JPH10215873A - コレステロールオキシダーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 コレステロールオキシダーゼを遺伝子操作的
に効率よく、誘導用培養基質を用いることなく高効率に
て生産する手段を得るものである。 【解決手段】 配列表１のアミノ酸配列の１から５８７
で表されるアミノ酸配列をコードする外来性ＤＮＡを導
入した遺伝子組換え微生物を培養することを特徴とする
コレステロールオキシダーゼの製造法。 【効果】 コレステロールオキシダーゼの部分アミノ酸
配列に基づくコレステロールオキシダーゼ生産菌株に由
来する染色体ＤＮＡライブラリーからコレステロールオ
キシダーゼ遺伝子の全ＤＮＡ配列を分離でき、該コレス
テロールオキシダーゼ遺伝子を導入した遺伝子組換え微
生物を利用すれば、高効率なコレステロールオキシダー
ゼの生産を可能とした。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、配列表１のアミノ
酸配列の１から５８７で表されるアミノ酸配列を有する
セルロモナス・エスピーＢ−０８１４株（ＦＥＲＭ Ｐ
−６３１６）由来のコレステロールオキシダーゼ遺伝子
組換え微生物を培養することによるコレステロールオキ
シダーゼの製造法、配列表１のアミノ酸配列の１から５
８７で表されるアミノ酸配列を有するセルロモナス・エ
スピーＢ−０８１４株（ＦＥＲＭＰ−６３１６）由来の
コレステロールオキシダーゼのアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡと該ＤＮＡを保持するプラスミド、および該Ｄ
ＮＡによる遺伝子組換え微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術】コレステロールオキシダーゼは下記反応
式

【０００３】

【化１】

【０００４】にて示される反応を触媒し、自然界におい
て微生物に存在することが知られている。既知のコレス
テロールオキシダーゼとしては、ストレプトマイセス属
由来（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８９）１７１，
５９６−６０１）、ロードコッカス属由来（特表平３−
５０３４８７号公報）、ブレビバクテリウム属由来（Ｇ
ｅｎｅ（１９９１）１０３，９３−９６）が報告され、
その遺伝子が分離され、全一次構造が判明している。

【０００５】コレステロールオキシダーゼは、血中コレ
ステロール濃度の測定による、高脂血症の病態診断に利
用されており、本発明者らは、本目的において特に優れ
た理化学的性質を有するコレステロールオキシダーゼが
セルロモナス・エスピーＢ−０８１４株（ＦＥＲＭ Ｐ
−６３１６）により生産されていることを発見した（特
開昭５８−１２９９７３号公報）（以下本コレステロー
ルオキシダーゼをＣＯＮと略称する）。

【０００６】なお、以下に示す発明の過程で明らかにな
った本発明のセルロモナス属由来のＣＯＮの全一次構造
は、前記３種のコレステロールオキシダーゼの全一次構
造と大きく異なり、本発明のＣＯＮは既知のコレステロ
ールオキシダーゼとは別のものである。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしセルロモナス属
微生物が生産するＣＯＮの量は微量であり、また誘導用
培養基質としてコレステロールを添加しなければならな
いなど商業生産における障害となっていた。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点に関し鋭意研究の結果、セルロモナス・エスピーＢ−
０８１４株よりＣＯＮを分離・精製し、その構成するポ
リペプチドの部分アミノ酸配列を決定することに成功
し、この部分アミノ酸配列を基にＣＯＮのアミノ酸配列
をコードするＤＮＡを分離し、ＣＯＮ遺伝子の塩基配列
を決定した。

【０００９】また、該ＣＯＮ遺伝子を任意のベクターに
導入し、好ましい宿主−ベクター系にて宿主微生物を形
質転換体とし、該形質転換体を培養して、ＣＯＮ遺伝子
情報を発現させ、該培養物からＣＯＮを確認し、優れた
工業的生産方法を確立し、本発明を完成するに至った。
本発明は、上記の知見に基づいてなされたもので、配列
表１のアミノ酸配列の１〜５８７で表されるアミノ酸配
列をコードする外来性ＤＮＡを導入した遺伝子組換え微
生物を培養することを特徴とするＣＯＮの製造法、配列
表１のアミノ酸配列の１から５８７で表されるアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ、配列表１のアミノ酸配列の１
から５８７で表されるアミノ酸配列をコードする外来性
ＤＮＡを保持する遺伝子組換え微生物である。

【００１０】セルロモナス・エスピーＢ−０８１４株由
来のＣＯＮ蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、セル
ロモナス・エスピーＢ−０８１４株（ＦＥＲＭ Ｐ−６
３１６）よりＤＮＡを分離精製した後、制限酵素などを
用いて切断した該ＤＮＡと、同じく切断して直鎖状にし
た発現ベクターとを、両ＤＮＡの末端部をＤＮＡリガー
ゼなどにより結合閉環させ、かくして得られた組み換え
ＤＮＡプラスミドを宿主微生物に導入し、発現ベクター
のマーカーと、ＣＯＮの活性発現若しくはＤＮＡプロー
ブを指標としてスクリーニングを行い、ＣＯＮ遺伝子を
含有する組換えＤＮＡプラスミドを保持する微生物を分
離し、該遺伝子組換え微生物を培養し、該培養菌体から
該組み換えＤＮＡプラスミドを分離精製し、次いで該組
み換えＤＮＡプラスミドからＣＯＮ遺伝子であるＤＮＡ
を取得することにより得られる。

【００１１】ＣＯＮ蛋白質をコードするＤＮＡを得るた
めには、具体的には以下のように行えばよいが、その操
作法のうち常法とされるものは、例えばマニアティスら
の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２，
１９８９）や、市販の各種酵素、キット類に添付された
手順に従えば実施できるものである。

【００１２】ＣＯＮを生産する微生物に由来するＤＮＡ
（ｔｏｔａｌＤＮＡと略称する）を採取するには、例え
ばＣＯＮを生産する微生物を培養し、得られる培養菌液
から菌体を集菌し、次いでこれを溶菌させることによっ
てＣＯＮ遺伝子を含有する溶菌物を調製する。溶菌方法
としては、例えばリゾチームなどの細胞壁溶解酵素によ
る処理が施され、必要によりプロテアーゼなどの他の酵
素やラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併用さ
れ、さらに細胞壁の物理的破壊法である凍結融解（特開
昭６３−１８５３７１号公報参照）やフレンチプレス処
理を上述の溶菌法と組合せで行ってもよい。

