JPH1033904A - 超微粒子の凝集分離方法およびその再生分散方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 媒体中に浮遊分散する単分散性の超微粒子
（末端官能性オリゴマーを導入してなるグラフト化超微
粒子を含む）を効率よく分離することができる方法を提
供する。 【解決手段】 カルボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯＮ
ａ）を有する超微粒子が添加され浮遊分散されてなる水
系分散媒体中に水溶性多価金属塩を、［Ｍⁿ⁺］／［−Ｃ
ＯＯＮａ］（モル比）＝０．１〜１００００（ただし、
Ｍは多価金属であり、ｎは２〜４の整数である）の範囲
で添加し、反応系のｐＨを５〜１３に調製し、反応系内
の温度を０〜９０℃の範囲に保持して、該超微粒子のカ
ルボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯＮａ）間を多価金属で
架橋して該超微粒子の凝集体を形成するとを特徴とする
超微粒子の分離精製方法による。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、超微粒子の凝集分
離方法およびその再生分散方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】本発明者等は、機械的強度、化学的安定
性、ｐＨの広領域での適用のできる高吸着容量の吸着体
とすることのできる有効な表面官能基を高濃度に持つポ
リアクリルアミド系超微粒子を特開平７−１７９５０４
号公報において開示している。さらに、該ポリアクリル
アミド系超微粒子に該末端官能性オリゴマーを導入して
なるグラフト化超微粒子を特願平７−８９５６２号およ
び特願平８−１６２２０４号に提案している。

【０００３】上記ポリアクリルアミド系超微粒子では、
これを支持体とし、さらに必要に応じてスペーサを導入
したものに、特定リガンドを固定化した超微粒子（親和
性吸着体）をアフィニティクロマトグラフィー等のアフ
ィニティ技術に利用する場合、単分散性の親和性吸着体
に固定化された特定リガンドを血液または血漿（媒体）
に混合することで、血液（血漿）中の目的物を特異的に
吸着させることができる。しかしながら、用いる超微粒
子は、その比重が極めて小さいため、目的物を吸着して
も分散した状態で浮遊している。そのため、その後に目
的物を分離精製するためには該媒体中より目的物を吸着
した親和性吸着体を分離する必要があるが、単に静置す
るだけでは親和性吸着体と媒体との比重差が小さく該親
和性吸着体を完全に沈降分離することはできない。

【０００４】こうした超微粒子からなる該親和性吸着体
を分離する方法としては、カラムクロマトグラフィーに
よる分離精製方法が可能であるが、この場合には一回の
クロマト操作にも極めて長時間を要し、精製を終えるま
でには極めて長い時間を要するため、工業化を図る上
で、その管理などが難しく実用的でない。また、遠心分
離法により該親和性吸着体を分離する場合には、該親和
性吸着体と媒体との密度差が小さく、１万Ｇ以上の回転
数を加えても分離が容易でなく、大きな遠心力を加える
ため血球成分を含む溶液では溶血現象を起こすため血漿
を用いる必要があるが、それでも１万Ｇ以上の回転数を
精製を終えるまでに何度も加えることにより吸着した目
的物が損傷を受けたり、親和性吸着体から脱離するなど
の問題があり、現在までに超微粒子（親和性吸着体）を
簡便な方法を用いて効率的に分離することはできていな
いのが現状である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、媒体中に浮遊分散する単分散性の超微粒子（末
端官能性オリゴマーを導入してなるグラフト化超微粒子
を含む）を効率よく凝集分離することができる方法を提
供するものである。

【０００６】さらに、本発明の他の目的は、上記分離し
た超微粒子凝集体を再生分散することができる方法を提
供するものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的を
達成するために、単分散性の超微粒子（末端官能性オリ
ゴマーを導入してなるグラフト化超微粒子を含む）の簡
便な凝集分離方法について鋭意研究した結果、単分散性
の超微粒子は、その表面上に極めて多くの官能基として
の側鎖（スペーサを導入してなる側鎖を含む）を有して
いるため、リガンドを固定化し（さらに目的物を吸着
し）た超微粒子（以下、親和性吸着体ともいう）であっ
ても、なお側鎖が残っており、これをカルボン酸ナトリ
ウム基（−ＣＯＯＮａ）に置換した後に多価金属塩を添
加し、特定の条件下（温度、ｐＨなど）におくことによ
り、図１ないし図２に示すように、該多価金属が超微粒
子のカルボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯＮａ）間を架橋
して超微粒子凝集体を形成することにより、個々の超微
粒子に比して該凝集体の比重が激増し、水系分散媒体
（血液や血漿）と大きなな比重差を生じさせることがで
きることを見出だし、これにより短時間放置ないし緩や
かな遠心分離によって簡単に該超微粒子を凝集分離する
ことができることを知り、この知見に基づき本発明を完
成するに至ったものである。

【０００８】さらに、本発明者等は、こうした超微粒子
凝集体をバイオアフィニテー技術に利用して目的物を分
離精製した後の該凝集体は、そのままでは水系媒体中に
浮遊分散しないため、これを再度目的物の吸着などに使
用することができず、１回きりの使い捨てとなるため経
済的でないとした上記発明に特有な新たな課題を見出だ
し、この点についても鋭意検討した結果、超微粒子凝集
体を特定の条件下で酸処理することにより、図３に示す
ように、該多価金属がはずれてカルボキシル基を有する
単分散性の超微粒子として再生分散し得ることを知り、
この知見に基づきさらなる発明を完成するに至ったもの
である。

