas, adquisición de linfólisis mediada por células,
capacidad para mediar en la citotoxicidad mediada por células
dependiente de anticuerpos o la capacidad de ayudar a los linfocitos
B a producir anticuerpos. Así, un ligando de carbohidratos
particular que se puede ligar a una leczima en un linfocito T y
efectuar subsiguientemente la función de la célula puede hacerlo
aumentando o disminuyendo cualquiera de las funciones del linfocito
T mencionadas más arriba. Como otro ejemplo, la adición de un
complejo de carbohidrato a las células epiteliales del tracto
gastrointestinal afectará la absorción de hierro.
La función de una célula que expresa una leczima
puede ser modificada poniendo en contacto la célula con un ligando
de carbohidratos que se liga a la leczima. Además, la invención
provee métodos para modificar la función de una célula que expresa
un ligando de carbohidratos poniendo en contacto la célula con una
leczima que liga al ligando. La identificación de o bien un ligando
de carbohidratos o una leczima que puede modificar la función de
una célula tiene usos in vitro e in vivo. Por ejemplo,
los ligandos o las leczimas capaces de disminuir o aumentar la
actividad funcional de una célula que está involucrada en un estado
de enfermedad pueden ser administrados a un individuo para tratar
la enfermedad.
Un péptido que se puede ligar al sitio de
ligadura del ligando de carbohidratos de una leczima puede ser
identificado, por ejemplo, poniendo en contacto una muestra que
contiene un péptido o péptidos a ser probados con una leczima bajo
condiciones adecuadas para permitir la ligadura del péptido a la
leczima. Subsiguientemente, la leczima se hace reaccionar con un
ligando de carbohidratos que se sabe que se liga a la leczima. La
reacción se realiza bajo condiciones adecuadas para que el ligando
de carbohidratos se ligue a la leczima. Alternativamente, el
péptido, la leczima y el ligando de carbohidratos pueden ser
agregados juntos al comienzo de la reacción.
El ligando de carbohidratos puede ser agregado
directamente a la mezcla que contiene el péptido y la leczima o
puede ser agregado después que cualquier péptido no ligado ha sido
retirado de la leczima. Después del final de la reacción, la
cantidad de carbohidrato que liga a la leczima se determina y se
compara con la cantidad de ligando de carbohidratos que se liga a
la leczima en una muestra de control que no contenía péptido. Si la
cantidad de ligando de carbohidratos que se liga a la leczima en la
muestra que contiene el péptido es menor que la cantidad de ligando
de carbohidratos que se liga a la leczima en la muestra de control,
entonces se puede concluir que el péptido se ligó al sitio de
ligadura del ligando de carbohidratos de la leczima y por lo tanto
es un péptido mimetopo del ligando de carbohidratos.
Un péptido mimetopo puede ser identificado en un
formato de ensayo que utiliza un ligando de carbohidratos que
contiene un marcador detectable y una leczima que está ligada a un
soporte sólido o es expresada por una célula. Los métodos
divulgados en la presente para identificar un ligando de
carbohidratos que se liga a una leczima son útiles para generar el
formato de ensayo para identificar un péptido mimetopo de un ligando
de carbohidratos.
Una secuencia de péptidos definida puede ser
sintetizada químicamente o producida por métodos biológicos, tales
como por técnicas de ADN recombinante (ver, por ejemplo, Sambrook
et al., supra, 1989). También se puede usar una
mezcla compleja de péptidos para identificar a un péptido mimetopo.
Tales mezclas complejas pueden incluir, por ejemplo, una mezcla de
secuencias definidas, o puede ser una biblioteca de secuencias
semialeatoria o aleatoria. Los métodos para generar las bibliotecas
de péptidos por métodos tales como síntesis química en una perla o
una placa de microtitulación o producción biológica tal como en la
superficie de un bacteriófago son bien conocidos en el arte (ver,
por ejemplo, Huse et al., Science
246:1275-1281 (1989), que se incorpora a la
presente por referencia).
Un péptido que se puede ligar al sitio de
ligadura del ligando de carbohidratos de una leczima también puede
tener algunas de las características funcionales de un ligando de
carbohidratos y así puede ser considerado un mimetopo funcional del
ligando de carbohidratos. Tales péptidos mimetopos se pueden usar
para modificar la función de una célula y también se pueden usar
para tratar un estado de enfermedad que involucra una leczima que
se puede ligar al mimetopo.
Una célula puede ser modificada para producir un
ligando de carbohidratos introduciendo un vector de expresión que
codifica una leczima en una célula para obtener la expresión de la
leczima, lo que da por resultado la producción del ligando de
carbohidratos por la célula. Las células que producen un ligando de
carbohidratos particular son útiles para proveer tipos de ligandos
únicos, que pueden ser purificados a partir de las células. Además,
tales células son útiles en ensayos de ligadura para identificar una
leczima que liga al ligando.
Una respuesta inmunológica en un individuo, tal
como un ser humano u otro animal, puede ser modulada usando un
antígeno para el cual se desea la respuesta inmunológica y un
ligando de carbohidratos que se liga a una leczima. Como las
leczimas incluyen, por ejemplo, las moléculas del complejo mayor de
histocompatibilidad que están involucradas en el sistema
inmunológico, la inyección de un ligando de carbohidratos y un
antígeno puede modular una respuesta inmunológica. Como se usa en
la presente, "modular" significa aumentar o disminuir. Un
aumento en la respuesta inmunológica se puede obtener administrando
un ligando de carbohidratos ligado a un antígeno de tal modo que el
antígeno es direccionado a través de la leczima a una célula que
presenta un antígeno.
Un antígeno puede ser asociado con un ligando de
carbohidratos uniendo en forma covalente el antígeno al
carbohidrato o a cualquier proteína o lípido del ligando usando
métodos bien conocidos en el arte. El método actual para acoplar en
forma covalente el antígeno al ligando de carbohidratos dependerá de
la naturaleza de cada molécula a ser acoplada y si el procedimiento
de acoplamiento es perjudicial para cualquier determinante
antigénico crítico del antígeno o la capacidad del ligando de
carbohidratos para ligar su leczima objetivo. Tales efectos
perjudiciales pueden ser evaluados fácilmente en ensayos de ligadura
como se describió más arriba.
Más de una sola molécula de antígeno o más de un
solo ligando de carbohidratos pueden ser acoplados juntos para
producir un inmunógeno. Tales moléculas pueden hacerse multivalentes
para cualquiera o para ambos del antígeno o el ligando de
carbohidratos y se pueden usar para provocar una mayor respuesta
inmunológica que un inmunógeno que contiene una sola molécula de
antígeno y una sola molécula de un ligando de carbohidratos.
Los métodos para aumentar una respuesta
inmunológica en un individuo son bien conocidas por los expertos en
el arte y requieren optimización de parámetros tales como dosis, vía
de administración, uso de un adyuvante, o esquema de administración
(ver, por ejemplo, Hartow y Lane, capítulo 5, supra, 1988).
Estos mismos métodos pueden ser adaptados para usar con ligandos de
carbohidratos. Una respuesta inmunológica aumentada obtenida
después de administrar un antígeno y un ligando de carbohidratos se
logra cuando el parámetro de la respuesta inmunológica ha aumentado
en un nivel estadísticamente significativo sobre el nivel del
parámetro manifestado antes de la administración del antígeno y el
ligando de carbohidratos.
Los parámetros de la respuesta inmunológica que
pueden aumentar después de administrar un antígeno asociado con un
ligando de carbohidratos incluyen una respuesta mediada por
anticuerpos o una respuesta mediada por células. Los métodos para
medir las respuestas inmunológicas a los anticuerpos son bien
conocidos por los expertos en el arte e incluyen, por ejemplo,
detección de inmunoglobulinas por métodos in vitro e in
vivo (ver, por ejemplo, Harlow y Lane, supra, 1988). Los
métodos para medir las respuestas inmunológicas celulares también
son bien conocidos en el arte e incluyen métodos in vivo
tales como prueba en la piel para la hipersensibilidad retardada y
métodos in vitro tales como citotoxicidad celular directa o
ensayos de activación celular (ver, por ejemplo, Colligan et
al., supra, 1992; Mishell y Shiigi, supra,
1980).