【００１３】この様にして得られた溶菌物からｔｏｔａ
ｌＤＮＡを分離精製するには、常法に従って、例えばフ
ェノール抽出による除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リ
ボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離などの
方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
分離精製されたｔｏｔａｌＤＮＡを切断する方法は、常
法に従って制限酵素処理により行えばよく、特に得られ
るｔｏｔａｌＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易なら
しめるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列
に作用する、例えば、ＳａｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨ
Ｉ、ＰｓｔＩ、ＸｈｏＩ、ＭｌｕＩなどのＩＩ形制限酵
素が適している。

【００１４】ｔｏｔａｌＤＮＡ断片を組み込むベクター
としては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファー
ジ又はプラスミドから遺伝子組み換え用として構築され
たものが適しており、ファージベクターとしては、例え
ば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ）に属する微生物を宿主微生物とする場合にはλ
ｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが使用できる。また、プ
ラスミドベクターとしては、例えば、エシェリヒア・コ
リを宿主微生物とする場合には、プラスミドｐＢＲ３２
２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐ
ＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐ
ＩＮ Ｉ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋、枯草菌を宿主
とする場合にはｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ、放
線菌を宿主とする場合にはｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０
２、酵母特にサッカロマイセス・セルビシエを宿主とす
る場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３などが使用
できる。

【００１５】このようなベクターを、ｔｏｔａｌＤＮＡ
の切断に使用した制限酵素で生成するＤＮＡ末端と、同
じ末端を生成する制限酵素で切断してベクター断片を作
製し、ｔｏｔａｌＤＮＡ断片とベクター断片とを、ＤＮ
Ａリガーゼ酵素により常法に従って結合させればよい。
ｔｏｔａｌＤＮＡの断片を結合したベクターを移入する
宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的
に増殖可能であればよく、例えば宿主微生物がエシェリ
ヒア・コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリ
ＤＨ１、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア
・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００などが
利用できる。また、微生物宿主が枯草菌に属する微生物
の場合、バチラス・サチリスＩＳＷ１２１４など、放線
菌に属する微生物の場合、ストレプトマイセス・リビダ
ンスＴＫ２４など、サッカロマイセス・セルビシエに属
する微生物の場合、サッカロマイセス・セルビシエＩＮ
ＶＳＣ１などが使用できる。

【００１６】宿主微生物に組み換えＤＮＡを移入する方
法としては、例えば、宿主微生物がエシェリヒア・コリ
やサッカロマイセス・セルビシエ、ストレプトマイセス
・リビダンスに属する微生物の場合には、常法に従って
コンピテントセル化した宿主菌株に組み換えＤＮＡの移
入を行えばよく、菌株によっては電気穿孔法を使用して
もよい。

【００１７】宿主微生物への目的組み換えＤＮＡ移入の
有無についての選択は、上記方法により組換えＤＮＡを
移入した宿主微生物により作製した遺伝子ライブラリー
から、³²Ｐや蛍光体などでラベルした、ＣＯＮの部分ア
ミノ酸配列を基に設計し、あらかじめ合成したＣＯＮの
ＤＮＡプローブで、コロニーハイブリダイゼーションや
プラークハイブリダイゼーションなどを行うことにより
ポジティブ株を選択し、この株を目的の形質転換体とす
ればよい。

【００１８】形質転換体からのＣＯＮ遺伝子を含むＤＮ
Ａの分離は、常法に従って行えばよい。また、もし１回
の操作でＣＯＮ遺伝子の全体が分離できなかった場合
は、別の制限酵素を用いて作製した遺伝子ライブラリー
から再度遺伝子の分離を行い、残った遺伝子の部分を分
離し、適当な制限酵素認識部位を用いて両者を結合すれ
ばよい。

【００１９】上述の方法によって得られたＣＯＮ遺伝子
のＤＮＡの塩基配列は、ジデオキシ法（Ｓａｎｇａｒ，
Ｆ．（１９８１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５−
１２１０）で解読すればよく、またＣＯＮを構成するポ
リペプチドの全アミノ酸配列は、塩基配列より予測決定
できる。この様にして一度選択された組み換えＤＮＡ
は、該組み換えＤＮＡを保持する形質転換微生物から取
り出され、他の宿主微生物に移入することも容易に実施
できる。

【００２０】また、さらに、該組み換えＤＮＡから制限
酵素などにより切断してＣＯＮを構成するポリペプチド
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを切り出し、前記と
同様な方法により切断して得られる他の開環ベクターの
末端に結合させて新規な特徴を有する組み換えＤＮＡを
作製して、他の宿主微生物に移入することも容易に実施
できる。

【００２１】かくして得られた形質転換体である微生物
は、栄養培地に培養されることによりＣＯＮを産生し得
るが、宿主微生物によってはＣＯＮ遺伝子を移入するだ
けではＣＯＮ生産性を有しない場合がありうる。このよ
うな場合、得られたＣＯＮ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、
ゾラーの方法による部位特異的変異法（Ｚｏｌｌｅｒ，
Ｍ．Ｊ．ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３６
７）による制限酵素認識部位の作製や、制限酵素による
切り出しなどにより適切な形態で分離し、該宿主微生物
に適合する遺伝子プロモーター下流にＣＯＮ遺伝子を結
合したＤＮＡを組み込んだベクターにより、新たな形質
転換体を作製し、ＣＯＮを産生させればよい。

【００２２】例えば、上記宿主微生物がエシェリヒア・
コリに属する微生物の場合、ＣＯＮ遺伝子を接続する遺
伝子プロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ｔ
ａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ピルビン酸オキ
シダーゼ遺伝子プロモーター（特開平１−１４４９７６
号公報）などが例示され、これらのプロモーターの下流
にリボソーム結合部位を介在して、開始コドンＡＴＧや
ＧＴＧを有するＣＯＮ構造遺伝子を接続し、エシェリヒ
ア・コリを宿主とするベクターに組み込み、かくのごと
くして作製されたベクターでエシェリヒア・コリを形質
転換すればよい。

