JPH10168105A - 酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物の比重調整方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 酵素又は微生物菌体を固定化する粒状成形物
の比重を水より低い１.０以下に低下させて、リアクタ
ー中における粒状成形物の均一な流動性を確保するため
に、粒状成形物の比重を任意に調整することができる方
法を提供すること。 【解決手段】（ａ） １分子中に少なくとも２個のエチ
レン性不飽和結合を有する親水性光硬化性樹脂、（ｂ）
光重合開始剤、及び（ｃ） アルカリ金属イオン又は
多価金属イオンとの接触によりゲル化する能力のある水
溶性高分子多糖類を含んでなる水性液状組成物を、アル
カリ金属イオン又は多価金属イオンを含有する水性媒体
中に滴下して該組成物を粒状にゲル化させ、次いで得ら
れる粒状ゲルに活性光線を照射して該粒状ゲル中の光硬
化性樹脂を硬化させることにより酵素又は微生物菌体固
定化用粒状成形物を製造するに際し、該液状組成物中に
無機質系微小中空ビーズ（ｄ）を添加することを特徴と
する酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物の比重調整
方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は酵素又は微生物菌体
固定化用粒状成形物の比重を調整する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】酵素又は微生物の固定化法としては、従
来から、包括法、物理的吸着法、共有結合法等多くの方
法が知られている。これらの方法によって得られる塊状
又はシート状の固定化物は、微生物反応や酵素反応に使
用する場合には、細かく切断したり磨砕したりした後カ
ラムに充填するのが普通である。しかしその場合、固定
化物は面同志で密着することが多く、微生物反応や酵素
反応の効率が悪くなり、また、屡々チャネリング現象を
起こしてカラムを閉塞する等の欠点がある。

【０００３】このため、最近では、酵素又は微生物菌体
を粒状成形物として固定化することによって、流動しや
すく、カラムへの充填作業が容易で、粒子同志の接触面
積も少なく、微生物反応や酵素反応の効率をアップさせ
ることが提案されている（例えば、特公昭６２−１９８
３７号公報参照）。しかしながら、酵素又は微生物菌体
を固定化する従来の光硬化性樹脂を主成分とする粒状成
形物は、固定化後でも一般に水と同じ１.０から１.０３
の範囲内の比重を有しているため、流動床型のリアクタ
ー、特に大型のリアクターや複雑な構造のリアクター中
で反応のために流動させる場合、下方に移動しやすく、
均一に流動させることは困難であるという問題があっ
た。

【０００４】この問題を解決するために比重の低いプラ
スチックビーズを粒子中に添加する方法もあるが、水性
媒体中で粒子が凝集するためそのままで使用することが
できず、プラスチックビーズの表面を親水化処理する必
要があった。このためコストが上がり実用的でないとい
うのが現状である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、酵素
又は微生物菌体を固定化する粒状成形物の比重を水より
低い１.０以下に低下させて、リアクター中における粒
状成形物の均一な流動性を確保するために、粒状成形物
の比重を任意に調整することができる方法を提供するこ
とである。

【０００６】

【発明が解決する手段】本発明者らは、上記した目的を
達成するために鋭意検討を重ねた結果、酵素又は微生物
菌体固定化用粒状成形物の組成中に無機質系微小中空ビ
ーズを添加することにより、粒状成形物の比重を容易に
調整することができることを見い出し、本発明を完成す
るに至った。

【０００７】かくして、本発明に従えば、（ａ） １分
子中に少なくとも２個のエチレン性不飽和結合を有する
親水性光硬化性樹脂、（ｂ） 光重合開始剤、及び
（ｃ） アルカリ金属イオン又は多価金属イオンとの接
触によりゲル化する能力のある水溶性高分子多糖類を含
んでなる水性液状組成物を、アルカリ金属イオン又は多
価金属イオンを含有する水性媒体中に滴下して該組成物
を粒状にゲル化させ、次いで得られる粒状ゲルに活性光
線を照射して該粒状ゲル中の光硬化性樹脂を硬化させる
ことにより酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物を製
造するに際し、該液状組成物中に無機質系微小中空ビー
ズ（ｄ）を添加することを特徴とする酵素又は微生物菌
体固定化用粒状成形物の比重調整方法が提供される。

