JPH10276788A - フェルラ酸脱炭酸酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 香味の優れた蒸留酒の製造に有用なフェルラ
酸脱炭酸酵素を提供する。 【解決手段】 配列番号１で表されるアミノ酸配列から
なるタンパク質または配列番号１で表されるアミノ酸配
列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつフェルラ酸脱炭酸酵素活性を
有するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、
該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクター
を含む形質転換体、該形質転換体に由来しかつフェルラ
酸脱炭酸酵素活性有する酵素源を用いる４−ビニルグア
ヤコール、バニリンもしくはバニリン酸または蒸留酒の
製造方法、酸脱炭酸酵素活性を増大させた酵母を用いる
蒸留酒の製造方法、および上記の蒸留酒の製造方法によ
り得られる蒸留酒に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、フェルラ酸脱炭酸
酵素遺伝子を導入した酵母を用いた香味の優れた蒸留酒
の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】焼酎、ウイスキー、ブランデー、ウォッ
カ、ラム、ジン、白酒等の蒸留酒において、香味の優れ
たものの開発は常に望まれている。優れた香味を有する
蒸留酒には、４−ビニルグアヤコール、バニリンまたは
バニリン酸が多く含まれている。

【０００３】バニリンおよびバニリン酸は、４−ビニル
グアヤコールが酸化されて生成する［日本農芸化学会
誌, 70, 684-686, (1996) ］。香味の優れた蒸留酒を製
造する方法として、ヒドロキシシナミック酸エステル加
水分解酵素もしくは該酵素を高生産する麹菌（特開平７
−１１５９５７号公報）、またはフェルラ酸エステラー
ゼ［日本農芸化学会誌, 70, 684-686 (1996)］を添加し
て、フェルラ酸をモロミ中に遊離させる方法が知られて
いる。

【０００４】また、細胞融合によりフェルラ酸脱炭酸酵
素活性の高い酵母を取得する方法が、提案されている
［平成７年度生物工学会大会要旨集, 41 (1995) ］。し
かし、フェルラ酸脱炭酸酵素活性を高められた酵母は得
られておらず、かかる酵母を用いて香味の優れた蒸留酒
を製造する方法は知られていない。フェルラ酸脱炭酸酵
素は、フェルラ酸を脱炭酸して４−ビニルグアヤコール
を生成する反応を触媒する酵素である。

【０００５】フェルラ酸は、ケイ皮酸、クマル酸等とと
もにフェニルアクリル酸の一種であり、穀物等の植物の
細胞壁を構成するヘミセルロース画分に含まれるアラビ
ノキシランのアラビノース側鎖にエステル結合して存在
する。バチルス・プミルス（Bachillus pumilus ）［ア
プライド・アンド・エンバイロメンタル・ミクロバイオ
ロジー（Appl. Environ. Microbiol. ）, 61, 326-332
(1995) およびシュードモナス・フルオレセンス（Pseud
omonas fluorescens ）［ジャーナル・オブ・バクテリ
オロジー(J. Bacteriol.), 176, 5912-5918(1994) ］の
フェルラ酸脱炭酸酵素は、単離精製されている。しか
し、サッカロマイセス（Saccharomyces ）属等に属する
酵母のフェルラ酸脱炭酸酵素は、該酵素活性の存在が知
られているだけで、単離精製はなされていない。

【０００６】バチルス・プミルス（B. pumilus ）のフ
ェルラ酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子（以下、ＦＤＣ
遺伝子という）［Appl. Environ. Microbiol., 61, 448
4-4486 (1995) ］は知られている。また、サッカロマイ
セス・セレビジェ（S. cerevisiae）ではフェニルアク
リル酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子（以下、ＰＡＤ１
遺伝子という）［ジーン（Gene）, 142 , 107-112 (199
4)］が知られているが、ＦＤＣ遺伝子は知られていな
い。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、香味の優れ
た蒸留酒の製造に有用なフェルラ酸脱炭酸酵素を提供す
ることを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列番号１で
表されるアミノ酸配列からなるタンパク質または配列番
号１で表されるアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、
置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつフ
ェルラ酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質（以下、本
発明のタンパク質という）、該タンパク質をコードする
遺伝子（以下、本発明の遺伝子という）、該遺伝子を含
有する組換えベクター（以下、本発明の組換えベクター
という）、該組換えベクターを含む形質転換体（以下、
本発明の形質転換体という）、該形質転換体に由来しか
つフェルラ酸脱炭酸酵素活性を有する酵素源の存在下、
水性媒体中でフェルラ酸を反応させ、水性媒体中に生成
した４−ビニルグアヤコール、バニリンまたはバニリン
酸を採取することを特徴とする、４−ビニルグアヤコー
ル、バニリンまたはバニリン酸の製造方法（以下、本発
明の４−ビニルグアヤコール、バニリンまたはバニリン
酸の製造方法という）、モロミ中に該形質転換体に由来
しかつフェルラ酸脱炭酸酵素活性を有する酵素源を添加
することを特徴とする蒸留酒の製造方法（以下、本発明
のタンパク質を用いる蒸留酒の製造方法という）、フェ
ルラ酸脱炭酸酵素活性を増大させた酵母を用いることを
特徴とする蒸留酒の製造方法（以下、本発明の酵母を用
いる蒸留酒の製造方法という）、および上記の蒸留酒の
製造方法により得られる蒸留酒に関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明のタンパク質は、フェルラ
酸脱炭酸酵素活性を有しさえすれば、配列番号１で表さ
れるアミノ酸配列においてアミノ酸残基が欠失、置換も
しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であ
ってもよい。欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸残
基の数は特に限定されないが、１個から数十個、特に１
個から数個までのアミノ酸残基であることが好ましい。
また、ＤＮＡＳＩＳver3.0（日立ソフトウエアエンジニ
アリング製）を用いて、全アミノ酸配列について配列番
号１で示されるアミノ酸配列とシンプルホモロジー解析
を行った場合に、２０％以上、特に４０％以上のホモロ
ジーを有するアミノ酸配列であることが好ましい。

【００１０】本発明の遺伝子の単離、該遺伝子の塩基配
列の決定、本発明の組換えベクター、本発明の組換えベ
クターを含む形質転換体および本発明のタンパク質の製
造を行うための遺伝子工学または生物工学の基本操作に
ついては、市販の実験書、例えば、遺伝子マニュアル
講談社、高木康敬編 遺伝子操作実験法 講談社、モレ
キュラー・クローニング（Molecular Cloning ）コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Sprin
g Harbor Laboratory ）(1982)、モレキュラー・クロー
ニング第２版（Molecular Cloning, 2nd ed.）コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring
Harbor Laboratory ）(1989)、メソッズ・イン・エンザ
イモロジー（Methods in Enzymol. ）, 194 (1991)、実
験医学別冊・酵母による遺伝子実験法 羊土社(1994)等
に記載された方法に従って行うことができる。

【００１１】本発明の遺伝子は、フェルラ酸脱炭酸酵素
活性を有しない酵母または該酵素活性が著しく低い酵母
（以下、併せてフェルラ酸脱炭酸酵素活性を実質的に有
しない酵母という）、例えばサッカロマイセス・セレビ
ジェＫ９Ｈ１４株（以下、Ｋ９Ｈ１４株という）に該酵
素活性を付与する遺伝子として単離することができる。
すなわち、ＦＤＣ遺伝子をもつ酵母のＤＮＡライブラリ
ーでＫ９Ｈ１４株を形質転換して、フェルラ酸脱炭酸酵
素活性が付与された酵母からＤＮＡを取得することによ
り、ＦＤＣ遺伝子として単離することができる。

【００１２】ＦＤＣ遺伝子を持つ酵母のＤＮＡライブラ
リーはフェルラ酸脱炭酸酵素活性を有する酵母、例えば
ワイン酵母であるサッカロマイセス・セルビジェＷ３株
（以下、Ｗ３株という）の染色体ＤＮＡを制限酵素で切
断し、得られたＤＮＡ断片を酵母中で保持することが可
能なベクターと連結することによって作製することがで
きる。