【０００９】すなわち、本発明の目的は、（１） カル
ボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯＮａ）を有する超微粒子
が添加され浮遊分散されてなる水系分散媒体中に水溶性
多価金属塩を［Ｍⁿ⁺］／［−ＣＯＯＮａ］（モル比）＝
０．１〜１００００（ただし、Ｍは多価金属であり、ｎ
は２〜４の整数である）の範囲で添加し、反応系のｐＨ
を５〜１３に調製し、反応系内の温度を０〜９０℃の範
囲に保持することを特徴とする超微粒子凝集体形成によ
る凝集分離方法により達成される。

【００１０】また、本発明の目的は、（２） 前記カル
ボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯＮａ）を有する超微粒子
が、さらに固定化された特定リガンドを有することを特
徴とする上記（１）に示す凝集分離方法によっても達成
される。

【００１１】なお、本発明の他の目的は、（３） 上記
（１）または（２）で形成された超微粒子凝集体が添加
されてなるｐＨ１〜１０の水系分散媒体中に、酸を添加
して系内を酸性域として、温度０〜９０℃の範囲に保持
することを特徴とする超微粒子凝集体の再生分散方法に
より達成される。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明を実施の形態に基づ
き、より詳細に説明する。

【００１３】まず、本発明に係る超微粒子の凝集分離方
法の一つの実施の形態（手段）は、カルボン酸ナトリウ
ム基（−ＣＯＯＮａ）を有する単分散性の超微粒子が添
加され浮遊分散されてなる水系分散媒体中に水溶性多価
金属塩を、［Ｍⁿ⁺］／［−ＣＯＯＮａ］（モル比）＝
０．１〜１００００（ただし、Ｍは多価金属であり、ｎ
は２〜４の整数である）の範囲で添加し、反応系のｐＨ
を５〜１３に調製し、反応系内の温度を０〜９０℃の範
囲に保持することを特徴とするものである。これによ
り、該超微粒子のカルボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯＮ
ａ）間を多価金属で架橋して該超微粒子凝集体を速やか
に形成でき、さらに、こうして超微粒子を凝集させるこ
とで分散媒体との比重差を生み、これによって沈降分離
や緩やかな遠心分離により容易に分離することができる
ものである。

【００１４】上記超微粒子の凝集分離方法に用いること
のできる超微粒子としては、例えば、本発明者らが既に
開示ないし提案した特開平７−１７９５０４号公報、特
願平７−８９５６２号および特願平８−１６２２０４号
に記載されているポリアクリルアミド系超微粒子ないし
該超微粒子に末端官能性オリゴマーを導入してなるグラ
フト化超微粒子を用いることができる。該超微粒子を製
造する方法に関しても上記公報等に開示ないし提案され
ている手段を利用することにより得ることができる。こ
れにより、親水性かつ化学的に不活性で、活性化可能な
官能基を（スペーサのようなオリゴマーの側鎖を介し
て）高濃度に有し、機械的強度および化学的安定性に優
れ、ｐＨの広領域での適用のでき、疎で強固な多孔性の
構造を持つ球状ゲルで、サイズが均一で高吸着容量の親
和性吸着体とすることができる強固な単分散の超微粒子
を得ることができる。

【００１５】より具体的に説明すれば、上記超微粒子を
製造する方法としては、アルコール類の有機溶媒中にエ
チレン系不飽和アミドを含む単量体混合物と、前記単量
体混合物と架橋剤との混合物を１００重量％とした場
合、前記架橋剤を２５〜５０重量％の範囲で溶解させた
混合溶液を温度３０〜９５℃に保持し、過酸化物系開始
剤およびアゾ系開始剤よりなる群から選ばれた少なくと
も１種の開始剤を１×１０^-5〜８×１０^-2モル／リット
ルとなる範囲で添加して重合を行なうことを特徴とする
ものであればよい。また、上記超微粒子の製造方法とし
て好ましくは、分散剤を添加することなく重合を行なう
ことを特徴とするものである。さらに、上記超微粒子の
製造方法として好ましくは、前記有機溶媒に水を、全溶
媒１００重量％に対して３０重量％以下の範囲となるよ
うに添加してなることを特徴とするものである。

【００１６】さらに、グラフト化超微粒子の製造方法と
しては、溶媒中に表面官能基を有する粒径０．０５〜
０．５μｍのポリアクリルアミド系超微粒子および末端
官能性オリゴマーを添加し、混合撹拌して該ポリアクリ
ルアミド系超微粒子を分散させると共に末端官能性オリ
ゴマーを溶解させ、その後に該溶媒中に縮合剤を添加
し反応温度０〜５０℃として（低温法）、あるいはそ
の後に反応温度５０〜１００℃として（高温法）グラフ
ト化反応させることにより、該ポリアクリルアミド系超
微粒子に該末端官能性オリゴマーを導入することを特徴
とするものである。ここで、前記表面官能基は、アミド
基、カルボキシル基およびアミノ基のよりなる群から選
ばれてなる少なくとも１種であることが望ましく、また
前記末端官能性オリゴマーが、Ｈ₂ Ｎ（ＣＨ₂ ）_n ＣＯ
ＯＨ、Ｈ₂ Ｎ（ＣＨ₂ ）_n ＮＨ₂ 、Ｈ₂ Ｎ（ＣＨ₂ ）_n
ＳＨおよびＨ₂ Ｎ（ＣＨ₂ ）_n ＯＨ、ＨＯＯＣ（Ｃ
Ｈ₂ ）_nＣＯＯＨ（式中のｎは７以下の整数である）の
いずれか１種であることが望ましく、さらに、前記ポリ
アクリルアミド系超微粒子が温度０〜４０℃で、比重
０．３〜１．２であることがより望ましいものである。

