JPH1048217A - プロテインキナーゼのリン酸化酵素活性の測定法及び測定キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 各種のプロテインキナーゼのリン酸化酵素活
性を感度よく且つ簡易に測定できる測定法及び測定キッ
トを提供すること。 【解決手段】 本発明のプロテインキナーゼのリン酸化
酵素活性の測定法は、（ａ）〜（ｃ）の工程を含む。即
ち、（ａ）プロテインキナーゼによりリン酸化されうる
基質ペプチドを標識物質により標識化した標識基質ペプ
チドと、前記プロテインキナーゼとを液相で反応させ
て、リン酸化標識基質ペプチドとする工程。（ｂ）リン
酸化基質ペプチド（基質ペプチドのアミノ酸配列のうち
所定のアミノ酸がリン酸化されたもの）と特異的に結合
する抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体
と、前記（ａ）で得られたリン酸化標識基質ペプチドと
を反応させて、両者を結合させる工程。（ｃ）前記
（ｂ）で得られた固相化抗体とリン酸化標識基質ペプチ
ドとの結合物の標識量を測定する工程。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、プロテインキナー
ゼのリン酸化酵素活性の測定法及び測定キットに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】多細胞生物であれ、単細胞生物であれ、
すべての細胞は外部からの必要な情報を取り込み応答す
る。多細胞生物ではそれぞれの細胞が適切な情報を取り
込み適切な応答を行うがゆえに、発生という過程を通じ
て極めて複雑な個体が作られ、その恒常性が維持されて
いる。細胞外からの情報は、他の細胞が分泌する液性の
因子や細胞同士の接触を介してやり取りされるが、これ
らの情報は細胞が持つ受容体で感知され、そのシグナル
は細胞の中で複雑な経路を伝わり遺伝子の発現を伴って
種々の応答を引き起こす。増殖や分化の開始は最も著し
い細胞応答である。このように細胞外の情報が細胞膜を
通って細胞内へ伝達され、さらに細胞核に伝えられる過
程を細胞内情報伝達と呼び、その過程には多くの蛋白質
のリン酸化カスケードが関与していることが知られてい
る。

【０００３】細胞内蛋白質のリン酸化は、蛋白質リン酸
化酵素（プロテインキナーゼ）によって行われ、このよ
うなプロテインキナーゼとしては、プロテインキナーゼ
Ｃ（ＰＫＣ）、サイクリックＡＭＰ依存性プロテインキ
ナーゼ（ＰＫＡ）、ＰＩ３キナーゼ、ｃｄｃ２キナー
ゼ、ｒａｆ−１キナーゼ等が知られているが、これらプ
ロテインキナーゼは細胞内の情報伝達を介して細胞の増
殖と分化の調節に関わっており、プロテインキナーゼ及
び細胞情報伝達に関与する分子の発現異常は癌や糖尿病
等の疾患として表現される。従ってこれらプロテインキ
ナーゼや細胞内情報伝達に関与する分子の機能異常の検
出は細胞増殖や細胞分化、ひいては癌などの疾患の解明
に不可欠である。プロテインキナーゼの機能異常の検出
の手段としては、プロテインキナーゼの酵素活性の測定
が行われるが、測定方法としては放射免疫測定法（ＲＩ
Ａ）や酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が知られていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、従来行われて
いたこれらの方法のうち、ＲＩＡ法では放射性物質を取
り扱うための施設が必要となるため、簡易に測定するこ
とが難しかった。また、ＥＬＩＳＡ法では、リン酸化の
対象となる基質ペプチドを固相に結合させ、試料中のプ
ロテインキナーゼによって基質ペプチドをリン酸化した
後、標識化抗体（リン酸化基質ペプチドに対する抗体を
標識化したもの）と反応させ、この反応物の標識量を検
出することによりリン酸化酵素活性の程度を検出してい
たが、この方法では固相に結合する基質ペプチドの量が
限られているため、プロテインキナーゼとの反応効率が
よくなく、十分リン酸化が行われないことがあった。即
ち、測定対象として、ＰＫＣやＰＫＡなど比較的Ｋｍ値
（ミカエリス常数）が大きく、高い感度を必要としない
ものはこのような方法でもリン酸化が十分進行するため
リン酸化酵素活性の測定が可能であるが、ｃｄｃ２キナ
ーゼやｒａｆ−１キナーゼのようにＫｍ値がそれほど大
きくないものは、固相に結合したリン酸化基質ぺプチド
を用いる方法ではリン酸化が十分進行せず感度よく測定
することは不可能であった。

【０００５】このため、Ｋｍ値の大きなプロテインキナ
ーゼのみならず、ｃｄｃ２キナーゼのようなＫｍ値がそ
れほど大きくないプロテインキナーゼであっても、リン
酸化酵素活性を測定することのできる方法、即ち、各種
のプロテインキナーゼのリン酸化酵素活性を測定しうる
方法の確立が望まれていた。

