JPH10227795A

JPH10227795A - 免疫測定法及び免疫測定試薬

Info

Publication number: JPH10227795A
Application number: JP3022797A
Authority: JP
Inventors: Yoshie Matsumoto; 美枝松本; Hiroshi Kuroda; 広志黒田
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1997-02-14
Filing date: 1997-02-14
Publication date: 1998-08-25
Anticipated expiration: 2017-02-14
Also published as: JP3654732B2

Abstract

(57)【要約】【課題】リポソームを用いた免疫測定法において、検出
に比色法を適用できるために、汎用性が高く、簡便であ
り、かつ、感度が十分高い免疫測定法及び免疫測定試薬
を提供する。【解決手段】検体中の測定対象物質に対する抗原又は抗
体（例、ＡＦＰ抗体）、或いは該測定対象物質が結合さ
れ、抗原抗体反応により溶解作用を受ける膜からなり、
定量可能なマーカー物質が内包されたリポソームと、検
体（例、ＡＦＰ含有検体）とを共存させて、抗原抗体反
応によりリポソームから遊離されるマーカー物質を検出
し、測定対象物質（例、ＡＦＰ）の量を測定する免疫測
定法であって、上記マーカー物質が不溶性担体（例、ラ
テックス粒子）であることを特徴とする免疫測定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、検体中の測定対象
物質の量を測定するための免疫測定法及び免疫測定試薬
に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、癌マーカーを中心に微量物質の測
定が重要になってきている。このような微量物質の測定
は、高い特異性、感度等が必要であり、抗原抗体反応を
利用した方法が最も適しており、特に標識物質を用いた
方法が感度面で優れているため、広く用いられている。
上記標識物質としては、ラジオアイソトープ、酵素、蛍
光物質等があるが、ラジオアイソトープは放射能処理、
特殊な施設等が必要であり、酵素を用いるエンザイム・
イムノアッセイ（ＥＩＡ）法や蛍光物質を用いるフルオ
レッセンス・イムノアッセイ（ＦＩＡ）法が主流になり
つつある。

【０００３】また、ＥＩＡ法やＦＩＡ法には、操作上、
抗原抗体反応した標識物質と未反応の標識物質の分離
（Ｂ／Ｆ分離）が必要な不均一法（ヘテロジニアス法）
と、Ｂ／Ｆ分離を必要としない均一法（ホモジーニアス
法）とがあり、ヘテロジーニアス法は感度面では優れて
いるが、操作が煩雑である。

【０００４】一方、ホモジーニアス法は操作が簡便で、
迅速化が可能であり、エンザイム・マルチプライド・イ
ムノアッセイ・テクニック（ＥＭＩＴ）法やアソシエイ
テッド・エンザイム・センシティブ・テクニック（ＡＥ
ＳＴ）法等が実用化されているが、ＥＭＩＴ法は高分子
量物質の測定が困難であり、ＡＥＳＴ法は安定性に問題
がある。

【０００５】また、ホモジーニアス系にリポソームを用
いた方法として、抗原感作リポソームを用いた方法が報
告されているが、この方法は抗原をリポソームに感作す
るので不安定な抗原には適用できない等の問題がある。

【０００６】また、抗体感作リポソームを用いた方法と
しては、特開昭56-132564 号公報、特開昭61-250558 号
公報、特開昭61-269070 号公報などに報告されている。

【０００７】しかしながら、特開昭56-132564 号公報の
ものでは、酵素を封入物質としているので、リポソーム
表面に酵素が吸着したり、酵素がリポソームの組成の一
部になり、活性基がリポソーム表面に現れる等のために
リポソームが破壊しなくてもある程度の酵素活性を示
し、測定系に応用したときにブランク値が高くなる（こ
のようなリポソームへの結合などを非特異吸着と称す
る）等の問題がある。

【０００８】上記特開昭61-250558 号公報のものは、リ
ポソーム上に被検物質に対する抗体の少なくとも一部が
固定化され、さらに前記リポソーム内部には親水性の標
識物質（蛍光性化合物、発光性化合物、吸光性化合物、
糖類、イオン性化合物、酵素、補酵素、ラジカル化合物
など）が封入されているリポソーム免疫分析用試薬を、
前記被検物質を含有する試料にあらかじめ接触し反応さ
せ、その後に被検物質に対する第２抗体及び補体を作用
させることを特徴とする免疫分析方法であり、最初に抗
体感作リポソームと被検物質を反応させることにより感
度の高い測定を行っている。

