JPH10295398A - 化学発光酵素免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として
用い、低濃度の測定対象物質に対しても高感度測定が可
能な化学発光系により抗原または抗体を免疫学的に測定
する方法を提供する。 【解決手段】 ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として
用いる酵素免疫測定法において、下記一般式（１） 【化１】 （上記一般式（１）において、Ｒ¹ およびＲ² は、アル
キル基、アリール基およびハロゲン化アリール基からな
る群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよ
く、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ およびＲ⁶ は、水素原子、アルキ
ル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基およ
びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一で
もまたは異なるものでもよく、Ｘ^n-はｎ価の陰イオンで
あり、ｎは１または２である。）で表わされるＮ，Ｎ’
−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を還元処
理して得られる反応生成物を化学発光性物質として用い
る化学発光系により、抗原または抗体を免疫学的に高感
度に測定する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、化学発光方法を利
用する酵素免疫測定方法に関するものであり、さらに詳
しくは、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として用い、
特定のアクリジニウム塩類の還元反応生成物を化学発光
性物質として用いる抗原または抗体の免疫学的測定方法
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】酵素免疫測定方法は、標識物質に放射性
同位元素を使用しないので良好な測定環境を保持するこ
とが可能であり、人体に対して危険性の少ない免疫測定
方法として開発され、種々の物質の測定系に利用されて
いる。この酵素免疫測定方法において、ぺルオキシダー
ゼ、アルカリホスファダーゼ、β−ガラクトシダーゼお
よびグルコースオキシダーゼ等の種々の酵素が使用され
ている。これらの酵素を用いた酵素標識抗体または抗原
の酵素活性を検出する方法としては、過酸化水素／ｏ−
フェニレンジアミン、４−ニトロフェニル−ホスフェ−
ト、２−ニトロフェニル−β−ガラクトシド等の酵素基
質の酵素による分解反応に伴い生成する発色性物質の発
色量を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性と相関
性を有する抗体または抗原の量を定量する比色法が一般
的である。しかしながら、臨床化学分析においてはその
測定対象が生体試料（主として血清、尿等）であり、そ
の測定値は病態の診断または経過観察等に用いられるこ
とが多く、そのために、さらに高感度および高精度の測
定が求められているが、比色法によりこの要求を完全に
満足させるのは困難である。そこで、この要求を満たす
ことを目的として蛍光法が提案されている。蛍光法と
は、標識に用いた酵素の触媒活性により、４−ヒドロキ
シフェニル酢酸、４−メチルウムベリフェリル−β−ガ
ラクトシド、４−メチルウムベリフェリル−ホスフェー
ト等の蛍光基質を分解して蛍光を発生させた後、この蛍
光強度を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性と相
関性を有する抗体または抗原の量を定量する方法であ
る。しかし、蛍光法では、励起光の散乱が存在するため
上記の要求を満たすには充分とは云い難い。また、比色
法および蛍光法では、キセノンランプ等の光源が必要で
あり、光源からの光に由来する迷走現象や溶媒に由来す
るラマン光が原因となり、バックグラウンドのレベルを
上昇させてしまうので、比色法および蛍光法による測定
の高感度化は原理的に困難である。近年、比色法および
蛍光法を上回る高感度の酵素免疫測定方法として、化学
発光酵素免疫測定方法（ＣＬＥＩＡ）が開発され、注目
されている。

