JPH10337181A - 新規アルカリペクチン酸リアーゼ及びその製造法 - Google Patents
新規アルカリペクチン酸リアーゼ及びその製造法Info
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- JPH10337181A JPH10337181A JP24273497A JP24273497A JPH10337181A JP H10337181 A JPH10337181 A JP H10337181A JP 24273497 A JP24273497 A JP 24273497A JP 24273497 A JP24273497 A JP 24273497A JP H10337181 A JPH10337181 A JP H10337181A
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- C11D3/16—Organic compounds
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 プロトペクチン、ペクチン酸、酸可溶性
ペクチン酸及びペクチンに作用し、ペクチン酸をβ−脱
離反応でα−１，４結合を切断し、不飽和結合を形成す
る作用を有し、最適反応pHが１０．３〜１０．７で、pH
５〜１１．５で安定であり、分子量約２０〜２１ｋＤａ
（超遠心平衡沈降法）を有するアルカリペクチン酸リア
ーゼ及びその製造法。 【効果】 このペクチン酸リアーゼは、アルカリ条件下
で優れたペクチン酸リアーゼ活性を有し、衣料用や食器
用等の洗浄剤配合用酵素として、また繊維処理用酵素と
して有用である。
ペクチン酸及びペクチンに作用し、ペクチン酸をβ−脱
離反応でα−１，４結合を切断し、不飽和結合を形成す
る作用を有し、最適反応pHが１０．３〜１０．７で、pH
５〜１１．５で安定であり、分子量約２０〜２１ｋＤａ
（超遠心平衡沈降法）を有するアルカリペクチン酸リア
ーゼ及びその製造法。 【効果】 このペクチン酸リアーゼは、アルカリ条件下
で優れたペクチン酸リアーゼ活性を有し、衣料用や食器
用等の洗浄剤配合用酵素として、また繊維処理用酵素と
して有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は洗浄剤、食品加工
剤、繊維処理剤等として有用なアルカリペクチン酸リア
ーゼ及びその製造法に関する。
剤、繊維処理剤等として有用なアルカリペクチン酸リア
ーゼ及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】高等植物の細胞は、細胞壁に囲まれてお
り、それぞれの細胞は中葉を介して相互に接着し組織を
形成している。細胞壁の主体はセルロースであるが、一
次壁にはヘミセルロースやペクチン質が存在している。
また中葉の主成分はペクチン質であり、細胞壁間の接着
剤の役目を果たしている。植物組織の崩壊という観点か
らみると、例えば果実の成熟は自身の酵素により細胞壁
や中葉の水不溶性のペクチン質が分解され、水溶性のペ
クチン質へと変化し、軟化して行くという過程をたど
る。そのために果実の破砕物や搾汁の中には多量のペク
チン質が含まれ、食品工業においては、以前から果汁の
清澄化にペクチン質分解酵素を用いている。そればかり
でなくペクチン質分解酵素は、搾汁率の向上、柑橘ジュ
ースパルプからの可溶性固形分の回収、野菜単細胞食品
の製造、みかん内果皮の剥皮、コーヒー豆の外皮を除去
した後に残るペクチンを主成分とする粘質物の除去等に
広く用いられている。また、セルラーゼ、ヘミセルラー
ゼと併用することで大豆外種皮の剥皮、澱粉製造の収率
向上、茶成分の抽出、粉末化などにも効果を認められて
いる。
り、それぞれの細胞は中葉を介して相互に接着し組織を
形成している。細胞壁の主体はセルロースであるが、一
次壁にはヘミセルロースやペクチン質が存在している。
また中葉の主成分はペクチン質であり、細胞壁間の接着
剤の役目を果たしている。植物組織の崩壊という観点か
らみると、例えば果実の成熟は自身の酵素により細胞壁
や中葉の水不溶性のペクチン質が分解され、水溶性のペ
クチン質へと変化し、軟化して行くという過程をたど
る。そのために果実の破砕物や搾汁の中には多量のペク
チン質が含まれ、食品工業においては、以前から果汁の
清澄化にペクチン質分解酵素を用いている。そればかり
でなくペクチン質分解酵素は、搾汁率の向上、柑橘ジュ
ースパルプからの可溶性固形分の回収、野菜単細胞食品
の製造、みかん内果皮の剥皮、コーヒー豆の外皮を除去
した後に残るペクチンを主成分とする粘質物の除去等に
広く用いられている。また、セルラーゼ、ヘミセルラー
ゼと併用することで大豆外種皮の剥皮、澱粉製造の収率
向上、茶成分の抽出、粉末化などにも効果を認められて
いる。
【０００３】ペクチナーゼを工業的に利用しようという
試みは、洗剤工業界においても考えられており、例え
ば、特公平６−３９５９６号公報、ＷＯ９５／２５７９
０等が開示されている。前者においては、セルラーゼは
繊維を傷めるという観点からペクチナーゼ単独で泥汚れ
洗浄力に対する効果について述べられているが、完全に
精製された酵素を用いていないためにその効果に関して
は明確ではない。さらに洗浄剤に関するものとして洗浄
剤組成物（特開昭６０−２２６５９９号公報）が開示さ
れているが、これはリゾップス属のセルラーゼ及びペク
チナーゼを併用することで洗浄力を発揮するというもの
であるが、いずれも中酸性領域に至適pHを有する酵素で
ある。また、コンタクトレンズ用洗浄剤（特開昭６２−
９１３号公報）、イオン交換膜洗浄剤（特開平１−３０
４００７号公報）等にペクチナーゼを使用することも開
示されている。また、植物性繊維の精練においてペクチ
ナーゼは古くから用いられている。
試みは、洗剤工業界においても考えられており、例え
ば、特公平６−３９５９６号公報、ＷＯ９５／２５７９
０等が開示されている。前者においては、セルラーゼは
繊維を傷めるという観点からペクチナーゼ単独で泥汚れ
洗浄力に対する効果について述べられているが、完全に
精製された酵素を用いていないためにその効果に関して
は明確ではない。さらに洗浄剤に関するものとして洗浄
剤組成物（特開昭６０−２２６５９９号公報）が開示さ
れているが、これはリゾップス属のセルラーゼ及びペク
チナーゼを併用することで洗浄力を発揮するというもの
であるが、いずれも中酸性領域に至適pHを有する酵素で
ある。また、コンタクトレンズ用洗浄剤（特開昭６２−
９１３号公報）、イオン交換膜洗浄剤（特開平１−３０
４００７号公報）等にペクチナーゼを使用することも開
示されている。また、植物性繊維の精練においてペクチ
ナーゼは古くから用いられている。
【０００４】ペクチン質分解酵素の基質はプロトペクチ
ン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸などに分けら
れるが、いずれもＤ−ガラクツロン酸がα−１，４結合
したポリガラツクロン酸を基本骨格としている。プロト
ペクチンは水不溶性の重合度１，０００〜２，０００の
ポリガラクツロン酸単位からなり、５０〜８０％のメト
キシル基を有している。一方、ペクチンとペクチニン酸
は水溶性で、ポリガラクツロン酸がメトキシル化された
ものであり、後者の場合、そのメトキシル基が少量のも
のを言う。ペクチン酸はメトキシル基を含まないポリガ
ラクツロン酸そのものである。
ン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸などに分けら
れるが、いずれもＤ−ガラクツロン酸がα−１，４結合
したポリガラツクロン酸を基本骨格としている。プロト
ペクチンは水不溶性の重合度１，０００〜２，０００の
ポリガラクツロン酸単位からなり、５０〜８０％のメト
キシル基を有している。一方、ペクチンとペクチニン酸
は水溶性で、ポリガラクツロン酸がメトキシル化された
ものであり、後者の場合、そのメトキシル基が少量のも
のを言う。ペクチン酸はメトキシル基を含まないポリガ
ラクツロン酸そのものである。
【０００５】これらの基質に対して作用する酵素は大き
く分類すると、４種類存在する。すなわち（１）ペクチ
ンのメチルエステルを加水分解するペクチンメチルエス
テラーゼ、（２）ペクチンとペクチン酸のα−１，４結
合を加水分解するエンド型とエキソ型のポリガラクツロ
ナーゼ、（３）ペクチンとペクチン酸に対しβ−脱離反
応でα−１，４結合を切断し、基質の非還元末端にＣ４
−Ｃ５不飽和結合を形成するエンド型とエキソ型のペク
チンリアーゼとペクチン酸リアーゼ、そして（４）オリ
ゴガラクツロン酸を主な基質とするオリゴガラクツロナ
ーゼである（伊崎，バイオサイエンスとインダストリ
ー，50, 315-321, 1992）。この他、プロトペクチンに
対して作用するプロトペクチナーゼも知られるようにな
ってきている（Sakai, T. & Okushima, M., Agric. Bio
l. Chem.,42, 2427-2429, 1978;Sakai, T. & Okushima,
M., Agric. Biol. Chem., 46, 667-676, 1982;Sakai,
T. &Sakamoto, T., Agric. Biol. Chem., 54, 879-889,
1990）。この酵素はポリガラクツロナーゼあるいはペ
クチン酸リアーゼ活性を有するＡ−タイプと、セルロー
スとペクチン質を結び付けている介在多糖のアラビナン
のα−１，５結合性ガラクタンのα−１，４結合を加水
分解するＢ−タイプのプロトペクチナーゼに分類される
