JPH1023899A - 有用蛋白質の生産方法 - Google Patents
有用蛋白質の生産方法Info
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- JPH1023899A JPH1023899A JP8180594A JP18059496A JPH1023899A JP H1023899 A JPH1023899 A JP H1023899A JP 8180594 A JP8180594 A JP 8180594A JP 18059496 A JP18059496 A JP 18059496A JP H1023899 A JPH1023899 A JP H1023899A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 有用蛋白質の生産量を増大できる方法を提供
する。 【解決手段】 イヌＩＦＮ−βを発現する組換え多核体
病ウイルスを培養細胞に接種してイヌＩＦＮ−βを製造
するに当たり、組換え多核体病ウイルスのシグナル配列
を狂犬病ウイルスＧ蛋白質のシグナル配列に置換するこ
とにより、イヌＩＦＮ−βを大量に生産する。
する。 【解決手段】 イヌＩＦＮ−βを発現する組換え多核体
病ウイルスを培養細胞に接種してイヌＩＦＮ−βを製造
するに当たり、組換え多核体病ウイルスのシグナル配列
を狂犬病ウイルスＧ蛋白質のシグナル配列に置換するこ
とにより、イヌＩＦＮ−βを大量に生産する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、組換え多核体病ウ
イルスをＳｆ細胞等の培養細胞もしくはカイコ等の昆虫
に接種して有用蛋白質を生産する方法に関し、詳しく
は、有用蛋白質の生産量を増大させることができる有用
蛋白質の生産方法に関する。
イルスをＳｆ細胞等の培養細胞もしくはカイコ等の昆虫
に接種して有用蛋白質を生産する方法に関し、詳しく
は、有用蛋白質の生産量を増大させることができる有用
蛋白質の生産方法に関する。
【０００２】
【発明の背景と従来の技術】近時、遺伝子操作の進歩に
より、例えばヒトインターフェロン（ＩＦＮ）−α、豚
成長ホルモン等の有用蛋白質を、これをコードする遺伝
子で遺伝子組換えをした多核体病ウイルスを用いて生産
する方法、すなわち同遺伝子組換えウイルスをＳｆ細胞
等の培養細胞又はカイコ等の昆虫に接種して増殖させる
ことにより、カイコ等の体内もしくは培養液に当該有用
蛋白質を蓄積させる方法が報告されている（Maeda,S.(1
989) Ann.Rev.Entomol.,vol.34,pp351-372,Luckow,V.A.
and Summers,M.D.(1988) Bio/technology,Vol.6,pp47-
55）。
より、例えばヒトインターフェロン（ＩＦＮ）−α、豚
成長ホルモン等の有用蛋白質を、これをコードする遺伝
子で遺伝子組換えをした多核体病ウイルスを用いて生産
する方法、すなわち同遺伝子組換えウイルスをＳｆ細胞
等の培養細胞又はカイコ等の昆虫に接種して増殖させる
ことにより、カイコ等の体内もしくは培養液に当該有用
蛋白質を蓄積させる方法が報告されている（Maeda,S.(1
989) Ann.Rev.Entomol.,vol.34,pp351-372,Luckow,V.A.
and Summers,M.D.(1988) Bio/technology,Vol.6,pp47-
55）。
【０００３】しかし、この方法によって生産される有用
蛋白質の生産量は、有用蛋白質によりさまざまであり、
一般に生産量を高めることが望まれているにもかかわら
ず、個々の組換え体において有用蛋白質の生産量を増大
できる方法については未だ報告されていない。
蛋白質の生産量は、有用蛋白質によりさまざまであり、
一般に生産量を高めることが望まれているにもかかわら
ず、個々の組換え体において有用蛋白質の生産量を増大
できる方法については未だ報告されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ところで、細胞内で産
生された蛋白質には、分泌蛋白質や膜蛋白質などの細胞
外に輸送される蛋白質と、細胞内に留まる蛋白質とがあ
り、これらはシグナル配列の有無によって区別される。
生された蛋白質には、分泌蛋白質や膜蛋白質などの細胞
外に輸送される蛋白質と、細胞内に留まる蛋白質とがあ
り、これらはシグナル配列の有無によって区別される。
【０００５】すなわち、細胞外に輸送される蛋白質と細
胞内に留まる蛋白質はシグナル配列の有無により区別さ
れ、したがってシグナル配列が細胞外に輸送される蛋白
質のマーカーとして機能する。
胞内に留まる蛋白質はシグナル配列の有無により区別さ
れ、したがってシグナル配列が細胞外に輸送される蛋白
質のマーカーとして機能する。
【０００６】このシグナル配列は、通常、細胞外に輸送
される蛋白質のＮ末端側に位置し、最初に翻訳される。
シグナル配列がポリペプチドに翻訳されリボゾームから
露出すると、そこにシグナル認識ＲＮＡ蛋白質複合体
（以下「ＳＲＰ」と略す）が結合し、一時翻訳を停止す
る。そのあと、シグナルペプチドとＳＲＰの複合体は細
胞内の小胞体表面上のレセプターに結合し、翻訳を再開
する。シグナルペプチドはレセプターに存在する穴を通
じて小胞体内部へと押し出され、しかるべき位置で小胞
体内膜に存在するシグナルペプチダーゼにより切断除去
される。翻訳が進行すると残りのペプチド部分は自動的
に小胞体内に押し出され、分泌蛋白質の場合は小胞体内
に、膜蛋白質の場合は小胞体膜上に局在する。その後、
蛋白質は小胞体からゴルジ体へと輸送され、最終的には
分泌蛋白質は細胞外へと放出され、膜蛋白質は細胞膜表
面へと分布する。したがって、以上の分泌過程における
シグナルペプチド（遺伝子上ではシグナル配列）の配列
もしくは構造は、分泌蛋白質の分泌量に大きく影響する
と考えられる。大腸菌の発現系では、すでにシグナル配
列と発現量の関係について研究されている（徳永正雄、
菱沼文夫：蛋白質核酸酵素３７巻２２３〜２３４頁，１
９９２年）。
される蛋白質のＮ末端側に位置し、最初に翻訳される。
シグナル配列がポリペプチドに翻訳されリボゾームから
露出すると、そこにシグナル認識ＲＮＡ蛋白質複合体
（以下「ＳＲＰ」と略す）が結合し、一時翻訳を停止す
る。そのあと、シグナルペプチドとＳＲＰの複合体は細
胞内の小胞体表面上のレセプターに結合し、翻訳を再開
する。シグナルペプチドはレセプターに存在する穴を通
じて小胞体内部へと押し出され、しかるべき位置で小胞
体内膜に存在するシグナルペプチダーゼにより切断除去
される。翻訳が進行すると残りのペプチド部分は自動的
に小胞体内に押し出され、分泌蛋白質の場合は小胞体内
に、膜蛋白質の場合は小胞体膜上に局在する。その後、
蛋白質は小胞体からゴルジ体へと輸送され、最終的には
分泌蛋白質は細胞外へと放出され、膜蛋白質は細胞膜表
面へと分布する。したがって、以上の分泌過程における
シグナルペプチド（遺伝子上ではシグナル配列）の配列
もしくは構造は、分泌蛋白質の分泌量に大きく影響する
と考えられる。大腸菌の発現系では、すでにシグナル配
列と発現量の関係について研究されている（徳永正雄、
菱沼文夫：蛋白質核酸酵素３７巻２２３〜２３４頁，１