【００１７】また、上記超微粒子としては、上述の超微
粒子の製造方法によって得られた超微粒子であって、該
超微粒子の吸湿率が１０〜４００％であり、ゲル化率が
４０〜９８％であることを特徴とするものであればよ
い。また、上記超微粒子として好ましくは、前記超微粒
子の粒子径が０．０５〜０．５μｍの範囲であることを
特徴とするものである。

【００１８】さらに、グラフト化超微粒子としては、上
記製法によって得られたグラフト化超微粒子であって、
該グラフト化超微粒子１ｇ当たりの官能基濃度が０．０
０１ｍｇ当量以上であることを特徴とするものであれば
よく、主として該超微粒子の表面に末端官能性オリゴマ
ーが導入されていることがより好ましいものである。

【００１９】なお、カルボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯ
Ｎａ）を有する超微粒子は、上記超微粒子の表面アミド
基をｐＨ１０．５以上のアルカリ状態を保つように、例
えば、Ｎａ₂ ＣＯ₃ を濃度０．０１〜２モル／ｌ、温度
１０〜９０℃で１〜７時間反応させることにより、カル
ボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯＮａ）へ交換した超微粒
子（以下、マトリックスないし単にＣＭとも記す）とす
ることができる。なお、グラフト化超微粒子は、カルボ
ン酸ナトリウム基（−ＣＯＯＮａ）へ交換したマトリッ
クスに、末端官能性オリゴマーであるスペーサ（以下、
単にＳとも記す）がグラフト化反応により導入されたマ
トリックス（以下、単にＣＭ−Ｓとも記す）であり、カ
ルボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯＮａ）を有する超微粒
子の１種であるといえる。

【００２０】また、本発明の凝集分離方法に用いられる
水系分散媒体としては、水またはアルコール類の有機媒
体等を用いることができる。このうちアルコール類の有
機媒体としては、例えば、メタノール、エタノール、プ
ロパノール、イソプロパノール、１−ブタノール、２−
ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノー
ル、２−ペンタノール、３−ペンタノール、ｔ−ペンチ
ルアルコール、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、
３−ヘキサノールなどの１価アルコール、エチレングリ
コール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコー
ル、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、
１，３−ブチレングリコール、ネオペンチルグリコー
ル、ペンタメチレングリコール、ヘキサメチレングリコ
ールなどの２価アルコール、グリセロールなどの３価ア
ルコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、エ
チレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコ
ールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノイソ
ブチルエーテルなど炭素数１〜６のアルコール類のほ
か、分子量６０００以下、好ましくは４０００以下のポ
リエチレングリコールなどが挙げられる。これらの分散
媒体は、単独で用いることもできるが、２種以上を混合
して用いることも可能である。

【００２１】さらに上記水系分散媒体には、例えば、ポ
リビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビ
ニルアルコール、ポリビニルカルバゾール等の有機高分
子系の分散媒体を用いてもよい。

【００２２】また、上記水系分散媒体に対する上記超微
粒子の添加量としては、特に制限されるものでないが、
水系分散媒体１００ｍｌに対し通常１０ｍｇ〜５０ｇ、
好ましくは３０ｍｇ〜３０ｇ、より好ましくは５０ｍｇ
〜１０ｇの範囲である。上記超微粒子の添加量が、１０
ｍｇ未満の場合には、表面官能基が濃度が低いため、リ
ガンドとの結合量も少なくなり、目的物を効率よく吸着
できず、また５０ｇを越える場合には、粒子濃度が高く
なりすぎ、分散状態が不安定となるので好ましくない。

【００２３】さらに、本発明に用いられる水溶性多価金
属塩中の多価金属の種類としては、例えば、カルシウ
ム、マグネシウムなどの２価のアルカリ土類金属、銅、
アルミニウム、鉄などの２〜４価の遷移金属が挙げられ
るが、バイオアフィニテーに利用する場合には、生体毒
性のないカルシウムおよびマグネシウムなどの２価のア
ルカリ土類金属が好ましい。また、多価金属塩として
は、多価金属の塩化物、硫化物、炭酸化合物、水酸化化
合物、およびそれらの錯塩（錯合体）などを挙げること
ができる。

【００２４】該多価金属の添加量としては、［Ｍⁿ⁺］／
［−ＣＯＯＮａ］（モル比）＝０．１〜１００００、好
ましくは０．５〜７０００、より好ましくは１．０〜５
０００（ただし、Ｍは多価金属であり、ｎは２〜４の整
数である）の範囲である。該添加量が［Ｍⁿ⁺］／［−Ｃ
ＯＯＮａ］（モル比）＜０．１となる場合には、多価金
属が不足するため、超微粒子の凝集化が不十分で、沈降
せずになお浮遊分散した状態の超微粒子が多く残るな
ど、分離が十分に行えないため好ましくなく、［Ｍⁿ⁺］
／［−ＣＯＯＮａ］（モル比）＞１００００となる場合
には、架橋により超微粒子の凝集体が形成し完全に沈降
分離することができるが、添加によるさらなる作用・効
果は発現できず、過剰な多価金属が媒体中に残されるこ
とになるだけで経済的でない。