【０００８】以下、本発明についてさらに詳しく説明す
る。

【０００９】（ａ） 光硬化性樹脂 本発明において、酵素又は微生物菌体固定化用粒状担体
の製造に用いられる１分子中に少なくても２個のエチレ
ン性不飽和結合を有する光硬化性樹脂としては、一般
に、３００〜３００００、好ましくは５００〜２０００
０の範囲内の数平均分子量を有し、水性媒体中に均一に
分散するに充分なイオン性又は非イオン性の親水性基、
例えば水酸基、アミノ基、カルボキシル基、リン酸基、
スルホン酸基、エーテル結合等を含み、かつ波長が約２
５０〜約６００ｎｍの範囲内の活性光線を照射したと
き、硬化して水に不溶性の樹脂に変わるものが好適に使
用される。そのような光硬化性樹脂としては、包括固定
化用の固定化担体として既に知られているものを用いる
ことができる（例えば、特公昭５５−４０号公報、特公
昭５５−２０６７６号公報、特公昭６２−１９８３７号
公報等参照）。代表的なものとしては以下に記載するも
のを挙げることができる。

【００１０】（ｉ） ポリアルキレングリコールの両末
端に光重合可能なエチレン性不飽和基を有する化合物：
例えば、 分子量４００〜６０００のポリエチレングリコール
１モルの両末端水酸基を（メタ）アクリル酸２モルでエ
ステル化したポリエチレングリコールジ（メタ）アクリ
レート類。

【００１１】 分子量２００〜４０００のポリプロピ
レングリコール１モルの両末端水酸基を（メタ）アクリ
ル酸２モルでエステル化したポリプロピレングリコール
ジ（メタ）アクリレート類。

【００１２】 分子量４００〜６０００のポリエチレ
ングリコール１モルの両末端水酸基をトリレンジイソシ
アネート、キシリレンジイソシアネート、イソホロンジ
イソシアネート等のジイソシアネート化合物２モルでウ
レタン化し、次いで（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシ
エチル等の不飽和モノヒドロキシエチル化合物２モルを
付加した不飽和ポリエチレングリコールウレタン化物。

【００１３】 分子量２００〜４０００のポリプロピ
レングリコール１モルの両末端水酸基をトリレンジイソ
シアネート、キシリレンジイソシアネート、イソホロン
ジイソシアネート等のジイソシアネート化合物２モルで
ウレタン化し、次いで（メタ）アクリル酸２−ヒドロキ
シエチル等の不飽和モノヒドロキシ化合物２モルを付加
した不飽和ポリプロピレングリコールウレタン化物、な
ど。

【００１４】（ii） 高酸価不飽和ポリエステル樹脂：
不飽和多価カルボン酸を含む多価カルボン酸成分と多価
アルコールとのエステル化により得られる酸価が４０〜
２００の不飽和ポリエステルの塩類など。

【００１５】（iii） 高酸価不飽和エポキシ樹脂：エポ
キシ樹脂と（メタ）アクリル酸などの不飽和カルボキシ
ル化合物との付加反応物に残存するヒドロキシル基に酸
無水物を付加して得られる酸価４０〜２００の不飽和エ
ポキシ樹脂など。

【００１６】（iv） アニオン性不飽和アクリル樹脂：
（メタ）アクリル酸及び（メタ）アクリル酸エステルか
ら選ばれる少なくとも２種の（メタ）アクリル系モノマ
ーを共重合させて得られるカルボキシル基、リン酸基及
び／又はスルホン酸基を含有する共重合体に光重合可能
なエチレン性不飽和基を導入した樹脂など。