９９２年）。
【０００７】ところで、分泌蛋白質は通常、自前のシグ
ナル配列を有しているが、それが常に最大の効率で分泌
経路に誘導するとは限らない。
ナル配列を有しているが、それが常に最大の効率で分泌
経路に誘導するとは限らない。
【０００８】本発明者らは、シグナル配列の上述のよう
な特徴的作用に着目して、有用蛋白質の生産量を増大さ
せることができる方法の提供を目的として鋭意検討を進
めた。
な特徴的作用に着目して、有用蛋白質の生産量を増大さ
せることができる方法の提供を目的として鋭意検討を進
めた。
【０００９】具体的には、イヌＩＦＮ−βをモデル蛋白
質として、その分泌を増加させるシグナル配列を見出す
研究を進め、本発明を完成するに至ったものである。
質として、その分泌を増加させるシグナル配列を見出す
研究を進め、本発明を完成するに至ったものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成する本願
発明は前記特許請求の範囲の各請求項に記載した構成を
有することを特徴とし、本願の請求項１の有用蛋白質の
生産方法の発明は、有用蛋白質をコードする遺伝子によ
ってこの有用蛋白質を産生するように遺伝子が組換えら
れた組換え多核体病ウイルスを、Ｓｆ細胞等の培養細胞
又はカイコ等の昆虫に接種して当該有用蛋白質を生産す
る方法において、前記有用蛋白質のシグナル配列を、ウ
イルス由来のシグナル配列に置換するか、又はシグナル
配列を前記方法による蛋白質生産量の多い同種の蛋白質
のシグナル配列に置換して、有用蛋白質の産生を増大さ
せるようにしたことを特徴とする。
発明は前記特許請求の範囲の各請求項に記載した構成を
有することを特徴とし、本願の請求項１の有用蛋白質の
生産方法の発明は、有用蛋白質をコードする遺伝子によ
ってこの有用蛋白質を産生するように遺伝子が組換えら
れた組換え多核体病ウイルスを、Ｓｆ細胞等の培養細胞
又はカイコ等の昆虫に接種して当該有用蛋白質を生産す
る方法において、前記有用蛋白質のシグナル配列を、ウ
イルス由来のシグナル配列に置換するか、又はシグナル
配列を前記方法による蛋白質生産量の多い同種の蛋白質
のシグナル配列に置換して、有用蛋白質の産生を増大さ
せるようにしたことを特徴とする。
【００１１】この方法により生産量を増大することがで
きる有用蛋白質としては、限定されるものではないが、
例えばイヌＩＦＮ−βを代表的に挙げることができる。
また有用蛋白質としてはＩＦＮやサイトカインなどの分
泌蛋白質が考えられるが、その他の分泌蛋白質であって
も良い。
きる有用蛋白質としては、限定されるものではないが、
例えばイヌＩＦＮ−βを代表的に挙げることができる。
また有用蛋白質としてはＩＦＮやサイトカインなどの分
泌蛋白質が考えられるが、その他の分泌蛋白質であって
も良い。
【００１２】また、生産量増大のために用いられる置換
シグナル配列としては、限定されるものではないが、例
えばヨトウガ多核体ウイルス（以下「ＡｃＮＰＶ」と略
す）ｇｐ６７の下記配列番号２に示すシグナル配列、狂
犬病ウイルスのＧ蛋白質の下記配列番号３に示すシグナ
ル配列など、ウイルス由来のシグナル配列、または有用
タンパク質がイヌＩＮＦ−βである場合、同種のタンパ
ク質では生産量が多いことが報告されているヒトＩＦＮ
−βの下記配列番号４に示すシグナル配列を挙げること
ができる。
シグナル配列としては、限定されるものではないが、例
えばヨトウガ多核体ウイルス（以下「ＡｃＮＰＶ」と略
す）ｇｐ６７の下記配列番号２に示すシグナル配列、狂
犬病ウイルスのＧ蛋白質の下記配列番号３に示すシグナ
ル配列など、ウイルス由来のシグナル配列、または有用
タンパク質がイヌＩＮＦ−βである場合、同種のタンパ
ク質では生産量が多いことが報告されているヒトＩＦＮ
−βの下記配列番号４に示すシグナル配列を挙げること
ができる。
【００１３】また、これらのシグナル配列は、アミノ酸
配列の一部が欠失もしくは置換、あるいはｌ〜複数個の
アミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有するものであっ
ても良い。
配列の一部が欠失もしくは置換、あるいはｌ〜複数個の
アミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有するものであっ
ても良い。
【００１４】本発明において用いられるシグナル配列
は、ＤＮＡを化学合成することで遺伝子断片とし、例え
ばイヌＩＦＮ−β遺伝子のシグナル配列部分と交換して
もよいし、シグナル配列遺伝子を既存の遺伝子断片から
調整することもできる。
は、ＤＮＡを化学合成することで遺伝子断片とし、例え
ばイヌＩＦＮ−β遺伝子のシグナル配列部分と交換して
もよいし、シグナル配列遺伝子を既存の遺伝子断片から
調整することもできる。
【００１５】なお、以上の操作は、サムブロックら（Sa
mbrook et al.,1989,Molecular cloning ; a laborator
y manual. 2nd edtion ,Cold Spring Harbor Press）等
の既知の遺伝子操作技術・細胞工学技術にしたがって行
うことができる。
mbrook et al.,1989,Molecular cloning ; a laborator
y manual. 2nd edtion ,Cold Spring Harbor Press）等
の既知の遺伝子操作技術・細胞工学技術にしたがって行
うことができる。
【００１６】本発明によれば、例えば下記配列番号１〜
４のアミノ酸配列を有するシグナル配列とイヌＩＦＮ−
β遺伝子を組み合わせた遺伝子、およびこれらの複合遺
伝子を組み込んだ組換えＡｃＮＰＶ用のトランスファー
ベクターおよび組換えウイルスを提供することができ
る。このような組換えウイルスは、例えばＢａβ−Ｂ
Ｓ、Ｂａβ−ｇｐ、Ｂａβ−ＲＶ、Ｂａβ−Ｈｕとして
提供することができる。
４のアミノ酸配列を有するシグナル配列とイヌＩＦＮ−
β遺伝子を組み合わせた遺伝子、およびこれらの複合遺
伝子を組み込んだ組換えＡｃＮＰＶ用のトランスファー
ベクターおよび組換えウイルスを提供することができ
る。このような組換えウイルスは、例えばＢａβ−Ｂ
Ｓ、Ｂａβ−ｇｐ、Ｂａβ−ＲＶ、Ｂａβ−Ｈｕとして
提供することができる。
【００１７】また本発明によれば、これらの複合遺伝子
を組み込んだ組換えＡｃＮＰＶ等を用いて、これらのウ
イルスを感染させることにより、高濃度のイヌＩＦＮ−
βを含んだ感染培養上清を提供することもできる。
を組み込んだ組換えＡｃＮＰＶ等を用いて、これらのウ
イルスを感染させることにより、高濃度のイヌＩＦＮ−
βを含んだ感染培養上清を提供することもできる。
【００１８】
【発明の実施の形態】上記において一例的に挙げたイヌ
ＩＦＮ−βを生産する組換えウイルスは、次のようにし
て作出することができる。すなわち、イヌＩＦＮ−β蛋
白質をコードするＤＮＡ断片からシグナル配列部分を制
限酵素により切断・除去し、予め合成しておいたシグナ
ル配列部分に相当する遺伝子ＤＮＡを挿入して複合遺伝
子を得る。次いでこの複合遺伝子をバキュロウイルスの
多核体プロモータと連結し、そのトランスファーベクタ
ーをバキュロウイルスＤＮＡとともに昆虫細胞に導入
