JPH09103292A - 熱安定性酵素 - Google Patents

熱安定性酵素

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JPH09103292A JP8240996A JP24099696A JPH09103292A JP H09103292 A JPH09103292 A JP H09103292A JP 8240996 A JP8240996 A JP 8240996A JP 24099696 A JP24099696 A JP 24099696A JP H09103292 A JPH09103292 A JP H09103292A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、化学修飾により可逆的に不活性化
された熱安定性酵素を提供する。 【解決手段】 前記化学修飾された熱安定性酵素は、ア
ルカリ性ｐＨの水性緩衝液中での約25℃未満の温度での
前記酵素のインキュベーションが約20分未満で酵素活性
の有意な増加を全く引き起こさず、且つ25℃で約ｐＨ８
〜９に調整された水性緩衝液中での約50℃より高い温度
での前記酵素のインキュベーションが約20分未満で酵素
活性の少なくとも２倍の増加を引き起こすことを特徴と
する。 【効果】 前記化学修飾された熱安定性酵素は、増幅反
応の前にまたはその一部として、反応混合物の高温イン
キュベーションにより不活性化された酵素の活性が回復
される核酸の増幅に利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般的には核酸化
学の分野に関する。より詳しくは、本発明は核酸配列の
増幅方法および非特異的増幅の削減方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】核酸
配列を増幅させるためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）法は当業界で周知であり、米国特許第 4,683,202
号、同第 4,683,195号および同第 4,965,188号に開示さ
れている。販売業者、例えばPerkin Elmer, Norwalk, C
T はＰＣＲ試薬を販売しておりそしてＰＣＲプロトコー
ルを発表している。
【０００３】ＰＣＲ増幅の各サイクルにおいて、二本鎖
標的配列を変性させ、変性した標的の各鎖にプライマー
をアニーリングさせ、そしてＤＮＡポリメラーゼの作用
により該プライマーを伸長させる。増幅の特異性はプラ
イマーハイブリダイゼーションの特異性に依存する。プ
ライマーは標的核酸配列の各鎖の３′末端に存在する配
列に相補的であるかまたは実質上相補的であるように選
択される。典型的なＰＣＲで使われる高温条件下では、
プライマーは意図する標的配列にのみハイブリダイズす
る。
【０００４】しかしながら、増幅反応混合物は、典型的
にはプライマーハイブリダイゼーション特異性を保証す
るのに必要とされる温度よりずっと低い室温で調合され
る。そのような低緊縮（Stringent ）条件下では、プラ
イマーは一部分のみ相補的な核酸配列に（または他のプ
ライマーにさえも）非特異的に結合し、標的配列と一緒
に増幅されてしまう望ましくない伸長生成物の合成を開
始させることがある。非特異的プライマー伸長生成物の
増幅は所望の標的配列の増幅と競合し、所望の配列の増
幅効率を大きく減少させてしまう。非特異的増幅により
生じる問題はChou他, 1992, Nucleic Acids Research
20(7):1717-1723 中に更に論じられている。
【０００５】非特異的増幅は、反応の開始前に非標的配
列に結合したプライマーからの伸長生成物の形成を減少
させることにより減らすことができる。「ホット・スタ
ート」プロトコールと呼ばれる１つの方法では、必要な
ハイブリダイゼーション特異性を提供するのに十分な位
温度が高くなるまで、１または複数の重要な試薬を反応
混合物に加えないでおく。この方法では、反応条件が特
異的プライマーハイブリダイゼーションを保証しないう
ちは、反応混合物はプライマー伸長を支援することがで
きない。
【０００６】ホット・スタート法は、最初の高温インキ
ュベーション段階の後で反応チューブを開け、欠けてい
る試薬を加えることにより、手動で実施することができ
る。しかしながら、手動のホット・スタート法は重労働
であり、反応混合物の汚染の危険性を増加させる。反応
成分を分離または隔離するために熱不安定性材料、例え
ばワックスを使うホット・スタート法は、米国特許第
5,411,876号とChou他,1992, 前掲中に記載されている。
これらの方法では、高温予備反応インキュベーションが
熱不安定性材料を融解させ、それによって試薬を混合さ
せる。
【０００７】反応の開始前に非標的配列に結合したプラ
イマーからの伸長生成物の形成を減少させる別の方法
は、熱可逆的方法でＤＮＡポリメラーゼに非共有結合的
に結合する化合物を使ったＤＮＡポリメラーゼの阻害に
頼る方法である。米国特許第 5,338,671号は、ＤＮＡポ
リメラーゼ活性を阻害するための熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼに特異的な抗体の使用を記載している。
【０００８】この場合、抗体−ＤＮＡポリメラーゼ複合
体の形成を可能にするために反応混合物の調合の前に前
記抗体を緩衝液中でＤＮＡポリメラーゼと共に室温でイ
ンキュベートしなければならない。ＤＮＡポリメラーゼ
活性の抗体阻害は高温予備反応インキュベーションによ
り不活性化される。この方法の欠点は、ＤＮＡポリメラ
ーゼに特異的な抗体の製造が、特に大量の場合、高価で
あり且つ時間を浪費するということである。更に、反応
混合物への抗体の添加は増幅反応のデザイン変更を要す
る場合がある。
【０００９】伸長生成物の形成は、熱可逆的方法でプラ
イマーに非共有結合的に結合し、それによってプライマ
ーが任意の配列、標的またはその他のものにハイブリダ
イゼーションしないようにする化合物の添加により阻害
することもできる。例えば、反応混合物に添加された一
本鎖結合タンパク質はプライマーと結合し、それによっ
てプライマーハイブリダイゼーションを防止し、そして
プライマー伸長を阻害するだろう。第32遺伝子タンパク
質を使ったＰＣＲ生成物の収率の改善はSchwarz 他, 19
90, Nucleic Acids Research 18(4):10中に記載されて
いる。
【００１０】非特異的増幅は、非標的配列に結合したプ
ライマーから形成された伸長生成物を、例えば米国特許
第 5,418,149号およびWO 92/01814 中に記載された方法
を使って、反応の開始前に分解させることにより減らす
ことができる。新たに合成された伸長生成物の分解は、
反応混合物中にdUTPとUNG を配合し、そして増幅反応を
実施する前に反応混合物を45〜60℃でインキュベートす
ることにより達成される。この方法の欠点は、伸長生成
物の分解が伸長生成物の形成と競合し、そして非特異的
プライマー伸長生成物の除去が完全という程ではないら
しいことである。
【００１１】当該技術の範囲内である分子生物学、タン
パク質化学および核酸化学の常用技術は文献中に十分に
説明されている。例えば、Molecular Cloning - A Labo
ratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, New York (Sambrook他, 1989) ; Olig
onucleotide Synthesis (M.J. Gait編, 1984) ; Nuclei
c Acid Hybridization (B.D. HamesおよびS.J. Higgins
編, 1984) ; ChemicalReagents for Protein Modificat
ion (CRC Press) 並びに Methods in Enzymologyのシ
リーズ (Academic Press, Inc.) を参照のこと。本明細
書中の上記および下記に言及される全ての特許、特許出
願および刊行物は参考として本明細書中に組み込まれ
る。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明は、プライマーに
基づく増幅反応を使った核酸を増幅させるための方法お
よび試薬を提供する。これらの方法および試薬は、非特
異的増幅の課題に対する単純で且つ経済的な解決策を提
供する。該方法は、増幅反応混合物中での高温でのイン
キュベーションにより回復させることができる可逆的に
不活性化された熱安定性酵素を使用する。プライマーハ
イブリダイゼーション特異性を保証する温度にまで反応
混合物の温度が高められるまで、反応混合物がプライマ
ー伸長を支持しないため、非特異的増幅が大きく削減さ
れる。
【００１３】本発明の一観点は、プライマー伸長反応を
触媒する熱安定性酵素と修飾試薬との反応によって製造
される、可逆的に不活性化された熱安定性酵素に関す
る。この反応は、酵素活性の有意な低下、好ましくは本
質的に完全な低下を引き起こす。アルカリ性ｐＨの水性
緩衝液中での約25℃より低い温度での前記修飾された酵
素のインキュベーションは、約20分未満で本質的に全く
酵素活性の増加を引き起こさない。
【００１４】25℃でｐＨ＝８〜９に調整された水性緩衝
液中での約50℃より高い温度での前記修飾された酵素の
インキュベーションは、約20分未満でプライマー伸長の
少なくとも２倍の増加を引き起こす。本発明の可逆的に
不活性化された熱安定性酵素は、それらの活性状態で、
プライマー伸長を触媒するかまたはプライマー伸長が起
こるのに必要であるかのいずれかである。好ましい酵素
としては熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとリガーゼが挙げ
られる。
【００１５】好ましい修飾試薬は、一般式
【化５】 （上式中、Ｒ1 とＲ2 は水素または有機基であり、互い
に連結していてもよい）または一般式
【化６】 （上式中、Ｒ1 とＲ2 は有機基であって、好ましくは連
結しており、そして水素はシス配置である）のジカルボ
ン酸無水物である。
【００１６】前記有機基は炭素−炭素結合によって、ま
たは炭素−ヘテロ原子結合、例えば炭素−酸素、炭素−
窒素もしくは炭素−硫黄結合を通して、環に直接取り付
けられてもよい。有機基は、例えば３，４，５，６−テ
トラヒドロフタル酸無水物の場合のように、互いに連結
して環構造を形成してもよい。好ましい試薬としては、
無水マレイン酸；置換された無水マレイン酸、例えばシ
トラコン酸無水物、シス−アコニット酸無水物および
２，３−ジメチルマレイン酸無水物；エキソ−シス−
３，６−エンドオキソ−Δ4 −テトラヒドロフタル酸無
水物；並びに３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸無
水物が挙げられる。特に、シトラコン酸無水物とシス−
アコニット酸無水物は、ＰＣＲ増幅に使われる可逆的に
不活性化されたＤＮＡポリメラーゼの調製に好ましい。
【００１７】本発明の別の観点は、本発明の可逆的に不
活性化された熱安定性酵素を使って核酸増幅反応を実施
する方法に関する。本発明は、試料中に含まれる標的核
酸の増幅方法であって、次の段階： (a) 前記試料を、前記標的核酸に相補的なプライマーと
修飾された熱安定性酵素を含有する増幅反応混合物と接
触させ、ここで前記修飾された熱安定性酵素はプライマ
ー伸長反応を触媒する熱安定性酵素と修飾試薬との混合
物の反応により製造され、該反応は約25℃より低い温度
でアルカリ性ｐＨで行われ、前記反応は酵素活性の本質
的に完全な不活性化をもたらす酵素の化学修飾を引き起
こし、そして25℃で約ｐＨ＝８〜９に調整された水性緩
衝液中での約50℃より高い温度での前記修飾された酵素
のインキュベーションが約20分未満で酵素活性の少なく
とも２倍の増加を引き起こし；そして(b) 段階(a) から
得られた反応混合物を、前記酵素を回復させそしてプラ
イマー伸長生成物の形成を可能にするのに十分な時間、
約50℃より高い温度でインキュベートする；を含んで成
る方法に関する。
【００１８】好ましい方法として、本発明は、試料中に
含まれる標的核酸の増幅方法であって、次の段階： (a) 前記試料を、前記標的核酸に相補的なプライマーと
修飾された熱安定性酵素とを含有する増幅反応混合物と
接触させ、ここで前記修飾された熱安定性酵素は熱安定
性酵素と一般式
【化７】 （上式中、Ｒ1 とＲ2 は水素または有機基であり、互い
に連結していてもよい）または一般式
【化８】 （上式中、Ｒ1 とＲ2 は有機基であって、好ましくは連
結しており、そして水素はシス配置である）のジカルボ
ン酸無水物との混合物の反応により製造され、前記反応
は酵素活性の本質的に完全な不活性化を引き起こし；そ
して(b) 段階(a) から得られた反応混合物を、前記酵素
を回復させそしてプライマー伸長生成物の形成を可能に
するのに十分な時間、約50℃より高い温度でインキュベ
ートする；を含んで成る方法に関する。
【００１９】本発明の好ましい態様は、好ましい修飾試
薬を使って修飾された可逆的に不活性化された酵素を使
用する。本発明の或る態様では、インキュベーション段
階(b) が増幅反応の開始前に行われる。別の態様では、
酵素の再活性化を引き起こすインキュベーションが増幅
工程の一体（integral）段階である。例えば、各ＰＣＲ
サイクル中に行われる変性段階が同時に修飾されたＤＮ
Ａポリメラーゼを再活性化させる働きをすることができ
る。
【００２０】本発明の好ましい態様では、増幅反応がポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、そして可逆的に
不活性化された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用す
る。増幅反応を実施する前に、増幅反応のアニーリング
温度より高い温度で反応混合物をインキュベートする。
こうして、温度が増幅反応の特異性を保証する温度より
高くなるまではＤＮＡポリメラーゼが不活性化され、そ
れによって非特異的増幅が削減される。
【００２１】本発明の別の観点は、増幅反応を行うため
の試薬と一緒に本発明の可逆的に不活性化された熱安定
性酵素を含有する増幅反応混合物に関する。好ましい態
様では、増幅反応混合物はＰＣＲを行うためのオリゴヌ
クレオチドプライマーを含有する。本発明の更に別の観
点は、本発明の可逆的に不活性化された熱安定性酵素と
１または複数の増幅試薬とを含んで成るキットに関す
る。本発明の理解を助けるために、幾つかの用語を下記
に定義する。
【００２２】「核酸」と「オリゴヌクレオチド」なる用
語は、プライマー、プローブ、および検出しようとする
オリゴマー断片を指し、ポリデオキシリボヌクレオチド
（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌク
レオチド（Ｄ−リボースを含む）、およびプリンもしく
はピリミジン塩基または修飾されたプリンもしくはピリ
ミジン塩基のＮ−グリコシドである他の任意の形のポリ
ヌクレオチドに対する総称とする。「核酸」と「オリゴ
ヌクレオチド」の用語の間には何ら意図する区別はな
く、それらの用語は互いに交換可能に用いられるだろ
う。それらの用語は分子の一次構造にのみ言及する。よ
って、それらの用語には二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、並
びに二本鎖および一本鎖ＲＮＡが包まれる。オリゴヌク
レオチドは任意の適当な方法により調製することができ
る。合成方法の総説はGoodchild 他,1990, Bioconjugat
e Chemistry 1 (3):165-187 中に与えられている。
【００２３】「ハイブリダイゼーション」なる用語は、
相補的塩基対合によって生じる２つの一本鎖核酸による
二重型構造の形成を意味する。ハイブリダイゼーション
は完全に相補的な核酸鎖の間、または小領域の不正対合
（ミスマッチ）を含む「実質上相補的な」核酸鎖の間で
起こり得る。完全に相補的な核酸鎖のみがハイブリダイ
ズするような条件を「緊縮（stringent ）ハイブリダイ
ゼーション条件」または「配列特異的ハイブリダイゼー
ション条件」と称する。実質上相補的な配列の安定な二
重型は、より低い緊縮ハイブリダイゼーション条件下で
達成することができる。核酸化学技術の熟練者は、当業
界で公知の手引き書に従って（例えばSambrook他, 198
9, 前掲を参照のこと）、例えばオリゴヌクレオチドの
長さと塩基対濃度、イオン強度および不適正塩基対の発
生率を包含する多数の変数を経験的に考慮しながら、二
重型安定性を決定することができる。
【００２４】一般的に、緊縮ハイブリダイゼーション条
件は、限定されたイオン強度とｐＨにおける特異配列の
融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択され
る。Ｔｍは塩基対の50％が解離される（限定されたイオ
ン強度とｐＨの下での）温度である。ハイブリダイゼー
ション条件の緊縮性を緩めると、配列の不正対合が寛容
されるようになるだろう。寛容される不正対合の程度は
ハイブリダイゼーション条件の適当な調整により制御す
ることができる。
【００２５】「プライマー」なる用語は、天然型であろ
うと合成型であろうと、核酸鎖に相補的なプライマー伸
長生成物の合成が誘導される条件下に置いた時に、すな
わち適当な緩衝液中に且つ適当な温度で４種の異なるヌ
クレオシド三リン酸と重合剤（すなわちＤＮＡポリメラ
ーゼまたは逆転写酵素）の存在下に置いた時にＤＮＡ合
成の開始点として働くことができるオリゴヌクレオチド
を指す。オリゴヌクレオチド類似体、例えば「ペプチド
核酸」はプライマーとして働くことができるので、本明
細書中で使用する用語「プライマー」の意味の中に含ま
れる。
【００２６】プライマーは好ましくは一本鎖オリゴデオ
キシリボヌクレオチドである。プライマーの適切な長さ
は該プライマーの意図する用途に依存するが、典型的に
は６〜50ヌクレオチドの範囲である。一般的に、短いプ
ライマー分子は鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体
を形成するのにより低い温度を必要とする。プライマー
は鋳型の配列を正確に反映する必要はないが、鋳型とハ
イブリダイズするのに十分な位に相補的でなければなら
ない。
【００２７】本明細書中で用いる「プライマー伸長」な
る用語は、開始点としてプライマーを使った個々のヌク
レオシド三リン酸の重合から生じるＤＮＡの合成と、該
プライマーを伸長するためのプライマーへの追加のオリ
ゴヌクレオチドの結合の両方を意味する。本明細書中で
用いる時、用語「プライマー伸長」は、以後の増幅サイ
クルにおいて標的として働くことができる更に長鎖の生
成物を形成する２つのオリゴヌクレオチドの連結を包含
する。本明細書中で用いる時、用語「プライマー」は、
近接部位にハイブリダイズする第二のオリゴヌクレオチ
ドの連結によって伸長される連結媒介型増幅方法で使わ
れるオリゴヌクレオチドを包含する。
【００２８】プライマーは、該プライマーの検出または
固定化を考慮に入れているがＤＮＡ合成の開始点として
作用するというプライマーの基本的性質を変えないよう
な追加の特徴を含むことができる。例えば、プライマー
は標的核酸にハイブリダイズしないが増幅生成物のクロ
ーニングを促進する追加の核酸配列を５′末端に含んで
もよい。ハイブリダイズするのに十分な位鋳型に相補的
であるプライマーの領域は本明細書中ではハイブリダイ
ズ領域と呼ばれる。「標的領域」および「標的核酸配
列」なる用語は、増幅しようとする核酸の領域または部
分配列のことを言う。プライマーハイブリダイゼーショ
ン部位はプライマーハイブリダイゼーションのための標
的領域と呼ぶことができる。
【００２９】本明細書中で使用する時、オリゴヌクレオ
チドプライマーは、オリゴヌクレオチドと標的配列との
間に存在する不正対合（ミスマッチ）の数がオリゴヌク
レオチドと試料中に存在しうる非標的配列との間に存在
する不正対合の数よりも少ないならば、標的配列に「特
異的」である。存在する不正対合の数がオリゴヌクレオ
チと標的配列との間に存在する不正対合の数より多くな
い場合にのみ安定な二重型が形成されるハイブリダイゼ
ーション条件を選択することができる。そのような条件
下では、オリゴヌクレオチドは標的配列とのみ安定な二
重型構造を形成することができる。よって、適当に緊縮
な増幅条件下での標的特異的プライマーの使用により、
標的プライマー結合部位を含むそれらの標的配列の特異
的増幅が可能になる。配列特異的増幅条件の使用によ
り、正確に相補的なプライマー結合部位を含むそれらの
標的配列の特異的増幅が可能になる。
【００３０】用語「非特異的増幅」とは、標的配列以外
の配列にハイブリダイズし、次いでプライマー伸長のた
めの基質として働く、プライマーから生じる標的配列以
外の核酸配列の増幅を言う。非標的配列へのプライマー
のハイブリダイゼーションは「非特異的ハイブリダイゼ
ーション」と呼ばれ、これは低温で低緊縮の予備反応条
件の最中に起こり得る。
【００３１】「熱安定性酵素」なる用語は、熱に対して
比較的安定である酵素を指す。熱安定性酵素は、活性の
