JPH10273496A

JPH10273496A - リポタイコ酸

Info

Publication number: JPH10273496A
Application number: JP8033797A
Authority: JP
Inventors: Shoichi Kusumoto; 正一楠本; Yasuo Sumida; 泰生隅田; Haruhiko Takada; 春比古高田; Rieko Aragaki; 理恵子新垣; Shozo Kotani; 尚三小谷
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1997-03-31
Filing date: 1997-03-31
Publication date: 1998-10-13

Abstract

(57)【要約】【課題】ＬＴＡの化学構造を解明することにより、Ｌ
ＴＡの物性、特には生物活性、さらに詳細にはサイトカ
イン誘導活性とＬＴＡの化学構造との関係を解明するこ
と。【解決手段】下記構造式（１）：【化１】（式中、Ｘは各々独立に、Ｈ、Ａｌａ（Ｇｌｃ）_mまた
は（Ｇｌｃ）_mを示し、ここでｍは１〜５の自然数を示
し；ｎは５〜４２の自然数を示し；そして、ＣＯＲは、
脂肪酸残基を示す）を有することを特徴とするリポタイ
コ酸。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、リポタイコ酸（本
明細書中以下、ＬＴＡとも略記される）に関し、さらに
詳細には、グリセロホスフェート部分のグリセロール部
分の２位が、アラニンで一部エステル化されたグルコー
スまたはオリゴグルコースによって置換されていること
を特徴とするリポタイコ酸に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＬＴＡは、Streptococcus、Enterococcu
s、Staphylococcus、Lactobacillus、Bacillus、Lister
ia、Leuconostoc（一部の例外を除く）などのグラム陽
性球菌・桿菌に広く分布する両親媒性の細菌細胞表層成
分である。ＬＴＡは、細胞質膜成分の一部である糖脂質
の非還元末端ヘキソースの６位水酸基にｓｎ−グリセロ
−１−リン酸のポリマーが結合し、細胞壁ペプチドグリ
カン部に突き出した構造を有している。ＬＴＡ中のグリ
セロール部分の２位水酸基には、グリコシル基、Ｄ−ア
ラニンなどが結合していることが多いことが知られてい
るが、ＬＴＡを産生する菌種が異なれば、糖脂質部およ
びポリ（グリセロリン酸）部の構造または置換基も一般
的に異なることが知られており、かかる相違によってＬ
ＴＡの化学構造および物理化学的性状は多岐に渡ってい
る。

【０００３】例えば、抗原性に関しては、ポリ（グリセ
ロリン酸）部自体、およびそのグリコシル置換基やＤ−
アラニンエステルが、主として抗原決定基として働く。
一部のグラム陽性菌ではリポタイコ酸のグリコシル置換
基が群特異抗原として認識されるが、そのような例とし
ては、Lactobacillus helveticusの群特異Ａ抗原、L.fe
rmentiの同Ｆ抗原、Enterococcus faecalis の同Ｄ抗
原、Lactococcus lactis の同Ｎ抗原、Streptococcus m
utans の血清型別抗原ａなどが挙げられる。

【０００４】また、ヒト、特に１０歳台後半以降の血清
には、受身赤血球凝集反応により、ＬＴＡと反応する抗
体がしばしば検出される。レンサ球菌、ブドウ球菌由来
の標品を中心とした研究によって、ＬＴＡがＬＰＳ（グ
ラム陰性菌の外膜を構成する両親媒性の内毒素性リポ多
糖）に類似する幅広い免疫生物学的活性を示すことが明
らかにされている。すなわち、ＬＴＡはマウスの腹腔刺
激マクロファージを刺激し、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、Ｉ
ＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＣＳＦなどのサイトカインの生
成、放出を誘導し、食作用、活性酸素生成、細胞内寄生
菌に対する殺菌作用を高めることが知られている。

【０００５】さらに、ＬＴＡは、マウス等への投与によ
り網内系を賦活し、非特異抵抗力を増強する。またこれ
に関連して、マウスの実験腫瘍系において、ＬＴＡはＭ
ｅｔｈＡファイブロサルコーマに対する増殖抑制、腫瘍
退縮・治癒効果、Ｌ−１サルコーマの肺転移抑制効果を
示す。ＬＴＡのリンパ球に対する刺激作用（マイトジェ
ン作用など）については、議論が別れている。

【０００６】ＬＴＡのその他の作用については、血管平
滑筋細胞からの一酸化窒素（ＮＯ）生成誘導作用、補体
成分（Ｃ１ｑ）と直接反応して古典経路を介して補体を
活性化する作用などが記載されている。ＬＴＡの上記作
用はＬＰＳに比べると弱いが、致死毒性や発熱原性につ
いての両者の差は大きい。なお、ＬＴＡはヒトや動物の
頬・鼻粘膜上皮細胞、赤血球、血小板、多形核白血球、
脾細胞に結合するが、この作用は、Streptococcus pyog
enesやStaphylococcus aureus が、咽頭や鼻粘膜の付着
する性質の一端を担い、病原性発現に寄与する可能性が
ある。他方、ＬＴＡを表面に結合した宿主細胞は抗ＬＴ
Ａ抗体と補体との作用によって破壊され、また抗体依存
・細胞媒介細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を被る。なお、赤
血球表面に吸着した状態のＬＴＡは補体を別経路を介し
て活性化する。

【０００７】上記のように、ＬＴＡの化学構造、従って
「物性」は多岐にわたり、免疫生物学的活性も菌種、菌
株、菌の培養条件の差によって変化し、また十分に均質
な純化標品の単離が容易ではないことなどを理由とし
て、前記の免疫生物学的活性を担う化学構造は未だ明ら
かではない。

【０００８】EnterococcusおよびStreptococcusに属す
る菌種由来のＬＴＡの化学構造については、これまでに
W. Fischer により報告されている（明細書末尾記載の
引用文献リスト中の文献１を参照）。W. Fischerは、Ｌ
ＴＡは一般的には、糖脂質アンカー並びに、グリセロー
ルの２位がオリゴグルコースまたはＤ−アラニンで置換
されている１，３−結合ポリ（グリセロホスフェート）
から構成されていると報告している。また、サイトカイ
ン（ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦ−α）誘導活性お
よび抗腫瘍活性などのようなＬＴＡの生物学的活性も報
告されている（文献２〜８を参照）。

【０００９】またさらに最近になって、マクロファージ
捕捉受容体による認識に対してＬＴＡの構造が及ぼす影
響について報告されている（J.W.Greenberg 他 Infecti
on and Immunity, Vol.64, No.8, p.3318-3325 (199
6)）。しかしながら、この文献中には、ＬＴＡのグリセ
ロホスフェート部分のグリセロールの２位に、アラニン
で一部エステル化されたグルコースまたはオリゴグルコ
ースを有するＬＴＡは記載されていない。