【０００３】化学発光酵素免疫測定方法は、酵素の触媒
活性によって化学発光性物質が中間体を経て励起状態と
なり、この状態から基底状態に戻る際に放出される発光
量を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性
を有する抗体または抗原の量を定量する方法であり、化
学反応により化学発光性物質を発光させるため光源が不
要であり、光源に起因するバックグラウンドの上昇等が
ないため測定の高感度化が可能である。化学発光酵素免
疫測定方法に用いられる酵素としては、ぺルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ等が挙げら
れるが、取り扱い易さ、入手し易さ等の点でぺルオキシ
ダーゼが好適に用いられ、化学発光性物質にルミノール
を用い、発光増強剤にｐ−ヨードフェノールを用いる化
学発光方法が開発され、種々の物質が化学発光方法によ
り免疫学的に高感度に定量することが可能になってい
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ペルオ
キシダーゼ酵素を標識物質とする化学発光酵素免疫測定
方法（ＣＬＥＩＡ）においては、測定対象物質の低濃度
領域での定量性をさらに高める必要性が生じるケースが
多く、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質とする化学発光
酵素免疫測定方法のさらなる高感度化が望まれていた。
本発明は、上記事情に鑑み、測定対象物質をより高感度
で測定可能な化学発光方法を利用する新規な酵素免疫測
定方法を提供することを課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】従って、本発明者らは、
上記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、化
学発光性物質として、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビ
スアクリジニウム塩類の還元処理により得られる反応生
成物を用い、水素受容体の存在下において、特に好まし
くは発光増強剤として特定のフェノール性化合物を用い
る化学発光系が、化学発光性物質としてルミノールを用
いる化学発光系より高感度に測定対象物質を免疫学的に
定量することが可能なことを見い出し、これらの知見に
基いて本発明に到達したものである。

【０００６】従って、本発明は、ペルオキシダーゼ酵素
標識した抗体もしくは抗原を試料中の測定すべき抗原も
しくは抗体またはそれらの凝集物と混合し、抗原抗体反
応によりペルオキシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体から
なる免疫複合体を生成させ、さらに、好ましくは、該免
疫複合体を不溶性担体に固定化した抗体もしくは抗原と
反応させて該不溶性担体上に捕捉した後、化学発光性物
質として下記一般式（１）

【０００７】

【化３】 （上記一般式（１）において、Ｒ¹ およびＲ² は、アル
キル基、アリール基およびハロゲン化アリール基からな
る群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよ
く、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ およびＲ⁶ は、水素原子、アルキ
ル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基およ
びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一で
もまたは異なるものでもよく、Ｘ^n-はｎ価の陰イオンで
あり、ｎは１または２である。）で表わされるＮ，Ｎ’
−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元処
理により得られる反応生成物を添加し、水素受容体の存
在下において化学発光させ、その化学発光量を測定する
ことにより試料中の抗原もしくは抗体を測定することを
特徴とする化学発光酵素免疫測定方法に関するものであ
る。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明につきさらに詳しく
説明する。

【０００９】本発明の化学発光酵素免疫測定方法は、抗
原抗体反応により測定すべき抗原または抗体をペルオキ
シダーゼ酵素標識した免疫複合体として捕捉する免疫反
応段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在す
る標識酵素を用いる化学発光方法により測定する化学発
光反応段階とからなる。

【００１０】免疫反応段階を構成する免疫反応の方法は
任意であり、化学発光反応段階において酵素活性の検出
・定量に化学発光性物質Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
ビスアクリジンニウム塩類の還元処理により得られる反
応生成物を用いることができるものであれば、いずれの
方法も採用することができる。

【００１１】例えば、 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
を捕捉させると同時または捕捉させた後にペルオキシダ
ーゼ酵素標識抗体を反応させるサンドイッチ法、 サンドイッチ法において、不溶性担体に結合した抗体
と異なる動物種に由来する抗体を用い、生成したサンド
イッチ錯体に対して、さらに、この抗体に対する標識し
た第二抗体を反応させる二抗体法、 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
をペルオキシダーゼ酵素標識抗原の存在下で反応させる
競合法、 測定すべき抗原または抗体を含有する試料にこれらと
特異的に反応する標識した抗体または抗原を作用させて
凝集沈殿させた後、遠心分離して分離された免疫複合体
中の標識物質を検出する凝集沈殿法または 不溶性担体に結合した抗原に試料中の測定すべき抗体
を捕捉させた後にペルオキシダーゼ酵素標識抗ヒトガン
マグロブリン抗体を作用させる抗体検出法等の方法、さ
らに、ビオチン標識抗体およびペルオキシダーゼ標識ア
ビジン等を利用する方法等を非限定的に用いることがで
きる。