Un antígeno asociado con un ligando de
carbohidratos también se puede usar para disminuir una respuesta
inmunológica al antígeno y puede ser particularmente útil para
tratar una respuesta inmunológica deletérea tal como un estado de
enfermedad autoinmune. Los métodos para disminuir una respuesta
inmunológica pueden, bajo algunas condiciones, dar por resultado un
estado prolongado de falta de respuesta inmunológica específica al
antígeno, denominado comúnmente estado de tolerancia al
antígeno.
La disminución de una respuesta inmunológica a
un antígeno administrando el antígeno unido a un ligando de
carbohidratos se puede lograr usando métodos bien conocidos en el
arte para suprimir o tolerizar un individuo a un antígeno. Tales
métodos incluyen, por ejemplo, la administración de bajas dosis,
formas monoméricas y no agregadas del antígeno y el ligando de
carbohidratos o la administración oral. Además, se puede obtener
una respuesta inmunológica disminuida administrando el antígeno y el
ligando de carbohidratos en forma concurrente con un agente
inmunosupresor tal como ciclosporina A, FK506 o anticuerpos a un
receptor de la superficie celular de linfocitos T particular. Los
métodos para usar tales agentes para disminuir la respuesta
inmunológica a un antígeno en seres humanos o animales son bien
conocidos en el arte.
Un trastorno metabólico de hierro conocido como
hemocromatosis también puede ser diagnosticado usando métodos
divulgados en la presente porque los defectos en el metabolismo del
hierro pueden tener una base en la función de la leczima. En
concentraciones elevadas, el hierro es una molécula inorgánica
tóxica que ha sido involucrada en la fisiopatología de un número de
enfermedades comunes. Estas incluyen, pero no están limitadas a,
cáncer (Stevens et al., N. Engl. J. Med., 319:1047 (1988);
Stevens, et al., Med. Oncol. Tumor Pharmacother, 7:
177-181 (1990)), enfermedades cardíacas (Kannel,
et al., 1976; Sullivan, Lancet, 1:1293-1294
(1981); Salonen, et al., Circulation,
86:803-811 (1992)), lesión por reperfusión (Zweier,
J. Biol. Chem., 263:1353-1357 (1988)) y artritis
reumatoide (Blake et al., Arthritis Rheum.,
27:495-501 (1984)). No hay argumentos en contra de
que una fuerte sobrecarga de hierro da por resultado un conjunto de
patologías, denominadas colectivamente hemocromatosis, la
enfermedad genética más común que se conoce que afecta a los seres
humanos.
La hemocromatosis resulta de la absorción
aumentada de hierro del tracto GI por transporte activo, pero el
gen o los genes que provocan el efecto metabólico subyacente no se
conocen actualmente. La identificación de los genes responsables de
la absorción de hierro y que desarrollan un modelo animal en donde
la sobrecarga de hierro se debe a la absorción de hierro aumentada
activa del tracto GI, facilitaría mucho la comprensión de la
hemocromatosis y aumentaría el conocimiento de los mecanismos
generales del metabolismo del hierro. Como se divulga en la
presente, una leczima codificada por el MHC puede estar involucrada
en la patogénesis de la hemocromatosis.
La hemocromatosis no capta usualmente la
atención clínica hasta que se desarrollan los síntomas y varios
estudios han indicado que la remoción del hierro después del
desarrollo del daño al tejido no mejora necesariamente la función
del órgano (Cundy, et al., Clin, Endocrinol.,
38:617-620 (1993); Westera et al., Am. J.
Clin. Path., 99:39-44 (1993)). La hemocromatosis es
una enfermedad subdiagnosticada y subtratada que se beneficiaría
mucho del diagnóstico temprano y de un tratamiento efectivo (para
un panorama ver, Edwards et al., Hosp. Pract. Suppl.,
3:30-36 (1991); Edwards y Kushner, N. Engl. J. Med.,
328:1616-1620 (1993)).
La hemocromatosis no tratada está caracterizada
por la sobrecarga de hierro de las células del parénquima, que es
tóxica y en muchos casos una causa probable de varias complicaciones
incluyendo hepatopatía (incluyendo cirrosis y cáncer hepático),
artropatía, hipogonadismo hipogonadotrópico, aplasia medular,
trastornos de la piel, diabetes mellitus y cardiomiopatía (para un
panorama ver, Halliday y Powell, "Iron and Human Disease",
Lauffer, RB, (ed). 131-160 (1992)). Hay, según se
informa, aproximadamente 1,5 a 2 millones de casos activos de
hemocromatosis en los EE.UU., con aproximadamente 25% de los
pacientes diagnosticados tardíamente o no tratados que
desarrollaron hepatomas.
En la hemocromatosis no tratada, el hierro es
depositado universalmente en los hepatocitos del hígado, y la
saturación elevada de transferrina con niveles elevados de ferritina
sérica combinados con una biopsia del hígado provee la mejor prueba
diagnóstica disponible actualmente (Fairbanks, Hosp. Pract., 26:
17-24 (1991)). El hierro se encuentra
principalmente en el citoplasma de los hepatocitos y por microscopia
electrónica en vacuolas lisosómicas, y en casos más graves, el
hierro se deposita en la mitocondria (para un panorama, ver Iancu,
Ped. Pathol., 10:281-296 (1990)). Otras toxinas
hepáticas tales como alcohol y hepatitis exacerban el daño causado
por la deposición de hierro (Piperno et al., J. Hepat.,
16:364-368 (1992)). A los pacientes con
hemocromatosis se les aconseja no tomar alcohol, debido a un mayor
daño del hígado, o a no fumar productos de tabaco, ya que la
deposición de hierro también puede ocurrir en los pulmones.
En la literatura se informa que la
hemocromatosis es una enfermedad recesiva autosómica en la cual el
o los genes responsables están unidos al locus A del MHC humano
(complejo HLA), ubicado en el cromosoma 6 (Simon y Brissot,
Hepatol., 6:116-124 (1988)). La unión al
HLA-A3 humano ha sido documentada en aproximadamente
73% de los casos. Sin embargo, también se han involucrado otros
loci genéticos, especialmente en poblaciones africanas (Gorduke
et al., N. Engl. J. Med., 326:95-100 (1992))
y afro-americanas (Barton et al., Blood,
85:95a (1993)).
La hemocromatosis se reconoce actualmente como
la enfermedad genética más común en los seres humanos, excediendo
en mucho a la fibrosis quística, la fenilcetonuria y la distrofia
muscular combinadas (Leggett et al., Clin. Chem.,
36:1350-1355 (1990)). Una explicación para la alta
incidencia de esta enfermedad genética puede ser que las mutaciones
en genes ligados en forma múltiple producen un fenotipo similar. La
hemocromatosis ocurre muy frecuentemente en poblaciones de origen
europeo con una frecuencia de homocigotas y heterocigotas de
aproximadamente 0,3 y 13%, respectivamente.
Varios marcadores, incluyendo el D6S105
recientemente descrito, han sido identificados en el locus del MHC
humano y han estrechado la ubicación genómica del gen de la
hemocromatosis a dentro de 1 centimorgan del locus A (Jazwinska
et al., Am. J. Hum. Genet., 53:347-352
(1993)), y posiblemente centromérico con respecto a
HLA-F (Gasparini, et al., Hum. Mol. Genet.,
5:571-576 (1993)). Otros han informado genes
candidatos para la hemocromatosis ubicados 20-200
kb teloméricos con respecto a HLA-A (Kahloun et
al., Hum. Mol. Genet., 2:55-60 (1993)). Si bien
se creía que varios de estos genes candidatos eran una copia simple,
se halló que tres de los genes, denominados HCG II, IV y VII, eran
genes multicopias. Así, a pesar de los avances realizados en la
determinación de la ubicación del gen de la hemocromatosis, aún no
ha sido aislado.