【００２５】また、上記実施の形態においては、上記水
系分散媒体中に水溶性多価金属塩を添加し、反応系のｐ
Ｈを通常５〜１３、好ましくは６〜１２、より好ましく
は６．５〜１１に調製し、反応系の温度を０〜９０℃、
好ましくは４〜７０℃、より好ましくは１０〜５０℃の
範囲に保持することにより、図１に示すように、超微粒
子表面の側鎖のカルボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯＮ
ａ）間に多価金属イオン（Ｍⁿ⁺）が結合架橋して超微粒
子凝集体を形成し、３時間程度で該超微粒子凝集体を容
易に沈降させることができるものである。なお、上記反
応系のｐＨが５未満の場合は、多価金属イオンによる架
橋反応が起こりにくく、またリガンドが生体由来物であ
る場合は、変性などによりその機能の発現ができなくな
り、ｐＨが１３を越える場合は、多価金属イオンによる
架橋反応が同様に起こりにくく、リガンドが生体由来の
化合物である場合は、その変性により機能を発現するこ
とができない。このｐＨの調製には、例えば、塩酸、硫
酸、燐酸等の無機塩およびそのアルカリ塩、酢酸、マレ
イン酸、クエン酸、アスコルビン酸等の有機酸およびそ
のアルカリ塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水
酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウムなど
を用いることができる。また、上記反応系の温度が０℃
未満の場合には、架橋・凝集反応しにくくなるほか、場
合によっては水系分散媒体が凝固するおそれがあるなど
好ましくない。また９０℃を越える場合には、導入スペ
ーサの分解が起こる可能性があり好ましくない。

【００２６】次に、本発明に係る超微粒子の凝集分離方
法の他の一つの実施の形態（手段）としては、カルボン
酸ナトリウム基（−ＣＯＯＮａ）を有する超微粒子が添
加され浮遊分散されてなるｐＨ５〜１３の水系分散媒体
中に水溶性多価金属塩を、［Ｍⁿ⁺］／［−ＣＯＯＮａ］
（モル比）＝０．１〜１００００（ただし、Ｍは多価金
属であり、ｎは２〜４の整数である）の範囲で添加し、
温度を０〜９０℃の範囲に保持して０〜９０℃の範囲に
保持して、該超微粒子のカルボン酸ナトリウム基（−Ｃ
ＯＯＮａ）間を多価金属で架橋して該超微粒子の凝集体
を形成してなる上記実施の形態において、図２に示すよ
うに、前記超微粒子が、さらに特定リガンドが固定化さ
れてなる超微粒子（親和性吸着体）であることを特徴と
するものである。

【００２７】まず、本実施の形態において、超微粒子に
固定化される特定リガンドとしては、特に制限されるも
のでなく、例えば、Ｌ−フェニルアラニン、チロキシ
ン、トリヨードチロニン、Ｌ−トリプトファン、Ｄ−ト
リプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−リジン、ε−アミノ
カプロイル−Ｄ−トリプトファンメチルエステルなどの
アミノ酸リガンド；Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ（Ｂｚｌ）
−Ａｒｇなどのペプチドリガンド；抗ＢＳＡ、抗ヒトＩ
ｇＧ、カゼイン、コンカナパリンＡ、小麦胚レクチン、
大豆レクチン、大豆アグルチチニン、小麦胚アグルチニ
ン、フコース結合タンパク質、大豆トリプシン阻害剤、
リマ豆トリプシン阻害剤、ヘモグロビン、トリプシン阻
害剤、プロテインＡなどのタンパク質リガンド；、ヘキ
サン−アデノシン（Ｃ⁵ で結合）、ヘキサン−アデノシ
ン５′−リン酸（Ｎ⁵ で結合）、ヘキサン−アデノシン
５′−リン酸（Ｃ⁸ で結合）、ヘキサン−アデノシン
５′−リン酸（リボースで結合）、ヘキサン−アデノシ
ン３′，５′−環状リン酸（Ｃ⁸ で結合）、ヘキサン−
アデノシン５′−二リン酸（リボースで結合）、ヘキサ
ン−アデノシン２′，５′−二リン酸（Ｎ⁶ で結合）、
ヘキサン−アデノシン３′，５′−二リン酸（Ｎ⁶ で結
合）、ヘキサン−アデノシン５′−三リン酸（リボース
で結合）、ヘキサン−アデノシン５′−三リン酸（Ｎ⁶
で結合）、ヘキサン−グアノシン５′−三リン酸（リボ
ースで結合）、ヘキサン−ウリジン５′−二リン酸（リ
ボースで結合）、ヘキサン−ウリジン５′−三リン酸
（リボースで結合）、５′−アデニル酸（５′−リン酸
で結合）、５′−ＧＭＰ（５′−リン酸で結合）、５′
−ＵＭＰ（５′−リン酸で結合）、５′−（４−アミノ
フェニルホスホリルウリジン）−２′（３′）−リン酸
などのヌクレオシドまたはヌクレオチドリガンド；ポリ
リボアデニル酸、ポリリボグアニル酸、ポリリボイノシ
ン酸、ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸、ポリ
リボシチジル酸、ポリウリジル酸、オリゴ（ｄＴ）、ポ
リウリジン酸などのポリヌクレオチドリガンド；デオキ
シリボ核酸（ＤＮＡ）、ＤＮＡ（未変性ＤＮＡ）、ＤＮ
Ａ（変性ＤＮＡ）などの核酸リガンド；、ヘキサン−コ
エンチームＡ（Ｔｙｐｅ−１）、ヘキサン−ＣｏＡ（Ｔ
ｙｐｅ−５）、ヘキサン−ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（ＮＡＤ）（Ｔｙｐｅ−１）、ヘキサン−Ｎ
ＡＤ（Ｔｙｐｅ−３）、ヘキサン−ＮＡＤ（Ｔｙｐｅ−
４）、ヘキサン−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸（ＮＡＤＰ）などの補酵素リガンド；ｐ−アミ
ノフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｐ−アミノ
フェニル−α−Ｄ−マンノシド、ｐ−アミノフェニル−
β−Ｄ−チオガラクトシド、ε−アミノカプロイル−フ
コサミンなどの糖リガンド；システアミン、ヘキサン−
チオールなどのチオール化合物リガンド、ｐ−アミノフ
ェニルメルクリアセテート、ジニトロフェノール、アル
サニル酸、メチル化アルブミン、ＲＰＣ−５、ＲＰＣ−
６、ｍ−アミノベンジルオキシメチル、ブロモアセチ
ル、３−アミノベンゼンホウ酸、４−アミノベンズアミ
ジン、ＢＤ、Ｂｌｕｅなどの特異的吸着体リガンド、ア
ルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デ
ヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアル
デヒドデヒドロゲナーゼ、チトクロム、カタラーゼ、ペ
ルオキシダーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸キナー
ゼ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、リパーゼ、コリ
ンエステラーゼ、フィシン、アルカリ性ホスファター
ゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、α
−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ノ
イラミニダーゼ、グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチ
ターゼ、プロリダーゼ、キモトリプシン、トリプシン、
プロナーゼ、プロテアーゼ、スプチロペプチダーゼＡ、
スプチロペプチダーゼＢ、スプチリシン、パパイン、プ
ロテイナーゼ、プロメリン、ペプシン、ウレアーゼ、ア
ミノアシラーゼ、アスパラギナーゼ、アルドラーゼ、グ
ルコースリン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３
−リン酸デヒドロゲナーゼと３−ホスホグリセリン酸ホ
スホキナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼと
トリホスフェートイソメラーゼ、クレアチンリン酸キナ
ーゼ、ヘキソキナーゼとグルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼと３−ホスホグリセリン酸ホスホキナーゼ、ヘ
キソキナーゼとグルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ、アンヒドロトリプシンおよびアンヒドロトロンビン
などを挙げることができる。また、該特定リガンドの固
定化の方法としては、特に制限されるものでなく、従来
公知の固定化技術を適宜利用することができる。たとえ
ば、アンヒドロトロンビンを固定する場合には、本発明
者らが既に開示した特開平７−１７９５０４号公報ある
いは特願平７−８９５６２号および特願平８−１６２２
０４号に記載されているポリアクリルアミド系超微粒子
あるいはポリアクリルアミド系超微粒子に末端官能性オ
リゴマーを導入してなるグラフト化超微粒子をもとにし
て特定リガンドの固定化に適当な官能基としてカルボキ
シレート、アミノ酸を高濃度に置換導入し固定化するこ
とができる。