【００１３】染色体ＤＮＡの切断に用いる制限酵素とし
ては、染色体ＤＮＡを切断できればいずれも用いること
ができるが、好ましくは１０Ｋｂｐ以下のＤＮＡ断片を
生じさせる制限酵素が用いられる。なお、染色体ＤＮＡ
は制限酵素によって完全に切断しても、部分的に切断し
てもよい。酵母中で保持することが可能なベクターとし
ては、ＹＣｐ型ベクター、ＹＥｐ型ベクター、ＹＲｐ型
ベクター、ＹＩｐ型ベクターおよびＹＡＣ（酵母人工染
色体）ベクター等があげられる。

【００１４】ＤＮＡライブラリーのＫ９Ｈ１４株への形
質転換は、スフェロプラスト法［例えばプロシーディン
グス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
スUSA(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 1929-1933
(1978)］、酢酸リチウム法［例えばJ. Bacteriol., 15
3 , 163-168 (1983)］、エレクトロポレーション法［例
えばMethods in Enzymol., 194 , 182-187 (1991) ］
等、遺伝子工学ないし生物工学の分野で慣用されている
方法に従って行うことができる。

【００１５】フェルラ酸脱炭酸酵素活性を付与された酵
母を選択する方法としては、例えば以下の方法があげら
れる。上記方法により得られた形質転換株をＹＰＤ液体
培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコー
ス）で一晩（２０〜２４時間）培養し、得られた培養液
０．９ｍｌに１ｇ／ｌフェルラ酸溶液を０．１ｍｌ加
え、一晩（２０〜２４時間）培養する。培養終了後、く
ん煙臭のする培養液を官能的に選択し、さらに高速液体
クロマトグラフィー［日本農芸化学会誌, 69, 1587-159
6, (1995) ］により４―ビニルグアヤコールが検出でき
る培養液を選択する。選択した培養液から形質転換株を
回収し、回収して得られた株をフェルラ酸脱炭酸酵素活
性が付与された酵母として選択する。

【００１６】フェルラ酸としては、トランス−フェルラ
酸、シス−フェルラ酸のいずれを用いてもよいが、トラ
ンス−フェルラ酸が好適に用いられる。フェルラ酸脱炭
酸酵素活性が付与された酵母からプラスミドを回収する
方法および回収したプラスミドを大腸菌に形質転換する
方法としては、遺伝子工学の分野で慣用されている方法
を用いることができる。上記酵母からプラスミドを回収
する方法としては、例えば実験医学別冊・酵母による遺
伝子実験法、羊土社(1994)に記載されている方法が、回
収したプラスミドを大腸菌に形質転換する方法として
は、例えばMolecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring
Harbor Laboratory(1989)) に記載されている方法があ
げられる。

【００１７】上記方法により選択されたＤＮＡクローン
を、適当な制限酵素、例えばＰｓｔＩなどで切断し、得
られたＤＮＡ断片を、ダイデオキシ法およびＤＮＡシー
ケンサー（ファルマシアＬＫＢ社製、ＡＬＦ ＤＮＡシ
ークエンサーII）の解析を行うことにより、ＦＤＣ遺伝
子の塩基配列を決定することができる。なお、Ｗ３株由
来のＦＤＣ遺伝子の塩基配列は、酵母ゲノム・プロジェ
クトの結果［例えばインターネットhttp://genome-www.
stanford.edu/sacchdb／］より得ることができる。

【００１８】このようにして決定されるＦＤＣ遺伝子の
塩基配列として、例えば配列番号１で示される塩基配列
があげられる。配列番号１で示される塩基配列がフェル
ラ酸脱炭酸酵素をコードすることが一旦確定されると、
その後は、化学合成によって、またはＰＣＲ（Polymera
se Chain Reaction)法によって、あるいは該塩基配列を
有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせ
ることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。

【００１９】本発明の遺伝子は、上記により作製された
遺伝子をさらに人為的に遺伝子の塩基配列の一部を改
変、例えば欠失、置換または挿入することによっても得
られる。なお、アミノ酸に対するコドンの選択は任意で
よく、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して
決定することができる［例えばヌクレイック・アシッズ
・リサーチ（Nucleic Acids Res.）, 9, 43-74 (1981)
］。また、塩基配列の改変は、サイトスペシフィック
・ミュータジェネシス［例えばProc. Natl. Acad.Sci.
USA, 81, 5662-5666 (1984)］等の方法に従って行うこ
とができる。

【００２０】本発明の遺伝子は、例えばMethods in Enz
ymol., 194 , 594-597 (1991) に記載の方法を用いるこ
とにより、遺伝子の破壊、発現制御、発現量の改変等を
行うこともできる。本発明の組換えベクターは、本発明
の遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素等を用いて調製し
た後に、該ＤＮＡ断片を発現ベクター中のプロモーター
の下流に挿入することにより作製することができる。

【００２１】本発明の組換えベクターにおいては、本発
明の遺伝子の塩基配列を宿主細胞での発現に最適なコド
ンとなるように、必要に応じて塩基を置換して用いるこ
とが好ましい。本発明の組換えベクターにおいては、本
発明の遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要で
はないが、好適には構造遺伝子の直下に転写終結配列を
配置することが好ましい。

【００２２】本発明の形質転換体は、上記の発現ベクタ
ーに適合する宿主細胞中に本発明の組換えベクターを導
入することにより得られる。宿主細胞としては、目的と
する遺伝子を発現できるもであれば、例えばEscherichi
a coli 、Bacillus subtilis、Bacillus amylolique
faciens 、Brevibacterium flavum、Brevibacterium
lactofermentum、Corynebacterium glutamicum 、Micr
obacterium ammoniaphilum 等のエシェリヒア属、セラ
チア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
属、シュードモナス属、バチルス属等に属する細菌、Sa
ccharomyces cerevisiae 、Schizosaccharomyces pom
be、Kluyveromyces lactis 、Trichosporon pullulan
s 、Schwanniomyces alluvius等の酵母、ナマルバ細
胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、タバコ細
胞、ニンジン細胞等の植物細胞など、いずれを用いても
よい。

【００２３】発現ベクターとしては、上記宿主細胞にお
いて自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能
で、本発明の組換えタンパク質をコードする配列が転写
できるようにプロモーターを含有しているものが用いら
れる。大腸菌等の細菌を宿主細胞として用いる場合に
は、本発明の組換えベクターは該微生物中で自立複製可
能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配
列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列より構成されている
ことが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含ま
れていてもよい。

【００２４】発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒ
ｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもBoehring
er Mannheim 社製）、ｐＫＹＰ２００［Agric. Biol. C
hem., 48, 669-675 (1984)］、ｐＬＳＡ１［Agric. Bio
l. Chem., 53, 277 (1989)］、ｐＧＥＬ１［Proc. Nat
l. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)」、pBluescript
（Stratagene社製）等が用いられる。

【００２５】プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細
胞中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。
例えば、trp プロモーター（Ｐtrp ）、lac プロモータ
ー（Ｐlac ）、P _L プロモーター、P _R プロモーターな
どの、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用
いられる。Ｐtrp を２つ直列させたプロモーター（Ｐtr
p ｘ２）、tac プロモーターのように人為的に設計改変
されたプロモーター等を用いてもよい。

【００２６】リボソーム結合配列としては、大腸菌等の
宿主細胞中で発現できるものであればいずれも用いられ
るが、リボソーム結合配列と開始コドンとの間を適当な
距離（例えば６〜１８塩基）に調節して用いることが好
ましい。細菌への組換えベクターの導入方法としては、
細菌にＤＮＡを導入する方法であれば、例えば、カルシ
ウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci., US
A, 69, 2110-2114 (1972) ］、プロトプラスト法（特開
昭63-2483942）等、いずれの方法も用いられる。