【００２３】上記の遺伝子操作に一般的に使用される量
的関係は、供与微生物からのＤＮＡ及びベクターＤＮＡ
を０．１〜１０μｇに対し、制限酵素を約１〜１０ｕ、
リガーゼ約３００ｕ、その他の酵素約１〜１０ｕ、程度
が例示される。ＣＯＮ遺伝子を含み、ＣＯＮを産生し得
る形質転換微生物の具体的な例示としては、エシェリヒ
ア・コリに属する微生物を宿主微生物とし、その内部に
ＣＯＮ遺伝子を含有するプラスミドｐＴＶＣＯＮ１（そ
の構造を図１に示した）を保有する形質転換微生物、エ
シェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）Ｗ３１１０・ｐＴＶＣＯＮ１（ＦＥＲＭ Ｐ−１６
０３９）が挙げられる。

【００２４】また特にエシェリヒア・コリを宿主微生物
とする場合、天然型ＣＯＮのいわゆるシグナルペプチド
にあたる領域をコードするＤＮＡを除くと、活性を有す
るＣＯＮが生産されなくなることが研究中に判明してい
る。また、エシェリヒア・コリを宿主微生物にし、シグ
ナルペプチドをコードする領域を除かないＣＯＮ遺伝子
を使ってＣＯＮを生産した場合、生産されたＣＯＮは配
列表１のアミノ酸配列の１〜３７で表されるシグナルペ
プチド領域のアミノ酸がＮ末端側から一部または全部欠
失しており、生産されるＣＯＮは配列表１のアミノ酸配
列の少なくとも３８〜５８７で表されるアミノ酸配列を
含むものと判明した。即ち、最小のアミノ酸配列は配列
表１のアミノ酸配列の３８〜５８７で表されるアミノ酸
配列を有し、最長のアミノ酸配列は配列表１のアミノ酸
配列の１〜５８７で表されるアミノ酸配列を有し、この
最小ないし最長のアミノ酸配列の適宜なアミノ酸配列長
を包含するものである。

【００２５】形質転換微生物により該ＣＯＮを製造する
に当たっては、該形質転換微生物を栄養培地で培養して
菌体内又は培養液中に該ＣＯＮを産生せしめ、培養終了
後、得られた培養物を濾過又は遠心分離などの手段によ
り菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法又はリゾ
チームなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥ
ＤＴＡ及び／又は適当な界面活性剤などを添加して該Ｃ
ＯＮの水溶液を濃縮するか、又は濃縮する事なく硫安分
画、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の
吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ーにより処理して、純度のよい該ＣＯＮを得ることがで
きる。

【００２６】形質転換微生物の培養条件はその栄養生理
的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多く
の場合は、液体培養で行うが、工業的には深部通気撹拌
培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微
生物の培養に通常用いられるものが広く使用されうる。
炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、
例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、マルト
ース、フラクトース、糖蜜などが使用される。窒素源と
しては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプ
トン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物など
が使用される。

【００２７】その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグ
ネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛
などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必
要に応じて使用される。培養温度は微生物が発育し、Ｃ
ＯＮを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア
・コリの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培
養条件は、条件によって多少異なるが、ＣＯＮが最高終
了に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了す
ればよく、エシェリヒア・コリの場合、通常は１２〜４
８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、ＣＯＮを生
産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの
場合、好ましくはｐＨ６〜８程度である。

【００２８】培養物中のＣＯＮは、菌体を含む培養液そ
のままを採取し、利用することもできるが、一般には常
法に従って、ＣＯＮが培養液中に存在する場合には、濾
過、遠心分離などによりＣＯＮ含有溶液と微生物菌体と
を分離した後に利用される。ＣＯＮが菌体内に存在する
場合には、得られた培養物を濾過又は遠心分離などの手
段により、菌体を採取し、次いでこの菌体を必要に応じ
て機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊
し、またＥＤＴＡなどのキレート剤及び／又は界面活性
剤を添加してＣＯＮを可溶化し水溶液として分離採取す
る。

【００２９】この様にして得られたＣＯＮ含有溶液を、
例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸ナトリウ
ムなどの塩析処理などによる分別沈澱法により沈澱せし
めればよい。次いでこの沈澱物を、水に溶解し、半透膜
にて透析せしめて、より低分子量の不純物を除去するこ
とができる。また、吸着剤あるいはゲル濾過剤などによ
るゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の吸
着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
等により精製し、これらの手段を用いて得られるＣＯＮ
含有溶液から、減圧濃縮凍結乾燥等の処理により精製さ
れたＣＯＮが得られる。

【００３０】また、ＣＯＮの活性を測定するには、以下
のようにすればよい。０．１Ｍのトリス塩酸（ｐＨ７．
０）、５ｕ／ｍｌのパーオキシダーゼ、０．０３％の４
−アミノアンチピリン、０．０２％のフェノール、０．
３％のトリトンＸ−１００、０．１２９ｍｇ／ｍｌのコ
レステロールよりなる反応液１ｍｌを小試験管に入れ、
３７℃で３分間予備加温した後、適当に希釈した酵素液
０．０５ｍｌを添加して撹拌し、反応を開始する。正確
に１０分間反応の後に、エタノールを２ｍｌ添加して反
応を停止し、波長４８０ｎｍの吸光度を測定する（Ａ
ｓ）。また盲検として酵素液のかわりに蒸留水０．０５
ｍｌを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａ
ｂ）。この酵素使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度
（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より下記の計算式に
従って酵素活性を求める。

【００３１】酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×
０．６９９×酵素の希釈率 上記活性測定法等に基づく本発明のＣＯＮの物理化学的
性質を以下に示した。 物理化学的性質 （１）基質特異性：コレステロールに対して基質特異性
を有する。 （２）酵素作用

【００３２】

【化２】

【００３３】（３）分子量：５８，０００（セファデッ
クスＧ−１５０を用いたゲル濾過法） ５８，０００（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動） （４）至適ｐＨ：７．０ （５）ｐＨ安定性：ｐＨ６〜７で安定 （６）等電点：ｐＨ４．８ （７）熱安定性：５０℃以下

【００３４】

【発明の実施の形態】以下、実施例に基づいて本発明を
より詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。なお、実施例中、常法に従い、と
記述した操作は、例えば前出のマニアティスらの方法
や、市販の各種酵素、キット類に添付された手順に従え
ば実施できるものである。また、実験に使用した組換え
ＤＮＡ実験酵素試薬（制限酵素など）、ベクターＤＮ
Ａ、キット類は特に指摘しない限り宝酒造株式会社より
購入したものである。