La mayoría de los modelos animales para la
sobrecarga de hierro no son completamente adecuados para el estudio
de la hemocromatosis ya que no reflejan la absorción aumentada de
hierro del intestino por transporte activo. Ratones homocigotas
para la eliminación del gen que codifica el \beta_{2}M (ratones
\beta_{2}-/- (Koller et al., Science,
248:1227-1230 (1990); Zijlstra et al.,
Nature, 344:742-746 (1990)), sin embargo, proveen
un excelente modelo animal para el estudio de la hemocromatosis.
Estos animales no tienen las proteínas clase I detectables en la
superficie celular, aunque la marcación bioquímica muestra que los
productos de genes clase I están siendo sintetizados. Los
linfocitos activados de animales \beta_{2}-/- pueden ser
lisados por células asesinas naturales (NK), sugiriendo nuevamente
una deficiencia en la expresión de la clase I (Liao et al.,
Science, 253:199-202 (1991)). Estos ratones se
desarrollaron originalmente para estudiar el rol del \beta_{2}M
en el desarrollo. Si bien los ratones se desarrollaron y tuvieron
crías normalmente, no pudieron generar números significativos de
células T CD8+. En consecuencia, estos ratones han sido estudiados
intensamente desde una perspectiva inmunológica.
Los ratones \beta_{2}-/- combaten
infecciones virales relativamente bien, aunque el curso de la
infección es más largo que en animales normales (Eichelberger et
al., J. Exp Med., 174:875-878 (1991); Muller
et al., Nature, 255:1576-1579 (1992)). Los
mismos rechazan aloinjertos (Zijlistra et al., J. Exp. Med.,
175:885-889 (1992)) y muestran mayores niveles de
producción de Ig y un cambio de clase de los tipos de anticuerpos
más rápido que los ratones normales. Aunque las células T CD8+ se
encuentran a un nivel bajo hasta no detectable en el nacimiento,
los estudios han mostrado que los animales pueden generar células T
CD8+, y se puede formar una respuesta citotóxica de las células T
CD8+ bajo circunstancias apropiadas (Apasov y Stikovsky, J.
Immunol., 152:2087-2097 (1994)). Otra anormalidad
significativa informada en estos animales es que desarrollan
hiperglucemia (glucosa>300 mg/dl) cuando son viejos (más de 2
años). Se ha sugerido que la aparición de diabetes en los ratones
\beta_{2}-/- está relacionada con la autoinmunidad (Faustman
et al., Science, 254:1756-1761 (1991)), sin
embargo, esta explicación ha sido discutida (Serreze et al.,
Diabetes, 43:505-509 (1994); Wicker et al.,
Diabetes, 43:500-504 (1994)).
Los ratones \beta_{2}-/- pueden desarrollar
sobrecarga de hierro que es similar a la hemocromatosis humana. Los
ratones \beta_{2}-/- pueden desarrollar espontáneamente
hepatomas. Esta observación combinada con los datos de biología
molecular de los genes \beta-GAP (ver Ejemplo I),
sugirieron que los ratones desarrollarían sobrecarga de hierro. El
examen histoquímico de los tejidos de estos ratones, confirmó esta
hipótesis. Se halló hierro depositado en el hígado de todos los
animales y en los riñones, bazos y pulmones de algunos de los
animales. Además, el 16% de los animales desarrolló una enfermedad
hepática, presentando o bien hepatomas o necrosis del hígado. Así,
los hallazgos clínicos para los ratones con deficiencia de
\beta_{2}-/- son suficientemente similares a la patología de la
hemocromatosis para hacer que los ratones \beta_{2}-/- sean un
modelo atractivo para el estudio de un mecanismo subyacente a la
hemocromatosis humana. Lo que es más importante, los ratones
\beta_{2}-/- demostraron que el \beta_{2}M tiene un rol en
esta enferme-
dad.
dad.
La capacidad de los promotores
\beta-GAP para co-regular el gen
\beta-GAP y un gen clase I no clásico que
codifica a la leczima, expresándose ambos en el intestino, sostiene
un rol para una leczima clase I en la hemocromatosis. El gen clase
I no clásico regulado por el promotor \beta-GAP es
una leczima que puede reconocer y modificar una estructura de
carbohidrato asociada con el producto de gen
\beta-GAP, el último de los cuales liga directa o
indirectamente el hierro (es decir, el gen p-GAP
puede ser un vehículo del hierro). La disrupción de la expresión de
\beta_{2}M resulta en una pérdida de regulación de la función de
la leczima provista por la molécula clase I no clásica, que lleva a
la sobrecarga de hierro y la hemocromatosis.
Una predisposición genética para la
hemocromatosis u otras enfermedades de acumulación de hierro basadas
en una leczima puede ser diagnosticada detectando una mutación en
la cadena pesada de una molécula del MHC clase I codificada por un
gen en el locus del MHC. Estos métodos pueden ser usados para
diagnosticar a un individuo que tiene los síntomas de una
enfermedad con acumulación de hierro. Un diagnóstico positivo de
mutación en una cadena pesada del individuo es útil para verificar
la causa subyacente de la enfermedad y para identificar la leczima
particular que mutó. La identificación de la leczima que mutó se
puede usar con los métodos divulgados en la presente para
identificar un carbohidrato adecuado para tratar la enfermedad.
Un individuo que no tiene una enfermedad de
acumulación de hierro, pero del que se sospecha que ha heredado una
mutación que puede predisponer al individuo a desarrollar una
enfermedad de acumulación de hierro más tarde en su vida también se
puede beneficiar de probar las mutaciones por los métodos divulgados
en la presente.
Una mutación que puede diagnosticar la
enfermedad es una que da por resultado una afinidad
significativamente reducida de la cadena pesada para el
\beta_{2}M humano. Por ejemplo, una mutación en una cadena
pesada clase I no clásica que da por resultado la eliminación de
una señal para la fosforilación es una mutación que diagnostica la
hemocromatosis ya que una cadena pesada adecuadamente fosforilada es
necesaria para que la cadena interactúe con el \beta_{2}M. Las
secuencias de aminoácidos de consenso que dan una señal a una
célula para fosforilar un residuo de serina o treonina en un
polipéptido son bien conocidas en el arte. Una mutación que sirve
como diagnóstico para la hemocromatosis también puede ocurrir en una
región de la cadena pesada que está cerca de un sitio de
fosforilación. Una mutación como ésta puede reducir la capacidad de
la cadena pesada de asociarse con el \beta_{2}M si el grupo
fosfato agregado a este sitio no puede ser retirado en una
célula.
Los métodos para detectar una mutación en un
sitio de fosforilación en una cadena pesada clase I no clásica
pueden basarse o bien en el análisis de la proteína o del ácido
nucleico que codifica a la proteína. Para la determinación de la
proteína, la molécula clase I no clásica puede ser purificada a
partir de una fuente de células o fluidos corporales de un
individuo y la cadena pesada puede ser aislada de \beta_{2}M.
Los métodos para purificar una molécula del MHC clase I y aislar la
cadena pesada de \beta_{2}M son bien conocidos en el arte. La
cadena pesada aislada puede ser sometida a secuenciación de
aminoácidos, mapeo de péptidos u otros análisis de proteínas de
este tipo para determinar si la secuencia de un sitio de
fosforilación ha sido mutada. Tales métodos para la determinación
de proteínas son bien conocidos por los expertos en el arte.
Una mutación en una secuencia de ácidos
nucleicos puede ser detectada por varios métodos para analizar
ácidos nucleicos tal como por secuenciación de ácidos nucleicos,
reacción en cadena de polimerasa o hibridación. Tales métodos son
bien conocidos por los expertos en el arte (ver, por ejemplo,
Sambrook et al., supra, 1989; Hames y Higgins,
"Nucleic Acid Hybridisation: a practical approach", (IRL Press,
Nueva York, 1985), los cuales se incorporan a la presente por
referencia).