【０００６】本発明は上記課題に鑑みなされたものであ
って、各種のプロテインキナーゼのリン酸化酵素活性を
感度よく且つ簡易に測定できる測定法及び測定キットを
提供するものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の第１であるプロ
テインキナーゼのリン酸化酵素活性の測定法は、下記
（ａ）〜（ｃ）の工程を含むことを特徴とする。即ち、 （ａ） プロテインキナーゼによりリン酸化されうる基
質ペプチドを標識物質により標識化した標識基質ペプチ
ドと、前記プロテインキナーゼとを液相で反応させて、
リン酸化標識基質ペプチドとする工程。 （ｂ） リン酸化基質ペプチド（基質ペプチドのアミノ
酸配列のうち所定のアミノ酸がリン酸化されたもの）と
特異的に結合する抗体を不溶性支持体に結合せしめてな
る固相化抗体と、前記（ａ）で得られたリン酸化標識基
質ペプチドとを反応させて、両者を結合させる工程。 （ｃ） 前記（ｂ）で得られた固相化抗体とリン酸化標
識基質ペプチドとの結合物の標識量を測定する工程。

【０００８】本発明の第２であるプロテインキナーゼの
リン酸化酵素活性の測定キットは、プロテインキナーゼ
によりリン酸化されうる基質ペプチドを標識物質により
標識化した標識基質ペプチドと、リン酸化基質ペプチド
（基質ペプチドのアミノ酸配列のうち所定のアミノ酸が
リン酸化されたもの）と特異的に結合する抗体を不溶性
支持体に結合せしめてなる固相化抗体とを備えたことを
特徴とする。

【０００９】本発明は、これまでリン酸化酵素活性を測
定するのが困難であったＫｍ値のそれほど大きくないｃ
ｄｃ２キナーゼ等にとって特に有用である。即ち、前記
プロテインキナーゼがｃｄｃ２キナーゼであり、前記基
質ペプチドがマウスビメンチンの合成ペプチドであるＭ
Ｖ５５ペプチド（配列表の配列番号１で表されるペプチ
ド）であり、前記リン酸化基質ペプチドがリン酸化ＭＶ
５５ペプチド（配列表の配列番号１で表されるペプチド
のアミノ酸番号６のセリンがリン酸化されたもの）であ
り、前記抗体が抗リン酸化ＭＶ５５ペプチド抗体（例え
ば、融合細胞クローン４Ａ４（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ
−１５７５９）により産生されたモノクローナル抗体）
であっても、リン酸化酵素活性を感度よく測定できる。

【００１０】また、標識物質としては、例えば、ビオチ
ン、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ア
ルカリフォスファターゼ及びマイクロペルオキシダーゼ
からなる群から選ばれた一つを用いることができる。
尚、測定キットは、標識基質ペプチド、固相化抗体の他
に、例えば、標識物質の標識量を測定するための基質や
発色剤等を備えていたり、検量線を求める際に用いるプ
ロテインキナーゼ標準物質（精製品）を備えていたりし
てもよい。

【００１１】

【発明の実施の形態】従来のように、基質ペプチドを不
溶性支持体に結合させ、これとプロテインキナーゼとを
反応させてリン酸化基質ペプチドとし、このリン酸化基
質ペプチドと特異的に結合する標識化抗体を反応させて
その標識量を測定するという測定系では、リン酸化が固
−液反応であるため反応効率がよくなかった。このた
め、この測定法は、比較的Ｋｍ値が大きく、高い感度を
必要としないプロテインキナーゼ（例えばＰＫＣやＰＫ
Ａなど）には適用できるものの、ｃｄｃ２キナーゼやｒ
ａｆ−１キナーゼのようにＫｍ値がそれほど大きくな
く、基質ペプチドを効率よくリン酸化できないものには
適用が難しかった。今回、基質ペプチドのリン酸化を液
相で行うようにしたためＫｍ値がそれほど大きくないｃ
ｄｃ２キナーゼ等であっても、リン酸化が効率よく進行
し、高感度なリン酸化酵素活性の測定を実現した。

【００１２】［基質ペプチドについて］プロテインキナ
ーゼのリン酸化酵素活性は、リン酸化された基質ペプチ
ドを検出することによって測定する。プロテインキナー
ゼによってリン酸化される基質ペプチドとしては、例え
ば、プロテインキナーゼがｃｄｃ２キナーゼの場合には
ＭＶ５５ペプチド（配列表の配列番号１のペプチド、こ
の場合アミノ酸番号６のセリンがリン酸化される）、ｒ
ａｆ−１キナーゼの場合にはＭＥＫ−１ペプチド（配列
表の配列番号２のペプチド、この場合アミノ酸番号６及
び１０のセリンがリン酸化される）、ＰＫＣあるいはＰ
ＫＡの場合にはＰＳペプチド（配列表の配列番号３のペ
プチド、この場合アミノ酸番号７のセリンがリン酸化さ
れる）を用いることが好ましい。このような基質ペプチ
ドは、例えば全自動合成装置を用いて合成できる。