【００３５】

【実施例１】 ＜ＣＯＮの培養＞セルロモナス・エスピーＢ−０８１４
株（ＦＥＲＭ Ｐ−６３１６）を１．０％のグルコー
ス、０．５％のポリペプトン、０．５％の肉エキスおよ
び０．３％の塩化ナトリウムよりなる培地（ｐＨ７．
０）１００ｍｌに植菌し、３０℃、３６時間振盪培養し
て菌体培養液とした。

【００３６】

【実施例２】 ＜セルロモナス・エスピーからのＤＮＡの抽出＞セルロ
モナス・エスピーＢ−０８１４株の菌体を、遠心分離に
より集菌後、１ｍｇ／ｍｌリゾチームを添加した２０ｍ
ｌのＴＥＳバッファー（５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＥＤＴＡ、１５％のシュク
ロース）に懸濁し、３７℃、１０分処理した。その後、
１０％のＳＤＳを０．５ｍｌとＴＥ緩衝液（１００ｍＭ
のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴ
Ａ）飽和フェノール・クロロホルム＝１：１混合液を２
１ｍｌ加え、３０分転倒攪拌した。攪拌後、１５，００
０ｒｐｍで１５分遠心して水層を分取し、これに３Ｍの
酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を２ｍｌ混合した。

【００３７】この液上にエタノールを４２ｍｌ重層し、
界面に析出する染色体をガラス棒で巻き取り回収した。
回収した染色体は５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを添加
したＴＥ緩衝液５ｍｌに溶解し、３７℃で１時間処理し
た後、ＴＥ緩衝液飽和フェノール・クロロホルム＝１：
１混合液を５ｍｌ加え、３０分転倒攪拌した。攪拌後、
１５，０００ｒｐｍで１５分遠心し、水層を分取し、こ
れに３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を０．５ｍｌ
混合した。

【００３８】この液上にエタノールを１０ｍｌ重層し、
界面に析出する染色体をガラス棒で巻き取り回収した。
回収した染色体はＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）２ｍｌに溶
解し、ＴＥ緩衝液飽和フェノール・クロロホルム＝１：
１混合液を２ｍｌ加え、１０分転倒攪拌した。攪拌後１
５，０００ｒｐｍで１０分遠心して水層を分取し、常法
のエタノール沈殿処理により染色体を析出後、沈殿・分
離し、７０％エタノールによる洗浄と乾燥処理を行い、
ＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。

【００３９】以上の操作によりセルロモナス・エスピー
Ｂ−０８１４株の染色体標品１ｍｇを得た。

【００４０】

【実施例３】 ＜ＣＯＮのＮ末端アミノ酸配列の解析＞精製したＣＯＮ
をリジルエンドペプチダーゼでペプチド断片に分解し、
そのアミノ酸配列をエドマン分解法（島津プロテインシ
ークエンサーＰＳＱ−１）により決定した。決定された
ＣＯＮの部分アミノ酸配列は、配列表１のアミノ酸配列
の４９２から５１２で表される。

【００４１】

【実施例４】 ＜放射性ＤＮＡプローブの作製＞判明した部分アミノ酸
配列をコードするＣＯＮ遺伝子の塩基配列を予想した。
この配列を基に設計されるオリゴヌクレオチドプローブ
には無数の形状があるが、本発明ではそのうち、配列表
２で表される塩基配列を有するＣＯＮＰ１と命名したオ
リゴヌクレオチドを使用した。

【００４２】このオリゴヌクレオチドを外部機関（ベッ
クス社）に合成依託して作製し、完成したオリゴヌクレ
オチド２００ｎｇをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼバッ
ファー（５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、
１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭの２−メルカプ
トエタノール）、及び７４０ｋＢｑ（キロベクレル）の
［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（第一化学薬品社販売）存在下、
８．５ｕのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで３７℃、３
０分間反応せしめ、ラジオアイソトープ³²Ｐを取り込ま
せ放射性オリゴヌクレオチドプローブとした。

【００４３】

【実施例５】 ＜ＣＯＮ遺伝子含有ＤＮＡフラグメントの検定＞実施例
２の操作で得られたセルロモナス・エスピーＢ−０８１
４株の染色体ＤＮＡから遺伝子ライブラリーを作製する
ため、本染色体を各種制限酵素で切断し、目的遺伝子が
含有されるＤＮＡフラグメントの鎖長を検定する操作を
行った。すなわち、セルロモナス・エスピーＢ−０８１
４株の染色体ＤＮＡ（１０μｇ）を各種制限酵素で切断
し、１．５％アガロースゲル（宝酒造社製Ｈ１４、４０
ｍＭのトリス酢酸緩衝液（ｐＨ７．４）、２ｍＭのＥＤ
ＴＡ）で１５０Ｖ、１．５時間電気泳動し、常法に従っ
てサザンブロッティングを行い、アガロースゲルからナ
イロンメンブレン（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）に
ＤＮＡを移行させた。

【００４４】このメンブレンを風乾後、ナイロンメンブ
レン添付のマニュアルに従ってプレハイブリダイゼーシ
ョンを行い、さらに実施例４で作製したＣＯＮＰ１放射
性プローブを使用したハイブリダイゼーションを４５℃
で１晩行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレン
を５５℃の洗浄液（６×ＳＳＣ、０．０５％ピロリン酸
ナトリウム〔１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ塩化ナトリウム，
１５ｍＭクエン酸ナトリウム〕：メンブレン１００平方
ｃｍ当り約５０ｍｌ）で１０分洗った後、メンブレンを
自然乾燥した。この乾燥したメンブレンをＸ線フィルム
（富士写真フィルム社製 Ｎｅｗ ＲＸＯ−Ｈ）に重
ね、遮光下、−７０℃で２４時間オートラジオグラフィ
ーを行った。

【００４５】オートラジオグラフィー終了後、フィルム
を現像し、各制限酵素による切断染色体が示すポジティ
ブバンドのサイズを観察した。その結果、ＢａｍＨＩ切
断により約２ｋｂ（キロベース：ＤＮＡ鎖長の単位、
１，０００塩基対）のＤＮＡフラグメント上に、Ｐｓｔ
Ｉ切断により約７ｋｂのＤＮＡフラグメント上にＣＯＮ
遺伝子が含有されることが明らかとなり、ＢａｍＨｌＩ
で切断した染色体ＤＮＡ２ｋｂフラグメントと、Ｐｓｔ
Ｉで切断した染色体ＤＮＡの７ｋｂフラグメントそれぞ
れから２種類の遺伝子ライブラリーを作製することとし
た。