不可逆的損失を被ることなく修飾基を除去するのに使わ
れる高温インキュベーション、典型的には50℃より高い
温度に耐えることができる。本発明の方法で有用な修飾
された熱安定性酵素としては、熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼおよび熱安定性リガーゼが挙げられる。
【００３２】「熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ」なる用語
は、熱に対して比較的安定であり、且つヌクレオシド三
リン酸の重合を触媒して標的配列の核酸鎖のうちの一方
に相補的であるプライマー伸長生成物を形成する酵素を
言う。該酵素はプライマーの３′末端のところで合成を
開始し、そして合成が終わるまで鋳型の５′方向に進行
する。精製された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、米国
特許第 4,889,818号；米国特許第 5,352,600号；米国特
許第 5,079,352号；WO 91/09950 ；WO 92/03556 ；WO 9
2/06200 ；WO 92/06202 ；米国特許第 5,491,086号；WO
92/09689 ；および米国特許第 5,210,036号中に記載さ
れている。
【００３３】ある生物に「由来する」酵素とは、本明細
書中では、その生物から精製される酵素またはその生物
から精製される酵素の組換え変異体を言い、分子生物学
の技術を使ってアミノ酸配列が変更されている酵素を包
含する。本明細書中で用いる「可逆的に不活性化され
た」という用語は、酵素の共有結合的修飾をもたらす化
合物との反応により不活性化されている酵素であって、
修飾化合物が適当な条件下で除去できる酵素を言う。修
飾化合物の除去と酵素機能の回復をもたらす反応が存在
する限り、該酵素は可逆的に不活性化されると見なされ
る。
【００３４】「反応混合物」なる用語は、与えられた反
応を実施するのに必要な試薬を含有する溶液を言う。
「増幅反応混合物」は増幅反応を実施するのに必要な試
薬を含有する溶液を言い、典型的には、適当な緩衝液中
にオリゴヌクレオチドプライマーとＤＮＡポリメラーゼ
またはリガーゼを含有する。「ＰＣＲ反応混合物」は、
典型的には適当な緩衝液中にオリゴヌクレオチドプライ
マー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、dNTPs および二価
金属カチオンを含有する。
【００３５】反応混合物が該反応を可能にするのに必要
な試薬を全て含有するならばそれは完全と呼ばれ、そし
てそれが必要な試薬のサブセットのみを含有するならば
不完全と呼ばれる。通常は便利性、貯蔵安定性、および
用途に応じて成分の濃度を個別に調節できるようにする
ために、反応成分を各々が全成分のサブセットを含む別
々の溶液として保存すること、更に、反応成分を反応前
に混合して完全な反応混合物を調製することは、当業者
により理解されるところであろう。
【００３６】本発明の方法は、熱活性化熱安定性酵素を
使って増幅反応を行うことを含み、ここで活性酵素はプ
ライマー伸長に必要である。該酵素を活性化する高温イ
ンキュベーションの前には、増幅反応混合物はプライマ
ー伸長を支持せず、且つ伸長生成物、非特異的生成物ま
たは他のものは全く形成されない。該酵素を回復させる
高温インキュベーション後は、反応特異性を保証する高
温で増幅反応が維持される。よって、プライマー伸長生
成物は増幅特異性を保証する条件下でのみ形成される。
【００３７】本発明の方法では、熱活性化酵素はそれの
活性状態でプライマー伸長反応を触媒する。典型的な増
幅反応、例えばＰＣＲで使われる熱活性化熱安定性酵素
は、それの活性状態でＤＮＡポリメラーゼ活性を有す
る。リガーゼ媒介型増幅方法で使われる熱活性化熱安定
性酵素はそれの活性状態でＤＮＡリガーゼ活性を有す
る。
【００３８】リガーゼ媒介型増幅方法では、「伸長生成
物」は第一のオリゴヌクレオチド（本明細書中の用語
「プライマー」に包まれる）の３′末端の近隣にハイブ
リダイズする第二のオリゴヌクレオチドへの第一のオリ
ゴヌクレオチドの連結により形成される。第二のオリゴ
ヌクレオチドはプライマーのすぐ近隣にハイブリダイズ
することができ（この場合、連結のみが要求される）、
またはプライマーから遠く離れた１もしくは複数の塩基
にハイブリダイズすることができる（この場合、連結の
前にプライマーを伸長するポリメラーゼ活性が要求され
る）。どちらの場合でも、標的ＤＮＡの近隣領域にハイ
ブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドの結合は用語
「プライマー伸長」に含まれる。
【００３９】本発明の可逆的に不活性化された熱安定性
酵素は、酵素の可逆的化学修飾を引き起こし、酵素活性
の全部またはほとんど全部の低下をもたらす、酵素と修
飾試薬との反応により製造される。この修飾はタンパク
質への修飾基の共有結合から成る。修飾化合物は、修飾
が増幅反応緩衝液中での高温インキュベーションにより
逆戻りするように選択される。適当な酵素と修飾基につ
いては後述する。
【００４０】活性状態でＤＮＡポリメラーゼ活性を有す
る可逆的に不活性化された酵素は熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼから調製される。増幅反応において有用な熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼは当業界で周知であり、多数の
源、例えばテルムス属、テルモトガ属、テルモコッカス
属、ピロジクチウム属、ピロコッカス属およびテルモシ
フォ属の種からの高温性真正細菌または古細菌から誘導
することができる。
【００４１】ＰＣＲ増幅において有用な熱安定性ＤＮＡ
ポリメラーゼが誘導されている典型的な種としては、テ
ルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）、テル
ムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）、テル
モトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）、ピロジク
チウム・オクルタム（Pyrodictium occultum）、ピロジ
クチウム・アビシイ（Pyrodictium abyssi）およびテル
モシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）が
挙げられる。
【００４２】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは米国特許第
4,889,818 号；米国特許第5,352,600 号；米国特許第5,
079,352 号；WO 91/09950 ；WO 92/03556 ；WO 92/0620
0 ；WO 92/06202 ；米国特許第5,491,086 号；WO 92/09
689 ；および米国特許第5,210,036 号中に記載されてい
る。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはPerkin Elmer社,Nor
walk, CT から市販されている。他の増幅方法、例えば
リガーゼ媒介型増幅での使用に適当な可逆的に不活性化
された熱安定性酵素は、様々な増幅方法を記載した下記
の引用文献中に記載された熱安定性酵素から調製され
る。
【００４３】本発明の方法は例示した酵素の使用に限定
されない。例えば、増幅反応に用いられる文献中に記載
されたどんな熱安定性ＤＮＡポリメラーゼでも、本明細
書中に記載のように修飾して本発明の方法での使用に適
当な可逆的に不活性化された酵素を製造することができ
る。一般に、プライマー伸長を触媒するか、またはプラ
イマー伸長が起こるのに必要とされ、且つ不可逆的に不
活性化されてしまうことなく高温回復インキュベーショ
ンに耐えるほど十分に熱安定性であり、且つ本明細書中
に記載のように修飾して可逆的に不活性化された酵素を
製造することができるどんな酵素も、当該方法に用いる
ことができる。当業者は、本明細書中の教示に基づい
て、修飾反応条件および増幅反応条件を任意の一定の酵
素について最適化することができるだろう。
【００４４】本発明の好ましい態様では、熱安定性酵素
の可逆的不活性化は、リジン残基のε−アミノ基の化学
修飾によるリジン残基の可逆的ブロックにより行われ
る。タンパク質の活性領域中のリジンの修飾は該タンパ
ク質の不活性化を引き起こす。その上、活性領域の外側
のリジンの修飾も、立体的相互作用またはコンホメーシ
ョン変化を通してタンパク質の不活性化に貢献するかも
しれない。可逆的方法でアミノ基と反応する多数の化合
物が文献中に記載されている。
【００４５】例えば、アミノ基は、トリフルオロアセチ
ル化（GoldbergerおよびAnfinsen,1962, Biochemistry
1:410参照）、アミジノ化（HunterおよびLudwig, 1962,
J.Amer. Chem. Soc. 84:3491 参照）、マレイル化（Bu
tler他, 1967, Biochem. J. 103:78参照）、アセトアセ
チル化（Marzotto他, 1967, Biochem. Biophys. Res. C
ommun. 26:517およびMarzotto他, 1968, Biochim. Bio
phys. Acta 154: 450参照）、テトラフルオロスクシニ
ル化（Braunitzer他, 1968, Hoppe-Seyler'sZ. Physio
l. Chem. 349: 265参照）、およびシトラコニル化（Dix
on およびPerham, 1968, Biochem. J. 109:312-314 ；
並びにHabeebおよびAtassi, 1970, Biochemistry 9 (2
5): 4939-4944 参照）により可逆的に修飾されている。
【００４６】リジン残基のε−アミノ基の化学修飾のた
めの好ましい試薬は、一般式
【化９】 （上式中、Ｒ1 とＲ2 は水素または有機基であり、互い
に連結していてもよい）または一般式
【化１０】 （上式中、Ｒ1 とＲ2 は有機基であって、好ましくは連
結しており、そして水素はシス配置である）のジカルボ
ン酸無水物である。
【００４７】前記有機基は炭素−炭素結合によって、ま
たは炭素−ヘテロ原子結合、例えば炭素−酸素、炭素−
窒素もしくは炭素−硫黄結合を通して、環に直接取り付
けられてもよい。前記有機基は、例えば３，４，５，６
−テトラヒドロフタル酸無水物の場合のように、互いに
連結して環構造を形成してもよい。
【００４８】ジカルボン酸無水物は、シトラコン酸無水
物について図１中に示されるように、タンパク質のアミ
ノ基と反応して対応するアシル化生成物を与える。上記
ジカルボン酸無水物の可逆性は、アミド基との相互作用
およびその後の脱アシルに適当な空間的配向にアシル化
残基の末端カルボキシル基を維持する、シス−炭素−炭
素二重結合またはシス水素のいずれかの存在によって増
強されると思われる。アシル化反応と脱アシル反応の両
方の尤もらしい機構の記載についてはPalacian他, 199
0, Mol. Cell. Biochem. 97:101-111を参照のこと。他
の置換基も同様にアシル化生成物中のアシル成分の２，
３−結合の周りの回転を制限することができ、そのよう
な化合物は本発明の方法において機能すると予想され
る。
【００４９】好ましい試薬の例としては、無水マレイン
酸；置換された無水マレイン酸、例えばシトラコン酸無
水物、シス−アコニット酸無水物および２，３−ジメチ
ルマレイン酸無水物；エキソ−シス−３，６−エンドオ
キソ−Δ4 −テトラヒドロフタル酸無水物；並びに３，
４，５，６−テトラヒドロフタル酸無水物が挙げられ
る。これらの試薬は例えばAldrich Chemical Co. (Milw
aukee, WI), Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)また
はSpectrum Chemical Mfg. Corp. (Gardena, CA)から市
販されている。置換された無水マレイン酸試薬であるシ
トラコン酸無水物およびシス−アコニット酸無水物を使
った熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの修飾は下記の実施例
に記載される。
【００５０】上記試薬を使ってアシル化されたアミノ基
の相対安定度は、次の順序で減少する：無水マレイン
酸；エキソ−シス−３，６−エンドオキソ−Δ4 −テト
ラヒドロフタル酸無水物；シトラコン酸無水物；３，
４，５，６−テトラヒドロフタル酸無水物；シス−アコ
ニット酸無水物；および２，３−ジメチルマレイン酸無
水物（Palacian他，前掲を参照のこと）。特定の試薬を
使って修飾された酵素についての最適活性化インキュベ
ーション条件は、下記の実施例の部に記載されるように
して経験的に決定される。
【００５１】米国特許第 5,262,525号は、無水マレイン
酸とジエンとのDiels-Alder 反応により調製されたジカ
ルボン酸無水物である化合物を使用するタンパク質の化
学修飾方法を記載している。本明細書中に明記された安
定性を有する第5,262,525 号特許明細書中に記載された
化合物は本発明において適当かもしれない。
【００５２】本発明の方法は、例示された修飾化合物ま
たはリジン残基の化学修飾によるタンパク質の修飾に限
定されない。酵素活性の全部またはほとんど全部の可逆
的低下を引き起こすようにタンパク質と反応し、該修飾
が増幅反応緩衝液中での高温でのインキュベーションに
より可逆的である、文献中に記載された化合物のいずれ
も、可逆的に不活性化された酵素の調製に適当である。
可逆的にタンパク質を修飾する新規化合物が利用可能に
なれば、それらもまた本発明の方法での使用に適当であ
ろう。よって、本発明の修飾された熱安定性酵素の調製
のための化合物は、次の特性を満たす化合物である：
【００５３】(1) プライマー伸長を触媒する熱安定性酵
素との反応が該酵素の有意な不活性化を引き起こす； (2) 約ｐＨ＝８〜９の水性緩衝液中での約室温（25℃）
またはそれ以下の温度での修飾された酵素のインキュベ
ーションが、約20分未満で酵素活性の有意な増加を全く
引き起こさない；および (3) 室温で約ｐＨ＝８〜９に調整された増幅反応緩衝液
中での約50℃より高い高温での修飾された熱安定性酵素
のインキュベーションが、約20分未満で酵素活性の少な
くとも２倍の増加を引き起こす。
【００５４】特定の修飾化合物の適切性は、通常は本明
細書中に与えられる教示に従って経験的に決定すること
ができる。上記性質、タンパク質の修飾から生じる酵素
活性の低下の度合い、および増幅反応混合物中での高温
でのインキュベーション後の酵素活性の回復の度合いを
測定する実験手順は、下記の実施例の部において記載さ
れる。
【００５５】可逆的に不活性化された熱安定性酵素の調
製 タンパク質中のリジン残基の化学修飾は、求核試薬と反
応するこの残基のε−アミノ基の能力に基づいている。
非プロトン化形アミノ基は反応性形態であり、これには
アルカリ性ｐＨが有利である。修飾反応は水性緩衝液中
でpH 8.0〜9.0で室温（25℃）またはそれより低い温度
で実施される。この反応は、12〜24時間のインキュベー
ション後に本質上完全である。適当な反応条件は当業界
において周知であり、下記実施例中に更に記載される。
【００５６】ジカルボン酸無水物は水と容易に反応して
対応する酸を与える。従って、タンパク質アミノ基の修
飾の間に試薬の大部分が加水分解される。加水分解の速
度はｐＨと共に増加する。約９より高いｐＨにおいて起
こる加水分解の増加は、タンパク質の次善的アシル化を
引き起こし得る。
【００５７】一般に、タンパク質に関してモル過剰量の
修飾試薬がアシル化反応に使われる。修飾試薬対酵素の
最適モル比は使用する試薬に依存し、経験的に決定され
る。一例として、Taq ＤＮＡポリメラーゼは、20倍また
はそれ以上のモル過剰量のシトラコン酸無水物との反応
により本質上完全に不活性化される（元の活性の＜５
％）。酵素の本質上完全な不活性化を引き起こす修飾試
薬の最小モル比は、実施例中に記載されるように、修飾
試薬の希釈系列を使って不活性化反応を実施することに
より決定することができる。
【００５８】本発明の方法では、酵素が完全に不活性化
されることは必要でなく、酵素が有意に不活性化される
ことのみが必要である。本明細書中で使用する時、修飾
試薬との反応後の酵素の活性が元の活性の約50％未満で
あれば、酵素は有意に不活性化される。有意に不活性化
された酵素を使って非特異的増幅の減少を獲得すること
ができる。反応中の修飾試薬対酵素のモル比は、本明細
書中に与えられる教示に従って酵素の本質上完全な不活
性化または有意な不活性化のいずれかを引き起こすよう
に経験的に選択することができる。適当なモル比は実施
例中に与えられる。例示されていない酵素の不活性化の
ための適当な反応条件は、本明細書中に与えられる教示
に従って常用実験により決定することができる。
【００５９】本発明の熱不活性化酵素の重要な観点はそ
れらの貯蔵安定性である。一般に、本明細書中に記載さ
れる化合物は長期間安定であり、各々を使用の直前に調
製する必要性を排除する。例えば、シトラコニル化Taq
ＤＮＡポリメラーゼは、25℃で貯蔵した時少なくとも４
週間不活性のままであることがわかった。推奨される貯
蔵条件は、どの修飾試薬を使用するかに依存して異なる
が、一般に不活性化された酵素の調製物は室温（25℃）
またはそれ以下で、好ましくは冷凍保存すべきである。
特に、より不安定な修飾された酵素、例えば２，３−ジ
メチルマレイン酸無水物を使って修飾された酵素は、冷
凍保存すべきである。
【００６０】本発明の方法は、可逆的に不活性化された
熱安定性酵素を含有する反応混合物を使用し、そして該
反応混合物を増幅反応の前にまたは一体的な部分として
高温インキュベーションにかけることを含む。この高温
インキュベーションは、アミノ基の脱アシルと酵素活性
の回復をもたらす。
【００６１】修飾されたアミノ基の脱アシルは、温度の
上昇と付随するｐＨの減少の両方から生じる。増幅反応
は典型的には室温で8.0 〜9.0 のｐＨに調整されたTris
-HCl緩衝液中で行われる。室温では、アルカリ性反応緩
衝液条件がアミノ基のアシル化形に有利である。反応緩
衝液のｐＨは室温で8.0 〜9.0 のｐＨに調整されている
が、温度の上昇と共にTris-HCl反応緩衝液のｐＨは低下
する。よって、増幅反応が行われる高温、特に、活性化
インキュベーションが行われる高温では反応緩衝液のｐ
Ｈは低下する。反応緩衝液のｐＨの低下はアミノ基の脱
アシルに有利である。
【００６２】高温反応条件に起因して起こるｐＨの変化
は、使用する緩衝液に依存する。生物学的反応に使われ
る様々な緩衝液についてのｐＨの温度依存性は、Good
他, 1966, Biochemistry 5 (2):467-477 中に報告され
ている。Tris緩衝液の場合、ｐＫａ、即ち緩衝領域の中
間点のｐＨは、次のように温度に関係がある：ΔｐＫａ
／℃＝−0.031 。例えば、25℃で作製したTris-HCl緩衝
液は、活性化インキュベーションのために95℃に上げら
れると2.17のｐＫａの降下をする。
【００６３】増幅反応は典型的にはTris-HCl緩衝液中で
行われるけれども、温度によるｐＨの変化がより小さい
または大きい緩衝液中で行ってもよい。使用する緩衝液
に応じて、より安定性の大きいまたは小さい修飾された
酵素が望ましいかもしれない。例えば、緩衝液のｐＨの
より小さな変化の下での十分な酵素活性の回復を考慮に
入れて、より不安定な修飾された酵素をもたらす修飾試
薬が使われる。上記に与えたような様々な試薬により修
飾された酵素の相対安定度の経験的比較は、特定の緩衝
液中での使用に適当な修飾された酵素の選択の手引きと
なる。
【００６４】本発明の方法では、修飾された酵素の活性
化は、増幅特異性を保証するために増幅反応で使われる
プライマーハイブリダイゼーション（アニーリング）温
度に等しいかまたはそれより高い温度で行われるインキ
ュベーションによって達成される。酵素活性の回復に必
要とされるインキュベーション時間の長さは、反応混合
物の温度およびｐＨ並びに酵素のアシル化アミノ基の安
定性に依存し、前記安定性は修飾された酵素の調製に使
われる修飾試薬に依存する。広範囲のインキュベーショ
ン条件が有用であり；最適条件は各反応ごとに実験的に
決定される。一般に、インキュベーションは増幅反応緩
衝液中で約50℃より高い温度で約10秒〜約20分行われ
る。例示されない酵素の回復のための、または例示され
ない反応混合物のための最適インキュベーション条件
は、本明細書中に与えられる教示に従って常用の実験に
より決定することができる。
【００６５】好ましい態様では、ＰＣＲ増幅は可逆的に
不活性化された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使って行
われる。ＰＣＲ増幅で使われるアニーリング温度は典型
的には約55〜75℃であり、そして予備反応インキュベー
ションはアニーリング温度に等しいかまたはそれより高