【００２７】酵母を宿主細胞として用いる場合には、発
現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ATCC37115
）、ＹＥｐ２４（ATCC37051 ）、ＹＣｐ５０（ATCC374
19 ）等が用いられる。プロモーターとしては、酵母中
で発現できるものであれば、例えば、ヘキソースキナー
ゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、gal 1 プロモー
ター、gal 10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロ
モーター、MFα1 プロモーター、CUP 1プロモーター
等、いずれのものを用いてもよい。

【００２８】酵母への組換えベクターの導入方法として
は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば、例えば、エ
レクトロポレーション法［Methods in Enzymol., 194,
182-187 (1990)］、スフェロプラスト法［Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 84, 1929-1933 (1978) ］、酢酸リチ
ウム法［J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983)］等、い
ずれの方法も用いられる。

【００２９】動物細胞を宿主細胞として用いる場合に
は、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍ
ｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（いずれもフナコシ社
製）等が用いられる。この場合、プロモーターとして
は、動物細胞中で発現できるものであれば、例えば、ヒ
トＣＭＶのIE(immediate early) 遺伝子のプロモーター
等、いずれのものを用いてもよい。また、ヒトＣＭＶの
IE遺伝子のエンハンサーをプロモーターとともに用いて
もよい。

【００３０】動物細胞への組換えベクターの導入方法と
しては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であれば、例
えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー
(Cytotechnology), 3, 133(1990)］、リン酸カルシウム
法（特開平2-227075）、リポフェクション法［Proc. Na
tl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)］等、いずれの
方法も用いられる。

【００３１】植物細胞を宿主細胞として用いる場合に
は、発現ベクターとして、例えば、ｐＢＩ１２１［Nucl
eic Acids Res., 12, 8771-8721 (1984)］等が用いられ
る。この場合、プロモーターとしては、植物細胞中で発
現できるものであれば、例えば、カリフラワー・モザイ
ク・ウィルスの３５Ｓプロモーター等、いずれのものを
用いてもよい。

【００３２】植物細胞への組換えベクターの導入方法と
しては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であれば、例
えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agroba
cterium tumefaciens）法［Methods in Enzaymol., 11
8, 627-640 (1986) ］、高速微粒子法［プラント・モレ
キュラー・バイオロジー（Plant Molecular Biology）,
11, 433-439 (1989)］、プロトプラスト法［ネイチャ
ー（Nature）, 319, 791-793 (1986) ］等、いずれの方
法も用いられる。

【００３３】本発明の形質転換体は、本発明のタンパク
質の製造、４−ビニルグアヤコール、バニリンまたはバ
ニリン酸等のフレーバーの製造等に用いられる。また、
宿主細胞が酵母である本発明の形質転換体は、香味の優
れた蒸留酒の製造に好適に用いられる。本発明のタンパ
ク質は、本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中
に本発明のタンパク質を生成蓄積させ、該培養物から該
タンパク質を採取することにより製造することができ
る。

【００３４】本発明の形質転換体を培地に培養する方法
は、該形質転換体の宿主細胞を培養するときに用いられ
る通常の方法に従って行われる。大腸菌や酵母菌等の微
生物を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する場
合、培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素
源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に
行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用い
てもよい。

【００３５】炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、スクロース、糖蜜、デンプン、デンプン加水分解物
等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノ
ール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム、りん酸アンモニウム
等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその
他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆
粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体またはその消
化物等が用いられる。

【００３６】無機物としては、りん酸第一カリウム、り
ん酸第二カリウム、りん酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。培養は、通常振
盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下、１
５〜４０℃で１６〜９６時間行う。培養期間中、ｐＨは
３. ０〜９. ０に保持する。

【００３７】培養中は必要に応じて、アンピシリンやテ
トラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現
ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必
要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例
えば、lac プロモーターを用いた発現ベクターで形質転
換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、trp プロ
モーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を
培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を
培地に添加してもよい。

【００３８】動物細胞を宿主細胞として得られた形質転
換体を培養する場合、動物細胞が資化し得る炭素源、窒
素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的
に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用
いてもよいが、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭ
ＥＭ培地またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培
地等が通常用いられる。

【００３９】培養は、通常５％ＣＯ₂ 存在下、３５〜３
７℃で３〜７日間行う。培養中は必要に応じて、カナマ
イシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。植物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培
養する場合、植物細胞が資化し得る炭素源、窒素源、無
機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える
培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよ
いが、ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Wh
ite ）培地等が通常用いられる。

【００４０】培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌
培養などの好気的条件下、１５〜４０℃で１〜３０日間
行う。培養期間中、ｐＨは３. ０〜９. ０に保持する。
培養中は必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の
抗生物質を培地に添加してもよい。培養終了後、本発明
の形質転換体の細胞内または細胞外に生産される本発明
のタンパク質を単離精製するには、通常の酵素の単離、
精製法を用いればよい。細胞内に本発明のタンパク質が
生産される場合、該培養液を遠心分離した菌体を回収
し、該菌体を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプ
レス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等
により菌体を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽
出液を遠心分離することにより得られた上清から、硫安
等による塩析、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セ
ファロースなどの陰イオン交換クロマトグラフィー、ブ
チルセファロース、フェニルセファロースなどの疎水性
クロマトグラフィー、分子篩を用いたゲル濾過法、等電
点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いることによ
り、本発明のタンパク質の精製酵素標品を得ることがで
きる。細胞外に本発明のタンパク質が生産される場合、
該培養液から無細胞抽出液から精製するのと同様の方法
を用いることにより、本発明のタンパク質の精製酵素標
品を得ることができる。

【００４１】本発明の４−ビニルグアヤコール、バニリ
ンまたはバニリン酸の製造方法には、本発明の形質転換
体に由来しかつフェルラ酸脱炭酸酵素活性を有する酵素
源として、上記方法により得られる粗精製または精製し
た本発明のタンパク質の他、本発明の形質転換体の培養
物、菌体、菌体処理物等が用いられる。菌体処理物とし
ては、洗浄菌体、凍結乾燥菌体、アセトン処理菌体等の
物理化学的、生化学的に処理した菌体等があげられる。

【００４２】酵素源は、水性媒体中にフェルラ酸脱炭酸
酵素の酵素量単位として０．１〜１０００単位／ｍｌの
濃度範囲で通常は用いられる。なお、フェルラ酸脱炭酸
酵素の酵素量単位は、フェルラ酸を基質として５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中で、３０℃、１時間反応
を行った場合に１ｎｍｏｌの４−ビニルグアヤコールを
生成する酵素量をそれぞれ１単位として表示する。

【００４３】酵素源として培養物または菌体を用いる場
合は、培養物または菌体をセチルピリジウムクロライ
ド、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド等の界面
活性剤またはトルエン、キシレン等の有機溶剤を添加し
てもよい。界面活性剤または有機溶剤を添加する場合に
は、その添加量はそれぞれ０．０５〜１．０％（ｗ／
ｖ）または１〜２０％（ｖ／ｖ）であればよい。

【００４４】フェルラ酸は、通常は水性媒体中に０．０
１〜１０ｇ／ｌの濃度範囲で用いられる。反応は、培養
物、菌体または菌体処理物の量およびフェルラ酸の量に
より異なるが、２０〜６０℃、ｐＨ２．５〜１０．０
で、１〜７２時間行う。このようにして得られる該水性
媒体中には、４−ビニルグアヤコールが存在している。
反応終了後、該水性媒体より、培養物、菌体または菌体
処理物などを必要に応じて破砕後、沈澱物を遠心分離な
どの手段により除去し、得られる上清から、抽出、蒸
留、各種クロマトグラフィー、再結晶等、通常の方法用
いることにより、４−ビニルグアヤコールを単離、精製
することができる。