【００４６】

【実施例７】 ＜遺伝子ライブラリーの作製＞実施例５の操作で得られ
たセルロモナス・エスピーＢ−０８１４株の染色体ＤＮ
Ａ１０μｇを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、常法に従い
約２ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離した。このＤＮＡ
フラグメントを、制限酵素ＢａｍＨＩで切断しアルカリ
フォスファターゼ（以下ＢＡＰと略称）１ｕで切断末端
を脱リン酸化した１μｇのｐＢＲ３２２と、ＤＮＡライ
ゲーションキット（宝酒造社製）で連結させた。これを
用いて、常法に従ってコンピテント細胞としたエシェリ
ヒア・コリＤＨ１株（ＡＴＣＣ３３８４９）をトランス
フォーメーションし、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有
ＬＢ（１０ｇ／ｌのバクトトリプトン（ＤＩＦＣＯ社
製）、５ｇ／ｌの酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製）、１０
ｇ／ｌのＮａＣｌ）１．５％寒天平板培地にて一夜培養
してアンピシリン耐性コロニーを生育させ、遺伝子ライ
ブラリーとした。

【００４７】また同様にして、ＰｓｔＩで切断した約７
ｋｂの染色体ＤＮＡフラグメントとｐＢＲ３２２からも
遺伝子ライブラリーを作製した。

【００４８】

【実施例８】 ＜ＣＯＮ遺伝子含有クローンのスクリーニング＞実施例
７により得た２種類の遺伝子ライブラリーを、ナイロン
メンブレン（ＰＡＬＬ社製：バイオダインＡ）にレプリ
カし、このフィルターに添付のマニュアルに従って菌体
のＤＮＡを固定した。

【００４９】このフィルターを添付のマニュアルに従っ
てプレハイブリダイゼーションおよび、実施例４で調製
したＣＯＮＰ１プローブを使用したハイブリダイゼーシ
ョンを行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレン
を実施例５に示した５５℃の洗浄液で１０分洗った後メ
ンブレンを自然乾燥した。この乾燥メンブレンをＸ線フ
ィルムに重ね、遮光下、−７０℃で２４時間オートラジ
オグラフィーを行った。

【００５０】オートラジオグラフィー終了後、フィルム
を現像し、ポジティブシグナルを示すコロニーをＢａｍ
ＨＩライブラリー、ＰｓｔＩライブラリーそれぞれから
確認した。

【００５１】

【実施例９】 ＜組み換えプラスミドの抽出＞実施例８で選ばれた２種
類のライブラリーのポジティブシグナルを示すコロニー
を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ液体培地１．
５ｍｌに植菌し３７℃で１６時間振盪培養した後、常法
に従って各プラスミドを抽出した。このプラスミドのう
ちＢａｍＨＩライブラリーより分離したプラスミドをｐ
ｃＣＯＮ１、ＰｓｔＩとライブラリーより分離したプラ
スミドをｐｃＣＯＮ２と命名した。

【００５２】

【実施例１０】 ＜ＣＯＮ遺伝子塩基配列の決定＞実施例９で得られたプ
ラスミドｐｃＣＯＮ１およびｐｃＣＯＮ２より、ＣＯＮ
構造遺伝子部分についてジデオキシ法により塩基配列を
決定した。その結果、両プラスミドはともに単独ではＣ
ＯＮ構造遺伝子の全体を含まず、ｐｃＣＯＮ１は遺伝子
の５’末端を、ｐｃＣＯＮ２は遺伝子の３’末端を有
し、両方を合わせてＣＯＮ構造遺伝子全体を含むもので
あった。決定したＣＯＮ構造遺伝子の塩基配列およびそ
のコードするアミノ酸配列は配列表１に示した。

【００５３】

【実施例１１】 ＜ＣＯＮ発現用プラスミドｐＴＶＣＯＮ１の作製＞実施
例１０で得たプラスミドｐｃＣＯＮ１をＢａｍＨＩで切
断し、ＣＯＮ遺伝子の一部を含む約２ｋｂのＤＮＡフラ
グメントを定法に従い分離した。このＤＮＡフラグメン
トを、ＢａｍＨＩで切断し１ｕのＢＡＰで切断末端を脱
リン酸化した１μｇのｐＵＣ１１８と、ＤＮＡライゲー
ションキットで連結させた。これを用いて、常法に従っ
てコンピテント細胞としたエシェリヒア・コリＤＨ１株
をトランスフォーメーションし、５０μｇ／ｍｌアンピ
シリン含有ＬＢ１．５％寒天平板培地にて一夜培養して
アンピシリン耐性コロニーを生育させた。

【００５４】生育してきた複数のコロニーから定法に従
ってプラスミドを抽出し、ＣＯＮ遺伝子の向きがｐＵＣ
１１８のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と反対向きになる
ようにＢａｍＨＩの約２ｋｂのＤＮＡフラグメントがｐ
ＵＣ１１８に挿入されたプラスミドを選択した。このプ
ラスミドをｐｃＣＯＮ３と命名した。次に実施例１０で
得たプラスミドｐｃＣＯＮ２をＰｓｔＩとＥｃｏＲＩで
切断し、ＣＯＮ遺伝子の一部を含む約１．５ｋｂのＤＮ
Ａフラグメントを定法に従い分離した。このＤＮＡフラ
グメントを、同じくＰｓｔＩとＥｃｏＲＩで切断し１ｕ
のＢＡＰで切断末端を脱リン酸化した１μｇのｐｃＣＯ
Ｎ３と、ＤＮＡライゲーションキットで連結させた。こ
れを用いて、常法に従ってコンピテント細胞としたエシ
ェリヒア・コリＤＨ１株をトランスフォーメーション
し、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ１．５％寒天
平板培地にて一夜培養してアンピシリン耐性コロニーを
生育させた。