Los métodos para detectar una ligadura
disminuida de una cadena pesada mutada con \beta_{2}M se pueden
usar para diagnosticar una enfermedad de acumulación de hierro tal
como la hemocromatosis. En estos métodos, la cadena pesada de una
molécula del MHC clase I es aislada de un individuo y puesta en
contacto con \beta_{2}M bajo condiciones adecuadas para que una
cadena pesada como ésta no mutada se asocie con \beta_{2}M. Una
reacción de control, que contiene una forma no mutante de una cadena
pesada clase I igual o similar a la que se está probando para
determinar una mutación se realiza en paralelo. Después de poner en
contacto la cadena pesada con \beta_{2}M, la reacción es
incubada bajo condiciones adecuadas, incluyendo, por ejemplo, una
concentración de búfer y pH y tiempo y temperatura apropiados, que
es suficiente para que la cadena pesada de control se asocie con el
\beta_{2}M. La cadena pesada del individuo que está siendo
examinada se considera que tiene un diagnóstico de mutación para una
enfermedad de acumulación de hierro cuando la fracción de esta
cadena pesada que se asocia con el \beta_{2}M es
significativamente menor que la fracción de la cadena pesada de
control que se asocia con el \beta_{2}M.
La asociación de una cadena pesada clase I con
el \beta_{2}M puede ser detectada, por ejemplo, uniendo una de
las moléculas a un soporte sólido y uniendo un marcador detectable
tal como un radionúclido o un marcador fluorescente a la otra
molécula y midiendo la cantidad de marcador detectable que está
asociado con el soporte sólido, en donde la cantidad de marcador
detectada indica la cantidad de asociación de la cadena pesada con
el \beta_{2}M.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar pero
no limitar la presente invención.
Ejemplo
I
Este ejemplo provee una propuesta para
identificar y clonar genes de leczima de varias especies de
animales para elucidar su rol en las enfermedades metabólicas de
hierro.
Se construyeron bibliotecas \alpha genómicas
por digestión parcial con Hae III de ADN de hígado de ratones A/J y
Balb/c y clonación de los fragmentos en el vector Charon 4A. Las
bibliotecas fueron rastreadas con la sonda S15, aislada del gen
H-2L^{d} (Margulies et al., Nature, 295:
168-170 (1982), que se incorpora a la presente por
referencia)) S15 es una sonda de ratón del MHC clase I 3' y consiste
en 522 pares de bases incluyendo 36 pares de bases del exón 4 que
codifica el dominio alfa-3 y 486 pares de bases del
intrón (Evans et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA),
79:1994-1998 (1982)). Las sondas se prepararon
extirpando el inserto de M13RF o pUC 18, purificando el fragmento a
partir de geles de acrilamida reticulados con disulfuro (Hansen,
Anal. Biochem. 116:146-151 (1981)), y marcando con
^{32}P a una actividad específica de >10^{8} cpm/\alphag
por traducción de la mella ("nick") (Rigby et al., J.
Mol. Biol. 113:237-251 (1977)). Las bibliotecas
fueron rastreadas usando técnicas de hibridación de colonias
estándar (para detalles ver Sambrook et al., supra,
1988).
Se aislaron 17 clones \alpha únicos de las
bibliotecas y fueron sometidos a mapeo de digestión por enzimas de
restricción. La digestión con BamHI y electroforesis en gel de estos
clones reveló cinco de la cepa A/J y uno de la cepa Balb/c que
contenían un fragmento de restricción (BB500) BamHI de 500 pares de
bases (bp) único. Los seis clones que contenían el fragmento único
fueron sometidos a digestión con BamHI, el fragmento BB500 fue
purificado en gel y subclonado en el vector M13, Mp18 y mp19
(Yanisch-Perron et al., Gene 33:
103-119 (1985)). Las secuencias de ADN fueron
determinadas por el método de terminación de cadena (Sanger, et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 74:5463-5467
(1977)) usando ^{35}S-ATP. Las reacciones se
analizaron en geles de gradiente de 6%
urea-poliacrilamida (Biggins et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA) 80:3963-3965 (1983)). Las
secuencias de ADN fueron ensambladas y analizadas usando los
Programas del Grupo de Computación de la Universidad de Wisconsin
(Devereux, et al., Nucleic Acids Res.
12:387-395 (1984)) corridos en una computadora
VAX-11/785.
Las comparaciones de secuencias de ADN
demostraron que los fragmentos de BB500 comparten más de 93% de
homología de secuencias. Una región dentro del fragmento BB500
muestra una homología de secuencias de 100% entre los clones
\alpha y ha sido denominado \beta-GAP (promotor
análogo de globina) ya que su motivo regulador comparte homología
de secuencia con promotores \beta-globina de
ratón, conejo o seres humanos (para una comparación detallada ver
más adelante). Hay una estrecha similitud entre los seis fragmentos
(denominados \beta-GAP1-6) con la
excepción menor del \beta-GAP4 en donde se ha
eliminado una secuencia de 8 pares de bases AAGAGGAG,
inmediatamente corriente abajo de un elemento CCAAT. Hay otras
diferencias menores entre estas secuencias y los clones \alpha de
las cuales fueron aislados demuestran diferentes modelos de
restricción que confirman que los diversos clones \alpha
contienen secuencias y no son un artefacto de clonación. Así, el
ratón de cepa A/J contiene por lo menos cinco secuencias
\beta-GAP altamente homólogas dentro de su
genoma.
Se usó la transferencia Southern para determinar
si la secuencia BB500 podía identificar genes ubicados en el
cromosoma 17 del ratón. Se evaluó el ADN de varias líneas celulares
híbridas somáticas de ratón de ovario de hámster chino (CHO) por
transferencia Southern usando la sonda \beta-GAP6
de BB500. Se aisló el ADN genómico de células cultivadas, se
digirió con EcoRI, se sometió a electroforesis en geles de agarosa
0,8% y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa. La
hibridación con la sonda BB500 se llevó a cabo en presencia de
sulfato de dextrano bajo las condiciones descriptas por Meinkof y
Wahl (Anal. Biochem. 138:267-284 (1985)) con un
lavado final en 0,2X de búfer de cloruro de sodio citrato de sodio,
pH 7,0 (SSC) a 60ºC.
La sonda BB500 hibridó con la línea celular HM27
que contenía el ADN de los cromosomas de ratón 15 y 17 y reveló el
mismo modelo de bandeo que con el ADN genómico total de BALB/c. La
línea celular HM65 que no tiene el cromosoma 17 de BALB/c no tenía
bandas hibridables, indicando que la sonda no se ligó no
específicamente al ADN de CHO. Se examinó el ADN de otras líneas
celulares de CHO que contenían cromosomas de ratón distintos del
cromosoma 17 por transferencia Southern con la sonda BB500 y se
halló que eran negativas (no mostradas). Estos resultados indican
que las secuencias de \beta-GAP mapean todas al
cromosoma 17 en el ratón.
El hecho de que las secuencias
\beta-GAP fueron aisladas del genoma de ratón
proporcionó varias herramientas poderosas para mapear precisamente
la ubicación de las secuencias. Primero, el MHC de ratón está
altamente caracterizado, particularmente con respecto a la región
clase I no clásica y, segundo, existen cepas congénicas de ratones
en donde la posición de los genes en el MHC puede ser destacada. Las
cepas congénicas se desarrollaron originalmente criando cepas de
ratones consanguíneos juntas. Las generaciones subsiguientes de
entrecruzamiento cromosómico han producido un número de cepas que
contienen una parte del MHC de una cepa y el resto del MHC de otra
cepa. En consecuencia, es posible comparar el polimorfismo de la
longitud del fragmento de restricción (RFLP) entre las cepas, y
determinar si los modelos de bandeo están ligados a un locus de MHC
dado (para un panorama ver Klein, "Natural History of the Major
Histocompatibility Complex", 50-73 (1986)). El
análisis del RFLP se realizó obteniendo ADN genómico purificado de
varias cepas de ratón, digiriendo el ADN con EcoRI y realizando una
hibridación Southern con la sonda \beta-GAP6 de
BB500 como se describió más arriba. La transferencia Southern
mostró que la sonda identificó hasta diez bandas diferentes del ADN
de las cepas de ratón examinadas (Tabla 1). Cuatro de estas bandas,
de 30 kb, 20 kb, 16 kb y 10,5 kb, fueron mapeadas dentro del locus
de MHC. El análisis del RFLP indicó que había por lo menos cuatro a
seis copias de las secuencias \beta-GAP/genoma
dependiendo de la cepa de ratón examinada. Además, el análisis
genético de los modelos de RFLP indicó que las bandas de
\beta-GAP de 30 kb y 10,5 kb fueron mapeadas a una
región Q entre Q1 y Q4, mientras que las bandas de
\beta-GAP de 20 kb y 16 kb fueron mapeadas a la
región T. Además, dos de las secuencias \beta-GAP
que no demostraron polimorfismo RFLP fueron mapeadas teloméricas con
respecto a los genes clase I clásicos.