【００１２】本発明の化学発光酵素免疫測定方法の免疫
反応段階において用いられる不溶性担体としては、例え
ば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポ
リエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋
デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、そ
の他、紙、ガラス、金属、磁性粒子およびこれらの組み
合わせ等が挙げられる。また、不溶性担体の形状として
は、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容
器状、セル、マイクロプレート、試験管等の種々の形状
で用いることができる。さらに、これら不溶性担体への
抗原、抗体類の固定化方法は任意であるが、物理的吸着
法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができ
る。

【００１３】なお、本発明の化学発光酵素免疫測定方法
において用いられる抗体類はモノクローナル抗体および
ポリクローナル抗体のいずれも可能であり、形態は全抗
体でもＦ（ａｂ’）₂ 、Ｆａｂ等の断片を用いることも
できる。また、抗体の起源は任意であるが、マウス、ラ
ット、兎、羊、山羊、鶏等に由来する抗体が好適に用い
られる。

【００１４】本発明の化学発光酵素免疫測定方法の後段
の化学発光反応段階を構成する化学発光反応は、化学発
光性物質としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアク
リジニウム塩類の還元処理により得られる反応生成物を
用いることに特異性がある。さらに、反応系に発光増強
剤を存在させることが好ましく、発光増強剤の存在下に
おいて水素受容体を作用させて、標識物質であるペルオ
キシダーゼ酵素の活性を測定することができる。その測
定手法は任意であるが、一般に、化学発光性物質および
発光増強剤を含有する測定試薬をペルオキシダーゼ酵素
標識抗体または抗原を免疫学的に捕捉した不溶性担体に
添加し、特定塩基性ｐＨ領域において水素受容体を添加
して化学発光反応させ、その化学発光量を発光測定装置
で測定する方法等が行なうことができる。

【００１５】本発明の化学発光酵素免疫測定方法に用い
られる化学発光性物質であるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，
９’−ビスアクリジニウム塩類の還元処理により得られ
る反応生成物は、前記一般式（１）で表わされる化合物
を溶媒中において還元剤を用いて還元処理を行なうこと
により得られる反応生成物であり、単一化合物または混
合物である。一般式（１）において、Ｒ¹ およびＲ²
は、各々、アルキル基、アリール基およびハロゲン化ア
リール基からなる群より選択され、互いに同一でもまた
は異なるものでもよい。アルキル基としては、炭素数１
〜２０、好ましくは、１〜１４の直鎖状または分岐状の
いずれでも用いることができ、アリール基およびハロゲ
ン化アリール基は、各々、炭素数６〜２０のものであ
り、炭素数１〜１４のアルキル基で置換されたものでも
よいが、特にフェニル基およびハロゲン化フェニル基が
好ましい。また、式中、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ およびＲ⁶
は、各々、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリ
ーロキシ基およびハロゲン原子からなる群より選択さ
れ、互いに同一でも異なるものでもよい。アルキル基、
アルコキシ基は炭素数１〜２０、好ましくは、１〜１４
の直鎖状または分岐状のものでもよく、アリール基、ア
リーロキシ基は炭素数６〜２０のものであり、アルキル
基で置換されたものでもよい。

【００１６】前記一般式（１）において、Ｘ^n-はｎ価の
陰イオンであり、ｎは１または２である。陰イオンとし
ては、特に限定されるものではないが、硝酸イオン（Ｎ
Ｏ₃ ^-）、ハロゲン化物イオン（例えば、塩化物イオン、
フッ化物イオン等）、リン酸イオン（ＰＯ₃ ^-）等を挙げ
ることができる。これらの陰イオンのなかで特に硝酸イ
オンが好ましい。

【００１７】Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩類の具体例を例示すると、Ｎ，Ｎ’−ジメチ
ル−９，９’−ビスアクリジニウム塩が好適に用いられ
るが、その他に、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−９，９’−ビス
アクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジプロピル−９，９’−
ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’
−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジペンチル−９，
９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−
９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−
クロロフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩等を
非限定的に挙げることができる。これらのなかで、特
に、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウ
ムジナイトレートが好適である。

【００１８】前記還元反応生成物は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換
−９，９’−ビスジヒドロアクリジン誘導体を含有する
ものでよく、該誘導体は、例えば、下記一般式（２）で
表すことができる。