し、得られた組換えバキュロウイルスのうち、イヌＩＦ
Ｎ−βの活性を生産する組換えウイルスクローンを選択
し、その組換えクローンを昆虫細胞もしくは昆虫に感染
させ、イヌＩＦＮ一β蛋白質を生産する。
ＩＦＮ−βを生産する組換えウイルスは、次のようにし
て作出することができる。すなわち、イヌＩＦＮ−β蛋
白質をコードするＤＮＡ断片からシグナル配列部分を制
限酵素により切断・除去し、予め合成しておいたシグナ
ル配列部分に相当する遺伝子ＤＮＡを挿入して複合遺伝
子を得る。次いでこの複合遺伝子をバキュロウイルスの
多核体プロモータと連結し、そのトランスファーベクタ
ーをバキュロウイルスＤＮＡとともに昆虫細胞に導入
し、得られた組換えバキュロウイルスのうち、イヌＩＦ
Ｎ−βの活性を生産する組換えウイルスクローンを選択
し、その組換えクローンを昆虫細胞もしくは昆虫に感染
させ、イヌＩＦＮ一β蛋白質を生産する。
【００１９】
【実施例】以下、実施例を拳げて本発明をさらに具体的
に説明する。
に説明する。
【００２０】（ｌ）プラスミドの構築 イヌＩＦＮ−β遺伝子を組み込んだバキェロウイルスト
ランスファーベクターをベースとした。その構造を図１
に示す。トランスファーベクターｐＢａβのイヌＩＦＮ
−β遺伝子ＯＲＦのＮ末瑞側にはＮｃｏＩ切断部位、Ｃ
末端側にはＥｃｏＲＩ切断部位が存在する。また、シグ
ナル配列部分を−３２から−１とすると、−４のメチオ
ニンコドンの位置にもＮｃｏＩ切断部位が存在する。こ
れらの切断部位を利用して、それぞれのトランスファー
ベクターを構築した。
ランスファーベクターをベースとした。その構造を図１
に示す。トランスファーベクターｐＢａβのイヌＩＦＮ
−β遺伝子ＯＲＦのＮ末瑞側にはＮｃｏＩ切断部位、Ｃ
末端側にはＥｃｏＲＩ切断部位が存在する。また、シグ
ナル配列部分を−３２から−１とすると、−４のメチオ
ニンコドンの位置にもＮｃｏＩ切断部位が存在する。こ
れらの切断部位を利用して、それぞれのトランスファー
ベクターを構築した。
【００２１】（１−１）ｐＢａβ−ＢＳの構築 イヌＩＦＮ−βでは遺伝子配列から予想されるシグナル
ペプチドの長さが他の動物種のＩＦＮ−βに比べて長
い。また、他の動物種のＩＦＮ−β遺伝子のシグナル配
列のＮ末端と同じところ（−２１番目）に翻訳開始コド
ンであるメチオニンコドンがあった。そこで、−２１番
目のメチオニンコドンに相当するＡＴＧから発現する遺
伝子を作製した。
ペプチドの長さが他の動物種のＩＦＮ−βに比べて長
い。また、他の動物種のＩＦＮ−β遺伝子のシグナル配
列のＮ末端と同じところ（−２１番目）に翻訳開始コド
ンであるメチオニンコドンがあった。そこで、−２１番
目のメチオニンコドンに相当するＡＴＧから発現する遺
伝子を作製した。
【００２２】（１−１−１）ベクター部分の調製 １μｇのｐＢａβプラスミドを１０ｍＭ トリス塩酸
（ｐＨ８．Ｏ）および１００ｍＭ 塩化カリウム、１０
ｍＭ 塩化マグネシウムを含むバッファ２００μｌに溶
解し、２０単位のＮｃｏＩを加え、３７℃で２時間酵素
処理を行った。反応後、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．
６）を２０μｌ加え、混和し、さらに４００μｌのエタ
ノールを加えて、混和後、−２０℃で１時間静置し、沈
殿を形成させた。１２０００×ｇで１５分間遠心するこ
とで沈殿を集め、７０％エタノールで遠心分離物を洗浄
した。この沈殿物を乾燥した後、２０μｌの滅菌蒸留水
に溶解し、５μｌの電気泳動用色素液（０．１％ブロム
フェノールブルー、２０％フィコール、１００ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸を含む）を加えて１％アガロース中
で電気泳動を行った。ゲルを０．５μｇ／ｍｌの臭化エ
チジウムで染色し、長波長トランスイルミネータで解析
し、５．２ｋｂのバンドを含むアガロースゲル部分を切
り出した。ＤＮＡ断片はジーンクリーンキットII（ Bio
101，Inc 社製）を用いて、添付のプロトコルに従い精
製した。
（ｐＨ８．Ｏ）および１００ｍＭ 塩化カリウム、１０
ｍＭ 塩化マグネシウムを含むバッファ２００μｌに溶
解し、２０単位のＮｃｏＩを加え、３７℃で２時間酵素
処理を行った。反応後、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．
６）を２０μｌ加え、混和し、さらに４００μｌのエタ
ノールを加えて、混和後、−２０℃で１時間静置し、沈
殿を形成させた。１２０００×ｇで１５分間遠心するこ
とで沈殿を集め、７０％エタノールで遠心分離物を洗浄
した。この沈殿物を乾燥した後、２０μｌの滅菌蒸留水
に溶解し、５μｌの電気泳動用色素液（０．１％ブロム
フェノールブルー、２０％フィコール、１００ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸を含む）を加えて１％アガロース中
で電気泳動を行った。ゲルを０．５μｇ／ｍｌの臭化エ
チジウムで染色し、長波長トランスイルミネータで解析
し、５．２ｋｂのバンドを含むアガロースゲル部分を切
り出した。ＤＮＡ断片はジーンクリーンキットII（ Bio
101，Inc 社製）を用いて、添付のプロトコルに従い精
製した。
【００２３】（１−１−２）シグナル配列に相当する遺
伝子断片の調製 −２１番目からのシグナル配列に相当する遺伝子断片Ｂ
Ｓ１、ＢＳ２の塩基配列を以下に示す。
伝子断片の調製 −２１番目からのシグナル配列に相当する遺伝子断片Ｂ
Ｓ１、ＢＳ２の塩基配列を以下に示す。
【００２４】 ＢＳ１ 5’-CATGACCAGTAGATGCATCCTCCAAACAACTCTCCTGTTGTATTTCTCCAC-3’ ＢＳ２ 3’-TGGTCATCTACGTAGGAGGTTTGTTGAGAGGACAACATAAAGAGGTGGTAC-5’ ＢＳ１配列中、下線を引いた部分は−２１番目のメチオ
ニンコドンに相当する。ＢＳ１の５’末瑞から４番目か
ら最後までと、ＢＳ２の５’末端から４番目から最後ま
でが相補的になっており、また、残りの部分は制限酵素
ＮｃｏＩと結合するよう工夫されている。これらのＤＮ
ＡはＤＮＡ合成機で合成し、精製した。 （１−１−３）ｐＢａβ−ＢＳの作製 前記「（１−１−１）」で調製したベクターＤＮＡと、
前記「（１−１−２）」で調製したシグナル配列ＤＮＡ
をモル比１：５０で混合し、総量２０μｌとし、２．５
μｌのＴ４ポリヌクレオチドＬｉｇａｓｅを加え、１５
℃で一晩酵素反応を行った。反応液をコンピテント化し
た大腸菌Ｋ１２株由来ＴＢ１と混和し、形質転換反応を
行って形質転換体を得た。次に１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬＢプレートに生育するクローンを得
た。
ニンコドンに相当する。ＢＳ１の５’末瑞から４番目か
ら最後までと、ＢＳ２の５’末端から４番目から最後ま
でが相補的になっており、また、残りの部分は制限酵素
ＮｃｏＩと結合するよう工夫されている。これらのＤＮ
ＡはＤＮＡ合成機で合成し、精製した。 （１−１−３）ｐＢａβ−ＢＳの作製 前記「（１−１−１）」で調製したベクターＤＮＡと、
前記「（１−１−２）」で調製したシグナル配列ＤＮＡ
