JPH10192372A - 制御水分条件下での乾熱ウイルス不活化 - Google Patents
制御水分条件下での乾熱ウイルス不活化Info
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- JPH10192372A JPH10192372A JP9327193A JP32719397A JPH10192372A JP H10192372 A JPH10192372 A JP H10192372A JP 9327193 A JP9327193 A JP 9327193A JP 32719397 A JP32719397 A JP 32719397A JP H10192372 A JPH10192372 A JP H10192372A
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- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2/00—Disinfection or sterilisation of materials or objects, in general; Accessories therefor
- A61L2/02—Disinfection or sterilisation of materials or objects, in general; Accessories therefor using physical processes
- A61L2/04—Heat
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
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- A61L2103/05—Living organisms or biological materials
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ウイルス不含血液製剤の提供。
【解決手段】 生物学的に活性な蛋白質組成物をウイル
スを実質的に含まない状態にさせる、所定の水分含有量
を有する蛋白質組成物の凍結乾燥試料を調製し、その組
成物を低温殺菌条件にまで加熱した際にウイルス力価の
少なくとも３．２ｌｏｇ10の低下をもたらすであろう最
少もしくは閾水分含有量を決定し、そしてその後にその
蛋白質の生物学的活性を維持させながらもウイルス力価
の少なくとも３．２ ｌｏｇ10の低下をもたらすであろ
う低温殺菌条件下でその試料を加熱することを含む方
法。
スを実質的に含まない状態にさせる、所定の水分含有量
を有する蛋白質組成物の凍結乾燥試料を調製し、その組
成物を低温殺菌条件にまで加熱した際にウイルス力価の
少なくとも３．２ｌｏｇ10の低下をもたらすであろう最
少もしくは閾水分含有量を決定し、そしてその後にその
蛋白質の生物学的活性を維持させながらもウイルス力価
の少なくとも３．２ ｌｏｇ10の低下をもたらすであろ
う低温殺菌条件下でその試料を加熱することを含む方
法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は一般的に、凍結乾燥
させた生物学的蛋白質ケーキでの加熱によるウイルスの
不活化に関し、そして具体的には低温殺菌条件下で加熱
する際には生物学的蛋白質マトリックスでのウイルス力
価の実質的低下に必要とされる前記蛋白質マトリックス
中の含水量（水分）の最少量を決定することに関する。
させた生物学的蛋白質ケーキでの加熱によるウイルスの
不活化に関し、そして具体的には低温殺菌条件下で加熱
する際には生物学的蛋白質マトリックスでのウイルス力
価の実質的低下に必要とされる前記蛋白質マトリックス
中の含水量（水分）の最少量を決定することに関する。
【０００２】
【従来の技術】多くの生物学的に活性な蛋白質がヒトに
おける疾患症状を治療するのに用いられている。しかし
ながらヒト血液から単離された活性蛋白質の調剤作業に
はウイルス媒介性疾患を伝播させるという固有の危険性
が伴う。従って蛋白質含有産物の製造の際には、ウイル
ス感染の危険を減少させる安全な産物を生産するための
ウイルスの低下もしくは不活化工程を組み入れるのが一
般的である。
おける疾患症状を治療するのに用いられている。しかし
ながらヒト血液から単離された活性蛋白質の調剤作業に
はウイルス媒介性疾患を伝播させるという固有の危険性
が伴う。従って蛋白質含有産物の製造の際には、ウイル
ス感染の危険を減少させる安全な産物を生産するための
ウイルスの低下もしくは不活化工程を組み入れるのが一
般的である。
【０００３】ウイルス力価は蛋白質を精製するのに用い
られる方法により低下することもある。血漿からＩｇＧ
分画を精製するのに用いられるＣｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙ
法はウイルス力価が低下している蛋白質を生産すること
が見いだされている。例えば、Ｍｉｔｒａらに対する米
国特許第４，７６２，７１４号を参照されたい。更に
は、血液構成成分の感染性を低下させる簡潔な一般的論
議についてはＦｒｉｅｄｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇ．Ｉｎｖｅｓｔ． ２４：４９−７１（１９９５年）
も参照されたい。
られる方法により低下することもある。血漿からＩｇＧ
分画を精製するのに用いられるＣｏｈｎ−Ｏｎｃｌｅｙ
法はウイルス力価が低下している蛋白質を生産すること
が見いだされている。例えば、Ｍｉｔｒａらに対する米
国特許第４，７６２，７１４号を参照されたい。更に
は、血液構成成分の感染性を低下させる簡潔な一般的論
議についてはＦｒｉｅｄｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇ．Ｉｎｖｅｓｔ． ２４：４９−７１（１９９５年）
も参照されたい。
【０００４】化学物質および／または加熱での処理によ
るウイルスの不活化の方法は当該技術分野では一般的と
なっている。例えば、引用により本明細書に取り込まれ
るＮｅｕｒａｔｈら（１９８５年）に対する米国特許第
４，５４０，５７３号は、トリアルキルリン酸および洗
剤によるウイルスを不活化させるための蛋白質含有性組
成物の処理についての記載を行っている。そのような溶
媒／洗剤法は、血液産物特性については限定された効果
を示しながらも包膜ウイルスの不活化には効果的である
として承認されている。Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｖｏｘ Ｓ
ａｎｇ． ５２：５３−５９（１９８７年）。更に、様
々なウイルス不活化法の検討についてはＳｅｎｇらに対
する米国特許第４，３９，１７６号（１９９０年）も参
照されたい。Ｋａｍｅｙａｍａらに対する米国特許第
５，１５１，４９９号（１９９２年）はウイルス力価の
大きな低下をもたらすために、トリアルキルリン酸／洗
剤方法に乾熱工程を付加している。非包膜ウイルスでの
最終乾熱処理の凝血因子濃度における効果がＨａｒｔ
ら、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ、６７：３４５−３５０（１９９
４年）に検討されている。
るウイルスの不活化の方法は当該技術分野では一般的と
なっている。例えば、引用により本明細書に取り込まれ
るＮｅｕｒａｔｈら（１９８５年）に対する米国特許第