【００１７】（ｖ） 不飽和ポリアミド：トリレンジイ
ソシアネート、キシリレンジイソシアネートなどのジイ
ソシアネートとアクリル酸２−ヒドロキシエチルなどの
エチレン性不飽和ヒドロキシ化合物との付加物をゼラチ
ンなどの水溶性ポリアミドに付加反応させた不飽和ポリ
アミドなど。

【００１８】以上に例示した如き光硬化性樹脂はそれぞ
れ単独で使用することができ、或いは２種もしくはそれ
以上組み合わせて使用してもよい。

【００１９】これらの光硬化性樹脂のうち、本発明にお
いて特に有利に使用しうるものは、前記（ｉ）のポリア
ルキレングリコールの両末端に光重合可能なエチレン性
不飽和基を有する化合物であり、代表的なものとして
は、関西ペイント株式会社からＥＮＴ−１０００、ＥＮ
Ｔ−２０００、ＥＮＴ−４０００、ＥＮＴＧ−２００
０、ＥＮＴＧ−３８００等の商品名で販売されているも
のを挙げることができる。 （ｂ） 光重合開始剤 上記（ａ）に述べた光硬化性樹脂の光重合反応を促進す
る目的で、本発明に従う液状組成物には光重合開始剤を
含ませる。使用しうる光重合開始剤は、光照射により分
解してラジカルを生成し、このものが重合開始種となっ
て重合性不飽和基を有する樹脂間に橋かけ反応をおこさ
せるものであり、例えば、ベンゾインなどのα−カルボ
ニル類；ベンゾインエチルエーテルなどのアシロインエ
ーテル類：ナフトールなどの多環芳香族化合物類；メチ
ルベンゾインなどのα−置換アシロイン類；２−シアノ
−２−ブチルアゾホルムアミドなどのアゾアミド化合物
類などを挙げることができる。

【００２０】（ｃ） 水溶性高分子多糖類 本発明において使用する水溶性高分子多糖類は、水溶性
であり、かつ水性媒体中でアルカリ金属イオン又は多価
金属イオンと接触したときに水に不溶性又は難溶性のゲ
ルに変化する能力のある高分子多糖類であって、一般に
約３０００〜約２００００００の範囲内の数平均分子量
を有し、また、アルカリ金属イオン又は多価金属イオン
と接触させる前の水溶性の状態で通常少なくとも約１０
ｇ／ｌ（２５℃）の溶解度を示すものが好適に使用され
る。

【００２１】かかる特性をもつ水溶性高分子多糖類の具
体例には、アルギン酸のアルカリ金属塩、カラギーナン
等が包含される。

【００２２】これら水溶性高分子多糖類は、水性媒体中
に溶解した状態で、カラギーナンの場合は、カリウムイ
オン又はナトリウムイオン等のアルカリ金属イオンと接
触することによって、また、アルギン酸のアルカリ金属
塩の場合は、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、
ストロンチウムイオン、バリウムイオン等のアルカリ土
類金属イオン；或いはアルミニウムイオン、セリウムイ
オン、ニッケルイオン等の他の多価金属イオン；のうち
の少なくとも１種の多価金属イオンと接触することによ
ってゲル化しうるものである。ゲル化が起るアルカリ金
属イオン又は多価金属イオンの濃度は水溶性高分子多糖
類の種類等により異なるが、一般には０.０１〜５ｍｏ
ｌ／ｌの範囲内である。

【００２３】（ｄ） 無機質系微小中空ビーズ（ｄ） 本発明に従い粒状成型物の比重調整のために使用される
微小中空ビーズ（ｄ）は、好ましくは珪素を主成分と
し、殊に珪酸塩又はアルミナシリカを主成分とし、粒子
内に中空体構造を有する比重が０.３〜０.７の範囲内に
ある完全閉鎖型微小中空粒子であることができる。具体
的には中空ガラスビーズ及び中空セライトを挙げること
ができる。

【００２４】微小中空ビーズ（ｄ）は、一般に１〜２０
０μｍ、好適には３〜５０μｍの範囲内の平均粒子径を
有することができ、また、中空の大きさは、所望される
比重によっても異なるが、通常、ビーズの直径の ¹/₂
以下、好ましくは ¹/₃ 以下であることが有利である。