【００１９】

【化４】 一般式（２）において、Ｒ¹¹、およびＲ²²は、アルキル
基、アリール基およびハロゲン化アリール基からなる群
より選択され、互いに同一でもまたは異なるものでもよ
い。アルキル基としては炭素数１〜２０、好ましくは、
１〜１４の直鎖状または分岐状のいずれでも用いること
ができ、アリール基およびハロゲン化アリール基は、炭
素数６〜２０のものであり、各々、炭素数１〜１４のア
ルキル基で置換されたものでよいが、特に、フェニル基
およびハロゲン化フェニル基が好ましい。また、Ｒ³³、
Ｒ⁴⁴、Ｒ⁵⁵およびＲ⁶⁶は、水素原子、アルキル基、アリ
ール基、アルコキシ基、アリーロキシ基およびハロゲン
原子からなる群より選択され、互いに同一でもまたは異
なるものでもよい。アルキル基、アルコキシ基は炭素数
１〜２０、好ましくは、１〜１４の直鎖状または分岐状
のものでよく、アリール基、アリーロキシ基は炭素数６
〜２０のものであり、アルキル基で置換されたものでも
よい。

【００２０】これらの化学発光性物質は、ｐＨ７．５〜
１３の塩基性条件下において、過剰の水素受容体の存在
下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。
この発光は特にフェノール性化合物等の発光増強剤によ
って増強することが認められている。このようなフェノ
ール性化合物としては、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−フ
ェニルフェノール、６−ヒドロキシベンゾチアゾールが
特に好ましいが、その他にもｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ
−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロ
モフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）
フェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノ
ール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等がその例
として非限定的に挙げられる。

【００２１】本発明の化学発光酵素免疫測定方法におい
て用いられる化学発光性物質であるＮ，Ｎ’−ジ置換−
９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元反応生成物の
濃度は、出発物質のＮ，Ｎ’置換−９，９’−ビスアク
リジニウム塩類に換算して１０^-8〜１Ｍ、好ましくは１
０^-5〜１０^-2Ｍの範囲であり、その使用量としては１０
〜５００μｌ、特に、５０〜３００μｌの範囲が好まし
い。また、発光増強剤の使用量は還元反応生成物からな
る化学発光性物質の０．０１〜１００倍モル、好ましく
は０．１〜１０倍モルの範囲であり、濃度は１０^-6〜１
Ｍ、好ましくは１０^-4〜１０^-2Ｍの範囲である。

【００２２】また、化学発光反応に用いられる水素受容
体としては、ペルオキシダーゼ酵素の基質となり得るも
のであれば特に限定されるものではないが、有機過酸化
物、無機過酸化物等が任意に用いられるが、過酸化水素
が好ましく用いられる。この水素受容体の使用量は化学
発光性物質に対して充分に過剰な量で用いることが必要
であり、その使用量は化学発光性物質に対して３〜１万
倍モル、好ましくは１０〜１０００倍モルの範囲で用い
ることができる。

【００２３】化学発光反応に用いる塩基性緩衝液として
は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸
緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に
用いることができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜
１Ｍの範囲で用いるのが好ましい。また、反応時に界面
活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることがで
きる。

【００２４】本発明の化学発光反応の発光量の測定は発
光光度計を用いて測定することができ、その測定の開始
点および積算時間は任意であるが、発光量が安定し且つ
発光量の濃度依存性の高い時間を選択するのが望まし
い。例えば、測定開始点は試薬混合後０〜１時間、好ま
しくは０〜３０分、特に好ましくは０〜１５分であり、
測定の積算時間は１秒〜１分、好ましくは１〜３０秒、
特に好ましくは１〜１０秒である。