【０００９】また、上記特開昭61-269070 号公報のもの
は、マーカー（蛍光物質など）を封入したリポソームに
抗体を結合させ、この抗体感作リポソーム及びフリーの
抗体（抗原に対する抗体液そのままのもの又は希釈液）
を検体とともに共存させて、検体中の抗原をリポソーム
に結合している抗体とフリーの抗体とでサンドイッチ型
の抗原抗体複合体となし、この複合体の形成されたリポ
ソームを補体により特異的に破壊してリポソームから流
出するマーカーを測定し、この測定値を別途作成された
標準検量線に照合させることを特徴とする、抗原の定量
法であり、抗原をサンドイッチ型にすることで補体作用
を促進し、高い感度を得ている。

【００１０】しかし、特開昭61-250558 号公報、特開昭
61-269070 号公報に開示された方法は蛍光測定が主であ
り、汎用の分光光度計が使用できず一般的な比色法に応
用することはできないので、汎用性、簡便性にやや欠け
る。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の問題
点を解決するものであり、その目的は、リポソームを用
いた免疫測定法において、検出に比色法を適用できるた
めに、汎用性が高く、簡便であり、かつ、感度が十分高
い免疫測定法及び免疫測定試薬を提供することにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、リポソー
ムを用いた免疫測定法において、検出に比色法が適用で
き、かつ、感度が十分高く検体中の測定対象物質を測定
できる方法として、封入物質として不溶性担体（特にラ
テックス）を用い、反応系中に遊離された不溶性担体の
濁度（吸光度）を比色法で検出する系が望ましいと考
え、鋭意研究した。その結果、特に、表面が親水性を示
すラテックス粒子を封入物質とすることにより、比色法
により検体中の測定対象物質を測定できることを見出
し、本発明を完成した。すなわち、本発明はリポソーム
内に不溶性担体（特にラテックス）を内包した抗体又は
抗原感作リポソームを用いる検体中の測定対象物質の定
量方法を提供するものである。

【００１３】以下、本発明について詳細に説明する。

【００１４】本発明の請求項１記載の免疫測定法は、検
体中の測定対象物質に対する抗原又は抗体、或いは該測
定対象物質が結合され、抗原抗体反応により溶解作用を
受ける膜からなり、定量可能なマーカー物質が内包され
たリポソームと、検体とを共存させて、抗原抗体反応に
よりリポソームから遊離されるマーカー物質を検出し、
測定対象物質の量を測定する免疫測定法であって、上記
マーカー物質が不溶性担体であることを特徴とする。

【００１５】本発明の請求項２記載の免疫測定法は、不
溶性担体がラテックス粒子である請求項１記載の免疫測
定法である。

【００１６】本発明の請求項３記載の免疫測定法は、ラ
テックス粒子が親水性の表面をもつラテックス粒子であ
る請求項２記載の免疫測定法である。

【００１７】本発明の免疫測定試薬は、請求項１記載の
リポソームの膜溶解によってリポソームから遊離された
不溶性担体を検出することによる、検体中の測定対象物
質の量を測定するための免疫測定試薬である。

【００１８】まず、本発明の免疫測定法について説明す
る。

【００１９】本発明に於いて使用されるリポソームの主
たる膜構成成分としては、通常のリポソーム調製におい
て膜構成成分として用いられるものがすべて挙げられ、
特に限定されない。例えば、リン脂質を含むヒツジ赤血
球のクロロホルム抽出画分（Biochemistry,8,p4149,(19
69) 等）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭ
ＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰ
Ｃ）、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオ
イルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチ
ジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジル
エタノールアミン、卵黄ホスファチジルグリセロール、
ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジミリス
トイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジミ
リストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファ
チジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリ
ン等のリン脂質；ガングリオシド糖脂質、スフィンゴ糖
脂質、グリセロ糖脂質等の糖脂質；コレステロール類；
天然レシチン（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン
等）；これらの一種又は二種以上の混合系等、通常知ら
れている組成のものは全て使用できる。

【００２０】また、リポソーム内に内包されるマーカー
物質は、比色法でその濃度を測定できる不溶性担体であ
れば特に限定されないが、粒径の比較的小さい微粒子が
好ましく、例えば、ラテックス粒子、酸化チタン粒子、
磁性体粒子などが挙げられ、入手の容易さ、使用し易
さ、安定性などの点から、ラテックス粒子が特に好まし
い。

【００２１】上記ラテックス粒子としては、粒径が比較
的一定であり、一定の品質、性能のものが工業的に大量
生産され得る粒子が好ましい。例えば、スチレン、塩化
ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エ
ステル、メタクリル酸エステルなどのビニル系モノマー
の単一重合体及び／又は共重合体；スチレン−ブタジエ
ン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合
体などのブタジエン系共重合体などの微粒子が挙げられ
る。通常、このようなラテックス表面は疎水性に富むた
め、このままではリポソームの材料であるリン脂質をそ
の表面に吸着したり、又は粒子同士で自己凝集してしま
う可能性が高くなる。そのため、親水性の表面をもつラ
テックス粒子が好ましい。親水性の表面をもつラテック
ス粒子を得るには、例えば、ウシ血清アルブミンなどの
免疫学的に不活性なタンパク質でラテックス粒子表面を
被覆し、親水性を付与する方法、又はラテックスを重合
する際に、アクリルアミドなど親水性に富むモノマーを
用い、親水性官能基を有するラテックスを得る方法など
が挙げられる。