をモル比１：５０で混合し、総量２０μｌとし、２．５
μｌのＴ４ポリヌクレオチドＬｉｇａｓｅを加え、１５
℃で一晩酵素反応を行った。反応液をコンピテント化し
た大腸菌Ｋ１２株由来ＴＢ１と混和し、形質転換反応を
行って形質転換体を得た。次に１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬＢプレートに生育するクローンを得
た。
【００２５】挿入されたＤＮＡ断片は両未端ともＮｃｏ
Ｉ切断部位をもつようにライゲーションしたため、ｐＢ
ａβ−ＢＳシリーズのプラスミドには、バキュロウイル
ス多核体プロモータに対して順方向、逆方向に結合した
インサートを持つプラスミドが１：１で混合している。
多核体蛋白質プロモータに対して順方向の場合、ＢＳ
１、ＢＲ３プライマーを用いてＰＣＲ増幅した場合、４
５０ｂｐのバンドが、逆方向の場合はバンドが出現しな
い。なお、ＢＲ３プライマーの塩基配列は以下に示すと
おりである。
Ｉ切断部位をもつようにライゲーションしたため、ｐＢ
ａβ−ＢＳシリーズのプラスミドには、バキュロウイル
ス多核体プロモータに対して順方向、逆方向に結合した
インサートを持つプラスミドが１：１で混合している。
多核体蛋白質プロモータに対して順方向の場合、ＢＳ
１、ＢＲ３プライマーを用いてＰＣＲ増幅した場合、４
５０ｂｐのバンドが、逆方向の場合はバンドが出現しな
い。なお、ＢＲ３プライマーの塩基配列は以下に示すと
おりである。
【００２６】 ＢＲ３ 5’-GGCCGAATTCTCAGTTCTGGAGATAATCTG- 3’ 得られたコロニーをランダムに選択し、爪楊枝で大腸菌
を回収し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ
プレートに移植するとともに５０μｌのＰＣＲ反応溶液
に懸濁した。ＰＣＲ反応溶液は１μＭのＢＳ１、ＢＲ３
プライマーとそれぞれ２００μＭのデオキシヌクレオチ
ド、１０ｍＭの塩化カリウム、１０ｍＭのトリス−塩酸
（ｐＨ７．５）、２ｍＭの塩化マグネシウムに、２ユニ
ットの市販のＴｔｈポリメラーゼ（ファルマシア社製）
を含む。引き続いてパラフィンオイルを重層し、９４℃
で４５秒、５０℃で６０秒、７２℃で１２０秒を１サイ
クルとしたＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクショ
ン）を２０サイクル行った。クロロフォルムを加えてパ
ラフィンオイルを除去し、増幅されたＤＮＡ断片をアガ
ロース電気泳動で確認し、４５０ｂｐの増幅産物を与え
たクローンを同定した。
を回収し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ
プレートに移植するとともに５０μｌのＰＣＲ反応溶液
に懸濁した。ＰＣＲ反応溶液は１μＭのＢＳ１、ＢＲ３
プライマーとそれぞれ２００μＭのデオキシヌクレオチ
ド、１０ｍＭの塩化カリウム、１０ｍＭのトリス−塩酸
（ｐＨ７．５）、２ｍＭの塩化マグネシウムに、２ユニ
ットの市販のＴｔｈポリメラーゼ（ファルマシア社製）
を含む。引き続いてパラフィンオイルを重層し、９４℃
で４５秒、５０℃で６０秒、７２℃で１２０秒を１サイ
クルとしたＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクショ
ン）を２０サイクル行った。クロロフォルムを加えてパ
ラフィンオイルを除去し、増幅されたＤＮＡ断片をアガ
ロース電気泳動で確認し、４５０ｂｐの増幅産物を与え
たクローンを同定した。
【００２７】これらのクローンのうち、１つを選んで１
００ｍｌの１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ
培地で培養し、プラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎカラム
（ DIAGEN , GmbH、QIAGEN,Inc社製）で添付のプロトコ
ルに従って精製した。
００ｍｌの１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ
培地で培養し、プラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎカラム
（ DIAGEN , GmbH、QIAGEN,Inc社製）で添付のプロトコ
ルに従って精製した。
【００２８】（１−２）ｐＢａβ−ｃａｔの構築 ネコＩＦＮ−αのシグナルペプチドはバキュロウイルス
で発現したところ、２カ所で切断された。そこで、シグ
ナルペプチドの配列を典型的な配列に変えたところ、分
泌されたネコＩＦＮ−α蛋白質のＮ末瑞がそろい、発現
量も３倍になった（Ueda,Y., Sakurai,T. and Yanai,A.
(1993) J,Vet.Med.Sci.,Vol.55,pp251-258,)。そこで、
以下に示すネコＩＦＮのシグナル配列遺伝子ＤＮＡを４
本に分けて合成した。
で発現したところ、２カ所で切断された。そこで、シグ
ナルペプチドの配列を典型的な配列に変えたところ、分
泌されたネコＩＦＮ−α蛋白質のＮ末瑞がそろい、発現
量も３倍になった（Ueda,Y., Sakurai,T. and Yanai,A.
(1993) J,Vet.Med.Sci.,Vol.55,pp251-258,)。そこで、
以下に示すネコＩＦＮのシグナル配列遺伝子ＤＮＡを４
本に分けて合成した。
【００２９】 Ｃａｔ１ 5’-CATGGCGCTGCCCTCTTCCTTCTTGGTGGCCCTG- 3’ Ｃａｔ２ 5’-GTGGCGCTGGGCTGCAACTCCGTCTGCGTGCTGG- 3’ Ｃａｔ３ 3’-GCGACCCGACGTTGAGGCAGACGCACGACCGTAC- 5’ Ｃａｔ４ 3’-CGCGACGGGAGAAGGAAGAACCACCGGGACCACC- 5’ Ｃａｔ１とＣａｔ２で連続したアミノ酸をコードする側
の鎖を、Ｃａｔ３とＣａｔ４で連続したアミノ酸をコー
ドしない側の鎖を形成し、Ｃａｔ１の下線を引いたコド
ンが翻訳の開始コドンに相当する。Ｃａｔ１の５’末端
から４番目からＣａｔ２の最後までと、Ｃａｔ３の５’
末瑞から４番目からＣａｔ４の最後までが相補的になっ
ており、また、残りの部分は制限酵素ＮｃｏＩと結合す
るよう工夫されている。
の鎖を、Ｃａｔ３とＣａｔ４で連続したアミノ酸をコー
ドしない側の鎖を形成し、Ｃａｔ１の下線を引いたコド
ンが翻訳の開始コドンに相当する。Ｃａｔ１の５’末端
から４番目からＣａｔ２の最後までと、Ｃａｔ３の５’
末瑞から４番目からＣａｔ４の最後までが相補的になっ
ており、また、残りの部分は制限酵素ＮｃｏＩと結合す
るよう工夫されている。
【００３０】これらの４本のＤＮＡの混合物と前記
「（１−１−１）」で調製したベクターＤＮＡを混合
し、前記「（１−１−３）」に示すとおりにトランファ
ーベクターｐＢａβ−Ｃａｔを作製した。バキュロウイ
ルス多核体プロモータに対しての方向はＣａｔ１とＢＲ
３プライマーを用いて決定し、ＤＮＡを調製した。
「（１−１−１）」で調製したベクターＤＮＡを混合
し、前記「（１−１−３）」に示すとおりにトランファ
ーベクターｐＢａβ−Ｃａｔを作製した。バキュロウイ
ルス多核体プロモータに対しての方向はＣａｔ１とＢＲ