【００２５】本発明の化学発光酵素免疫測定方法に用い
られるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウ
ム塩類の還元反応生成物の製造方法は任意であるが、前
記一般式（１）で表される化合物を還元剤を用いて還元
処理することにより容易に製造することができる。用い
られる還元剤としては、リチウムアルミニウムハイドラ
イド、リチウムボロンハイドライド、ナトリウムボロン
ハイドライド等が挙げられるが、リチウムアルミニウム
ハイドライドが特に好ましく用いられる。還元反応は反
応溶媒中で行なうことが好ましいが、反応溶媒として
は、反応試薬に対して不活性であり、反応試薬に対する
溶解性を有するものであれば、特に限定されるものでは
なく、テトラヒドロフラン、ジオキサン類等の環状エー
テル類等が好ましく用いられる。反応温度は用いられる
還元剤および反応溶媒の種類によって異なるが、一般的
に、−１０〜＋１５０℃、好ましくは０〜１２０℃、特
に好ましくは２０〜９０℃の範囲の温度である。反応時
間は１分〜一昼夜、好ましくは１０分〜１２時間、特に
好ましくは３０分〜５時間の範囲である。

【００２６】また、本発明によれば、Ｎ，Ｎ’−ジ置換
−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還元反応生成物
からなる化学発光測定用試薬を提供することができ、ペ
ルオキシダーゼ酵素標識物質、化学発光測定用試薬、水
素受容体溶液の過酸化水素および発光増強剤のフェノー
ル性化合物等を用いた酵素免疫測定用試薬キットを提供
することができる。この測定用試薬またはこれらの測定
用試薬キットは効率的な化学発光酵素免疫測定を行なう
上で極めて有用である。

【００２７】

【実施例】以下、参考例と共に実施例等を示し、本発明
を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例等に限
定されるものではない。なお、参考例および実施例等中
の％は重量％を意味する。

【００２８】［参考例１］化学発光試薬の製造 ルシゲニン（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアク
リジニウムジナイトレート）１ｍｇを試験管に採り、撹
拌下に１，４−ジオキサン１ｍｌ中へ加えてルシゲニン
を１，４−ジオキサン中に微分散させた。次に、これに
水素化リチウムアルミニウム粉末１５０ｍｇを添加し
て、８０℃で２時間撹拌して還元処理した後、反応生成
物を氷冷下に脱イオン水中へ少量ずつ注入して過剰量の
水素化リチウムアルミニウムを分解させた。次に、生成
した水酸化アルミニウム等の沈殿を濾別してから、濾液
のｐＨを１Ｎ塩酸で７．０に調整することによりルシゲ
ニンの還元反応生成物を含有する化学発光試薬を得た。

【００２９】［参考例２］不溶性担体固定化ポリクローナル抗体の製造 抗原に特異的反応性を有する兎等の動物由来のポリクロ
ーナル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．
４）（ＰＢＳ）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液
を、白色マイクロプレート（ラボシステム社）の各ウェ
ルに０．１ｍｌずつ加え、３７℃の温度で１時間放置し
た後、ＰＢＳで洗浄してから、１％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）水溶液を０．３ｍｌずつ加えて３７℃の温度
で１時間放置してポストコーティング処理を実施してポ
リクローナル抗体固定化白色マイクロプレートを得た。

【００３０】［参考例３］ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体の製造 抗原に特異的反応性を有するマウス由来等のモノクロー
ナル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
（ｐＨ７．４）に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶
液１ｍｌに、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サ
クシンイミドエステル（ＭＢＳ）の１０ｍｇ／ｍｌの濃
度のジメチルホルムアミド溶液０．１ｍｌを添加し、２
５℃の温度で３０分間反応させた。次いで、この反応混
合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用
い、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）でゲル濾過を
行ない、マレイミド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢ
Ｓとを分離した。

【００３１】一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホース
ラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１．０ｍ
ｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−
（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の１
０ｍｇ／ｍｌの濃度のエタノール溶液を添加し、２５℃
の温度で３０分間反応させた。

【００３２】次いで、この反応混合液をセファデックス
Ｇ−２５を充填したカラムを用い、１０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ４．５）でゲル濾過して精製、ピリジルジスルフ
ィド化ＨＲＰを含有する画分を採取し、これをコロジオ
ンバック中において氷冷下に約１０倍に濃縮した。次
に、これに０．１Ｍジチオスレイトールを含有する０．
１Ｍ酢酸緩衝生理食塩水（ｐＨ４．５）１ｍｌを添加し
て、２５℃の温度で３０分間撹拌してＨＲＰ分子中に導
入したピリジルジスルフィド基を還元した後、この反応
混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用
いてゲル濾過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分を得
た。