【００１０】以上のようなＬＴＡのサイトカイン誘導活
性の発現に必須のＬＴＡ中の化学構造を解明することを
目的として、ＬＴＡ類に関して提唱されている基本構造
を有する化合物が合成された（文献９および１０を参
照）。しかし、意外なことに、これらの合成化合物は、
サイトカイン誘導活性も抗腫瘍活性も示さなかった（文
献１１を参照）。この合成アナログの構造は、天然ＬＴ
Ａについて提唱されている構造と以下の点について相違
していた：（Ｉ）天然ＬＴＡの糖脂質アンカーは不飽和
脂肪酸を含む一方、合成ＬＴＡは飽和酸のみを含む；
（ＩＩ）天然ＬＴＡのポリ（グリセロホスフェート）
は、９から４０個の繰り返し単位を有していると考えら
れる一方（文献１２を参照）、合成ＬＴＡの場合は４個
のみの繰り返し単位を含む；（ＩＩＩ）天然ＬＴＡは高
度のグリコシル置換およびアラニル置換を有している一
方、合成ポリ（グリセロホスフェート）部分は置換基を
有していない。

【００１１】即ち、合成化合物がサイトカイン誘導活性
を有していないことは、以下の２つの可能性の何れかに
よるものと考えられる：（１）上記の構造的特徴の幾つ
かまたは全てがＬＴＡの生物学的活性に不可欠である；
（２）ＬＴＡ中に存在する未知の構成成分が該活性に関
与する。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは最近、En
terococcus hirae ＡＴＣＣ９７９０由来のＬＴＡを、
ヒト全血細胞に対するＩＬ−６誘導活性を有する量的に
少ない成分と、同細胞に対してＩＬ−６誘導活性を有さ
ない量的に多い成分（９０％以上を占める）とに分離す
ることに成功した（文献１３を参照）。そこで、本発明
者らは本研究において、この分離されたＩＬ−６誘導活
性を有さない量的に多い成分の化学構造を分析した。即
ち、本発明の目的の一つは、ＬＴＡの化学構造を解明す
ることにより、ＬＴＡの物性、特には生物活性、さらに
詳細にはサイトカイン誘導活性とＬＴＡの化学構造との
関係を解明することである。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、微生物En
terococcus hirae から分画法によりＬＴＡを含む画分
を得、これをもとに、ＬＴＡの構造を解析した結果、グ
リセロホスフェート部分のグリセロール部分の２位が、
アラニンで一部エステル化されたグルコースまたはオリ
ゴグルコースによって置換されていることを見い出し、
本発明を完成するに至った。グリセロホスフェート部分
のグリセロール部分の２位が、アラニンで一部エステル
化されたグルコースまたはオリゴグルコースによって置
換されているＬＴＡは、従来報告されていない新規なＬ
ＴＡである。

【００１４】即ち、本発明によれば、下記構造式
（１）：

【化２】（式中、Ｘは各々独立に、Ｈ、Ａｌａ（Ｇｌｃ）_mまた
は（Ｇｌｃ）_mを示し、ここでｍは１〜５の自然数を示
し；ｎは５〜４２の自然数を示し；そして、ＣＯＲは、
脂肪酸残基を示す）を有することを特徴とするリポタイ
コ酸が提供される。

【００１５】本発明の一つの態様においては、上記の構
造式（１）のＸの定義中の少なくとも１個のＸは、Ａｌ
ａ（Ｇｌｃ）_mである。なお、ｎは５〜４２の自然数を
示すが、ｎの平均値としては約１１である。

【００１６】本発明のリポタイコ酸は、好ましくは、En
terococcus 属由来、さらに好ましくは、Enterococcus
hirae 由来、特に好ましくは、Enterococcus hirae Ａ
ＴＣＣ９７９０由来であることを特徴とする。

【００１７】本発明のリポタイコ酸は、例えば、リポタ
イコ酸産生菌を培養し、該菌を回収した後、疎水性相互
作用を利用した分離法に付し、次いで、陽イオン交換作
用を利用した分離法に付することにより得ることができ
る。本発明のリポタイコ酸を得るために行われる陽イオ
ン交換作用を利用した分離法においては、塩を含有する
緩衝液を溶出液として使用することができる。

【００１８】本明細書中において、Ａｌａとはアラニン
を示し、Ｄ体でもＬ体でもよいが、好ましくは、Ｄ−ア
ラニンを示す。なお、Ａｌａ（Ｇｌｃ）_mで示される式
中において、Ａｌａは任意のグルコシル基中の任意の水
酸基とエステル結合により結合しており、グルコシル基
またはオリゴグルコシル基に対するアラニンの結合位置
は特には限定されない。但し、オリゴグルコシル基の場
合には、グリセロール成分から一番離れた末端のグルコ
シル基にアラニンが結合していることが好ましい。ま
た、アラニンは、グルコシル基中の水酸基の中でも、６
位の水酸基と結合していることが好ましい。

【００１９】本明細書中において、Ｇｌｃとは、グルコ
シル基を示す。本明細書中において、ＣＯＲは脂肪酸残
基を示すが、ここでＲは飽和または不飽和の炭化水素基
を示す。炭化水素基の炭素数は特に限定されるものでは
なく、短鎖脂肪酸（炭素数２〜４）、中鎖脂肪酸（炭素
数５〜１０）および長鎖脂肪酸（炭素数１１以上）の何
れの脂肪酸残基でもよい。好ましくは脂肪酸残基は長鎖
脂肪酸残基であり、この場合炭素数は一般的には１１以
上であり、例えば炭素数１６および１８の脂肪酸残基が
挙げられる。より具体的には、炭素数１６の飽和脂肪酸
残基、炭素数１６で不飽和結合（２重結合など）を１個
有する脂肪酸残基、炭素数１８の飽和脂肪酸残基、ある
いは炭素数１８で不飽和結合（２重結合など）を１個有
する脂肪酸残基などが脂肪酸残基の例として挙げられ
る。

【００２０】

【発明の実施の形態】本明細書上述した通り、リポタイ
コ酸は、Streptococcus、Enterococcus、Staphylococcu
s、Lactobacillus、Bacillus、Listeria、Leuconostoc
（一部の例外を除く）などのグラム陽性球菌・桿菌に広
く見いだされる。従って、本発明による上記構造式
（１）を有するリポタイコ酸も上記菌の何れかによって
産生されていることが予測される。即ち、本発明のリポ
タイコ酸の入手源は特定の微生物に限定されるものでは
なく、構造式（１）を有するリポタイコ酸を産生する任
意の微生物から入手することができる。また、微生物な
どにより産生される天然のＬＴＡのみならず、化学合成
により構造式（１）を有するリポタイコ酸を得ることが
できる場合もあり、このような化学合成されたリポタイ
コ酸も本発明の範囲内のものである。本発明のリポタイ
コ酸は、好ましくは、Enterococcus属の微生物から入手
することができ、さらに好ましくEnterococcus hirae
から入手することができ、特に好ましくは、Enterococc
us hirae ＡＴＣＣ９７９０から入手することができ
る。