い温度、好ましくは約90℃より高温で行われる。温度循
環の前にＤＮＡポリメラーゼを再活性化（回復）させる
ために好ましくは約90〜100 ℃で約12分間まで増幅反応
混合物がインキュベートされる。典型的なＰＣＲ増幅の
場合の適当な予備反応インキュベーション条件は、予備
反応インキュベーション条件を変えることの増幅に対す
る影響と共に実施例に記載される。
【００６６】典型的なＰＣＲ増幅の第一段階は二本鎖標
的核酸の熱変性から成る。試料核酸の変性に要求される
正確な条件は、試料核酸の長さと組成に依存する。典型
的には、90〜100 ℃で約10秒間から約４分間までのイン
キュベーションが、試料核酸を十分に変性させるのに効
果的である。初期変性段階は、ＤＮＡポリメラーゼを再
活性化（回復）させるための予備反応インキュベーショ
ンとして働くことができる。しかしながら、初期変性段
階の長さと温度、並びにＤＮＡポリメラーゼを再活性化
（回復）させるのに使う変性試薬によっては、ＤＮＡポ
リメラーゼ活性の再活性化（回復）が不完全かもしれな
い。酵素活性の最大の再活性化（回復）が所望であるな
らば、予備反応インキュベーションを延長してもよく、
あるいはまた、増幅サイクルの数を増やすことができ
る。
【００６７】本発明の好ましい態様では、修飾された酵
素と初期変性条件は、再活性化（回復）可能な酵素活性
の一部分が初期インキュベーション段階中に再活性化
（回復）されるように選択される。各々が高温変性段階
を含むＰＣＲのその後のサイクルは酵素活性の更なる再
活性化（回復）を引き起こす。よって、酵素活性の再活
性化（回復）は増幅の初期サイクルを過ぎて遅延され
る。このＤＮＡポリメラーゼ活性の「徐放」（time rel
ease）が非特異的増幅を更に減少させることが観察され
た。過剰のＤＮＡポリメラーゼ活性が非特異的増幅に寄
与することは知られている。
【００６８】本発明の方法では、標的配列の数が小さい
増幅の初期段階の間はＤＮＡポリメラーゼ活性の量が低
く、形成される非特異的伸長生成物の量を減少させる。
最大ＤＮＡポリメラーゼ活性は、標的配列の数が大きい
増幅の後期段階の間に存在し、高い増幅効率を可能にす
る。必要ならば、初期サイクル中に存在するＤＮＡポリ
メラーゼ活性の少量を埋め合わせるために増幅サイクル
の数を増加させることができる。増幅サイクル数を増加
させることの増幅に対する影響は下記実施例中に示され
る。
【００６９】本発明の方法の利点は、当該方法が反応混
合物の最初の調製の後に反応混合物の操作を全く必要と
しないことである。よって、当該方法は、初期変性段階
後の試薬の添加またはワックスバリヤーの使用が不都合
または実行不可能であるような自動増幅方法やその場で
の増幅方法での使用に理想的である。
【００７０】本発明の方法はＰＣＲにおける非特異的増
幅の削減に特に適当である。しかしながら、本発明はい
ずれかの特定の増幅方法に限定されない。本発明の可逆
的に不活性化された酵素は、熱安定性酵素を使用し且つ
増幅特異性を得るのに反応温度に頼っている任意のプラ
イマーベースの増幅方法に使用することができる。本発
明の方法は熱安定性酵素を使用する等温増幅方法に適用
することができる。酵素活性を回復させるのに高温での
一時的インキュベーションだけが必要である。酵素活性
を回復させるために反応混合物を高温インキュベーショ
ンにかけた後は、適当な反応温度で反応を行うことがで
きる。
【００７１】ＰＣＲ（米国特許第 4,683,195号；同第
4,683,202号；同第 4,683,202号；および同第 4,965,18
8号）に加えて、他の増幅方法として限定的でなく次の
ものが挙げられる：リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ，Wuおよ
びWallace, 1989, Genomics 4:560-569 並びにBarany,
1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193）；ポ
リメラーゼ−リガーゼ連鎖反応（Barany, 1991, PCR Me
thods and Applic. 1:5-16）； Gap−ＬＣＲ（ＰＣＴ特
許公報第 WO 90/01069号）；修復連鎖反応（ヨーロッパ
特許公報第439,182 A2号）；３ＳＲ（Kwoh他, 1989, Pr
oc. Natl. Acad.Sci. USA 86:1173-1177；Guatelli他,
1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878；
ＰＣＴ特許公報第 WO 92/08800号）；およびＮＡＳＢＡ
（米国特許第 5,130,238号）が挙げられる。本発明はい
ずれかの特定の増幅方法に限定されない。他の方法が開
発された時には、それらの方法は本発明の実施により恩
恵を受けるだろう。増幅方法の最近の概説はAbramsonお
よびMyers, 1993, Current Opinion in Biotechnology
4: 41-47に発表されている。
【００７２】各増幅反応に適当な試料調製方法は技術の
現状において記載されている（例えば、Sambrook他, 前
掲、および上記に挙げた増幅方法を記載している文献を
参照のこと）。標的配列のＰＣＲ増幅用の単純且つ迅速
な試料調製方法は Higuchi,1989, PCR Technology（Erl
ich編, Stockton Press, New York）中、およびPCRProt
ocols, 18-20章中（Innis 他編, Academic Press, 199
0）中に記載されている。当業者は適当なプロトコール
を選択しそして経験的に最適化することができるだろ
う。
【００７３】増幅生成物の検出方法は文献中に広く記載
されている。標準法としては、ゲル電気泳動による分析
またはオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼ
ーションによる分析が挙げられる。増幅された核酸とプ
ローブとの間で形成されたハイブリッドの検出は、ドッ
トブロットアッセイ方式および逆ドットブロットアッセ
イ方式をはじめとする様々な方式で実施することができ
る〔Saiki 他, 1986,Narure 324: 163-166 ; Saiki他,
1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230 ; PCT
特許公報第 WO 89/11548号；米国特許第 5,008,182号お
よび同第 5,176,775号；PCR Protocols: A Guide to Me
thods and Applications (Innis 他編,Academic Press,
San Diego, CA):337-347を参照のこと。〕。マイクロ
ウエルプレートを使った逆ドットブロット法は、同時係
属米国特許出願第 141,355号（EP-A-420260 に対応）；
米国特許第 5,232,829号；Loeffelholz 他, 1992, J. C
lin. Microbiol. 30(11):2847-2851；Mulder他, 1994,
J. Clin. Microbiol. 32(2):292-300 ；およびJackson
他, 1991, AIDS 5:1463-1467 中に記載されている。
【００７４】５′−ヌクレアーゼアッセイと呼ばれる別
の適当なアッセイ法は米国特許第 5,210,015号；および
Holland 他, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7
276-7280に記載されている。この５′−ヌクレアーゼア
ッセイでは、標識されたプローブがＤＮＡポリメラー
ゼ、例えばTaq ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エキソ
ヌクレアーゼ活性によりプライマー伸長と同時に分解さ
れる。プローブ分解生成物の検出は、プローブと標的Ｄ
ＮＡとのハイブリダイゼーションが起こったことと増幅
反応が起こったことの両方を示す。米国特許第 5,491,0
63号（EP-A-699,768に対応）とEP-A-713,921は、増幅に
付随して起こるプローブの分解を検出するための改良方
法を記載している。
【００７５】反応混合物中の二本鎖ＤＮＡの総量の増加
をモニタリングすることにより核酸の増幅を検出する別
の方法が、Higuchi 他, 1992, Bio/Technology 10:413
-417; Higuchi他, 1993, Bio/Technology 11:1026-103
0 ;並びにヨーロッパ特許公報第487,218 号および同第5
12,334 号に記載されている。この二本鎖標的ＤＮＡの
検出は、臭化エチジウム（EtBr）や他のＤＮＡ結合標識
物質が二本鎖ＤＮＡに結合した時に示す蛍光の増加を当
てにしている。標的配列の合成に起因する二本鎖ＤＮＡ
の増加が検出可能な蛍光の増加を引き起こす。この方法
の問題点は、非標的配列の合成、即ち非特異的増幅が蛍
光の増加を引き起こし、それが標的配列の合成に起因す
る蛍光の増加の測定を妨害することである。よって、本
発明の方法は、それらが非特異的増幅を削減し、それに
よって非標的配列の増幅に起因する蛍光の増加を最小に
するので、特に有用である。
【００７６】本発明は、本発明の方法を実施するのに有
用な成分を含んで成る多容器ユニットであるキットにも
関する。有用なキットは、可逆的に不活性化された熱安
定性酵素および増幅反応を実施するための１または複数
の試薬、例えばヌクレオチドプライマー、基質ヌクレオ
シド三リン酸、補因子、並びに適当な緩衝液を含有す
る。本発明の実施例を下記に記載するが、これは例示目
的にのみ与えられるのであって本発明の範囲を制限する
ためではない。上記説明や下記実施例を読むことから、
特許請求の範囲内に含まれる本発明の多数の実施態様が
当業者に明白になるであろう。
【００７７】
【実施例】実施例１：ポリメラーゼ活性アッセイ 下記実施例中に記載するＤＮＡポリメラーゼ活性の測定
は全て、次のＤＮＡポリメラーゼ活性を使って実施し
た。該アッセイは、本質的にはLawyer他, 1989,J. Bio
l. Chem. 264: 6427-6437、およびAmpliTaq（登録商
標）ＤＮＡポリメラーゼ製品説明書（Perkin Elmer, No
rwalk, CT ）（両者は参考として本明細書中に組み込ま
れる）中に記載された通りである。
【００７８】酵素活性の１単位は、74℃で10分のインキ
ュベーションで酸不溶性材料中に30分あたり10ナノモル
のdNTPs を取り込むであろう量として定義される。修飾
された酵素の不安定性のため、50℃で活性を測定し、74
℃で同様に測定した標準TaqＤＮＡポリメラーゼ溶液に
対して標準化した。反応は次の試薬を含有する50μl容
量において実施した：
【００７９】25 mM TAPS〔トリス（ヒドロキシメチル）
メチルアミノプロパンスルホン酸、ナトリウム塩〕, pH
9.3（室温で）；50 mM KCl ；2 mM MgCl2；1 mM β−
メルカプトエタノール；各々200 μM のdATP, dGTPおよ
びdTTP；100 μM 〔α−32Ｐ〕−dCTP（0.05〜0.1 Ci／
ナノモル）；活性化されたサケ精子ＤＮＡ。
【００８０】実施例２：Taq ＤＮＡポリメラーゼのシト
ラコニル化 この実施例は、シトラコン酸無水物を使ったTaq ＤＮＡ
ポリメラーゼの修飾を記載する。ＤＮＡポリメラーゼ活
性の完全な不活性化を得るのに必要とされる不活性化反
応での修飾剤対酵素のモル比を示すシトラコニル化Taq
ＤＮＡポリメラーゼの活性の測定については、下記実施
例３に記載する。
【００８１】Taq ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaqR , Pe
rkin Elmer, Norwalk, CT ）は1.3mg／mlの初濃度で使
用した。初期実験では、まずTaq ＤＮＡポリメラーゼを
容量で1000倍過剰の0.1 Ｍホウ酸ナトリウム, pH 8.63
に対して透析した。この段階は重要でないことがわかっ
たので、後期実験では、Taq ＤＮＡポリメラーゼをホウ
酸ナトリウムに対して透析せずにそのままTris緩衝液
（50 mM Tris-HCl, 1 mMEDTA, 65 mM KCl, pH 7.5）中
で使用した。シトラコン酸無水物（11.06 Ｍ）は市販さ
れている（Aldrich, Milwaukee, WI）。シトラコン酸無
水物の出発溶液は、11.06 Ｍシトラコン酸無水物をＤＭ
Ｆ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）中に100 倍希釈す
ることにより作製した。
【００８２】修飾反応の１セット目では、ＤＭＦ中での
繰り返し倍々希釈によりシトラコン酸無水物の希釈系列
を作製した。この系列の各溶液について、４μl のシト
ラコン酸無水物希釈溶液を400 μl のTaq ＤＮＡポリメ
ラーゼ溶液（ホウ酸ナトリウム透析したもの）に添加
し、約80/1, 40/1, 20/1および10/1のシトラコン酸無水
物対Taq ＤＮＡポリメラーゼのモル比を含有する溶液を
得た。これらの溶液を４℃で一晩インキュベートしてTa
q ＤＮＡポリメラーゼを不活性化した。本明細書中で
は、Ｎ倍モル過剰の修飾剤との反応で修飾された酵素を
Ｎ×酵素と呼ぶことにする。従って、得られたシトラコ
ニル化Taq ＤＮＡポリメラーゼは、本明細書中80×，40
×，20×および10×Taq ＤＮＡポリメラーゼと呼ばれ
る。
【００８３】約80×，160 ×および240 ×モル比のシト
ラコン酸無水物対Taq ＤＮＡポリメラーゼ（ホウ酸ナト
リウム透析しないもの）を使って、追加の修飾反応を実
施した。160 ×と240 ×モル比は、11.06 Ｍシトラコン
酸無水物の出発希釈液をＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミド）中で適当に希釈調整することにより調製し
た。例えば、最終160 ×比の場合は、11.06 Ｍシトラコ
ン酸無水物をＤＭＦ中で1/50希釈し、得られたシトラコ
ン酸無水物出発溶液の４μl を400 μl のTaq ＤＮＡポ
リメラーゼ溶液に添加した。得られたシトラコニル化Ta
q ＤＮＡポリメラーゼは、本明細書中では240 ×，160
×および80×Taq ＤＮＡポリメラーゼと呼ばれる。
【００８４】実施例３：シトラコン酸無水物を使ったＤ
ＮＡポリメラーゼ活性の不活性化と熱再活性化（回復） この実施例は、高温インキュベーションによるシトラコ
ニル化Taq ＤＮＡポリメラーゼの再活性化の前後の実施
例２のシトラコニル化Taq ＤＮＡポリメラーゼの活性測
定を記載する。シトラコニル化Taq ＤＮＡポリメラーゼ
の熱再活性化（回復）後に再活性化（回復）される活性
の量に対するｐＨの影響を測定した。
【００８５】シトラコニル化Taq ＤＮＡポリメラーゼの
試料を、10 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0.
5 ％ Tween 20, 0.5％ NP-40, 16％グリセロールから成
る緩衝液中で1/200 希釈した。この緩衝液のｐＨは室温
で8.25であった。シトラコニル化Taq ＤＮＡポリメラー
ゼの希釈試料を90℃で20分間インキュベートするか、ま
たは対照として室温に維持した。処理後、試料を酵素希
釈緩衝液（25 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM β−メル
カプトエタノール, 0.5 ％ TweenTM 20, 0.5％NP-40,
0.1 ％ゼラチン）中で1/5 希釈し、そして実施例１に記
載した通りに活性を測定した。処理後のＤＮＡポリメラ
ーゼ活性を下記に示す。モル比は、修飾反応で使用した
シトラコン酸無水物：Taq ＤＮＡポリメラーゼのモル比
である。各々の活性は二重反復試料から測定した２つの
活性の平均である。
【００８６】
【表１】
【００８７】Taq ＤＮＡポリメラーゼの完全な不活性化
は、20倍より高いモル過剰のシトラコン酸無水物を使っ
て得られた。完全に不活性化されたTaq ＤＮＡポリメラ
ーゼの90℃での20分間のインキュベーション後、最低で
16％の活性が回復された。80×シトラコニル化Taq ＤＮ
Ａポリメラーゼを使った時よりも40×シトラコニル化Ta
q ＤＮＡポリメラーゼを使った時の方がより多くの酵素
活性が回復されたけれども、商品キット中では製造許容
差を大きくするために80×（またはそれより高い）シト
ラコニル化Taq ＤＮＡポリメラーゼを使用することがよ
り一層実用的かもしれない。
【００８８】室温でpH 7.75 に調整された緩衝液を使っ
て同様な実験を実施した。結果を下記に示す。
【表２】 回復されたＤＮＡポリメラーゼ活性の量は低ｐＨの方が
大きかった。
【００８９】80×および160 ×Taq ＤＮＡポリメラーゼ
（ホウ酸ナトリウム透析しないもの）の活性を、上記と
本質的に同じ高温インキュベーションによる再活性化の
前後に測定した。インキュベーションに使った緩衝液の
ｐＨは室温で8.0 であった。結果を下記に示す。各々の
活性は二重反復試料から測定した２つの活性の平均であ
る。
【００９０】
【表３】 再活性化に対するｐＨの影響は、80×Taq ＤＮＡポリメ
ラーゼを使って異なるｐＨでの３つの再活性化から回復
された活性を比較することにより更に調べることができ
る。上記データは、修飾反応において高モル過剰の修飾
試薬を使った時でも、酵素活性が回復されることを指摘
する。
【００９１】実施例４：シトラコニル化Taq ＤＮＡポリ
メラーゼを使ったＰＣＲ増幅 この実施例はＰＣＲ増幅における実施例２に記載のシト
ラコニル化Taq 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの使用を記
載する。
【００９２】ＰＣＲプロトコール 増幅は、実施例２に記載の240 ×修飾されたTaq ＤＮＡ
ポリメラーゼの1/20,1/40および1/80希釈液を使って実
施した。希釈液は20 mM Tris-HCl, pH 8.0（室温で）,
100 mM KCl, 0.1 mM EDTA （エチレンジアミン四酢
酸）, 1 mM DTT（ジチオスレイトール）, 50％グリセロ
ール, 0.5 ％ Tween 20, 0.5％ Nonidet P40(AmpliTaq
R 保存用緩衝液, Perkin Elmer, Norwalk, CT ）から成
る緩衝液中に作製した。比較のため、未修飾のTaq ＤＮ
Ａポリメラーゼの1/10, 1/20, 1/40および1/80希釈液を
使って同様に増幅を実施した。
【００９３】プライマー SK432とSK111 を使ってクロー
ン化HTLV-Iゲノム配列を増幅させた。これらのプライマ
ー配列は米国特許第 5,418,149号（参考として本明細書
中に組み込まれる）中に与えられている。ＰＣＲは次の
反応条件下で100 μl の反応容量において実施した。
【００９４】反応混合物： 30コピーのHTLV-I DNA鋳型 10 mM Tris, pH 8.3 50 mM KCl 0.5 μM の各プライマー 200 μM dATP, dCTP およびdGTP 400 μM dUTP 0.5 μl のシトラコニル化Taq ＤＮＡポリメラーゼ溶液 2.5 mM MgCl2 1 ngのhpＤＮＡ １単位のＵＮＧ (Perkin Elmer, Norwalk, CT)
【００９５】
【００９６】増幅生成物は、１×ＴＢＥ（0.089 M Tri
s, 0.089 M ホウ酸, 0.0025 M EDTA二ナトリウム）泳動
緩衝液を使った４％アガロースゲル電気泳動により分析
した。電気泳動は100 ボルトで約２時間実施した。電気
泳動後に臭化エチジウム（0.5 μg/ml）を添加して存在
する全てのＤＮＡを染色した。ゲルを１×ＴＢＥ中で脱
色し、臭化エチジウムで染色されたＤＮＡバンドをＵＶ
照射により視覚化した。
【００９７】結果 結果を図２に与える。増幅された標的配列に相当するバ
ンドが示される。増幅された標的配列に相当するバンド
以外のゲル上に現れるバンドは、非標的配列の非特異的
増幅により生じた生成物である。シトラコニル化Taq Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（標識Taq, HS ）を使った増幅の効果
は、各レーン内のバンドのパターンと強度を比較するこ
とにより知ることができる。非特異的生成物の増幅は標
的配列の増幅と競合するため、標的配列の増幅の増加は
非特異的増幅の減少の量を更に示す。よって、各レーン
内の生成物の相対量の変化は、非特異的増幅に対する予
備反応処理の効果を最もよく示す。
【００９８】未修飾のTaq ＤＮＡポリメラーゼを使った
増幅は、圧倒的に非特異的増幅生成物をもたらした。シ
トラコニル化Taq ＤＮＡポリメラーゼの使用は、増幅さ
れた標的配列に相当するバンドの強度の有意な増加と、
非標的増幅生成物に相当するバンドの強度の有意な減少
をもたらした。このデータは、可逆的に不活性化された
ＤＮＡポリメラーゼを使ったＰＣＲ増幅が非特異的増幅
を有意に減少させ且つ目的とする増幅された標的配列の
量を有意に増加させることを示す。