【００５５】生育してきた複数のコロニーから定法に従
ってプラスミドを抽出し、連続する全ＣＯＮ構造遺伝子
を含むプラスミドを分離し、このプラスミドをｐｃＣＯ
Ｎ４と命名した。次にＣＯＮ構造遺伝子の開始コドン上
と下流に制限酵素認識部位をクンケルの部位特異変異法
により導入するために、オリゴヌクレオチドＣＯＮ１１
とＣＯＮ１２を設計し、それぞれ外部機関（ＢＥＸ社）
に合成依頼して作成した。ＣＯＮ１１のＤＮＡ配列を配
列表３に、ＣＯＮ１２のＤＮＡ配列を配列表４に示し
た。また、プラスミドｐｃＣＯＮ４を部位特異変異用実
験キットＭｕｔａｎ−Ｋ（宝酒造社製）に添付されたエ
シェリヒア・コリＣＪ２３６株に常法に従って導入し、
添付のマニュアルに従って一本鎖ＤＮＡ状のｐｃＣＯＮ
４を調製した。この２μｇの一本鎖ＤＮＡ状のｐｃＣＯ
Ｎ１を鋳型ＤＮＡとし、１μｇのＣＯＮ１１と１μｇの
ＣＯＮ１２を変異用プライマーとして、Ｍｕｔａｎ−Ｋ
を用い、添付のマニュアルに従って部位特異変異を行
い、制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩの認識部位が追加さ
れたＤＮＡ鎖を含有するプラスミドを作製した。

【００５６】このプラスミドをＭｕｔａｎ−Ｋに添付の
エシェリヒア・コリＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ株に常法
に従って導入し、組換え菌体数コロニーから組換えプラ
スミドを抽出し、１０単位のＮｃｏＩで、添付のマニュ
アルに従って３７℃で２時間切断処理し、０．７％アガ
ロースゲル電気泳動で分析し、新たにＮｃｏＩとＥｃｏ
ＲＩの認識部位が導入されているプラスミドを確認、選
択した。以上により得たプラスミドをｐｃＣＯＮ５と命
名した。

【００５７】さらに１μｇのｐｃＣＯＮ５を用い、制限
酵素ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩそれぞれ１０単位で添付の
マニュアルに従って３７℃で２時間切断処理し、０．７
％アガロースゲル電気泳動で約１．８ｋｂのＣＯＮ遺伝
子を含むＤＮＡ断片を分離回収した。一方、１μｇのエ
シェリヒア・コリ宿主プラスミドベクターｐＴＶ１１９
Ｎを前記と同様に切断し、５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐ
Ｈ８．０）存在下に、１ｕのＢＡＰを加え、６５℃で２
時間処理した。

【００５８】次いで、前記のＤＮＡ溶液を混合し、実施
例２と同様にライゲーションを実施し、さらにエシェリ
ヒア・コリＷ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）にトラ
ンスフォーメーションを行い、５０μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを含有する３．７％のＢＨＩ寒天培地にまき、２
５℃で一昼夜培養した。このようにして、プラスミドベ
クターｐＴＶ１１９ＮのＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩ部位に
ＣＯＮ遺伝子を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片が挿入さ
れたプラスミドｐＴＶＣＯＮ１を保持する形質転換微生
物、エシェリヒア・コリＷ３１１０・ｐＴＶＣＯＮ１を
取得し、実施例３の方法で組換えプラスミドｐＴＶＣＯ
Ｎ１を得た。プラスミドｐＴＶＣＯＮ１の構造を図１に
示す。なお図中の「ｃｏｎ」はＣＯＮ構造遺伝子を、
「ａｐ」はアンピシリン耐性構造遺伝子を、「ｏｒｉ」
はエシェリヒア・コリのプラスミドの複製起点領域を、
「ｌａｃＺ」はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子プロモータ
ーを、「ＮｃｏＩ」および「ＥｃｏＲＩ」は制限酵素認
識部位をそれぞれ表す。

【００５９】

【実施例１２】 ＜ｐＴＶＣＯＮ１保持エシェリヒア・コリの培養とその
細胞抽出液の調製＞エシェリヒア・コリＷ３１１０・ｐ
ＴＶＣＯＮ１を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有し
た３．７％のＢＨＩ（ＤＩＦＣＯ社製）液体培地１．５
ｍｌで３０℃、１６時間培養し、そのうち１ｍｌを遠心
分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、２
００μｌの１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
を加え、超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心
分離（１４，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得し
て細胞抽出液とした。同様に、ＣＯＮ遺伝子を含まない
クローニングベクターｐＴＶ１１９Ｎにより形質転換さ
れたエシェリヒア・コリＷ３１１０・ｐＴＶ１１９Ｎの
抽出液も調製した。

【００６０】

【実施例１３】 ＜細胞抽出液中のＣＯＮ酵素活性の確認＞実施例１１で
調製したエシェリヒア・コリＷ３１１０・ｐＴＶＣＯＮ
１、およびエシェリヒア・コリＷ３１１０・ｐＴＶ１１
９Ｎの細胞抽出液中のＣＯＮ酵素活性を、前述のＣＯＮ
酵素活性測定法によって測定した。その結果、エシェリ
ヒア・コリＷ３１１０・ｐＴＶＣＯＮ１では、培養液１
ｍｌあたり１ユニットの活性が検出され、エシェリヒア
・コリＷ３１１０・ｐＴＶ１１９Ｎでは活性は検出され
なかった。これによりエシェリヒア・コリＷ３１１０・
ｐＴＶＣＯＮ１でのＣＯＮの活性発現が確認され、前記
の物理化学的性質を確認した。

【００６１】

【発明の効果】ＣＯＮの部分アミノ酸配列に基づいて合
成したオリゴヌクレオチドを使用して、ＣＯＮ生産菌株
に由来する染色体ＤＮＡライブラリーからＣＯＮ遺伝子
の全ＤＮＡ配列を明確とした新規なＣＯＮ遺伝子を分離
したもので、該ＣＯＮ遺伝子を利用して、誘導培養基質
を用いることなく高効率なＣＯＮの生産が可能になっ
た。