【００２２】上記ラテックス粒子の粒径は、リポソーム
に内包され得る大きさであれば特に制限されないが、
０．０１〜１μｍが好ましく、０．０５〜０．２μｍが
特に好ましい。該粒径が０．０１μｍ未満であると、測
定時に大きな濁度変化量を得るためには、大量のラテッ
クスが必要となり、１μｍを超えると、リポソームに内
包できる個数が激減し、やはり大きな濁度変化量を得る
ことが困難になる。リポソームに内包されるラテックス
の最適濃度は、測定対象物質を測定する際に必要とされ
る感度によって適宜選択される。

【００２３】本発明において、リポソームの調製方法と
しては、従来公知のリポソーム調製法を利用することが
できる。例えば、「ライフサイエンスにおけるリポソー
ム実験マニュアル」（寺田弘、吉村哲郎編著、p60-8
9、シュプリンガー・フェアラーク東京（株）、（1992
年））に示されたVortex法、界面活性剤除去法、フレン
チプレス法、超音波処理法のほか、逆相蒸発法（REV
法）、エタノール注入法、エーテル注入法、プレ−ベジ
クル（Pre-Vesicle ）法、Ca²⁺融合法、アニーリング
（Annealing 法）、凍結融解融合法、凍結乾燥法、W/O/
W エマルジョン法等の方法や、S.M.Grunerら（Biochemi
stry, 24 ,p2833 ,(1985))により報告されたStable Plu
rilamellar Vesicle法（SPLV法）等の方法が挙げられ
る。また、必要に応じてリポソームを濾過して粒径を整
える操作を行っても良い。

【００２４】また、ラテックス粒子などの不溶性担体を
リポソームに内包させる方法としては、従来公知のリポ
ソーム調製法を応用することができる。例えば、有機溶
媒に溶解したリン脂質を容器に入れ減圧下にエバポレー
ター又は窒素ガスの吹き付けにより溶媒を除去して薄い
脂質膜を形成させ、次に予め封入したいラテックスを懸
濁させた適当な水溶液や緩衝液を加え振盪する方法や、
ボルテックスミキサーで振盪撹拌する方法や、前述の方
法で得たリポソームをラテックス懸濁液とともに超音波
発振装置で超音波処理する方法、有機溶媒に溶解したリ
ン脂質を急激にラテックス懸濁液を含む塩類溶液と混和
する方法、などの種々の方法が挙げられる。

【００２５】本発明に使用されるリポソームの粒径は、
１００〜５０００ｎｍが好ましく、２００〜３０００ｎ
ｍがより好ましく、５００〜１０００ｎｍが特に好まし
い。この範囲においては、保存中に沈殿し難いので試薬
としての安定性に優れ、しかも分光光度計等による濁度
（吸光度）の測定の点からも好ましい。

【００２６】リポソームへ抗原又は抗体を結合（感作）
させる方法としては、フランシス・ジェイ・マーチンら
〔Biochemistry,20,p4229,(1981)、J. Biol. Chem., 25
7 ,p286 ,(1982) 等〕に報告されている架橋法を用いて
結合させることができる。架橋剤は、上記文献の前者の
ものではＮ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオナート（SPDP）のようなジチオピリジル基
を、上記文献の後者のものではＮ−サクシンイミジル４
−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（SMPB）のよ
うなマレイミド基を用いてリポソームにタンパク等を結
合させているが、他に、Ｎ−（γ- マレイミドブチリル
オキシ）サクシンイミド（GMBS）、Ｎ−（δ−マレイミ
ドカプロイルオキシ）サクシンイミド（EMCS）等を架橋
剤として用いることもできる。

【００２７】リポソームに結合（感作）させる抗原又は
抗体は測定対象物質（検体中の被検抗体又は抗原）に応
じて適宜選択される。例えば、α−フェトプロテイン
（AFP）、癌胎児性抗原（CEA ）、β2-ミクログロブリ
ン、カルボハイドレート・アンチゲン19-9（CA19-9）等
の各種癌抗原に対する抗体；HBsAg 、HBcAg 、HTLV-I、
HTLV-III等のウィルス関連の抗原又はこれらに対する抗
体；更には血中のホルモンやIgG 等の血漿タンパクが挙
げられる。