【００２８】上記実施の形態における固定化したリガン
ドの適正ｐＨは、通常５〜１４、好ましくは６〜１２、
より好ましくは７〜１０の範囲である。すなわち、例え
ば、アンヒドロトロンビンなどでは、中性から弱アルカ
リ性範囲であれば、安定な活性部位として目的物である
アンチトロンビンIII （ＡＴIII)を特異的に吸着し得る
ものである。一方、アンヒドロトリプシンなどでは、一
般にｐＨ３〜７の酸性範囲で安定な活性部位として目的
物であるアルギニン系ペプチドを特異的に吸着し得るも
のであるが、一旦吸着してしまえば、その後、系内を上
記リガンドの適正範囲内、特にアルカリ性領域内に変え
て架橋、凝集反応を行った場合であっても、リガンドで
あるペプシンに吸着した目的物は安定に保持される。

【００２９】次に、本発明に係る超微粒子の再生分散方
法の一つの実施の形態（手段）としては、上述した超微
粒子の凝集分離方法により形成された超微粒子凝集体が
添加されてなるｐＨ１〜１０の水系分散媒体中に、酸を
添加して系内を酸性域として、温度０〜９０℃の範囲に
保持することを特徴とするものである。これにより、図
３に示すように、該超微粒子（親和性吸着体）凝集体の
架橋構造部位に供されている多価金属をはずしてカルボ
キシル基（−ＣＯＯＨ）を有する単分散性の超微粒子と
することを特徴とするものである。

【００３０】上記超微粒子の再生分散方法に用いられる
超微粒子凝集体には、通常、リガンドが固定化された単
分散性の超微粒子（親和性吸着体）を使用して目的物を
特異的に吸着した後、該吸着体を上述した超微粒子の凝
集分離方法により凝集体を形成させて沈降などによって
凝集分離した後、吸着した目的物を分離精製した後の該
凝集体などを用いることができるが、本発明の再生分散
方法に用いられる凝集体は、これらに限定されるもので
なく、上記超微粒子の凝集分離方法を適用し得るあらゆ
る分離技術（手段）に用いられた凝集体を用いることが
できる。

【００３１】また、超微粒子の再生分散方法に用いられ
る水系分散媒体としては、水またはアルコール類の有機
媒体等を用いることができる。このうちアルコール類の
有機媒体としては、例えば、メタノール、エタノール、
プロパノール、イソプロパノール、１−ブタノール、２
−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノー
ル、２−ペンタノール、３−ペンタノール、ｔ−ペンチ
ルアルコール、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、
３−ヘキサノールなどの１価アルコール、エチレングリ
コール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコー
ル、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、
１，３−ブチレングリコール、ネオペンチルグリコー
ル、ペンタメチレングリコール、ヘキサメチレングリコ
ールなどの２価アルコール、グリセロールなどの３価ア
ルコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、エ
チレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコ
ールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノイソ
ブチルエーテルなど炭素数１〜６のアルコール類のほ
か、分子量６０００以下、好ましくは４０００以下のポ
リエチレングリコールなどが挙げられる。これらの分散
媒体は、単独で用いることもできるが、２種以上を混合
して用いることも可能である。