という（坂井と阪本，繊維工学，45, 19-32, 1992）。
く分類すると、４種類存在する。すなわち（１）ペクチ
ンのメチルエステルを加水分解するペクチンメチルエス
テラーゼ、（２）ペクチンとペクチン酸のα−１，４結
合を加水分解するエンド型とエキソ型のポリガラクツロ
ナーゼ、（３）ペクチンとペクチン酸に対しβ−脱離反
応でα−１，４結合を切断し、基質の非還元末端にＣ４
−Ｃ５不飽和結合を形成するエンド型とエキソ型のペク
チンリアーゼとペクチン酸リアーゼ、そして（４）オリ
ゴガラクツロン酸を主な基質とするオリゴガラクツロナ
ーゼである（伊崎，バイオサイエンスとインダストリ
ー，50, 315-321, 1992）。この他、プロトペクチンに
対して作用するプロトペクチナーゼも知られるようにな
ってきている（Sakai, T. & Okushima, M., Agric. Bio
l. Chem.,42, 2427-2429, 1978;Sakai, T. & Okushima,
M., Agric. Biol. Chem., 46, 667-676, 1982;Sakai,
T. &Sakamoto, T., Agric. Biol. Chem., 54, 879-889,
1990）。この酵素はポリガラクツロナーゼあるいはペ
クチン酸リアーゼ活性を有するＡ−タイプと、セルロー
スとペクチン質を結び付けている介在多糖のアラビナン
のα−１，５結合性ガラクタンのα−１，４結合を加水
分解するＢ−タイプのプロトペクチナーゼに分類される
という（坂井と阪本，繊維工学，45, 19-32, 1992）。
【０００６】ペクチン酸リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．
２）は、１９６１年、バチルス ポリミキサ（Bacillus
polymyxa）の培養液に初めて見い出されたもので、ペ
クチン酸に対しβ−脱離反応により、α−１，４結合を
切断し、非還元末端にＣ４−Ｃ５不飽和結合を形成する
酵素であり、反応にカルシウムイオンを必要としている
（Nagel, C. W. & Vaughn, R. H., Arch. Biochem. Bio
phys., 94, 328-332,1961）。
２）は、１９６１年、バチルス ポリミキサ（Bacillus
polymyxa）の培養液に初めて見い出されたもので、ペ
クチン酸に対しβ−脱離反応により、α−１，４結合を
切断し、非還元末端にＣ４−Ｃ５不飽和結合を形成する
酵素であり、反応にカルシウムイオンを必要としている
（Nagel, C. W. & Vaughn, R. H., Arch. Biochem. Bio
phys., 94, 328-332,1961）。
【０００７】一般に、細菌由来（Pseudomonas属、Erwin
ia属、Bacillus属等）のペクチン酸リアーゼの最適反応
pHは、pH８〜９．５付近のアルカリ領域にあることが知
られている（Rombouts, F. M. & Pilnik, W., Economic
Microbiol., 5, 227-282, 1980）。さらに、真菌、細
菌由来のいくつかのペクチン酸リアーゼは、その最適反
応pHをpH１０〜１０．５付近に有すると報告されてい
る。例えば、Fusarium oxysporum f. sp. ciceri株の生
産する２種のアルカリペクチン酸リアーゼ（Artes, E.
P. & Tana, M., Physiol. Mol. Plant Pathol., 37, 10
7-124, 1990）、Bacillus sp. YA-14株（Han, H.-J. et
al., Korean J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 20,
655-662, 1992）などはいずれもpH７〜８付近にも活性
のピークが存在し、二つのピークを有するpH−活性曲線
を示している。すなわち、単純なpH−活性曲線を示す酵
素ではない。また、分子量も前者は、３７ｋＤａ（ゲル
濾過法）、後者は４３ｋＤａ（ゲル濾過法、ＳＤＳポリ
アクリルアミド電気泳動法）であり、２０ｋＤａより遙
かに大きい。また、その最適反応pHをpH１０付近に有す
ると報告されているFusarium solani f. sp. pisi株の
生産するＰｅｌＢは、分子量が２９ｋＤａ（ＳＤＳポリ
アクリルアミド電気泳動法）である（Guo, W.et al.,
J. Bacteriol., 177, 7070-7077, 1995）。同様に生産
されるＰｅｌＤは、分子量が２３ｋＤａ（ＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動法）である（Guo,W. et al., Arc
h., Biochem. Biophys., 332, 305-312, 1996）。さら
に、最適反応pHをpH１０．２５に有すると報告されてい
るAmycolata sp.の生産するペクチン酸リアーゼは、そ
の分子量が３１ｋＤａ（ＳＤＳポリアクリルアミド電気
泳動法）である（Bruhlmom, F., Appl. Environ. Micro
biol., 61, 3580-3585, 1995）。一方、特公昭５８−２
６７３には好アルカリ性バチルス属の菌株をペクチン質
を唯一の炭素源としてペクチン酸リアーゼを生産する方
法が開示されているが、ここでは誘導酵素の製造法を述
べているにすぎず、また生産される酵素の最適反応pH
は、pH９付近である。
ia属、Bacillus属等）のペクチン酸リアーゼの最適反応
pHは、pH８〜９．５付近のアルカリ領域にあることが知
られている（Rombouts, F. M. & Pilnik, W., Economic
Microbiol., 5, 227-282, 1980）。さらに、真菌、細
菌由来のいくつかのペクチン酸リアーゼは、その最適反
応pHをpH１０〜１０．５付近に有すると報告されてい
る。例えば、Fusarium oxysporum f. sp. ciceri株の生
産する２種のアルカリペクチン酸リアーゼ（Artes, E.
P. & Tana, M., Physiol. Mol. Plant Pathol., 37, 10
7-124, 1990）、Bacillus sp. YA-14株（Han, H.-J. et
al., Korean J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 20,
655-662, 1992）などはいずれもpH７〜８付近にも活性
のピークが存在し、二つのピークを有するpH−活性曲線
を示している。すなわち、単純なpH−活性曲線を示す酵
素ではない。また、分子量も前者は、３７ｋＤａ（ゲル
濾過法）、後者は４３ｋＤａ（ゲル濾過法、ＳＤＳポリ
アクリルアミド電気泳動法）であり、２０ｋＤａより遙
かに大きい。また、その最適反応pHをpH１０付近に有す
ると報告されているFusarium solani f. sp. pisi株の
生産するＰｅｌＢは、分子量が２９ｋＤａ（ＳＤＳポリ
アクリルアミド電気泳動法）である（Guo, W.et al.,
J. Bacteriol., 177, 7070-7077, 1995）。同様に生産
されるＰｅｌＤは、分子量が２３ｋＤａ（ＳＤＳポリア
クリルアミド電気泳動法）である（Guo,W. et al., Arc
h., Biochem. Biophys., 332, 305-312, 1996）。さら
に、最適反応pHをpH１０．２５に有すると報告されてい
るAmycolata sp.の生産するペクチン酸リアーゼは、そ
の分子量が３１ｋＤａ（ＳＤＳポリアクリルアミド電気
泳動法）である（Bruhlmom, F., Appl. Environ. Micro
biol., 61, 3580-3585, 1995）。一方、特公昭５８−２
６７３には好アルカリ性バチルス属の菌株をペクチン質
を唯一の炭素源としてペクチン酸リアーゼを生産する方
法が開示されているが、ここでは誘導酵素の製造法を述
べているにすぎず、また生産される酵素の最適反応pH
は、pH９付近である。
【０００８】前述のように、植物性繊維の精練に関して
は古くよりペクチナーゼを利用するという試みがなされ
ており、特に麻繊維の精練に広く使用されてきた。この
ような状況の中で例えば、特開昭５１−１４９９７６
号、特公昭５７−３９６３６号、特開平６−２２０７７
２号公報等に開示されているようにペクチナーゼ（ペク
チン酸リアーゼを含む）を植物性繊維の精練、非木材繊
維のパルプ化、木綿繊維の精練に使用することができ
る。繊維の精練においてはアルカリ性領域で処理するこ
とで精練度合を高めることができるとされている。ま
た、一般の衣料用洗剤や漂白剤も高アルカリ性（pH１０
〜１１）にすることによってその洗浄力を高めることが
できる。一方、植物性繊維上のプロトペクチンに付着し
た汚れを除去するには、Ａ−タイプに属し高アルカリ性
領域で作用するペクチン酸リアーゼが有効であると考え
られる。
は古くよりペクチナーゼを利用するという試みがなされ
ており、特に麻繊維の精練に広く使用されてきた。この
ような状況の中で例えば、特開昭５１−１４９９７６
号、特公昭５７−３９６３６号、特開平６−２２０７７
２号公報等に開示されているようにペクチナーゼ（ペク
チン酸リアーゼを含む）を植物性繊維の精練、非木材繊
維のパルプ化、木綿繊維の精練に使用することができ
る。繊維の精練においてはアルカリ性領域で処理するこ
とで精練度合を高めることができるとされている。ま
た、一般の衣料用洗剤や漂白剤も高アルカリ性（pH１０
