JPH1028581A

JPH1028581A - ウイルス除去用の構造がはつきりしたデプスフイルター

Info

Publication number: JPH1028581A
Application number: JP9079247A
Authority: JP
Inventors: Savage Margarett; マーガレツト・サベイジ; Werner Hinsken; ウエルナー・ヒンスケン
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Priority date: 1996-03-21
Filing date: 1997-03-14
Publication date: 1998-02-03
Also published as: DE69735974D1; ES2267115T3; AU1636097A; AU731658B2; ATE327774T1; CA2200148A1; EP0798003B1; CA2200148C; DE69735974T2; EP0798003A2; EP0798003A3

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は一般的には溶液からのウイルスの除
去に関し、そして特に生物学的に活性な蛋白質を含有す
る溶液のウイルス力価を減じるための構造がはっきりし
たデプスフィルターの使用に関する。【解決手段】生物学的に活性な蛋白質の水溶液中で蛋
白質の活性に悪影響を与えずにウイルス力価を減少させ
る方法であって、該方法がその溶液を約５.０〜約７.０
の範囲のｐＨにおいて正に荷電された多孔性フィルター
要素を含んでなる構造がはっきりしたデプスフィルター
の中に通す段階を含んでなり、そのフィルター要素の平
均孔直径がウイルスの平均直径より大きく、そして蛋白
質の生物学的活性を保ちながら濾過された溶液中のウイ
ルス力価の実質的な減少を生ずる条件下で濾過を行う方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】分野本発明は一般的には溶液からのウイルスの除去に
関し、そして特に生物学的に活性な蛋白質を含有する溶
液のウイルス力価を減じるための構造がはっきりしたデ
プスフィルターの使用に関する。

【０００２】背景微粒子寸法不純物の液体からの濾過
用には種々の多孔性フィルター媒体が使用されている。
フィルターとして機能するには、媒体は粒状不純物を保
持しながら流体、一般的には水、を通過可能にしなけれ
ばならない。この粒状不純物の保持は多孔性媒体中での
２つの明白に異なる濾過機構、すなわち（１）機械的引
っ張り(straining)および（２）界面動電粒子捕獲の一
方または両方の操作により行われる。機械的引っ張りで
は、粒子がそれ自身より小さい孔を通過しようとする時
にそれが流体流から物理的保持により除去される。界面
動電捕獲機構の場合には、粒子が多孔性物質内で表面と
衝突しそして表面上に短い範囲のファンデルワールスタ
イプの引力により保持される。

【０００３】フィルター媒体はしばしばそれらの物理的
形態に応じて記載される。あるフィルター媒体は膜の表
面に不純物を保持することにより機能する本質的に分離
した膜である（表面フィルター）。それ故、これらのフ
ィルター媒体は主として機械的引っ張りにより作用し、
そしてフィルター媒体の孔寸法が流体から除去しようと
する不純物の粒子寸法より小さいことが必要である。そ
のようなフィルター媒体は一般的には低い流速および急
速に詰まる傾向を示す。

【０００４】他のフィルター媒体は多孔性ケーキまたは
多孔性担体もしくは基質上に沈着した微細な繊維質もし
くは粒状物質の形態をとる。濾過される溶液は次にその
進路を微細物質の格子中に形成された孔のねじれた通路
の中に向けていなければならず、コロイド状不純物がフ
ィルター物質により保持される。フィルター物質が深い
ために、このフィルターは（表面フィルターとは反対
に）デプスフィルターと称される。デプスフィルターは
典型的には不純物をふるい機構および界面動電粒子捕獲
機構の両者により保持する。界面動電粒子捕獲方式で
は、フィルター媒体がそのような小さい孔寸法を有する
ことは必要ない。懸濁された粒状不純物をかなり大きい
孔寸法のフィルター媒体で除去する能力はそれが比較的
高い流速を可能にする限り魅力的である。さらに、これ
らのフィルターは粒状物を保持する高い能力を有してい
るため、詰まる傾向が減少する。特に製薬工業に適用さ
れる濾過の一般的な議論に関しては Curling (1980) お
よび Meltzer (1987) を参照のこと（両者とも引用する
ことにより本発明の内容となる）。