【００３２】さらに上記水系分散媒体には、例えば、ポ
リビニルピロリドン、ポリエチレングチコール、ポリビ
ニリアルコール、ポリビニルカルバゾールなどの有機高
分子系の分散媒体を用いてもよい。

【００３３】上記再生分散方法における水系分散媒体の
ｐＨは、通常１〜１０、好ましくは１．５〜５の範囲に
調製したものである。該ｐＨが上記範囲をはずれる場合
には、凝集した粒子の再分離を行うことができないため
好ましくない。

【００３４】上記再生分散方法において、添加される酸
としては、例えば、塩酸、硫酸、燐酸などの無機塩およ
び酢酸、マレイン酸、クエン酸、アスコルビン酸などの
有機酸などを用いることができる。これらの酸を添加す
ることにより、系内を酸性域、好ましくはｐＨ１．５〜
５とすることが望ましい。

【００３５】上記再生分散方法における反応系の温度
は、通常０〜９０℃、好ましくは４〜７０℃、より好ま
しくは１０〜５０℃の範囲である。該温度が０℃未満の
場合には、水系分散媒体が凝固するおそれがあり好まし
くない。また９０℃を越える場合には、導入スペーサお
よびリガンドの分解や変性が起こる可能性があり好まし
くない。

【００３６】上記再生分散方法においては、上記条件
（構成要件）下におくことで、図３に示すように多価金
属で架橋された凝集体の当該多価金属がはずれて、単分
散性の超微粒子を再生し得るものである。これにより、
再度、水系媒体中に浮遊分離しさせることができるた
め、目的物の吸着などに再利用することができ、経済性
に優れる。

【００３７】

【実施例】以下、本発明の実施例について述べる。

【００３８】実施例１ 窒素雰囲気下で、エタノール１０００ｍｌにアクリルア
ミド２５ｇ、架橋剤であるＮ，Ｎ′−メチレンビスアク
リルアミド２０．５ｇ（単量体混合物と架橋剤との混合
物を１００重量％として、架橋剤４５．１重量％）を撹
拌しながら溶解させ、同時に溶存酸素を十分取り除い
た。続いて温度７０℃で開始剤として２，２′−アゾビ
スイソブチルニトリル０．８２１ｇ（開始剤濃度５×１
０^-3モル／リットル）を添加し、ｐＨ６．５として３時
間重合を行ない、反応終了後、氷浴で重合容器ごと急冷
し、ラジカル重合を停止させ、単分散球形の超微粒子を
得た。

【００３９】次に、生成したポリアクリルアミド系超微
粒子を遠心分離機で分別し、上澄み液を取り除いた。こ
こに新たにエタノール１０００ｍｌを加え、１時間激し
く撹拌し、その後遠心分離機で分別した。同様の操作を
３回行ない、ガラスフィルターで濾過後、５０℃、減圧
下で真空乾燥した。

【００４０】得られた超微粒子を、溶媒として精製水を
用いて５重量％ポリマー溶媒とし、これに沈殿剤として
２０倍量のアセトンを加え、良く撹拌しながら再沈殿さ
せた。その後、遠心分離機で分別し、上澄み液を取り除
いた。同様の操作を２回行ない、ガラスフィルターで濾
過後、５０℃、減圧下で真空乾燥し精製を終了した。

【００４１】上記超微粒子の表面アミド基をｐＨ１０．
５以上のアルカリ状態を保つように、Ｎａ₂ ＣＯ₃ 濃度
０．０４モル／ｌ、６０℃で３時間反応させ、カルボキ
シル基へ交換したマトリックス（以下、単にＣＭとも記
す）として２．０ｇを精製水１２０ｍｌを加え、２４時
間撹拌し、十分に分散させた。導入する末端官能性オリ
ゴマーをスペーサ（以下、単にＳとも記す）としてエチ
レンジアミンを０．５４ｍｌ（０．０１モル）を溶媒と
して精製水２５ｍｌで希釈したものを反応フラスコに入
れ、１０％ＨＣｌ７ｍｌでｐＨ４．５〜５．５に調整
し、マトリックスおよびスペーサが完全に分散、溶解す
るまで撹拌を行った。

【００４２】次に縮合剤としてＣＭＣ１．６１０ｇ（縮
合剤濃度０．０２５Ｍ）を反応フラスコに加え、この時
を反応開始時刻として引き続き２３℃（室温）で撹拌を
行い、４８時間で反応を終了した。

【００４３】次に分離精製工程として反応終了後のスペ
ーサがグラフト導入されたマトリックス（以下、単にＣ
Ｍ−Ｓとも記す）を遠心分離機で１４５００ｒｐｍで１
５分間の条件で分別し、上澄液を取り除いた。ここに新
たに精製水１００ｍｌを加え、５０℃で２時間、２００
ｒｐｍで撹拌を行い、遠心分離機で１４５００ｒｐｍで
２０分間遠心分離を行った。同様の操作を５回行った
後、凍結乾燥を行い精製を終了し、本実施例に用いる超
微粒子を得た。