〜１１）にすることによってその洗浄力を高めることが
できる。一方、植物性繊維上のプロトペクチンに付着し
た汚れを除去するには、Ａ−タイプに属し高アルカリ性
領域で作用するペクチン酸リアーゼが有効であると考え
られる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は高アルカリ領域において充分作用するＡ−タイプのア
ルカリペクチン酸リアーゼを提供することにある。
は高アルカリ領域において充分作用するＡ−タイプのア
ルカリペクチン酸リアーゼを提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】以上のような状況を鑑み
て、本発明者らは新たなペクチン酸リアーゼを探索すべ
く日本国内の土壌よりスクリーニングしたところ、微生
物が産生するアルカリ領域に最適反応pHを有する新規な
アルカリペクチン酸リアーゼを見出し本発明を完成する
に至った。
て、本発明者らは新たなペクチン酸リアーゼを探索すべ
く日本国内の土壌よりスクリーニングしたところ、微生
物が産生するアルカリ領域に最適反応pHを有する新規な
アルカリペクチン酸リアーゼを見出し本発明を完成する
に至った。
【００１１】すなわち、本発明は下記の酵素学的性質を
有するアルカリペクチン酸リアーゼ及びその製造法を提
供するものである。
有するアルカリペクチン酸リアーゼ及びその製造法を提
供するものである。
【００１２】 （１）作用 ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応に よってエンド的にα−１，４結合を切断すると共に非 還元末端のＣ４−Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和ジ ガラクツロニド、あるいは不飽和オリゴガラクツロニ ドを生成する。 （２）基質特異性 プロトペクチン、ペクチン酸（ポリガラクツロン酸） 、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作用する。 （３）最適反応pH pH１０．３〜１０．７（５０mMグリシン−水酸化ナト リウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合） （４）安定pH pH５〜１１．５（３０℃、４０mMブリットン・ロビン ソン広域緩衝液中６０分間処理） （５）分子量 約２０〜２１ｋＤａ（超遠心平衡沈降法；ＳＤＳポリ アクリルアミド電気泳動法では約２６ｋＤａ）
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明アルカリペクチン酸リアー
ゼは、さらに詳細には、以下の酵素学的性質を有する酵
素である。
ゼは、さらに詳細には、以下の酵素学的性質を有する酵
素である。
【００１４】 （１）作用 ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応に よってエンド的にα−１，４結合を切断すると共に非 還元末端のＣ４−Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和ジ ガラクツロニド、あるいは不飽和オリゴガラクツロニ ドを生成する。 （２）基質特異性 プロトペクチン、ペクチン酸（ポリガラクツロン酸） 、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作用する。 （３）最適反応pH pH１０．３〜１０．７（５０mMグリシン−水酸化ナト リウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合） （４）安定pH pH５〜１１．５（３０℃、４０mMブリットン・ロビン ソン広域緩衝液中６０分間処理） （５）最適反応温度 ５０〜５５℃（pH１０．５、５０mMグリシン−水酸化 ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合） （６）耐熱性 約５０℃（pH７．５、５０mMトリス−塩酸緩衝液中、 ３０分間処理） （７）分子量 約２０〜２１ｋＤａ（超遠心平衡沈降法；ＳＤＳポリ アクリルアミド電気泳動法では約２６ｋＤａ） （８）等電点 pH１０．３付近（等電点電気泳動法） （９）阻害剤 エチレンジアミンテトラアセテート等のキレート剤に よって阻害される。 （１０）金属イオン 反応にＣａ2+を必要とする。
【００１５】本発明ペクチン酸リアーゼは、例えばアル
カリペクチン酸リアーゼ生産菌を培養し、その培養物か
ら採取することにより製造される。かかるアルカリペク
チン酸リアーゼとしては、バチルス属に属する細菌、例
えば下記の菌学的性質を有するＫＳＭ−Ｐ１５株が挙げ
られる。
カリペクチン酸リアーゼ生産菌を培養し、その培養物か
ら採取することにより製造される。かかるアルカリペク
チン酸リアーゼとしては、バチルス属に属する細菌、例
えば下記の菌学的性質を有するＫＳＭ−Ｐ１５株が挙げ
られる。
【００１６】Ａ 形態学的性質 （ａ）細胞の形及び大きさ 桿菌 ０．３〜０．
５×１．６〜２．１μｍ （ｂ）多形性 無し （ｃ）運動性 有り （ｄ）胞子（大きさ、形、位置、膨潤の有無）０．６〜
０．７×１．２〜１．４μｍ，中央、準端，膨潤有り （ｅ）グラム染色 陽性 （ｆ）抗酸性 陰性 （ｇ）肉汁寒天平板培地上での生育（培地１）黄白色、
点状、隆起状、全縁のコロニーを形成 （ｈ）リトマスミルク（培地２） 僅かに赤色を呈する
が凝固はしない
５×１．６〜２．１μｍ （ｂ）多形性 無し （ｃ）運動性 有り （ｄ）胞子（大きさ、形、位置、膨潤の有無）０．６〜
０．７×１．２〜１．４μｍ，中央、準端，膨潤有り （ｅ）グラム染色 陽性 （ｆ）抗酸性 陰性 （ｇ）肉汁寒天平板培地上での生育（培地１）黄白色、
点状、隆起状、全縁のコロニーを形成 （ｈ）リトマスミルク（培地２） 僅かに赤色を呈する
が凝固はしない
【００１７】Ｂ 生理学的性質 （ａ）硝酸塩の還元（培地３） 陽性 （ｂ）脱窒反応 （培地３） 陰性 （ｃ）ＭＲテスト（培地４） 陽性（pH５．５） （ｄ）ＶＰテスト（培地４） 陽性 （ｅ）インドール生成（培地５） 陰性 （ｆ）硫化水素生成（培地６） 陰性 （ｇ）デンプン加水分解（培地７）陽性 （ｈ）クエン酸の利用（培地８） 陽性 （ｉ）無機窒素の利用（培地９） 硝酸塩、アンモニウ
ム塩を利用しない。 （ｊ）色素の生成（培地１０） 無し （ｋ）ウレアーゼ（培地１１） 陰性 （ｌ）オキシダーゼ（培地１２） 陽性 （ｍ）生育の温度範囲（培地１３）２０℃〜４５℃ （ｎ）生育のpH範囲（培地１４） pH７〜１０ （ｏ）生育における酸素の影響 （培地１５） 嫌気
条件下で生育する。 （ｐ）ＯＦテスト （培地１６） 生育するが色調の変
化は認められない （ｑ）グルコースからのガス産生（培地１７） 無し （ｒ）塩化ナトリウムに対する耐性（培地１８） ３％
塩化ナトリウム含有培地上で生育できない。 （ｓ）糖からの酸生成（培地１９） 下表に結果を示
す。
ム塩を利用しない。 （ｊ）色素の生成（培地１０） 無し （ｋ）ウレアーゼ（培地１１） 陰性 （ｌ）オキシダーゼ（培地１２） 陽性 （ｍ）生育の温度範囲（培地１３）２０℃〜４５℃ （ｎ）生育のpH範囲（培地１４） pH７〜１０ （ｏ）生育における酸素の影響 （培地１５） 嫌気
条件下で生育する。 （ｐ）ＯＦテスト （培地１６） 生育するが色調の変
化は認められない （ｑ）グルコースからのガス産生（培地１７） 無し （ｒ）塩化ナトリウムに対する耐性（培地１８） ３％
塩化ナトリウム含有培地上で生育できない。 （ｓ）糖からの酸生成（培地１９） 下表に結果を示
す。
【００１８】
【表１】 糖類 酸生成 ガラクトース ＋ キシロース ＋ アラビノース ＋ シュークロース ＋ グルコース ＋ マンニトール ＋ マンノース ＋ イノシトール − ソルビトール − トレハロース ＋ ラクトース ＋ グリセリン ＋ マルトース ＋ フラクトース ＋ ラフィノース ＋ メリビオース ＋ 可溶性でんぷん ＋ ＋，酸生成有り ； −，酸生成無し
【００１９】 培地１ ニュートリエントアガー（Ｄｉｆｃｏ社製）、
指示量 培地２ バクトリトマスミルク （Ｄｉｆｃｏ社製）、
１０．５重量％ 培地３ ニュートリエントブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）、
０．８重量％；硝酸カリウム、０．１重量％ 培地４ ＶＰ−ＭＲ ブロス（ＢＢＬ社製）、指示量 培地５ ニュートリエントブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）、
指示量；インドール試験紙( 日水製薬社製） 培地６ ＴＳＩ寒天培地（栄研化学社製）、指示量 培地７ ニュートリエントアガー（Ｄｉｆｃｏ社製）、
指示量；可溶性デンプン、１．０重量％ 培地８ クリステンセン培地（栄研化学社製）、指示量 培地９ 酵母エキス、０．０５重量％；硫酸ナトリウ
ム、０．１重量％；リン酸１カリウム、０．１重量
％，；グルコース、０．１重量％；硝酸ナトリウム、又
は亜硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム、０．０２５重量％ 培地１０ キングＡ培地、キングＢ培地（栄研化学社
製）、指示量 培地１１ バクトペプトン、０．１重量％；塩化ナトリ
ウム、０．３重量％；リン酸１カリウム、０．２重量
％；酵母エキス、０．０５重量％；グルコース、０.1重
量％；フェノールレッド、０．００１重量％；尿素、
２．０重量％ 培地１２ チトクロムオキシダーゼ試験濾紙（日水製薬