【００２８】上記抗体は、動物への免疫法や、モノクロ
ーナル抗体作製の通常技術によって製造される。また、
抗体はそのまま結合させてもよく、また抗原認識部位を
含む断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａ
ｂ’）₂）であってもよい。後述のフリーの抗体により
抗原抗体複合体を形成するに当たっては、リポソームに
共有結合させる抗体源として山羊のＩｇＧフラクショ
ン、山羊のＦａｂ’又は家兎のＦａｂ’を、またフリー
の抗体源として家兎のＩｇＧフラクションを用いること
ができる。リポソームに共有結合させる抗体とフリーの
抗体とが共にモノクローナル抗体であることもでき、又
モノクローナル抗体とポリクローナル抗体を組み合わせ
て用いることができる。リポソームに共有結合させる抗
体源としてマウスモノクローナル抗体を用い、一方フリ
ーの抗体源としてマウスモノクローナル抗体又は家兎ポ
リクローナル抗体を用いるのが有利である。リポソーム
に共有結合させるモノクローナル抗体とフリーのモノク
ローナル抗体とは、それぞれ異なる抗原決定部位を認識
して結合する、互いに異なるモノクローナル抗体である
のが特に好ましい。

【００２９】本発明において、検体中の測定対象物質に
対する抗原又は抗体、或いは該測定対象物質が結合さ
れ、定量可能なマーカー物質が内包されたリポソーム
と、検体とを共存させて、抗原抗体反応によりリポソー
ムからマーカー物質を遊離させるには、上記抗原抗体反
応させた後、該反応系に補体を存在させることにより、
リポソーム膜を溶解することにより行われる。上記補体
としては、特に限定されず、例えばモルモット補体、ウ
サギ補体、マウス補体、ヒト補体が好適に使用される。

【００３０】本発明の免疫測定法について、検体中の測
定対象物質として抗原を定量する場合の一例について、
手順に従って説明する。まず、上記のようにして得られ
た、不溶性担体（ラテックス粒子）内包抗体感作リポソ
ームと、検体を適当な緩衝剤中で混合し、抗原抗体反応
を起こさせ、次いで、フリーの抗体（フリーの抗体と
は、測定対象物質である抗原に対する抗体であり、かつ
補体結合部位を有した抗体）及び補体を加え、検体中の
抗原を感作リポソーム上の抗体とフリーの抗体とでサン
ドイッチして抗原抗体複合体を形成させ、この抗原抗体
複合体が形成されたリポソームを補体により特異的に溶
解させ、リポソームに内包されていた不溶性担体（ラテ
ックス粒子）をリポソーム内から遊離させる。この遊離
不溶性担体（ラテックス粒子）の量は、検体中の抗原の
量を反映するので、この遊離不溶性担体（ラテックス粒
子）の量を、例えば、光の透過光の減少（濁度の増加、
吸光度の増加）として分光光度計又は自動分析装置（日
立７０５、７０５０、７１５０、７３６、７０７０等）
により測定し、例えば、予め作成した検量線との照合に
より、検体中の抗原の量を測定する。

【００３１】上記反応において使用される、不溶性担体
（ラテックス粒子）内包抗体感作リポソーム液のリン脂
質濃度は０．０１〜２．０ｍｇ／ｄｌが好ましく、０．
１〜０．７ｍｇ／ｄｌがより好ましい。検体と不溶性担
体（ラテックス粒子）内包抗体感作リポソーム液との比
率は、適宜選択できるが、通常、検体１〜２０μｌに対
し、不溶性担体（ラテックス粒子）内包抗体感作リポソ
ーム液１〜２００μｌが好ましく、５〜１００μｌがよ
り好ましい。

【００３２】不溶性担体（ラテックス粒子）内包抗体感
作リポソーム液と検体を反応させた後、反応系に存在さ
せる補体としては、通常、補体を含む動物血清を１〜４
００００倍、好ましくは２０〜１００００倍に緩衝液で
希釈したものが用いられる。使用量は、検体と不溶性担
体（ラテックス粒子）内包抗体感作リポソーム液との前
記比率の反応液に対して、補体として、例えば、０．２
〜２ＣＨ₅₀のモルモット血清を含む緩衝液であれば、１
０〜３００μｌが好ましく、１００〜２００μｌがより
好ましい。

【００３３】上記反応において用いられる緩衝剤として
は、例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン（Tris）緩衝液、グッド
緩衝液、ベロナール緩衝液等が挙げられるが、これらに
限定されるものではなく、通常用いられる緩衝剤であれ
ばいずれも使用可能である。本発明の免疫測定法におい
て用いられる免疫測定試薬に、必要に応じて、ウシ血清
アルブミン、ゼラチン等の蛋白質、糖、キレート、還元
剤、防腐剤等の、通常この分野において使用される添加
剤等を添加してもよい。