【０００５】ウイルス不活性化方法人間の疾病状態を
処置するために多くの生物学的に活性な蛋白質が使用さ
れている。しかしながら、蛋白質原料（人間の血漿また
は細胞発現系）により、製品中のウイルス汚染の可能性
がある。従って、ウイルス減少または不活性化段階を導
入してウイルス感染の危険性を減らしてさらに安全な製
品を製造することが蛋白質含有製品の製造においては典
型的である。ウイルス力価の減少はウイルスの不活性化
または除去により行うことができる。

【０００６】化学物質および／または熱を用いる処理に
よるウイルスの不活性化方法は当技術において一般的で
ある。例えば、Neurath 他の米国特許第４,５４０,５７
３号はウイルスを不活性化するためのトリアルキル燐酸
エステルおよび洗剤を用いる蛋白質−含有組成物の処理
を記載している。Kameyama 他の米国特許第５,１５１,
４９９号はトリアルキル燐酸エステル／洗剤方法に乾燥
加熱段階を加えてウイルス力価におけるさらに大きな減
少を生ずる。ウイルス力価は蛋白質を精製するために使
用される方法により減じることができる。血液の血漿か
らＩｇＧ画分を精製するために使用されるコーン−オン
クレイ(Cohn-Oncley)法は減少したウイルス力価を有す
る蛋白質を生ずることが見いだされている。例えば、Mi
tra 他の米国特許第４,７６２,７１４号を参照のこと。
血液成分の感染性減少の簡潔な一般的議論に関しては F
riedman 他 (1995) も参照のこと。

【０００７】数社の製造業者は溶液をウイルス粒子より
小さい孔寸法を有する膜の中を通すふるい作用により溶
液からウイルスを除去した製品を開発した。これらの方
法はYuasa 他 (1991)、Nader (1994)、および DiLeo 他
(1994) に記載されている。これらの参考文献で報告さ
れたウイルス（およびそれらの平均直径）はＣ型肝炎ウ
イルス（３０−３８ｎｍ）、バクテリオファージｆｒ（
^〜２３ｎｍ）、φＸ１７４（^〜２８ｎｍ）、およびφ６
バクテリオファージ（^〜７８ｎｍ）であった。

【０００８】デプスフィルターは典型的には最終的なフ
ィルター、典型的には表面（または膜）フィルター、の
有効寿命を延長するためのプレフィルターとして使用さ
れる。しかしながら、名目上の孔寸法がウイルスの平均
直径より大きい場合でさえ、デプスフィルターはウイル
スの保持用に有用であることも知られている。McConnel
l 他 (1984) は遅い速度の砂濾過すなわち「構造がはっ
きりしない」デプスフィルターを使用する方法を用いる
水からの４log₁₀単位のウイルス除去を示している。Mel
tzer (1987), p.8 を参照のこと。

【０００９】そのような高いウイルス除去は「構造がは
っきりした」デプスフィルターでは報告されていない。
一定の寸法および形状に予備成形できる構造がはっきり
したデプスフィルターは種々の技術により製造される。
それらの製造は個々の繊維、またはセラミック、金属、
もしくは重合体の小片もしくは断片のある形状への決め
られた配置を含んでなる。これは編み込み、フェルト形
成、織り、接着、熱または溶媒浸漬などを含んでもよ
い。生ずる繊維または粒子の有機結合体がフィルター要
素である。結合された成分粒子中にある間隙はフィルタ
ー孔を含んでなる。これらの孔により引き起こされる濾
過作用はふるいわけ並びに吸着による保持を含む。

【００１０】構造がはっきりした媒体デプスフィルター
の例は Hou 他の米国特許第４,８５９,３４０号に示さ
れており、それは一方または両方がカチオン樹脂でコー
テイングされた微粒子およびセルロース繊維の自己結合
性マトリックスを含んでなるフィルター媒体シートを記
載している。関連特許は米国特許第４,００７,１１３号
および第４,００７,１１４号である。これらの三特許の
全ては引用することにより本発明の内容となる。

【００１１】Jones 他 (1978) は水からのポリオウイル
スを保持しそして濃縮するための正に荷電されたデプス
フィルターの使用を記載している。Payment 他 (1988)
はウイルスを水から回収するためのファイバーグラスデ
プスフィルターの使用を記載している。Jones 他および
Payment 他の両者は９９％以上のウイルスのフィルタ
ーへの吸着を示す。