Las dos secuencias de genes
\beta-GAP que fueron mapeadas a la región Q entre
Q1 y Q4, estaban ligadas directamente a Q1 y Q2 por análisis de
secuencias de ADN de los genes Q1 y Q2 aislados de una biblioteca
C57BL/6 (H-2^{b}). La secuenciación mostró que
ambos genes, Q1 y Q2, están asociados en una configuración cabeza a
cabeza con un gen desconocido (definido comúnmente como el gen
\beta-GAP) con ambos genes regulados en forma
transcripcional por una sola región de promotor/intensificador que
tiene dos promotores definidos por un par de secuencias CAAT y TATA
ubicadas aprox. 25 bp separadas en hebras opuestas del ADN. Así,
teniendo promotores intactos y una región reguladora común, los
genes \beta-GAP y clase I serían transcriptos de
hebras opuestas, con los genes clase I, Q1 o Q2, transcriptos de 5'
a 3' en la hebra superior y el gen \beta-GAP
transcripto de 5' a 3' en la hebra inferior.
El análisis de secuencias de los genes Q1 y Q2
de C57BL/6, así como también un gen TL de A/J
(H-2^{a}, Watts et al., EMBO J. 8:
1749-1759 (1980)) indicó que el promotor
\beta-GAP y las regiones reguladoras habían
reemplazado las secuencias reguladoras 5' clase I clásicas típicas
que se sabía que estaban involucradas en la regulación de los genes
clase I clásicos. El promotor \beta-GAP es un
promotor activo ya que se sabe que el gen Q2 expresa un producto de
gen que puede ser detectado en el intestino (Wang et al.,
Immunogenet., 38:370-372 (1993)). Estos resultados
indican que el promotor \beta-GAP regula la
expresión de algunos genes clase I no clásicos.
La estructura de genes cabeza a cabeza con
co-regulación de los genes fue descripta previamente
en organismos que abarcan desde bacterias a seres humanos,
indicando que la corregulación es una estrategia ampliamente
adoptada. (Brickman et al., J. Molec. Biol.,
212:669-682 (1990); Xu y Doolittle, Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA), 87:2097-2101 (1990); Lennard y
Fried, Molec. Cell. Biol., 11:1281-1294 (1991);
Heikkila et al., J. Biol. Chem.,
268:24677-24682 (1993); Fererjian y Kafatos, Dev.
Biol., 161:37-47 (1994); Sun y Kitchingman, Nucleic
Acids Res., 22:861-868 (1994)). En ambos sistemas,
el procariótico y el eucariótico, se ha sugerido la interacción
entre, o la ligadura en, una vía metabólica de dos productos de
genes (Galvalas, et al., Mol. Cell. Biol.,
13:4784-4792 (1993); Lightfoot et al., Br. J
Cancer, 69:264-2673 (1994)). Debería señalarse que
en los clones de \beta-GAP estudiados hasta
ahora, los genes Q1 y Q2 aún poseen sus propios elementos CAAT y
TATA, y sólo están ausentes las regiones intensificadoras
reguladoras de clase I clásicas típicas.
Para demostrar que las secuencias
\beta-GAP están conservadas, y que varias
especies, incluyendo los seres humanos, contienen múltiples copias
de estos genes una "transferencia Zoo" de varias especies de
ADNs genómicos fue digerida con EcoRI y analizada por transferencia
Southern usando la sonda de ratón \beta-GAP6
BB500. Bajo condiciones moderadas la transferencia mostró la
detección de una multiplicidad de bandas en el ADN de seres
humanos, ratas, ratones, perros, conejos y monos. Esto indica que se
hallaron múltiples copias de las secuencias
\beta-GAP en muchas especies incluyendo los seres
humanos. Además, la conservación de la familia de multigenes
\beta-GAP antedata la evolución de las especies de
ratones y seres humanos y por lo tanto no es el producto de una
duplicación o reasociación reciente de genes. La demostración de
homología de secuencias interespecies es significativa porque, en
general, los exones y las regiones reguladoras tienden a ser
conservadas. Experimentos adicionales muestran homología de
secuencias para el \beta-GAP en conejos, ratones,
pollos y seres humanos. Así, el modelo de las regiones específicas
de homología retenida sugiere que las secuencias de
\beta-GAP son retenidas por presión selectiva.
Las secuencias dentro de los seis clones de
\beta-GAP de 500 bp muestran una homología de
secuencias y de posición notable con respecto a elementos
reguladores del promotor de \beta-globina de
ratón, conejo y de seres humanos. Se han caracterizado importantes
elementos reguladores dentro de una región de 106 bp del promotor
de \beta-globina (Myers et al., Science
232:613-618 (1986); Stuve y Myers, Mol. Cell Biol.
6:3350-3358 (1990)). Usando mutagénesis de
saturación y promotores de eliminación 5', Myers y sus colegas
construyeron una serie de mutantes que se usaron para identificar
cuatro secuencias reguladoras. Los cuatro motivos reguladores
fueron ubicados entre las posiciones -95 y -26 que contienen un
elemento CACCC (posiciones -95 a -87), los motivos de secuencias
CCAAT y TATA en las posiciones -79 a -72 y -30 a -26,
respectivamente, y un elemento de repetición de 11 bp ubicado entre
las secuencias CCAAT y TATA (posiciones -53 a -32) que contiene 2
elementos de repetición duplicados imperfectos (\betaDRE). El
hecho de que estos \betaDRE son esenciales para la expresión de
genes de globina ha sido demostrado por estudios de eliminación.
La comparación de las seis secuencias de
\beta-GAP de 500 bp con las secuencias del
promotor de \beta-globina de varias especies
mostró varias homologías de secuencias notables con respecto a los
elementos reguladores de \beta-globina. El
análisis de la secuencia de \beta-GAP en esta
región reveló 5 motivos reguladores hallados en los promotores de
\beta-globina. Estos incluyen el elemento
eritroide 5' CACCC entre las posiciones -127 a -123, los motivos de
secuencias CCAAT y TATA entre las posiciones -109 a -105 y -30 a
-26, respectivamente, las secuencias de consenso "cap"
posiciones -13 a -10, y un quinto y más complejo elemento regulador
involucró un \betaDRE de \beta-globina de una
secuencia de 10 y 11 bp (la numeración de los pares de bases fue
determinada de las alineaciones de secuencias con espacios
("gaps") insertados y no refleja la verdadera posición de los
pares de bases del sitio de inicio de la transcrip-
ción).
ción).
En todos los clones de
\beta-GAP, dos de los cuatro motivos reguladores
\betaDRE estaban flanqueados por los elementos CCAAT y TATA entre
las posiciones -54 y -32, mientras que otros dos \betaDREs fueron
hallados inmediatamente corriente arriba de la secuencia TATA
(posiciones -11 a +1 y +3 a +12). Todos estos \betaDREs fueron
conservados en secuencia, y además, dos de ellos fueron conservados
en posición (-54 y -32). Es significativo que los \betaDREs
conservados en \beta-GAP fueron conservados en
globinas de múltiples especies (ratón, conejo, pollo y seres
humanos) abarcando más de 100 millones de años de evolución. Esta
observación de la conservación en la evolución indica que los genes
\beta-GAP son genes viejos.
Un motivo regulador putativo final de los clones
de \beta-GAP era AGATAA (nucleótidos -82 a -77),
que es idéntica a la secuencia de consenso de ADN para los factores
de ligadura de transcripción NF-E1. Esta familia de
proteínas ligantes de \beta-GAP (NFE 1 a, b, y c)
están involucradas en la expresión específica eritroide y/o de
células T de muchos genes, incluyendo la
\beta-globina adulta de ratón y de pollo, la
enzima porfobilinógeno (PGB) desaminasa de la vía heme, el receptor
de la célula T y el virus de la leucemia HTLVIII.