【００２５】中空の直径が ¹/₂ より大きいものは、得
られる固定化用粒状成形物中で破壊したりして圧縮強度
が低下するおそれがある。

【００２６】微小中空ビーズ（ｄ）は、前記（ａ）、
（ｂ）及び（ｃ）の各成分からなる水性液状組成物中の
（ａ）成分１００重量部に対し０.１〜１０重量部の割
合で添加することによって、得られる粒状成形物の比重
を０.９０〜１.００の範囲内になるように調整すること
ができる。

【００２７】微小中空ビーズとしては市販品を使用する
ことができ、その代表例を商品名で例示すると、例え
ば、Filite ２００／７、同左３００／７（日本フェラ
イト社製、アルミナ・シリカ系）、サンチュライトＹＯ
２、ＹＯ４、ＹＯＣ（三機工業社製、アルミナ・シリカ
系）、ウィンライトＭＳＢ−５０２１、ＭＳＢ−５０１
１、ＳＢ−９０１１、ＳＣ−５０（イヂチ化成工業社
製、アルミナ・シリカ系）、ＺＥＥＯＳＰＨＥＲＥＳ２
００、４００、６００、８００、８５０（Zeelan Indus
tries INC、アルミナ・シリカ系）、グラスバブルスＥ
２２Ｘ、Ｃ１５／２５０、Ｂ２３／５００、Ｂ２８／７
５０、Ｂ３７／２０００、Ｂ３８／４０００、Ｂ４６／
４０００、Ｓ６０／１００００（ミネソタ・マイニング
アンド・ＭＦＧ製、硼珪酸塩ガラス）フジバルーンＳ−
３５、Ｓ−４０、Ｓ−４５、Ｈ−３０、Ｈ−３５、Ｈ−
４０（富士シリシア化学社製、硼珪酸塩ガラス）等が挙
げられる。

【００２８】本発明の酵素又は微生物菌体固定化用粒状
成型物の比重調整は、前記した（ａ）、（ｂ）及び
（ｃ）成分からなる水性液状組成物に、所望の比重に応
じて微小中空ビーズ（ｄ）を添加し、このものをアルカ
リ金属イオン又は多価金属イオンを含有する水性媒体中
に滴下して粒状化することによって行われる。

【００２９】上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の
各成分の相互の使用割合は厳密に制限されるものではな
く、各成分の種類等に応じて広範にわたって変えること
ができるが、一般には、（ａ）成分の親水性光硬化性樹
脂１００重量部に対し、（ｂ）〜（ｄ）成分は下記の割
合で使用するのが適当である（カッコ内は好適範囲であ
る）。

【００３０】（ｂ） 光重合開始剤：０.５〜５重量部
（１〜３重量部） （ｃ） 水溶性高分子多糖類：０.５〜１５重量部（１
〜８重量部） （ｄ） 微小中空ビーズ：０.１〜１０重量部。

【００３１】以上に述べた（ａ）〜（ｄ）の各成分は水
性媒体中に溶解ないし分散させることにより、水性液状
組成物が調製される。この液状組成物の固形分濃度は一
般に５〜３０重量％の範囲内が適当である。

【００３２】このようにして調製される水性液状組成物
は、次いで、前述した如き種類のアルカリ金属イオン又
は多価金属イオンを含有する水性媒体中に滴下すること
により、該液状組成物が粒状でゲル化せしめられる。

【００３３】アルカリ金属イオン又は多価金属イオンを
含有する水性媒体中への水性液状組成物の滴下は、例え
ば、注射器の先端から該液状組成物を滴下する方法、遠
心力を利用して該液状組成物を粒状に飛散させる方法、
スプレーノズルの先端から該液状組成物を霧化して粒状
とし滴下する方法などの方法により行なうことができ
る。滴下する液滴の大きさは、最終の粒状固定化物に望
まれる粒径に応じて自由に変えることができるが、通常
は直径が約０.１〜約５ｍｍ、好ましくは約０.５〜約４
ｍｍの範囲内の液滴として滴下させるのが好都合であ
る。

