JPS63158461A - 免疫分析用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 （産業上の利用分野） 本発明は試料中に存在する特定の抗原又は抗体を定量分
析するための免疫分析用試薬に関する。

（従来の技術） 試料中に存在する特定の抗原又は抗体の定量分析には、
例えばラジオイムノアッセイ（以下、ＲＩＡと記す）が
用いられる。しかし、ＲＩＡでは放射性元素を用いるた
め、専用の機器を設置し、資格を有するオペレータが操
作を行わなければならず、しかも廃棄物の処理等にも注
意を要するという問題がある。

また、その他の分析方法として、例えば免疫電気泳動が
知られている。しかし、免疫電気泳動では測定に長時間
を要するうえ、感度が低く、被検物質がごく微量しか含
まれていない場合には適用することができないという問
題がある。

そこで、本発明者らは先に特願昭５８−２２４５０９号
において、表面に親水性の抗体又は抗原を固定化し、内
部に親水性の標識物質を封入したリポソーム試薬を開示
した。

この免疫分析用試薬を得るには以下のような方法により
製造する事ができる。

まず、所望の脂質と架橋剤とを溶媒中で反応させること
により、脂質分子に官能基を導入して官能性脂質とする
。この官能基がリポソーム上における抗体もしくは抗体
の一部又は抗原を固定化するための官能基として作用す
る。次に、得られた官能性脂質と、必要であればコレス
テロール及び他の脂質の適当量をフラスコに入れ、溶媒
を加えて溶解・混合させて後、溶媒を吸引除去して乾燥
する。この結果、フラスコ壁面に脂質薄膜が形成される
。つづいて、フラスコ内に標識物質を含有する水溶液を
加え、密栓して振とうすることにより、多重層のリポソ
ームの懸濁液を調製する。

一方、リポソームに固定化される抗体もしくは抗体の一
部又は抗原には、必要ならば架橋剤との反応により架橋
基を導入した後、必要に応じて還元剤で処理して修飾す
る。

次いで、前記リボンーム懸濁液と抗体もしくは抗体の一
部又は抗原とを適当な緩衝液中で反応させて、リポソー
ムに抗体もしくは抗体の一部又は抗原を固定化させる。

その後、緩衝液で固定化されなかった抗体又は抗原を洗
浄し適当量の緩衝溶液中に懸濁して多重層のリポソーム
から成る免疫分析試薬とする。

しかしながら、以上の様にして得た多重層のリポソーム
の場合、リポソームの最外殻の膜表面にある官能性脂質
の官能基は抗体もしくは抗体の一部又は抗原と結合する
が、最外殻膜以外の内側にある数層の膜中の官能性脂質
の官能基は抗体又は抗原等が固定化される事なく未反応
の状態で存在する。

この様な状態のリポソーム試薬を用いて血清やタンパク
質含有試料の分析を行う場合、抗原−抗体反応以外に非
特異反応が起り、これに起因してリポソームが破壊され
ることがわかってきた。これは多重層リポソームの最外
殻の抗体又は抗原等を固定化された膜が抗原−抗体反応
に伴って破壊された後、更に多重層リポソームの内側に
ある数層の膜が試料中のタンパク質や微量化学物質との
反応により順次破壊されるものと考える。

従って、抗原−抗体反応以外の反応によって多重層リポ
ソームの膜が破壊される為、測定対象物の濃度とは無関
係にリポソームに封入された標識物質が流出し定猷性が
困難となるという問題があった。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記問題点を解決するためになされたものであ
り、精密かつ簡便な分析が行える免疫分析試薬を提供す
ることを目的とする。

〔発明の構成〕

（問題点を解決するための手段） 本発明の免疫分析用試薬は、リン脂質及び糖脂質のうち
のいずれかと抗原又は抗体を固定化したリン脂質もしく
は糖脂質あるいは脂肪酸を組成とするリポソームと該リ
ポソーム内に封入された標識物質とから成る免疫分析用
試薬において、該リポソームが２Ｍ以上の膜から成る多
重層のリポソームであり、かつ、該２層以上の膜のそれ
ぞれが抗原又は抗体を固定化したリン脂質もしくは糖脂
質あるいは脂肪酸を少なくとも含有する事を特徴とする
ものである。