社製） 培地１３ ＳＣＤ培地（日本製薬社製） 培地１４ ニュートリエントブロスに炭酸ナトリウム、
塩酸を別滅菌後に添加し、pHを調整した。 培地１５ アナエロビック アガー（Ｄｉｆｃｏ社
製）、指示量 培地１６ ＯＦ基礎培地（Ｄｉｆｃｏ社製）、指示量；
グルコース、１．０重量％ 培地１７ ＳＣＤ培地（日本製薬社製）、指示量；グル
コース、０．５重量％ 培地１８ ニュートリエントアガー（Ｄｉｆｃｏ社
製）、指示量；塩化ナトリウム、３．０〜１０．０重量
％ 培地１９ リン酸二アンモニウム、０．１；塩化カリウ
ム、０．０２重量％；硫酸マグネシウム、０．０２重量
％；酵母エキス、０．０２重量％；寒天、１．５重量
％；ブロムクレゾールパープル、０．０００６重量％；
糖類（別滅菌）、０．５重量％
指示量 培地２ バクトリトマスミルク （Ｄｉｆｃｏ社製）、
１０．５重量％ 培地３ ニュートリエントブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）、
０．８重量％；硝酸カリウム、０．１重量％ 培地４ ＶＰ−ＭＲ ブロス（ＢＢＬ社製）、指示量 培地５ ニュートリエントブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）、
指示量；インドール試験紙( 日水製薬社製） 培地６ ＴＳＩ寒天培地（栄研化学社製）、指示量 培地７ ニュートリエントアガー（Ｄｉｆｃｏ社製）、
指示量；可溶性デンプン、１．０重量％ 培地８ クリステンセン培地（栄研化学社製）、指示量 培地９ 酵母エキス、０．０５重量％；硫酸ナトリウ
ム、０．１重量％；リン酸１カリウム、０．１重量
％，；グルコース、０．１重量％；硝酸ナトリウム、又
は亜硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム、０．０２５重量％ 培地１０ キングＡ培地、キングＢ培地（栄研化学社
製）、指示量 培地１１ バクトペプトン、０．１重量％；塩化ナトリ
ウム、０．３重量％；リン酸１カリウム、０．２重量
％；酵母エキス、０．０５重量％；グルコース、０.1重
量％；フェノールレッド、０．００１重量％；尿素、
２．０重量％ 培地１２ チトクロムオキシダーゼ試験濾紙（日水製薬
社製） 培地１３ ＳＣＤ培地（日本製薬社製） 培地１４ ニュートリエントブロスに炭酸ナトリウム、
塩酸を別滅菌後に添加し、pHを調整した。 培地１５ アナエロビック アガー（Ｄｉｆｃｏ社
製）、指示量 培地１６ ＯＦ基礎培地（Ｄｉｆｃｏ社製）、指示量；
グルコース、１．０重量％ 培地１７ ＳＣＤ培地（日本製薬社製）、指示量；グル
コース、０．５重量％ 培地１８ ニュートリエントアガー（Ｄｉｆｃｏ社
製）、指示量；塩化ナトリウム、３．０〜１０．０重量
％ 培地１９ リン酸二アンモニウム、０．１；塩化カリウ
ム、０．０２重量％；硫酸マグネシウム、０．０２重量
％；酵母エキス、０．０２重量％；寒天、１．５重量
％；ブロムクレゾールパープル、０．０００６重量％；
糖類（別滅菌）、０．５重量％
【００２０】以上の菌学的性質について「Bergey's Man
ual of Systematic Bacteriology」（Williams & Wilki
ns社、1984年）の記載に準じ検討したところ、本菌株は
バチルス サーキュランス（Bacillus circulans）に属
させることが妥当である。しかし、バチルス サーキュ
ランスは、一般的に非常に多様性に富む菌株であり、本
菌株の諸性質は既知のバチルス サーキュランスの諸性
質とは完全に一致しない新規な微生物である。そこで、
本菌株を工業技術院生命工学研究所にバチルスエスピー
（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｐ１５（ＦＥＲＭ Ｐ−１５
９８７）として寄託した。
ual of Systematic Bacteriology」（Williams & Wilki
ns社、1984年）の記載に準じ検討したところ、本菌株は
バチルス サーキュランス（Bacillus circulans）に属
させることが妥当である。しかし、バチルス サーキュ
ランスは、一般的に非常に多様性に富む菌株であり、本
菌株の諸性質は既知のバチルス サーキュランスの諸性
質とは完全に一致しない新規な微生物である。そこで、
本菌株を工業技術院生命工学研究所にバチルスエスピー
（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｐ１５（ＦＥＲＭ Ｐ−１５
９８７）として寄託した。
【００２１】ＫＳＭ−Ｐ１５株等のアルカリペクチン酸
リアーゼ生産菌を用いて本発明アルカリペクチン酸リア
ーゼを生産するには、菌株を同化性の炭素源、窒素源そ
の他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養
すれば良い。炭素源、窒素源は特に制限はなく、資化し
うる炭素源、例えばペクチン質、ガラクトース、グルコ
ース、蔗糖、でんぷん、クエン酸、酢酸等があげられ
る。窒素源としては、肉エキス、魚肉エキス、コーンス
ティープリカー、ペプトン、大豆粉、綿実油粕、酵母エ
キス、尿素等が利用できる。その他、リン酸塩、Ｍ
ｇ2+、Ｃａ2+、Ｍｎ2+、 Ｎａ+ 、Ｋ+ 等の金属塩など
有機、無機微量栄養源を培地中に適宜添加できる。培地
のpHの調整には、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等を用
い、本酵素の最適生産pHに調整することが望ましい。
リアーゼ生産菌を用いて本発明アルカリペクチン酸リア
ーゼを生産するには、菌株を同化性の炭素源、窒素源そ
の他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養
すれば良い。炭素源、窒素源は特に制限はなく、資化し
うる炭素源、例えばペクチン質、ガラクトース、グルコ
ース、蔗糖、でんぷん、クエン酸、酢酸等があげられ
る。窒素源としては、肉エキス、魚肉エキス、コーンス
ティープリカー、ペプトン、大豆粉、綿実油粕、酵母エ
キス、尿素等が利用できる。その他、リン酸塩、Ｍ
ｇ2+、Ｃａ2+、Ｍｎ2+、 Ｎａ+ 、Ｋ+ 等の金属塩など
有機、無機微量栄養源を培地中に適宜添加できる。培地
のpHの調整には、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等を用
い、本酵素の最適生産pHに調整することが望ましい。
【００２２】かくして得られた培養液中からのアルカリ
ペクチン酸リアーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採
取及び精製方法に準じて行うことができる。即ち、培養
液から遠心分離又はろ過することで菌体を除き、培養上
清液から常法の精製手段、例えば塩析法、溶媒沈殿法、
等電点沈殿法によってタンパク質を沈殿させたり、限外
ろ過により濃縮させて目的酵素を得る。塩析法の例とし
て硫安（３０〜９０％飽和画分）、溶媒沈殿法の例とし
てエタノール（５０％以上）中で酵素を沈殿させた後、
遠心分離、脱塩処理し、凍結乾燥粉末を得ることができ
る。ここで脱塩方法としては、透析あるいはセファデッ
クスＧ−１０等を用いるゲルろ過の方法が用いられる。
このようにして得られる酵素液は、そのまま用いること
もできるがさらに公知の方法により精製、結晶化するこ
ともできる。
ペクチン酸リアーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採
取及び精製方法に準じて行うことができる。即ち、培養
液から遠心分離又はろ過することで菌体を除き、培養上
清液から常法の精製手段、例えば塩析法、溶媒沈殿法、
等電点沈殿法によってタンパク質を沈殿させたり、限外
ろ過により濃縮させて目的酵素を得る。塩析法の例とし
て硫安（３０〜９０％飽和画分）、溶媒沈殿法の例とし
てエタノール（５０％以上）中で酵素を沈殿させた後、
遠心分離、脱塩処理し、凍結乾燥粉末を得ることができ
る。ここで脱塩方法としては、透析あるいはセファデッ
クスＧ−１０等を用いるゲルろ過の方法が用いられる。
このようにして得られる酵素液は、そのまま用いること
もできるがさらに公知の方法により精製、結晶化するこ
ともできる。
【００２３】かくして得られる本発明のアルカリペクチ
ン酸リアーゼの一例であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｋ
ＳＭ−Ｐ１５株由来のアルカリペクチン酸リアーゼは、
以下に示すような理化学的性質を有する。なお、酵素活
性の測定は次の如くして行った。
ン酸リアーゼの一例であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｋ
ＳＭ−Ｐ１５株由来のアルカリペクチン酸リアーゼは、
以下に示すような理化学的性質を有する。なお、酵素活
性の測定は次の如くして行った。
【００２４】（１）標準酵素活性測定法 試験管に０．３mlの０．５M グリシン−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（pH１０．５）、０．３mlの６mM 塩化カルシ
ウム溶液、１．７mlの脱イオン水を加え、３０℃で５分
間恒温した後、０．１mlの適当に希釈した酵素液（希釈
は１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝
液、pH７．５により行った）を加えさらに５分間恒温し