【００１３】［標識物質について］標識物質としては、
通常の免疫学的測定方法に使用し得るものであれば特に
限定されことなく使用でき、例えば、酵素、ビオチン、
蛍光物質、発光物質及び放射性物質等を使用することが
でき、このうち簡易に測定できる観点から、酵素、ビオ
チンが好ましい。酵素としては、ペルオキシダーゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、
マイクロペルオキシダーゼが挙げられ、蛍光物質として
はフルオレッセインイソチオシアネート、フィコビリプ
ロテイン、フィコエリスリン等が挙げられ、発光物質と
してはイソルシノール、ルシゲニン等、そして放射性物
質としては¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、¹⁴Ｃ、³Ｈ 等が挙げられる。
また、標識物質としてビオチンを用いた場合にはさらに
酵素標識アビジンを用いることにより標識ビオチンの量
を高い感度で測定できるので、好ましい。酵素標識アビ
ジンの酵素としては、抗体に標識した場合の酵素と同様
の酵素を用いることができるが、ペルオキシダーゼが好
ましい。

【００１４】［抗リン酸化基質ペプチド抗体について］
リン酸化基質ペプチドと特異的に結合する抗体は、以下
のＡ．〜Ｆ．のようにして得ることができる。 Ａ．抗原 抗原としてはリン酸化基質ペプチド（例えば、プロテイ
ンキナーゼがｃｄｃ２キナーゼの場合にはリン酸化ＭＶ
５５ペプチド（配列番号１で表されるペプチドのアミノ
酸番号６のセリンがリン酸化されたもの）、プロテイン
キナーゼがｒａｆ−１キナーゼの場合にはリン酸化ＭＥ
Ｋ−１ペプチド（配列番号２で表されるペプチドのアミ
ノ酸番号６及び１０のセリンがリン酸化されたもの）、
プロテインキナーゼがＰＫＣまたはＰＫＡの場合にはリ
ン酸化ＰＳペプチド（配列番号３で表されるペプチドの
アミノ酸番号７のセリンがリン酸化されたもの））を合
成し、免疫原として使用する。当該ペプチドは比較的低
分子であり、このものをそのまま免疫しても抗体ができ
にくいため、通常、ＫＬＨ（スカシガイヘモシアニン）
やアルブミンのようなキャリアー蛋白質と結合させるこ
とにより免疫原として使用することが好ましい。

【００１５】Ｂ．上記抗原による免疫 免疫動物としては哺乳動物であるマウスのほかラット、
ハムスターなども用いることができる。通常マウスが最
も汎用され、ＢＡＬＢ／ｃマウス、その他の系（ｓｔｒ
ａｉｎ）のマウスを用いることができる。この際、免疫
計画及び抗原の濃度は十分な量の抗原刺激を受けたリン
パ球が形成されるよう選ばれるべきである。例えばマウ
ス１匹に２５μｇの抗原を２週間間隔で腹腔に３回免疫
後、さらに２５μｇを静脈に投与する。最終免疫の数日
後に融合のための脾臓細胞を取り出す。

【００１６】Ｃ．細胞融合 上記のごとく免疫した哺乳動物の個体から脾臓を無菌的
に取り出し、そこから単細胞懸濁液を調製する。この脾
臓細胞（抗体産生細胞）を適当な骨髄腫細胞と適当な融
合促進剤の使用により細胞融合させる。骨髄腫細胞とし
ては免疫動物と同種の哺乳動物に由来するものが望まし
いが、ラット、ハムスター等の脾臓細胞とマウスの骨髄
腫細胞を融合させることもできる。脾臓細胞と骨髄腫細
胞の好ましい比率は約２０：１〜約２：１の範囲であ
る。約１０⁸ 個の脾細胞について０．５〜１．５ｍｌの
融合媒体の使用が適当である。好ましい融合促進剤とし
ては、例えば平均分子量１０００〜４０００のポリエチ
レングリコールを有利に使用できるが、この分野で知ら
れている他の融合促進剤（例えばセンダイウイルス（別
名ＨＶＪ））を用いることもできる。また、これら融合
促進剤を用いた方法以外に電気ショックを用いる方法に
より細胞融合を行ってもよい。