４，５４０，５７３号は、トリアルキルリン酸および洗
剤によるウイルスを不活化させるための蛋白質含有性組
成物の処理についての記載を行っている。そのような溶
媒／洗剤法は、血液産物特性については限定された効果
を示しながらも包膜ウイルスの不活化には効果的である
として承認されている。Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｖｏｘ Ｓ
ａｎｇ． ５２：５３−５９（１９８７年）。更に、様
々なウイルス不活化法の検討についてはＳｅｎｇらに対
する米国特許第４，３９，１７６号（１９９０年）も参
照されたい。Ｋａｍｅｙａｍａらに対する米国特許第
５，１５１，４９９号（１９９２年）はウイルス力価の
大きな低下をもたらすために、トリアルキルリン酸／洗
剤方法に乾熱工程を付加している。非包膜ウイルスでの
最終乾熱処理の凝血因子濃度における効果がＨａｒｔ
ら、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ、６７：３４５−３５０（１９９
４年）に検討されている。
【０００５】溶媒と洗剤との混合物での蛋白質の処理
は、生物学的もしくは生物技術的資源のいずれかに由来
する蛋白質による包膜ウイルスの伝播を妨害するのに広
く用いられている。Ｐｉｅｔら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏ
ｎ ３０：５９２−９８（１９９０年）。この処理は脂
質包膜を有するウイルスに対して有効であり、かつこの
構造を含まないウイルスに対してはその有効性はかなり
低くなる。近年、溶剤／洗剤で処理された生物学的産物
の使用による少なくとも２つの非包膜ウイルスの伝播が
記載されている。非包膜ＲＮＡウイルスであるＡ型肝炎
ウイルスは、予め溶剤と洗剤で処理してある因子ＶＩＩ
Ｉ産物を用いることで患者に伝播してしまった。Ｐｕｒ
ｃｅｌｌら、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．６７（Ｓｕｐｐ．
４）：２−７（１９９４）。因子ＶＩＩＩは更にはヒト
に対する非包膜パルボウイルスＢ１９の伝播への関連が
暗示されている。Ｌｅｆｒｅｒｅら、Ｌａｎｃｅｔ ３
４３：２１１−１２（１９９４年）。
は、生物学的もしくは生物技術的資源のいずれかに由来
する蛋白質による包膜ウイルスの伝播を妨害するのに広
く用いられている。Ｐｉｅｔら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏ
ｎ ３０：５９２−９８（１９９０年）。この処理は脂
質包膜を有するウイルスに対して有効であり、かつこの
構造を含まないウイルスに対してはその有効性はかなり
低くなる。近年、溶剤／洗剤で処理された生物学的産物
の使用による少なくとも２つの非包膜ウイルスの伝播が
記載されている。非包膜ＲＮＡウイルスであるＡ型肝炎
ウイルスは、予め溶剤と洗剤で処理してある因子ＶＩＩ
Ｉ産物を用いることで患者に伝播してしまった。Ｐｕｒ
ｃｅｌｌら、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．６７（Ｓｕｐｐ．
４）：２−７（１９９４）。因子ＶＩＩＩは更にはヒト
に対する非包膜パルボウイルスＢ１９の伝播への関連が
暗示されている。Ｌｅｆｒｅｒｅら、Ｌａｎｃｅｔ ３
４３：２１１−１２（１９９４年）。
【０００６】乾式粉末としてか（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ
に対する米国特許第４，４５６，５９０号（１９８４
年）；Ｔｈｏｍａｓに対する米国特許第４，４９５，２
７８号（１９８５年））もしくは水溶液で（Ｓｃｈｗｉ
ｎｎらに対する米国特許第４，２９７，３４４号（１９
８１年）；Ｆｕｋｕｓｈｉｍａらに対する米国特許第
４，３２７，０８６号（１９８２年））のいずれかでの
形態の蛋白質の加熱での処理が非包膜ウイルスを誘導す
る抗−ウイルス活性のスペクトラムを拡張するのに用い
られている。しかしながら非包膜ウイルスの不活化は一
般的には包膜ウイルスに対するものより難易度が高く、
かつ完全な不活化を確実に達成するためには一層長期の
処理時間もしくは一層高目の温度が必要とされることが
よくある。Ｂ１９は１００℃で３０分間乾熱処理された
因子ＶＩＩＩ産物により患者に伝播した。Ｓａｎｔａｇ
ｏｓｔｉｎｏら、Ｌａｎｃｅｔ ３４３：７９８（１９
９４）。６３℃で１０時間のＦＶＩＩＩの溶液低温殺菌
は幾つかの非包膜ウイルスを完全に不活化するには不十
分であった。Ｂｉｅｓｅｒｔら、Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇ
ｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ６（ｓｕｐｐ．
２）：Ｓ４８−５４（１９９５年）。
に対する米国特許第４，４５６，５９０号（１９８４
年）；Ｔｈｏｍａｓに対する米国特許第４，４９５，２
７８号（１９８５年））もしくは水溶液で（Ｓｃｈｗｉ
ｎｎらに対する米国特許第４，２９７，３４４号（１９
８１年）；Ｆｕｋｕｓｈｉｍａらに対する米国特許第
４，３２７，０８６号（１９８２年））のいずれかでの
形態の蛋白質の加熱での処理が非包膜ウイルスを誘導す
る抗−ウイルス活性のスペクトラムを拡張するのに用い
られている。しかしながら非包膜ウイルスの不活化は一
般的には包膜ウイルスに対するものより難易度が高く、
かつ完全な不活化を確実に達成するためには一層長期の
処理時間もしくは一層高目の温度が必要とされることが
よくある。Ｂ１９は１００℃で３０分間乾熱処理された
因子ＶＩＩＩ産物により患者に伝播した。Ｓａｎｔａｇ
ｏｓｔｉｎｏら、Ｌａｎｃｅｔ ３４３：７９８（１９
９４）。６３℃で１０時間のＦＶＩＩＩの溶液低温殺菌
は幾つかの非包膜ウイルスを完全に不活化するには不十
分であった。Ｂｉｅｓｅｒｔら、Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇ
ｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ６（ｓｕｐｐ．
２）：Ｓ４８−５４（１９９５年）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】生物学的産物の安全性
を維持および改善するためにはウイルス不活化の改善法
が必要とされることは自明である。
を維持および改善するためにはウイルス不活化の改善法
が必要とされることは自明である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】生物学的に活性な蛋白質
組成物を実質的にウイルス不含有性にさせる我々の方法
は、所定の含水量（もしくは水分）を有する組成物の凍
結乾燥試料を調製する工程、そのウイルスの実質的減少
を確実に達成する低温殺菌条件下でその組成物を加熱す
る際に生物学的活性を維持させながらウイルス力価の実
質的低下を確実に達成させるのに必要な最低もしくは限
界含水量を決定する工程、その最低含水量を有する試料
を選択する工程、およびその後の低温殺菌条件にそれら
選択された試料を供する工程を含んでなる。この方法は
非破壊的であり、かつ乾燥減量およびカール・フィシャ
ー法のような現在で用いられている技術との相関関係を
示すことができる。
組成物を実質的にウイルス不含有性にさせる我々の方法
は、所定の含水量（もしくは水分）を有する組成物の凍