た。反応は、０．６mlの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロ
ン酸水溶液（ＩＣＮ社製：Ｌｏｔ １４４８２、水酸化
ナトリウム溶液にてpH６．８に調整したもの）を添加し
開始した。３０℃で１０分間恒温した後、３mlの５０mM
塩酸を加え反応を停止した。生成した不飽和ポリガラク
ツロン酸量は２３５nmにおける吸光度を測定し、不飽和
ジガラクツロニドの分子吸光係数４６００（Hasegawa,
S. & Nagel, C. W., J. Food Sci. 31, 838-845, 196
6）を用いて求めた。なお、ブランクは酵素液を加えず
に処理した反応液に３mlの５０mM塩酸を加え、その後に
０．１mlの酵素液を添加したものを用意した。酵素１単
位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μmo
l の不飽和ジガラクツロニド相当の不飽和ポリガラクツ
ロニドを生成する量とした。
ム緩衝液（pH１０．５）、０．３mlの６mM 塩化カルシ
ウム溶液、１．７mlの脱イオン水を加え、３０℃で５分
間恒温した後、０．１mlの適当に希釈した酵素液（希釈
は１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝
液、pH７．５により行った）を加えさらに５分間恒温し
た。反応は、０．６mlの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロ
ン酸水溶液（ＩＣＮ社製：Ｌｏｔ １４４８２、水酸化
ナトリウム溶液にてpH６．８に調整したもの）を添加し
開始した。３０℃で１０分間恒温した後、３mlの５０mM
塩酸を加え反応を停止した。生成した不飽和ポリガラク
ツロン酸量は２３５nmにおける吸光度を測定し、不飽和
ジガラクツロニドの分子吸光係数４６００（Hasegawa,
S. & Nagel, C. W., J. Food Sci. 31, 838-845, 196
6）を用いて求めた。なお、ブランクは酵素液を加えず
に処理した反応液に３mlの５０mM塩酸を加え、その後に
０．１mlの酵素液を添加したものを用意した。酵素１単
位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μmo
l の不飽和ジガラクツロニド相当の不飽和ポリガラクツ
ロニドを生成する量とした。
【００２５】（２）最適反応pH ５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７〜９）、又は５０mMグ
リシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH８．５〜１１．
０）を用いて最適反応pHを調べたところ、本酵素はグリ
シン−水酸化ナトリウム緩衝液pH１０．５中で最も反応
速度が高く、pH１０．３〜１０．７の範囲内において最
高活性の９０％以上の活性を示した。さらにpH１０．０
〜１１．０の範囲内において最高活性の７０％以上の活
性を示した（図１）。
リシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH８．５〜１１．
０）を用いて最適反応pHを調べたところ、本酵素はグリ
シン−水酸化ナトリウム緩衝液pH１０．５中で最も反応
速度が高く、pH１０．３〜１０．７の範囲内において最
高活性の９０％以上の活性を示した。さらにpH１０．０
〜１１．０の範囲内において最高活性の７０％以上の活
性を示した（図１）。
【００２６】（３）pH安定性 ４０mMブリットン・ロビンソン広域緩衝液（pH３〜１
２）、５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７〜９）又は５０
mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH９〜１０．
５）中に１mMの塩化カルシウムを添加した系と無添加の
系を用い、酵素液を加えて３０℃、１時間恒温した後の
残存活性を標準酵素活性測定法にて調べた。その結果、
本酵素は、カルシウムの存在の有無に拘らずpH５〜１
１．５の範囲で極めて安定であった（図２）。
２）、５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７〜９）又は５０
mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH９〜１０．
５）中に１mMの塩化カルシウムを添加した系と無添加の
系を用い、酵素液を加えて３０℃、１時間恒温した後の
残存活性を標準酵素活性測定法にて調べた。その結果、
本酵素は、カルシウムの存在の有無に拘らずpH５〜１
１．５の範囲で極めて安定であった（図２）。
【００２７】（４）最適反応温度 ５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．
５）中にて１０℃〜７０℃の各温度で酵素反応を行い、
最適反応温度を調べた。その結果、本酵素は、１０℃−
６５℃の広範囲において作用し、その最適反応温度は５
０〜５５℃であった（図３）。
５）中にて１０℃〜７０℃の各温度で酵素反応を行い、
最適反応温度を調べた。その結果、本酵素は、１０℃−
６５℃の広範囲において作用し、その最適反応温度は５
０〜５５℃であった（図３）。
【００２８】（５）耐熱性 ５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）に１mMの塩化カ
ルシウムを添加した系及び無添加系を用意し、酵素を加
えて１０℃〜７０℃の各温度で３０分間放置した。その
後氷中で急冷し、残存活性を標準酵素活性測定法にて調
べた。その結果、本酵素は、５０℃まで極めて安定であ
った。また、カルシウムイオンによる安定化効果は高温
側で若干認められた（図４）。
ルシウムを添加した系及び無添加系を用意し、酵素を加
えて１０℃〜７０℃の各温度で３０分間放置した。その
後氷中で急冷し、残存活性を標準酵素活性測定法にて調
べた。その結果、本酵素は、５０℃まで極めて安定であ
った。また、カルシウムイオンによる安定化効果は高温
側で若干認められた（図４）。
【００２９】（６）分子量 ａ．平衡沈降法による本酵素の分子量は次のように求め
た。超遠心機（日立製作所製ＳＣＰ−７０Ｈ型、 ＲＡ
Ｐ６０型ローター）を用いダブルセクターセルの一方に
酵素サンプル（０．２，０．３，０．４及び０．６mg／
ml）を０．１ml、もう一方に０．１mlの脱イオン水を注
入し、２０℃、２００００rpm で２０−２４時間回転さ
せ平衡状態に達した後、ＵＶスキャナ（日立製作所製
ＡＢＳ−７型）を用いて酵素の分布状態を測定し、デー
タ解析装置（日立製作所製 ＤＡ−７型）により分子量
を求めた。部分比容値は、０．７４を用い、タンパク質
濃度を０に外挿し分子量を求めた結果、本酵素の分子量
は、２０．３±１．０ｋＤａであった。
た。超遠心機（日立製作所製ＳＣＰ−７０Ｈ型、 ＲＡ
Ｐ６０型ローター）を用いダブルセクターセルの一方に
酵素サンプル（０．２，０．３，０．４及び０．６mg／
ml）を０．１ml、もう一方に０．１mlの脱イオン水を注
入し、２０℃、２００００rpm で２０−２４時間回転さ
せ平衡状態に達した後、ＵＶスキャナ（日立製作所製
ＡＢＳ−７型）を用いて酵素の分布状態を測定し、デー
タ解析装置（日立製作所製 ＤＡ−７型）により分子量
を求めた。部分比容値は、０．７４を用い、タンパク質
濃度を０に外挿し分子量を求めた結果、本酵素の分子量
は、２０．３±１．０ｋＤａであった。
【００３０】ｂ．ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポ
リアクリルアミド電気泳動法（１５％ゲル）により、本
酵素の分子量は約２６ｋＤａと見積られた。尚、標準タ
ンパク質としてバイオラッド社製の分子量マーカー（ホ
スフォリラーゼｂ，９７．４ｋＤａ；牛血清アルブミ
ン，６６．２ｋＤａ；オボアルブミン，４５ｋＤａ；カ
ルボニックアンヒドラーゼ，３１ｋＤａ；トリプシンイ
ンヒビター，２１．５ｋＤａ；α−ラクトアルブミン，
１４．４ｋＤａ）を用いた。
リアクリルアミド電気泳動法（１５％ゲル）により、本
酵素の分子量は約２６ｋＤａと見積られた。尚、標準タ
ンパク質としてバイオラッド社製の分子量マーカー（ホ
スフォリラーゼｂ，９７．４ｋＤａ；牛血清アルブミ
ン，６６．２ｋＤａ；オボアルブミン，４５ｋＤａ；カ
ルボニックアンヒドラーゼ，３１ｋＤａ；トリプシンイ
ンヒビター，２１．５ｋＤａ；α−ラクトアルブミン，
１４．４ｋＤａ）を用いた。
【００３１】（７）等電点 pH８−１０．５のアンフォライン（ファルマライト，フ
ァルマシア社製）を含む５％ポリアクリルアミドゲルを
用いた等電点電気泳動法により、本酵素の等電点はpH１
０．３付近であった。
ァルマシア社製）を含む５％ポリアクリルアミドゲルを
用いた等電点電気泳動法により、本酵素の等電点はpH１
０．３付近であった。
【００３２】（８）アミノ末端配列 本酵素をＰｒｏＳｏｒｂフィルター（パーキンエルマー
社製）にブロッティングし、プロテインシークエンサー
（６７４型，アプライドバイオシステム社製）を用いて
アミノ末端配列を２０番目のアミノ酸まで決定した結
果、ＡＰＴＶＶＨＥＴＩＲＶＰＡＧＱＴＦＤＧＫであっ
た。
社製）にブロッティングし、プロテインシークエンサー
（６７４型，アプライドバイオシステム社製）を用いて
アミノ末端配列を２０番目のアミノ酸まで決定した結
果、ＡＰＴＶＶＨＥＴＩＲＶＰＡＧＱＴＦＤＧＫであっ
た。