【００３４】上記の如くして生成せしめた粒状ゲルは、
そのまま水性媒体中に分散させた状態で、或いは水性媒
体から分離した後、活性光線を照射することにより、該
粒状ゲル中の親水性光硬化性樹脂を硬化せしめる。これ
により粒状ゲルは水に実質的に不溶性で機械的強度の大
きい酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物が得ること
ができる。

【００３５】上記の光硬化に使用しうる活性光線の波長
は、該粒状ゲル中に含まれる光硬化性樹脂の種類等に応
じて異なるが、一般には、約２５０〜約６００ｎｍの範
囲内の波長の光を発する光源を照射に使用するのが有利
である。そのような光源の例としては、低圧水銀灯、高
圧水銀灯、蛍光灯、キセノンランプ、カーボンアーク
灯、太陽光等が挙げられる。照射時間は光源の光の強
さ、光源からの距離等に応じて変える必要があるが、一
般には約０.５〜約１０分間の範囲内とすることができ
る。

【００３６】このように照射処理が終った粒状ゲルは水
又は緩衝水溶液で洗浄し、そのまゝあるいは凍結乾燥し
て保存することができる。

【００３７】本発明によって比重調整された酵素又は微
生物菌体固定化用粒状成形物は、表面の構造が特に微生
物の付着に適しており、微生物を大量に付着させること
ができる。該担体に付着させうる微生物は、特に限定さ
れず、嫌気性微生物、好気性微生物のどちらでも用いる
ことができる。微生物の種類としては、アスパルギルス
属、ペニシリウム属、フザリウム属などのカビ類、サッ
カロミセス属、ファフィア属、カンジダ属などの酵母
類；ザイモモナス属、ニトロソモナス属、ニトロバクタ
ー属、パラコッカス属、ビブリオ属、メタノサルシナ
属、バチルス属などの細菌類等を挙げることができる。

【００３８】なお、上記した微生物や酵素は、予め
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の各成分からなる水
性液状物に混合しておいて包括固定化してもよい。

【００３９】かくして、本発明により、従来の水とほゞ
同じ比重を有する粒状固定化物を、その性能を変えるこ
となく、水より低い比重を有するものに容易に変えるこ
とができる。しかも、本発明により提供される粒状固定
化物は、水中における流動性に優れているため、流動床
型のバイオリアクターまたは撹拌型の発酵槽等に使用す
るのに最も適しているが、固定床型のバイオリアクタ
ー、発酵槽等に応用することも可能である。

【００４０】

【実施例】次に実施例により本発明をさらに説明する。

【００４１】実施例１ 分子量約４０００のポリエチレングリコール２０００ｇ
とイソホロンジイソシアネート１モル（２２２ｇ）およ
びメタクリル酸２−ヒドロキシエチル１モル（１３０
ｇ）の混合物からなる光硬化性（樹脂）プレポリマー１
００重量部と、ベンゾインイソブチルエーテル２重量
部、２％アルギン酸ナトリウム水溶液１００重量部、平
均粒径４０μｍの微小中空ガラスビーズ（富士シリアル
社製商品名Ｓ３５ビーズ、真比重０.３５）６重量部お
よび蒸留水１００重量部をよく混合して得られる水性液
状組成物を、１モル濃度の塩化カルシウム溶液中に、注
射器の先端から液面高さ１０ｃｍより滴下したところ、
粒径約２ｍｍの粒状物が得られた。

【００４２】この粒状物を平らな底面を有するペトリ皿
にとり、ペトリ皿の上面及び下面から波長３００〜４０
０ｎｍの活性光線を３分間照射したところ、比重０.９
３及び圧縮強度２０ｋｇ／ｃｍ²の固定化用粒状成形物
が得られた。