本発明の免疫分析用試薬は例えば以下の様な方法で製造
する事ができる。

まず、脂質及び必要であればコレステロールの適当量を
フラスコに入れ溶媒を加えて溶解・混合させた後、溶媒
を吸引除去して乾燥する。この結果、フラスコ壁面に脂
質薄膜が形成される。

一方、抗原又は抗体とリン脂質もしくは糖脂質あるいは
脂肪酸の誘導体とを化学反応させて、リン脂質もしくは
糖脂質あるいは脂肪酸の誘導体に固定化した抗原又は抗
体を調製する。

次に、壁面に脂質薄膜が形成された該フラスコ内に、標
識物質を含有する溶液及び該リン脂質もしくは糖脂質あ
るいは脂肪酸の誘導体に固定化された抗原又は抗体を加
え、密栓し振とうする事により多重層リポソームの懸濁
液を調製する。

本発明で用いられるリン脂質及び糖脂質としては分子量
が小さいものだけでなく、どのようなものであってもよ
く特に限定されるものではない。

例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰ
Ｃ＞　、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミ
ン（ＤＰＰＥ＞、ジオレオイルホスファチジルエタノー
ルアミン（ＤＯＰＥ）、シミリストイルホスファチジル
エタノールアミン（ＤＭＰＥ＞、ジステアロイルホスフ
ァチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）等が挙げられる
。

本発明の免疫分析試薬において、リポソームはリン脂質
及び糖脂質のうち少なくともいずれか一方を組成とする
ものである。なお、上述したように必要に応じてリン脂
質、糖脂質に対してコレステロールを１０〜５００モル
％を加えてもよく、これによって安定なリポソームを得
ることができる。

また、リン脂質、糖脂質中の脂肪酸炭素鎖は炭素原子数
が１２〜１８であることが好ましく、更に偶数であるこ
とが好ましい。

本発明で用いられる抗原又は抗体を結合したリン脂質も
しくは糖脂質あるいは脂肪酸の誘導体とは、上記リン脂
質及び糖脂質又は脂肪酸に架橋剤を介して腫瘍マーカー
、免疫グロブリン、ホルモン及び薬物等の抗原又は抗体
を結合したものである。

本発明に用いられる架橋剤とは例えば、Ｎ−サクシンイ
ミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰ
ＤＰ）　、Ｎ−サクシンイミジル４−（Ｐ−マレイミド
フェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）　、Ｎ−（γ−マレ
イミドブチリルオキシ）サクシンイミド（ＧＭＢＳ）、
Ｎ−（ε−マレイミドカプロ）！レオキシ）サクシンイ
ミド（ＥＭＣ３）　、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド等
が挙げられる。

本発明に用いられる脂肪酸とは、ウンデカン酸、ラウリ
ン酸、ミリスチン酸、パルチミン酸、ヘプタデカン酸、
ステアリン酸等が挙げられる。

本発明の免疫分析試薬において、リポソーム内に封入さ
れる標識物質としては、親水性で、リポソーム外に流出
した際に定量可能な物質が選択される。このような物質
としては、例えば、高濃度では自己消光により蛍光を示
さないが、低濃度（１０−３Ｍ以下）で非常に強い蛍光
を発するカルボキシフルオレセインのような蛍光性物質
：リポソーム外で酸化反応により発光するルミノールや
ルシフェリンのような発光性物質；可視域又は紫外域に
特異的な吸収帯を有する吸光性化合物（水溶性色素等）
：酸化酵素の作用により分解され、酵素消費又は過酸化
水素生成をもたらすグルコース、シュークロース等の糖
類：テトラベンチルアンモニウムのような比較的大きな
イオン性化合物：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（ＮＡＤ）のような補酵素類；メチルビオロゲン等の
ラジカル化合物等が挙げられる。これらの化合物は、検
出方法、感度及びリポソームの安定性等の因子を考慮し
た上で適宜選択される。

本発明の免疫分析試薬は、以下のようにして使用される
。すなわち、まず被検物質を含有する試料に本発明の免
疫分析試薬を加え、これと別に補体を加える。なお、こ
の際被検物質に対する第２抗体を加え被検物質を挟みこ
む方法を用いてもよい。この結果、被検物質とリポソー
ム上に固定化された抗体もしくは抗体の一部又は抗原と
の抗原−抗体反応及びそれに伴なう補体の作用により、
リポソームが破壊されて封入されている標識物質（例え
ば蛍光性化合物）が流出する。この流出した標識物質の
社と、試料中の被検物質の量との間には相関関係がある
ので、流出した標識物質を適当な分析方法（例えば蛍光
分析）によって定量することにより、被検物質を定量す
ることができる。