【００１２】デプスフィルター媒体の表面電荷はウイル
スの吸着および溶離においてある役割を演ずることが示
されている。Borrego 他 (1991)、Sobsey 他 (1984)、J
ones他 (1978) を参照のこと。荷電変更したデプスフィ
ルターの一般的議論に関しては、Mandaro (Meltzer, 19
87, 5章中）を参照のこと。これらのウイルス回収定量
法の目的は一般的にはウイルスを大量の溶液から回収お
よび濃縮してその後の定量法におけるウイルス検知感度
を改良することである。これらの方法は従って一般的に
は水処理中のウイルス不純物の存在または量を検定する
ために使用された。Goyal 他 (1980) は尿膜流体からの
ウイルスの回収方法を出願した。

【００１３】Breitenbach 他 (1995) はウイルスを不活
性化する新規なフィルター物質を記載しておりそして５
log₁₀単位を越えるウイルス不活性化速度を報告してい
る。これらの新規なフィルターはフィルター物質の２つ
の異なる層を含んでなる。１つの層は抗ウイルス薬化学
物質、この場合にはヨウ化物、を放出し、そして他の層
は溶液がこの第二フィルター層を通過する際に抗ウイル
ス薬を放出する。ウイルス不活性化は相当なものである
が、抗ウイルス薬の酸化特性がこのフィルターを通過す
る物質の生物学的活性に悪影響を与えるかもしれない。

【００１４】上記の如く、デプスフィルターは製薬工業
においてプレフィルターとして最近使用されている。他
の用途では、それらは典型的にはプレフィルターとして
または最終的フィルターとして溶液から粒状物体を除去
するために使用されており、清澄化と称する方法であ
る。一部のウイルス除去は蛋白質精製方法における沈澱
段階に本来備わっており、溶液を次にデプスフィルター
の使用により残留沈澱から清澄化することができる。し
かしながら、我々の知識では沈澱段階とは別の溶液のウ
イルス力価における実質的な減少を生ずるためのウイル
ス寸法より大きい孔寸法を有する正に荷電された構造が
はっきりしたデプスフィルターの使用は報告されていな
い。

【００１５】

【発明の要旨】我々は生物学的に活性な蛋白質の溶液の
濾過のための構造がはっきりしたデプスフィルターの使
用がウイルス力価における驚異的な程度の減少を生ずる
条件を今回発見した。濾過しようとする溶液は約４.５
〜約８.０、より好適には約５.０〜約７.０の範囲のｐ
Ｈを有すべきであり、そして濾過は除去するウイルスの
平均直径より大きい平均直径を有するカチオン的に荷電
されたデプスフィルターを使用して行うべきである。濾
液中のウイルス力価は少なくとも約３log₁₀単位または
より好適には少なくとも約４log₁₀単位ほど減じられ
る。蛋白質の生物学的活性は実質的に保有され、好適に
はこの濾過は元の（濾過前の）活性の少なくとも約８０
％そしてより好適には少なくとも約９０％の保有を生ず
る。フィルターの好適な平均孔直径は約０.１μｍ〜約
２μｍの範囲であってよく、より好適な範囲は約０.２
５μｍ〜約２μｍである。好適なフィルターは例えば珪
藻土の如きフィルター助剤およびセルロース繊維の自己
結合性マトリックスから製造され、それらの一方または
両方はカチオン樹脂でコーテイングされており、より好
適なフィルターはクノ社（コネチカット州、メリデン）
により市販されているＺＥＴＡＰＬＡＳ商標のフィル
ターである。

【００１６】

【特定例】この報告はＣ型肝炎ウイルス用のモデルに選
択された牛のウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、Ｂ
型肝炎およびヘルペスウイルス用のモデルに選択された
仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）並びにエンベロープウイ
ルスのモデルとして選択されたレオウイルス３型（Ｒｅ
ｏ）を含む数種のモデルウイルスの除去並びに物理的お
よび化学的不活性化方法に対するその耐性を評価するデ
ータを示している。

【００１７】以下に示されているデータは実施例のデプ
スフィルターがエンベロープおよび非エンベロープウイ
ルスの両者のウイルス力価を減少させうることを示して
いる。それ故、この研究は処理した溶液がウイルス伝達
の危険性に対して高い安全性の余地を与えるという追加
保証も与える。