Una inspección más cercana de las regiones de
homología entre el \beta-GAP y los promotores de
\beta-globina de ratón, revela varias
características: 1) 18 de 26 pares de bases se aparean en las
posiciones -35 a -10 abarcando el motivo TATA de consenso (Bucher,
J. Mol. Biol. 212:563-578 (1990)); 2) una región que
abarca la secuencia CCAT del \beta-GAP,
posiciones -113 a -109 contiene el elemento regulador de
\beta-globina CACCC que se ha demostrado que es
esencial para la expresión apropiada de
\beta-globina en células eritroides; 3) un
apareamiento perfecto del elemento CCAAT existe en las posiciones
-109 a -105; 4) la cuarta región de apareamiento comprende un
elemento \betaDRE, ubicado entre las secuencias CCAAT y TATA en
las posiciones -64 a -45 (esta región contiene 16 de 19 bp
apareamientos sin espacios ("gaps")); y 5) una secuencia de
sitio "cap" de consenso como definió Bucher (Bucher,
supra, 1990) y un sitio de inicio de transcripción putativo
es identificado en los nucleótidos -13 a + 1.
Varias otras secuencias reguladoras putativas
son evidentes en el promotor de \beta-GAP. Entre
las posiciones -68 y -37 y los 5 nucleótidos de comienzo distales
del elemento TATA hay 4 palíndromos. La repetición de 5 pares de
bases de TCAGA aparece dos veces dentro de 24 pares de bases. Estas
repeticiones flanquean y se encuentran dentro de un elemento de
repetición directo imperfecto tipo globina (posiciones -57 a -47).
Dos palíndromos más largos con simetría díada imperfecta de 12 bp, y
15 bp, posiciones -67 a -56 y -51 a -37, respectivamente, contienen
palíndromos internos más pequeños de 7 bp, CCTCAGG (-66 a -60) y
repetición de 5 bp, TCAGA (-46 a -42), respectivamente. Esta región
tipo \betaDRE de 33 bp de \beta-GAP que combina
los dos palíndromos imperfectos de 12 y 15 bp grandes, el elemento
de repetición directo imperfecto de \beta-globina
y las dos repeticiones palindrómicas TCAGA muestran aprox. 50%
(16/33) de homología de secuencias de nucleótidos con respecto al
promotor de \beta-globina del
ratón.
ratón.
El modelo de las regiones específicas de
homología retenida entre los motivos reguladores de
\beta-globina y los promotores de
\beta-GAP sugiere: 1) las secuencias han salido en
un gen ancestral común; y 2) las regiones conservadas en las
secuencias \beta-GAP tienen un rol crítico en la
regulación de la expresión de sus genes respectivos. Además, la
homología con los promotores para genes involucrados íntimamente en
el metabolismo del hierro, la existencia de secuencias reguladoras
específicas eritroides y la proximidad estrecha de estos genes con
respecto al locus humano responsable de la hemocromatosis, indica un
rol para los genes \beta-GAP en el metabolismo
del hierro.
Para demostrar que los promotores del
\beta-GAP regulan los mensajes corriente abajo, es
imperativo mostrar que los genes asociados codifican los mensajes
que se pueden transcribir. Además, tales mensajes deberían ser
expresados en tejidos involucrados en la absorción de hierro, es
decir, el tracto gastrointestinal, si es que van a estar
involucrados en la patogénesis de la hemocromatosis.
Se realizó una transferencia Northern con poli
A+ ARN de varios órganos incluyendo el tracto gastrointestinal. La
transferencia se desarrolló usando una sonda derivada de un clon
cósmido \beta-GAP(Q2^{b}). Se preparó
ARN celular total por el método del reactivo TRIzol^{TM} de
acuerdo con las instrucciones del fabricante (Gibco/BRL,
Gaitherburg, MO). Se purificó poli A+ o mARN por cromatografía de
oligo dT celulosa (Strategene, San Diego, CA). Se analizó el ARN en
geles de formaldehído-agarosa y se transfirió a
membranas Zeta Bind como se describió previamente (Evans, et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:5532-5536
(1984)). El clon cósmido que contiene una secuencia
\beta-GAP que se usó para la sonda se obtuvo de
una biblioteca. El clon fue digerido con ApaLI and KpnI para dar un
fragmento de 10kb. El fragmento fue digerido parcialmente con BamHI
para dar un fragmento de 2 kb que comprende las secuencias
\beta-GAP y un fragmento de 8 kb más corriente
abajo que contiene las secuencias de codificación para un
gen
\beta-GAP.
\beta-GAP.
La transferencia Northern mostró la presencia de
mensajes polidispersos producidos en tejidos del estómago, duodeno,
yeyuno, riñón, de 4-5 kb y 8 kb de tamaño. El riñón
mostró menos polidispersidad con sólo el predominio de la banda de
8 kb. Estos resultados indican que las secuencias codificadoras del
\beta-GAP corriente arriba y del promotor de
\beta-GAP están expresadas en el tracto
gastrointestinal y están asociadas con miembros de una familia de
multigenes de los cuales el mensaje de 5 Kb del yeyuno es el más
importante. El hecho de que esta sonda también reconoció una banda
en el riñón y el estómago, sugirió que los miembros relacionados de
la familia del \beta-GAP pueden funcionar en otros
tejidos.
El tamaño y la complejidad de los productos de
mARN del \beta-GAP detectados por la transferencia
Northern es consistente con los genes \beta-GAP
que codifican para una familia de proteínas grandes. Estas
características son más como las de una familia de proteínas de
mucina que de una familia de moléculas de transporte de iones. La
homología con respecto a los promotores de
\beta-globina, la existencia de secuencias
reguladoras específicas eritroides y la estrecha proximidad de los
genes \beta-GAP y de la clase I no clásica con
respecto al locus responsable de la hemocromatosis en los seres
humanos, una enfermedad hereditaria del metabolismo de hierro
indican un rol para los genes \beta-GAP y los
genes clase I no clásicos en el metabolismo del hierro. Con esta
información a mano y los hechos divulgados en la presente de que los
ratones \beta^{2}M-knockout tienen una
incidencia inusualmente alta de hepatomas llevó a la comprensión de
que estos ratones tienen una condición metabólica y patológica
similar a la hemocromatosis.
Se usa una sonda de cósmido
\beta-GAP para rastrear una biblioteca de cADN de
yeyuno de ratón (Strategene de ZAP Express kit). Se usan
transferencias Northern para indicar que los mensajes reconocidos
por la sonda de \beta-GAP son expresados en los
tejidos examinados. Los clones que dan señales positivas son
aislados, caracterizados y purificados. El ADN purificado de los
seleccionados es digerido con EcoRI y sometido a un análisis de
transferencia Southern. La transferencia se exploró con la sonda
\beta-GAP de 800 bp para verificar que contiene
los genes \beta-GAP.
Se prepara una biblioteca de ADN genómica humana
producida en un vector cósmido sCOS como se describió previamente
para producir una biblioteca genómica de ratón en sCOS (Strategene,
San Diego, CA). El aislamiento de los genes
\beta-GAP humanos de la biblioteca de cósmidos
sCOS humanos se realiza rastreando los clones con una sonda de MHC
clase I. La sonda es generada a partir de los exones 4 y 5 del gen
HLA-A2, que codifica el dominio de ligadura
\beta_{2}M altamente conservado y la región transmembrana. Se
detectan los clones seleccionados que contienen las secuencias
clase I, y se purifican los cósmidos de esos clones, se cortan con
la enzima de restricción EcoRI, se corren en un gel de agarosa al
0,7% y se transfieren sobre una membrana de nylon cargada. La
transferencia es hibridada con la sonda de la clase I, separada e
hibridada nuevamente con la sonda de \beta-GAP de
800 bp.
Ejemplo
II
Este ejemplo provee un método para analizar la
deficiencia de hierro en un modelo animal en donde se eliminó
genéticamente la función de la leczima codificada por el MHC.
Además, estos ratones son útiles para evaluar la utilidad in
vivo de los ligandos de carbohidratos en el tratamiento de la
hemocromatosis y varias enfermedades relacionadas con el hierro
tales como ateroesclerosis, artritis o cáncer.