【００１７】Ｄ．目的とするモノクローナル抗体を産生
する融合細胞の選択 別の容器（例えばマイクロタイタープレート）で未融合
の脾細胞、未融合の骨髄腫細胞及び融合した融合細胞の
混合物を未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択培地で希
釈し、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間（約１
時間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−アザグ
アニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しないもの
（例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジンを含む培地））が使用される。この選択培
地中では未融合の骨髄腫細胞は死滅する。また、未融合
の脾細胞は非腫瘍性細胞なので、ある一定期間（例えば
１週間）後に死滅する。これに対して融合した細胞は、
骨髄腫の親細胞の腫瘍性と親脾細胞の性質を合わせ持つ
ため、選択培地中で生存できる。

【００１８】かくして、融合細胞が検出された後、前記
のリン酸化基質ペプチドに対する抗体について酵素免疫
測定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay )によりス
クリーニングを行い、リン酸化基質ペプチドと特異的に
結合するモノクローナル抗体を産生する融合細胞だけを
選択する。例えば、抗リン酸化ＭＶ５５ペプチド抗体を
産生する融合細胞としてはクローン４Ａ４（受託番号：
ＦＥＲＭ Ｐ−１５７５９）、抗リン酸化ＭＥＫ−１ペ
プチド抗体を産生する融合細胞としてはクローン１Ｅ９
（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５９９３）及びクローン
２Ｆ１１（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５９９４）、抗
リン酸化ＰＳペプチド抗体を産生する融合細胞としては
クローン２Ｂ９（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５１３
３）及びクローン２Ｇ３（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１
５１３４）が挙げられる。

【００１９】Ｆ．目的とするモノクローナル抗体の取得 目的とするモノクローナル抗体を産生する融合細胞を適
当な方法（例えば限界希釈法）でクローン化した後、抗
体は２つの異なった方法で産生することができる。その
第１の方法によれば、融合細胞を一定期間、適当な培地
で培養することにより、その培養上清からその融合細胞
の産生するモノクローナル抗体を得ることができる。第
２の方法によれば、融合細胞は同質遺伝子、または半同
質遺伝子を持つ免疫動物の腹腔に注射することができ
る。一定時間後の宿主動物の血液中および腹水中より、
その融合細胞の産生するモノクローナル抗体を得ること
ができる。

【００２０】［固相化抗体］固相化抗体は、抗リン酸化
基質ペプチド抗体を不溶性支持体に結合させたものであ
る。かかる固相化抗体は、例えば、この抗体の溶液と不
溶性支持体を接触さて不溶性支持体の表面にこの抗体を
吸着させることにより得られるほか、共有結合等の化学
的な方法によって結合させることにより得ることもでき
る。なお、抗リン酸化基質ペプチド抗体は、完全抗体で
あってもよく、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）’₂等のフラグ
メントであってもよい。

【００２１】不溶性担体としては、例えばポリスチレ
ン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポ
リアクリルニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、
ポリサッカライドなどの高分子、その他紙、ガラス、金
属、アガロースおよびこれらの組み合わせなどを例示す
ることができる。また、不溶性担体の形状としては、ト
レイ状、球状、棒状、繊維状、盤状、容器状、セル、試
験管など種々の形状であることができる。

【００２２】［測定について］酵素を標識物質として用
いた場合にはその活性を測定するために基質、必要によ
り発色剤が用いられる。酵素としてペルオキシダーゼを
用いる場合には、基質としてＨ₂Ｏ₂を用い、発色剤とし
て２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリ
ンスルホン酸］アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、５−アミ
ノサリチル酸、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、４
−アミノアンチピリン、３，３’，５，５’−テトラメ
チルベンジジン等、酵素にアルカリフォスファターゼを
用いる場合は基質としてｏ−ニトロフェニルフォスフェ
ート等、酵素にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合
は基質としてフルオロセイン−ジ−（β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド）、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド等を用いることができる。

【００２３】

【実施例】以下に、本発明の好適な実施例を説明する。
尚、本発明の実施の形態は、下記の実施例に何ら限定さ
れるものではなく、本発明の技術的範囲に属する限り種
々の形態を採り得ることはいうまでもない。

【００２４】［実施例１］ 免疫原の作製 リン酸化ＭＶ５５ペプチド（配列表の配列番号１で表さ
れるペプチドのアミノ酸番号６のセリンがリン酸化され
たもの）はミリポア社製９０５０全自動合成装置を用い
て、装置の使用説明書に従いＦｍｏｃ法を用いた固相法
により作製した（合成法の詳細は秀潤社刊、細胞工学別
冊「抗ペプチド抗体実験プロトコール」参照）。Ｃ末端
にはキャリアー蛋白と結合させるためのシステイン残基
を導入した。合成したリン酸化ペプチドは開裂しトリフ
ルオロ酢酸で保護基を除いた後、以下の条件で逆相高速
液体クロマトグラフィーを行い精製した。 使用カラム：μBondasphere 5-μm C18 100A（3.9×1
50mm） 溶出条件：０．１％トリニトロ酢酸（アセトニトリル６
〜６０％直線グラジェント）