【００９９】実施例５：他のシトラコニル化熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ この実施例は、上記のTaq ＤＮＡポリメラーゼに加えて
幾つかの他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのシトラコニ
ル化を記載する。次の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを修
飾した： 1) WO 91/09950 （本明細書中に参考として組み込まれ
る）中に記載されたテルムス・テルモフィラス（Thermu
s thermophilus）由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
（rTth, Perkin Elmer, Norwalk, CT ）。
【０１００】2) WO 92/03556 （本明細書中に参考とし
て組み込まれる）中に記載されたテルモトガ・マリチマ
（Thermotoga maritima）由来の熱安定性変異型ＤＮＡ
ポリメラーゼ（UlTma TM, Perkin Elmer, Norwalk, CT
）。 3) WO 92/06200 （本明細書中に参考として組み込まれ
る）中に記載された、３′→５′エキソヌクレアーゼ活
性を欠くテルムス・アクアティカス（Thermusaquaticu
s）由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの変異型。この
酵素は本明細書中ではTaq CSまたはAmpliTaqR CSと呼ば
れる。
【０１０１】上記３つのＤＮＡポリメラーゼの各々につ
いて、200 単位／μl のおよその濃度の出発溶液を調製
した。比較のため、前の実施例で使用した1.3 mg/ml の
TaqＤＮＡポリメラーゼは、およそ260 単位／μl に等
しい。各ＤＮＡポリメラーゼを本質的に実施例２に記載
した通りに修飾した。10μl のシトラコン酸無水物を50
0 μl のＤＭＦ中で希釈した。次いで10μl の希釈シト
ラコン酸無水物を1000μl の各酵素溶液と混合した。生
じた溶液を４℃で一晩インキュベートした。
【０１０２】実施例６：シトラコニル化ＤＮＡポリメラ
ーゼを使ったＰＣＲ増幅 この実施例は、ＰＣＲ増幅における実施例２および５に
記載のシトラコニル化熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの使
用を記載する。ＰＣＲプロトコール 増幅は修飾されたＤＮＡポリメラーゼの希釈液を使って
実施した。希釈液は20mM Tris-HCl, pH 8.0（室温で）,
100 mM KCl, 0.1 mM EDTA （エチレンジアミン四酢
酸）, 1 mM DTT（ジチオスレイトール）, 50％グリセロ
ール, 0.5 ％ TweenTM 20, 0.5％ Nonidet P40 (AmpliT
aqR 保存用緩衝液, Perkin Elmer, Norwalk, CT ）から
成る緩衝液中に作製した。
【０１０３】プライマー SK145とSK431 (Perkin Elmer,
Norwalk, CT) を使って HIV-1ゲノム配列を増幅させ
た。プライマー SK 145 とSK 431は米国特許第 5,418,1
49号中と次の科学文献中に記載されている。SK 145はKw
ok他, 1990, Nucleic Acids Res. 18:999-1005 に記載
されており；SK 431はJackson 他, 1991, AIDS 5: 146
3-1467に記載されている。ＰＣＲは次の反応条件下で10
0 μl の反応容量において実施した。
【０１０４】反応混合物： 100 コピーのHIV-1 DNA 鋳型 10 mM Tris, pH 8.3 50 mM KCl 0.5 μM の各プライマー 200 μM dATP, dCTPおよびdGTP 400 μM dUTP 0.5 μl のＤＮＡポリメラーゼ溶液 2.5 mM MgCl2 １μg のhpＤＮＡ １単位のＵＮＧ (Perkin Elmer, Norwalk, CT)
【０１０５】
【０１０６】予備反応インキュベーション段階は初期変
性段階としても役立つ。初期変性段階は二本鎖標的の完
全な変性を保証するために典型的な増幅反応で汎用され
る。ＰＣＲの各サイクルは94℃で１分の変性段階で始ま
る。かくして、最初の予備反応インキュベーションの直
後、最初のサイクルの変性段階において反応混合物が94
℃で１分間インキュベートされる。
【０１０７】増幅生成物は、１×ＴＢＥ（0.089 M Tri
s, 0.089 M ホウ酸, 0.0025 M EDTA二ナトリウム）泳動
緩衝液を使ったアガロースゲル電気泳動〔100 mlの３％
NuSieve（登録商標）と0.5 ％ SeaChem（登録商標）〕
により分析した。電気泳動は100 ボルトで約１時間実施
した。電気泳動後に臭化エチジウム（0.5 μg/ml）を添
加して存在する全てのＤＮＡを染色した。ゲルを１×Ｔ
ＢＥ中で脱色し、臭化エチジウムで染色されたＤＮＡバ
ンドをＵＶ照射により視覚化した。
【０１０８】シトラコニル化ＤＮＡポリメラーゼを使っ
た増幅 実施例５に記載のシトラコニル化ＤＮＡポリメラーゼと
実施例２に記載の240×シトラコニル化Taq ＤＮＡポリ
メラーゼの希釈液（1/10, 1/20, 1/40および1/80）をHI
V-1 核酸の増幅において使用し、そして増幅生成物をア
ガロースゲル電気泳動により分析した。比較のため、未
修飾のTaq ＤＮＡポリメラーゼの希釈液を使って増幅を
行った。
【０１０９】結果を図３に与える。増幅された標的配列
に相当するバンドが示される。増幅された標的配列に相
当するバンド以外のゲル上に現れるバンドは、非標的配
列の非特異的増幅により生じた生成物である。シトラコ
ニル化ＤＮＡポリメラーゼを使った増幅の効果は、各レ
ーン内のバンドのパターンと強度を比較することにより
知ることができる。非特異的生成物の増幅は標的配列の
増幅と競合するため、標的配列の増幅の増加は非特異的
増幅の減少の量を更に示す。よって、各レーン内の生成
物の相対量の変化は、非特異的増幅に対する予備反応処
理の効果を最もよく表す。
【０１１０】未修飾のTaq ＤＮＡポリメラーゼを使った
増幅は、酵素の全希釈度について圧倒的に非特異的増幅
生成物をもたらした。シトラコニル化Taq ＤＮＡポリメ
ラーゼの使用は、1/80希釈度以外の全部について、増幅
された標的配列に相当するバンドの強度の有意な増加
と、非標的増幅生成物に相当するバンドの強度の有意な
減少をもたらした。このデータは、可逆的に不活性化さ
れたＤＮＡポリメラーゼを使ったＰＣＲ増幅が非特異的
増幅を有意に減少させ且つ目的とする増幅された標的配
列の量を有意に増加させることを示す。
【０１１１】シトラコニル化UlTma, Taq CS および rTt
h ＤＮＡポリメラーゼの使用もまた、非特異的増幅生成
物の量の同時減少と共に、未修飾のTaq ＤＮＡポリメラ
ーゼを使った増幅で見られるよりも多量の特異的増幅生
成物の生成をもたらした。この結果は、本発明の方法が
一般的に熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに適用できること
を証明する。
【０１１２】この結果は本発明の機能性を証明するけれ
ども、修飾条件が各ＤＮＡポリメラーゼについて比較で
きるように最適化されてないため、シトラコニル化Taq,
UlTma, Taq CSおよび rTth ＤＮＡポリメラーゼを使っ
て得られた結果を直接比較できない点に注意すべきであ
る。特に、ＤＮＡポリメラーゼの各出発溶液は同じ単位
／mlを含有したけれども、それらの溶液の容量モル濃度
は決定されず、従って各修飾反応におけるシトラコン酸
無水物のモル過剰量は決定されなかった。当業者は、本
明細書中に記載のプロトコールを使って最適修飾条件を
経験的に決定することができると思う。
【０１１３】実施例７：シス−アコニチル化ＤＮＡポリ
メラーゼ この実施例は、シス−アコニット酸無水物を使ったTaq
ＤＮＡポリメラーゼの修飾を記載する。シス−アコニッ
ト酸無水物を使った修飾は、本質的には実施例２に記載
した通りに行ったが、シス−アコニット酸無水物が液体
としてでなく粉末として販売されているために主に異な
っている。Tris緩衝液（50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 6
8 mM HCl, pH 7.5）中のTaq ＤＮＡポリメラーゼ（Ampl
iTaqR , Perkin Elmer,Norwalk, CT ）を1.3 mg/ml の
初濃度で使用した。シス−アコニット酸無水物（Aldric
h, Milwaukee, WI）の出発溶液は、20 mg のシス−アコ
ニット酸無水物を１mlの100 ％EtOH中に溶かすことによ
り作製した。
【０１１４】シス−アコニット酸無水物溶液10μl また
は20μl を1000μl のTaq ＤＮＡポリメラーゼ溶液に添
加し、約90/1および180/1 のシス−アコニット酸無水物
対Taq ＤＮＡポリメラーゼのモル比を含む溶液を得た。
該溶液を４℃で一晩インキュベートしてTaq ＤＮＡポリ
メラーゼを不活性化した。シス−アコニチル化Taq ＤＮ
Ａポリメラーゼを使った増幅とシトラコニル化Taq ＤＮ
Ａポリメラーゼを使った増幅の比較を下記に記載する。
【０１１５】実施例８：シス−アコニット酸無水物を使
ったＤＮＡポリメラーゼ活性の不活性化と熱回復 実施例７で調製した90×および180 ×シス−アコニチル
化Taq ＤＮＡポリメラーゼの活性を、本質的には前記実
施例３に記載した通りの高温インキュベーションによる
回復の前後に測定した。インキュベーション中の緩衝液
のｐＨは8.0 であった。結果を下記に示す。各々の活性
は二重反復試料から測定した２つの活性の平均である。
【０１１６】
【表４】
【０１１７】実施例３の結果と上記結果の比較は、シス
−アコニチル化がシトラコニル化よりも容易に逆戻りす
ることを示す。ＤＮＡポリメラーゼを完全に不活性化す
るのにより高いモル過剰のシス−アコニット酸無水物が
必要であり、そして高温インキュベーション後により多
くの活性が回復される。90倍モル過剰のシス−アコニッ
ト酸無水物を使った修飾後に100 ％以上の活性測定値が
得られる理由は不明であるが、活性測定の不正確により
引き起こされるのかまたはＤＮＡポリメラーゼの実際の
修飾を反映するのかもしれない。
【０１１８】実施例９：予備反応インキュベーション時
間の効果 この実施例は、得られる生成物の量に対する予備反応イ
ンキュベーション時間の効果を記載する。上述した通り
に調製したシトラコニル化およびシス−アコニチル化Ta
q ＤＮＡポリメラーゼを使って増幅を行った。増幅条件
の各セットについて、80倍および160 倍モル過剰のシト
ラコン酸無水物と、90倍および180 倍モル過剰のシス−
アコニット酸無水物を使った。増幅は上記実施例６に記
載のHIV-1 モデル系を使って実施したが、ただし最初の
予備反応インキュベーションを変更した。各酵素調製物
について、12, 6, 3および0 分の予備反応インキュベー
ション時間を使って増幅を行った。
【０１１９】上述したように、予備反応インキュベーシ
ョン段階は初期変性段階としても働く。ＰＣＲの各サイ
クルは変性段階で始まる。95℃で12, 6, 3または0 分の
最初の予備反応インキュベーションの直後に、最初のサ
イクルの変性段階において反応混合物が94℃で１分間イ
ンキュベートされる。よって、予備反応インキュベーシ
ョンを使わない時であっても、最初のサイクルの変性段
階において酵素活性が回復される。
【０１２０】増幅生成物はアガロースゲル電気泳動によ
り分析した。結果を図４に与える。増幅された標的配列
に相当するバンドが示される。増幅された標的配列に相
当するバンド以外のゲル上に現れるバンドは、非標的配
列の非特異的増幅により生じた生成物に相当する。結果
は、シス−アコニチル化ＤＮＡポリメラーゼを使うと、
全ての予備反応インキュベーション時間が増幅生成物に
相当する強いバンドを生じたことを示す。予備反応イン
キュベーションを使わずに行った増幅は、延長した予備
反応インキュベーションを使った増幅とほぼ同量の生成
物を生じた。
【０１２１】対照的に、結果は、シトラコニル化ＤＮＡ
ポリメラーゼを使うと、最大量の増幅生成物を得るのに
少なくとも３分の予備反応インキュベーションが必要で
あることを示した。予備反応インキュベーションを使わ
ずに行った増幅はかなり少ない増幅生成物を生じた。こ
の結果は、シス−アコニチル化ＤＮＡポリメラーゼの活
性がシトラコニル化ＤＮＡポリメラーゼのよりも速く回
復されることを示す。
【０１２２】実施例10：サイクル数の効果 この実施例は、短い予備反応インキュベーション時間を
補うために増幅サイクル数を増加させることの効果を記
載する。80倍および160 倍モル過剰のシトラコン酸無水
物と、90倍および180 倍モル過剰のシス−アコニット酸
無水物を使って修飾したTaq ＤＮＡポリメラーゼを使っ
て増幅を行った。増幅は上記実施例６に記載のHIV-1 モ
デル系を使って本質的には上述した通りに実施したが、
ただし最初の予備反応インキュベーションとサイクル数
を変更した。各酵素調製物について、次の条件を使って
増幅を行った：
【０１２３】
【表５】
【０１２４】増幅生成物をアガロースゲル電気泳動によ
り分析した。結果を図５に与える。この結果は、増幅サ
イクル数を増加させることが予備反応インキュベーショ
ンを使わない時のＤＮＡポリメラーゼ活性の不完全な回
復に起因する増幅効率の低下を補うことができることを
示す。
【０１２５】各ＤＮＡポリメラーゼについて、増幅サイ
クル数の増加は増幅生成物の増加をもたらした。この効
果はシス−アコニチル化Taq ＤＮＡポリメラーゼを使っ
た時に最小であり、実施例９において予備反応インキュ
ベーションをほとんど必要としないことが証明された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、シトラコン酸無水物、シス−アコニッ
ト酸無水物および２，３−ジメチルマレイン酸無水物の
構造、並びにシトラコン酸無水物とリジンとの反応を示
す。
【図２】図２は、実施例４に記載されるシトラコニル化
Taq ＤＮＡポリメラーゼを使って行った増幅の結果を示
す電気泳動図であり、図面代用写真である。
【図３】図３は、実施例６に記載されるシトラコニル化
ＤＮＡポリメラーゼを使って行った増幅の結果を示す電
気泳動図であり、図面代用写真である。
【図４】図４は、実施例９に記載されるシトラコニル化
およびシス−アコニチル化ＤＮＡポリメラーゼを使って
行った増幅における予備反応インキュベーション時間の
変更の結果を示す電気泳動図であり、図面代用写真であ
る。
【図５】図５は、実施例10に記載されるシトラコニル化
およびシス−アコニチル化ＤＮＡポリメラーゼを使って
行った増幅における増幅サイクル数の変更の結果を示す
電気泳動図であり、図面代用写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ウォルター ジョセフ レアード アメリカ合衆国，カリフォルニア 94564, ピノール，ラッセン ウェイ 2660 (72)発明者 マイケル アンソニー ゾコーリ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94556, モラガ，ディアフィールド ドライブ 303

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 化学修飾により可逆的に不活性化された
    熱安定性酵素であって、アルカリ性ｐＨの水性緩衝液中
    での約25℃より低い温度での前記化学修飾された熱安定
    性酵素のインキュベーションが約20分未満で酵素活性の
    有意な増加を引き起こさず、且つ25℃で約ｐＨ＝８〜９
    に調整された水性緩衝液中での約50℃より高い温度での
    前記化学修飾された熱安定性酵素のインキュベーション
    が約20分未満で酵素活性の少なくとも２倍の増加を引き
    起こすことを特徴とする前記化学修飾された熱安定性酵
    素。
  2. 【請求項２】 前記酵素活性が熱安定性ＤＮＡポリメラ
    ーゼ活性または熱安定性リガーゼ活性である、請求項１
    に記載の化学修飾された熱安定性酵素。
  3. 【請求項３】 前記酵素活性が熱安定性ＤＮＡポリメラ
    ーゼ活性であり、そして前記熱安定性ＤＮＡポリメラー
    ゼがテルムス・アクアティカス（Thermus aquaticu
    s）、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilu
    s）およびテルモトガ・マリチマ（Thermotoga maritim
    a）から成る属の群より選択された種に由来する、請求
    項１に記載の化学修飾された熱安定性酵素。
  4. 【請求項４】 熱安定性酵素と修飾試薬との混合物の反
    応により製造される、請求項１〜３のいずれか一項に記
    載の化学修飾された熱安定性酵素。
  5. 【請求項５】 熱安定性酵素と修飾試薬との混合物の反
    応により製造され、前記反応が約25℃より低い温度でア
    ルカリ性ｐＨで行われ、前記試薬が一般式 【化１】 （上式中、Ｒ1 とＲ2 は水素または有機基であり、互い
    に連結していてもよい）または一般式 【化２】 （上式中、Ｒ1 とＲ2 は有機基であって、好ましくは連
    結しており、そして水素はシス配置である）のジカルボ
    ン酸無水物であり、そして前記反応が酵素活性の本質上
    完全な不活性化を引き起こす、請求項１〜３のいずれか
    一項に記載の化学修飾された熱安定性酵素。
  6. 【請求項６】 熱安定性酵素と修飾試薬との混合物の反
    応により製造され、前記修飾試薬が無水マレイン酸；エ
    キソ−シス−３，６−エンドオキソ−Δ4 −テトラヒド
    ロフタル酸無水物；シトラコン酸無水物；３，４，５，
    ６−テトラヒドロフタル酸無水物；シス−アコニット酸
    無水物；および２，３−ジメチルマレイン酸無水物から
    成る群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に
    記載の化学修飾された熱安定性酵素。
  7. 【請求項７】 熱安定性酵素と修飾試薬との混合物の反
    応により製造され、前記修飾試薬が前記熱安定性酵素に
    対して20倍モル過剰量より多い、請求項１〜６のいずれ
    か一項に記載の化学修飾された熱安定性酵素。
  8. 【請求項８】 熱安定性酵素と修飾試薬との混合物の反
    応により製造され、前記熱安定性酵素がテルムス・アク
    アティカス（Thermus aquaticus）由来の熱安定性ＤＮ
    Ａポリメラーゼであり、そして前記修飾試薬がシトラコ
    ン酸無水物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載
    の化学修飾された熱安定性酵素。
  9. 【請求項９】 熱安定性酵素と修飾試薬との混合物の反
    応により製造され、前記熱安定性酵素がテルムス・テル
    モフィラス（Thermus thermophilus）由来の熱安定性Ｄ
    ＮＡポリメラーゼであり、そして前記修飾試薬がシス−
    アコニット酸無水物である、請求項１〜７のいずれか一
    項に記載の化学修飾された熱安定性酵素。
  10. 【請求項１０】 可逆的に不活性化された化学修飾され
    た熱安定性酵素の調製方法であって、熱安定性酵素と修
    飾試薬との混合物を反応させることを含んで成り、前記
    反応が約25℃より低い温度でアルカリ性ｐＨで行われ、
    前記試薬が一般式 【化３】 （上式中、Ｒ1 とＲ2 は水素または有機基であり、互い
    に連結していてもよい）または一般式 【化４】 （上式中、Ｒ1 とＲ2 は有機基であって、好ましくは連
    結しており、そして水素はシス配置である）のジカルボ
    ン酸無水物であり、そして前記反応が酵素活性の本質上
    完全な不活性化を引き起こすことを特徴とする方法。
  11. 【請求項１１】 試料中に含まれる標的核酸の増幅方法
    であって、 (a) 前記試料を、前記標的核酸に相補的なプライマーと
    請求項１〜９のいずれか一項に記載の化学修飾された熱
    安定性酵素を含有する増幅反応混合物と接触させ；そし
    て(b) 段階(a) から得られた反応混合物を、前記化学修
    飾された熱安定性酵素を回復させそしてプライマー伸長
    生成物の形成を可能にするのに十分な時間、約50℃より
    高い温度でインキュベートする；段階を含んで成る方
    法。
  12. 【請求項１２】 一対のプライマーと請求項１〜９のい
    ずれか一項に記載の化学修飾された熱安定性酵素を含ん
    で成る、ポリメラーゼ連鎖反応用増幅反応混合物。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜９のいずれか一項に記載の