結乾燥試料を調製する工程、そのウイルスの実質的減少
を確実に達成する低温殺菌条件下でその組成物を加熱す
る際に生物学的活性を維持させながらウイルス力価の実
質的低下を確実に達成させるのに必要な最低もしくは限
界含水量を決定する工程、その最低含水量を有する試料
を選択する工程、およびその後の低温殺菌条件にそれら
選択された試料を供する工程を含んでなる。この方法は
非破壊的であり、かつ乾燥減量およびカール・フィシャ
ー法のような現在で用いられている技術との相関関係を
示すことができる。
【０００９】本明細書に用いられる際にはウイルス力価
の実質的低下は、ウイルス力価の少なくとも約３．２
ｌｏｇ10単位の低下を、そして一層好ましくは少なくと
も約４ ｌｏｇ10単位の低下を意味する。
の実質的低下は、ウイルス力価の少なくとも約３．２
ｌｏｇ10単位の低下を、そして一層好ましくは少なくと
も約４ ｌｏｇ10単位の低下を意味する。
【００１０】本明細書に用いられる際には生物学的活性
の維持は、意図される結果に有用な測定可能な機能もし
くは活性を表すことを意味する（特に、変性状態もしく
は使用不可状態での同一蛋白質に相対するものとし
て）。機能、活性、もしくは意図される結果は例えば、
酵素活性もしくは結合親和性であってよい。以下の実施
例では低温殺菌条件は、そのような生物学的活性を維持
するのに許容されることが知られている範囲内で選択し
た。
の維持は、意図される結果に有用な測定可能な機能もし
くは活性を表すことを意味する（特に、変性状態もしく
は使用不可状態での同一蛋白質に相対するものとし
て）。機能、活性、もしくは意図される結果は例えば、
酵素活性もしくは結合親和性であってよい。以下の実施
例では低温殺菌条件は、そのような生物学的活性を維持
するのに許容されることが知られている範囲内で選択し
た。
【００１１】低温殺菌条件は、少なくとも６０℃の温度
で少なくとも１０時間加熱することを意味する。
で少なくとも１０時間加熱することを意味する。
【００１２】
【発明の具体的な記述】凍結乾燥させた凝血因子濃縮物
の乾熱処理中に効果的なウイルス不活化をもたらす目的
での水分の最低限界レベルについての要件が記述され
る。加熱中の含水量を決定するのに用いられる技術は乾
燥減量（ＬＯＤ）法およびカール・フィシャー（ＫＦ）
法であった。日常的に用いられる技術では、試料の調製
および取り扱いの結果としてもたらされる過誤を生じる
ことが見いだされた。従って、近赤外分光分析（ＮＩ
Ｒ）を用いる残存含水量の決定のための非侵害的、非破
壊的方法を、凍結乾燥された抗血友病因子（ＡＨＦ）用
に開発した。この方法は、赤外スペクトルの領域の比例
Ｏ−Ｈ倍振動シグナルおよび凍結乾燥ケーキ中の残存含
水量に基づく。決定は未開封バイアルで実施することが
でき、そしてそのため測定は大気水分からの妨害による
影響を受けない。ＮＩＲは二次的技術であり、そして例
えばカール・フィシャー法もしくは乾燥減量（Ｌｏｓｓ
−ｏｎ−ｄｒｙｉｎｇ）法のような一次技術に対する較
正に当てられる。較正式を両対照方法に対して決定し、
そしてそれらの式についての評価を行った。この方法を
用いて、８０℃での乾熱によるウイルス不活化の効率に
おける水分含有量の効果を評定した。
の乾熱処理中に効果的なウイルス不活化をもたらす目的
での水分の最低限界レベルについての要件が記述され
る。加熱中の含水量を決定するのに用いられる技術は乾
燥減量（ＬＯＤ）法およびカール・フィシャー（ＫＦ）
法であった。日常的に用いられる技術では、試料の調製
および取り扱いの結果としてもたらされる過誤を生じる
ことが見いだされた。従って、近赤外分光分析（ＮＩ
Ｒ）を用いる残存含水量の決定のための非侵害的、非破
壊的方法を、凍結乾燥された抗血友病因子（ＡＨＦ）用
に開発した。この方法は、赤外スペクトルの領域の比例
Ｏ−Ｈ倍振動シグナルおよび凍結乾燥ケーキ中の残存含
水量に基づく。決定は未開封バイアルで実施することが
でき、そしてそのため測定は大気水分からの妨害による
影響を受けない。ＮＩＲは二次的技術であり、そして例
えばカール・フィシャー法もしくは乾燥減量（Ｌｏｓｓ
−ｏｎ−ｄｒｙｉｎｇ）法のような一次技術に対する較
正に当てられる。較正式を両対照方法に対して決定し、
そしてそれらの式についての評価を行った。この方法を
用いて、８０℃での乾熱によるウイルス不活化の効率に
おける水分含有量の効果を評定した。
【００１３】材料および方法 用いられたウイルスおよびウイルス不活化実験の設計 この実験のために選択されたウイルスおよびそれらの特
性が表１にまとめてある。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２
を代表する臨床的に注目すべきウイルスとしてＨＩＶ−
１についての評価を実施した。包膜ＲＮＡウイルスであ
るウシウイルス性下痢病ウイルス（ＢＶＤＶ）をＣ型肝
炎ウイルスについての適切なモデルとして選択した。包
膜ＤＮＡウイルスである仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）
を、臨床的に適切なヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ）ウイル
ス、すなわち：ＣＭＶ、エプスタイン−バール（Ｅｐｓ
ｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス、および単純疱疹（Ｈｅ
ｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）ウイルスのタイプ１、２、
６、および７についてのモデルとして選択した。更には
非包膜ＲＮＡウイルスであるレオウイルス（Ｒｅｏｖｉ
ｒｕｓ）タイプ３（Ｒｅｏ）を物理化学的試薬に対する
耐性を有するモデルウイルスとして選択した。Ａ型肝炎
ウイルス（ＨＡＶ）の株ＨＭ１７５を凝血産物のための
臨床的に適切なウイルスとして用い、そしてブタパルボ
ウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｐａｒｖｏ ｖｉｒｕｓ）
（ＰＰＶ）をヒトＢ１９パルボウイルスについてのモデ
ルとして用いた。これらのウイルス（ＨＡＶおよびＰＰ
Ｖ）の両方共が物理化学的不活化法に対して高い耐性を
示すことも知られている。ウイルスの選択は、１９９６
年３月１３日に出版された「ｔｈｅ Ｎｏｔｅ ｆｏｒ
Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｏｎ ｐｌａｓｍａ ｄｅｒｉｖｅ
ｄ ＭｅｄｉｃｉｎａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ ＣＰＭＰ／
ＢＷＰ／２６９／９５」において公開された推奨事項に
従っている。
性が表１にまとめてある。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２
を代表する臨床的に注目すべきウイルスとしてＨＩＶ−
１についての評価を実施した。包膜ＲＮＡウイルスであ
るウシウイルス性下痢病ウイルス（ＢＶＤＶ）をＣ型肝
炎ウイルスについての適切なモデルとして選択した。包
膜ＤＮＡウイルスである仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）
を、臨床的に適切なヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ）ウイル