【００３４】上記反応の温度は、いずれも１０〜４５℃
が好ましく、２５〜４０℃がより好ましい。上記反応の
ｐＨは５〜９が好ましく、中性付近がより好ましい。

【００３５】検体中の抗原測定の別の方法としては、検
体に、不溶性担体（ラテックス粒子）内包測定対象物質
（抗原）感作リポソーム及び該測定対象物質（抗原）に
対する一定量の抗体を加え、検体中の測定対象物質（抗
原）とリポソームに感作された測定対象物質（抗原）と
を前記抗体に競合反応させた後、抗原抗体結合リポソー
ムを形成させた後、補体を加え、補体によりリポソーム
を特異的に溶解させ、遊離した不溶性担体（ラテックス
粒子）の量を、光の透過光の減少（濁度の増加、吸光度
の増加）として測定し、予め作成した検量線との照合に
より、検体中の測定対象物質（抗原）の量を測定する、
方法でもよい。すなわち、この方法は、検体中の測定対
象物質として抗原が結合されたリポソームと、検体とを
共存させて、抗原抗体反応によりリポソームから遊離さ
れるマーカー物質を検出し、測定対象物質の量を測定す
る免疫測定法に相当する。

【００３６】また、本発明の免疫測定法について、検体
中の測定対象物質として抗体を定量する場合の一例につ
いて、手順に従って説明する。まず、上記のようにして
得られた、不溶性担体（ラテックス粒子）内包抗原感作
リポソームと、検体を適当な緩衝剤中で混合し、抗原抗
体反応を起こさせてリポソーム上に抗原抗体複合体を生
成させ、次いで、補体を加え、この抗原抗体複合体が形
成されたリポソームを補体により特異的に溶解させ、リ
ポソームに内包されていた不溶性担体（ラテックス粒
子）をリポソーム内から遊離させる。この遊離不溶性担
体（ラテックス粒子）の量は、検体中の抗体の量を反映
するので、この遊離不溶性担体（ラテックス粒子）の量
を、例えば、光の透過光の減少（濁度の増加、吸光度の
増加）として分光光度計又は自動分析装置（日立７０
５、７０５０、７１５０、７３６、７０７０等）により
測定し、例えば、予め作成した検量線との照合により、
検体中の抗体の量を測定する。

【００３７】本発明の免疫測定試薬は、請求項１記載の
リポソームの膜溶解によってリポソームから遊離された
不溶性担体を検出することによる、検体中の測定対象物
質（抗原又は抗体）の量を測定するための免疫測定試薬
であり、その詳細は、上記の免疫測定法の説明の中で用
いられた試薬と同様である。

【００３８】すなわち、本発明の免疫測定試薬の具体例
としては、（１）検体中の測定対象物質に対する抗体が
結合され、検体中の測定対象物質である抗原との抗原抗
体反応により溶解作用を受ける膜からなり、定量可能な
マーカー物質として不溶性担体が内包されたリポソーム
からなる試薬；（２）検体中の測定対象物質に対する抗体が結合さ
れ、検体中の測定対象物質である抗原との抗原抗体反応
により溶解作用を受ける膜からなり、定量可能なマーカ
ー物質として不溶性担体が内包されたリポソームと、
前記のフリーの抗体および補体が混合されたものとから
なる試薬；（３）検体中の測定対象物質に対する抗体が結合さ
れ、検体中の測定対象物質である抗原との抗原抗体反応
により溶解作用を受ける膜からなり、定量可能なマーカ
ー物質として不溶性担体が内包されたリポソームと、
上記のフリーの抗体と、補体とからなる試薬；

【００３９】（４）検体中の測定対象物質が結合され、
該測定対象物質に対する抗体との抗原抗体反応により溶
解作用を受ける膜からなり、定量可能なマーカー物質と
して不溶性担体が内包されたリポソームからなる試薬；（５）検体中の測定対象物質が結合され、該測定対象
物質に対する抗体との抗原抗体反応により溶解作用を受
ける膜からなり、定量可能なマーカー物質として不溶性
担体が内包されたリポソームと、上記測定対象物質に
対する抗体および補体が混合されたものとからなる試
薬；（６）検体中の測定対象物質が結合され、該測定対象
物質に対する抗体との抗原抗体反応により溶解作用を受
ける膜からなり、定量可能なマーカー物質として不溶性
担体が内包されたリポソームと、上記測定対象物質に
対する抗体と、補体とからなる試薬；