【００４４】上記ＣＭ−Ｓを下記表１に示す条件下で超
微粒子凝集体とした。すなわち、超微粒子３０ｍｇを水
系分散媒体である精製水中に添加して該超微粒子濃度を
３０ｍｇ／１００ｍｌに調製した。これに、多価金属塩
として塩化カルシウムを、［Ｃａ²⁺］／［−ＣＯＯＮ
ａ］（モル比）＝１０となるように添加し、さらに反応
系のｐＨを０．０１Ｎの水酸化ナトリウムを用いて８．
５に調製し、反応系の温度を２０℃に保持することによ
り、該超微粒子のカルボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯＮ
ａ）を多価金属で架橋して該超微粒子の凝集体を形成す
ることができ、反応開始後３時間以内に該凝集体を自然
放置により簡単に沈降でき、これにより容易に分離でき
ることを確認した。

【００４５】次に、上記超微粒子の凝集体を下記表１に
示す条件下で再生分散した。すなわち、上記凝集体が添
加されているｐＨ７．５の水系分散媒体である精製水中
に、酸として塩酸を添加して反応系のｐＨを３．０と酸
性域にして、温度２０℃に保持することにより、３時間
以内に該凝集体の多価金属であるＣａをはずしてカルボ
ンキシル基（−ＣＯＯＨ）を有する単分散性の超微粒子
を再生することができることを確認した。

【００４６】実施例２ 実施例１において、表１に示すように、多価金属塩とし
て、塩化カルシウムの代わりに塩化マグネシウムを用い
た以外は、実施例１と同様にして凝集体を沈降・分離し
得ることを確認した。

【００４７】また、本実施例２により得られた凝集体を
表１に示すように酸として塩酸の代わりに硫酸を用いた
以外は、実施例１と同様にして当該凝集体を再生分散で
きることを確認した。

【００４８】実施例３ 実施例１において、表１に示すように、超微粒子濃度を
３０ｍｇ／１００ｍｌに調製する代わりに４０ｍｇ／１
００ｍｌに調製し、塩化カルシウムを［Ｃａ²⁺］／［−
ＣＯＯＮａ］（モル比）＝１０とする代わりに１００と
なるように添加し、さらに反応系のｐＨを８．５に代え
て９．０とした以外は、実施例１と同様にして凝集体を
沈降・分離し得ることを確認した。

【００４９】また、本実施例３により得られた凝集体を
表１に示すように実施例１と同様にして当該凝集体を再
生分散できることを確認した。

【００５０】実施例４ 実施例１において、表１に示すように、スペーサとして
エチレンジアミンに代えて１，３−プロパンジアミンを
用い、超微粒子濃度を３０ｍｇ／１００ｍｌとする代わ
りに４０ｍｇ／１００ｍｌとし、塩化カルシウムを［Ｃ
ａ²⁺］／［−ＣＯＯＮａ］（モル比）＝１０とする代わ
りに１０００となるように添加し、反応系のｐＨを８．
５に代えて９．０とし、さらに反応系の温度を２０℃に
代えて３０℃とした以外は、実施例１と同様にして凝集
体を沈降・分離し得ることを確認した。

【００５１】また、本実施例４により得られた凝集体を
表１に示すように、反応系のｐＨを３．０に代えて３．
５とし、さらに反応系の温度を２０℃に代えて３０℃と
した以外は、実施例１と同様にして当該凝集体を再生分
散できることを確認した。

【００５２】実施例５ 実施例１において、表１に示すように、スペーサとして
エチレンジアミンに代えて１，３−プロパンジアミンを
用い、超微粒子濃度を３０ｍｇ／１００ｍｌとする代わ
りに５０ｍｇ／１００ｍｌとし、多価金属塩として、塩
化カルシウムの代わりに塩化銅（II）を用い、さらに反
応系の温度を２０℃に代えて３０℃とした以外は、実施
例１と同様にして凝集体を沈降・分離し得ることを確認
した。

【００５３】また、本実施例５により得られた凝集体を
表１に示すように、酸として塩酸の代わりに硫酸を用い
た以外は、実施例１と同様にして凝集体を再生分散でき
ることを確認した。

【００５４】実施例６ 実施例１において、表１に示すように、スペーサとして
エチレンジアミンに代えてヘキサメチレンジアミンと
し、超微粒子濃度を３０ｍｇ／１００ｍｌとする代わり
に５０ｍｇ／１００ｍｌとし、さらに反応系の温度を２
０℃に代えて３０℃とした以外は、実施例１と同様にし
て凝集体を沈降・分離し得ることを確認した。

【００５５】また、本実施例６により得られた凝集体を
表１に示すように実施例１と同様にして当該凝集体を再
生分散できることを確認した。

【００５６】実施例７ 実施例１において、表１に示すように、スペーサとして
エチレンジアミンが導入されたマトリックス（ＣＭ−
Ｓ）超微粒子に代えてスペーサ未導入のマトリックス
（ＣＭ）超微粒子を用いた以外は、実施例１と同様にし
て凝集体を沈降・分離し得ることを確認した。

【００５７】また、本実施例７により得られた凝集体を
表１に示すように、反応ｐＨを３．０に代えて３．５と
し、さらに反応系の温度を２０℃に代えて３０℃とした
以外は、実施例１と同様にして当該凝集体を再生分散で
きることを確認した。

【００５８】実施例８ 実施例１において、表１に示すように、スペーサとして
エチレンジアミンが導入されたマトリックス（ＣＭ−
Ｓ）超微粒子に代えてスペーサ未導入のマトリックス
（ＣＭ）超微粒子を用い、塩化カルシウムを［Ｃａ²⁺］
／［−ＣＯＯＮａ］（モル比）＝１０とする代わりに３
０となるように添加し、反応系のｐＨを８．５に代えて
９．０とし、さらに反応系の温度を２０℃に代えて３０
℃とした以外は、実施例１と同様にして凝集体を沈降・
分離し得ることを確認した。