【００１８】ここで使用される平均孔直径は、フィルタ
ーによるその寸法の粒子の少なくとも約９０％のふるい
作用による拒絶に相当する孔寸法を意味する。

【００１９】ここで使用されるウイルスの平均直径は、
関連する科学文献に報告されているウイルスの直径に関
して一般的に認められている値を意味する。

【００２０】ここで使用されるウイルス力価における実
質的な減少は、ウイルス力価における少なくとも約３lo
g₁₀単位の減少を意味する。

【００２１】ここで使用される生物学的に活性な蛋白質
は、測定可能な機能すなわち活性を示すかまたは（特に
変性状態もしくは使用不能状態の同一蛋白質とは反対
に）意図する結果にとって有用である蛋白質を意味す
る。機能、活性、または意図する結果は例えば酵素活性
または結合親和性であることができる。

【００２２】ここで使用される生物学的活性の保有は、
生物学的活性の少なくとも約８０％またはより好適には
少なくとも約９０％の保有を意味する。

【００２３】物質および方法流出液IIIは、コーン−オンクレイ冷エタノール法を使
用しテノルド(Tenold)の米国特許第４,３９６,６０８号
（引用することにより本発明の内容となる）に従い変更
して、分別された人間の血漿のプールから得られた。コ
ーン分別法は、可能性のあるウイルス伝達に関して安全
な免疫グロブリン製品を生成すると一般的には考えられ
ている。使用される血漿の個々の単位を試験し、そして
Ｂ型肝炎表面抗原（ＡＢｓＡｇ）に関して不活性であり
且つ人間免疫不全ウイルスタイプ１および２（ＨＩＶ−
１、ＨＩＶ−２）並びにＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に
関して陰性であることが見いだされた。肝機能のための
および肝炎ウイルスにより引き起こされる推定損傷によ
る指標であるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）は
正常範囲の２倍を越えなかった。それ故、原料物質であ
る血漿は流出液IIIからの臨床的に意義あるウイルスの
不存在を確認するように選択されそして試験される。

【００２４】この研究用に選択されるウイルスおよびそ
れらの特質が表１にまとめられている。牛のウイルス性
下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）であるエンペロープＲＮＡウ
イルスがＣ型肝炎ウイルス用の関連モデルとして選択さ
れた。エンペロープＤＮＡウイルスである仮性狂犬病ウ
イルス（ＰＲＶ）が臨床的関連性ヘルペスウイルスであ
るＣＭＶ、エプステイン−バル(Epstein-Barr)ウイルス
並びに単純ヘルペス１、２、６および７型用のモデルと
して選択された。さらに、非エンペロープＲＮＡウイル
スであるレオウイルス３型（Ｒｅｏ）が物理化学的試薬
に対する耐性を有するモデルウイルスとして選択され
た。

【００２５】表１：使用されたモデルウイルスウイルス特質ＢＶＤＶ仮性狂犬病レオウイルス３型菌株ＮＡＤＬＰＲＶ dl tk アブネイ(Abney) (ATCC VR-534) (ATCC VR-2074) (ATCC VR-232) またはＰＲＶバッカー (デュポン/メルク) デラウェア州、ウィルミントン核酸ＲＮＡＤＮＡＲＮＡエンベロープありありなし寸法 80-100nm 120-220nm 60-80nm 物理化学的試薬中程度中程度高いに対する耐性定量法システムＢＴ細胞ＲＡＢ−９ＢＳＣ−１細胞 (ATCC CRL 1390)(ATCC CRL 1414) (ATCC CCL 26) 各々のウイルスに関して最低２回の独立した実験を行っ
た。ウイルスを各々のサンプル中で時間０において滴定
してウイルス充填量を測定した。モデルウイルスが加え
られた１５０ｍＬおよび５００ｍＬの流出液IIIをＺＥ
ＴＡＰＬＵＳＺＰ０４７０１−５０ＣＰデプスフィル
ター（コネチカット州、メリデンのクノ・インコーポレ
ーテッド）中に通した。濾過に関する量対表面積を最大
にするために６５０ｍＬを使用したレオが加えられた別
の１回濾過を行った。流出液IIIに、１５０ｍＬ実験お
よび別の６５０ｍＬレオ実験（レオウイルス充填量を増
やしそしてその結果として濾過の効力の試験を行う）に
関しては１部のウイルスおよび１９部の出発物質の割合
でそしてウイルスを保全する５００ｍＬ実験に関しては
１部のウイルスおよび９９部の出発物質を加えた。