３プライマーを用いて決定し、ＤＮＡを調製した。
【００３１】（１−３）ｐＢａβ−ｇｐの構築 バキュロウイルスの主要糖蛋白質であるｇｐ６７の予想
されるシグナル配列部分（Whitford,M.,Stewart,S.,Kuz
io,J. and Faulkner,P.(1989)J.Virol.,Vol.63,pp1393-
1399）をイヌＩＦＮ−βシグナル配列と交換した。以下
に示すｇｐ６７のシグナル配列遺伝子ＤＮＡを合成し
た。
されるシグナル配列部分（Whitford,M.,Stewart,S.,Kuz
io,J. and Faulkner,P.(1989)J.Virol.,Vol.63,pp1393-
1399）をイヌＩＦＮ−βシグナル配列と交換した。以下
に示すｇｐ６７のシグナル配列遺伝子ＤＮＡを合成し
た。
【００３２】 ｇｐ１ 5-CATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGC-3’ ｇｐ２ 3-CATTCGCGATAACAAAATATACACGAAAACCGCCGCCGCCGCGTAAGACGGAAACGCCGGTAC-5’ ｇｐ１はアミノ酸をコードする側の鎖を、ｇｐ２はアミ
ノ酸をコードしない側の鎖を形成し、ｇｐ１の下線を引
いたコドンが翻訳の開始コドンに相当する。ｇｐ１の
５’末瑞から４番目から最後までと、ｇｐ２の５’末端
から４番目からの最後までが相補的になっており、ま
た、残りの部分は制限酵素ＮｃｏＩと結合するよう工夫
されている。
ノ酸をコードしない側の鎖を形成し、ｇｐ１の下線を引
いたコドンが翻訳の開始コドンに相当する。ｇｐ１の
５’末瑞から４番目から最後までと、ｇｐ２の５’末端
から４番目からの最後までが相補的になっており、ま
た、残りの部分は制限酵素ＮｃｏＩと結合するよう工夫
されている。
【００３３】これらの２本のＤＮＡの混合物と前記
「（１−１−１）」で調製したベクターＤＮＡを混合
し、前記「（１−１−３）」に示すとおりにトランスフ
ァーベクターｐＢａβ−ｇｐを作製した。バキュロウイ
ルス多核体プロモータに対しての方向はｇｐ１とＢＲ３
プライマーを用いて決定し、ＤＮＡを調製した。
「（１−１−１）」で調製したベクターＤＮＡを混合
し、前記「（１−１−３）」に示すとおりにトランスフ
ァーベクターｐＢａβ−ｇｐを作製した。バキュロウイ
ルス多核体プロモータに対しての方向はｇｐ１とＢＲ３
プライマーを用いて決定し、ＤＮＡを調製した。
【００３４】（１−４）ｐＢａβ−ＲＶの構築 （１−４−１）狂犬病ウイルスＧ蛋白質シグナル配列遺
伝子の合成 狂犬病ウイルスＧ蛋白質はバキュロウイルス発現システ
ムで多量に発現された。以下に示す狂犬病ウイルスのＧ
蛋白質のシグナル配列（Tuchiya,K., unpablished dat
a,GenBank accession number D14873）遺伝子ＤＮＡを
合成した。
伝子の合成 狂犬病ウイルスＧ蛋白質はバキュロウイルス発現システ
ムで多量に発現された。以下に示す狂犬病ウイルスのＧ
蛋白質のシグナル配列（Tuchiya,K., unpablished dat
a,GenBank accession number D14873）遺伝子ＤＮＡを
合成した。
【００３５】 ＲＶ１ 5’-CATGGTTCCGCAAGCTCTTTTGCTTGTACCCATTCTGGGTTTTTCCTTGTGTTTCGG-3’ ＲＶ２ 3’-CAAGGCGTTCGAGAAAACGAACATGGGTAAGACCCAAAAAGGAACACAAAGCCGTAC-5’ ＲＶ１はアミノ酸をコードする側の鎖を、ＲＶ２はアミ
ノ酸をコードしない側の鎖を形成し、ＲＶ１の下線を引
いたコドンが翻訳の開始コドンに相当する。ＲＶ１の
５’末端から４番目から最後までと、ＲＶ２の５’末瑞
から４番目からの最後までが相補的になっており、ま
た、残りの部分は制限酵素ＮｃｏＩもしくはＢｓｐＨＩ
と結合するよう工夫されている。
ノ酸をコードしない側の鎖を形成し、ＲＶ１の下線を引
いたコドンが翻訳の開始コドンに相当する。ＲＶ１の
５’末端から４番目から最後までと、ＲＶ２の５’末瑞
から４番目からの最後までが相補的になっており、ま
た、残りの部分は制限酵素ＮｃｏＩもしくはＢｓｐＨＩ
と結合するよう工夫されている。
【００３６】（１−４−２）イヌＩＦＮ−β成熟蛋白質
部分の遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製 狂犬病ウイルスＧ蛋白質のシグナルペプチダーゼによる
切断部位は正確に決定されている。そのため、狂犬病ウ
イルスのシグナル配列は正確にイヌＩＦＮ−β遺伝子と
結合する必要がある。
部分の遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製 狂犬病ウイルスＧ蛋白質のシグナルペプチダーゼによる
切断部位は正確に決定されている。そのため、狂犬病ウ
イルスのシグナル配列は正確にイヌＩＦＮ−β遺伝子と
結合する必要がある。
【００３７】シグナル配列が除去された成熟イヌＩＦＮ
−β遺伝子部分はＢＦ−ｃｏｌｉプライマーと先に記載
したＢＲ３プライマーで増幅した。ＢＦ−ｃｏｌｉプラ
イマーの塩基配列を以下に示す。
−β遺伝子部分はＢＦ−ｃｏｌｉプライマーと先に記載
したＢＲ３プライマーで増幅した。ＢＦ−ｃｏｌｉプラ
イマーの塩基配列を以下に示す。
【００３８】 ＢＦ−ｃｏｌｉ ５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＴＴＴＡＡ
ＴＣＡＴＧＡＧＣＡＡＣＧＡＣＴＴＧＣＴＴＣＧ−３’ 配列中、下線を引いた部分は制限酵素ＢｓｐＨＩによる
認識配列であり、この配列中に成熟イヌＩＦＮ−β蛋白
質のＮ末端のメチオニンを指定するコドンＡＴＧが含ま
れる。
ＴＣＡＴＧＡＧＣＡＡＣＧＡＣＴＴＧＣＴＴＣＧ−３’ 配列中、下線を引いた部分は制限酵素ＢｓｐＨＩによる
認識配列であり、この配列中に成熟イヌＩＦＮ−β蛋白
質のＮ末端のメチオニンを指定するコドンＡＴＧが含ま
れる。
【００３９】ｐＢａβプラスミド０．１μｇ／５０μ
ｌ、１μＭの各プライマー、それぞれ２００μＭのデオ
キシヌクレオチド、１０ｍＭの塩化カリウム、１０ｍＭ
のトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、２ｍＭの塩化マグネシ
ウムに、１０ユニットの市販のＶｅｎｔ ポリメラーゼ
（New England Biolab. Inc ）を加えて総量５０μｌと
し、パラフィンオイルを重層し、９４℃で４５秒、５０
℃で６０秒、７２℃で１２０秒を１サイクルとしたＰＣ
Ｒを２０サイクル行った。クロロフォルムを加えてパラ
フィンオイルを除去し、増幅されたＤＮＡ断片をアガロ
ース電気泳動で確認した。
ｌ、１μＭの各プライマー、それぞれ２００μＭのデオ
キシヌクレオチド、１０ｍＭの塩化カリウム、１０ｍＭ
のトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、２ｍＭの塩化マグネシ
ウムに、１０ユニットの市販のＶｅｎｔ ポリメラーゼ
（New England Biolab. Inc ）を加えて総量５０μｌと
し、パラフィンオイルを重層し、９４℃で４５秒、５０