    化学修飾された熱安定性酵素を含んで成る、ポリメラー
    ゼ連鎖反応を実施するためのキット。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10276776A (ja) * 1997-04-07 1998-10-20 Toyobo Co Ltd 可逆的に不活化された耐熱性ｄｎａポリメラーゼ
JP2000004878A (ja) * 1998-05-29 2000-01-11 Qiagen Gmbh 熱安定性酵素の可逆性修飾の方法
JP2002199877A (ja) * 2000-11-30 2002-07-16 Advanced Biotechnologies Ltd 酵素の可逆的な不活性化およびその酵素を含むキット
JP2003199592A (ja) * 2001-12-03 2003-07-15 F Hoffmann La Roche Ag インビトロｄｎａ合成および増幅のための可逆的に修飾された熱安定酵素
JP2008005841A (ja) * 2006-06-28 2008-01-17 Qiagen Gmbh 可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化の増強
JP2015500636A (ja) * 2011-12-02 2015-01-08 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 高相同性オリゴヌクレオチドによる非特異的増幅の抑制
JP2016507221A (ja) * 2012-12-20 2016-03-10 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 熱安定性ｄｎａポリメラーゼの特徴づけ
JP2017104108A (ja) * 2008-04-30 2017-06-15 インテグレイテツド・デイー・エヌ・エイ・テクノロジーズ・インコーポレイテツド 修飾されたｒｎａ単量体を用いるｒｎアーゼｈを基礎とするアッセイ
JP2018516072A (ja) * 2015-05-29 2018-06-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ シトラコン酸無水物によって微生物を不活性化する方法

Families Citing this family (298)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6096499A (en) * 1996-03-22 2000-08-01 Geron Corporation Mammalian DNA primase screen and activity modulating agents
US6828094B2 (en) * 1996-12-20 2004-12-07 Roche Diagnostics Gmbh Method for the uncoupled, direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules with the addition of a second thermostable DNA polymerase and its application
US20030215857A1 (en) * 1996-12-20 2003-11-20 Roche Diagnostics Gmbh Method for the direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules and its application
US6482590B1 (en) 1996-12-20 2002-11-19 Aventis Behring Gmbh Method for polynucleotide amplification
US6399304B1 (en) * 1996-12-20 2002-06-04 Roche Diagnostics Gmbh Sequential activation of one or more enzymatic activities within a thermocycling reaction for synthesizing DNA molecules
US6605428B2 (en) * 1996-12-20 2003-08-12 Roche Diagnostics Gmbh Method for the direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules and its application
US6132416A (en) * 1998-09-01 2000-10-17 Broselow; James B. Universal medication dosing system
US6440706B1 (en) 1999-08-02 2002-08-27 Johns Hopkins University Digital amplification
GB9920194D0 (en) * 1999-08-27 1999-10-27 Advanced Biotech Ltd A heat-stable thermostable DNA polymerase for use in nucleic acid amplification
WO2001075139A1 (en) * 2000-04-03 2001-10-11 Biolink Partners, Inc. Reversible chemical modification of nucleic acids and improved method for nucleic acid hybridization
EP1312673A4 (en) * 2000-08-25 2004-08-04 Fujirebio Kk PROTECTION METHOD FOR PERSONAL INFORMATION
EP1334113A4 (en) * 2000-10-20 2007-08-08 Expression Diagnostics Inc EVALUATION OF LEUCOCYTAIRE EXPRESSION LEVEL
GB0110501D0 (en) * 2001-04-30 2001-06-20 Secr Defence Brit Amplification process
US7235358B2 (en) 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US6905827B2 (en) * 2001-06-08 2005-06-14 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases
US7026121B1 (en) * 2001-06-08 2006-04-11 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
EP1275735A1 (en) * 2001-07-11 2003-01-15 Roche Diagnostics GmbH Composition and method for hot start nucleic acid amplification
DE60231901D1 (de) * 2001-11-14 2009-05-20 Toyo Boseki Dna-synthesepromotoren, mit dna-polymerase assoziierte faktoren und nutzung davon
AU2003201910A1 (en) * 2002-01-09 2003-07-30 Sysmex Corporation Nucleic acid detection method and system thereof
RU2215037C1 (ru) * 2002-04-15 2003-10-27 Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН Способ ферментативного синтеза днк
US20050221349A1 (en) * 2002-05-30 2005-10-06 Stuart Wilson Methods of detecting target molecules and molecular interactions
US6896727B2 (en) * 2002-06-28 2005-05-24 Seh America, Inc. Method of determining nitrogen concentration within a wafer
EP1403379A1 (en) * 2002-09-24 2004-03-31 QIAGEN GmbH Enhanced coamplification of nucleic acids
RU2240350C1 (ru) * 2003-03-11 2004-11-20 НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова Минздрава РФ Способ идентификации генных мутаций и полиморфизмов
EP2194123B1 (en) 2003-03-25 2012-08-22 Stratagene California DNA polymerase fusions and uses thereof
DE10315640A1 (de) * 2003-04-04 2004-10-14 Ignatov, Konstantin Verfahren zur kontrollierten Freisetzung von Komponenten in eine Lösung
US7892745B2 (en) * 2003-04-24 2011-02-22 Xdx, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US20060263813A1 (en) * 2005-05-11 2006-11-23 Expression Diagnostics, Inc. Methods of monitoring functional status of transplants using gene panels
AU2004203649B2 (en) 2003-08-12 2006-01-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Thermostable Taq polymerase fragment
EP2208797A3 (en) 2004-03-01 2010-11-24 Applied Biosystems, LLC Methods, compositions and kits for use in polynucleotide amplification
KR100624490B1 (ko) 2004-05-27 2006-09-20 바이오퀘스트(주) 화학변형 열안정성 ｄｎａ 중합효소
US7622296B2 (en) * 2004-05-28 2009-11-24 Wafergen, Inc. Apparatus and method for multiplex analysis
US20060019366A1 (en) * 2004-06-09 2006-01-26 Wanli Bi Reversibly modified thermostable enzyme compositions and methods of making and using the same
US20060019288A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-26 Applera Corporation Methods, reaction mixtures, and kits for ligating polynucleotides
US7700281B2 (en) * 2004-06-30 2010-04-20 Usb Corporation Hot start nucleic acid amplification
WO2006029184A2 (en) * 2004-09-08 2006-03-16 Expression Diagnostics, Inc. Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders
EP1634965B1 (en) 2004-09-09 2010-01-20 Roche Diagnostics GmbH Real time PCR with the addition of pyrophosphatase
US20060051796A1 (en) * 2004-09-09 2006-03-09 Inga Boell Real time PCR with the addition of pyrophosphatase
EP1791982B1 (en) 2004-09-21 2011-01-05 Life Technologies Corporation TWO-COLOR REAL-TIME/END-POINT QUANTITATION OF MICRORNAS (MIRNAs)
KR20070090158A (ko) * 2004-10-18 2007-09-05 브랜데이스 유니버시티 Ｐｃｒ 증폭에서 재현성을 개선시키고 미스프라이밍을감소시키기 위한 시약 및 방법
US20060228726A1 (en) * 2005-01-06 2006-10-12 Martin Patrick K Polypeptides having nucleic acid binding activity and compositions and methods for nucleic acid amplification
JP2008527979A (ja) * 2005-01-12 2008-07-31 アプレラ コーポレイション 核酸の選択的増幅のための組成物、方法およびキット
WO2007011901A2 (en) 2005-07-15 2007-01-25 Applera Corporation Hot start reverse transcription by primer design
ATE489473T1 (de) 2005-07-15 2010-12-15 Life Technologies Corp Analyse von boten-rna und mikro-rna im gleichen reaktionsansatz
US20070059713A1 (en) 2005-09-09 2007-03-15 Lee Jun E SSB-DNA polymerase fusion proteins
WO2007041201A2 (en) 2005-10-03 2007-04-12 Applera Corporation Compositions, methods, and kits for amplifying nucleic acids
DE102005047617A1 (de) * 2005-10-05 2007-04-19 Qiagen Gmbh Polymerase-Kettenreaktions-Verfahren unter Einsatz einer DNA-Polymerase mit Proofreading-Eigenschaft
GB0600228D0 (en) 2006-01-06 2006-02-15 Fermentas Uab Inactivation method
CN103172700B (zh) * 2006-02-27 2014-12-17 霍夫曼-拉罗奇有限公司 经由镁螯合的pcr热启动
DE102006015960A1 (de) * 2006-04-04 2007-10-11 Qiagen Gmbh Gemisch reversibel inhibierter Enzyme
CA2648580A1 (en) * 2006-04-07 2008-05-02 Xdx, Inc. Steroid responsive nucleic acid expression and prediction of disease activity
US8232091B2 (en) * 2006-05-17 2012-07-31 California Institute Of Technology Thermal cycling system
CN101517091B (zh) * 2006-06-01 2013-02-13 垂林克生物技术公司 用于核酸扩增的化学修饰的寡核苷酸引物
US11001881B2 (en) 2006-08-24 2021-05-11 California Institute Of Technology Methods for detecting analytes
WO2008011004A2 (en) * 2006-07-17 2008-01-24 Brandeis University Specialized oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification and detection
US8048626B2 (en) 2006-07-28 2011-11-01 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
US11525156B2 (en) 2006-07-28 2022-12-13 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
US9045522B2 (en) 2006-07-31 2015-06-02 Wanli Bi Nucleic acid amplification using a reversibly modified oligonucleotide
CN101495657B (zh) * 2006-07-31 2016-08-10 毕万里 使用可逆修饰寡核苷酸扩增核酸
WO2008021431A2 (en) * 2006-08-14 2008-02-21 Xdx, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders
US11560588B2 (en) 2006-08-24 2023-01-24 California Institute Of Technology Multiplex Q-PCR arrays
US8148067B2 (en) * 2006-11-09 2012-04-03 Xdx, Inc. Methods for diagnosing and monitoring the status of systemic lupus erythematosus
KR100825279B1 (ko) * 2006-11-30 2008-04-25 한국해양연구원 Ｄｎα 중합효소 활성 증가 단백질 및 이를 암호화 하는유전자
US7902345B2 (en) 2006-12-05 2011-03-08 Sequenom, Inc. Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry
EP2109627A4 (en) 2007-01-22 2014-07-23 Wafergen Inc DEVICE FOR CHEMICAL REACTIONS WITH HIGH THROUGHPUT
US20090036325A1 (en) * 2007-05-25 2009-02-05 Applera Corporation Directed assembly of amplicons to enhance read pairing signature with massively parallel short read sequencers
CA2690164A1 (en) * 2007-06-16 2008-12-24 Enigma Diagnostics Limited Compositions
GB0711683D0 (en) * 2007-06-16 2007-07-25 Enigma Diagnostics Ltd Compositions
EP2183380B1 (en) * 2007-08-27 2014-11-26 Life Technologies Corporation Methods and compositions for pcr
US9404150B2 (en) 2007-08-29 2016-08-02 Sequenom, Inc. Methods and compositions for universal size-specific PCR
EP2240576B1 (en) * 2008-01-11 2012-10-03 Genesys Ltd Cren7 chimeric protein
GB0803628D0 (en) * 2008-02-28 2008-04-02 Genesys Ltd Enzyme
GB0804722D0 (en) * 2008-03-14 2008-04-16 Genesys Ltd Enzyme
GB0804721D0 (en) * 2008-03-14 2008-04-16 Genesys Ltd Enzyme