【００２６】ウイルス定量法非必須アミノ酸類、ヘペ
ス緩衝液（Ｎ−[２−ヒドロキシエチル]ピペラジン−
Ｎ′[２−エタンスルホン酸]）、胎牛血清および抗生物
質が補充されたＲＰＭＩ１６４０またはイーグルの最
少必須培地（ＭＥＭ）を用いるウイルス感染定量法用に
標準的細胞培養条件を使用した。ＲＰＭＩ１６４０培
地はＭＴ−４細胞用にだけ使用した。ウイルス力価を５
０％感染度（ＴＣＩＤ₅₀）における組織培養感染投与量
定量法により定量化した。ＴＣＩＤ₅₀力価をスペアマン
−カーバー(Spearman-Karber)法により計算した。Caval
li-Sforza (1974), p.171-173 を参照のこと。９６ウェル微量滴定板を適当な集密的細胞（牛の鼻甲介
（ＢＴ）細胞中のＢＶＤＶ、Ｒａｂ−９細胞中のＰＲ
Ｖ、ＢＳＣ−１またはベロ(Vero)細胞中のレオ）と共に
使用した。比較的高い力価が必要な研究用にはＰＲＶの
ベッカー菌株を使用した。ウイルス加入法の接種物は１
個のウェル当たり０.１ｍＬであった。log₁₀または半−
log₁₀希釈をＨＢＳＳ中で１０^-0.5または１０^-1から１
０^-6まで、分別実験１回に関して１希釈当たり４個の複
製ウェルを使用して行った。第二実験に関しては、合計
１２個のウェルにするために１希釈当たりさらに８個の
複製ウェルを使用した。これは１希釈当たり４個の複製
ウェルを使用する定量法の感度を確認するために行われ
た。ＢＶＤＶおよびＰＲＶを用いる濾過に関しては３回
の実験が行われた。レオを加えて４回の実験が行われ
た。１希釈当たり１２個の複製ウェルを用いてＨＢＳＳ
中で半−log希釈を１０^-0.5〜１０^-7.5まで行った。

【００２７】試験物質を細胞と１時間にわたり３７℃で
接触させてウイルス吸着を可能にした。物質を除去しそ
して新しいＭＥＭをウェルに加えた。ＭＥＭはＰＲＶお
よびレオ用に使用された。ＢＶＤＶ用には、ＭＥＭに胎
牛血清でなく馬の血清が補充された。板を５〜７日間に
わたり３６±２℃で培養した。培養後に、細胞単層を細
胞変性効果（ＣＰＥ）により示されるウイルス感染の存
在に関して顕微鏡で観察した。５〜７日後に、ＢＶＤＶ
およびＰＲＶにより誘発されたＣＰＥは顕微鏡試験によ
り容易に確認できた。しかしながら、ＣＰＥの測定が細
胞の過剰成長のために困難である時には、レオ感染細胞
を染色してＣＰＥの可視化を促進した。細胞を１０分間
にわたり冷９５％エタノール（ＥｔＯＨ）で固定し、次
にＥｔＯＨを除去しそして細胞をメイ−グリュンワルド
−ジエムサ(May-Gruenwald-Giemsa)またはクリスタルバ
イオレット染料で染色した。染色および蒸留水を用いる
洗浄後に、細胞を顕微鏡で試験した。未感染細胞は濃青
色単層として現れたがウイルス感染細胞の巣は非常に薄
く染色された部分として現れた。

【００２８】細胞毒性およびウイルス干渉に関する試験低水準のウイルスを含有していると予測される分別生成
物サンプルに関しては、ウイルスなしの未希釈サンプル
を指示細胞系統の各々に適用して細胞上のマトリックス
効果（エタノール、工程緩衝液および蛋白質など）を評
価した。

【００２９】流出液IIIを未希釈のＲａｂ９およびＢＳ
Ｃ−１細胞上でＨＢＳＳ中で１：３.２の割合で接種し
た。ＨＢＳＳが対照として使用された。別の対照は細胞
上のエタノール濃度の影響を評価するための１７％エタ
ノールを含有するＨＢＳＳを含んでいた。物質に対する
１時間の露呈後に、流出液を除去しそして細胞に新しい
ＭＥＭを供給した。細胞を細胞毒性に関して７日後に試
験した。

【００３０】ウイルス干渉定量法はウイルス株を対照と
してのＨＢＳＳ中におよびＨＢＳＳ中で１：１０に希釈
された流出液III中に希釈することにより行われた。こ
れらの実験用に使用された２種のウイルスはＢＶＤＶお
よびレオであった。log₁₀希釈を行いそして細胞に０.１
ｍＬを１時間の吸着時間にわたり接種した。物質を除去
しそして培地を加えた。７日間の後感染時に、細胞をウ
イルスＣＰＥに関して顕微鏡で試験した。