【００４０】（７）検体中の測定対象物質に対する抗原
が結合され、検体中の測定対象物質である抗体との抗原
抗体反応により溶解作用を受ける膜からなり、定量可能
なマーカー物質として不溶性担体が内包されたリポソー
ムからなる試薬；（８）検体中の測定対象物質に対する抗原が結合さ
れ、検体中の測定対象物質である抗体との抗原抗体反応
により溶解作用を受ける膜からなり、定量可能なマーカ
ー物質として不溶性担体が内包されたリポソームと、
補体とからなる試薬；などが挙げられる。

【００４１】

【発明の実施の形態】

（実施例１）次の実施例は、本発明によるＡＦＰ抗原検
出用の免疫測定試薬及びその免疫測定法について説明す
るものである。実施例においては、次に挙げる試薬及び
測定用検体を使用した。なお、後述の比較例においても
特に指示のない限り、同名の試薬については同じものを
使用した。

【００４２】〔材料〕ＤＰＰＣ：ジパルミトイルフォスファチジルコリンＣｈｏｌ：コレステロールＤＴＰ−ＤＰＰＥ：ジチオピリジル化ジパルミトイルフ
ォスファチジルエタノールアミンＴＥＳ：ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチ
ル−２−アミノエタンスルホン酸）、塩化ナトリウムを
精製水に溶解し、ＴＥＳ、塩化ナトリウムの終濃度がそ
れぞれ１０ｍＭ、１５０ｍＭとなるように溶解し、水酸
化ナトリウムでｐＨを７．５に調製したもの。酢酸緩衝液：酢酸、塩化ナトリウムを精製水に溶解し、
酢酸、塩化ナトリウムの終濃度がそれぞれ１０ｍＭ、１
５０ｍＭとなるように溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨ
を４．５に調製したもの。ＳＰＤＰ：Ｎ−ハイドロオキシスクシンイミジル３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオネートＤＴＴ：ジチオスレイトールマウスモノクローナル抗ＡＦＰ抗体：１０ｍＭＨｅｐ
ｅｓ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有ｐＨ７．
５）に溶解したもの。

【００４３】（１）ラテックス粒子内包リポソームの調
製ＤＰＰＣ５０μｍｏｌ、Ｃｈｏｌ５０μｍｏｌ、Ｄ
ＴＰ−ＤＰＰＥ２．５μｍｏｌのクロロホルム溶液を
１００ｍｌ容ナス型フラスコに分注し、加温しながらエ
バポレーションしてクロロホルムを留去した。このとき
脂質及びコレステロールはフラスコ内壁に薄膜を形成し
た。更に１時間以上減圧下にフラスコを置き、溶媒を完
全に除去した。

【００４４】その後、２ｍｌのウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）感作ラテックス懸濁液（固形分５重量％）、２ｇ
のガラスビーズを加え激しく撹拌して薄膜を剥がしとっ
た。なお、ＢＳＡ感作ラテックスは以下のようにして調
製した。すなわち平均粒径０．０８７μｍのポリスチレ
ンラテックス（固形分１０重量％）１ｍｌに、ＢＳＡ１
％（Ｗ／Ｖ）を含むＰＢＳ（等張リン酸緩衝液、ｐＨ
６．５）２ｍｌを添加し、２５℃で１時間マグネチック
スターラーで素早く撹拌を行った。遠心洗浄などによ
り、ラテックスに未吸着のＢＳＡを除去した後、１％Ｂ
ＳＡ・ＰＢＳ溶液にてラテックス濃度を５重量％に再調
整した。超音波処理などによりラテックス懸濁液を分散
処理したものを、ＢＳＡ感作ラテックス懸濁液として用
いた。

【００４５】ガラスビーズを除去した後、脂質懸濁液を
エクストルーダーを用いて０．４μｍまでサイジングし
て粒径の均一なリポソーム（ラテックス粒子内包）を調
製した。リポソームに封入されなかったラテックス粒子
はゲル濾過などによって除去した。こうして得られたラ
テックス粒子内包リポソームの濃度をリン定量によって
決定した。

【００４６】（２）抗体への反応基の導入マウスモノクローナル抗ＡＦＰ抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）
１ｍｌに３０ｍＭＳＰＤＰ（エタノール溶解）３０μ
ｌを加え、室温で３０分間反応させた。その後酢酸緩衝
液で平衡化したセファデックスＧ−２５でゲル濾過し、
緩衝液の交換とともに未反応のＳＰＤＰを除去した。得
られた抗体溶液にＤＴＴを終濃度１０ｍＭとなるように
添加し室温で３０分間反応させた。その後、ＴＥＳで平
衡化したセファデックスＧ−２５でゲル濾過し、緩衝液
の交換とともにＤＴＴを除去した。得られた抗体溶液
は、分光光度計で２８０ｎｍの吸光度を測定し濃度を決
定した。