【００３３】次に、マレイミド化モノクローナル抗体と
チオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用い
て氷冷下に４ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃
で一昼夜放置した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＳＥＰ
ＲＡＣＯＲ社）を充填したカラムを用いてゲル濾過し、
ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体を得た。

【００３４】［実施例１］同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるα−フェトプロテ
イン（ＡＦＰ）の測定 兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を
０〜８００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）５０μｌとペルオキシダーゼ
酵素標識マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３
μｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液
（ｐＨ７．４）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１
時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引
除去した後、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに参
考例１で調製した化学発光試薬を０．１Ｍトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．４）で１０倍に希釈した溶液１０μｌお
よびｐ−ヨードフェノールを１０^-3Ｍの濃度で含有する
０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）２４０μｌを
加え、これに０．００３４％過酸化水素の０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）５０μｌを注入して発光さ
せ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製
ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定
し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることに
より、図１に示される濃度依存性の良い検量線を得た。
この検量線を用いて血清検体中のヒトＡＦＰを０．０５
ｎｇ／ｍｌの濃度まで測定することが可能であった。

【００３５】［実施例２］同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるプロラクチン（Ｐ
ＲＬ）の測定 兎抗ヒトＰＲＬポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトＰＲＬ（標準物質）を
０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）５０μｌとペルオキシダーゼ
酵素標識マウス抗ヒトＰＲＬモノクローナル抗体を約２
μｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液
（ｐＨ７．４）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１
時間インキュベートした。次いで、ウェル内の溶液を吸
引除去し、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに参考
例２で調製したＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスア
クリジニウム塩の還元反応生成物を０．１Ｍトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８．４）で１０倍に希釈した溶液１０μｌ
およびｐ−ヨードフェノールを１０^-3Ｍの濃度で含有す
る０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）２４０μｌ
を加え、これに０．００３４％過酸化水素の０．１Ｍト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）５０μｌを注入して発光
させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社
製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測
定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすること
により、図２に示される濃度依存性の良い検量線を得
た。この検量線を用いて血清検体中のヒトプロラクチン
を０．１ｎｇ／ｍｌの濃度まで測定することが可能であ
った。

【００３６】［実施例３］同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるヒト絨毛性ゴナド
トロピンβ鎖（βｈＣＧ）の測定 兎抗ヒトｈＣＧポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したβｈＣＧ（標準物質）を０
〜２００ｍＩＵ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）５０μｌとペルオキシダーゼ
酵素標識マウス抗βｈＣＧモノクローナル抗体を約２μ
ｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液
（ｐＨ７．４）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１
時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引
除去した後、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに化
学発光試薬を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）
で１０倍に希釈した溶液１０μｌ、およびｐ−ヨードフ
ェノールを１０^-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８．４）２４０μｌを加え、これに０．
００３４％過酸化水素の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．４）５０μｌを注入して発光させ、この発光量を
ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９
０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準
物質濃度に対してプロットすることにより、図３に示さ
れる濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を用い
て血清検体中のβｈＣＧを０．１ｍＩＵ／ｍｌの濃度ま
で測定することが可能であった。

【００３７】［比較例１］ルミノールを用いる同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによ
るα−フェトプロティン（ＡＦＰ）の測定 兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を
０〜８００ｎｇ／ｍの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有Ｐ
ＢＳ溶液（ｐＨ７．４）５０μｌとペルオキシダーゼ酵
素標識マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μ
ｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液
（ｐＨ７．４）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１
時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引
除去した後、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルにル
ミノールを５．６×１０^-5Ｍ、ｐ−ヨードフェノールを
１０^-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．４）１００μｌを加え、これに０．００３４
％過酸化水素の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
４）５０μｌを注入して発光させ、この発光量をルミノ
メーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００
Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃
度に対してプロットすることにより、図４に示される濃
度依存性を有する検量線を得た。この検量線を用いて血
清検体中のヒトＡＦＰを２．０ｎｇ／ｍｌの濃度まで測
定することが可能であった。