【００２１】本発明のリポタイコ酸を産生する微生物か
ら当該リポタイコ酸を調製するための方法は、特に限定
されるものではなく、当業者に知られる単離・精製方法
を適宜組み合わせることによって実施することができ
る。

【００２２】例えば、リポタイコ酸産生微生物を適当な
培地（一般的には、炭素源、窒素源、金属塩、無機塩な
どを含む）中で培養した後、菌を回収する。なお、培養
培地、培養条件（温度、時間など）は、所望のリポタイ
コ酸が産生されるように適宜調節することができる。次
いで、菌の遊離脂質を除去し、フェノール／水で抽出
し、抽出物をＤＮａｓｅ−ＲＮａｓｅ処理し、透析、濃
縮、凍結乾燥すると粗ＬＴＡ画分が得られる。

【００２３】さらに、この粗ＬＴＡ画分を、疎水性相互
作用を利用する分離法（バッチ式分画法またはクロマト
グラフィーなど）に付し、次いで、イオン性相互作用を
利用する分離法（バッチ式またはクロマトグラフィーな
ど）に付することによって、より精製されたＬＴＡ画分
を得ることができる。また、ゲル濾過クロマトグラフィ
ーなどのような生体物質の単離または精製に慣用される
他の手段を適宜組み合わせて用いることもできる。

【００２４】疎水性相互作用を利用する分離法において
は、オクチル−セファロース、フェニルセファロース、
ポリスチレンゲルなどの疎水性基を有する担体などを吸
着剤として使用することができる。例えば、オクチル−
セファロースを使用する疎水性相互作用を利用する分離
法においては、粗ＬＴＡ画分をオクチル−セファロース
に適用した後、適用な溶出液によりＬＴＡを溶出させ
る。溶出液としては、例えば、適当な濃度の１−プロパ
ノールを含有する緩衝液を使用することができる。例え
ば、カラムクロマトグラフィー方式で溶出させる場合に
は、１５％〜７０％の濃度勾配の１−プロパノールを溶
出液として使用することができ、バッチ式で分離する場
合には、例えば、１５％、４０％または６０％などの濃
度の１−プロパノールを含有する緩衝液を溶出液として
使用することができる。これらの溶出液の種類および濃
度は、吸着剤との組み合わせにおいて当業者が適宜選択
できるものである。

【００２５】また、イオン性相互作用を利用する分離法
においては、イオン交換膜、具体的には、ＱＭＡ−Ｍｅ
ｍＳｅｐ１０１０（PerSeptive Biosystems, Framingha
m,ＭＡ，ＵＳＡ）、ＤＥＡＥ−ＭｅｍＳｅｐ１０００
（日本ミリポア社製）、ＱＭＡ−ＭｅｍＳｅｐ１０００
（日本ミリポア社製）、またはＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃ
ｅｌ、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＱＭ−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ（全てファルマシア社製）などの中あるいは強
塩基性イオン交換基を有するイオン交換樹脂などを使用
することができる。例えば、ＱＭＡ−ＭｅｍＳｅｐ１０
１０をイオン交換膜として使用するイオン性相互作用を
利用する分離法においては、ＬＴＡ含有画分を当該膜に
適用した後、適用な溶出液によりＬＴＡを溶出させる。
溶出液としては、適当な濃度（例えば３５％など）の１
−プロパノールを含有する緩衝液を使用することがで
き、また、適当な濃度または濃度勾配（例えば０〜１
Ｍ）を有する塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣＨ₃Ｃ
ＯＯＮＨ₄、ＨＣＯＯＮＨ₄など）を含む緩衝液を使用す
ることができる。

【００２６】なお、上記のような分離法で得られたＬＴ
Ａ成分は、ＮＭＲスペクトル、マススペクトル、薄層ク
ロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）などによりその構造を詳細に決定する
ことができる。また、加水分解、アセチル化／脱アセチ
ル化、アルカリ処理などにより生成物を適宜処理するこ
とにより、化学構造の決定に役立てることができる。

【００２７】なお以下の実施例では、Enterococcus hir
ae ＡＴＣＣ９７９０で表される微生物から出発して、
菌を脱脂し、熱フェノール／水抽出し、ＤＮアーゼ−Ｒ
Ｎアーゼ消化して得た抽出物を、透析、濃縮、凍結乾燥
して粗ＬＴＡ試料を得た。次いで、この粗ＬＴＡ試料を
オクチル−セファロースを使用するバッチ式分離法に付
して、ＬＴＡを含む画分を得た（ＢＯＳ１５、ＢＯＳ４
０およびＢＯＳ６０）。これをさらにイオン交換膜に適
用して、ＬＴＡ成分（ＱＭ−Ｉ）を得た。このようにし
て得られたＬＴＡ成分（ＱＭ−Ｉ）の構造を解析するこ
とにより、本発明者らは、従来報告されていない新規な
構造を有するＬＴＡを見い出したのである。

【００２８】以下の実施例により本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明は実施例によって限定されるもの
ではない。

【００２９】

【実施例】実施例１細菌細胞の培養 E. hirae（ＡＴＣＣ９７９０）を１５０Ｌバッチで３７
℃で６時間攪拌しながら増殖させた。この増殖培地（１
Ｌ）は、１０ｇのグルコース、１５ｇのトリプチカー
ゼ、４ｇのトリプトース、４ｇの酵母エキス、２ｇのＫ
₂ＨＰＯ₄ 、５ｇのＫＨ₂ＰＯ₄ 、２ｇのＮａ₂ＣＯ₃ 、
及び２ｇのＮａＣｌを含有するものであった。菌体を遠
心分離により採取して、使用するまでアセトン中で４℃
で保存した。

【００３０】ＮＭＲスペクトル ¹ Ｈ−及び¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルをＪＭＮ−ＬＡ５０
０スペクトロメーター（JEOL，東京）でそれぞれ５００
及び１２６ＭＨｚで測定した。化学シフトをδ値で表
し、 ¹Ｈスペクトルについてはテトラメチルシラン（δ
０）又は水（δ４．６５）を内部標準として用いること
によりそして¹³Ｃスペクトルについてはテトラメチルシ
ラン（δ０）を内部標準として又はベンゼン（δ１２
８）を外部標準として用いることにより測定した。

【００３１】マススペクトルＦＡＢ−ＭＳは、ＳＸ−１０２マススペクトロメーター
（JEOL）で得た。グリセロール又はｍ−ニトロベンジル
アルコールをマトリックスとして用いた。ＥＳＩ−ＭＳ
は、ＡＰＩ IIIプラスマススペクトロメーター（PE SCI
EX，カナダ、オンタリオ州 Thornhill）で得た。