CA2658520C (en) 2008-03-19 2016-11-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Nucleic acid amplification in the presence of modified randomers
EP2113574A1 (en) 2008-04-28 2009-11-04 Biotype AG Substances and methods for a DNA based profiling assay
US8911948B2 (en) * 2008-04-30 2014-12-16 Integrated Dna Technologies, Inc. RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers
US10227641B2 (en) 2008-04-30 2019-03-12 Integrated Dna Technologies, Inc. RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers
EP2294076B1 (en) 2008-05-27 2017-03-08 TriLink BioTechnologies Chemically modified nucleoside 5'-triphosphates for thermally initiated replication of nucleic acid
EP2300613A4 (en) * 2008-06-18 2011-11-09 Life Technologies Corp THERMALLY STABLE CHEMICALLY MODIFIED POLYMERIAS DNA MUTANTS
HRP20150280T1 (hr) 2008-06-30 2015-04-10 Life Technologies Corporation Postupak za izravno pojačanje iz neprerađenih uzoraka nukleinske kiseline
US8691968B2 (en) * 2008-07-03 2014-04-08 Allelogic Biosciences Corporation Compositions and methods for the protection of nucleophilic groups
US8583380B2 (en) 2008-09-05 2013-11-12 Aueon, Inc. Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options
US7910720B2 (en) * 2008-09-09 2011-03-22 Roche Diagnostics Operations, Inc. Polyanion for improved nucleic acid amplification
US8206929B2 (en) 2009-01-07 2012-06-26 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleic acid amplification with allele-specific suppression of sequence variants
EP2382321A4 (en) 2009-01-08 2012-12-19 Bio Rad Laboratories METHODS AND COMPOSITIONS FOR ENHANCING THE EFFICACY OF NUCLEIC ACID AMPLIFICATION REACTIONS
RU2405823C2 (ru) * 2009-01-29 2010-12-10 Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН Термостабильная днк-лигаза из археи рода thermococcus, способ ее получения и нуклеотидная последовательность днк, кодирующая эту днк-лигазу
JP5457222B2 (ja) 2009-02-25 2014-04-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 小型化ハイスループット核酸分析
US9347092B2 (en) * 2009-02-25 2016-05-24 Roche Molecular System, Inc. Solid support for high-throughput nucleic acid analysis
DE102009010639B4 (de) * 2009-02-26 2020-07-02 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Verfahren und Anordnung zur Inhibierung einer chemischen Reaktion von Substanzen in einer Flüssigkeit vor einer Messung
US8039215B2 (en) 2009-03-10 2011-10-18 Roche Molecular Systems, Inc. Multiplex quantitative nucleic acid amplification and melting assay
EP2406394B1 (en) 2009-03-12 2014-01-08 Brandeis University Reagents and methods for pcr
US9464319B2 (en) 2009-03-24 2016-10-11 California Institute Of Technology Multivolume devices, kits and related methods for quantification of nucleic acids and other analytes
US10196700B2 (en) 2009-03-24 2019-02-05 University Of Chicago Multivolume devices, kits and related methods for quantification and detection of nucleic acids and other analytes
CA2756463C (en) 2009-03-24 2019-01-22 University Of Chicago Slip chip device and methods
US9447461B2 (en) 2009-03-24 2016-09-20 California Institute Of Technology Analysis devices, kits, and related methods for digital quantification of nucleic acids and other analytes
WO2010111509A1 (en) 2009-03-25 2010-09-30 Life Technologies Corporation Discriminatory positive/extraction control dna
CN202830041U (zh) * 2009-04-03 2013-03-27 Illumina公司 用于加热生物样本的设备
CN201837588U (zh) * 2009-09-09 2011-05-18 海利克斯公司 用于多个反应的光学系统
US20110159551A1 (en) * 2009-10-09 2011-06-30 Life Technologies Corporation cDNA SYNTHESIS USING A REVERSIBLY INACTIVATED REVERSE TRANSCRIPTASE
US20110117559A1 (en) * 2009-11-13 2011-05-19 Integrated Dna Technologies, Inc. Small rna detection assays
IN2012DN05145A (ja) 2009-11-19 2015-10-23 Solis Biodyne
WO2011068569A1 (en) 2009-12-04 2011-06-09 Biotium, Inc. Heterocycle-substituted xanthene dyes
US8614071B2 (en) 2009-12-11 2013-12-24 Roche Molecular Systems, Inc. Preferential amplification of mRNA over DNA using chemically modified primers
US9238832B2 (en) 2009-12-11 2016-01-19 Roche Molecular Systems, Inc. Allele-specific amplification of nucleic acids
US20110236916A1 (en) 2010-03-26 2011-09-29 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for detecting colorectal neoplasm
US9068017B2 (en) 2010-04-08 2015-06-30 Ibis Biosciences, Inc. Compositions and methods for inhibiting terminal transferase activity
US20110250598A1 (en) 2010-04-12 2011-10-13 Ulrike Fischer Detergent free polymerases
US9309565B2 (en) 2010-05-14 2016-04-12 Life Technologies Corporation Karyotyping assay
US8618253B2 (en) * 2010-05-25 2013-12-31 Samsung Techwin Co., Ltd. Modified RNAse H and detection of nucleic acid amplification
WO2011150277A2 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Life Technologies Corporation Synthesis of 2', 3'-dideoxynucleosides for automated dna synthesis and pyrophosphorolysis activated polymerization
ES2536252T3 (es) 2010-06-18 2015-05-21 F. Hoffmann-La Roche Ag ADN polimerasas con diferenciación de desapareamientos 3' aumentada
JP5841136B2 (ja) 2010-06-18 2016-01-13 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 増大した３’末端ミスマッチ識別能を有するｄｎａポリメラーゼ
CN103025867B (zh) 2010-06-18 2015-05-20 霍夫曼-拉罗奇有限公司 具有增强的3’-错配辨别力的dna聚合酶
US8722378B2 (en) 2010-06-18 2014-05-13 Roche Molecular Systems, Inc. DNA polymerases with increased 3′-mismatch discrimination
CA2802000C (en) 2010-06-18 2016-08-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination
JP5926248B2 (ja) 2010-06-18 2016-05-25 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 増大した３’末端ミスマッチ識別能を有するｄｎａポリメラーゼ
JP5876479B2 (ja) 2010-06-18 2016-03-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 増大した３’末端ミスマッチ識別を有するｄｎａポリメラーゼ
CN103025870B (zh) 2010-06-18 2015-07-01 霍夫曼-拉罗奇有限公司 具有增强的3’-错配辨别力的dna聚合酶
US9410194B2 (en) 2010-06-21 2016-08-09 Life Technologies Corporation Compositions, kits and methods for synthesis and/or detection of nucleic acids
WO2012038049A2 (en) 2010-09-22 2012-03-29 Roche Diagnostics Gmbh Amplification of distant nucleic acid targets using engineered primers
RU2565550C2 (ru) 2010-09-24 2015-10-20 Те Борд Оф Трастиз Оф Те Лилэнд Стэнфорд Джуниор Юниверсити Прямой захват, амплификация и секвенирование днк-мишени с использованием иммобилизированных праймеров
CN103124797B (zh) 2010-10-04 2015-04-22 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于在相同反应容器内的细胞裂解和pcr的方法
ES2533732T3 (es) 2010-10-04 2015-04-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Método para lisis celular en un tampón de reacción de RT-PCR
WO2012045670A1 (en) 2010-10-04 2012-04-12 Roche Diagnostics Gmbh Method for cell lysis in a pcr reaction buffer
EP2630257B1 (en) 2010-10-22 2017-08-02 Oslo Universitetssykehus HF Methods and kits for detection of 5-hydroxymethylcytosine
US8361720B2 (en) 2010-11-15 2013-01-29 Exact Sciences Corporation Real time cleavage assay
US8916344B2 (en) 2010-11-15 2014-12-23 Exact Sciences Corporation Methylation assay
CN110079588B (zh) * 2010-12-17 2024-03-15 生命技术公司 用于核酸扩增的方法、组合物、系统、仪器和试剂盒
US20120208189A1 (en) 2011-01-14 2012-08-16 Life Technologies Corporation Methods for isolation, identification, and quantification of mirnas
ES2632768T3 (es) 2011-01-17 2017-09-15 Life Technologies Corporation Flujo de trabajo para la detección de ligandos empleando ácidos nucleicos
JP2014519310A (ja) 2011-02-02 2014-08-14 エクザクト サイエンシーズ コーポレイション Ｄｎａメチル化のデジタル配列分析
EP2675897B1 (en) 2011-02-15 2016-05-11 Roche Diagnostics GmbH Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination
EP2683834B1 (en) 2011-03-10 2017-12-06 Oslo Universitetssykehus HF Methods and biomarkers for detection of gastrointestinal cancers
AU2012236896A1 (en) 2011-03-25 2013-05-16 Integrated Dna Technologies, Inc. RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers
CA2831180C (en) 2011-04-11 2017-02-14 Keith Bauer Dna polymerases with improved activity
US8993341B2 (en) 2011-05-12 2015-03-31 Exact Sciences Corporation Removal of PCR inhibitors
CN103649298A (zh) 2011-05-12 2014-03-19 精密科学公司 核酸的分离
US8808990B2 (en) 2011-05-12 2014-08-19 Exact Sciences Corporation Serial isolation of multiple DNA targets from stool
DK2718260T3 (en) 2011-06-08 2018-11-19 Life Technologies Corp DESIGN AND DEVELOPMENT OF NEW DETERGENTS FOR USE IN PCR SYSTEMS
WO2012170907A2 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Life Technologies Corporation Polymerization of nucleic acids using proteins having low isoelectric points
WO2013066438A2 (en) 2011-07-22 2013-05-10 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
JP6378085B2 (ja) 2011-07-28 2018-08-22 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 改善された活性を有するｄｎａポリメラーゼ
US9758837B2 (en) 2011-08-02 2017-09-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Sensitive and rapid method for Candidatus Liberibacter species detection
WO2013043715A1 (en) 2011-09-19 2013-03-28 Genentech, Inc. Combination treatments comprising c-met antagonists and b-raf antagonists
ES2656961T3 (es) 2011-09-23 2018-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Uso de G-Clamp para mejorar la PCR específica de alelo
JP2014533100A (ja) 2011-11-04 2014-12-11 オスロ ウニヴェルスィテーツスィーケフース ハーエフＯｓｌｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｔｓｓｙｋｅｈｕｓ Ｈｆ 結腸直腸癌の分析のための方法およびバイオマーカー
WO2013083262A1 (en) 2011-12-08 2013-06-13 Roche Diagnostics Gmbh Dna polymerases with improved activity
CN103987843B (zh) 2011-12-08 2015-12-23 霍夫曼-拉罗奇有限公司 具有改进活性的dna聚合酶
EP2788479B1 (en) 2011-12-08 2016-02-10 Roche Diagnostics GmbH Dna polymerases with improved activity