ス、すなわち：ＣＭＶ、エプスタイン−バール（Ｅｐｓ
ｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス、および単純疱疹（Ｈｅ
ｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）ウイルスのタイプ１、２、
６、および７についてのモデルとして選択した。更には
非包膜ＲＮＡウイルスであるレオウイルス（Ｒｅｏｖｉ
ｒｕｓ）タイプ３（Ｒｅｏ）を物理化学的試薬に対する
耐性を有するモデルウイルスとして選択した。Ａ型肝炎
ウイルス（ＨＡＶ）の株ＨＭ１７５を凝血産物のための
臨床的に適切なウイルスとして用い、そしてブタパルボ
ウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｐａｒｖｏ ｖｉｒｕｓ）
（ＰＰＶ）をヒトＢ１９パルボウイルスについてのモデ
ルとして用いた。これらのウイルス（ＨＡＶおよびＰＰ
Ｖ）の両方共が物理化学的不活化法に対して高い耐性を
示すことも知られている。ウイルスの選択は、１９９６
年３月１３日に出版された「ｔｈｅ Ｎｏｔｅ ｆｏｒ
Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｏｎ ｐｌａｓｍａ ｄｅｒｉｖｅ
ｄ ＭｅｄｉｃｉｎａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ ＣＰＭＰ／
ＢＷＰ／２６９／９５」において公開された推奨事項に
従っている。
【００１４】ウイルス定量アッセイ 標準的細胞培養条件を、非必須アミノ酸、ＨＥＰＥＳ緩
衝液（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’
−［２−エタンスルホン酸］）、ウシ胎仔血清、および
抗生物質を補足してあるＲＰＭＩ１６４０もしくはイー
グル（Ｅａｇｌｅ）最少必須培地（ＭＥＭ）でのウイル
ス不活化アッセイ用に用いた。ＲＰＭＩ１６４０培地は
ＭＴ−４細胞についてのみ用いた。ウイルス力価は５０
％不活化（ＴＣＩＤ50）での組織培養物感染用量アッセ
イにより定量した。ＴＣＩＤ50力価はＳｐｅａｒｍａｎ
−Ｋａｅｒｂｅｒの方法により算出した。
衝液（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’
−［２−エタンスルホン酸］）、ウシ胎仔血清、および
抗生物質を補足してあるＲＰＭＩ１６４０もしくはイー
グル（Ｅａｇｌｅ）最少必須培地（ＭＥＭ）でのウイル
ス不活化アッセイ用に用いた。ＲＰＭＩ１６４０培地は
ＭＴ−４細胞についてのみ用いた。ウイルス力価は５０
％不活化（ＴＣＩＤ50）での組織培養物感染用量アッセ
イにより定量した。ＴＣＩＤ50力価はＳｐｅａｒｍａｎ
−Ｋａｅｒｂｅｒの方法により算出した。
【００１５】９６ウエルのマイクロタイタープレートを
適切な密集細胞と共に用いた（ウシ鼻甲介（Ｂｏｖｉｎ
ｅ Ｔｕｒｂｉｎａｔｅ）（ＢＴ）細胞中のＢＶＤＶ、
Ｒａｂ−９細胞中のＰＲＶ、ＢＳＣ−１もしくはベロ
（Ｖｅｒｏ）細胞中のＲｅｏ、アカゲザル胎仔腎臓（Ｆ
ｅｔａｌ Ｒｈｅｓｕｓ Ｋｉｄｎｅｙ）（ＦＲｈＫ）
細胞中のＨＡＶ、およびブタ精巣（Ｓｗｉｎｅ Ｔｅｓ
ｔｉｃｌｅ）（ＳＴ）細胞中のＰＰＶ）。ＰＲＶのＢｅ
ｃｋｅｒ株を、高力価が必要とされる研究用に用いた。
ウイルススパイク過程用接種物はウエル当たり０．１ｍ
Ｌであった。ウイルス吸着を考慮するため検査物質を３
７℃で１時間細胞に接触させた。この物質を除去し、そ
して新鮮なＭＥＭをそれらのウエルに添加した。ＰＲ
Ｖ、Ｒｅｏ、ＨＡＶ、およびＰＰＶについてはＭＥＭを
用いた。ＢＶＤＶについてはＭＥＭに、ウシ胎仔血清よ
りはむしろウマ血清を補足した。これらのプレートを３
６±２℃で５〜７日間インキュベートした。ＨＡＶ感染
細胞を３６±２℃で１０〜１４日間インキュベートし
た。インキュベーション後、細胞単層を細胞変性効果
（ＣＥＰ）により示されるウイルス感染の存在について
顕微鏡で観察した。５〜７日後には、ＢＶＤＶおよびＰ
ＲＶにより誘導されるＣＰＥは顕微鏡観察により容易に
識別された。ウイルス感染のＣＰＥの形跡はＲｅｏおよ
びＰＰＶについては７日目に、そしてＨＡＶについては
１０〜１４日目に観察された。
適切な密集細胞と共に用いた（ウシ鼻甲介（Ｂｏｖｉｎ
ｅ Ｔｕｒｂｉｎａｔｅ）（ＢＴ）細胞中のＢＶＤＶ、
Ｒａｂ−９細胞中のＰＲＶ、ＢＳＣ−１もしくはベロ
（Ｖｅｒｏ）細胞中のＲｅｏ、アカゲザル胎仔腎臓（Ｆ
ｅｔａｌ Ｒｈｅｓｕｓ Ｋｉｄｎｅｙ）（ＦＲｈＫ）
細胞中のＨＡＶ、およびブタ精巣（Ｓｗｉｎｅ Ｔｅｓ
ｔｉｃｌｅ）（ＳＴ）細胞中のＰＰＶ）。ＰＲＶのＢｅ
ｃｋｅｒ株を、高力価が必要とされる研究用に用いた。
ウイルススパイク過程用接種物はウエル当たり０．１ｍ
Ｌであった。ウイルス吸着を考慮するため検査物質を３
７℃で１時間細胞に接触させた。この物質を除去し、そ
して新鮮なＭＥＭをそれらのウエルに添加した。ＰＲ
Ｖ、Ｒｅｏ、ＨＡＶ、およびＰＰＶについてはＭＥＭを
用いた。ＢＶＤＶについてはＭＥＭに、ウシ胎仔血清よ
りはむしろウマ血清を補足した。これらのプレートを３
６±２℃で５〜７日間インキュベートした。ＨＡＶ感染
細胞を３６±２℃で１０〜１４日間インキュベートし
た。インキュベーション後、細胞単層を細胞変性効果
（ＣＥＰ）により示されるウイルス感染の存在について
顕微鏡で観察した。５〜７日後には、ＢＶＤＶおよびＰ
ＲＶにより誘導されるＣＰＥは顕微鏡観察により容易に
識別された。ウイルス感染のＣＰＥの形跡はＲｅｏおよ
びＰＰＶについては７日目に、そしてＨＡＶについては
１０〜１４日目に観察された。
【００１６】装置 用いられた近赤外（Ｎｅａｒ Ｉｎｆｒａｒｅｄ）分光
計は、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓａｍｐｌｅｒ
（ＲＣＳ）およびＶｉｓｉｏｎ−ＤＡデータ収集ソフト
ウエアーを搭載してあるＮＩＲ Ｓｙｓｔｅｍ モデル
６５００であった。ＲＣＳサンプリングアクセサリー
は、ガラス製産物用バイアルの底を通過するよう入射Ｎ
ＩＲビームの方角設定を行うことによる凍結乾燥産物の
非侵害的分析を考慮するものであり、その入射ビームは
後には試料を貫通し、そして全方向に分散的に反射す
る。反射エネルギーのある部分が入射ビームファイバー
束の周辺付近に配置された６つ一組の検出機により回収
される。
計は、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓａｍｐｌｅｒ
（ＲＣＳ）およびＶｉｓｉｏｎ−ＤＡデータ収集ソフト
ウエアーを搭載してあるＮＩＲ Ｓｙｓｔｅｍ モデル
６５００であった。ＲＣＳサンプリングアクセサリー
は、ガラス製産物用バイアルの底を通過するよう入射Ｎ
ＩＲビームの方角設定を行うことによる凍結乾燥産物の
非侵害的分析を考慮するものであり、その入射ビームは
後には試料を貫通し、そして全方向に分散的に反射す
る。反射エネルギーのある部分が入射ビームファイバー
束の周辺付近に配置された６つ一組の検出機により回収
される。
【００１７】カール・フィシャー滴定は、ＥＭ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ社のＡｑｕａｓｔｅｒ Ｃ３０００ Ｃｏｕｌ
ｏｍｅｔｒｉｃ滴定機を用いて実施した。この装置で
は、細胞中に存在するヨウ素から電気化学的にヨウ素が
算出される。ヨウ素、メタノール、二酸化硫黄、および