Los datos referidos a la sobrecarga de hierro en
los ratones \beta_{2}M-knockout se encuentran
en Rothenberg y Voland, 1994. El examen histológico de tejidos de
ratones knockout de 12-18 meses de edad, mantenidos
en una dieta estándar, reveló evidencia de necrosis hepática.
Manchas de hierro de los tejidos revelaron deposición de hierro en
el hígado de todos los animales, y el riñón, o el pulmón de
aproximadamente 10% de los animales. La dieta estándar contiene 350
mg/kg de carbonato férrico. Cuando los animales recibieron una
"dieta de criador", que contiene además de carbonato férrico,
10 mg/kg de sulfato ferroso, los depósitos de hierro aumentaron
notablemente. La deposición de hierro en los animales también estaba
relacionada con la edad observándose los niveles más altos de
hierro en los animales más viejos. Todos estos datos juntos indican
que los ratones \beta_{2}M-knockout desarrollan
sobrecarga de hierro que está relacionada con la dieta y la edad.
Además, hemos mostrado que los animales desarrollan hepatomas y
otros han informado que los animales más viejos desarrollan
diabetes (Faustman et al., Science 254:
1756-1761 (1991)). Este conjunto de patologías
representa la hemocromatosis humana.
Claims (15)
1. Un método para la identificación de un
individuo que tiene, o que está predispuesto a tener, hemocromatosis
por medio del análisis de una muestra que comprende una cadena
pesada de clase I del MHC aislada de un individuo a ser examinado,
que comprende los pasos de:
- a)
- poner en contacto la cadena pesada con la microglobulina \beta_{2} bajo condiciones adecuadas para asociar una cadena pesada de clase I del MHC con la microglobulina \beta_{2}; y
- b)
- detectar la asociación de dicha cadena pesada con dicha microglobulina \beta_{2}, en donde una asociación reducida de dicha cadena pesada con la microglobulina \beta_{2} comparada con la asociación de una cadena pesada de control con la microglobulina \beta_{2} identifica a un individuo como teniendo, o estando predispuesto a tener, hemocromatosis.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
que comprende además el paso de determinar si el individuo tiene
una mutación en dicha cadena pesada de clase I del MHC no clásica
en, o cerca de, un sitio de fosforilación.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en donde dicha cadena pesada de clase I del MHC no clásica es
HLA-X, HLA-E, HLA-J,
HLA-H, HLA-G, o
HLA-F.
4. A método de acuerdo con la reivindicación 1 ó
2, en donde dicha cadena pesada de clase I del MHC no clásica es
CD1.
5. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde la mutación detectada se encuentra
en un dominio \alpha3 de la cadena pesada de clase I del MHC no
clásica.
6. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde la mutación detectada altera la
fosforilación de una serina o una treonina en la cadena pesada de
clase I del MHC no clásica.
7. Un método para la identificación de un
individuo que tiene, o está predispuesto a tener, hemocromatosis
por medio del análisis de una muestra que contiene una molécula de
ácido nucleico que codifica una cadena pesada de clase I del MHC no
clásica aislada de un individuo a ser examinado, que comprende los
pasos de:
- a)
- detectar una mutación en dicha molécula de ácido nucleico, mutación que da por resultado la capacidad reducida de dicha cadena pesada para asociarse con la microglobulina \beta_{2},
- en donde la presencia de la mutación identifica al individuo como teniendo una mutación asociada con la hemocromatosis.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7,
en donde dicha cadena pesada de clase I del MHC no clásica
codificada por dicha molécula de ácido nucleico es
HLA-X, HLA-E, HLA-J,
HLA-H, HLA-G o
HLA-F.
9. Un método de acuerdo con la reivindicación 7
u 8, en donde dicha cadena pesada de clase I del MHC no clásica
codificada por dicha molécula de ácido nucleico es CD1.
10. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, en donde la mutación detectada se encuentra
en una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio \alpha3
de la cadena pesada de clase I del MHC no clásica.
11. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, en donde la mutación detectada elimina una
señal para la adición de un grupo fosfato.
12. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, en donde la mutación detectada elimina la
capacidad de un grupo fosfato en dicha cadena pesada de
desfosforilar en una célula.
13. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 11, en donde la mutación es detectada por
hibridación de ácido nucleico.
14. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 11, en donde la mutación es detectada por
secuenciación de ácido nucleico.
15. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 11, en donde la mutación en la secuencia de
ácidos nucleicos es detectada por reacción en cadena de
polimerasa.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US349883 | 1994-12-06 | ||
| US08/349,883 US5674681A (en) | 1994-12-06 | 1994-12-06 | Methods to identify hemochromatosis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2287936T3 true ES2287936T3 (es) | 2007-12-16 |
Family
ID=23374368
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES95943382T Expired - Lifetime ES2287936T3 (es) | 1994-12-06 | 1995-12-06 | Identificacion, purificacion y usos de leczimas y ligandos de carbohidratos. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US5674681A (es) |
| EP (1) | EP0820469B1 (es) |
| JP (1) | JPH10510424A (es) |
| CN (1) | CN1173184A (es) |
| AT (1) | ATE362941T1 (es) |
| AU (1) | AU711726B2 (es) |
| CA (1) | CA2207103C (es) |
| DE (1) | DE69535501T2 (es) |
| ES (1) | ES2287936T3 (es) |
| WO (1) | WO1996017870A1 (es) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5674681A (en) * | 1994-12-06 | 1997-10-07 | Rothenberg; Barry E. | Methods to identify hemochromatosis |
| US7026116B1 (en) | 1996-04-04 | 2006-04-11 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Polymorphisms in the region of the human hemochromatosis gene |
| US6140305A (en) | 1996-04-04 | 2000-10-31 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Hereditary hemochromatosis gene products |
| US6849399B1 (en) | 1996-05-23 | 2005-02-01 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for diagnosis and treatment of iron misregulation diseases |
| WO1997047655A1 (en) * | 1996-06-14 | 1997-12-18 | Rothenberg Barry E | Methods for the detection of a mutant receptor diagnostic for hemochromatosis |
| US6500660B1 (en) * | 1996-11-27 | 2002-12-31 | Université Catholique de Louvain | Chimeric target molecules having a regulatable activity |
| DE69841593D1 (de) | 1997-06-13 | 2010-05-12 | Bio Rad Laboratories | Verfahren und Zusammensetzungen für die Diagnose und die Behandlung von Krankheiten, die mit Eisenüberschuss oder Eisenmangel assoziiert sind |
| CN1177266C (zh) * | 1997-10-13 | 2004-11-24 | 罗斯蒙德公司 | 工业过程中现场的过程设备及其形成方法 |
| US6268217B1 (en) * | 1999-11-12 | 2001-07-31 | James C. Barton | Erythrocyte parameters in hemochromatosis |
| GB9929993D0 (en) * | 1999-12-17 | 2000-02-09 | Avidex Ltd | Substances |
| US20020186875A1 (en) * | 2001-04-09 | 2002-12-12 | Burmer Glenna C. | Computer methods for image pattern recognition in organic material |
| US6762293B2 (en) * | 2001-06-29 | 2004-07-13 | Erasmus University Rotterdam | Diagnostics and therapeutics for autosomal dominant hemochromatosis |
| US20030180811A1 (en) * | 2002-03-11 | 2003-09-25 | Montero-Julian Felix A. | Immunoassays for beta2-microglobulin |
| FR2856599A1 (fr) * | 2003-06-30 | 2004-12-31 | Commissariat Energie Atomique | Utilisation de compositions contenant une forme soluble d'hla-g dans le traitement de pathologies du sang. |