【００３３】（９）基質特異性 ポリガラクツロン酸の代わりにエステル化度の異なるペ
クチンを基質とた場合の反応速度を標準酵素活性測定法
を用いて調べた。本酵素は、ポリガラクツロン酸（ＩＣ
Ｎ社製、Ｌｏｔ １４４８２）に対し最も反応性が高
く、同じポリガラクツロン酸（シグマ社製、Ｌｏｔ １
２２Ｈ３７８０）を用いた時の約２倍の反応速度であっ
た。エステル化度が高くなるにつれて反応速度は減少し
ていくが、９３％のエステル化度を有するペクチンに対
しても弱いながらも作用した（図５）。なお、ペクチン
酸（ＩＣＮ社製）に対するｋｍ値は、０．０８％であっ
た。次に基質として品質管理用作業手袋（４０スムス晒
指付き・綿、中田久吉商店製）を細かく裁断（１〜２mm
四方）した木綿繊維片１０mg（１％ｗ／ｖ）を０．６mM
塩化カルシウムを含む１００mMグリシン−水酸化ナトリ
ウム緩衝液（pH１０．５）中に懸濁し、酵素を添加した
後、３０℃、６０分間、１２０rpm で反応させた。反応
液を遠心分離し上澄液中に遊離したペクチンをカルバゾ
ール硫酸法により定量した（Sakai, T., Methods Enzym
ol., 161, 335-350, 1988）。その結果、０．１U の酵
素を用いた場合１０mgの木綿繊維あたりガラクツロン酸
として２０〜５０μｇのペクチン遊離量が認められた。
このことは、本酵素が木綿繊維表面のプロトペクチンに
対して作用していることを示唆し、さらに上澄液中の２
３５nmにおける吸光度の上昇が認められたことから、本
酵素はＡタイプに属するプロトペクチナーゼ活性を有し
ていることが判った。さらにＷａｒｄとＦｏｇａｒｔｙ
の方法（J. Gen. Microbiol., 73, 439-446, 1972）に
従い調製した酸可溶性ペクチン酸を基質として用いた場
合、ペクチン酸に対する反応速度と同程度の反応速度で
分解した。
クチンを基質とた場合の反応速度を標準酵素活性測定法
を用いて調べた。本酵素は、ポリガラクツロン酸（ＩＣ
Ｎ社製、Ｌｏｔ １４４８２）に対し最も反応性が高
く、同じポリガラクツロン酸（シグマ社製、Ｌｏｔ １
２２Ｈ３７８０）を用いた時の約２倍の反応速度であっ
た。エステル化度が高くなるにつれて反応速度は減少し
ていくが、９３％のエステル化度を有するペクチンに対
しても弱いながらも作用した（図５）。なお、ペクチン
酸（ＩＣＮ社製）に対するｋｍ値は、０．０８％であっ
た。次に基質として品質管理用作業手袋（４０スムス晒
指付き・綿、中田久吉商店製）を細かく裁断（１〜２mm
四方）した木綿繊維片１０mg（１％ｗ／ｖ）を０．６mM
塩化カルシウムを含む１００mMグリシン−水酸化ナトリ
ウム緩衝液（pH１０．５）中に懸濁し、酵素を添加した
後、３０℃、６０分間、１２０rpm で反応させた。反応
液を遠心分離し上澄液中に遊離したペクチンをカルバゾ
ール硫酸法により定量した（Sakai, T., Methods Enzym
ol., 161, 335-350, 1988）。その結果、０．１U の酵
素を用いた場合１０mgの木綿繊維あたりガラクツロン酸
として２０〜５０μｇのペクチン遊離量が認められた。
このことは、本酵素が木綿繊維表面のプロトペクチンに
対して作用していることを示唆し、さらに上澄液中の２
３５nmにおける吸光度の上昇が認められたことから、本
酵素はＡタイプに属するプロトペクチナーゼ活性を有し
ていることが判った。さらにＷａｒｄとＦｏｇａｒｔｙ
の方法（J. Gen. Microbiol., 73, 439-446, 1972）に
従い調製した酸可溶性ペクチン酸を基質として用いた場
合、ペクチン酸に対する反応速度と同程度の反応速度で
分解した。
【００３４】（１０）基質の分解様式 オストワルド粘度計（イワキガラス社製、Ｎｏ．１）に
終濃度が５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH
１０．５）、０．６mM塩化カルシウム、０．７５％ポリ
ガラクツロン酸水溶液（ＩＣＮ社製：Ｌｏｔ １４４８
２、水酸化ナトリウム溶液にてpH６．８に調整したも
の）となるように調製した反応液を加えて、３０℃で恒
温した。これに酵素を０．１U添加し、３０℃で１時間
反応させた。一定時間ごとに粘度を測定しながら、反応
液を１mlずつ採取し、０．５Mエチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）を０．０４ml加えた後、２３５nmにおける
吸光度を測定した。その結果、反応時間に伴い粘度は低
下し、初期粘度を１００％とした場合、３０分後には６
０％、６０分後には４０％まで減少した。この時の不飽
和ジガラクツロニド相当の不飽和物生成量は、基質の構
成ガラクツロン酸量を１００％とした場合、６０分後で
２％程度であったことから、本酵素はエンド型のペクチ
ン酸リアーゼであることが判った（図６）。
終濃度が５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH
１０．５）、０．６mM塩化カルシウム、０．７５％ポリ
ガラクツロン酸水溶液（ＩＣＮ社製：Ｌｏｔ １４４８
２、水酸化ナトリウム溶液にてpH６．８に調整したも
の）となるように調製した反応液を加えて、３０℃で恒
温した。これに酵素を０．１U添加し、３０℃で１時間
反応させた。一定時間ごとに粘度を測定しながら、反応
液を１mlずつ採取し、０．５Mエチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）を０．０４ml加えた後、２３５nmにおける
吸光度を測定した。その結果、反応時間に伴い粘度は低
下し、初期粘度を１００％とした場合、３０分後には６
０％、６０分後には４０％まで減少した。この時の不飽
和ジガラクツロニド相当の不飽和物生成量は、基質の構
成ガラクツロン酸量を１００％とした場合、６０分後で
２％程度であったことから、本酵素はエンド型のペクチ
ン酸リアーゼであることが判った（図６）。
【００３５】（１１）金属イオンの影響 本酵素は、反応にカルシウムイオンを必要とし、そのＫ
ｍ値は０．１４mMであった。１mMのＥＤＴＡにより処理
をした酵素（脱イオン水に対して透析したもの）につい
てカルシウムイオン以外の金属イオンの影響を調べた結
果、マンガン、ストロンチウム、コバルトの各イオンを
添加した場合に若干の分解反応が認められたが、いずれ
もカルシウムイオンの場合の１０％以下の反応速度であ
った。次に１mMのＥＤＴＡ を含む１０mM ＭＯＰＳ緩
衝液（pH７．５）にて希釈した酵素液を最終濃度が５０
mM ＭＯＰＳ緩衝液（pH７．５）、５mMの各金属塩とな
るように調製した処理液に１／１０量添加し、３０℃で
３０分間放置した。処理した酵素液を２０mMトリス−塩
酸緩衝液（pH７．５）にて希釈し、標準酵素活性測定法
により残存活性を測定した。本酵素は、上記の処理にお
いて各種金属イオンに対し極めて安定であったが、水銀
イオン及び亜鉛イオンにより若干阻害された（表２）。
ｍ値は０．１４mMであった。１mMのＥＤＴＡにより処理
をした酵素（脱イオン水に対して透析したもの）につい
てカルシウムイオン以外の金属イオンの影響を調べた結
果、マンガン、ストロンチウム、コバルトの各イオンを
添加した場合に若干の分解反応が認められたが、いずれ
もカルシウムイオンの場合の１０％以下の反応速度であ
った。次に１mMのＥＤＴＡ を含む１０mM ＭＯＰＳ緩
衝液（pH７．５）にて希釈した酵素液を最終濃度が５０
mM ＭＯＰＳ緩衝液（pH７．５）、５mMの各金属塩とな
るように調製した処理液に１／１０量添加し、３０℃で
３０分間放置した。処理した酵素液を２０mMトリス−塩
酸緩衝液（pH７．５）にて希釈し、標準酵素活性測定法
により残存活性を測定した。本酵素は、上記の処理にお
いて各種金属イオンに対し極めて安定であったが、水銀
イオン及び亜鉛イオンにより若干阻害された（表２）。
【００３６】
【表２】 各種金属イオンの酵素活性に及ぼす影響 金属塩 濃度（ｍＭ） 残存活性（％） 塩化カルシウム ５ ９８ 塩化ストロンチウム ５ ９６ 塩化カドミウム ５ ９１ 塩化バリウム ５ ９２ 塩化マンガン ５ ８８ 塩化亜鉛 ５ ７３ 塩化第一鉄 ５ ９９ 塩化第ニ鉄 ５ ９２ 塩化マグネシウム ５ ９５ 塩化ニッケル ５ ８１ 硝酸銀 ５ ８４ 塩化銅 ５ １０９ 塩化水銀 ５ ７６ 塩化コバルト ５ ９６ 塩化アルミニウム ５ ９８ 無添加 − １００
【００３７】（１２）各種化合物の影響 本酵素の活性に及ぼす各種化合物の影響を調べた。ま
ず、標準酵素活性測定法に各種化合物を添加して酵素反
応を行ったところ、１mM ＥＤＴＡ、１mM ＥＧＴＡ（エ
チレングリコール四酢酸）、０．０１％ニトリロ三酢
酸、０．１％トリポリリン酸ナトリウムによって完全に
阻害された。これは、本酵素がカルシウムイオンを反応
に必要とするためにキレーターである上記化合物によっ
てカルシウムイオンが捕捉されることで起きたと考えら
れた。次に所定濃度の各種化合物を５０mMトリス−塩酸
緩衝液（pH７．５）中に添加し、酵素液を加えて３０
℃、１時間恒温した後に残存活性を標準酵素活性測定法
にて調べた。その結果、本酵素は、界面活性剤、キレー
ト剤、他の化合物により阻害されることはなかった（表
３）。
ず、標準酵素活性測定法に各種化合物を添加して酵素反
応を行ったところ、１mM ＥＤＴＡ、１mM ＥＧＴＡ（エ
チレングリコール四酢酸）、０．０１％ニトリロ三酢
酸、０．１％トリポリリン酸ナトリウムによって完全に
阻害された。これは、本酵素がカルシウムイオンを反応
に必要とするためにキレーターである上記化合物によっ