【００３１】流出液IIIに関するウイルス干渉定量法は
ウイルス株を対照としてのＨＢＳＳ中におよびＨＢＳＳ
中で１：３.２に希釈された流出液III中に希釈すること
により行われた。半−log₁₀希釈を行いそして上記の通
りに細胞を接種および培養した。使用されたウイルスは
ＰＲＶおよびレオであった。

【００３２】流入時のウイルス充填量を流出時のウイル
ス充填量と比較して減少因子を計算することにより、関
連モデルウイルスを除去する工程段階の効果を測定し
た。

【００３３】log₁₀希釈を使用するウイルス滴定に関す
る９５％信頼区間の大部分は約１log₁₀であった。半−l
og希釈を使用した時には、ウイルス滴定に関する９５％
信頼区間は約０.３−０.４log₁₀であった。

【００３４】本発明を下記の説明用の実施例によりさら
に示す。

【００３５】

【実施例】

実施例１流出液IIIの濾液IIIへの濾過３種のモデルウイルスを用いるウイルス除去実験の結果
は表２に示されている。ある実験に関しては、最少必須
培地（ＭＥＭ）中のウイルスを一定量の流出液III（上
記の通り）に加えた。例えば、５０４ｍＬの流出液III
に５ｇのＭＥＭ中のレオウイルスを加えた。流出液III
およびウイルスを含有する蛋白質のｐＨを５.４に調節
しそして−５℃に冷却した。フィルター助剤を０.６％
の最終濃度となるまで加えた。１０ｍＬサンプルを初期
ウイルス滴定用に取り出した。残りの溶液をＣＵＮＯ
ＺＥＴＡＰＬＵＳ^R ＺＰ０４７０１−５０ＣＰフィル
ターを通して１０ｐｓｉの圧力で濾過した。生じた濾液
を集めそしてサンプルをウイルスの検出用に滴定した。
濾過の完了後に、フィルターを除去し、５０ｍＬの均衡
のとれた塩溶液の中に入れそして１５分間振盪した。
（それより少量の実験からのフィルターは対応して少量
の均衡のとれた塩溶液の中で振盪された。）このサンプ
ルをフィルターにより保持されたウイルスの検出用に滴
定した。

【００３６】表２の結果は各々のサンプル中でlog₁₀Ｔ
ＣＩＤ₅₀／ｍＬとして表示されている。平均log₁₀減少
因子は、log₁₀ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬを流出液IIIの量に掛算
して各々のウイルスに関する合計ウイルス加入充填量
［(vol)(log₁₀ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ]を決めそして次に濾液
III中に残存する合計ウイルス［(vol)(log₁₀ＴＣＩＤ₅₀
／ｍＬ]により割算することにより、計算される。平均l
og₁₀減少因子はＢＶＤＶに関しては≦１であり、ＰＲＶ
に関しては≧３.８であり、そしてレオに関しては≧４.
５であった。≧として報告されている結果はウイルスの
加入充填量の完全な除去を示している。加入量に関して
より高いウイルス力価を得ることができるならそれより
高い除去または不活性化因子が得られるであろう。

【００３７】表２：流出液IIIの濾液IIIへのデプスフィルター濾過分別サンプル中のウイルス（log₁₀ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ）ＢＶＤＶＰＲＶレオウイルスＡ^a ＢＣ^b ＡＢＣＡＢＣＤ^c ＨＢＳＳ 4.4 5.8 5.3 5.8 5.8 5.3 6.5 6.7 6.3 7.0 流出液III 7.0^d 7.7 7.7 5.4 5.3 4.7 5.3 5.8 5.6 6.6 濾液 5.6 6.9 7.3 ≦1.3 ≦1.3 ≦1.3 ≦1.3 ≦1.3 ≦1.3 ≦1.3 フィルター 7.1 7.7 7.6 6.8 6.9 6.1 7.1 7.2 6.4 7.4パッド保持分^e log₁₀減少 1.4 0.8 0.4 ≧4.1 ≧4.0 ≧3.4 ≧4.0 ≧4.5 ≧4.3 ≧5.3 平均log₁₀減少 0.9 ≧3.8 ≧4.5 ^a ＡおよびＢ＝２回の複製実験−１５０ｍＬ濾過量^b Ｃ＝５００ｍＬ濾過量^c Ｄ＝レオに関して６５０ｍＬ濾過量^d ウイルスは濾液IIIの全てのサンプル中で見られたためＢＶＤＶに関して使用された合計ウイルス（合計log₁₀ＴＣＩＤ₅₀）^e フィルターパッドを１２−１８ｍＬのＨＢＳＳ中に懸濁させ、次にサンプルを濾過により除去したＢＶＤＶウイルスは使用された他のウイルスよりはるか
に低い充填密度を有しているかもしれないためこのウイ
ルスは保持されなかったと思われる。流出液IIIからデ
プスフィルターにより除去されたＩｇＧ以外の蛋白質の
存在はこのウイルスと競合するかもしれないため、この
ウイルスは保持されなかった。汚染性蛋白質が存在せず
そしてＩｇＧだけが蛋白質溶液中に存在する他の実験で
は、ＢＶＤＶはデプスフィルターにより保持された。