【００４５】バニリンまたはバニリン酸は、該水性媒体
中または該水性媒体から単離、精製された４−ビニルグ
アヤコールを、例えばエアレーション等により強制酸化
させるか、バチルス・サチルス（B. subtilis) 、コリ
ネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium Glu
tamicum ）等の菌体により酸化させる［ジャーナル・オ
ブ・インダストリアル・マイクロバイオロジー（J. In
d. Microbiol.）, 15,457-471 (1995)］ことにより、バ
ニリンまたはバニリン酸に変換することができる。

【００４６】バニリンまたはバニリン酸は、４−ビニル
グアヤコールを単離、精製する方法と同様な方法を用い
ることにより単離、精製することができる。本発明のタ
ンパク質を用いる蒸留酒の製造方法としては、本発明の
形質転換体に由来しかつフェルラ酸脱炭酸酵素活性を有
する酵素源を、モロミ中にフェルラ酸脱炭酸酵素の酵素
量単位として０．１〜５０単位／ｍｌとなるように添加
する以外は、炭素源を麹菌または糖化酵素で糖化し、酵
母を加えてアルコール発酵させた後に蒸留する、通常の
蒸留酒を製造方法が用いられる。

【００４７】本発明においてモロミとは、アルコール発
酵を通じて得られる培養物をいう。本発明の酵母を用い
る蒸留酒の製造方法としては、フェルラ酸脱炭酸酵素活
性を増大させた酵母を用いる以外は、炭素源を麹菌また
は糖化酵素で糖化し、酵母を加えてアルコール発酵させ
た後に蒸留する、通常の蒸留酒を製造方法が用いられ
る。

【００４８】フェルラ酸脱炭酸酵素活性を増大させた酵
母とは、宿主細胞または親株となる酵母に遺伝子組換え
技術、突然変異技術等を施して得られる、宿主細胞また
は親株となる酵母に比べてフェルラ酸脱炭酸酵素活性が
増大した酵母をいう。遺伝子組換え技術を用いる場合、
フェルラ酸脱炭酸酵素活性を増大させた酵母は、フェル
ラ酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子、例えば本発明に用
いる遺伝子、バチルス・プミルスのＦＤＣ遺伝子等を含
有する組換えベクターを上記方法により作製し、これを
上記方法により宿主細胞に形質転換することにより製造
することができる。

【００４９】突然変異技術を用いる場合、フェルラ酸脱
炭酸酵素活性を増大させた酵母は、親株に紫外線照射や
エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの変異誘発剤を処理する
等、通常の変異手段により変異させ、得られた変異株を
上記のフェルラ酸脱炭酸酵素活性を付与された酵母を選
択する方法と同様の方法を用いて親株に比べて４−ビニ
ルアヤコール生産性が向上した株を選択することにより
製造することができる。親株を変異処理した後、親株が
十分に生育できないような濃度のフェニルアクリル酸を
含む培地、例えばフェルラ酸を１ｍＭ以上含む培地で、
親株に比べて有意に生育可能な変異株を選択すれば、フ
ェルラ酸脱炭酸酵素活性を増大させた酵母が効率的に製
造することができる。

【００５０】フェルラ酸脱炭酸酵素活性を増大させた酵
母を製造するために用いる宿主細胞または親株として
は、蒸留酒の製造に用いられる酵母であればいずれの酵
母も用いられるが、好ましくはサッカロマイセス属に属
する酵母、さらに好ましくはサッカロマイセス・セレビ
ジェに属する酵母が用いられる。また、宿主細胞として
は、フェルラ酸脱炭酸酵素活性を実質的に有しないサッ
カロマイセス・セレビジェに属する酵母、例えば日本醸
造協会７号、日本醸造協会９号、Ｋ９Ｈ１４株（以上、
清酒、焼酎酵母）、ＩＦＯ２１１２、ＩＦＯ２１１４、
ＩＦＯ２１１５（以上、ウイスキー酵母）を用いると顕
著な効果が得られる。

【００５１】例えば、フェルラ酸脱炭酸酵素活性を実質
的に有しない酵母を宿主細胞とした場合には、本発明の
形質転換体の作製方法と同様の方法を用いて作製した形
質転換体に基質としてフェルラ酸を添加し、官能的にあ
るいは高速液体クロマトグラフィー等の機器を用いて定
量的に４―ビニルグアヤコールを検出し、４―ビニルグ
アヤコールの生成が確認できた株を選択することによ
り、本発明の酵母を作製することができる。

【００５２】上記の方法によって作製された本発明の酵
母としては、例えばサッカロマイセス・セレビジェＹＳ
Ａ７株（以下、ＹＳＡ７株という）があげられる。ＹＳ
Ａ７株は、ブダペスト条約に基づいて平成８年１２月１
１日付で、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にＦＥＲＭＢＰ
−５７７２として寄託されている。

【００５３】ＹＳＡ７株が、フェルラ酸脱炭酸酵素活性
を増大させた酵母であることを以下に示す。

【００５４】試験例１ フェルラ酸脱炭酸酵素活性能試
験 １０ｍｌのＹＰＤ培地の入った試験管にＹＳＡ７株、そ
の親株であるＫ９Ｈ１４株、Ｋ９Ｈ１４株にＹＥｐ２４
を導入した形質転換体であるＫ９Ｈ１４−Ｃ株を、それ
ぞれ１白金耳ずつ植菌し、３０℃で２２時間振とう培養
し、得られた培養液０．９ｍｌに１ｇ／ｌフェルラ酸溶
液を０．１ｍｌ加え、２５℃で２２時間静置培養した。
培養終了後、培養液上清中の４―ビニルグアヤコール含
量を以下に示す条件で高速液体クロマトグラフィーによ
り定量した。

【００５５】 カラム：Wakosil 5C 18-200(i.d.4.6 ×250mm) カラム温度：５０℃ 移動相：１０ｍＭリン酸緩衝液(pH2.5) ／メタノール＝
５０／５０（ｖ／ｖ） 検出器：蛍光検出器(Ex 280nm, Em 320nm) 試料：培養液上清を移動相で１０倍希釈し、１０μｌ注
入 結果を第１表に示す。

【００５６】

【表１】

【００５７】上記方法により作製されたフェルラ酸脱炭
酸酵素活性を増大させた酵母を用いた、本発明の蒸留酒
の製造方法を以下に示す。炭素源としては、いかなる糖
質および澱粉質も用いられるが、好ましくは米、麦、あ
わ、とうもろこし、こうりゃん、ひえ、きび等の穀類、
イモ類、そば、ブドウ、リンゴ等の果実またはこれらの
麹が、さらに好ましくは穀類またはこれらの麹が用いら
れる。

【００５８】麹菌としては、米麹、麦麹、ふすま麹等に
用いられる糸状菌、例えばアスペルギルス（Aspergillu
s ）属、リゾップス（Rhizopus）属に属する微生物等が
用いられる。糖化酵素としては、麦芽に含まれる酵素、
麹菌が生産する酵素、またはα−アミラーゼ、グルコア
ミラーゼ、プロテアーゼ等の酵素剤等が用いられる。

【００５９】アルコール発酵としては、以下の方法が例
示される。穀類を用いる場合には、穀類である澱粉質を
まず糖化酵素により糖類に分解し、ついで酵母を加えて
発酵させる並行複発酵を行う。例えば焼酎の製造におい
ては、発酵の開始時に麹を仕込み、発酵の経過とともに
残りの炭素源を追加する、１次仕込み、２次仕込みと呼
ばれる段仕込みを一般に行う。ウイスキーの製造におい
ては、麦芽に温水を加えて糖化し、得られた麦汁を発酵
させる方法を一般に行う。果実、糖蜜、グルコース等の
糖質を用いる場合は、直接酵母を加えて発酵させる単発
酵を行う。