てカルシウムイオンが捕捉されることで起きたと考えら
れた。次に所定濃度の各種化合物を５０mMトリス−塩酸
緩衝液（pH７．５）中に添加し、酵素液を加えて３０
℃、１時間恒温した後に残存活性を標準酵素活性測定法
にて調べた。その結果、本酵素は、界面活性剤、キレー
ト剤、他の化合物により阻害されることはなかった（表
３）。
【００３８】
【表３】 各種化合物の酵素活性に及ぼす影響 化合物 濃度 残存活性（％） ＥＤＴＡ ５ ｍＭ ８９ ＥＧＴＡ ５ ｍＭ ９１ トリポリリン酸ナトリウム ０．１％ ９１ クエン酸 ０．１％ ９５ ゼオライトＡ−３ ０．１％ １０３ アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム ０．０１％ ９１ ドデシル硫酸ナトリウム ０．０２％ ９８ ポリオキシエチレンアルキル ０．１％ ９７ 硫酸ナトリウム ソフタノール７０Ｈ ０．１％ １０１ アルキルグルコシド ０．１％ １０１ ｐ−クロロマーキュリ安息香酸 ０．５ｍＭ ９１ Ｎ−エチルマレイミド １ｍＭ ９３ モノヨード酢酸 １ｍＭ ９６ ジチオスレイトール １ｍＭ ９９ ２−メルカプトエタノール １ｍＭ ９７ 無添加（コントロール） − １００
【００３９】このように本発明のアルカリペクチン酸リ
アーゼは、プロトペクチナーゼ活性を有するＡ−タイプ
の酵素であり、単純なベル型のpH−活性曲線を示し、そ
の最適反応pHはpH１０．３〜１０．７にあり、分子量は
約２０〜２１ｋＤａ（平衡沈降法）である。これらの性
質を有する本発明酵素は、以上の点で従来のFusarium ox
ysporum f. sp. ciceri株、Bacillus sp. YA-14株、Frs
arium solani f. sp. pisi株及びAmycolata sp.の生産
するアルカリペクチン酸リアーゼと大きく異なってい
る。
アーゼは、プロトペクチナーゼ活性を有するＡ−タイプ
の酵素であり、単純なベル型のpH−活性曲線を示し、そ
の最適反応pHはpH１０．３〜１０．７にあり、分子量は
約２０〜２１ｋＤａ（平衡沈降法）である。これらの性
質を有する本発明酵素は、以上の点で従来のFusarium ox
ysporum f. sp. ciceri株、Bacillus sp. YA-14株、Frs
arium solani f. sp. pisi株及びAmycolata sp.の生産
するアルカリペクチン酸リアーゼと大きく異なってい
る。
【００４０】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれに制限されるものではない。
が、本発明はこれに制限されるものではない。
【００４１】実施例１：ペクチン酸リアーゼ生産菌のス
クリーニング 日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したもの、あるいは花王
（株）の微生物保存室に保有の菌株を下記の組成を有す
る寒天平板培地に塗布し、３０℃で３〜５日間培養を行
った。菌が生育した後、１％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ溶液
（セチルトリメチルアンモニウムブロマイド）を流し込
み１０分間靜置した。ポリガラクツロン酸の分解に起因
してコロニーの周辺に溶解斑を形成した菌を選抜してペ
クチン酸リアーゼ生産能を検定した。その結果、ペクチ
ン酸リアーゼ生産菌としてバチルスエスピー ＫＳＭ−
Ｐ１５株を得た。
クリーニング 日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したもの、あるいは花王
（株）の微生物保存室に保有の菌株を下記の組成を有す
る寒天平板培地に塗布し、３０℃で３〜５日間培養を行
った。菌が生育した後、１％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ溶液
（セチルトリメチルアンモニウムブロマイド）を流し込
み１０分間靜置した。ポリガラクツロン酸の分解に起因
してコロニーの周辺に溶解斑を形成した菌を選抜してペ
クチン酸リアーゼ生産能を検定した。その結果、ペクチ
ン酸リアーゼ生産菌としてバチルスエスピー ＫＳＭ−
Ｐ１５株を得た。
【００４２】
【表４】 スクリーニング用寒天平板培地の組成 イーストナイトロジェンベース（Ｄｉｆｃｏ製） ０．１７ ％（ｗ／ｖ） 硫酸アンモニウム ０．２ リン酸１カリウム ０．３ リン酸２ナトリウム ０．６ 酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ製） ０．１ ポリガラクツロン酸（Ｓｉｇｍａ製） ０．５ 寒天 １．５ トリス−塩酸緩衝液（pH８） ０．１ Ｍ（別滅菌）
【００４３】実施例２：ＫＳＭ−Ｐ１５株の培養 上述のスクリーニングにより得られたバチルス エスピ
ー ＫＳＭ−Ｐ１５株の培養は、坂口フラスコに５０ml
の液体培地を加えて３０℃、２日間振盪培養を行った。
培地組成は、３％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．５％
酵母エキス、１％魚肉エキス、０．１５％リン酸２カリ
ウム、０．００１％塩化カルシウム、０．５％ペクチ
ン、０．５％炭酸ナトリウムとした。
ー ＫＳＭ−Ｐ１５株の培養は、坂口フラスコに５０ml
の液体培地を加えて３０℃、２日間振盪培養を行った。
培地組成は、３％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．５％
酵母エキス、１％魚肉エキス、０．１５％リン酸２カリ
ウム、０．００１％塩化カルシウム、０．５％ペクチ
ン、０．５％炭酸ナトリウムとした。
【００４４】実施例３：ＫＳＭ−Ｐ１５株由来アルカリ
ペクチン酸リアーゼの精製 バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ１５株の培養液を遠心
分離（１２，０００×ｇ、１５分）し、その上澄液（１
２５０ml）に硫酸アンモニウムを９０％飽和となるよう
に徐々に添加した。５℃で一昼夜放置した後、遠心分離
（１２，０００×ｇ、１５分）を行い沈殿物を回収し
た。これを少量の１mM塩化カルシウムを含む１０mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH７．０）に溶解し、同緩衝液に対し
て一昼夜透析を行った。得られた透析内液（９００ml）
のうち１００mlずつをあらかじめ１mM塩化カルシウムを
含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて平衡化
しておいたスーパーＱトヨパール６５０Ｍ（東ソー社
製）カラム（２．５×１０cm）へ添着した。平衡化緩衝
液にて洗浄溶出される画分に活性が認められ、これを集
めた（１１００ml）。次にＢｉｏ Ｃａｄ ６０ ＨＰ
ＬＣシステム（日本パーセプティブ社製）を用いて０．
２mM塩化カルシウムを含む２０mMトリス−塩酸緩衝液
（pH７．０）にて平衡化しておいたスルホプロピルカラ
ムへ上記の非吸着画分を２００mlずつ添着した。０から
０．２M の塩化ナトリウムを用いた濃度勾配溶出法によ
り、タンパク質を溶出させた。ペクチン酸リアーゼ活性
は０．１M 付近の塩化ナトリウム濃度で単一ピークとし
て溶出され、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法においても均一なタンパク質として検出された。上記
の操作を繰り返し、精製酵素を得た。活性収率は約６０
％であり、精製倍率は５０倍であった。得られた精製酵
素は前記の酵素学的性質を有していた。
ペクチン酸リアーゼの精製 バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ１５株の培養液を遠心
分離（１２，０００×ｇ、１５分）し、その上澄液（１
２５０ml）に硫酸アンモニウムを９０％飽和となるよう
に徐々に添加した。５℃で一昼夜放置した後、遠心分離
（１２，０００×ｇ、１５分）を行い沈殿物を回収し
た。これを少量の１mM塩化カルシウムを含む１０mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH７．０）に溶解し、同緩衝液に対し
て一昼夜透析を行った。得られた透析内液（９００ml）
のうち１００mlずつをあらかじめ１mM塩化カルシウムを
含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて平衡化
しておいたスーパーＱトヨパール６５０Ｍ（東ソー社
製）カラム（２．５×１０cm）へ添着した。平衡化緩衝
液にて洗浄溶出される画分に活性が認められ、これを集
めた（１１００ml）。次にＢｉｏ Ｃａｄ ６０ ＨＰ
ＬＣシステム（日本パーセプティブ社製）を用いて０．
２mM塩化カルシウムを含む２０mMトリス−塩酸緩衝液
（pH７．０）にて平衡化しておいたスルホプロピルカラ
ムへ上記の非吸着画分を２００mlずつ添着した。０から
０．２M の塩化ナトリウムを用いた濃度勾配溶出法によ
り、タンパク質を溶出させた。ペクチン酸リアーゼ活性
は０．１M 付近の塩化ナトリウム濃度で単一ピークとし
て溶出され、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法においても均一なタンパク質として検出された。上記
の操作を繰り返し、精製酵素を得た。活性収率は約６０
％であり、精製倍率は５０倍であった。得られた精製酵
素は前記の酵素学的性質を有していた。
【００４５】実施例４：プロトペクチンに対する作用