【００３８】実施例２ウイルス除去実験を実施例１に記載されている通りにし
て別の３種のウイルスであるＡ型肝炎ウイルス、牛のパ
ルボウイルス、および豚のパルボウイルスに対して行っ
た。結果は表３に示されている。除去割合はＡ型肝炎ウ
イルスに関しては≧４.０log₁₀単位であり、牛のパルボ
ウイルスに関しては≧２.７log₁₀単位であり、そして豚
のパルボウイルスに関しては≧４.７log₁₀であった。さ
らに条件を精密にすると、牛のパルボウイルスに関する
ウイルス除去は≧３.０log₁₀単位となると思われる。

【００３９】表３：流出液IIIの濾液IIIへのデプスフィルター濾過分別サンプル中のウイルス（log₁₀ＴＣＩＤ₅₀／ｍＬ）Ａ型肝炎牛のパルボ豚のパルボウイルスウイルスウイルスＡ^a Ｂ^b Ｃ^a Ｄ^a Ａ^a Ｂ^a Ｃ^b Ａ^c Ｂ^a ＨＢＳＳ 6.1 4.8 6.7 5.6 5.0 5.0 5.2 6.2 6.5 流出液III 5.6 4.0 6.2 5.5 4.0 3.8 4.3 5.8 6.1 濾液 ≦1.3 ≦1.3 1.6 ≦1.3 ≦1.3 ≦1.3 ≦1.3 ≦1.3 ≦1.3 フィルター 6.1 5.2 6.8 6.2 4.2 4.5 5.1 7.1 6.3 パッド保持分^e log₁₀減少 ≧4.3 ≧2.7 4.6 ≧4.2 ≧2.7 ≧2.5 ≧3.0 ≧4.5 ≧4.8 平均log₁₀減少 ≧4.0 ≧2.7 ≧4.7 ^a １５０ｍＬ濾過量^b ５００ｍＬ濾過量^c ６００ｍＬ濾過量商業的に製造された免疫グロブリンの活性を監視する際
の我々の実験に基づくと、上記の実験は蛋白質の生物学
的活性に悪影響を与えるとは予測されずそして蛋白質の
元の生物学的活性が実質的に保有されるであろう。

【００４０】上記の実施例は本発明を説明しようとする
ものでありそして当技術の専門家にとっては変更を行え
ることが考えられる。従って、本発明の範囲は特許請求
の範囲および以下の好適な態様によってのみ限定される
べきである。

【００４１】参考文献１９７７年２月８日に発行された Ostricher, E. A.の
米国特許第４,００７,１１３号。

【００４２】１９７７年２月８日に発行された Ostrich
er, E. A.の米国特許第４,００７,１１４号。

【００４３】１９８３年８月２日に発行された Tenold,
R. A.の米国特許第４,３９６,６０８号。

【００４４】１９８５年９月１０日に発行された Neura
th, A. R. 他の米国特許第４,５４０,５７３号。

【００４５】１９８８年８月９日に発行された Mitra,
G. 他の米国特許第４,７６２,７１４号。

【００４６】１９８９年８月２２日に発行された Hou,
K. C. 他の米国特許第４,８５９,３４０号。

【００４７】１９９２年９月２９日に発行された Kamey
ama, S. 他の米国特許第５,１５１,４９９号。

【００４８】Borrego, J. J.他, "Development and App
lication of new Positively Charged Filters for the
Recovery of Bacteriophages from Water," Appl. Env
iron. Microbiol. 57: 1218-22 (1991)。