℃で６０秒、７２℃で１２０秒を１サイクルとしたＰＣ
Ｒを２０サイクル行った。クロロフォルムを加えてパラ
フィンオイルを除去し、増幅されたＤＮＡ断片をアガロ
ース電気泳動で確認した。
【００４０】反応後、エタノール沈殿によりＰＣＲ産物
を精製し、制限酵素ＢｓｐＨＩとＥｃｏＲＩで切断し
た。１％アガロースゲル電気泳動を行い、目的とする約
０．６ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガロースブロックを切
り出した。ＤＮＡ断片はジーンクリーンキットII（Bio
101, Inc社製）を用いて、添付のプロトコルに従い精製
した。
を精製し、制限酵素ＢｓｐＨＩとＥｃｏＲＩで切断し
た。１％アガロースゲル電気泳動を行い、目的とする約
０．６ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガロースブロックを切
り出した。ＤＮＡ断片はジーンクリーンキットII（Bio
101, Inc社製）を用いて、添付のプロトコルに従い精製
した。
【００４１】（１−４−３）トランスファーベクターｐ
Ｂａβ−ＲＶの調製 前記「（１−４−１）」で合成したＤＮＡと、前記
「（１−４−２）」で調製したＰＣＲ産物および前記
「（１−１−１）」で調製したベクターＤＮＡを混合
し、前記「（１−１−３）」に示すとおりにＢａβ−Ｒ
Ｖシリーズを作製した。バキュロウイルス多核体プロモ
ータに対しての方向はＲＶ１とＢＲ３プライマーを用い
て決定し、ＤＮＡを調製した。
Ｂａβ−ＲＶの調製 前記「（１−４−１）」で合成したＤＮＡと、前記
「（１−４−２）」で調製したＰＣＲ産物および前記
「（１−１−１）」で調製したベクターＤＮＡを混合
し、前記「（１−１−３）」に示すとおりにＢａβ−Ｒ
Ｖシリーズを作製した。バキュロウイルス多核体プロモ
ータに対しての方向はＲＶ１とＢＲ３プライマーを用い
て決定し、ＤＮＡを調製した。
【００４２】（１−５）ｐＢａβ−Ｈｕの構築 ヒトＩＦＮ−βはバキユロウイルス発現システムで多量
に発現された。以下に示すヒトＩＦＮ−βのシグナル配
列（Taniguchi,T.,Ohno,S.,Fujii-kuriyama,Yand Muram
atu,M.(1980). Gene Vol.10,pp11-15.,Smith,G.E.,Summ
ers,M.D. andFraser,M.J.(1983). Mol.Cellul.Biol.,Vo
l.3,pp2156-2165 ）遺伝子ＤＮＡを合成した。
に発現された。以下に示すヒトＩＦＮ−βのシグナル配
列（Taniguchi,T.,Ohno,S.,Fujii-kuriyama,Yand Muram
atu,M.(1980). Gene Vol.10,pp11-15.,Smith,G.E.,Summ
ers,M.D. andFraser,M.J.(1983). Mol.Cellul.Biol.,Vo
l.3,pp2156-2165 ）遺伝子ＤＮＡを合成した。
【００４３】 Ｈｕ１ 5'-CATGACCAACAAGTGTCTCCTCCAAATTGCTCTCCTGTTGTGCTTCTCCACTACAGCTCTTTC-3' Ｈｕ２ 3'-TGGTTGTTCACAGAGGAGGTTTAACGAGAGGACAACACGAAGAGGTGATGTCGAGAAAGGTAC-5' Ｈｕ１はアミノ酸をコードする側の鎖を、Ｈｕ２はアミ
ノ酸をコードしない側の鎖を形成し、Ｈｕ１の下線を引
いたコドンが翻訳の開始コドンに相当する。Ｈｕ１の
５’末端から４番目から量後までと、Ｈｕ２の５’末端
から４番目からの最後までが相補的になっており、ま
た、残りの部分は制限酵素ＮｃｏＩもしくはＢｓｐＨＩ
と結合するよう工夫されている。
ノ酸をコードしない側の鎖を形成し、Ｈｕ１の下線を引
いたコドンが翻訳の開始コドンに相当する。Ｈｕ１の
５’末端から４番目から量後までと、Ｈｕ２の５’末端
から４番目からの最後までが相補的になっており、ま
た、残りの部分は制限酵素ＮｃｏＩもしくはＢｓｐＨＩ
と結合するよう工夫されている。
【００４４】これらの２本のＤＮＡの混合物と、前記
「（１−４−２）」で調製したＰＣＲ産物および前記
「（１−１−１）」で調製したベクターＤＮＡを混合
し、前記「（１−１−３）」に示すとおりにＢａβ−Ｈ
ｕシリーズを作製した。バキュロウイルス多核体プロモ
ータに対しての方向はＨｕ１とＢＲ３プライマーを用い
て決定し、ＤＮＡを調製した。
「（１−４−２）」で調製したＰＣＲ産物および前記
「（１−１−１）」で調製したベクターＤＮＡを混合
し、前記「（１−１−３）」に示すとおりにＢａβ−Ｈ
ｕシリーズを作製した。バキュロウイルス多核体プロモ
ータに対しての方向はＨｕ１とＢＲ３プライマーを用い
て決定し、ＤＮＡを調製した。
【００４５】（２）組換えバキュロウイルスの作製 前記（１）のように調製したそれぞれのトランスファー
ベクターＤＮＡと制限酵素Ｂｓｕ３６１で切断したウイ
ルスＤＮＡをリポフェクチンに吸着させ、Ｓｆ２１ＡＥ
細胞に加えると、ＤＮＡ−リポフェクチン複合体はＳｆ
２１ＡＥ細胞に取り込まれ、低頻度ではあるが、両ＤＮ
Ａ間で相同組換えが生じ、トランスファーベクター中の
組換え遺伝子がバキュロウイルスＤＮＡに挿入され、同
時にウイルスＤＮＡの制限酵素Ｂｓｕ３６１による切断
点が除去される。相同組換えを起こさなかった切断され
たウイルスＤＮＡは、切断点を修復することができず、
増殖することはごく稀である。
ベクターＤＮＡと制限酵素Ｂｓｕ３６１で切断したウイ
ルスＤＮＡをリポフェクチンに吸着させ、Ｓｆ２１ＡＥ
細胞に加えると、ＤＮＡ−リポフェクチン複合体はＳｆ
２１ＡＥ細胞に取り込まれ、低頻度ではあるが、両ＤＮ
Ａ間で相同組換えが生じ、トランスファーベクター中の
組換え遺伝子がバキュロウイルスＤＮＡに挿入され、同
時にウイルスＤＮＡの制限酵素Ｂｓｕ３６１による切断
点が除去される。相同組換えを起こさなかった切断され
たウイルスＤＮＡは、切断点を修復することができず、
増殖することはごく稀である。
【００４６】したがって、組換えウイルスＤＮＡのみが
複製・増殖し、ウイルス粒子を形成し、細胞シート上に
明瞭なプラークを生じるため、そのプラークを指標に組
換えウイルスを単離することができる。この方法は一般
的に広く用いられている。
複製・増殖し、ウイルス粒子を形成し、細胞シート上に
明瞭なプラークを生じるため、そのプラークを指標に組
換えウイルスを単離することができる。この方法は一般
的に広く用いられている。
【００４７】以下に具体的な方法を示す。
【００４８】Ｓｆ２１ＡＥ細胞を１０％非動化牛胎児血
清（ＦＢＳ）と０．２６％のバクトトリプトースブロス
（ＢＴＢ）を含むグレース培地（ギブコ社製）で培養
し、１×１０6／穴の数を６穴プレートに分注し、室温
で１時間以上培養し、細胞をプレート穴底面に接着させ
た。
清（ＦＢＳ）と０．２６％のバクトトリプトースブロス
（ＢＴＢ）を含むグレース培地（ギブコ社製）で培養
し、１×１０6／穴の数を６穴プレートに分注し、室温
で１時間以上培養し、細胞をプレート穴底面に接着させ
た。
【００４９】一方、トランスファーベクターＤＮＡ１μ
ｇと制限酵素Ｂｓｕ３６１で切断したＢａｃＰＡＫ６ウ
イルスＤＮＡ（ＣＬＯＮＯＴＥＣＨ Laboratories,Inc