アミンが、水と定量的に反応するカール・フィシャー試
薬を形成する。
ｅｎｃｅ社のＡｑｕａｓｔｅｒ Ｃ３０００ Ｃｏｕｌ
ｏｍｅｔｒｉｃ滴定機を用いて実施した。この装置で
は、細胞中に存在するヨウ素から電気化学的にヨウ素が
算出される。ヨウ素、メタノール、二酸化硫黄、および
アミンが、水と定量的に反応するカール・フィシャー試
薬を形成する。
【００１８】試薬 Ｐｙｒｉｄｉｎｅ Ｆｒｅｅ Ｃｏｕｌｏｍａｔ Ｓｉ
ｎｇｌｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ
社）およびＣｅｒｔｉｆｉｅｄ Ａ．Ｃ．Ｓ．メタノー
ル（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）をＫａｒｌ Ｆ
ｉｓｃｈｅｒ決定に用いた。ヒドラナール（Ｈｙｄｒａ
ｎａｌ）（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ）をＫＦ法用
の水標準として用いた。
ｎｇｌｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ
社）およびＣｅｒｔｉｆｉｅｄ Ａ．Ｃ．Ｓ．メタノー
ル（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）をＫａｒｌ Ｆ
ｉｓｃｈｅｒ決定に用いた。ヒドラナール（Ｈｙｄｒａ
ｎａｌ）（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ）をＫＦ法用
の水標準として用いた。
【００１９】試料 抗血友病因子（Ａｎｔｉｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ Ｆａｃ
ｔｏｒ）（ＡＨＦ）の産物バッチからの試料を、評価を
実施した様々な方法による水分決定のために取得した。
実験的乾熱処理を施したＡＨＦ試料（８０℃で７２〜７
７時間）も実験的産生作業およびウイルス学科（Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ）から取得した。ウ
イルス学科（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎ
ｔ）から取得された試料をウイルス不活化段階としての
乾熱のウイルス低下評価用に用いた。
ｔｏｒ）（ＡＨＦ）の産物バッチからの試料を、評価を
実施した様々な方法による水分決定のために取得した。
実験的乾熱処理を施したＡＨＦ試料（８０℃で７２〜７
７時間）も実験的産生作業およびウイルス学科（Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ）から取得した。ウ
イルス学科（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎ
ｔ）から取得された試料をウイルス不活化段階としての
乾熱のウイルス低下評価用に用いた。
【００２０】方法 全試料を個別に同定し、そしてＮＩＲでのスキャンを行
ってからＫＦ法もしくはＬＯＤ法のいずれかによる分析
を実施した。分光計を水平位置に設置した。モニターを
行ったスペクトル領域は１１００〜２５００ｎｍであっ
た。二重検定試料スキャン（３２）に対する平均値を自
動算出させて試料スペクトルを提供し、そしてこの装置
を「拡散反射率×１」という設定で用いた。これらの試
料を検出鏡の向こう側にある光窓上に設置した。バイア
ルについては、光窓の向こう側にある手動調節式絞りで
中心を合わせた。試料は測定中、暗所にてはめ込み式カ
バーで密封した。ＮＩＲスキャンは試料バイアルの底を
通して実施した。
ってからＫＦ法もしくはＬＯＤ法のいずれかによる分析
を実施した。分光計を水平位置に設置した。モニターを
行ったスペクトル領域は１１００〜２５００ｎｍであっ
た。二重検定試料スキャン（３２）に対する平均値を自
動算出させて試料スペクトルを提供し、そしてこの装置
を「拡散反射率×１」という設定で用いた。これらの試
料を検出鏡の向こう側にある光窓上に設置した。バイア
ルについては、光窓の向こう側にある手動調節式絞りで
中心を合わせた。試料は測定中、暗所にてはめ込み式カ
バーで密封した。ＮＩＲスキャンは試料バイアルの底を
通して実施した。
【００２１】凍結乾燥ケーキの物理構造およびガラス製
バイアルの光学収差のような因子によりもたらされる変
化を最少限に留めるために二次微分スペクトルを算出
し、そして１９３０ｎｍでのゼロからのピーク偏向を用
いて対照水分決定法に対する補正を行った。従って用語
「ＮＩＲ相対水分値」は１０００という因子を掛け合わ
せた１９３０ｎｍでの水組み合わせバンドについてのゼ
ロからの二次微分ピーク偏向を意味する。各試料中の凍
結乾燥ケーキは、そのバイアルを約３０秒間ボルテック
スミキサーにかけることにより分析前に微粉砕した。
バイアルの光学収差のような因子によりもたらされる変
化を最少限に留めるために二次微分スペクトルを算出
し、そして１９３０ｎｍでのゼロからのピーク偏向を用
いて対照水分決定法に対する補正を行った。従って用語
「ＮＩＲ相対水分値」は１０００という因子を掛け合わ
せた１９３０ｎｍでの水組み合わせバンドについてのゼ
ロからの二次微分ピーク偏向を意味する。各試料中の凍
結乾燥ケーキは、そのバイアルを約３０秒間ボルテック
スミキサーにかけることにより分析前に微粉砕した。
【００２２】Ｋａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定はＡＨＦ凍
結乾燥ケーキのメタノール抽出物を用いて実施した。典
型的にはメタノール（５ｍＬもしくは１０ｍＬ）をバイ
アル内に注入し、そしてそのバイアルを激しく混合させ
た。その後にこのバイアルを室温で１０分間の超音波処
理にかけた。未開封バイアルを３０００ＲＰＭで３０分
間遠心分離にかけた。上清からの試料を各場合毎に注射
針を通して取り出し、そしてＫａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ
装置内に注入した。試料抽出法は大気水分への試料の露
出を避けるように設計した。典型的な注入サイズは１．
０ｍＬであった。試料を抽出するのに用いたメタノール
中の水分含有量を毎回測定してブランク値を決定した。
結乾燥ケーキのメタノール抽出物を用いて実施した。典
型的にはメタノール（５ｍＬもしくは１０ｍＬ）をバイ
アル内に注入し、そしてそのバイアルを激しく混合させ
た。その後にこのバイアルを室温で１０分間の超音波処
理にかけた。未開封バイアルを３０００ＲＰＭで３０分
間遠心分離にかけた。上清からの試料を各場合毎に注射
針を通して取り出し、そしてＫａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ
装置内に注入した。試料抽出法は大気水分への試料の露
出を避けるように設計した。典型的な注入サイズは１．
０ｍＬであった。試料を抽出するのに用いたメタノール
中の水分含有量を毎回測定してブランク値を決定した。
【００２３】重量法（乾燥減量（Ｌｏｓｓ ｏｎ Ｄｒ
ｙｉｎｇ、ＬＯＤ）も用いて水分含有量を決定した。こ
の方法は、凍結乾燥ＡＨＦケーキを、風袋重量が計測し
てあり、ストッパーが詰めてあるガラス容器内に懸濁さ
せることを必要とした。ストッパーが詰めてあるこのバ
イアルを乾燥用チェンバー内に入れ、そしてケーキを減
圧かつ加熱下で五酸化リンに通して恒量になるまで乾燥