【００６０】アルコール発酵は、通常、ｐＨ３．５〜
５．０、温度５〜２５℃、仕込み終了から焼酎で７〜１
４日間、ウイスキーで３〜４日間、ブランデーで７〜１
４日間行う。アルコール発酵終了後、得られたモロミは
そのまま蒸留してもよいが、モロミを圧搾濾過、遠心分
離等の処理により発酵残物、酵母菌体等を分離して得ら
れる液を蒸留してもよい。モロミまたはモロミを圧搾濾
過、遠心分離等の処理して得られる液を、蒸留すること
によりエタノールを濃縮させて、原酒を調製する。原酒
をそのまま蒸留酒としてもよいが、原酒を混合、希釈、
アルコール添加等の調整を行い、これを蒸留酒としても
よい。

【００６１】以下に実施例を示す。

【００６２】

【実施例】

実施例１ フェルラ酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子の
クローニング （１）Ｋ９Ｈ１４株へのｕｒａ３変異の付与 清酒（焼酎）酵母であるサッカロマイセス・セレビジェ
日本醸造協会９号（日本醸造協会）の一倍体株であり、
かつフェルラ酸脱炭酸酵素活性を実質的に有しない株で
あるＫ９Ｈ１４株に、プラスミドを導入するためのマー
カーとして、ボーク(Boeke) らの方法［モレキュラー・
アンド・ゼネラル・ゼネティクス(Mol.Gen. Genet.), 1
97, 345-346 (1984) ］に従って、ｕｒａ３変異を付与
した。すなわち、Ｋ９Ｈ１４株をＹＰＤ培地に１白金耳
植菌し、３０℃で一晩振とう培養した。得られた培養液
１００μｌをＦＯＡプレート［０．６７％イーストナイ
トロジェンベースＷ／Ｏアミノ酸（ディフコ社製）、
０．１％５−フルオロオロチン酸、０．００５％ウラシ
ル、２％グルコース、２％寒天］ に塗布し、３０℃で
３日間培養した。培養終了後、生じたコロニーのうち、
ウラシル要求性であり、ＵＲＡ３をマーカーとして持つ
プラスミドＹＣｐ５０で形質転換した場合にウラシル要
求性が相補され、かつフェルラ酸脱炭酸活性のない１菌
株を選抜し、Ｋ９Ｈ１４−３ｕ株とした。なお、発酵能
等の性質についてＫ９Ｈ１４−３ｕ株はＫ９Ｈ１４株と
同等の性質を示した。

【００６３】（２）クローニング ワイン酵母Ｗ３株の染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩで部分分
解したＤＮＡ断片を、プラスミドＹＣｐ５０のＢａｍＨ
Ｉ部位に挿入し、遺伝子ライブラリーを作製した。遺伝
子ライブラリーを用いて、Ｋ９Ｈ１４−３ｕ株を形質転
換し、ウラシル非要求性で形質転換体を選抜した。得ら
れた形質転換体を、ＹＰＤ液体培地で３０℃で一晩振と
う培養し、得られた培養液０．９ｍｌに１ｇ／ｌフェル
ラ酸溶液を０．１ｍｌ加え、２５℃で２２時間静置培養
した。培養終了後、培養液のにおいを嗅ぎ、くん煙様の
香の強い培養液を選抜し、培養液上清を高速液体クロマ
トグラフィーを行い、４―ビニルグアヤコールの生成を
確認した。

【００６４】該培養液から得られた株を、フェルラ酸脱
炭酸活性が付与された株として分離し、その株から組換
体のプラスミドｐＳＡ１１を抽出した。プラスミドｐＳ
Ａ１１には、ＢａｍＨＩ〜ＢａｍＨＩの約４ＫｂｐのＤ
ＮＡ断片が挿入されていた。プラスミドｐＳＡ１１を各
種の制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片を電気泳動
により分離して分子量を測定し、図１に示すとおり制限
酵素地図を作成した。

【００６５】（３）塩基配列の決定 プラスミドｐＳＡ１１に挿入されているＢａｍＨＩ〜Ｂ
ａｍＨＩの４ＫｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列をダイデオ
キシ法およびＤＮＡシーケンサー（ファルマシアＬＫＢ
社製、ＡＬＦ ＤＮＡシークエンサーII）を用いて決定
した。その結果、配列番号１で表される塩基配列からな
る遺伝子（以下、ＦＤＣ１遺伝子という）をオープン・
リーディング・フレームとして含む、配列番号２で表さ
れる塩基配列が決定された。決定された塩基配列より予
想されるＦＤＣ１遺伝子のコードするタンパク質は、５
０３アミノ酸残基からなるものであった。配列番号１で
表されるこの塩基配列は、酵母ゲノムプロジェクト［例
えばインターネットhttp://genome-www.stanford. edu/
sacchdb/］により公開されている塩基配列のうち、第Ｉ
Ｖ番染色体の配列１５１２１４０〜１５１３６５１に位
置している塩基配列と同一のものであった。ＦＤＣ１遺
伝子とバチルス・プミルスのＦＤＣ遺伝子［Appl. Envi
ron. Microbiol., 61, 4484-4486 (1995) ］およびサッ
カロマイセス・セレビジェのフェニルアクリル酸脱炭酸
酵素をコードする遺伝子（以下、ＰＡＤ１遺伝子とい
う）［Gene, 142 , 107-112 (1994)］とを、ＤＮＡＳＩ
Ｓver3.0（日立ソフトウエアエンジニアリング製）を用
いてシンプルホモロジー解析を行った結果、全塩基配列
でそれぞれ３０％および４１％、塩基配列を翻訳して得
られる全アミノ酸配列でそれぞれ１１．２５％および１
０．３７％のホモロジーしかなかった。また、ＢＬＡＳ
Ｔ法によるホモロジー検索［例えば、ゲノムネットのデ
ータベース利用法、共立出版（1996）］を行った結果、
ＦＤＣ１遺伝子とバチルス・プミルスのＦＤＣ遺伝子お
よびＰＡＤ１遺伝子とは、有意なホモロジーが見いだせ
なかった。

【００６６】実施例２ フェルラ酸脱炭酸酵素活性を付
与した焼酎酵母の作製 （１）ＦＤＣ１遺伝子発現用プラスミドの調製 プラスミドｐＳＡ１１約５μｇをＨ緩衝液［５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシ
ウム、１ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ塩化ナト
リウム］２０μｌに溶解し、１０単位の制限酵素Ｂａｍ
ＨＩおよびＳａｌＩを加え、３７℃で一晩反応させた。
反応生成物を０．８％アガロース電気泳動により分離
し、約３．６ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、ＧＥＮＥＣ
ＬＥＡＮ II キット（バイオ１０１社製）を用いて抽出
精製した。また、プラスミドｐＳＡ１１を酵母―大腸菌
シャトルベクターＹＥｐ２４に代える以外は上記と同様
な方法を用いて約７．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を抽出精製
した。プラスミドｐＳＡ１１由来の約３．６ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片１μｇとＹＥｐ２４由来の約７．７ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片０．１μｇをＬｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒
造）を用いて１６℃で一晩連結反応を行った。反応終了
後、反応液５μｌを用いてコンピテント・セルＥ．ｃｏ
ｌｉ ＪＭ１０９株（東洋紡社製）を形質転換した。得
られた形質転換株をアンピシリンＬＢ寒天培地［１％バ
クトトリプトン（ディフコ社製）、０．５％酵母エキ
ス、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天、５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリン］に塗布し、３７℃で２０時間培養を行
った。培養終了後、生じたコロニーを単離し、これを培
養して得られたプラスミドＤＮＡを抽出精製した。得ら
れたプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩで切断
し、約３．６ＫｂｐのＤＮＡ断片が確認できたものを発
現用プラスミドｐＳＡ８とした（図２）。