社製）２０ｎｇを混合し、全量を８μｌとした。リポフ
ェクチン（ＢＲＬ社製）を８μｌ加え、混合した後、約
１５分問室温で静置し、ＤＮＡ−リポフェクチン複合体
を形成させた。
ｇと制限酵素Ｂｓｕ３６１で切断したＢａｃＰＡＫ６ウ
イルスＤＮＡ（ＣＬＯＮＯＴＥＣＨ Laboratories,Inc
社製）２０ｎｇを混合し、全量を８μｌとした。リポフ
ェクチン（ＢＲＬ社製）を８μｌ加え、混合した後、約
１５分問室温で静置し、ＤＮＡ−リポフェクチン複合体
を形成させた。
【００５０】上記のように準備したＳｆ２１ＡＥ細胞を
血清を含まないグレース培地で洗浄し、１ｍｌグレース
培地を加えた。そこに１６μｌのＤＮＡ−リポフェクチ
ン複合体を加え、２７℃で５時間培養した。１ｍｌの１
０％ＦＢＳと０．２６％ＢＴＢを含むグレース培地を加
え、２７℃でさらに３日間培養し、プラークが形成され
るのを確認した。培養上清を無菌的にとり、一部でＩＦ
Ｎ活性を測定し、残りをプラーククローニングに用い
た。
血清を含まないグレース培地で洗浄し、１ｍｌグレース
培地を加えた。そこに１６μｌのＤＮＡ−リポフェクチ
ン複合体を加え、２７℃で５時間培養した。１ｍｌの１
０％ＦＢＳと０．２６％ＢＴＢを含むグレース培地を加
え、２７℃でさらに３日間培養し、プラークが形成され
るのを確認した。培養上清を無菌的にとり、一部でＩＦ
Ｎ活性を測定し、残りをプラーククローニングに用い
た。
【００５１】プラーククローニングは以下のように行っ
た。
た。
【００５２】培養上清を１０倍段階希釈し、６穴プレー
トに接着させたＳｆ２１ＡＥ細胞に希釈した培養上清を
２００μｌ加え、１時間静置し、ウイルスを細胞に吸着
させた。１％アガロースを含むグレース培地を２ｍｌ／
穴で重層し、さらに１ｍｌの１０％ＦＢＳと０．２６％
ＢＴＢを含むグレース培地を重層し、２７℃で３日間培
養した。出現したプラークを肉眼で容易に観察するため
に、０．０１％中性赤を含むＰＢＳ（−）を１ｍｌ重層
し、一晩静置した。多核体を生産していない明瞭なプラ
ークを選び、アガロース中に分泌されているウイルス粒
子をアガロースごと切り出し、０．５ｍｌの１０％ＦＢ
Ｓと０．２６％ＢＴＢを含むグレース培地にいれ、超音
波により分散させた。３０００ｒｐｍ×５分間遠心し、
その上清を組換えバキュロウイルスサンプルとして４℃
で保存し、含まれているウイルス量を形成されるプラー
ク数として測定した。
トに接着させたＳｆ２１ＡＥ細胞に希釈した培養上清を
２００μｌ加え、１時間静置し、ウイルスを細胞に吸着
させた。１％アガロースを含むグレース培地を２ｍｌ／
穴で重層し、さらに１ｍｌの１０％ＦＢＳと０．２６％
ＢＴＢを含むグレース培地を重層し、２７℃で３日間培
養した。出現したプラークを肉眼で容易に観察するため
に、０．０１％中性赤を含むＰＢＳ（−）を１ｍｌ重層
し、一晩静置した。多核体を生産していない明瞭なプラ
ークを選び、アガロース中に分泌されているウイルス粒
子をアガロースごと切り出し、０．５ｍｌの１０％ＦＢ
Ｓと０．２６％ＢＴＢを含むグレース培地にいれ、超音
波により分散させた。３０００ｒｐｍ×５分間遠心し、
その上清を組換えバキュロウイルスサンプルとして４℃
で保存し、含まれているウイルス量を形成されるプラー
ク数として測定した。
【００５３】得られた組み換えバキュロウイルスはそれ
ぞれ、Ｂａβ−ＢＳ、Ｂａβ−ｃａｔ、Ｂａβ−ｇｐ、
Ｂａβ−ＲＶ、Ｂａβ−Ｈｕと命名した。
ぞれ、Ｂａβ−ＢＳ、Ｂａβ−ｃａｔ、Ｂａβ−ｇｐ、
Ｂａβ−ＲＶ、Ｂａβ−Ｈｕと命名した。
【００５４】（３）組換えバキュロウイルスのイヌＩＦ
Ｎ−β産生 Ｂａβ−ＢＳ、Ｂａβ−Ｃａｔ、Ｂａβ−ｇｐ、Ｂａβ
−ＲＶ、Ｂａβ−Ｈｕのそれぞれ２クローンをｍｏｉ＝
４でＳｆ２ＡＥ１細胞に感染させ、ｐＨ６．４に調製し
たＨａｎｋｓ塩類溶液で３回洗浄し、血清を含まないグ
レース培地を加え、７２時間後に培養上清をサンプリン
グし、ＩＦＮ活性の生産を調ベた。
Ｎ−β産生 Ｂａβ−ＢＳ、Ｂａβ−Ｃａｔ、Ｂａβ−ｇｐ、Ｂａβ
−ＲＶ、Ｂａβ−Ｈｕのそれぞれ２クローンをｍｏｉ＝
４でＳｆ２ＡＥ１細胞に感染させ、ｐＨ６．４に調製し
たＨａｎｋｓ塩類溶液で３回洗浄し、血清を含まないグ
レース培地を加え、７２時間後に培養上清をサンプリン
グし、ＩＦＮ活性の生産を調ベた。
【００５５】ＩＦＮ活性は以下のように測定した。
【００５６】イヌ由来の培養細胞、Ａ７２（大日本製薬
（株）社より購入）を３×１０5 個／ｍｌになるように
２０％ＦＢＳを含むＬ−１５（大日本製薬（株）社製）
に浮遊させ、０．１ｍｌずつを９６穴マルチウェルプレ
ートに分注した。約１日培養した後、培養液を捨て、５
％ＦＢＳを含むＬ−１５で希釈した検体を加え、１日間
検体をＡ７２細胞に作用させた。培養液及び検体を捨
て、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）と５％ＦＢＳ
を含むＬ−１５存在下でVesicular stomatitisvirus
（ＶＳＶ）を感染させ、２４時間後にＶＳＶ感染増殖に
よって生じる細胞変性を観察し、Ａ７２細胞のシート全
体の損傷の程度を数値化し、グラフ化した。グラフより
５０％の細胞変性を示すと予想される検体の希釈率の逆
数をインターフェロン活性として示した。
（株）社より購入）を３×１０5 個／ｍｌになるように
２０％ＦＢＳを含むＬ−１５（大日本製薬（株）社製）
に浮遊させ、０．１ｍｌずつを９６穴マルチウェルプレ
ートに分注した。約１日培養した後、培養液を捨て、５
％ＦＢＳを含むＬ−１５で希釈した検体を加え、１日間
検体をＡ７２細胞に作用させた。培養液及び検体を捨
て、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）と５％ＦＢＳ
を含むＬ−１５存在下でVesicular stomatitisvirus
（ＶＳＶ）を感染させ、２４時間後にＶＳＶ感染増殖に
よって生じる細胞変性を観察し、Ａ７２細胞のシート全
体の損傷の程度を数値化し、グラフ化した。グラフより
５０％の細胞変性を示すと予想される検体の希釈率の逆
数をインターフェロン活性として示した。
【００５７】それぞれの組換えバキュロウイルス感染細
胞の培養液中に見いだされたＩＦＮ活性を下記表１に示
した。
胞の培養液中に見いだされたＩＦＮ活性を下記表１に示
した。
【００５８】
【表１】
【００５９】バキュロウイルス発現システムで、−２１
のメチオニンから始まるシグナル配列に変換した場合
（Ｂａβ−ＢＳ）、およびＡｃＮＰＶｇｐ６７のシグナ
ル配列に変換した場合（Ｂａβ−ＢＳ）は、およそ２倍
の活性が得られた。また、狂犬病ウイルスＧ蛋白質のシ
グナル配列に変換した場合（Ｂａβ−ＲＶ）、ヒトＩＦ
Ｎ−βのシグナル配列に変換した場合（Ｂａβ−Ｈｕ）
は、およそ５倍の活性が得られた。しかし、猫ＩＦＮ−
βのシグナル配列に変換した場合（Ｂａβ−Ｈｕ）は生
産量は変化しなかった。
のメチオニンから始まるシグナル配列に変換した場合
（Ｂａβ−ＢＳ）、およびＡｃＮＰＶｇｐ６７のシグナ
ル配列に変換した場合（Ｂａβ−ＢＳ）は、およそ２倍
の活性が得られた。また、狂犬病ウイルスＧ蛋白質のシ
グナル配列に変換した場合（Ｂａβ−ＲＶ）、ヒトＩＦ
Ｎ−βのシグナル配列に変換した場合（Ｂａβ−Ｈｕ）