【００３２】オクチル−セファロースによる粗ＬＴＡの
分画細菌の脱脂、熱フェノール／水抽出、及び抽出物のＤＮ
アーゼ−ＲＮアーゼ消化を文献記載の通りに行った（文
献１３を参照）。この消化した抽出物を透析し、濃縮
し、そして凍結乾燥して粗ＬＴＡ試料を得た。収率は、
脱脂細胞の乾燥重量を基準として２〜３％であった。こ
の粗ＬＴＡ（１ｇ）の１５％１−プロパノール含有０．
１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）２００ｍｌ中の溶液を、
同緩衝液で平衡にした４００ｍｌのオクチル−セファロ
ース（ファルマシア，スェーデン、ウプサラ）に加え
た。この混合液を４℃で３０分間放置してから濾過し
た。オクチル−セファロースを再度２５０ｍｌの同緩衝
液中に懸濁させ、４℃で３０分間放置してから濾過し
た。この操作をさらに４回繰り返した。回収したオクチ
ル−セファロースを４０％１−プロパノール含有酢酸緩
衝液で同じように処理（４回）してから６０％１−プロ
パノール含有酢酸緩衝液で同じように処理（６回）し
た。得られた濾液を別々に合わせて、約１００ｍｌまで
減圧濃縮し、透析し、再び減圧濃縮し、凍結乾燥して３
画分を得た。これらをそれぞれＢＯＳ１５（１５％１−
プロパノールを含有する緩衝液でのバッチ式オクチル−
セファロース溶出物）、ＢＯＳ４０、及びＢＯＳ６０と
命名した。それぞれの画分の回収率は、粗ＬＴＡから約
３０、４５、及び１０％であった。

【００３３】主オクチル−セファロース画分（ＢＯＳ４
０）の更なる分離ＢＯＳ４０の一部分（５０ｍｇ）を３５％１−プロパノ
ール含有０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）６ｍｌ中
に溶解させ、同緩衝液で平衡にしたイオン交換膜ＱＭＡ
−ＭｅｍＳｅｐ１０１０（PerSeptive Biosystems ，米
国マサチューセッツ州）に適用した。この膜を１００ｍ
ｌの同緩衝液で３．３ｍｌ／分の流速で洗浄した。その
溶出液をロータリーエバポレーターで約４０ｍｌまで減
圧濃縮した。次いで、膜に結合した物質を３５％１−プ
ロパノール及び１ＭのＮａＣｌを含有する１００ｍｌの
緩衝液で溶出させた。その溶出液をロータリーエバポレ
ーターで約４０ｍｌまで減圧濃縮した。両溶出液を別々
に透析し、濃縮し、凍結乾燥して２画分、つまりＱＭ−
Ａ及びＱＭ−Ｉを得た。同様の操作を数回繰り返した。
ＢＯＳ４０に基づくこれら２画分の回収率は、それぞれ
２〜３％及び８０〜９０％であった。

【００３４】分析操作リン、グリセロール、グルコース、脂肪酸、及びアラニ
ン含有量を文献記載の通りに分析した（文献１３を参
照）。ＴＬＣはシリカゲルプレートで行った（Merck Ke
iselgel 60 F₂₅₄ Art. 5715）。次の溶媒系を用いた：
Ａ，クロロホルム／メタノール／水（６５／２５／４，
容量比）；Ｂ，クロロホルム／メタノール／酢酸エチル
（１００／４／６，容量比）。プレート上のスポット
は、ヨード蒸気、水噴霧、又はアニスアルデヒド−硫酸
試薬を用いることにより可視化した。

【００３５】ＨＰＬＣは、ＲＩＤ−６Ａ屈折率検出器及
びＣ−Ｒ７Ａクロマトパックを備えたＬＣ−６ＡＣ液体
クロマトグラフ（島津製作所）で行った。ゲル透過クロ
マトグラフィーは、アサヒパックＧＦＡ−３０カラム
（５００ｍｍ×７．５ｍｍ内径，旭化成）で０．５Ｍの
ＮａＣｌを含有する０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）を溶離液として用いて０．８ｍｌ／分の流速で行っ
た。数種のヘパリンスタンダード（分子量：１．８×１
０⁴ 、９．８×１０³ 、４．４×１０³ 、２．４×１０
³ 、及び１．２×１０³ ）及びデキストランスタンダー
ド（１．７×１０⁴ 、１．１５×１０⁴ 、及び９．４×
１０³ ）を用いて、分子量測定用の検量線を作成した。

【００３６】高陰イオン性主成分（ＱＭ−Ｉ）中のホス
ホモノエステルの測定ＱＭ−Ｉ（１．５ｍｇ）を１．５ｍｌのアルカリ性ホス
ファターゼ溶液（大腸菌由来のもの，和光純薬工業株式
会社，０．０４Ｍ炭酸アンモニウム中５ユニット／ｍ
ｌ）中に溶解させた。この混合液を３７℃で２４時間イ
ンキュベートした。次いで、反応混合液中のフリーのリ
ン酸の量を上記の通りに測定した。

【００３７】ＱＭ−Ｉの加水分解４７％フッ化水素酸でのＱＭ−Ｉの加水分解及びその反
応生成物の相分離を Fischerの操作に従って行った（文
献１を参照）。簡単に説明すると、１０ｍｇのＱＭ−Ｉ
を５０μｌのフッ化水素酸で４℃で２４時間加水分解し
た。その反応混合液を水酸化ナトリウム上で減圧乾燥し
た。残渣をクロロホルム、メタノール、及び水（２／１
／３，容量比）から構成される２相溶媒系に分離させ
た。水相の生成物をアルカリ性ホスファターゼと共に３
７℃で２４時間、０．０４Ｍ炭酸アンモニウム中で処理
した。凍結乾燥後、この混合物を無水酢酸／ピリジン
（１／１，容量比）で室温で２４時間かけて完全アセチ
ル化した。減圧留去した後、この完全アセチル化生成物
をクロロホルムで抽出して、分取ＴＬＣにより溶媒系Ｂ
を用いて分離した。

【００３８】ＩＬ−６の誘導及びそのレベルの測定ヒト末梢全血細胞培養物（文献１４および１５を参照）
中でのＩＬ−６誘導及びＥＬＩＳＡを用いるそのレベル
の測定を文献記載の通りに行った（文献１３を参照）。

【００３９】ＱＭ−Ｉの脱アシル化ＱＭ−Ｉの脱アシル化を Kochanowskiらの操作に従って
行った（文献１６を参照）。即ち、０．２Ｍ水酸化ナト
リウムで３７℃で２時間加水分解してから遊離した脂肪
酸を除去し、そして透析により脱塩した。

【００４０】本発明者らは、試験材料及び試験装置が外
来菌体内毒素で汚染されないように注意した。例えば、
大塚（東京）から購入するか又は Toray pure LV-308
（東レ，東京）と GSL-200（アドバンテック，東京）を
組み合わせることにより調製した内毒素不含水を全検討
を通して用いた。