させた。バイアルおよびケーキ重量の測定は乾燥作業の
前後に実施した。質量の差を用いて存在する水の量を算
出した。この重量法では表面の水および水和作用により
緩く結合した水が測定される。
ｙｉｎｇ、ＬＯＤ）も用いて水分含有量を決定した。こ
の方法は、凍結乾燥ＡＨＦケーキを、風袋重量が計測し
てあり、ストッパーが詰めてあるガラス容器内に懸濁さ
せることを必要とした。ストッパーが詰めてあるこのバ
イアルを乾燥用チェンバー内に入れ、そしてケーキを減
圧かつ加熱下で五酸化リンに通して恒量になるまで乾燥
させた。バイアルおよびケーキ重量の測定は乾燥作業の
前後に実施した。質量の差を用いて存在する水の量を算
出した。この重量法では表面の水および水和作用により
緩く結合した水が測定される。
【００２４】Ｋａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定に対するＮ
ＩＲ水分の補正 異なる水分含有量を含む凍結乾燥ＡＨＦ試料は、同一産
生バッチからのバイアルを大気水分に様々な期間露出さ
せることにより調製した。ＡＨＦ凍結乾燥ケーキは吸湿
性であり、かつ露出時間に直接比例して水分を吸収する
（図１）。分析前には試料にストッパーを詰め、そして
そのバイアルを一晩平衡化させた。この試料をＮＩＲに
より水分含有量について評価した。ゼロ次数のＮＩＲス
ペクトルを定量のために二次微分スペクトルに転換し
た。その後に同一試料をＫａｒｌＦｉｓｃｈｅｒ Ｔｉ
ｔｒａｔｉｏｎ（滴定）により水分について分析した。
その後に補正式を補正セットから作成した。ＮＩＲ／Ｋ
Ｆ補正式は以下のとうりであった： ％水分率＝［（ＮＩＲ単位（Ｕｎｉｔ）×０．１１１
５］−１．０３７ ｒ＝０．９８ ＬＯＤに対するＮＩＲの補正は図２中の分布プロットの
ように表される。この相関係数は、分析された試料につ
いて得られたＮＩＲ単位とＬＯＤ値との間の高度の相関
を示す。この式をその後に、ＮＩＲ評価を用いてＫａｒ
ｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ水分値を評価するのに用いることが
できる。
ＩＲ水分の補正 異なる水分含有量を含む凍結乾燥ＡＨＦ試料は、同一産
生バッチからのバイアルを大気水分に様々な期間露出さ
せることにより調製した。ＡＨＦ凍結乾燥ケーキは吸湿
性であり、かつ露出時間に直接比例して水分を吸収する
（図１）。分析前には試料にストッパーを詰め、そして
そのバイアルを一晩平衡化させた。この試料をＮＩＲに
より水分含有量について評価した。ゼロ次数のＮＩＲス
ペクトルを定量のために二次微分スペクトルに転換し
た。その後に同一試料をＫａｒｌＦｉｓｃｈｅｒ Ｔｉ
ｔｒａｔｉｏｎ（滴定）により水分について分析した。
その後に補正式を補正セットから作成した。ＮＩＲ／Ｋ
Ｆ補正式は以下のとうりであった： ％水分率＝［（ＮＩＲ単位（Ｕｎｉｔ）×０．１１１
５］−１．０３７ ｒ＝０．９８ ＬＯＤに対するＮＩＲの補正は図２中の分布プロットの
ように表される。この相関係数は、分析された試料につ
いて得られたＮＩＲ単位とＬＯＤ値との間の高度の相関
を示す。この式をその後に、ＮＩＲ評価を用いてＫａｒ
ｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ水分値を評価するのに用いることが
できる。
【００２５】乾燥減量およびウイルス不活化結果に対す
るＮＩＲ水分の補正 凍結乾燥ＡＨＦ試料を様々なレベルの水分含有量のスト
ッパーを取得し、そして凍結乾燥以前にＡＨＦのバイア
ルにそのストッパーを詰めることにより調製した。その
後にこの凍結乾燥バイアルを様々な期間８０℃に加熱し
た。異なるインキュベーション時間によりもたらされる
ストッパーからＡＨＦケーキへの水分転移率のため、ケ
ーキ内の水分含有量が変化する。
るＮＩＲ水分の補正 凍結乾燥ＡＨＦ試料を様々なレベルの水分含有量のスト
ッパーを取得し、そして凍結乾燥以前にＡＨＦのバイア
ルにそのストッパーを詰めることにより調製した。その
後にこの凍結乾燥バイアルを様々な期間８０℃に加熱し
た。異なるインキュベーション時間によりもたらされる
ストッパーからＡＨＦケーキへの水分転移率のため、ケ
ーキ内の水分含有量が変化する。
【００２６】試料をＮＩＲにより水分含有量について評
価した。ゼロ次数のＮＩＲスペクトルを定量化のため二
次微分スペクトルに変換した。試料はＬＯＤによっても
分析した。３つの試料の二重検定について測定値の平均
をとり、各補正点とした。その後に補正式をその補正セ
ットから作成した。ＮＩＲ／ＬＯＤ補正式は以下のとう
りであった： ％水分率＝［（ＮＩＲ単位（Ｕｎｉｔ）×０．０４７
３］−０．０４１１ｒ＝０．９８ ＬＯＤに対するＮＩＲの補正は図３における分布プロッ
トとして表される。この相関係数は得られたＮＩＲ単位
とＬＯＤ値との間の高度の相関を示すが、ただしＮＩＲ
／ＫＦ補正の場合よりも分布が一層広範囲にわたってい
る。
価した。ゼロ次数のＮＩＲスペクトルを定量化のため二
次微分スペクトルに変換した。試料はＬＯＤによっても
分析した。３つの試料の二重検定について測定値の平均
をとり、各補正点とした。その後に補正式をその補正セ
ットから作成した。ＮＩＲ／ＬＯＤ補正式は以下のとう
りであった： ％水分率＝［（ＮＩＲ単位（Ｕｎｉｔ）×０．０４７
３］−０．０４１１ｒ＝０．９８ ＬＯＤに対するＮＩＲの補正は図３における分布プロッ
トとして表される。この相関係数は得られたＮＩＲ単位
とＬＯＤ値との間の高度の相関を示すが、ただしＮＩＲ
／ＫＦ補正の場合よりも分布が一層広範囲にわたってい
る。
【００２７】ＮＩＲ／ＬＯＤ補正曲線の予測能を評価す
るために、Ｂａｙｅｒ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｐｒｏｇ
ｒａｍからのＡＨＦ凍結乾燥試料をＮＩＲにより水分含
有量について評価した。予想ＬＯＤ値をＮＩＲ単位から
算出し、そして表２の実験的ＬＯＤ値と比較する。予想
ＬＯＤ値は実験値に非常によく一致する。
るために、Ｂａｙｅｒ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｐｒｏｇ
ｒａｍからのＡＨＦ凍結乾燥試料をＮＩＲにより水分含
有量について評価した。予想ＬＯＤ値をＮＩＲ単位から
算出し、そして表２の実験的ＬＯＤ値と比較する。予想
ＬＯＤ値は実験値に非常によく一致する。
【００２８】
実施例１ 表３は、異なる時期に取得されかつ各時点での水分含有
量が既知である、ＰＲＶをモデルとして用いるウイルス
不活化レベルを示す。ＬＯＤデータおよびＮＩＲデータ
の両方が示されている。これらのデータにより、系内の
最終水分が２．０％である際にはウイルス負荷の４．０
ｌｏｇ10の低下が得られることが示される。しかしな
がら０．７％の最終水分バイアルのように系内の水分含
有量が一層低い際にはウイルス減少の度合いはかなり低
くなる（すなわち、２．１ ｌｏｇ10 の低下）。表４
および５も、ＰＲＶについて取得されるウイルス不活化
を示す追加実験を表す。これらの実験についての全水分
値はＬＯＤにより決定した。
量が既知である、ＰＲＶをモデルとして用いるウイルス
不活化レベルを示す。ＬＯＤデータおよびＮＩＲデータ
の両方が示されている。これらのデータにより、系内の
最終水分が２．０％である際にはウイルス負荷の４．０
ｌｏｇ10の低下が得られることが示される。しかしな
がら０．７％の最終水分バイアルのように系内の水分含
有量が一層低い際にはウイルス減少の度合いはかなり低