【００６７】（２）ＦＤＣ１遺伝子の焼酎酵母への導入
と発現 Ｋ９Ｈ１４−３ｕ株をＹＰＤ培地１００ｍｌの入った三
角フラスコへ接種し、３０℃で２〜４×１０⁷細胞／ｍ
ｌになるまで振とう培養した。培養終了後、遠心分離
（２５００ｒｐｍ、５分）で集菌し、得られた菌体を酢
酸リチウム法によりプラスミドｐＳＡ８に接触させた。
プラスミドｐＳＡ８に接触させたＫ９Ｈ１４−３ｕ株を
ＳＤ寒天培地（０．６７％イースト・ナイトロジェン・
ベースＷ／Ｏアミノ酸、２％グルコース、２％寒天）上
に接種し、３０℃で２〜５日間培養した。培養終了後、
生じたコロニーのうちの一つから、Ｋ９Ｈ１４−３ｕ株
のウラシル要求性が相補された形質転換株であるＹＳＡ
７株を取得した。

【００６８】ＹＳＡ７株、Ｋ９Ｈ１４株およびＫ９Ｈ１
４−Ｃ株をそれぞれＹＰＤ培地中に接種し、３０℃で一
晩培養し、得られた培養液０．９ｍｌに１ｇ／ｌフェル
ラ酸溶液を０．１ｍｌ加え、２５℃で２２時間静置培養
した。培養終了後、培養液上清中の４―ビニルグアヤコ
ール含量を高速液体クロマトグラフィーにより定量した
ところ、Ｋ９Ｈ１４株、Ｋ９Ｈ１４−Ｃ株では４―ビニ
ルグアヤコールの生成はほとんど見られなかったが、Ｙ
ＳＡ７株では４―ビニルグアヤコールの生成が確認され
た。

【００６９】実施例３ 米焼酎の製造 ＹＳＡ７株、Ｋ９Ｈ１４株およびＫ９Ｈ１４−Ｃ株につ
いて、それぞれ総米８４０ｇで米焼酎の小仕込製造を行
った。仕込配合を第２表に示す。

【００７０】

【表２】

【００７１】アルコール発酵を２０℃で２次仕込後１０
日間行った後、得られたモロミを蒸留して米焼酎を製造
した。製造した米焼酎は、国税庁所定分析法に従って成
分分析を行った。それぞれの酵母を用いて製造した米焼
酎について、高速液体クロマトグラフィーを用いてエタ
ノール含量および４―ビニルグアヤコール含量を測定
し、パネラー７名により官能評価を行った。

【００７２】結果を第３表に示す。なお、官能評価の評
点は、７名の平均点とした。

【００７３】

【表３】

【００７４】第３表に示されるとおり、ＹＳＡ７株を用
いて製造した米焼酎は、その親株であるＫ９Ｈ１４株を
用いて製造した米焼酎よりも４―ビニルグアヤコール含
量が有意に高く、官能的にも特徴のある香味を有してい
た。

【００７５】

【発明の効果】本発明によれば、香味の優れた蒸留酒の
製造に有用なフェルラ酸脱炭酸酵素を提供することがで
きる。

【００７６】

【配列表】

配列番号： 1 配列の長さ： 1512 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：サッカロマイセス・セレビジェ(Saccharomyces
cerevisiae) 株名：ＹＳＡ７ 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置： 1.. 1512 配列を決定した方法：E 配列 ATG AGG AAG CTA AAT CCA GCT TTA GAA TTT AGA GAC TTT ATC CAG GTC 48 Met Arg Lys Leu Asn Pro Ala Leu Glu Phe Arg Asp Phe Ile Gln Val 1 5 10 15 TTA AAA GAT GAA GAT GAC TTA ATC GAA ATT ACC GAA GAG ATT GAT CCA 96 Leu Lys Asp Glu Asp Asp Leu Ile Glu Ile Thr Glu Glu Ile Asp Pro 20 25 30 AAT CTC GAA GTA GGT GCA ATT ATG AGG AAG GCC TAT GAA TCC CAC TTA 144 Asn Leu Glu Val Gly Ala Ile Met Arg Lys Ala Tyr Glu Ser His Leu 35 40 45 CCA GCC CCG TTA TTT AAA AAT CTC AAA GGT GCT TCG AAG GAT CTT TTC 192 Pro Ala Pro Leu Phe Lys Asn Leu Lys Gly Ala Ser Lys Asp Leu Phe 50 55 60 AGC ATT TTA GGT TGC CCA GCC GGT TTG AGA AGT AAG GAG AAA GGA GAT 240 Ser Ile Leu Gly Cys Pro Ala Gly Leu Arg Ser Lys Glu Lys Gly Asp 65 70 75 80 CAT GGT AGA ATT GCC CAT CAT CTG GGG CTC GAC CCA AAA ACA ACT ATC 288 His Gly Arg Ile Ala His His Leu Gly Leu Asp Pro Lys Thr Thr Ile 85 90 95 AAG GAA ATC ATA GAT TAT TTG CTG GAG TGT AAG GAG AAG GAA CCT CTC 336 Lys Glu Ile Ile Asp Tyr Leu Leu Glu Cys Lys Glu Lys Glu Pro Leu 100 105 110 CCC CCA ATC ACT GTT CCT GTG TCA TCT GCA CCT TGT AAA ACA CAT ATA 384 Pro Pro Ile Thr Val Pro Val Ser Ser Ala Pro Cys Lys Thr His Ile 115 120 125 CTT TCT GAA GAA AAA ATA CAT CTA CAA AGC CTG CCA ACA CCA TAT CTA 432 Leu Ser Glu Glu Lys Ile His Leu Gln Ser Leu Pro Thr Pro Tyr Leu 130 135 140 CAT GTT TCA GAC GGT GGC AAG TAC TTA CAA ACG TAC GGA ATG TGG ATT 480 His Val Ser Asp Gly Gly Lys Tyr Leu Gln Thr Tyr Gly Met Trp Ile 145 150 155 160 CTT CAA ACT CCA GAT AAA AAA TGG ACT AAT TGG TCA ATT GCT AGA GGT 528 Leu Gln Thr Pro Asp Lys Lys Trp Thr Asn Trp Ser Ile Ala Arg Gly 165 170 175 ATG GTT GTA GAT GAC AAG CAT ATC ACT GGT CTG GTA ATT AAA CCA CAA 576 Met Val Val Asp Asp Lys His Ile Thr Gly Leu Val Ile Lys Pro Gln 180 185 190 CAT ATT AGA CAA ATT GCT GAC TCT TGG GCA GCA ATT GGA AAA GCA AAT 624 His Ile Arg Gln Ile Ala Asp Ser Trp Ala Ala Ile Gly Lys Ala Asn 195 200 205 GAA ATT CCT TTC GCG TTA TGT TTT GGC GTT CCC CCA GCA GCT ATT TTA 672 Glu Ile Pro Phe Ala Leu Cys Phe Gly Val Pro Pro Ala Ala Ile Leu 210 215 220 GTT AGT TCC ATG CCA ATT CCT GAA GGT GTT TCT GAA TCG GAT TAT GTT 720 Val Ser Ser Met Pro Ile Pro Glu Gly Val Ser Glu Ser Asp Tyr Val 225 230 235 240 GGC GCA ATC TTG GGT GAG TCG GTT CCA GTA GTA AAA TGT GAG ACC AAC 768 Gly Ala Ile Leu Gly Glu Ser Val Pro Val Val Lys Cys Glu Thr Asn 245 250 255 GAT TTA ATG GTT CCT GCA ACG AGT GAG ATG GTA TTT GAG GGT ACT TTG 816 Asp Leu Met Val Pro Ala Thr Ser Glu Met Val Phe Glu Gly Thr Leu 260 265 270 TCC TTA ACA GAT ACA CAT CTG GAA GGC CCA TTT GGT GAG ATG CAT GGA 864 Ser Leu Thr Asp Thr His Leu Glu Gly Pro Phe Gly Glu Met His Gly 275 280 285 TAT GTT TTC AAA AGC CAA GGT CAT CCT TGT CCA TTG TAC ACT GTC AAG 912 Tyr Val Phe Lys Ser Gln Gly His Pro Cys Pro Leu Tyr Thr Val Lys 290 295 300 GCT ATG AGT TAC AGA GAC AAT GCT ATT CTA CCT GTT TCG AAC CCC GGT 960 Ala Met Ser Tyr Arg Asp Asn Ala Ile Leu Pro Val Ser Asn Pro Gly 305 310 315 320 CTT TGT ACG GAT GAG ACA CAT ACC TTG ATT GGT TCA CTA GTG GCT ACT 1008 Leu Cys Thr Asp Glu Thr His Thr Leu Ile Gly Ser Leu Val Ala Thr 325 330 335 GAG GCC AAG GAG CTG GCT ATT GAA TCT GGC TTG CCA ATT CTG GAT GCC 1056 Glu Ala Lys Glu Leu Ala Ile Glu Ser Gly Leu Pro Ile Leu Asp Ala 340 345 350 TTT ATG CCT TAT GAG GCT CAG GCT CTT TGG CTT ATC TTA AAG GTG GAT 1104 Phe Met Pro Tyr Glu Ala Gln Ala Leu Trp Leu Ile Leu Lys Val Asp 355 360 365 TTG AAA GGG CTG CAA GCA TTG AAG ACA ACG CCT GAA GAA TTT TGT AAG 1152 Leu Lys Gly Leu Gln Ala Leu Lys Thr Thr Pro Glu Glu Phe Cys Lys AAG GTA GGT GAT ATT TAC TTT AGG ACA AAA GTT GGT TTT ATA GTC CAT 1200 Lys Val Gly Asp Ile Tyr Phe Arg Thr Lys Val Gly Phe Ile Val His 385 390 395 400 GAA ATA ATT TTG GTG GCA GAT GAT ATC GAC ATA TTT AAC TTC AAA GAA 1248 Glu Ile Ile Leu Val Ala Asp Asp Ile Asp Ile Phe Asn Phe Lys Glu 405 410 415 GTC ATC TGG GCC TAC GTT ACA AGA CAT ACA CCT GTT GCA GAT CAG ATG 1296 Val Ile Trp Ala Tyr Val Thr Arg His Thr Pro Val Ala Asp Gln Met 420 425 430 GCT TTT GAT GAT GTC ACT TCT TTT CCT TTG GCT CCC TTT GTT TCG CAG 1344 Ala Phe Asp Asp Val Thr Ser Phe Pro Leu Ala Pro Phe Val Ser Gln 435 440 445 TCA TCC AGA AGT AAG ACT ATG AAA GGT GGA AAG TGC GTT ACT AAT TGC 1392 Ser Ser Arg Ser Lys Thr Met Lys Gly Gly Lys Cys Val Thr Asn Cys 450 455 460 ATA TTT AGA CAG CAA TAT GAG CGC AGT TTT GAC TAC ATA ACT TGT AAT 1440 Ile Phe Arg Gln Gln Tyr Glu Arg Ser Phe Asp Tyr Ile Thr Cys Asn 465 470 475 480 TTT GAA AAG GGA TAT CCA AAA GGA TTA GTT GAC AAA GTA AAT GAA AAT 1488 Phe Glu Lys Gly Tyr Pro Lys Gly Leu Val Asp Lys Val Asn Glu Asn 485 490 495 TGG AAA AGG TAC GGA TAT AAA TAA 1512 Trp Lys Arg Tyr Gly Tyr Lys 500