【００４１】結果本発明者らの先の検討では、粗ＬＴＡの分画を、ゲル濾
過クロマトグラフィーを行った後にオクチル−セファロ
ースでの疎水性相互作用クロマトグラフィーを一次勾配
の１−プロパノールで行って、３画分、つまり核酸含有
画分（ＮＡ）、ＬＴＡ−１（回収率：３０〜５０％）、
及びＬＴＡ−２（回収率：７〜１４％）を得た。しかし
ながら、この方法は、流速に限界があるため大規模分画
には実用的ではなかった。かくして、本検討において
は、オクチル−セファロースでのバッチ式分画方法を用
いて迅速かつ効率的な分離を実現した。本溶出用に選択
した１−プロパノール濃度は、本発明者らの先の一次勾
配でのクロマトグラフィーにおける３画分個々のピーク
の中心における濃度に相当する。３画分、つまりＢＯＳ
１５、ＢＯＳ４０、及びＢＯＳ６０は、それぞれ１５
％、４０％、及び６０％１−プロパノールを含有する
０．１Ｍ酢酸緩衝液で溶出させた。それらの回収率（粗
ＬＴＡを基準として約３０、４５、及び１０％）及び脂
肪酸含有率から判定して、ＢＯＳ１５、ＢＯＳ４０、及
びＢＯＳ６０は、それぞれ先の検討におけるＮＡ、ＬＴ
Ａ−１、及びＬＴＡ−２に相当すると推定された。ＢＯ
Ｓ４０及びＢＯＳ６０のＩＬ−６誘導活性もこの推定を
支持した。ＢＯＳ４０及びＢＯＳ６０は、先に文献記載
された（文献１３を参照）のと同じやり方でヒト末梢全
血細胞で試験した場合に、ＬＴＡ−２の誘導活性と同程
度にまでＩＬ−６を誘導した（図１）。その高い収率の
故に、ＢＯＳ４０を本検討において更に分画するのに用
いた。

【００４２】ＢＯＳ４０の更なる分画は、段階的溶出方
法をとった以外は先の検討と同様に（文献１３を参
照）、ＱＭＡ−ＭｅｍＳｅｐ１０１０でのイオン交換膜
クロマトグラフィーにより行った。２画分、つまりＱＭ
−Ａ及びＱＭ−Ｉが、それぞれ、３５％１−プロパノー
ルを含有する０．０１Ｍ酢酸緩衝液及び３５％１−プロ
パノールと１ＭＮａＣｌの両方を含有する同じ緩衝液
により溶出液から得られた。ＩＬ−６誘導活性はＱＭ−
Ａにおいて見られたがＱＭ−Ｉでは見られず（図２）、
本発明者らの先の検討結果（文献１３を参照）とよく一
致した。

【００４３】ＱＭ−Ｉは、そのデアシル誘導体のゲル透
過ＨＰＬＣで幅が広いが単一のピークとして溶離した。
その分子量は、（スタンダードヘパリンの使用により検
量して）２〜８×１０³ 又は（スタンダードデキストラ
ンの使用により検量して）７〜１４×１０³ の範囲内で
あると見積もられた。ＱＭ−Ｉは、対応するクロマトグ
ラフィーにおける溶離プロフィールから判定すると、疎
水的かつ陰イオン的に均質でもある。従って、ＱＭ−Ｉ
は、上記の分子量範囲を有する均質な高分子糖結合体と
みなすことができる。その化学組成を表Ｉに纏めた。

【００４４】

【表１】表ＩＱＭ−１の化学組成２モルの脂肪酸が存在していると仮定することによってモル比を計算した。重量％（モル比）ホスフェート 11.5 (12.0) グリセロール 18.7 (14.0) グルコース 42.4 (17.3) 脂肪酸 7.6 (2.0) Ｃ１６：０ (0.7) Ｃ１６：１ (0.1) Ｃ１８：０ (0.2) Ｃ１８：１ (0.9) アラニン 2.3 (2.0)

【００４５】ＱＭ−Ｉの直接アルカリ性ホスファターゼ
消化では遊離したフリーのホスフェートが検出されなか
ったので、ホスホモノエステルの存在可能性は排除され
た。かくして、この分子中のリンはホスホジエステルの
形で存在すると結論付けた。リンのグリセロールに対す
るモル比はおよそ１であるが、これは、ＬＴＡについて
示されたポリ（グリセロホスフェート）構造の存在を示
唆するものである。この分子中に豊富に存在すると考え
られるホスホジエステル結合を開裂させるために、ＱＭ
−Ｉをフッ化水素酸（ＨＦ）加水分解により消化して、
その生成物をクロロホルム／メタノール／水（２／１／
３，容量比）の混合液で分画した。溶媒系Ａを用いるＴ
ＬＣ分析で、このＨＦ加水分解物の有機相中において１
種の主生成物と幾つかの少量生成物が検出された（図
３）。それらを分取ＴＬＣにより単離した。それらのＦ
ＡＢ−ＭＳ及び ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルから、この主生
成物がＧｌｃ₂ ａｃｙｌ₂ Ｇｒｏ構造を有すること、及
び少量生成物がリソ誘導体、ジアシルグリセロール、及
び脂肪酸であることが明らかになった。

【００４６】Ｇｌｃ₂ ａｃｙｌ₂ Ｇｒｏ中のグリセロー
ル及びグルコース残基の一次元 ¹Ｈ−ＮＭＲデータを表
IIに纏めた。両グルコース残基の１位から４位における
プロトンのカップリング定数はピラノシル環構造を示し
た（文献１７を参照）。アノマープロトンの化学シフト
（δ４．９８及び４．９５）及びカップリング定数（³
Ｊ_1.2 として３．５及び３．８Ｈｚ）で、α−アノマー
配置が確認された（文献１８を参照）。グリセロール残
基に関しては、Ｈ−１及びＨ−２のＨ−３と比較したダ
ウンフィールドシフトから、これら１位及び２位に脂肪
酸が位置していることが示された。図４に示したＱＭ−
ＩのＮＯＥＳＹスペクトルにおいて、Ｇｌｃ^nrＨ−１と
Ｇｌｃ^r Ｈ−２の間、及びＧｌｃ^r Ｈ−１とＧｒｏＨ−
３の間の残基間ＮＯＥが認められた（Ｇｌｃ^nrは非還元
側グルコースを表し、Ｇｌｃ^r は還元側グルコースを表
す）。完全アセチル化すると、Ｇｌｃ^r Ｈ−２のダウン
フィールドシフトが ¹Ｈ−ＮＭＲデータに認められなく
なった（データは示していない）。これら結果から、こ
の糖脂質構造は、Ｇｌｃ^nr（α１−２）Ｇｌｃ^r （α１
−３）ａｃｙｌ₂Ｇｒｏと決定された。これらＮＭＲデ
ータは、表IIに挙げた合成同等物（文献９を参照）のデ
ータとよく一致した。これら結果は、このグリセロール
残基の立体化学が通常の糖グリセロ脂質中に存在するの
と同じであることも証明している。