は、およそ５倍の活性が得られた。しかし、猫ＩＦＮ−
βのシグナル配列に変換した場合（Ｂａβ−Ｈｕ）は生
産量は変化しなかった。
【００６０】以上のことから、イヌＩＦＮ−βを発現す
る組換え多核体病ウイルスをＳｆ細胞等の培養細胞に接
種してイヌＩＦＮ−βを製造する際に、シグナル配列を
ウイルス由来のシグナル配列もしくは同種の有用蛋白質
ですでに本系の方法で生産量が多いことが分かっている
蛋白質のシグナル配列に置換することにより、イヌＩＦ
Ｎ−βを大量に生産できることが確認された。
る組換え多核体病ウイルスをＳｆ細胞等の培養細胞に接
種してイヌＩＦＮ−βを製造する際に、シグナル配列を
ウイルス由来のシグナル配列もしくは同種の有用蛋白質
ですでに本系の方法で生産量が多いことが分かっている
蛋白質のシグナル配列に置換することにより、イヌＩＦ
Ｎ−βを大量に生産できることが確認された。
【００６１】
【発明の効果】本発明によれば、有用蛋白質をコードす
る遺伝子によってこの有用蛋白質を産生するように遺伝
子が組換えられた組換え多核体病ウイルスを、Ｓｆ細胞
等の培養細胞又はカイコ等の昆虫に接種して当該有用蛋
白質を生産する方法において、組換えられた遺伝子の前
記有用蛋白質のシグナル配列を、ウイルス由来のシグナ
ル配列に置換するか、又は前記方法による蛋白質生産量
の多い同種の蛋白質のシグナル配列に置換した遺伝子を
用いることにより、従来のシグナル配列を置換しない場
合に比べて、２〜５倍の濃度で有用蛋白質を生産できる
という効果が奏される。
る遺伝子によってこの有用蛋白質を産生するように遺伝
子が組換えられた組換え多核体病ウイルスを、Ｓｆ細胞
等の培養細胞又はカイコ等の昆虫に接種して当該有用蛋
白質を生産する方法において、組換えられた遺伝子の前
記有用蛋白質のシグナル配列を、ウイルス由来のシグナ
ル配列に置換するか、又は前記方法による蛋白質生産量
の多い同種の蛋白質のシグナル配列に置換した遺伝子を
用いることにより、従来のシグナル配列を置換しない場
合に比べて、２〜５倍の濃度で有用蛋白質を生産できる
という効果が奏される。
【００６２】
【配列番号１】 Ｂａβ−ＢＳのシグナルペプチドの配
列 n-MTSRCILQTTLLLYFST-c
列 n-MTSRCILQTTLLLYFST-c
【００６３】
【配列番号２】 Ｂａβ−ｇｐのシグナルペプチドの配
列 n-MVSAIVLYVLLAAAAHSAFAA-c
列 n-MVSAIVLYVLLAAAAHSAFAA-c
【００６４】
【配列番号３】 Ｂａβ−ＲＶのシグナルペプチドの配
列 n-MVPQALLLVPILGFSLCFG-c
列 n-MVPQALLLVPILGFSLCFG-c
【００６５】
【配列番号４】 Ｂａβ−Ｈｕのシグナルペプチドの配
列 n-MTNKCLLQIALLLCFSTTALS-c
列 n-MTNKCLLQIALLLCFSTTALS-c
【図１】トランスファーベクターｐＢａβの構造を示し
た図。
た図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92）
Claims (7)
- 【請求項１】 有用蛋白質をコードする遺伝子によって
この有用蛋白質を産生するように遺伝子が組換えられた
組換え多核体病ウイルスを、Ｓｆ細胞等の培養細胞又は
カイコ等の昆虫に接種して当該有用蛋白質を生産する方
法において、組換えられた遺伝子の前記有用蛋白質のシ
グナル配列を、ウイルス由来のシグナル配列に置換する
か、又は前記方法による蛋白質生産量の多い同種の蛋白
質のシグナル配列に置換して、有用蛋白質を産生させる
ことを特徴とする有用蛋白質の生産方法。 - 【請求項２】 請求項１において、有用蛋白質がイヌイ
ンターフェロン−βであることを特徴とする有用蛋白質
の生産方法。 - 【請求項３】 請求項２において、置換するシグナル配
列が、イヌインターフェロン−β遺伝子の−２１のメチ
オニンからの配列番号１のシグナル配列であることを特
徴とする有用蛋白質の生産方法。 - 【請求項４】 請求項２において、置換するシグナル配
列が、ヨトウガ多核体ウイルスｇｐ６７の配列番号２の
シグナル配列であることを特徴とする有用蛋白質の生産
方法。 - 【請求項５】 請求項２において、置換するシグナル配
列が、狂犬病ウイルスのＧ蛋白質の配列番号３のシグナ
ル配列であることを特徴とする有用蛋白質の生産方法。 - 【請求項６】 請求項２において、置換するシグナル配
列が、ヒトインターフェロン−βの配列番号４のシグナ
ル配列であることを特徴とする有用蛋白質の生産方法。 - 【請求項７】 請求項２において、置換するシグナル配
列が、請求項３ないし６のいずれか一項のシグナル配列
の一部が欠失もしくは置換、あるいは１〜複数個のアミ
ノ酸が付加されたアミノ酸配列であることを特徴とする
シグナル配列。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8180594A JPH1023899A (ja) | 1996-07-10 | 1996-07-10 | 有用蛋白質の生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8180594A JPH1023899A (ja) | 1996-07-10 | 1996-07-10 | 有用蛋白質の生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1023899A true JPH1023899A (ja) | 1998-01-27 |
Family
ID=16086001
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8180594A Pending JPH1023899A (ja) | 1996-07-10 | 1996-07-10 | 有用蛋白質の生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1023899A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008138649A3 (en) * | 2007-05-15 | 2009-01-08 | Transgene Sa | Signaling peptides |
-
1996
- 1996-07-10 JP JP8180594A patent/JPH1023899A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008138649A3 (en) * | 2007-05-15 | 2009-01-08 | Transgene Sa | Signaling peptides |
| JP2010526548A (ja) * | 2007-05-15 | 2010-08-05 | トランジェーヌ、ソシエテ、アノニム | シグナル伝達ペプチド |
| US8415462B2 (en) | 2007-05-15 | 2013-04-09 | Transgene S.A. | Signaling peptides |
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