【００７７】配列番号： 2 配列の長さ： 3930 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：サッカロマイセス・セレビジェ(Saccharomyces
cerevisiae) 株名：ＹＳＡ７ 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：532..2043 特徴を決定した方法：E 配列の特徴 特徴を表す記号：cleavage-site 存在位置：1..6, 3925..3930 他の情報：BamHI 切断部位 特徴を決定した方法：S 配列の特徴 特徴を表す記号：cleavage-site 存在位置：656..661 他の情報：StuI切断部位 特徴を決定した方法：S 配列の特徴 特徴を表す記号：cleavage-site 存在位置：1527..1732 他の情報：SpeI切断部位 特徴を決定した方法：S 配列の特徴 特徴を表す記号：cleavage-site 存在位置：3555..3600 他の情報：SalI切断部位 特徴を決定した方法：S 配列 GGATCCTAGA CTGCTTTGGC ATCCACGCTG ACACTTTTCC TCGTTGGGAA GGAATAAAAA 60 GCAAGTAACA CTTTTTCTGA GCATTTTATT ACGTTACTCA ACTACTAATA GAGTTGATTT 120 GTTACTTGCT AAAATCTTTT TATATTTCTT TTAGCCCCGA CAGAACTTGT TGCAAATGAA 180 TACAAACCGT GAACTTCCCG ATATCATTCT AATTGAACCC AGATATTTAC ACATGTACTT 240 CTTACTCATT TTCAATGTCA GCTTAAATAT CGTCTAAAAC AATATTTTAC TAGATACGCA 300 GTTCAATCTT CGCGCATATT TTCACGAAAG TCCAAATTGC GTACGTAGTT TTATGTCAAA 360 GTGACCGCCG TTGTAGCGTA CTTTTTCCTA TAAGACAAGC TCGTGATATC AGGAATATAT 420 CAGGAATGTA AACGAATACC GCATATCTTT TTGATTTTTT TCCTCTGAGT TATTCTATTC 480 TTGACATTAT TACATCACCA ATTCAAAAGA ATTGTCAATT TATATATTTA AATGAGGAAG 540 CTAAATCCAG CTTTAGAATT TAGAGACTTT ATCCAGGTCT TAAAAGATGA AGATGACTTA 600 ATCGAAATTA CCGAAGAGAT TGATCCAAAT CTCGAAGTAG GTGCAATTAT GAGGAAGGCC 660 TATGAATCCC ACTTACCAGC CCCGTTATTT AAAAATCTCA AAGGTGCTTC GAAGGATCTT 720 TTCAGCATTT TAGGTTGCCC AGCCGGTTTG AGAAGTAAGG AGAAAGGAGA TCATGGTAGA 780 ATTGCCCATC ATCTGGGGCT CGACCCAAAA ACAACTATCA AGGAAATCAT AGATTATTTG 840 CTGGAGTGTA AGGAGAAGGA ACCTCTCCCC CCAATCACTG TTCCTGTGTC ATCTGCACCT 900 TGTAAAACAC ATATACTTTC TGAAGAAAAA ATACATCTAC AAAGCCTGCC AACACCATAT 960 CTACATGTTT CAGACGGTGG CAAGTACTTA CAAACGTACG GAATGTGGAT TCTTCAAACT 1020 CCAGATAAAA AATGGACTAA TTGGTCAATT GCTAGAGGTA TGGTTGTAGA TGACAAGCAT 1080 ATCACTGGTC TGGTAATTAA ACCACAACAT ATTAGACAAA TTGCTGACTC TTGGGCAGCA 1140 ATTGGAAAAG CAAATGAAAT TCCTTTCGCG TTATGTTTTG GCGTTCCCCC AGCAGCTATT 1200 TTAGTTAGTT CCATGCCAAT TCCTGAAGGT GTTTCTGAAT CGGATTATGT TGGCGCAATC 1260 TTGGGTGAGT CGGTTCCAGT AGTAAAATGT GAGACCAACG ATTTAATGGT TCCTGCAACG 1320 AGTGAGATGG TATTTGAGGG TACTTTGTCC TTAACAGATA CACATCTGGA AGGCCCATTT 1380 GGTGAGATGC ATGGATATGT TTTCAAAAGC CAAGGTCATC CTTGTCCATT GTACACTGTC 1440 AAGGCTATGA GTTACAGAGA CAATGCTATT CTACCTGTTT CGAACCCCGG TCTTTGTACG 1500 GATGAGACAC ATACCTTGAT TGGTTCACTA GTGGCTACTG AGGCCAAGGA GCTGGCTATT 1560 GAATCTGGCT TGCCAATTCT GGATGCCTTT ATGCCTTATG AGGCTCAGGC TCTTTGGCTT 1620 ATCTTAAAGG TGGATTTGAA AGGGCTGCAA GCATTGAAGA CAACGCCTGA AGAATTTTGT 1680 AAGAAGGTAG GTGATATTTA CTTTAGGACA AAAGTTGGTT TTATAGTCCA TGAAATAATT 1740 TTGGTGGCAG ATGATATCGA CATATTTAAC TTCAAAGAAG TCATCTGGGC CTACGTTACA 1800 AGACATACAC CTGTTGCAGA TCAGATGGCT TTTGATGATG TCACTTCTTT TCCTTTGGCT 1860 CCCTTTGTTT CGCAGTCATC CAGAAGTAAG ACTATGAAAG GTGGAAAGTG CGTTACTAAT 1920 TGCATATTTA GACAGCAATA TGAGCGCAGT TTTGACTACA TAACTTGTAA TTTTGAAAAG 1980 GGATATCCAA AAGGATTAGT TGACAAAGTA AATGAAAATT GGAAAAGGTA CGGATATAAA 2040 TAATTGCCAT AGACTTTCTA CGGAAGAAAA ACCATATAAT CAGATTTTAA ATAAAATTTT 2100 CCGAACTTTT ATACTCCACG GTTTTGGAGT TGTTTGATTG CAGTGACAAG CAGTGCGCCA 2160 TTAACACTAT CCATCTTTCG TACAAAGTAA AGATAAAGTT ATTTTCCTGA GGTGAGAACC 2220 GTAAATCTTT ATAGACAAGG AGTATTTATA ACTAAACTAT TACCTTGTTA CTTATGGAAT 2280 TAATCTTGAC TAATAGGCAG ATGATCAACA GTTATTGATT TTGAGTGAAA GTCCATAAAG 2340 TTACAGTATG TAATTACAGT ACGTAATTAA GGAATGTCTG TAAATATATG CTCCTTTTTT 2400 TTTTTCCACT TACTATGATT TTAGTAAAGC ACCATGATGA TGTAGATGCG TAATACTCTA 2460 TAAATGTAAC ATCGTTAAAG CATTGGTTAT TTTAATTTCA TTCTATAAAC CAATATTTCT 2520 GACAGCACAT AAAAAATAAA TGGACTATAT TAACAGCAAA TATCGGTTAA TCTAGGGCAT 2580 AATTATTTAA CATCAAAAAG AAAGTTGCTA GTTGTTCTAG TATTGCTCGG AGTACCTCAA 2640 ACGGTAAAAA GATAATATTT GTTTCCGCTT TTATCATTGA ATAGCTTAGA AATTCTCTCC 2700 CTAGCGACCA TTTAAGGAAT GTAGCTAACA AAAATGATTC AAGTATGTTG CTCCTAAGCA 2760 GATATGTACT CTATAAGTTG AATCACTATA TCATTGAAAT ATAGTGGCGA GGGCGTACAT 2820 AAAATCAAAG GAACTATGCA ATAGACTCAA TTAAATGCCA CATAGCTATT TAAGACTCCA 2880 AATCTCCAAT ACAATCATTC GTTAAAGATT TTTTGTATTC TGCTGATATC TTTTTCTACA 2940 GTTTCTTGAG TGTCTAGTGA TTGCATAAAA TGACCACAGT ATTTTTAGTA CTCATGGCCT 3000 GTATGCAATT GCAAGGAACG GTATTACTTT TACAAAAACC CTGCTTTCCG GCAAGTTCAG 3060 CTGTCATTTG GTAAGATTTT GAAAATAGTG GAAACAATGG ATTATCAACG AATAGTCTTT 3120 AAACATAAGT GCTAAAATTC AAAACATCAT TTGATGCGTG CGGTGCATTT TTTCGTGCTG 3180 AATGAACTTT TGGAGATATC TGCCTTCGCC AATGAATATG CATTACCATT AATTGCATAG 3240 TAACCGTATA CATGAAAATG GAAATAATGA ACTGATTATT AAAAATAGCT AATGCAGGTG 3300 GGATTTGAGA CATTGTGGTT ATCCTGTCAG CCTGTATTTT GCGCTTTAAG GTATTTCATA 3360 AAAGTTAGAA TAAAATTTAA AAGTTCCATT CTATGAAACT GTAATTATAG GTATATACTA 3420 TCATCTACCA ATCTTACCCA TGTATAGTTC TAATATTAAA GACAGAGTAG GTAAAAAAAA 3480 AAATGGTAAT CAAAACGTGA TCGCTTATAT TCGGTATGGA CAAGCTTTGA ATATTCCCTA 3540 GAAAATGCAA TAGTATGTCA TAATGAAAGA AGATTGTAAT ACAATGCTTG GAATGTCGAC 3600 CGGCAGAAAC CCGTGTCACA TGGCCTTATT CAACGTGACG TTGTGATATA TGTAGAACAT 3660 GCTTTAGATG AGGCGGTATT TGACTGTAGC ATCTTCTAAA ATGTGCTGAT ATTGTTAAAT 3720 CTCAATCAAA CTGAGAGAGT ATGAGAGACT GAAAAAGTGG GATTCTGCCT GTGGTGCTAA 3780 TATCCTTAAA ATGCTAAACT GAAAGAAGTA ATATAATCAT ATATATTGAT CATGTATCAT 3840 ACAAAAGATG CATGTATTTT AGTAATATTA ACTGCTACTA TGATGTAGTA GACGATCGAT 3900 AATCGAATCT TGCGGTATAT TCTAGGATCC 3930