（市販木綿糸からのペクチン遊離量） 市販木綿糸４０mg（カネボウ社製カタン糸３０番手）に
１．９mlの５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）を加
え、精製アルカリペクチン酸リアーゼ（実施例３）を
０．１ml（０．２４U）添加し、３０℃、１時間反応さ
せた。反応後、糸を取去り氷冷した後、遠心分離（３０
００rpm、５分間）を行った。得られた上清液中に含ま
れる遊離のペクチン量をカルバゾール硫酸法（Sakai,
T., MethodsEnzymol., 161, 335-350, 1988）にて定量
した。ブランクは、酵素液の代わりに酵素希釈用緩衝液
（１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝
液、pH７．５）を０．１ml加えたものを用意し、上記と
同様の操作を行ったものとした。その結果、本酵素は、
木綿糸１ｇ当り約０．７８mgのペクチンを遊離した。
（市販木綿糸からのペクチン遊離量） 市販木綿糸４０mg（カネボウ社製カタン糸３０番手）に
１．９mlの５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）を加
え、精製アルカリペクチン酸リアーゼ（実施例３）を
０．１ml（０．２４U）添加し、３０℃、１時間反応さ
せた。反応後、糸を取去り氷冷した後、遠心分離（３０
００rpm、５分間）を行った。得られた上清液中に含ま
れる遊離のペクチン量をカルバゾール硫酸法（Sakai,
T., MethodsEnzymol., 161, 335-350, 1988）にて定量
した。ブランクは、酵素液の代わりに酵素希釈用緩衝液
（１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝
液、pH７．５）を０．１ml加えたものを用意し、上記と
同様の操作を行ったものとした。その結果、本酵素は、
木綿糸１ｇ当り約０．７８mgのペクチンを遊離した。
【００４６】
【発明の効果】本発明ペクチン酸リアーゼは、アルカリ
条件下で優れたペクチン酸リアーゼ活性を有し、衣料用
や食器用等の洗浄剤配合用酵素として、また繊維処理用
酵素として有用である。
条件下で優れたペクチン酸リアーゼ活性を有し、衣料用
や食器用等の洗浄剤配合用酵素として、また繊維処理用
酵素として有用である。
【図１】本発明アルカリペクチン酸リアーゼの反応に及
ぼすpHの影響を示す図である。
ぼすpHの影響を示す図である。
【図２】本発明アルカリペクチン酸リアーゼの安定性に
及ぼすpHの影響を示す図である。
及ぼすpHの影響を示す図である。
【図３】本発明アルカリペクチン酸リアーゼの反応に及
ぼす温度の影響を示す図である。
ぼす温度の影響を示す図である。
【図４】本発明アルカリペクチン酸リアーゼの安定性に
及ぼす温度の影響を示す図である。
及ぼす温度の影響を示す図である。
【図５】本発明アルカリペクチン酸リアーゼの基質特異
性を示す図である。
性を示す図である。
【図６】本発明アルカリペクチン酸リアーゼのポリガラ
クツロン酸に対する分解様式を示す図である。
クツロン酸に対する分解様式を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 凉松 淳 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 小林 徹 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 伊藤 進 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内
Claims (5)
- 【請求項１】 下記の酵素学的性質を有するアルカリペ
クチン酸リアーゼ。 （１）作用 ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応に よってエンド的にα−１，４結合を切断すると共に非 還元末端のＣ４−Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和ジ ガラクツロニド、あるいは不飽和オリゴガラクツロニ ドを生成する。 （２）基質特異性 プロトペクチン、ペクチン酸（ポリガラクツロン酸） 、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作用する。 （３）最適反応pH pH１０．３〜１０．７（５０mMグリシン−水酸化ナト リウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合） （４）安定pH pH５〜１１．５（３０℃、４０mMブリットン・ロビン ソン広域緩衝液中６０分間処理） （５）分子量 約２０〜２１ｋＤａ（超遠心平衡沈降法；ＳＤＳポリ アクリルアミド電気泳動法では約２６ｋＤａ） - 【請求項２】 下記の酵素学的性質を有するものである
請求項１記載のアルカリペクチン酸リアーゼ。 （１）作用 ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応に よってエンド的にα−１，４結合を切断すると共に非 還元末端のＣ４−Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和ジ ガラクツロニド、あるいは不飽和オリゴガラクツロニ ドを生成する。 （２）基質特異性 プロトペクチン、ペクチン酸（ポリガラクツロン酸） 、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作用する。 （３）最適反応pH pH１０．３〜１０．７（５０mMグリシン−水酸化ナト リウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合） （４）安定pH pH５〜１１．５（３０℃、４０mMブリットン・ロビン ソン広域緩衝液中６０分間処理） （５）最適反応温度 ５０〜５５℃（pH１０．５、５０mMグリシン−水酸化 ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合） （６）耐熱性 約５０℃（pH７．５、５０mMトリス−塩酸緩衝液中、 ３０分間処理） （７）分子量 約２０〜２１ｋＤａ（超遠心平衡沈降法；ＳＤＳポリ アクリルアミド電気泳動法では約２６ｋＤａ） （８）等電点 pH１０．３付近（等電点電気泳動法） （９）阻害剤 エチレンジアミンテトラアセテート等のキレート剤に よって阻害される。 （１０）金属イオン 反応にＣａ2+を必要とする。 - 【請求項３】 アルカリペクチン酸リアーゼ生産菌を培
養し、培養物からアルカリペクチン酸リアーゼを採取す
ることを特徴とする請求項１又は２記載のアルカリペク
チン酸リアーゼの製造法。 - 【請求項４】 アルカリペクチン酸リアーゼ生産菌が、
バチルス属に属するものである請求項３記載の製造法。 - 【請求項５】 アルカリペクチン酸リアーゼ生産菌が、
バチルス・エスピーＫＳＭ−Ｐ１５（ＦＥＲＭ Ｐ−１
５９８７）である請求項３記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24273497A JP3917258B2 (ja) | 1997-04-09 | 1997-09-08 | 新規アルカリペクチン酸リアーゼ及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9-91142 | 1997-04-09 | ||
| JP9114297 | 1997-04-09 | ||
| JP24273497A JP3917258B2 (ja) | 1997-04-09 | 1997-09-08 | 新規アルカリペクチン酸リアーゼ及びその製造法 |
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| Publication Number | Publication Date |
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| JPH10337181A true JPH10337181A (ja) | 1998-12-22 |
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ID=37401099
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
| EP (2) | EP0870834B1 (ja) |
| JP (2) | JP3917258B2 (ja) |
| DE (2) | DE69824778D1 (ja) |
| DK (2) | DK0870834T3 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003529623A (ja) * | 1999-01-14 | 2003-10-07 | ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー | ペクチン酸リアーゼおよびブリーチ系を含有した洗剤組成物 |
| JP2007043921A (ja) * | 2005-08-08 | 2007-02-22 | Saitama Prefecture | 大腸菌群の汚染源特定方法及びその検出に使用する大腸菌群検出用培地 |
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