本発明の免疫分析試薬によって定量が可能な被検物質は
、腫瘍マーカー（ＡＦＰＳＢＦＰ。

ＣＥＡ、ＰＯＡ等）、免疫グロブリン（ＩＱＧ。

ＩＱＥ、ＩＱＤ、ＩｇＡ、Ｉ（ＪＭ等）、ホルモン（イ
ンシュリン、■３等）、及び薬物等が挙げられ、その対
象は広範囲にわたる。

（作　用） 本発明の免疫分析用試薬は多重層のリポソームを形成す
るときに抗原又は抗体を予め固定化したリン脂質もしく
は糖脂質あるいは脂肪酸を用いるので、多重層リポソー
ムの最外殻層の膜のみならず内側の数層の膜においても
常に抗原又は抗体が固定化されている状態であり、多重
層リポソームのいずれの膜にも非特異的破壊の要因と考
えられる官能基が存在することはない。

従って、例えば試料となる血清中の被検物質とリポソー
ムとの抗原−抗体反応が終了した後、血清中のタンパク
質や微量物質とリポソームが反応することなく正確な定
量ができる。

（゛実施例） 以下、本発明の詳細な説明する。

実施例　ヒトＡＦＰの測定 ■　官能性脂肪酸への抗ヒトＡＦＰ抗体の修飾１ｎＭａ
ｆの抗ヒトＡＦＰ抗体２ｄを２％のデオキシコール酸を
含むリン酸緩衝液（Ｅ）Ｈ７，１：以下ＰＢＳと記す）
で希釈し、Ｎ−ヒトＯキシイミドのバルミチン酸エステ
ル５０μ９を加える。混合物を３７℃で１２時間インキ
ュベートした後、セファデックスＧ−７５カラムを用い
て、ｏ、ｉｓ％デオキシコール酸でゲルろ過する。これ
により抗体を修飾したバルミチン酸と未反応のバルミチ
ン酸エステルとを分離・採取する。

■　リポソームの調製 使用した脂質は全てクロロホルム又はクロロホルム／メ
タノール（２／１　）混合溶媒に溶解した。

５ｆｆ１Ｍのジパルミトイルホスファチジルコリン２０
０　ｔｔｌ　、１０ｍＭのコレステロールｉｏｏμｍを
１０ｒｒｄｌ容最のナス型フラスコに入れ、更にクロロ
ホルム２ｄを加えて混合した。次に、約４０℃の水浴中
でロータリーエバポレータにより溶媒を除去しフラスコ
壁面に脂質薄膜を形成した。つづいて、フラスコをデシ
ケータ中に移して真空ポンプで約１時間吸引し溶媒を完
全に除去した。

次いで、０．２Ｍのカルボキシフルオレセイン（Ｅ）Ｈ
７．４：以下ＣＦと記す＞１００μｍとＰＢＳに溶解し
た抗ヒトＡＦＰ抗体固定化バルミチン酸（パルミチン酸
濃度として５＋ｎ）ｌ）１０μ℃をフラスコ内に添加し
、フラスコ内を窒素置換した俊、密栓して約６０℃の水
浴中に約１分間浸漬した。つづいて、ｖｏｒｔｅｘミキ
サーを用いてフラスコ壁面の脂質薄膜が完全に消失する
までフラスコを激しく振とうした。この操作により抗原
又は抗体が多重層リポソームの全ての膜に固定化された
リポソームの懸濁液が調製された。

更に、リポソーム懸濁液にゼラチンベロナール緩衝液（
以下ＧｔＪＢ−と記す）を添加した後、遠心分離用チュ
ーブに移し４℃にて１５０００　ｒｐｍ　、　２０分間
遠心する操作を数回行い不要となったＣＦ及び抗ヒトＡ
ＦＰ抗体固定化パルミチン酸を洗浄・除去した。

最後に２ｄのＧＶＢ−″にリポソームを懸濁し免疫分析
用試薬とした。第１図に本発明の免疫分析用試薬の概念
図を示す。

■　抗ヒトＡＦＰ抗体固定化リポソーム試薬によるヒト
ＡＦＰ濃度の検量線作成 遊離のウサギ抗ヒトＡＦＰ抗体を用いたサンドイッチア
ッセイにより以下のようにしてヒトＡＦＰ溌度を定量し
、検量線を作成した。