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＦＤＣ１遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素
地図、ならびにＦＤＣ１遺伝子の特定のために行ったサ
ブクローニングの結果および得られたＤＮＡ断片のＦＤ
Ｃ活性の有無を示す図である。

【図２】 ＦＤＣ１遺伝子発現用プラスミドの作製工程
を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 7/22 Ｃ１２Ｐ 7/22 7/24 7/24 7/42 7/42 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:865）

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク
   質： （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタン
   パク質、（ｂ）アミノ酸配列（ａ）においてアミノ酸が
   欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、
   かつフェルラ酸脱炭酸酵素活性を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 請求項１記載のタンパク質をコードする
   遺伝子。
3. 【請求項３】 請求項２記載の遺伝子を含有する組換え
   ベクター。
4. 【請求項４】 請求項３記載の組換えベクターを含む形
   質転換体。
5. 【請求項５】 請求項３記載の組換えベクターを含む酵
   母。
6. 【請求項６】 請求項４記載の形質転換体に由来しかつ
   フェルラ酸脱炭酸酵素活性を有する酵素源の存在下、水
   性媒体中でフェルラ酸を反応させ、水性媒体中に生成し
   た４−ビニルグアヤコール、バニリンまたはバニリン酸
   を採取することを特徴とする４−ビニルグアヤコール、
   バニリンまたはバニリン酸の製造方法。
7. 【請求項７】 酵素源が、請求項１記載のタンパク質ま
   たは請求項４記載の形質転換体の培養物、菌体、菌体処
   理物である請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 モロミ中に請求項４記載の形質転換体に
   由来しかつフェルラ酸脱炭酸酵素活性を有する酵素源を
   添加することを特徴とする蒸留酒の製造方法。
9. 【請求項９】 酵素源が、請求項１記載のタンパク質ま
   たは請求項４記載の形質転換体の培養物、菌体、菌体処
   理物である請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】 フェルラ酸脱炭酸酵素活性を増大させ
    た酵母を用いることを特徴とする蒸留酒の製造方法。
11. 【請求項１１】 フェルラ酸脱炭酸酵素活性を増大させ
    た酵母がフェルラ酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子を含
    有する組換えベクターを含む酵母である請求項１０記載
    の方法。
12. 【請求項１２】 フェルラ酸脱炭酸酵素活性を増大させ
    た酵母が請求項５記載の酵母である請求項１０記載の方
    法。
13. 【請求項１３】 請求項８記載の方法により得られる蒸
    留酒。
14. 【請求項１４】 請求項１０記載の方法により得られる
    蒸留酒。