【００４３】実施例２ ポリエチレングリコール２０００（分子量２０００）１
０００ｇとメチルメタクリレート１モルとからなる光硬
化性（樹脂）プレポリマー１００重量部に蒸留水１００
重量部を加えてから約５０℃に加温してよく混合して均
一な樹脂水溶液とし、これにベンゾインエチルエーテル
２重量部を加えて混合溶解した。

【００４４】この樹脂混合液に３％ｋ−カラギーナン水
溶液７５重量部、実施例１で用いたと同じ微小中空ガラ
スビーズ２.５重量部及び２％グリコースイソメラーゼ
菌体酵素液（重炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８）２５重量
部を加えて均一な混合液を作成した。この均一な混合液
を注射器の先端から５％塩化カリウム水溶液中に液面よ
り２０ｃｍの位置から滴下したところ粒径１.５ｍｍの
粒状物が得られた。

【００４５】この粒状物を平らな底面を有するペトリ皿
に単層となるように塩化カリウム液と共に移し、深さ２
ｍｍの水溶液中に粒状物が存在するようにして上面より
３分間及び下面より３分間波長３００〜４００ｎｍの活
性光線を照射したところ、比重０.９５及び圧縮強度３
０ｋｇ／ｃｍ²の粒状固定化酵素が得られた。

【００４６】実施例３ 重合度が５００のポリビニルアルコール５００ｇに１.
０モルのＮ−メチロールアクリルアミドを付加して得た
光硬化性樹脂の２５％水溶液１００重量部に、ベンゾイ
ンイソブチルエーテル０.５重量部を均一に混合し、３
％ｋ−カラギーナン水溶液１００重量部及び平均粒子径
７５μｍの中空アルミナシリカ（日本フエライト社製商
品名、Filite ３００／７、真比重０.７）５重量部を均
一に混合分散したものを注射器の先端より０.５モル濃
度の塩化カリウム溶液中に滴下させ、粒状にゲル化させ
た。これをペトリ皿に入れ、上面及び下面より同時に３
００〜４００ｎｍの光を３分間照射して、粒径３ｍｍ、
比重０.９７および圧縮強度１０ｋｇ／ｃｍ²の固定化用
粒状成型物を作ることができた。

【００４７】

【発明の効果】本発明の酵素又は微生物菌体固定化用粒
状成形物の比重調整方法により、上記実施例から明らか
なように、粒状成形物の比重を容易に１.０以下に調整
することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 11/08 Ｃ１２Ｎ 11/08 Ａ // Ｃ０８Ｆ 299/00 Ｃ０８Ｆ 299/00

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ） １分子中に少なくとも２個のエチ
   レン性不飽和結合を有する親水性光硬化性樹脂、（ｂ）
   光重合開始剤、及び（ｃ） アルカリ金属イオン又は
   多価金属イオンとの接触によりゲル化する能力のある水
   溶性高分子多糖類を含んでなる水性液状組成物を、アル
   カリ金属イオン又は多価金属イオンを含有する水性媒体
   中に滴下して該組成物を粒状にゲル化させ、次いで得ら
   れる粒状ゲルに活性光線を照射して該粒状ゲル中の光硬
   化性樹脂を硬化させることにより酵素又は微生物菌体固
   定化用粒状成形物を製造するに際し、該液状組成物中に
   無機質系微小中空ビーズ（ｄ）を添加することを特徴と
   する酵素又は微生物菌体固定化用粒状成形物の比重調整
   方法。
2. 【請求項２】 無機質系微小中空ビーズ（ｄ）が、平均
   粒子径１〜２００μｍ及び比重０.３〜０.７の範囲内に
   ある中空ガラスビーズ又は中空セライトである請求項１
   記載の方法。
3. 【請求項３】 無機質系微小中空ビーズ（ｄ）の添加量
   が、該水性液状組成物中の親水性光硬化性樹脂（ａ）１
   ００重量部に対し０.１〜１０重量部の範囲内である請
   求項１又は２記載の方法。