ES2669214T3 (es) 2011-12-13 2018-05-24 Oslo Universitetssykehus Hf Procedimientos y kits para la detección de estado de metilación
US9115394B2 (en) 2011-12-22 2015-08-25 Roche Molecular Systems, Inc. Methods and reagents for reducing non-specific amplification
EP2802673B1 (en) 2012-01-09 2019-07-03 Oslo Universitetssykehus HF Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer
GB201201547D0 (en) * 2012-01-30 2012-03-14 Olink Ab Method and product
BR112014018924B1 (pt) 2012-02-01 2022-05-24 Certa Dose, Inc Método de gerar uma etiqueta de dosagem customizada para um dispositivo de distribuição de medicamento
US11617835B2 (en) 2012-02-01 2023-04-04 Cd Acquisitions, Llc Apparatuses, methods, and systems for delivering measured doses of medication
CN107326085B (zh) 2012-02-03 2022-05-03 加州理工学院 多路生化测定中信号的编码和解码
US9506117B2 (en) 2012-02-21 2016-11-29 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer
KR20210072137A (ko) 2012-06-14 2021-06-16 라이프 테크놀로지스 코포레이션 폴리머라제 연쇄 반응 (pcr)을 위한 신규 조성물, 방법 및 키트
US9085761B1 (en) 2012-06-14 2015-07-21 Affymetrix, Inc. Methods and compositions for amplification of nucleic acids
IN2015DN01609A (ja) 2012-08-03 2015-07-03 California Inst Of Techn
US9212392B2 (en) 2012-09-25 2015-12-15 Exact Sciences Corporation Normalization of polymerase activity
GB201217405D0 (en) * 2012-09-28 2012-11-14 Fermentas Uab Protein removal agent
PL3260558T3 (pl) 2012-11-02 2020-08-10 Life Technologies Corporation Nowe kompozycje i sposoby poprawy specyficzności pcr
US9710596B2 (en) 2012-11-21 2017-07-18 Exact Sciences Corporation Methods for quantifying nucleic acid variations
GB201301457D0 (en) 2013-01-28 2013-03-13 Fluorogenics Ltd Freeze-dried composition
US11254977B2 (en) 2013-03-12 2022-02-22 Life Technologies Corporation Universal reporter-based genotyping methods and materials
ES2859645T3 (es) 2013-03-14 2021-10-04 Mayo Found Medical Education & Res Detección de neoplasia
ES2732012T3 (es) 2013-03-14 2019-11-20 Abbott Molecular Inc Minimización de errores utilizando uracil-ADN-N-glicosilasa
WO2014184684A2 (en) 2013-05-16 2014-11-20 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for detection of hematological cancers
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
WO2015042446A2 (en) 2013-09-20 2015-03-26 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for the analysis of radiosensitivity
CN106458885B (zh) 2013-10-25 2019-12-10 生命技术公司 用于聚合酶链式反应系统的新颖化合物及其应用
WO2015066695A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Exact Sciences Corporation Multiple-control calibrators for dna quantitation
KR101488110B1 (ko) 2013-11-29 2015-01-29 성균관대학교산학협력단 나노아케움 이퀴탄스 유래의 Neq HS DNA 중합효소의 돌연변이체 제조 및 이를 이용한 hot-start PCR 응용
US9840697B2 (en) 2013-12-06 2017-12-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Fusion polymerases
EP4209600A1 (en) 2013-12-19 2023-07-12 Exact Sciences Corporation Synthetic nucleic acid control molecules
WO2015107430A2 (en) 2014-01-16 2015-07-23 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer
US9663770B2 (en) 2014-01-22 2017-05-30 Life Technologies Corporation Reverse transcriptases for use in high temperature nucleic acid synthesis
CN106460046A (zh) 2014-03-31 2017-02-22 梅奥医学教育和研究基金会 检测结直肠赘生物
WO2016022363A2 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
US10184154B2 (en) 2014-09-26 2019-01-22 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detecting cholangiocarcinoma
EP3207156A1 (en) 2014-10-13 2017-08-23 Life Technologies Corporation Methods, kits & compositions for determining gene copy numbers
WO2016094839A2 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Exact Sciences Corporation Compositions and methods for performing methylation detection assays
US10465248B2 (en) 2014-12-12 2019-11-05 Exact Sciences Development Company, Llc Method of characterizing ZDHHC1 DNA
EP3795681B1 (en) 2014-12-16 2024-09-18 Life Technologies Corporation Polymerase compositions and methods of making and using same
US9909169B2 (en) 2014-12-17 2018-03-06 Roche Molecular Systems, Inc. Allele-specific amplification of nucleic acids using blocking oligonucleotides for wild type suppression
WO2016134342A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Wafergen, Inc. Method for rapid accurate dispensing, visualization and analysis of single cells
CN107429296B (zh) 2015-03-13 2022-01-28 生命技术公司 捕获、检测和定量小rna的方法、组合物与试剂盒
WO2016160454A1 (en) 2015-03-27 2016-10-06 Exact Sciences Corporation Detecting esophageal disorders
CN104845967B (zh) 2015-04-15 2020-12-11 苏州新海生物科技股份有限公司 寡聚核苷酸片段及使用其的选择性扩增目标核酸序列变异体的方法及应用
ES2961374T3 (es) 2015-04-24 2024-03-11 Atila Biosystems Incorporated Amplificación con cebadores de composición de nucleótidos limitada
KR20250172724A (ko) 2015-08-31 2025-12-09 메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치 위 신생물 검출 방법
USD938023S1 (en) 2015-09-02 2021-12-07 Certa Dose, Inc. Drug delivery syringe
GB201518655D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Olink Ab Method for generating proximity probes
SG10202104041PA (en) 2015-10-23 2021-06-29 Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
KR20250073555A (ko) 2015-10-30 2025-05-27 이그잭트 사이언시즈 코포레이션 복합 증폭 검출 분석 및 혈장으로부터 dna의 분리 및 검출 방법
CN108779446B (zh) 2016-01-13 2023-04-21 新英格兰生物实验室公司 T7 rna聚合酶的热稳定变体
WO2017121836A1 (en) 2016-01-15 2017-07-20 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Thermophilic dna polymerase mutants
US10246740B2 (en) 2016-01-27 2019-04-02 Devyser Holding Ab Selective amplification of desired nucleic acid regions in a target sequence
WO2017155858A1 (en) 2016-03-07 2017-09-14 Insilixa, Inc. Nucleic acid sequence identification using solid-phase cyclic single base extension
EP3440221B1 (en) 2016-04-06 2025-08-27 Life Technologies Corporation Methods for synthesis and detection of nucleic acids
US20170321286A1 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Exact Sciences Corporation Detection of lung neoplasia by amplification of rna sequences
CN116064796A (zh) 2016-05-05 2023-05-05 精密科学公司 通过分析甲基化dna来检测肺肿瘤
AU2017264862C1 (en) 2016-05-11 2022-03-24 Certa Dose, Inc. Radiological dosing system and method
US11299739B2 (en) 2016-06-07 2022-04-12 Cepheid Thermostable polymerase inhibitor compositions and methods
US20170362640A1 (en) 2016-06-16 2017-12-21 Life Technologies Corporation Novel compositions, methods and kits for microorganism detection
US10066263B2 (en) 2016-06-17 2018-09-04 California Institute Of Technology Nucleic acid reactions and related methods and compositions
JP6924496B2 (ja) * 2016-06-23 2021-08-25 国立研究開発法人理化学研究所 ワンステップ逆転写テンプレートスイッチｐｃｒ
FR3053968A1 (fr) 2016-07-13 2018-01-19 Biomerieux Reactifs pour la protection reversible de molecules biologiques
ES3035263T3 (en) 2016-07-19 2025-09-01 Exact Sciences Corp Methylated control dna
AU2017300534B2 (en) 2016-07-19 2023-11-23 Exact Sciences Corporation Nucleic acid control molecules from non-human organisms
US11460405B2 (en) 2016-07-21 2022-10-04 Takara Bio Usa, Inc. Multi-Z imaging and dispensing with multi-well devices
KR20250103795A (ko) 2016-08-03 2025-07-07 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 아데노신 핵염기 편집제 및 그의 용도
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
CN118207299A (zh) 2016-08-26 2024-06-18 生命技术公司 核酸提取和扩增对照及其使用方法
WO2018044831A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 Integrated Dna Technologies, Inc. Cleavable hairpin primers
ES2956257T3 (es) 2016-09-02 2023-12-18 Mayo Found Medical Education & Res Detección de carcinoma hepatocelular
SG11201903089RA (en) 2016-10-14 2019-05-30 Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
WO2018127786A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Oslo Universitetssykehus Hf Compositions and methods for determining a treatment course of action
JP7289264B2 (ja) 2017-01-27 2023-06-09 エグザクト サイエンシーズ コーポレーション メチル化ｄｎａの分析による結腸腫瘍の検出
CA3049989A1 (en) 2017-02-10 2018-08-16 Zymergen Inc. A modular universal plasmid design strategy for the assembly and editing of multiple dna constructs for multiple hosts
CN110431241B (zh) 2017-02-28 2024-04-19 梅约医学教育与研究基金会 检测前列腺癌
WO2018162516A1 (en) 2017-03-08 2018-09-13 Etablissement Francais Du Sang Rhd gene allele associated with a weak d phenotype and its uses
EP3592381A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Cancer vaccine
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
WO2018165629A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
WO2018176009A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN107312762B (zh) * 2017-06-23 2020-08-11 苏州点晶生物科技有限公司 一种化学修饰ung酶及其修饰方法和应用
US11618891B2 (en) 2017-06-26 2023-04-04 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Thermophilic DNA polymerase mutants
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
USD846383S1 (en) 2017-08-10 2019-04-23 Certa Dose, Inc. Carton
EP3676376B1 (en) 2017-08-30 2025-01-15 President and Fellows of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
JP2021502825A (ja) 2017-11-13 2021-02-04 ライフ テクノロジーズ コーポレイション 尿路微生物検出のための組成物、方法、およびキット
JP7277460B2 (ja) 2017-11-30 2023-05-19 マヨ ファウンデーション フォア メディカル エデュケーション アンド リサーチ 乳癌の検出
US10648025B2 (en) 2017-12-13 2020-05-12 Exact Sciences Development Company, Llc Multiplex amplification detection assay II
WO2019118949A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
US12043851B2 (en) 2018-03-21 2024-07-23 Roche Molecular Systems, Inc. DNA polymerases for efficient and effective incorporation of methylated-dNTPS
CN112424377A (zh) 2018-04-17 2021-02-26 克罗玛科德公司 用于多重分析的方法和系统