【００３８】

【発明の効果】本発明の酵素免疫測定方法は、入手が容
易であり、取り扱いも比較的に容易なペルオキシダーゼ
酵素を標識物質として用い、化学発光性物質としてＮ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還
元反応生成物を用いる化学発光方法により測定対象物質
である種々の抗原または抗体類を免疫学的に高感度に測
定することができる。

【００３９】さらに、ペルオキシダーゼを標識物質とし
て抗原、抗体、核酸等を標識した酵素標識物を用いて、
酵素免疫測定方法により抗体、抗原等を、ウェスタンブ
ロット法により蛋白質を、そしてサザーン及びノーザン
ブロット法により酵素標識核酸プローブを用いてＤＮＡ
およびＲＮＡ等の核酸を夫々特異的に、且つ高感度で測
定することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数
としてプロットして作成したヒトαＡＦＰ測定用の検量
線である。

【図２】 実施例２記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をヒトプロラクチン（標準物質）の濃度の
関数としてプロットして作成したヒトプロラクチン測定
用の検量線である。

【図３】 実施例３記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をβｈＣＧ（標準物質）の濃度の関数とし
てプロットして作成したβｈＣＧ測定用の検量線であ
る。

【図４】 比較例１記載の従来方法による反応系を用い
て化学発光させた化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物
質）の濃度の関数としてプロットして作成したヒトαＡ
ＦＰ測定用の検量線である。

フロントページの続き (72)発明者 葛城 寿史 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 佐藤 未央 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ペルオキシダーゼ酵素標識した抗体もし
   くは抗原を試料中の測定すべき抗原もしくは抗体または
   それらの凝集物と混合し、抗原抗体反応によりペルオキ
   シダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体からなる免疫複合体を
   生成させ、該免疫複合体に化学発光性物質として下記一
   般式（１） 【化１】 （上記一般式（１）において、Ｒ¹ およびＲ² は、アル
   キル基、アリール基およびハロゲン化アリール基からな
   る群より選択され、互いに同一でもまたは異なるもので
   もよく、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ およびＲ⁶ は、水素原子、ア
   ルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基
   およびハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同
   一でもまたは異なるものでもよく、Ｘ^n-はｎ価の陰イオ
   ンであり、ｎは１または２である。）で表わされるＮ，
   Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の還
   元処理により得られる反応生成物を添加し、水素受容体
   の存在下において化学発光させ、その化学発光量を測定
   することにより試料中の抗原もしくは抗体の含有量を測
   定することを特徴とする化学発光酵素免疫測定方法。
2. 【請求項２】 前記反応生成物が下記一般式（２） 【化２】 （上記一般式（２）において、Ｒ¹¹およびＲ²²は、アル
   キル基、アリール基およびハロゲン化アリール基からな
   る群より選択され、互いに同一でもまたは異なるもので
   もよく、Ｒ³³、Ｒ⁴⁴、Ｒ⁵⁵およびＲ⁶⁶は、水素原子、ア
   ルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基
   およびハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同
   一でもまたは異なるものでもよい。）で表される化合物
   を含有してなる請求項１記載の化学発光酵素免疫測定方
   法。
3. 【請求項３】 前記免疫複合体が不溶性担体に固定化し
   た抗体または抗原と反応し該不溶性担体上に捕捉されて
   なる請求項１に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
4. 【請求項４】 前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビス
   アクリジニウム塩類がＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−
   ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項１に記
   載の化学発光酵素免疫測定方法。
5. 【請求項５】 前記水素受容体が過酸化水素である請求
   項１〜４のいずれかの請求項に記載の化学発光酵素免疫
   測定方法。
6. 【請求項６】 発光増強剤をさらに含有させてなる請求
   項１〜５のいずれかの請求項に記載の化学発光酵素免疫
   測定方法。
7. 【請求項７】 前記発光増強剤がフェノール性化合物で
   ある請求項６に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
8. 【請求項８】 前記フェノール性化合物がｐ−ヨードフ
   ェノール、ｐ−フェニルフェノール、６−ヒドロキシベ
   ンゾチアゾールからなる群より選択される少なくとも１
   種のフェノール性化合物である請求項７に記載の化学発
   光酵素免疫測定方法。