【００４９】Breitenbach, J.他、１９９５年６月２２
日に公告されたドイツ特許出願番号ＤＥ４３４３２
２６Ａ１。

【００５０】Cavalli-Sfroza, L., Biometrie Grunzuge
Biologisch-medizinischer Statistik [Biometry, the
Basics of Biological and Medical Statistics], Gus
tavFischer Verlag (Stuttgart, 1974)。

【００５１】Curling, J. M., ed., Methods of Plasma
Protein Fractionation, AcademicPress (London, 198
0)。

【００５２】DiLeo, A. J.他, "High Resolution Remov
al of Virus from Protein Solutions Using a Membran
e of Unique Structure," Bio/Technol., 10: 182-188
(1992)。

【００５３】Friedman, L. J.他, "Reducing the Infec
tivity of Blood Components - What We Have Learne
d," Immunolog. Invest. 24: 49-71 (1995)。

【００５４】Goyal, S. M.他, "Simple Method for the
Concentration of Influenza fromAllantoic Fluid on
Microporous Filter," Appl. Environ. Microbiol. 3
9: 500-504 (1980)。

【００５５】Jones, B. L.他, "Concentration of Poli
ovirus from Tap Water Using Positively Charged Mic
roporous Filters," Presented at Ann. Conf. Amer. W
aterWorks Ass'n, Atlantic City, NJ, June 26-30, 19
78。

【００５６】McConnell, L. K.他, "Reovirus Removal
and Inactivation by Slow Rate Sand Filtration," Ap
pl. Environ. Microbiol. 48: 818-825 (1984)。

【００５７】Meltzer, T. H., Filtration in the Phar
maceutical Industry, Marcel Dekker (New York, 198
7)。

【００５８】Nader, W., "Validation of a UF System
for the Removal of Viruses and Scrapie Agent," Gen
et. Engin. News, Nov, 1, 1994, p.16。

【００５９】Payment, P.他, "Wound Fiberglass Depth
Filters as a Less Expensive Approach for the Conc
entration of Viruses from Water," Can. J. Microbio
l.,34: 271-272 (1988)。

【００６０】Sobsey, M. D.他, "The Particle Size of
Hepatitis C Virus Estimated byFiltration Through
Microporous Regenerated Cellulose Fiber," J. Gen.
Virol., 72: 2021-2024 (1991)。

【００６１】本発明の主なる特徴および態様は以下のと
おりである。

【００６２】１．生物学的に活性な蛋白質の水溶液中で
蛋白質の活性に悪影響を与えずにウイルス力価を減少さ
せる方法であって、該方法がその溶液を約５.０〜約７.
０の範囲のｐＨにおいて正に荷電された多孔性フィルタ
ー要素を含んでなる構造がはっきりしたデプスフィルタ
ーの中に通す段階を含んでなり、そのフィルター要素の
平均孔直径がウイルスの平均直径より大きく、そして蛋
白質の生物学的活性を保ちながら濾過された溶液中のウ
イルス力価の実質的な減少を生ずる条件下で濾過を行う
方法。

【００６３】２．フィルター要素の平均孔直径が約０.
２５μｍ〜約２μｍの範囲内である、上記１の方法。

【００６４】３．濾過が蛋白質の生物学的活性の少なく
とも約８０％の保有を生ずる、上記２の方法。

【００６５】４．濾過が約３log₁₀単位のウイルス力価
の減少を生ずる、上記３の方法。

【００６６】５．フィルター要素がフィルター助剤およ
びセルロース繊維の自己結合性マトリックスを含んでな
り、それらの少なくとも一方がカチオン樹脂でコーテイ
ングされている、上記４の方法。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生物学的に活性な蛋白質の水溶液中で蛋
白質の活性に悪影響を与えずにウイルス力価を減少させ
る方法であって、該方法がその溶液を約５.０〜約７.０
の範囲のｐＨにおいて正に荷電された多孔性フィルター
要素を含んでなる構造がはっきりしたデプスフィルター
の中に通す段階を含んでなり、そのフィルター要素の平
均孔直径がウイルスの平均直径より大きく、そして蛋白
質の生物学的活性を保ちながら濾過された溶液中のウイ
ルス力価の実質的な減少を生ずる条件下で濾過を行う方
法。