US11712522B2 (en) 2018-05-01 2023-08-01 CD Acquistions, LLC System and method for sequential delivery of measured doses of medication
US11679204B2 (en) 2018-05-17 2023-06-20 Cd Acquisitions, Llc Syringe holder for medication dosing
US12157760B2 (en) 2018-05-23 2024-12-03 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
US12203129B2 (en) 2018-07-03 2025-01-21 ChromaCode, Inc. Formulations and signal encoding and decoding methods for massively multiplexed biochemical assays
EP3820495A4 (en) 2018-07-09 2022-07-20 The Broad Institute Inc. RNA-PROGRAMMABLE EPIGENETIC RNA MODIFIERS AND THEIR USES
EP3821020A4 (en) 2018-08-15 2022-05-04 Zymergen Inc. APPLICATIONS OF CRISPRI IN HIGH-PERFORMANCE METABOLIC ENGINEERING
US11408030B2 (en) 2018-09-10 2022-08-09 Andy Madrid Test for detecting Alzheimer's disease
JP7504872B2 (ja) 2018-09-13 2024-06-24 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 改善されたストランド置換能力を有する変異体ｄｎａポリメラーゼ
WO2020092453A1 (en) 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof
US20220017966A1 (en) 2018-11-16 2022-01-20 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and compositions for characterizing bladder cancer
USD943737S1 (en) 2019-01-22 2022-02-15 Certa Dose, Inc. Overdose resistant drug delivery syringe
US12351837B2 (en) 2019-01-23 2025-07-08 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
WO2020154665A1 (en) 2019-01-24 2020-07-30 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detecting endometrial cancer
JP7687957B2 (ja) 2019-03-14 2025-06-03 インシリクサ， インコーポレイテッド 時間ゲート蛍光ベースの検出のための方法およびシステム
EP3942043A2 (en) 2019-03-19 2022-01-26 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
WO2020214842A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
CN110283801A (zh) * 2019-07-16 2019-09-27 遵义医科大学珠海校区 一种dna聚合酶的化学修饰方法
US20230046033A1 (en) 2019-09-16 2023-02-16 Exact Sciences Corporation Structure and temperature-dependent flap endonuclease substrates
US12435330B2 (en) 2019-10-10 2025-10-07 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing RNA
US11702704B2 (en) 2019-10-31 2023-07-18 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detecting ovarian cancer
EP3901286A1 (en) 2020-04-24 2021-10-27 Mirnax Biosens, S.L. Bivalent reverse primer
US20220389497A1 (en) 2019-11-04 2022-12-08 Mirnax Biosens, S.L. Bivalent reverse primer
CN116113714A (zh) 2020-02-18 2023-05-12 生命技术公司 用于检测病毒序列的组合物、试剂盒和方法
BR112022022603A2 (pt) 2020-05-08 2023-01-17 Broad Inst Inc Métodos e composições para edição simultânea de ambas as fitas de sequência alvo de nucleotídeos de fita dupla
EP4157856A2 (en) 2020-05-26 2023-04-05 Qiagen Beverly, LLC Polymerase enzyme
JP2023539128A (ja) 2020-08-19 2023-09-13 マヨ ファウンデーション フォア メディカル エデュケーション アンド リサーチ 非ホジキンリンパ腫の検出
US12509668B2 (en) 2020-08-28 2025-12-30 Duke University Engineered polymerases and methods of using the same
JP2023543803A (ja) 2020-09-24 2023-10-18 ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド プライム編集ガイドｒｎａ、その組成物、及びその使用方法
CN112359031A (zh) * 2020-11-16 2021-02-12 北京丹大生物技术有限公司 一种热启动dna聚合酶及其制备方法和应用
EP4274894A2 (en) 2021-01-11 2023-11-15 The Broad Institute, Inc. Prime editor variants, constructs, and methods for enhancing prime editing efficiency and precision
US20250270619A1 (en) 2021-01-18 2025-08-28 Life Technologies Corporation Compositions, kits and methods for direct amplification from crude biological samples
WO2022159874A1 (en) 2021-01-25 2022-07-28 Life Technologies Corporation Compositions, kits and methods for detection of viral variant sequences
CN114958797B (zh) * 2021-02-20 2025-03-25 郑州思昆生物工程有限公司 突变型dna聚合酶、编码基因、重组表达载体、重组菌及其应用
US20250333806A1 (en) 2021-03-23 2025-10-30 Life Technologies Corporation Compositions, kits, and methods for variant-resistant detection of target viral sequences
WO2023014729A1 (en) 2021-08-02 2023-02-09 Life Technologies Corporation Compositions, kits, and methods for detection of nucleic acid sequence loads
WO2023021330A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 University Of Oslo Compositions and methods for determining a treatment course of action
EP4419712A1 (en) 2021-10-20 2024-08-28 Life Technologies Corporation Compositions, kits, and methods for quantification of nucleic acid sequences using an internal quantitative standard
WO2023076898A1 (en) 2021-10-25 2023-05-04 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing a genome with prime editing and a recombinase
CN116410951A (zh) * 2021-12-30 2023-07-11 广州达安基因股份有限公司 一种提高化学修饰的Taq酶的活性的方法和经该方法处理的Taq酶
US20250145989A1 (en) 2022-01-26 2025-05-08 Seegene, Inc. Method for detecting target nucleic acids in sample
CN119768474A (zh) 2022-06-29 2025-04-04 生命科技股份有限公司 多重染料化合物
WO2024006924A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Life Technologies Corporation Systems and methods for analyte detection from multiplexed assays
CN116024320A (zh) * 2022-07-13 2023-04-28 上海翔琼生物技术有限公司 一种用于检测核酸的荧光定量pcr方法
WO2024054925A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Life Technologies Corporation Compositions, kits and methods for detection of viral variant sequences
WO2024102839A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Life Technologies Corporation Compositions, kits, and methods for detection of viral sequences
EP4619515A1 (en) 2022-11-17 2025-09-24 The Broad Institute, Inc. Prime editor delivery by aav
WO2024148013A1 (en) 2023-01-02 2024-07-11 Life Technologies Corporation Compositions, kits and methods for detection of viral sequences
US20240254568A1 (en) 2023-01-27 2024-08-01 Life Technologies Corporation Compositions, kits, and methods for detecting sti pathogen sequences
CN121335987A (zh) 2023-05-12 2026-01-13 生命科技股份有限公司 用于多重聚合酶链式反应过程和数据分析的系统和方法
WO2025151807A1 (en) 2024-01-11 2025-07-17 Life Technologies Corporation Crude lysate sample extraction for digital pcr
WO2025175212A1 (en) 2024-02-15 2025-08-21 Life Technologies Corporation Methods for rapid extraction-free genotyping
WO2025175243A1 (en) 2024-02-15 2025-08-21 Life Technologies Corporation Amplification and data collection protocol for rapid genotyping
WO2026055641A1 (en) 2024-09-06 2026-03-12 Exact Sciences Corporation Methods and compositions for preparing biomolecule analytes from complex samples

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI69503C (fi) * 1984-03-13 1986-02-10 Neste Oy Ytbelagd bergsbehaollare eller tunnel
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5374553A (en) * 1986-08-22 1994-12-20 Hoffmann-La Roche Inc. DNA encoding a thermostable nucleic acid polymerase enzyme from thermotoga maritima
JP2641935B2 (ja) * 1987-09-28 1997-08-20 ノボ‐ノルディスク アクティーゼルスカブ リパーゼの固定化方法
US5108892A (en) * 1989-08-03 1992-04-28 Promega Corporation Method of using a taq dna polymerase without 5'-3'-exonuclease activity
ATE169337T1 (de) * 1989-12-22 1998-08-15 Hoffmann La Roche Rekombinante expressionsvektoren und reinigungsverfahren für dns-polymerase aus thermus thermophilus
EP0894860B1 (en) * 1990-09-28 2012-12-12 F. Hoffmann-La Roche AG Thermostable DNA polymerases and deletion mutants thereof
FR2674248B1 (fr) * 1991-03-19 1993-06-11 Elf Aquitaine Procede de modification chimique des proteines.
US5338671A (en) * 1992-10-07 1994-08-16 Eastman Kodak Company DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody
EP0655506B1 (en) * 1994-10-17 1996-09-18 President And Fellows Of Harvard College DNA polymerases having modified nucleotide binding site for DNA sequencing

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10276776A (ja) * 1997-04-07 1998-10-20 Toyobo Co Ltd 可逆的に不活化された耐熱性ｄｎａポリメラーゼ
JP2000004878A (ja) * 1998-05-29 2000-01-11 Qiagen Gmbh 熱安定性酵素の可逆性修飾の方法
JP2002199877A (ja) * 2000-11-30 2002-07-16 Advanced Biotechnologies Ltd 酵素の可逆的な不活性化およびその酵素を含むキット
JP2003199592A (ja) * 2001-12-03 2003-07-15 F Hoffmann La Roche Ag インビトロｄｎａ合成および増幅のための可逆的に修飾された熱安定酵素
JP2008005841A (ja) * 2006-06-28 2008-01-17 Qiagen Gmbh 可逆的に不活化された耐熱性酵素の再活性化の増強
US8728786B2 (en) 2006-06-28 2014-05-20 Qiagen Gmbh Enhancing reactivation of thermostable reversibly inactivated enzymes
JP2017104108A (ja) * 2008-04-30 2017-06-15 インテグレイテツド・デイー・エヌ・エイ・テクノロジーズ・インコーポレイテツド 修飾されたｒｎａ単量体を用いるｒｎアーゼｈを基礎とするアッセイ
JP2015500636A (ja) * 2011-12-02 2015-01-08 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 高相同性オリゴヌクレオチドによる非特異的増幅の抑制
JP2016507221A (ja) * 2012-12-20 2016-03-10 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 熱安定性ｄｎａポリメラーゼの特徴づけ
JP2018516072A (ja) * 2015-05-29 2018-06-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ シトラコン酸無水物によって微生物を不活性化する方法

Also Published As

Publication number Publication date
MX9603608A (es) 1997-03-29
AU689047B2 (en) 1998-03-19
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DK0771870T3 (da) 1999-09-20
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HUP9602289A3 (en) 2000-07-28
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HUP9602289A2 (en) 1997-05-28
CN1151437A (zh) 1997-06-11
ATE176499T1 (de) 1999-02-15
BR9603563A (pt) 1998-05-19
KR100221097B1 (ko) 1999-10-01
EP0771870B1 (en) 1999-02-03
RU2174556C2 (ru) 2001-10-10
US5773258A (en) 1998-06-30
NO963541L (no) 1997-02-26
US5677152A (en) 1997-10-14
DE771870T1 (de) 1997-10-09
NO963541D0 (no) 1996-08-23
EP0771870A1 (en) 1997-05-07
CA2184105A1 (en) 1997-02-26
DE69601488D1 (de) 1999-03-18
PL185711B1 (pl) 2003-07-31
HU9602289D0 (en) 1996-10-28
CN1282741C (zh) 2006-11-01
HU221750B1 (hu) 2002-12-28
IL119088A0 (en) 1996-11-14
ES2101668T1 (es) 1997-07-16
CZ289237B6 (cs) 2001-12-12
IL119088A (en) 2000-07-16

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