【００４７】

【表２】表 II ＱＭ−ＩのＨＦ加水分解により得られた糖脂質Ｇｌｃ₂
ａｃｙｌ₂ Ｇｒｏ及びその合成同等物についての ¹Ｈ−
ＮＭＲデータ。このスペクトルは、ＣＤＣｌ₃−ＣＤ₃
ＯＤ（３：１）中で３０３Ｋで測定した。帰属は ¹Ｈ−
及び¹³Ｃ−ＮＭＲ一次元スペクトル法並びにＤＱＦ−Ｃ
ＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ及びＨＭＱＣの二次元法により行っ
た。Ｇｌｃ^r 及びＧｌｃ^nrは、それぞれ還元側及び非還
元側グルコース残基を表わす。合成糖脂質についてのデ
ータは文献（９）から得た。 Glc₂acyl₂Gro 合成糖脂質プロトン化学シフト(³J _H,_H ) 化学シフト(³J _H,_H ) δ (Hz) δ (Hz) グリセロール Gro H-1 4.20 (6.6, 12.2) 4.20 (6.4, 12.1) 4.43 (3.4, 12.2) 4.43 (3.0, 12.1) Gro H-2 5.23 5.23 Gro H-3 3.64 (5.1, 10.8) 3.64 (5.3, 10.6) 3.83 (5.3, 10.9) 3.83 (5.8, 10.6) グルコース Glc^r H-1 4.98 (3.5) 4.98 (3.6) Glc^r H-2 3.59 (3.5, 9.8) 3.58 (3.6, 9.6) Glc^r H-3 3.78 (8.9, 9.8) 3.78 Glc^r H-4 3.45 (8.9, 9.7) 3.44 (9.2, 9.9) Glc^r H-5 3.57 3.57 Glc^r H-6 3.78 3.7-3.8 Glc^nrH-1 4.95 (3.8) 4.95 (3.8) Glc^nrH-2 3.45 (3.9, 9.6) 3.44 (3.8, 9.5) Glc^nrH-3 3.70 (9.0, 9.6) 3.69 (9.2, 9.5) Glc^nrH-4 3.33 (9.1, 9.8) 3.34 (9.2, 9.5) Glc^nrH-5 3.88 3.88 Glc^nrH-6 3.69 (6.1, 12.2) 3.70 (6.2, 12.4) 3.86 3.86

【００４８】この糖脂質中の脂肪酸エステルは、主に
０．６３／０．２３／０．１０／１．００のモル比で、
ヘキサデカン酸エステル、ヘキサデセン酸エステル、オ
クタデカン酸エステル、及びオクタデセン酸エステルか
ら構成されていた。この糖脂質部分の陽イオンモードＦ
ＡＢ−ＭＳ分析で、図５に示した分子イオンピークが示
された。この分子量の不均一性は、グリセロールの１位
及び２位における異なる脂肪酸の組み合わせでの置換に
よって説明される。例えば、ｍ／ｚ９４２におけるピー
クは１つのヘキサデカン酸と１つのオクタデセン酸を有
する糖脂質に相当するのに対して、ｍ／ｚ９６８におけ
るピークは２つのオクタデセン酸を含有する。

【００４９】ＱＭ−ＩのＨＦ加水分解物から水相中に抽
出された生成物をＥＳＩ−ＭＳにより分析した。陽イオ
ンモードでは、ｍ／ｚ２７７．２、４３９．３、６０
１．２、７６３．４、９２５．４並びにｍ／ｚ３２６．
２、４８８．３、６５０．４、８１２．４の２組のイオ
ンピークが認められた（図６）。前者の組はＧｌｃ_n Ｇ
ｒｏ（ｎ＝１〜５）のナトリウム付加物に帰属し、後者
の組はプロトン化された形のＡｌａＧｌｃ_n Ｇｒｏ（ｎ
＝１〜４）に帰属した。陰イオンモードＥＳＩ−ＭＳで
は、依然としてリン酸基を保持している化合物の存在が
示されたので、この混合物を更にアルカリ性ホスファタ
ーゼで処理して残りのリン酸分を除去した。得られた脱
リン酸化生成物のＥＳＩ−ＭＳ分析（陽イオンモード）
では、Ｇｌｃ_n Ｇｒｏ（ｎ＝１〜５）のナトリウム付加
物の分子イオンピークだけが認められ、アラニン置換基
はもはや検出されなかった。このホスファターゼ処理
は、弱いアルカリ性条件下で行われたので、このアラニ
ン残基の消失は、それらがＧｌｃ_n Ｇｒｏとエステル結
合で結合していたことを示唆する。この脱リン酸化生成
物を完全アセチル化したところ、溶媒系Ｂを用いる分取
ＴＬＣにより５種の化合物が単離された（分析用ＴＬＣ
のパターンを図７に示す）。

【００５０】これら単離された化合物は、 ¹Ｈ−ＮＭＲ
スペクトルに基づいて、完全アセチル化されたＧｒｏ、
Ｇｌｃ^I （α１−２）Ｇｒｏ、Ｇｌｃ^II（α１−２）Ｇ
ｌｃ^I （α１−２）Ｇｒｏ、Ｇｌｃ^III （α１−２）Ｇ
ｌｃ^II（α１−２）Ｇｌｃ^I（α１−２）Ｇｒｏ、及び
Ｇｌｃ^IV（α１−２）Ｇｌｃ^III （α１−２）Ｇｌｃ^II
（α１−２）Ｇｌｃ^I （α１−２）Ｇｒｏと同定された
（グルコシル残基は、グリセロールに結合したものから
非還元末端に向かって番号付けされている）。上記のＥ
ＳＩ−ＭＳにおいて検出されたにも拘らず、Ｇｌｃ₅ Ｇ
ｒｏの存在はその低含有量のためにＴＬＣでは確認され
なかった。

【００５１】これら生成物の ¹Ｈ−ＮＭＲデータを表II
I に纏める。アノマープロトン及び他の環プロトンのカ
ップリング定数から、全てのグルコース残基がα−グル
コピラノシル配置であることが示された。ＧｒｏＨ−２
のダウンフィールドシフトがＧｌｃ_n Ｇｒｏの完全アセ
チル化で認められなかったが、これはＧｌｃ（α１−
２）Ｇｒｏ結合を示すものである。完全アセチル化Ｇｌ
ｃ₃ ＧｒｏのＧｌｃ^I Ｈ−２及びＧｌｃ^IIＨ−２のいず
れについても、ダウンフィールドシフトは認められなか
った。これは、Ｇｌｃ_n Ｇｒｏ中のＧｌｃ（α１−２）
Ｇｌｃ結合を証明するものである。この残基間結合の位
置をＨＭＢＣにより更に確認した。かくして、完全アセ
チル化Ｇｌｃ₂ Ｇｒｏにおいて考えられる残基間相互関
係は、Ｇｌｃ^IIＣ−１とＧｌｃ^I Ｈ−２の間、Ｇｌｃ^II
Ｈ−１とＧｌｃ^IＣ−２の間、Ｇｌｃ^I Ｃ−１とＧｒｏ
Ｈ−２の間、及びＧｌｃ^I Ｈ−１とＧｒｏＣ−２の間に
認められた。