くなる（すなわち、２．１ ｌｏｇ10 の低下）。表４
および５も、ＰＲＶについて取得されるウイルス不活化
を示す追加実験を表す。これらの実験についての全水分
値はＬＯＤにより決定した。
【００２９】実施例２ 表６は、異なる時期に取得されかつ各時点でＬＯＤによ
り決定された水分含有量が既知である、Ａ型肝炎をモデ
ルとして用いるウイルス不活化レベルを示す。このデー
タにより、系内の水分が０．８％もしくはそれを上回る
パーセンテージである際には４ ｌｏｇ10の低下を上回
るウイルス不活化が得られてよいことが示される。しか
しながら系内の水分が０．８％を下回った場合には、加
熱後のウイルス減少は０．５ ｌｏｇ10を下回わった。
これらの実験には４つの矛盾したＬＯＤ結果が含まれて
いた。これらは、０．５％の水分の増加はバイアル開封
２分以内に生じ得、かつ１．０％の水分の増加は５分以
内に生じ得ることを示すデータにより説明することがで
きる（図１）。従って、ＬＯＤ決定のために凍結乾燥ケ
ーキを計り分けるのに更に追加的な時間をかけることに
より誤って評価される水分結果をまねくことがある。そ
のため過誤の移入を最も受けにくい水分測定は、ケーキ
の操作もしくはバイアル開封のいずれかを必要としない
方法によるバイアル内の水分測定法である。
り決定された水分含有量が既知である、Ａ型肝炎をモデ
ルとして用いるウイルス不活化レベルを示す。このデー
タにより、系内の水分が０．８％もしくはそれを上回る
パーセンテージである際には４ ｌｏｇ10の低下を上回
るウイルス不活化が得られてよいことが示される。しか
しながら系内の水分が０．８％を下回った場合には、加
熱後のウイルス減少は０．５ ｌｏｇ10を下回わった。
これらの実験には４つの矛盾したＬＯＤ結果が含まれて
いた。これらは、０．５％の水分の増加はバイアル開封
２分以内に生じ得、かつ１．０％の水分の増加は５分以
内に生じ得ることを示すデータにより説明することがで
きる（図１）。従って、ＬＯＤ決定のために凍結乾燥ケ
ーキを計り分けるのに更に追加的な時間をかけることに
より誤って評価される水分結果をまねくことがある。そ
のため過誤の移入を最も受けにくい水分測定は、ケーキ
の操作もしくはバイアル開封のいずれかを必要としない
方法によるバイアル内の水分測定法である。
【００３０】実施例３ 図７は、ＰＰＶがモデルとして用いられた際の、様々な
時期に得られたウイルス不活化を示す。各時点でＬＯＤ
により決定される水分含有量が示される。水分が０．８
％もしくはそれを上回るパーセンテージである場合には
ウイルス不活化は３．２ ｌｏｇ10以上となり、かつ通
常は４ ｌｏｇ10の規模となった。しかしながら水分が
少ない場合には（０．５％）、ウイルス負荷は２．５
ｌｏｇ10低下のみとなった（２実験の平均）。
時期に得られたウイルス不活化を示す。各時点でＬＯＤ
により決定される水分含有量が示される。水分が０．８
％もしくはそれを上回るパーセンテージである場合には
ウイルス不活化は３．２ ｌｏｇ10以上となり、かつ通
常は４ ｌｏｇ10の規模となった。しかしながら水分が
少ない場合には（０．５％）、ウイルス負荷は２．５
ｌｏｇ10低下のみとなった（２実験の平均）。
【００３１】実施例４ 図８は、ＨＩＶ−１、レオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕ
ｓ）、およびＢＶＤＶについて様々な時期に取得された
ウイルス不活化を示す。水分含有量は、ＨＩＶ−１につ
いては７２時間の時点でのみＬＯＤにより測定し（１．
３％）、そしてその低下は５．３ ｌｏｇ10を上回って
いた。水分決定はレオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）お
よびＢＶＤＶ実験については各時点で実施した。水分は
加熱中は１％に近く、かつｌｏｇ10低下はＲｅｏおよび
ＢＶＤＶについては５ ｌｏｇ10を上回っていた。
ｓ）、およびＢＶＤＶについて様々な時期に取得された
ウイルス不活化を示す。水分含有量は、ＨＩＶ−１につ
いては７２時間の時点でのみＬＯＤにより測定し（１．
３％）、そしてその低下は５．３ ｌｏｇ10を上回って
いた。水分決定はレオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）お
よびＢＶＤＶ実験については各時点で実施した。水分は
加熱中は１％に近く、かつｌｏｇ10低下はＲｅｏおよび
ＢＶＤＶについては５ ｌｏｇ10を上回っていた。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【表２】
【００３４】
【表３】
【００３５】
【表４】
【００３６】
【表５】
【００３７】
【表６】
【００３８】
【表７】
【００３９】
【表８】
【００４０】結論 これらのデータは、乾熱によりもたらされる十分なレベ
ルのウイルス減少を確実に達成するためには、限界含水
量を確立および確認する必要がある。既に知られている
アッセイ法は、それらのアッセイについて必要とされる
試料操作の度合いにより、ウイルス死滅化のための厳密
なレベルの水分を保証するには精度が不十分である。Ｎ
ＩＲ技術により、凍結乾燥させた生物学的産物中の含水
量を高度の厳密性および正確さをもって決定するための
迅速、非侵害的、かつ非破壊的分析のための実際的別法
が提供される。この技術を凍結乾燥産物を処理する乾熱
に代わるウイルス不活化法に、最少レベルの水分を全産
物バイアルについて確実に達成することができるように
適用することができる。
ルのウイルス減少を確実に達成するためには、限界含水
量を確立および確認する必要がある。既に知られている
アッセイ法は、それらのアッセイについて必要とされる
試料操作の度合いにより、ウイルス死滅化のための厳密
なレベルの水分を保証するには精度が不十分である。Ｎ
ＩＲ技術により、凍結乾燥させた生物学的産物中の含水
量を高度の厳密性および正確さをもって決定するための
迅速、非侵害的、かつ非破壊的分析のための実際的別法
が提供される。この技術を凍結乾燥産物を処理する乾熱
に代わるウイルス不活化法に、最少レベルの水分を全産
物バイアルについて確実に達成することができるように
適用することができる。
【００４１】上述の実施例は本発明を説明することを意
図し、かつ当業者には変法が思い浮かぶであろうことと
思われる。従って本発明の範囲は以下の特許請求項によ
ってのみ限定されるべきであることが意図される。
図し、かつ当業者には変法が思い浮かぶであろうことと
思われる。従って本発明の範囲は以下の特許請求項によ
ってのみ限定されるべきであることが意図される。
【００４２】本発明の主な特徴または態様は以下のとお
りである。
りである。
【００４３】１． 凍結乾燥させた生物学的に活性な蛋
白質を含有する組成物であって、ある残存含水量を有す
る組成物を制御された温度および時間の条件下、乾燥状
態で加熱処理する工程を含んでなる、該組成物のウイル
ス力価を実質的に低下させるための方法において、
（１）低温殺菌条件下で該組成物を加熱処理する際にウ
イルス力価の少なくとも実質的な低下を確実に達成する
のに必要な閾水分レベルを確立する工程、および（２）
その後に前記蛋白質の生物学的活性を維持させながらウ
イルス力価の実質的低下を確実に達成するのに十分な条
件下での加熱処理を行う工程を含んでなる改良方法。
白質を含有する組成物であって、ある残存含水量を有す
る組成物を制御された温度および時間の条件下、乾燥状
態で加熱処理する工程を含んでなる、該組成物のウイル