【００２５】リン酸化ＭＶ５５ペプチドはＭＢＳ法によ
りスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合させ免疫原
とした。即ち、４ｍｇのＫＬＨを０．２５ｍｌの１０ｍ
Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．２）に溶解し、この溶液
に２０μｌのジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）に溶解
した０．７ｍｇの３−マレイミドベンゾイックアシド−
Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ＭＢＳ）を加
え、室温で３０分間反応させた。反応後、セファデック
スＧ２５を充填したカラム（１．５×１０ｃｍ）を用い
てゲルろ過を行い、ＫＬＨ−ＭＢ複合体と遊離のＫＬＨ
を分離し、ＫＬＨ−ＭＢ複合体を集めた。そして、リン
酸化ＭＶ５５ペプチド５ｍｇを１ｍｌの０．１Ｍホウ酸
バッファー（ｐＨ９．０）に溶解し、この液とＫＬＨ−
ＭＢ複合体溶液を混合し、ｐＨを７．０〜７．５に調製
して室温で３時間放置して反応させた。反応後、ＰＢＳ
（生理的リン酸緩衝液）に十分透析した後、ＰＢＳで
０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、１００μｌずつ分注
して−２０℃に凍結して保存した。

【００２６】［実施例２］ マウスの免疫 実施例１で凍結保存した免疫原（リン酸化ＭＶ５５ペプ
チド−ＫＬＨ）１００μｌと完全フロインドアジュバン
ト１００μｌとをよく混合して懸濁液を作製し、この懸
濁液をＢＤＦ１マウスの腹腔内に１匹当り抗原として２
５μｇずつ投与した。２週間後に再度同量の抗原を投与
し、その３日後に脾臓を取り出し、以下に示すように細
胞融合を行った。

【００２７】［実施例３］ 細胞融合及び目的とするモ
ノクローナル抗体を産生する融合細胞の選択と取得 摘出したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞
（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）とを約１０：１の割合で混合
し、５０％ポリエチレングリコール４０００を融合促進
剤として細胞融合を行った。融合後の細胞は１×１０⁶
ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞濃度となるように１０％ウシ血
清を含むＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジンを含む培地）に懸濁し、９６ウエルのマイ
クロタイタープレート（ヌンク社製マキシソープ、以下
同じ）に１ウエルあたり１００μｌずつ分注した。

【００２８】融合細胞はＣＯ₂ インキュベータ（５％Ｃ
Ｏ₂ 、３７℃）中で培養し、ＨＡＴ培地で培地交換を行
い増殖させて、脾臓細胞と骨髄腫細胞からなる融合細胞
のスクリーニングを行った。ついでＨＴ培地中で馴化
し、さらに１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）−ＲＰＭＩ１
６４０培地で馴化した。

【００２９】融合細胞培養上清中の抗体は、リン酸化Ｍ
Ｖ５５ペプチドを感作したマイクロタイタープレートを
用いてＥＬＩＳＡ法により検出した。陽性となったウエ
ルに対しては、限界希釈法によるクローニングを２回繰
り返し、リン酸化ＭＶ５５ペプチドに対する反応性を有
するクローン１種類を選出し、融合細胞クローン４Ａ４
（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５７５９）と名付けた。こ
のクローンの細胞は１０％のＤＭＳＯを含む９０％ウシ
血清中に懸濁させ、液体窒素中に保存した。

【００３０】［実施例４］ モノクローナル抗体の採取 上記クローン４Ａ４の産生するモノクローナル抗体は、
クローンをＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内で増殖させ、そ
の腹水中からプロテイン−Ａセファロース４Ｂカラムを
用いてそれぞれを精製した。

【００３１】［実施例５］ 抗体の特異性の確認 実施例４で得たモノクローナル抗体につき、ＥＬＩＳＡ
法及びウエスターンブロット法によってリン酸化ＭＶ５
５ペプチドに対する反応性を確認した。 １）ＥＬＩＳＡ法による特異性の確認 ＭＶ５５ペプチドを結合したマイクロタイタープレート
及びリン酸化ＭＶ５５ペプチドを結合したマイクロタイ
タープレートのそれぞれに、実施例４で得たモノクロー
ナル抗体を加えて反応させた後、プレートを洗浄し、ペ
ルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（（株）医学生物学
研究所製）を反応させ、再度洗浄し、過酸化水素とオル
トフェニレンジアミンの溶液を基質として反応させ、基
質の吸光度を測定した。この結果、実施例４で得たモノ
クローナル抗体はリン酸化ＭＶ５５ペプチドとは反応し
たが、ＭＶ５５ペプチドとは反応しなかった。