【００５２】

【表３】表 III 完全アセチル化されたＧｒｏ、ＧｌｃＧｒｏ、Ｇｌｃ₂
Ｇｒｏ、Ｇｌｃ₃ Ｇｒｏ、Ｇｌｃ₄ Ｇｒｏについての ¹
Ｈ−ＮＭＲデータ。このスペクトルは、ＣＤＣｌ₃ 中で
３０３Ｋで測定した。帰属は ¹Ｈ−及び¹³Ｃ−ＮＭＲ一
次元スペクトル法、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、及びＨＭＱＣに
より行った。グルコシル残基は、グリセロールに結合し
たものから非還元末端に向かって番号付けされている。プロトン化学シフトδ（カップリング定数，Hz) Gro GlcGro Glc₂Gro Gro H-1 4.16 (5.7, 11.9) 4.09 4.18 4.29 (4.1, 11.9) 4.27 4.28 Gro H-2 5.24 4.06 4.09 Gro H-3 4.16 (5.7, 11.9) 4.09 4.21 4.29 (4.1, 11.9) 4.27 4.27 Glc^I H-1 5.31 (3.9) 5.21 (3.7) Glc^I H-2 4.84 (3.8, 10.3) 3.75 (3.6, 9.9) Glc^I H-3 5.47 (9.6, 10.1) 5.45 (9.4, 9.8) Glc^I H-4 5.06 (9.8, 9.9) 4.98 (9.2, 10.3) Glc^I H-5 4.20 4.21 Glc^I H-6 4.17 4.05 4.23 (4.6, 12.4) 4.29 Glc^IIH-1 5.16 (3.5) Glc^IIH-2 4.87 (3.5, 10.4) Glc^IIH-3 5.37 (9.5, 10.2) Glc^IIH-4 5.07 (9.5, 10.2) Glc^IIH-5 4.07 Glc^IIH-6 4.16

【００５３】

【表４】表 III （続き）プロトン化学シフトδ（カップリング定数，Hz) Glc₃Gro Glc₄Gro Gro H-1 4.18 4.09 4.38 4.43 Gro H-2 4.26 4.18 Gro H-3 4.17 4.24 4.33 4.30 Glc^I H-1 5.33 (3.9) 5.34 (3.9) Glc^I H-2 3.73 (3.9, 10.1) 3.93 (3.7, 9.9) Glc^I H-3 5.45 (9.6, 9.6) 5.49 (9.4, 9.6) Glc^I H-4 5.00 (9.6, 9.9) 5.04 (9.1, 9.4) Glc^I H-5 4.26 4.27 Glc^I H-6 4.06 4.11 Glc^IIH-1 5.04 (3.2) 5.05 (3.0) Glc^IIH-2 3.76 (3.2, 10.3) 3.70 (3.2, 10.3) Glc^IIH-3 5.40 (9.6, 9.9) 5.33 Glc^IIH-4 4.99 (9.6, 10.1) 5.00 (9.6, 9.9) Glc^IIH-5 4.16 4.04 Glc^IIH-6 4.07 4.18 Glc^III H-1 5.10 (3.7) 5.20 (3.4) Glc^III H-2 4.94 (3.7, 10.3) 3.76 (3.4, 9.9) Glc^III H-3 5.32 (9.4, 10.3) 5.35 Glc^III H-4 5.08 (9.4, 10.1) 5.01 (9.6, 10.0) Glc^III H-5 4.11 4.08 Glc^III H-6 4.18 4.17 Glc^IV H-1 5.12 (3.9) Glc^IV H-2 4.92 (3.6, 10.2) Glc^IV H-3 5.31 Glc^IV H-4 5.10 (9.6, 10.1) Glc^IV H-5 4.00 Glc^IV H-6 4.19

【００５４】糖脂質とＧｌｃ_n Ｇｒｏ部分の間の結合様
式を明らかにするために、脱アシル化したＱＭ−ＩのＮ
ＭＲスペクトルを調べた。¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図
８に示す。約５Ｈｚのカップリング定数を有するδ６
７．３８及び６７．５２のシグナルは、ＧｒｏＣ−１及
びＧｒｏＣ−３に帰属する。そのダウンフィールドシフ
ト及び ²Ｊ_c,_p について期待される値に対応するカップ
リング定数は、グリセロールの１位及び３位におけるホ
スホジエステル結合を示しているので、１，３−ホスホ
ジエステル結合ポリ（グリセロホスフェート）鎖の存在
を証明している。糖脂質領域についての ¹Ｈ及び¹³Ｃ−
ＮＭＲデータを表IVに纏める。それら帰属は、ＤＥＰＴ
（１３５°）、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ＨＭＱＣ、及
びＨＭＢＣスペクトルにより、及び報告されたデータ
（文献１６を参照）を参照することにより行った。観察
されたＧｌｃ^nrＣ−６（約５Ｈｚ）及びＧｌｃ^nrＣ−５
（約７Ｈｚ）のカップリング定数は、それぞれ ²Ｊ_c,_p
及び ³Ｊ_c,_p について期待される値と一致する。これ
は、明白に、非還元側グルコースの６位におけるホスホ
ジエステル結合を示している。これら結果から、このポ
リ（グリセロホスフェート）鎖が糖脂質部分の非還元側
グルコースの６位に結合していることが明らかになっ
た。

【００５５】

【表５】表 IV 脱アシル化ＱＭ−Ｉ内の糖脂質領域のグリセロール及び
グルコース残基についての ¹Ｈ−及び¹³Ｃ−ＮＭＲデー
タ。このスペクトルは、Ｄ₂Ｏ中で３０３Ｋで測定し
た。帰属は ¹Ｈ−及び¹³Ｃ−ＮＭＲ一次元スペクトル法
並びにＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、Ｈ
ＭＱＣ、及びＨＭＢＣ、並びに文献（１６）中のデータ
を参照することにより行った。Ｇｌｃ^r は還元側のグル
コース残基を表わし、Ｇｌｃ^nrは非還元側のグルコース
残基を表わす。位置化学シフト（δ) ¹Ｈ ¹³Ｃ Gro 1 3.65 64.62 Gro 2 71.52 Gro 3 3.81 70.00 Glc^r 1 5.11 97.15 Glc^r 2 3.63 76.74 Glc^r 3 3.76 72.55 Glc^r 4 3.42 70.69 Glc^r 5 3.54 72.55 Glc^r 6 3.67 61.88 3.76 Glc^nr1 5.04 97.40 Glc^nr2 3.56 72.33 Glc^nr3 3.73 73.80 Glc^nr4 3.50 70.69 Glc^nr5 3.97 72.01 Glc^nr6 4.06 65.25

【００５６】全データを考慮に入れると、ＱＭ−Ｉ、つ
まり E. hirae ＡＴＣＣ９７９０からのＢＯＳ４０中の
主成分ではあるがヒト末梢全血細胞を用いた実験ではＩ
Ｌ−６誘導活性を有しない成分の化学構造は、図９に示
した通りであると判断された。