ス力価を実質的に低下させるための方法において、
（１）低温殺菌条件下で該組成物を加熱処理する際にウ
イルス力価の少なくとも実質的な低下を確実に達成する
のに必要な閾水分レベルを確立する工程、および（２）
その後に前記蛋白質の生物学的活性を維持させながらウ
イルス力価の実質的低下を確実に達成するのに十分な条
件下での加熱処理を行う工程を含んでなる改良方法。
【００４４】２． 複数の生物学的に活性な蛋白質を含
有し、かつある残存含水量を有する組成物の少なくとも
幾つかの試料におけるウイルス力価の実質的な低下を確
実にする方法であって、前記組成物の試料の残存含水量
を決定し、低温殺菌条件に供する際にウイルス力価の少
なくとも実質的低下を確実に達成するのに必要な限界含
水量を有する試料のみを選択し、次いで前記蛋白質の生
物学的活性を維持させながらウイルス力価の実質的低下
を確実に達成するに十分な低温殺菌条件下で前記選択さ
れた組成物を加熱することを含んでなる方法。
有し、かつある残存含水量を有する組成物の少なくとも
幾つかの試料におけるウイルス力価の実質的な低下を確
実にする方法であって、前記組成物の試料の残存含水量
を決定し、低温殺菌条件に供する際にウイルス力価の少
なくとも実質的低下を確実に達成するのに必要な限界含
水量を有する試料のみを選択し、次いで前記蛋白質の生
物学的活性を維持させながらウイルス力価の実質的低下
を確実に達成するに十分な低温殺菌条件下で前記選択さ
れた組成物を加熱することを含んでなる方法。
【００４５】３． 限界含水量が約０．８重量％であ
る、前記２の方法。
る、前記２の方法。
【００４６】４． ウイルス力価の実質的低下が少なく
とも３．２ ｌｏｇ10ウイルス力価の低下となる、前記
１の方法。
とも３．２ ｌｏｇ10ウイルス力価の低下となる、前記
１の方法。
【図１】様々な期間、凍結乾燥させた抗血友病因子の試
料を大気水分に露出させる効果を示す分布プロットであ
る。
料を大気水分に露出させる効果を示す分布プロットであ
る。
【図２】近赤外（ＮＩＲ）技術により測定されるパーセ
ント水分率とＫａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定により測定
されるパーセント水分率との関連を示す分布プロットで
ある。
ント水分率とＫａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定により測定
されるパーセント水分率との関連を示す分布プロットで
ある。
【図３】近赤外技術により測定されるパーセント水分率
とＫａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定により測定されるパー
セント水分率との関連を示す分布プロットである。
とＫａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ滴定により測定されるパー
セント水分率との関連を示す分布プロットである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/14 Ｃ０７Ｋ 14/14 14/16 14/16
Claims (2)
- 【請求項１】 凍結乾燥させた生物学的に活性な蛋白質
を含有する組成物であって、ある残存含水量を有する組
成物を制御された温度および時間の条件下、乾燥状態で
加熱処理する工程を含んでなる、該組成物のウイルス力
価を実質的に低下させるための方法において、 （１）低温殺菌条件下で該組成物を加熱処理する際にウ
イルス力価の少なくとも実質的な低下を確実に達成する
のに必要な閾水分レベルを確立する工程、および（２）
その後に前記蛋白質の生物学的活性を維持させながらウ
イルス力価の実質的低下を確実に達成するのに十分な条
件下での加熱処理を行う工程を含んでなる改良方法。 - 【請求項２】 複数の生物学的に活性な蛋白質を含有
し、かつある残存含水量を有する組成物の少なくとも幾
つかの試料におけるウイルス力価の実質的な低下を確実
にする方法であって、前記組成物の試料の残存含水量を
決定し、低温殺菌条件に供する際にウイルス力価の少な
くとも実質的低下を確実に達成するのに必要な限界含水
量を有する試料のみを選択し、次いで前記蛋白質の生物
学的活性を維持させながらウイルス力価の実質的低下を
確実に達成するに十分な低温殺菌条件下で前記選択され
た組成物を加熱することを含んでなる方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/749354 | 1996-11-21 | ||
| US08/749,354 US5837519A (en) | 1996-11-21 | 1996-11-21 | Dry-heat viral inactivation under controlled moisture conditions |
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| JP9327193A Pending JPH10192372A (ja) | 1996-11-21 | 1997-11-13 | 制御水分条件下での乾熱ウイルス不活化 |
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| US (1) | US5837519A (ja) |
| EP (1) | EP0844005A1 (ja) |
| JP (1) | JPH10192372A (ja) |
| AU (1) | AU731581C (ja) |
| CA (1) | CA2221077A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2009519920A (ja) * | 2005-12-19 | 2009-05-21 | ラボラトワール フランセ デュ フラクションヌメント エ デ バイオテクノロジーズ ソシエテ アノニム | 乾燥加熱によるウイルス不活化方法 |
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-
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-
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- 1997-11-13 JP JP9327193A patent/JPH10192372A/ja active Pending
- 1997-11-13 CA CA002221077A patent/CA2221077A1/en not_active Abandoned
- 1997-11-14 AU AU45209/97A patent/AU731581C/en not_active Expired
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Also Published As
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| AU4520997A (en) | 1998-05-28 |
| AU731581B2 (en) | 2001-04-05 |
| CA2221077A1 (en) | 1998-05-21 |
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