【００３２】２）ウエスターンブロットによる特異性の
確認 ｃｄｃ２キナーゼ、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナー
ゼ、プロテインキナーゼＣ及びＣａ⁺⁺−カルモジュリン
依存性プロテインキナーゼIIの各プロテインキナーゼで
リン酸化したマウスビメンチン及び非リン酸化マウスビ
メンチンについてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行い、実施例４で得たモノクローナル抗体を用いて
ウエスターンブロットを行った。この結果、ｃｄｃ２キ
ナーゼでリン酸化されたマウスビメンチンのみが反応性
を示し、非リン酸化ビメンチン及び他のプロテインキナ
ーゼでリン酸化されたビメンチンは反応性を示さなかっ
た。

【００３３】３）インヒビションアッセイによる特異性
の確認 ｃｄｃ２キナーゼによってリン酸化されたマウスビメン
チン７５ｎｇをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
の各レーンに流し、ＰＢＳ、５０μｇ／ｍｌのリン酸化
ＭＶ５５ペプチド及び５０μｇ／ｍｌの非リン酸化ＭＶ
５５ペプチドで吸収した実施例４のモノクローナル抗体
（１μｇ／ｍｌ）を用いてウエスターンブロットを行っ
た。その結果、ＰＢＳ及び非リン酸化ＭＶ５５ペプチド
で吸収したモノクローナル抗体を用いた場合にビメンチ
ンのバンドが確認されたが、リン酸化ＭＶ５５ペプチド
で吸収した場合にはビメンチンのバンドは確認されなか
った。以上から、実施例４で得たクローン４Ａ４から産
生される抗体は、リン酸化ＭＶ５５ペプチドと特異的に
反応することが確認され、抗リン酸化ＭＶ５５ペプチド
抗体であることが確認された。尚、クローン４Ａ４から
産生される抗体の特異性は、ザ・ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（The Journal ofBiologic
al Chemistry）第269巻No.49pp.31097-31106(1994)に記
載されている。

【００３４】［実施例６］ 測定系の構築 実施例４で得たモノクローナル抗体を用いて検体中の蛋
白質リン酸化酵素の活性を測定する系を以下のように構
築した。

【００３５】［６−１］ 固相化抗体の作製 実施例４で得たモノクローナル抗体（抗リン酸化ＭＶ５
５ペプチド抗体）を０．１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．０で５
μｌ／ｍｌの濃度に調製し、ヌンク社製９６穴マイクロ
プレート「マキシソープ」の各ウエルに１００μｌずつ
加え、４℃で２０時間静置反応させた。抗体溶液を捨
て、１％ＢＳＡ、５％ショ糖を含むＰＢＳを各ウエルに
２００μｌずつ加え、室温（２０〜２５℃）で２時間静
置してブロッキングを行った。ブロッキング液を捨て、
プレートを風乾し、抗リン酸化ＭＶ５５ペプチド抗体を
不溶性支持体に結合せしめてなる固相化抗体（抗体感作
プレート）を得た。この固相化抗体は乾燥剤と共に密封
して保存した。

【００３６】［６−２］ ビオチン標識ＭＶ５５ペプチ
ドの作製 ＭＶ５５ペプチドは全自動合成装置を用いてＦｍｏｃ法
を用いた固相法により作製した（合成法の詳細は秀潤社
刊、細胞工学別冊「抗ペプチド抗体実験プロトコール」
参照）。このＭＶ５５ペプチドを０．１Ｍ炭酸バッファ
ーに透析して５ｍｇ／ｍｌの濃度に調製しスターラーで
ゆっくりと撹拌しながら、これに２５ｍｇ／ｍｌのＮＨ
Ｓ−ＬＣ−ＢＩＯＴＩＮ（ＰＩＥＲＣＥ社製）の０．１
Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ８．５）溶液をペプチドとビオ
チンのモル比が１：２０になるように加えた後、ＰＢＳ
に透析してビオチン標識ＭＶ５５ペプチドを作製した。

【００３７】［６−３］ 検体の調製 Ｍ期のＨｅｌａ細胞を０．０５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ
ＰＭＳＦ、５０μｇ／ｍｌのＬｅｕｐｅｐｔｉｎ、２ｍ
ｇ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、２５ｍＭβ−グリ
セロホスフェート、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、０．５ｍＭ ジチオスレイトール及び０．０１％の
ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテルを含む５
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で１０
⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調製し、超音波で破砕
して細胞抽出液とした。

【００３８】［６−４］ 測定 ２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、１００
ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍｇ／ｍｌのビオチン標識ＭＶ
５５ペプチド及び細胞抽出液の各６μｌと精製水３０μ
ｌを混合し、この混合液に１ｍＭ ＡＴＰ６μｌを加え
て３０℃で３０分間反応させた後、２０乃至１００ｍＭ
ＥＤＴＡ ６０μｌを加えて反応を停止した。この反
応液１００μｌを固相化抗体のウェルに添加し、２５℃
で６０分間反応させた後、０．０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ
７．２）で３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ストレプ
トアビジン（タゴ社、１／１００００希釈）１００μｌ
を添加して２５℃で６０分間反応させ、再度洗浄した後
オルトフェニレンジアミン発色基質（（株）医学生物学
研究所製）１００μｌを加え発色させ、０．１５Ｍ Ｈ
₃ＰＯ₄溶液１００μｌで反応を停止し、波長４９２ｎｍ
における吸光度を測定した。