【００５７】実施例２ＱＭ−ＩのＴＮＦ誘導活性ＱＭ−ＩをＴＨＰ−１（ヒト単球系細胞）培養系に加え
て、血清存在下及び血清非存在下でＴＮＦ誘導活性を調
べた。ＴＨＰ−１を培地（ＲＰＭＩ１６４０）中で培
養し、細胞数が１×１０⁶／ｍｌのＴＰＨ−１培養液中
に種々の濃度でＱＭ−ＩまたはＬＰＳを添加した。この
培養液を１％のウシ胎仔血清の存在下及び非存在下で、
更に３７℃で２４時間ＣＯ₂インキュベーター中で培養
してから、培養上澄み液中に存在するＴＮＦ−αの量を
ＥＬＩＳＡ法により測定した。結果を表Ｖに示す。

【００５８】

【表６】表Ｖ血清存在下添加物ＱＭ−ＩＬＰＳ添加物濃度（μg/ml） 0 0.1 1 10 0 0.01 0.1 1 ＴＮＦ−α（pg/ml） 20 20 158 2262 20 144 768 1754血清非存在下添加物ＱＭ−ＩＬＰＳ添加物濃度（μg/ml） 0 0.1 1 10 0 0.01 0.1 1 ＴＮＦ−α（pg/ml） 20 20 1423 3326 20 20 20 20

【００５９】ＱＭ−ＩのＴＮＦ誘導活性は、ＬＰＳの場
合とは逆に、血清の存在下で抑制されるが血清不存在下
において強くなる。

【００６０】引用文献リスト： 1. Fischer, W. (1990) (Kates, M., ed.), pp. 123
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【００６５】

【発明の効果】本発明のリポタイコ酸は、従来報告され
ていない新規な構造を有する物質である。また、本発明
のリポタイコ酸は、ＴＮＦ誘導活性を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＢＯＳ４０及びＢＯＳ６０のＩＬ−６
誘導活性を示す。サンプルの用量はＢＯＳ４０及びＢＯ
Ｓ６０については１００及び１０μｇ／ｍｌであり、Ｌ
ＰＳについては１０００、１００、及び１０ｐｇ／ｍｌ
であった。データは２実験の平均値±標準偏差である。
血液ドナーはＪＹであった。

【図２】図２は、ＢＯＳ４０とＢＯＳ６０からのＱＭ−
Ａ及びＱＭ−ＩのＩＬ−６誘導活性を示す。サンプルの
用量はＱＭ−Ａ及びＱＭ−Ｉについては１０及び１μｇ
／ｍｌであり、ＬＰＳについては１０００、１００、及
び１０ｐｇ／ｍｌであった。データは２実験の平均値±
標準偏差である。血液ドナーはＭＨであった。

【図３】図３は、ＱＭ−ＩのＨＦ加水分解物からの有機
相中に抽出された生成物のＴＬＣ分析を示す。ＴＬＣは
シリカゲルプレート（Merck Keiselgel 60 F₂₅₄ Art. 5
715 ）で溶媒系Ａ；クロロホルム／メタノール／水（６
５／２５／４，容量比）を用いて行った。生成物をアニ
スアルデヒド−硫酸試薬で可視化して、イメージスキャ
ナー（ScanJet IIcx, Hewlett Packard ）により記録し
た。

【図４】図４は、Ｇｌｃ₂ ａｃｙｌ₂ ＧｒｏのＮＯＥＳ
Ｙスペクトルの一部を示す。このスペクトルはクロロホ
ルム／メタノール（３：１）中で３０３Ｋで測定した。
混合時間は６５０分であった。

【図５】図５は、Ｇｌｃ₂ ａｃｙｌ₂ ＧｒｏのＦＡＢ−
ＭＳ分析を示す。ｍ−ニトロベンジルアルコールをマト
リックスとして用いた。

【図６】図６は、ＱＭ−ＩのＨＦ加水分解物からの水相
中に抽出された生成物のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。０．
１ｍｇ／ｍｌ溶液（２０％２−プロパノール含有水中）
を０．３ｍｌ／ｈで連続的に注入した。

【図７】図７は、ＱＭ−ＩのＨＦ加水分解物からの水相
中に抽出された生成物のＴＬＣ分析を示す。ＴＬＣはシ
リカゲルプレート（Merck Keiselgel 60 F₂₅₄ Art. 571
5 ）で溶媒系Ｂ；クロロホルム／メタノール／酢酸エチ
ル（１００／４／６，容量比）を用いて行った。生成物
をアニスアルデヒド−硫酸試薬で可視化して、イメージ
スキャナー（ScanJet IIcx, Hewlett Packard ）により
記録した。この方法によっては可視化されない完全アセ
チル化Ｇｒｏは、ヨード蒸気で検出した（データは示し
ていない）。

【図８】図８は、脱アシル化ＱＭ−Ｉの¹³Ｃ−ＮＭＲス
ペクトルを示す。このスペクトルは、Ｄ₂ Ｏ中で３０３
Ｋで測定した。帰属は、ＤＥＰＴ（１３５°）、ＨＭＱ
Ｃ、ＨＭＢＣ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、及びＮ
ＯＥＳＹにより行った。Ｇｌｃ^nrは、糖脂質領域の非還
元側グルコースを意味する。

【図９】図９は、ＢＯＳ４０からのＱＭ−Ｉの構造を示
す。グリセロール上のオリゴグルコシル置換基の一部
は、更にアラニンで置換され得る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記構造式（１）：【化１】（式中、Ｘは各々独立に、Ｈ、Ａｌａ（Ｇｌｃ）_mまた
は（Ｇｌｃ）_mを示し、ここでｍは１〜５の自然数を示
し；ｎは５〜４２の自然数を示し；そして、ＣＯＲは、
脂肪酸残基を示す）を有することを特徴とするリポタイ
コ酸。
【請求項２】少なくとも１個のＸがＡｌａ（Ｇｌｃ）
_mであることを特徴とする、請求項１に記載のリポタイ
コ酸。
【請求項３】 Enterococcus 属由来であることを特徴
とする、請求項１または２に記載のリポタイコ酸。
【請求項４】 Enterococcus hirae 由来であることを
特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のリポタイコ
酸。
【請求項５】 Enterococcus hirae ＡＴＣＣ９７９０
由来であることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記
載のリポタイコ酸。
【請求項６】リポタイコ酸産生菌を培養し、該菌を回
収した後、疎水性相互作用を利用した分離法に付し、次
いで、陽イオン交換作用を利用した分離法に付すること
により得ることができることを特徴とする、請求項１か
ら５の何れかに記載のリポタイコ酸。
【請求項７】陽イオン交換作用を利用した分離法にお
いて塩を含有する緩衝液を溶出液として使用することを
特徴とする、請求項６に記載のリポタイコ酸。