【００５９】また、本実施例８により得られた凝集体を
表１に示すように、実施例１と同様にして当該凝集体を
再生分散できることを確認した。

【００６０】実施例９ 実施例１において、表１に示すように、スペーサとして
エチレンジアミンが導入されたマトリックス（ＣＭ−
Ｓ）超微粒子に代えてスペーサ未導入のマトリックス
（ＣＭ）超微粒子を用い、超微粒子濃度を３０ｍｇ／１
００ｍｌとする代わりに５０ｍｇ／１００ｍｌとし、多
価金属塩として、塩化カルシウムの代わりに塩化マグネ
シウムを用い、塩化カルシウムを［Ｃａ²⁺］／［−ＣＯ
ＯＮａ］（モル比）＝１０とする代わりに塩化マグネシ
ウムを［Ｍｇ²⁺］／［−ＣＯＯＮａ］（モル比）＝３０
となるように添加し、反応系のｐＨを８．５に代えて
９．０とし、さらに反応系の温度を２０℃に代えて３０
℃とした以外は、実施例１と同様にして凝集体を沈降・
分離し得ることを確認した。

【００６１】また、本実施例９により得られた凝集体を
表１に示すように、反応ｐＨを３．０に代えて２．０と
した以外は、実施例１と同様にして当該凝集体を再生分
散できることを確認した。

【００６２】比較例１ 実施例１において、表１に示すように、反応系のｐＨを
８．５に代えて３．０とした以外は、実施例１と同様に
したが、２４時間を経過しても超微粒子は凝集せず、こ
れらを沈降・分離することはできないことが確認でき
た。

【００６３】比較例２ 実施例１において、表１に示すように、スペーサとして
エチレンジアミンに代えて１，３−プロパンジアミンを
用い、超微粒子濃度を３０ｍｇ／１００ｍｌとする代わ
りに４０ｍｇ／１００ｍｌとし、多価金属塩として、塩
化カルシウムの代わりに塩化マグネシウムを用い、塩化
カルシウムを［Ｃａ²⁺］／［−ＣＯＯＮａ］（モル比）
＝１０とする代わりに塩化マグネシウムを［Ｍｇ²⁺］／
［−ＣＯＯＮａ］（モル比）＝１．５となるように添加
し、反応系のｐＨを８．５に代えて４．０とし、さらに
反応系の温度を２０℃に代えて３０℃とした以外は、実
施例１と同様にしたが、２４時間を経過しても超微粒子
は凝集せず、これらを沈降・分離することはできないこ
とが確認できた。

【００６４】比較例３ 実施例１において、表１に示すように、スペーサとして
エチレンジアミンが導入されたマトリックス（ＣＭ−
Ｓ）超微粒子に代えてスペーサ未導入のマトリックス
（ＣＭ）超微粒子を用い、超微粒子濃度を３０ｍｇ／１
００ｍｌとする代わりに５０ｍｇ／１００ｍｌとし、塩
化カルシウムを［Ｃａ²⁺］／［−ＣＯＯＮａ］（モル
比）＝１０とする代わりに０．１となるように添加し、
さらに反応系のｐＨを８．５に代えて４．０とした以外
は、実施例１と同様にしたが、２４時間を経過しても超
微粒子は凝集せず、これらを沈降・分離することはでき
ないことが確認できた。

【００６５】

【表１】

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明に係る超微粒子の分離精製方法の一つ
の実施の形態（手段）として、超微粒子のカルボン酸ナ
トリウム基（−ＣＯＯＮａ）間を多価金属で架橋して、
該超微粒子が凝集体を形成する様子をモデル化した反応
概略図である。

【図２】 本発明に係る超微粒子の分離精製方法の他の
一つの実施の形態（手段）として、特定リガンドが固定
化されてなる親和性吸着体のカルボン酸ナトリウム基
（−ＣＯＯＮａ）間を多価金属で架橋して該親和性吸着
体が凝集体を形成する様子をモデル化した反応概略図で
ある。

【図３】 本発明に係る超微粒子の再生分散方法の一つ
の実施の形態（手段）として、親和性吸着体の凝集体
が、酸性下で該親和性吸着体の凝集体の多価金属がはず
れてカルボンキシル基（−ＣＯＯＨ）を有する単分散性
の超微粒子を形成する様子をモデル化した反応概略図で
ある。

【符号の説明】

１…超微粒子（マトリックス基材）、 ２…リガンド（Ｌ）、 Ｍ…多価金属。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 永田 政令 東京都中央区日本橋馬喰町１丁目４番16号 藤森工業株式会社研究開発本部内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カルボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯＮ
   ａ）を有する超微粒子が添加され浮遊分散されてなる水
   系分散媒体中に水溶性多価金属塩を［Ｍⁿ⁺］／［−ＣＯ
   ＯＮａ］（モル比）＝０．１〜１００００（ただし、Ｍ
   は多価金属であり、ｎは２〜４の整数である）の範囲で
   添加し、反応系のｐＨを５〜１３に調製し、反応系内の
   温度を０〜９０℃の範囲に保持することを特徴とする超
   微粒子凝集体形成による凝集分離方法。
2. 【請求項２】 前記カルボン酸ナトリウム基（−ＣＯＯ
   Ｎａ）を有する超微粒子が、さらに固定化された特定リ
   ガンドを有することを特徴とする請求項１に記載の凝集
   分離方法。
3. 【請求項３】 請求項１または２で形成された超微粒子
   凝集体が添加されてなるｐＨ１〜１０の水系分散媒体中
   に、酸を添加して系内を酸性域として、温度０〜９０℃
   の範囲に保持することを特徴とする超微粒子凝集体の再
   生分散方法。