【００３９】［６−５］ 従来法との比較 新規測定法の感度を確認するため、従来のＲＩＡ法及び
従来のＥＬＩＳＡ法による測定結果と比較した。

【００４０】［６−５−１］ 従来のＲＩＡ法 ２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、１００
ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍｇ／ｍｌのＭＶ５５ペプチド
及びｃｄｃ２キナーゼを含む試料溶液（上記［６−２］
で調製した検体）各５μｌと精製水２５μｌを混合し、
この混合液に１ｍＭγ−³²Ｐ−ＡＴＰ（５０万ｃｐｍ／
５μｌ）を加えて３０℃で３０分間反応させた後、５０
μｌの３００ｍＭ Ｈ₃ＰＯ₄ 溶液若しくは２０乃至１０
０ｍＭＥＤＴＡを加えて反応を停止した。反応液の５０
μｌをｐ−８１セルロース濾紙にスポットし、７５ｍＭ
Ｈ₃ＰＯ₄で３回洗浄した後、スポットの放射活性を測
定した。

【００４１】［６−５−２］従来のＥＬＩＳＡ法 ＭＶ５５ペプチドを生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶
解して１μｇ／ｍｌの溶液を調製した。この液１００μ
ｌを９６ウエルのマイクロタイタープレートの各ウエル
に添加し、４℃で１２時間〜１８時間静置反応させた
後、ペプチド溶液を除き、５％牛血清アルブミン、５％
シュクロース及び０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢ
Ｓ３５０μｌを加えて４℃で１２〜１８時間静置してマ
イクロタイタープレートの未反応部位をブロッキング
し、ブロッキング溶液を捨て、ＰＢＳで３回洗浄するこ
とにより、固相化ＭＶ５５ペプチドを得た。この固相化
ＭＶ５５ペプチドに上記［６−２］で調製した検体を添
加し、室温で５〜２０分間反応させ、２０％リン酸溶液
１００μｌを加えてリン酸化反応を停止し、ＰＢＳで５
回洗浄した（これにより、固相化ＭＶ５５ペプチドはリ
ン酸化される）。

【００４２】ビオチン標識モノクローナル抗体は次のよ
うにして作製した。即ち、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ
８．５）に溶解したモノクローナル抗体（クローン４Ａ
４から産生された抗体、５ｍｇ／ｍｌ）とＮＨＳ−ＬＣ
−ＢＩＯＴＩＮ（ＰＩＥＲＣＥ社製 ２５ｍｇ／ｍｌ）
をＩｇＧとＮＨＳ−ＬＣ−ＢＩＯＴＩＮのモル比が１：
６０になるように加え、室温で４時間スターラーを用い
て攪拌した。攪拌後、この溶液を生理的リン酸緩衝液
（ＰＢＳ）に透析し、ビオチン標識モノクローナル抗体
を得た。

【００４３】そして、上記のようにリン酸化された固相
化ＭＶ５５ペプチドにビオチン標識モノクローナル抗体
１００μｌを加え、室温で６０分間反応させ洗浄した
後、ストレプトアビジン−ＰＯＤ複合体溶液１００μｌ
を加えた。さらに室温で６０分間反応させた後、洗浄
し、オルトフェニレンジアミンと過酸化水素の混合溶液
１００μｌを加え、室温で３〜５分間反応させ、発色し
た後、２０％リン酸溶液１００μｌを加えて反応を停止
した。発色した溶液につき波長４９２ｎｍの吸光度を測
定した。

【００４４】［６−５−３］ 比較 今回の測定法、従来のＲＩＡ法、従来のＥＬＩＳＡ法の
各測定結果を図１に示した。この図１から明らかなよう
に、今回の測定法は、従来のＥＬＩＳＡ法に比べて感度
が約６倍となり、従来のＲＩＡ法に近い感度が得られる
ようになった。

【００４５】［その他］ｒａｆ−１キナーゼによりリン
酸化されうるリン酸化ＭＥＫ−１ペプチドを免疫原とし
て、実施例１〜４と同様の手順により融合細胞クローン
１Ｅ９（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５５９３）及びク
ローン２Ｆ１１（受託番号：ＦＥＲＭＰ−１５５９４）
を得、実施例５と同様の手順により抗リン酸化ＭＥＫ−
１ペプチド抗体の特異性を確認した。