０、０１〜１０００ｎＭｄの範囲で濃度を変化させたヒ
トＡＦＰ溶液２５μｍに、予めＧＶＢ十（ＧＶＢ−Ｇ，
：　０．５ｍＨのＶＩＱＣｆ１２水溶液及び０、５ｍ）
ｆのＣａＣ１２水溶液を添加したもの）で３０倍に希釈
したリポソーム試薬５μρを添加し、３７℃において１
０分間反応させた。次に、予めＧＶＢ十で２００倍に希
釈したウサギ抗ヒトＡＦＰ抗体＜Ｄａｋｏ社製）２５μ
ｍを添加し、３７℃において５分間反応させた。つづい
て、補体（５ＣＨ５０）２５μｍを添加し、３７℃にお
いて３０分間反応させた。

次いで、０．０１　ＭのＥＤＴＡ−ベロナール緩衝液１
００μｍで反応を停止させ、各濃度のヒトＡＦＰ溶液に
ついて、流出したＣＦ量をＭＴＰ−３２蛍光分光器（コ
ロナ電気製）により、励起波長４９０　ｎｍ、蛍光波長
５２０　ｎｍの条件で測定した。

この測定に基づいて、抗体固定化リポソームの補体に対
する安定性の影響を除去するために、次式により相対蛍
光強度を計算した。

ここで、Ｆｅ：実測した蛍光強度、ＦＯ：抗原を除いた
時（リポソームが全く破壊されていない時）の蛍光強度
、Ｆａ：脱イオン水を添加しリポソームを全て破壊した
時の蛍光強度、である。なお、標準値として、１０−７
Ｍ及び１０−８ＭのＣＦ溶液の蛍光強度を用いた。

このようにしてヒトＡＦＰ濃度と相対蛍光強度との関係
を示す検量線を得た。

■　ヒトＡＦＰ濃度の実測 ■で予め得られた検量線を用いて、患者血清１０試料に
ついてヒトＡＦＰ濃度を実測した。この結果を第１表に
示す。なお、第１表中、参照例はＲＩＡによる測定値で
ある。

比較例 先の特願昭５８−２２４５０９号に開示した免疫分析用
試薬（前述の従来の技術の項に簡単に記載）を用いヒト
ＡＦＰ１１度の検量線を作成し、実施例と同一の試料に
ついてＡＦＰ濃度を実測した。その結果を第１表に示す
。

第１表から明らかなように、実施例の免疫分析用試薬で
は、ＲＩＡによる測定値とよく一致した測定値が得られ
る。これに対して、比較例の免疫分析用試薬では測定不
可能な場合がほとんどであった。これは比較例の免疫分
析用試薬では非特異反応が生じるためである。

同、第２図に従来の免疫分析用試薬の概念図を示す。

第１表 〔発明の効果〕 以上詳述したように本発明の多重層リポソームから成る
免疫分析用試薬によれば、被検物質を含む血清等の試料
を原液のまま分析することができ、正確かつ簡便に被検
物質を定量することができる等顕著な効果を秦するもの
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係わる多重層リポソームから成る免疫
分析用試薬の概念図、第２図は従来の多重層リポソーム
からなる免疫分析用試薬の概念図。 代理人　弁理士　則　近　憲　佑 同　　　　竹　花　喜久男

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）リン脂質及び糖脂質のうちのいずれかと抗原又は
   抗体を固定化したリン脂質もしくは糖脂質あるいは脂肪
   酸を組成とするリポソームと該リポソーム内に封入され
   た標識物質とから成る免疫分析用試薬において、該リポ
   ソームが２層以上の膜から成る多重層のリポソームであ
   り、かつ、該膜のそれぞれが抗原又は抗体を固定化した
   リン脂質もしくは糖脂質あるいは脂肪酸を少なくとも含
   有する事を特徴とする免疫分析用試薬。
2. （２）リポソームの構成がリン脂質及び糖脂質のうちの
   いずれかと抗原又は抗体を固定化したリン脂質もしくは
   糖脂質あるいは脂肪酸とコレステロールから成る事を特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の免疫分析用試薬。
3. （３）標識物質が蛍光性化合物、発光性化合物、吸光性
   化合物、糖類、イオン性化合物、酵素、補酵素、又はラ
   ジカル化合物である事を特徴とする特許請求の範囲第１
   項記載の免疫分析用試薬。