【００４７】（３）抗体結合リポソームの調製（１）項で調製したラテックス粒子内包リポソーム（リ
ン濃度１０ｍＭ）１ｍｌと、（２）項で調製した抗体溶
液（濃度３ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを混合し、４℃で２日間
反応させた。その後、ＴＥＳで平衡化したセファロース
ＣＬ−４Ｂでゲル濾過を行い、未反応の抗体を除去し、
リポソーム分画を分取した。得られた抗体が共有結合し
たリポソーム（ラテックス粒子内包）についてリン定量
を行い濃度を決定した後、リン濃度１０ｍＭになるよう
にＴＥＳで調製した。また、粒度分布測定機により粒径
が０．３８〜０．４０μｍの範囲に分布することを確認
した。

【００４８】（４）ＡＦＰ抗原の測定（３）項で調製した抗体が共有結合したリポソーム（ラ
テックス粒子内包）を、ＴＥＳでリン酸濃度１ｍＭとな
るように希釈してリポソーム免疫測定試薬とした。測定
機として日立７１５０型自動分析装置（日立製作所社
製）を用いて、ＡＦＰ精製抗原を含む検体１０μｌ（濃
度１０、２５、５０、２５０、５００、１０００又は１
５００ｎｇ／ｍｌ）、リポソーム免疫測定試薬（Ｒ₁）
１００μｌ、モルモット補体０．５ＣＨ₅₀及び抗ＡＦＰ
抗体（家兎免疫血清ＩｇＧフラクション、７ｍｇ／ｍ
ｌ）を含む酢酸緩衝液２００μｌ（Ｒ₂）を用い、測定
主波長３４０ｎｍ、測定ポイント２８−５０の条件下で
ＡＦＰ抗原を測定した。その結果を表１及び図１に示し
た。図１において、縦軸は測定波長３４０ｎｍにおける
吸光度変化量を１００００倍した値を示す。また横軸は
ＡＦＰ精製抗原の濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。また、表
１における吸光度変化量も測定波長３４０ｎｍにおける
吸光度変化量を１００００倍した値を示した。

【００４９】なお、上記測定の詳細な条件は以下の通り
とした。ＡＦＰ精製抗原を含む検体１０μｌに、リポソ
ーム免疫測定試薬（Ｒ₁）１００μｌを加え、３７℃で
約８分インキュベートした。その後、モルモット補体及
び抗ＡＦＰ抗体を含む酢酸緩衝液（Ｒ₂）２００μｌを
添加し、Ｒ₂添加後２０秒後と６００秒後の吸光度の差
を求めた。なお、この測定における日立７１５０型自動
分析装置の設定条件を以下に示す。

【００５０】検体量：血清１０μｌリポソーム免疫測定試薬（Ｒ₁）：１００μｌ酢酸緩衝液（Ｒ₂）２００μｌ反応温度：３７℃ 測光ポイント：（２８）−（５０）測定波長：３４０ｎｍ

【００５１】

【表１】

【００５２】（比較例１）実施例１の（１）項におい
て、溶媒を除去したフラスコ内に、ラテックス懸濁液を
添加するかわりに、以下の操作を行った。すなわち、残
った脂質薄膜に標識物質溶液として自己消光性の蛍光物
質である０．２Ｍカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）１
５ｍｌを加え、激しく撹拌した。これを超音波破砕機な
どで十分分散処理することによって均一化し、蛍光物質
内包リポソームを調製した。ついでリポソームに封入さ
れなかったＣＦを除去するためにＳｅｐｈａｄｅｘＧ
−２５にて分離した。次いで、ラテックス粒子内包リポ
ソームの代わりに、蛍光物質内包リポソームを用いた他
は、実施例１の（２）及び（３）項と同様にして、ＡＦ
Ｐ抗体が共有結合したリポソーム（蛍光物質内包）を得
た。

【００５３】得られた抗体結合リポソーム（蛍光物質内
包）を、その初期蛍光強度が適当なものになるように、
０．５ｍＭＭｇＣｌ₂及び０．１５ｍＭＣａＣｌ₂
を含み、かつモルモット補体０．５ＣＨ₅₀及び抗ＡＦＰ
抗体（家兎免疫血清ＩｇＧフラクション、７ｍｇ／ｍ
ｌ）を含むゼラチン−ベロナール緩衝液（以下ＧＶＢ）
で１００倍程度希釈したもの３ｍｌに、検体として０．
５ｍｌの段階希釈したＡＦＰ精製抗原（濃度１０、２
５、５０、２５０、５００、１０００又は１５００ｎｇ
／ｍｌ）を加え、３７℃で６０分間放置して反応させた
後、各試料の蛍光強度を分光蛍光光度計（島津製作所社
製、ＲＦ−５４０）で測定した（励起波長：４９０ｎ
ｍ、蛍光波長：５１８ｎｍ）。なお、測定値は、ＡＦＰ
精製抗原液の代わりにｎ−プロピルアルコールを添加し
たものの蛍光強度と、ＡＦＰ精製抗原液の代わりにＧＶ
Ｂを添加したものの蛍光強度との差を１００％としたと
きの各検体の蛍光強度を相対的に換算し標識物質遊離率
（％）とした。結果を表２及び図２に示した。図２にお
いて、縦軸は標識物質の遊離率（％）を、横軸はＡＦＰ
精製抗原の濃度を示す。