【００４６】また、ＰＫＣ、ＰＫＡによりリン酸化され
うるリン酸化ＰＳペプチドを免疫原として、実施例１〜
４と同様の手順により融合細胞クローン２Ｂ９（受託番
号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５１３３）及びクローン２Ｇ３
（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５１３４）を得、実施例
５と同様の手順により抗リン酸化ＭＥＫ−１ペプチド抗
体の特異性を確認した。

【００４７】

【発明の効果】本発明の測定法及び測定キットによれ
ば、各種のプロテインキナーゼ、とりわけＫｍ値のそれ
ほど大きくないｃｄｃ２キナーゼ等のリン酸化酵素活性
を感度よくしかも簡易に測定することができる。このよ
うに各種プロテインキナーゼのリン酸化酵素活性を測定
することが可能になれば、細胞内における情報伝達のメ
カニズム解明のための手段が提供されると同時に、情報
伝達機構の異常として捉えられる疾患（癌や一部の糖尿
病等）の原因解明の手段が提供される。

【００４８】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００４９】配列番号：２ 配列の長さ：１6 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Gln Leu Ile Asp Ser Met Ala Asn Ser Phe Val Gly Thr Arg Cys 1 5 10 15

【００５０】配列番号：３ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ser Leu Arg Gln Lys Asn Val Cys 1 5 10

【図面の簡単な説明】

【図１】 各種測定法の感度の比較を表すグラフであ
る。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含むことを
   特徴とするプロテインキナーゼのリン酸化酵素活性の測
   定法。 （ａ） プロテインキナーゼによりリン酸化されうる基
   質ペプチドを標識物質により標識化した標識基質ペプチ
   ドと、前記プロテインキナーゼとを液相で反応させて、
   リン酸化標識基質ペプチドとする工程。 （ｂ） リン酸化基質ペプチド（基質ペプチドのアミノ
   酸配列のうち所定のアミノ酸がリン酸化されたもの）と
   特異的に結合する抗体を不溶性支持体に結合せしめてな
   る固相化抗体と、前記（ａ）で得られたリン酸化標識基
   質ペプチドとを反応させて、両者を結合させる工程。 （ｃ） 前記（ｂ）で得られた固相化抗体とリン酸化標
   識基質ペプチドとの結合物の標識量を測定する工程。
2. 【請求項２】 前記プロテインキナーゼがｃｄｃ２キナ
   ーゼであり、 前記基質ペプチドがＭＶ５５ペプチド（配列表の配列番
   号１で表されるペプチド）であり、 前記リン酸化基質ペプチドがリン酸化ＭＶ５５ペプチド
   （配列表の配列番号１で表されるペプチドのアミノ酸番
   号６のセリンがリン酸化されたもの）であり、 前記抗体が抗リン酸化ＭＶ５５ペプチド抗体であること
   を特徴とする請求項１記載の測定法。
3. 【請求項３】 前記リン酸化抗ＭＶ５５ペプチド抗体
   が、融合細胞クローン４Ａ４（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ
   −１５７５９）により産生されたモノクローナル抗体で
   あることを特徴とする請求項２記載の測定法。
4. 【請求項４】 前記標識物質が、ビオチン、ペルオキシ
   ダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスフ
   ァターゼ及びマイクロペルオキシダーゼからなる群から
   選ばれた一つであることを特徴とする請求項１〜請求項
   ３のいずれかに記載の測定法。
5. 【請求項５】 プロテインキナーゼによりリン酸化され
   うる基質ペプチドを標識物質により標識化した標識基質
   ペプチドと、 リン酸化基質ペプチド（基質ペプチドのアミノ酸配列の
   うち所定のアミノ酸がリン酸化されたもの）と特異的に
   結合する抗体を不溶性支持体に結合せしめてなる固相化
   抗体とを備えたことを特徴とするプロテインキナーゼの
   リン酸化酵素活性の測定キット。
6. 【請求項６】 前記プロテインキナーゼがｃｄｃ２キナ
   ーゼであり、 前記基質ペプチドがＭＶ５５ペプチド（配列表の配列番
   号１で表されるペプチド）であり、 前記リン酸化基質ペプチドがリン酸化ＭＶ５５ペプチド
   （配列表の配列番号１で表されるペプチドのアミノ酸番
   号６のセリンがリン酸化されたもの）であり、 前記抗体が抗リン酸化ＭＶ５５ペプチド抗体であること
   を特徴とする請求項５記載の測定キット。
7. 【請求項７】 前記抗リン酸化ＭＶ５５ペプチド抗体
   が、融合細胞クローン４Ａ４（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ
   −１５７５９）により産生されたモノクローナル抗体で
   あることを特徴とする請求項６記載の測定キット。
8. 【請求項８】 前記標識物質が、ビオチン、ペルオキシ
   ダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスフ
   ァターゼ及びマイクロペルオキシダーゼからなる群から
   選ばれた一つであることを特徴とする請求項５〜請求項
   ７のいずれかに記載の測定キット。