| EP1965211A4 (en) * | 2005-12-22 | 2009-08-12 | J Oil Mills Inc | METHOD FOR DETECTION OF A SUGAR CHAIN WITH GNT-V TRANSMITTED GLCNAC |
| GB201014805D0 (en) | 2010-09-07 | 2010-10-20 | Multi Sense Technologies Ltd | Microfluidics based assay device |
| GB201102037D0 (en) | 2011-02-07 | 2011-03-23 | Multi Sense Technologies Ltd | Microfluidics based assay device |
| GB201611442D0 (en) | 2016-06-30 | 2016-08-17 | Lumiradx Tech Ltd | Fluid control |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4970296A (en) * | 1984-03-01 | 1990-11-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Heterodimeric T lymphocyte receptor |
| US4946778A (en) * | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
| JP2754206B2 (ja) | 1987-11-17 | 1998-05-20 | メクト株式会社 | α２→３結合を認識するモノクローナル抗体 |
| US5693760A (en) * | 1988-04-14 | 1997-12-02 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Method of causing selective immunosuppression using HL-60 related lectins |
| US5464778A (en) | 1989-03-08 | 1995-11-07 | Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Glycoprotein ligand for P-selectin and methods of use thereof |
| US5242687A (en) | 1989-03-15 | 1993-09-07 | Tkb Associates Limited Partnership | Method of reducing cellular immune response involving T-cells using CD8-bearing antigen presenting cells |
| US5330897A (en) | 1989-04-27 | 1994-07-19 | South Alabama Medical Science Foundation | Sialic acid binding lectin of protozoan origin |
| US5211936A (en) | 1990-07-30 | 1993-05-18 | Glycomed Incorporated | Method of determining a cite of inflammation utilizing elam-1 ligands site |
| ES2236682T5 (es) * | 1991-01-21 | 2011-03-31 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Ensayo y modelo para la enfermedad de alzheimer. |
| FR2677372B1 (fr) * | 1991-06-06 | 1994-11-10 | Pasteur Institut | Sequences nucleotidiques et peptidiques d'un isolat de virus de l'hepatite c, applications diagnostiques et therapeutiques. |
| US5314813A (en) | 1992-02-19 | 1994-05-24 | Scripps Research Institute | Drosophila cell lines expressing genes encoding MHC class I antigens and B2-microglobulin and capable of assembling empty complexes and methods of making said cell lines |
| US5674681A (en) * | 1994-12-06 | 1997-10-07 | Rothenberg; Barry E. | Methods to identify hemochromatosis |
| US5705343A (en) * | 1995-05-08 | 1998-01-06 | Mercator Genetics, Inc. | Method to diagnose hereditary hemochromatosis |
| US5753438A (en) * | 1995-05-08 | 1998-05-19 | Mercator Genetics, Inc. | Method to diagnose hereditary hemochromatosis |
| US6140305A (en) * | 1996-04-04 | 2000-10-31 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Hereditary hemochromatosis gene products |
| US5712098A (en) * | 1996-04-04 | 1998-01-27 | Mercator Genetics | Hereditary hemochromatosis diagnostic markers and diagnostic methods |
| US6025130A (en) * | 1996-04-04 | 2000-02-15 | Mercator Genetics, Inc. | Hereditary hemochromatosis gene |
| US5879892A (en) * | 1997-04-25 | 1999-03-09 | Ludwig Institute For Cancer Research | Leukemia associated genes |
| US5879908A (en) * | 1997-04-30 | 1999-03-09 | Smithkline Beecham Corporation | CRFG-1a, a target and marker for chronic renal failure |
| US6284732B1 (en) * | 1998-12-18 | 2001-09-04 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Peptides and peptide analogues designed from HFE protein and their uses in the treatment of iron overload diseases |
| US6355425B1 (en) * | 1999-03-26 | 2002-03-12 | Billups-Rothenberg, Inc. | Mutations associated with iron disorders |
| US6268217B1 (en) * | 1999-11-12 | 2001-07-31 | James C. Barton | Erythrocyte parameters in hemochromatosis |
-
1994
- 1994-12-06 US US08/349,883 patent/US5674681A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-12-06 ES ES95943382T patent/ES2287936T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-06 AU AU44662/96A patent/AU711726B2/en not_active Ceased
- 1995-12-06 EP EP95943382A patent/EP0820469B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-06 WO PCT/US1995/015913 patent/WO1996017870A1/en not_active Ceased
- 1995-12-06 DE DE69535501T patent/DE69535501T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-06 JP JP8517777A patent/JPH10510424A/ja active Pending
- 1995-12-06 AT AT95943382T patent/ATE362941T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-12-06 CA CA002207103A patent/CA2207103C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-06 CN CN95197361A patent/CN1173184A/zh active Pending
-
2000
- 2000-12-06 US US09/732,363 patent/US6511807B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-01-28 US US10/352,683 patent/US20030143620A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-04-11 US US12/101,367 patent/US20080206266A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20080206266A1 (en) | 2008-08-28 |
| EP0820469A4 (en) | 2000-06-28 |
| US20030143620A1 (en) | 2003-07-31 |
| AU4466296A (en) | 1996-06-26 |
| WO1996017870A1 (en) | 1996-06-13 |
| JPH10510424A (ja) | 1998-10-13 |
| CN1173184A (zh) | 1998-02-11 |
| AU711726B2 (en) | 1999-10-21 |
| EP0820469A1 (en) | 1998-01-28 |
| EP0820469B1 (en) | 2007-05-23 |
| US5674681A (en) | 1997-10-07 |
| ATE362941T1 (de) | 2007-06-15 |
| US6511807B1 (en) | 2003-01-28 |
| CA2207103C (en) | 2008-07-15 |
| CA2207103A1 (en) | 1996-06-13 |
| DE69535501D1 (de) | 2007-07-05 |
| DE69535501T2 (de) | 2008-01-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2287936T3 (es) | Identificacion, purificacion y usos de leczimas y ligandos de carbohidratos. | |
| Nagaoka et al. | Ovine MHC class II DRB1 alleles associated with resistance or susceptibility to development of bovine leukemia virus-induced ovine lymphoma | |
| AU638954B2 (en) | Products and methods for controlling the suppression of the neoplastic phenotype | |
| JPH08510391A (ja) | Ｍｔｓ遺伝子における生殖系統の変異およびｍｔｓ遺伝子における癌の素因の検出方法 | |
| JP3779989B2 (ja) | リンパ抗原ｃｄ３０ | |
| Takaoka et al. | A novel mutation in the erythrocyte protein 4.2 gene of Japanese patients with hereditary spherocytosis (protein 4.2 Fukuoka) | |
| JPH05506365A (ja) | Ｈｌａ ｄｑベータｄｎａタイピング | |
| Lomas-Francis et al. | The Dombrock blood group system: a review | |
| EP0910667A1 (fr) | Sondes nucleotidiques et procede pour determiner le typage hla dqb1 | |
| JP2001512969A (ja) | 緑内障の診断および治療 | |
| CN110713544A (zh) | 融合基因plekha6-ntrk3及其在lch中的应用 | |
| JPH08134100A (ja) | 糖鎖特異的抗体の製造方法 | |
| US5858771A (en) | Products and methods for controlling the suppression of the neoplastic phenotype | |
| JP2002509707A (ja) | 肺腫瘍細胞を同定するための組成物および方法 | |
| Brunker et al. | Scianna: the lucky 13th blood group system | |
| Vaill | Studies of Highly Conserved Amino Acid Residues with Fixed Mutations Unique to the Human Lineage | |
| JPH11500004A (ja) | 腫瘍遺伝子Ｉｎｔ６のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列 | |
| JP4255052B2 (ja) | アルストレーム症候群遺伝子 | |
| Wallace et al. | Practical Atlas of Transplant Pathology | |
| Kubo et al. | CD4 regulates the efficiency of an endogenous superantigen‐induced clonal deletion of TCRVβ11+ cells in the periphery | |
| WO1998005796A1 (en) | Method for detecting a predisposition to susceptibility to toxic effects of drugs and poisons | |
| JP2024500049A (ja) | 先天性ｇｐｉ欠損症のバイオマーカーとしてのｅｍｍ抗原の使用 | |
| Hitchins | Identification and characterisation of genes from the Angelman and Prader-Willi syndrome region of chromosome 15q11-13 | |
| NUNES | Method for diagnosing myeloproliferative chronic myelomonocytic leukemia or unclassified myeloproliferative myelodysplastic neoplasm | |
| Gladyshev et al. | The 15 kDa selenoprotein (Sepl5): functional studies and a role in cancer etiology |