【００５４】

【表２】

【００５５】表１及び図１からわかるように、本発明で
は低濃度から高濃度まで、広い測定レンジが得られるこ
とがわかる。また比較例に示すような従来タイプのリポ
ソーム試薬では、（１）蛍光光度計など、汎用の分光光
度計に比べて特別な測定装置を必要とする、（２）検量
線を作成するための変化量が、遊離率（％）として表さ
れるため、吸光度に比べてレンジが狭く、（吸光度０〜
３５０００、遊離率０〜１００％）測定値の信頼性に劣
る、などの欠点がある。これらは表２及び図２から明ら
かである。

【００５６】

【発明の効果】本発明の請求項１記載の免疫測定法の構
成は、上記の通りであり、本発明の免疫測定法は、抗原
又は抗体感作リポソーム内に不溶性担体を包含し、検体
中の抗原又は抗体の量に応じて補体作用により遊離する
不溶性担体量を測定するので、測定対象物質としての抗
原又は抗体を高感度に、またレンジを広く測定できる。
また、蛍光物質などを封入した場合と比較して、汎用の
分光光度計が使用でき、操作が簡便で測定時間も短い。

【００５７】本発明の請求項２記載の免疫測定法の構成
は、上記の通りであり、不溶性担体として入手が容易で
あり、使用し易く、安定性に優れるラテックス粒子を用
いるので、上記請求項１の効果の全てを奏すると共に、
更に、測定対象物質としての抗原又は抗体を、より簡便
に、より高感度に測定できる。

【００５８】本発明の請求項３記載の免疫測定法の構成
は、上記の通りであり、不溶性担体として親水処理され
た表面をもつラテックス粒子を用いるので、リポソーム
の材料であるリン脂質をその表面に吸着することなく、
また、粒子同士で自己凝集してしまう可能性も低くな
り、そのため、上記請求項１の効果の全てを奏すると共
に、更に、測定対象物質としての抗原又は抗体を、より
正確に、より高感度に測定できる。

【００５９】本発明の免疫測定試薬の構成は、上記の通
りであり、請求項１記載のリポソームの膜溶解によって
リポソームから遊離された不溶性担体を検出することに
より検体中の測定対象物質としての抗原又は抗体を定量
するので、本発明の免疫測定試薬は、検出に比色法を適
用できるために、汎用性が高く、簡便であり、かつ、感
度が十分高い。

【００６０】これらの効果のため、本発明の免疫測定法
及び免疫測定試薬は、ＡＦＰ、ＣＲＰ、ＣＥＡ等の癌マ
ーカー、ＩｇＥ、ＩｇＧ等の免疫グロブリン、インスリ
ン、Ｔ３等のホルモン、ウィルス、薬物等の測定に広範
囲に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】抗体感作リポソーム（ラテックス粒子内包）を
用いたＡＦＰの定量における吸光度変化量とＡＦＰ濃度
の関係をプロットしたグラフである。

【図２】抗体感作リポソーム（蛍光物質内包）を用いた
ＡＦＰの定量における標識物質の遊離率（％）とＡＦＰ
濃度の関係をプロットしたグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】検体中の測定対象物質に対する抗原又は
抗体、或いは該測定対象物質が結合され、抗原抗体反応
により溶解作用を受ける膜からなり、定量可能なマーカ
ー物質が内包されたリポソームと、検体とを共存させ
て、抗原抗体反応によりリポソームから遊離されるマー
カー物質を検出し、測定対象物質の量を測定する免疫測
定法であって、上記マーカー物質が不溶性担体であるこ
とを特徴とする免疫測定法。
【請求項２】不溶性担体がラテックス粒子である請求
項１記載の免疫測定法。
【請求項３】ラテックス粒子が親水性の表面をもつラ
テックス粒子である請求項２記載の免疫測定法。
【請求項４】請求項１記載のリポソームの膜溶解によ
ってリポソームから遊離された不溶性担体を検出するこ
とによる、検体中の測定対象物質の量を測定するための
免疫測定試薬。