【００６２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１７６１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：セルロモナス・エスピー（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏ
ｎａｓ ｓｐ．） 株名：Ｂ−０８１４ 配列の特徴 Ｐ ＣＤＳ 配列 ATG GCG GCA CAA GAC GAA AAG TTC CGA CTG TCC CGA CGA GGT TTC ATG 48 Met Ala Ala Gln Asp Glu Lys Phe Arg Leu Ser Arg Arg Gly Phe Met 1 5 10 15 GCC GCT GGA GCC GGC GCC GTG GCA GCG ACC GCA TTC GCC GGC TGG ACG 96 Ala Ala Gly Ala Gly Ala Val Ala Ala Thr Ala Phe Ala Gly Trp Thr 20 25 30 CCG GCC TAC GCC GTC CCC GCC GGC TCT TCC GGC TCC GCG GGT GGT CCT 144 Pro Ala Tyr Ala Val Pro Ala Gly Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Pro 35 40 45 GTC TCC ACC CTC ACG CCG CCG CCT GCC TTC CCC GAA GGC ATC GCG CTG 192 Val Ser Thr Leu Thr Pro Pro Pro Ala Phe Pro Glu Gly Ile Ala Leu 50 55 60 TAC CAG CAG GCA TAT CAG AAC TGG TCC AAG GAG ATC ATG CTC GAC GCG 240 Tyr Gln Gln Ala Tyr Gln Asn Trp Ser Lys Glu Ile Met Leu Asp Ala 65 70 75 80 ATC TGG ACC TGT TCG CCC AAG ACG CCC GAA GAC GTA GTC CGC CTC GCG 288 Ile Trp Thr Cys Ser Pro Lys Thr Pro Glu Asp Val Val Arg Leu Ala 85 90 95 AAC TGG GGC CAT GCC AAC GGC TAC ACC ATT CGT CCC CGC GGT GCC ATG 336 Asn Trp Gly His Ala Asn Gly Tyr Thr Ile Arg Pro Arg Gly Ala Met 100 105 110 CAC GGC TGG ACG CCG CTG ACC ATC GTC AAC GGT GCG CCG GTC GAC AAG 384 His Gly Trp Thr Pro Leu Thr Ile Val Asn Gly Ala Pro Val Asp Lys 115 120 125 GTC ATC CTC GCC GAC ACC ACG GTC CAC CTC ACC GGA GTC TCC GTC AAC 432 Val Ile Leu Ala Asp Thr Thr Val His Leu Thr Gly Val Ser Val Asn 130 135 140 GCC GGT GGC AGC CCA GCC ACC GTC ACC GCA GGA CCC GGC GCG ACC CTC 480 Ala Gly Gly Ser Pro Ala Thr Val Thr Ala Gly Pro Gly Ala Thr Leu 145 150 155 160 GAC GCC ATC ACG ACC GCA CTG CAG GCA CAG GGC CTC GGG TTC GCG AAC 528 Asp Ala Ile Thr Thr Ala Leu Gln Ala Gln Gly Leu Gly Phe Ala Asn 165 170 175 CTG CCG GCG CCG GGT GTG TTG ACC ATT GCC GGC TGC CTC GCC GTC GAC 576 Leu Pro Ala Pro Gly Val Leu Thr Ile Ala Gly Cys Leu Ala Val Asp 180 185 190 GCT CAC GGC GCA GCG CTC CCC GCC GAA GGC GAA GCA CAC GTT CCC GGA 624 Ala His Gly Ala Ala Leu Pro Ala Glu Gly Glu Ala His Val Pro Gly 195 200 205 CAG ACT TTC GGC TCA CTC TCC AAC CTC GTC ACG TCC CTG ACC GCA GTG 672 Gln Thr Phe Gly Ser Leu Ser Asn Leu Val Thr Ser Leu Thr Ala Val 210 215 220 GTC TGG AAC GGC AGC GAG TAC GCG CTG AAG ACG TAT GCA CGT AGC GAC 720 Val Trp Asn Gly Ser Glu Tyr Ala Leu Lys Thr Tyr Ala Arg Ser Asp 225 230 235 240 GCG GCG ATC AAG CCG CTG CTG ACT CAC CTC GGA CGC ACC TTC CTC ACC 768 Ala Ala Ile Lys Pro Leu Leu Thr His Leu Gly Arg Thr Phe Leu Thr 245 250 255 TCC GTC ACC TTG CAG GCC GCC CCC AAT TAC CGC ATG CGC TGC GTC AGC 816 Ser Val Thr Leu Gln Ala Ala Pro Asn Tyr Arg Met Arg Cys Val Ser 260 265 270 CAC ACC GAC ATC GGT TGG CAG GAA CTC TTC GGC GCC CGC GGA GCG TCC 864 His Thr Asp Ile Gly Trp Gln Glu Leu Phe Gly Ala Arg Gly Ala Ser 275 280 285 GGA CGC ACC TTC GAG AAG TTC GTC CGC GAA AAC GGT CGC GCA GAA GCA 912 Gly Arg Thr Phe Glu Lys Phe Val Arg Glu Asn Gly Arg Ala Glu Ala 290 295 300 ATC TGG TAC CCC TTC ACC GAA CGC CCG TGG ATG AAG GTG TGG TCA CTT 960 Ile Trp Tyr Pro Phe Thr Glu Arg Pro Trp Met Lys Val Trp Ser Leu 305 310 315 320 GCC CCC ACC AAG CCG CCG TTC TCG CGT GAG GTG ACC GGA CCG TAC AAC 1008 Ala Pro Thr Lys Pro Pro Phe Ser Arg Glu Val Thr Gly Pro Tyr Asn 325 330 335 TAC ATC TTC TCC GAC AAC CTC CCG GAG CCG GTC ACC GAC ATG ATC GGC 1056 Tyr Ile Phe Ser Asp Asn Leu Pro Glu Pro Val Thr Asp Met Ile Gly 340 345 350 CAG ATC AAC TCC GGA AAC CCG GGC ATC GCA CCG GCA TTC GGG CAG ATC 1104 Gln Ile Asn Ser Gly Asn Pro Gly Ile Ala Pro Ala Phe Gly Gln Ile 355 360 365 ATG TAC GCC ACC ACC GTT GCC GGA CTC GCC GCG ACG TTC TCC AAC GAC 1152 Met Tyr Ala Thr Thr Val Ala Gly Leu Ala Ala Thr Phe Ser Asn Asp 370 375 380 CTG TGG GGA TGG ACC AAG GAC GTC CAG TTC TAC ATC CGG GCC ACC ACC 1200 Leu Trp Gly Trp Thr Lys Asp Val Gln Phe Tyr Ile Arg Ala Thr Thr 385 390 395 400 CTT GCT CTG ACC GAG GGC GGC GGA GCC GTC ATC ACC TCG CGC GCC AAC 1248 Leu Ala Leu Thr Glu Gly Gly Gly Ala Val Ile Thr Ser Arg Ala Asn 405 410 415 ATC GGC CAG GTC ATC CAT GAC TTC ACC CAG TGG TTC AAC GGT CGC ATG 1296 Ile Gly Gln Val Ile His Asp Phe Thr Gln Trp Phe Asn Gly Arg Met 420 425 430 GAG TAC TAC CGC TCC ATC GGA CAC TTC CCC CTC AAC GGC CCC GTC GAA 1344 Glu Tyr Tyr Arg Ser Ile Gly His Phe Pro Leu Asn Gly Pro Val Glu 435 440 445 ATC CGT TGC TGC GGC CTC GAT CAA CCG TCG GAT GTC GAG GTC GAC TCG 1392 Ile Arg Cys Cys Gly Leu Asp Gln Pro Ser Asp Val Glu Val Asp Ser 450 455 460 GCA GGC GCC CCC ACC ATC TCG GCC ATG CGC CCG CGC CCC GAC CAT CCG 1440 Ala Gly Ala Pro Thr Ile Ser Ala Met Arg Pro Arg Pro Asp His Pro 465 470 475 480 GAA TGG GAC ACC GCC ATC TGG CTC AAC GTC CTC GGC GTC CCC GGA ACC 1488 Glu Trp Asp Thr Ala Ile Trp Leu Asn Val Leu Gly Val Pro Gly Thr 485 490 495 CCC GGC ATG TTC GCG TTC TAC CGC GAA ATG GAA CAG TGG ATG CGT AAT 1536 Pro Gly Met Phe Ala Phe Tyr Arg Glu Met Glu Gln Trp Met Arg Asn 500 505 510 CAC TAC AAC AAC AAC GAC GCC ACC TTC CGC CCC GAG TGG TCC AAG GGC 1584 His Tyr Asn Asn Asn Asp Ala Thr Phe Arg Pro Glu Trp Ser Lys Gly 515 520 525 TGG GCG TTC GGC CCC GAC AAG CCG TAC ACC GAC ACC CCG ATC ATC ACC 1632 Trp Ala Phe Gly Pro Asp Lys Pro Tyr Thr Asp Thr Pro Ile Ile Thr 530 535 540 CAG GGC CTC CCC CAG ACC TAC CGC GAC GGC GTC CCA TCG AGC GAC AAC 1680 Gln Gly Leu Pro Gln Thr Tyr Arg Asp Gly Val Pro Ser Ser Asp Asn 545 550 555 560 TGG GAC ACC GCC AAC GCC GCA TTC AAC GCG TTG GAT CCG CAC AAG GTC 1728 Trp Asp Thr Ala Asn Ala Ala Phe Asn Ala Leu Asp Pro His Lys Val 565 570 575 TTC AGC AAC ACC TTC CTG GAC CAG TTG CTG CCT 1761 Phe Ser Asn Thr Phe Leu Asp Gln Leu Leu Pro 580 585

【００６３】

【配列表】

配列番号：２ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ
（合成ＤＮＡ） 配列の特徴 Ｓ ＣＤＳ 配列 GAR ATG GAR CAR TGG ATG RG 20 Glu Met Glu Gln Trp Met Arg 1 5

【００６４】

【配列表】

配列番号：３ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ
（合成ＤＮＡ） 配列 GGAGTAGCCC GACCATGGCG GCACAAGA 28

【００６５】

【配列表】

配列番号：４ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ
（合成ＤＮＡ） 配列 TGAGGTTCAA GTGGAATTCA CTGAGCGCAC T 31

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はプラスミドｐＴＶＣＯＮ１の構造を示
す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表１のアミノ酸配列の１から５８７
   で表されるアミノ酸配列をコードする外来性ＤＮＡを導
   入した遺伝子組換え微生物を培養することを特徴とする
   コレステロールオキシダーゼの製造法。
2. 【請求項２】 ＤＮＡが、セルロモナス・エスピーＢ−
   ０８１４株（ＦＥＲＭ Ｐ−６３１６）由来のコレステ
   ロールオキシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
   である請求項１記載のコレステロールオキシダーゼの製
   造法。
3. 【請求項３】 ＤＮＡが、配列表１の塩基配列の１から
   １７６１で表される塩基配列を有するＤＮＡである請求
   項１記載のコレステロールオキシダーゼの製造法。
4. 【請求項４】 遺伝子組換え微生物が、エシェリヒア属
   に属する微生物である請求項１記載のコレステロールオ
   キシダーゼの製造法。
5. 【請求項５】 遺伝子組換え微生物が、エシェリヒア・
   コリＷ３１１０・ｐＴＶＣＯＮ１（ＦＥＲＭ Ｐ−１６
   ０３９）である請求項１記載のコレステロールオキシダ
   ーゼの製造法。
6. 【請求項６】 コレステロールオキシダーゼが、少なく
   とも配列表１の３８から５８７で表されるアミノ酸配列
   を含むコレステロールオキシダーゼである請求項１記載
   のコレステロールオキシダーゼの製造法。
7. 【請求項７】 配列表１のアミノ酸配列の１から５８７
   で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
8. 【請求項８】 ＤＮＡが、セルロモナス・エスピーＢ−
   ０８１４株（ＦＥＲＭ Ｐ−６３１６）由来のコレステ
   ロールオキシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
   である請求項７記載のＤＮＡ。
9. 【請求項９】 ＤＮＡが、配列表１の塩基配列の１から
   １７６１で表される塩基配列を有するＤＮＡである請求
   項７記載のＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 配列表１のアミノ酸配列の１から５８
    ７で表されるアミノ酸配列をコードする外来性ＤＮＡを
    保持する遺伝子組換え微生物。
11. 【請求項１１】 ＤＮＡが、セルロモナス・エスピーＢ
    −０８１４株（ＦＥＲＭ Ｐ−６３１６）由来のコレス
    テロールオキシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮ
    Ａである請求項１０記載の遺伝子組換え微生物。
12. 【請求項１２】 ＤＮＡが、配列表１の塩基配列の１か
    ら１７６１で表される塩基配列を有するＤＮＡである請
    求項１０記載の遺伝子組換え微生物。
13. 【請求項１３】 遺伝子組換え微生物が、エシェリヒア
    属に属する微生物である請求項１０記載の遺伝子組換え
    微生物。
14. 【請求項１４】 遺伝子組換え微生物が、エシェリヒア
    ・コリＷ３１１０・ｐＴＶＣＯＮ１（微工研寄託、ＦＥ
    ＲＭ Ｐ−１６０３９）である請求項１０記載の遺伝子
    組換え微生物。