JPH10500014A

JPH10500014A - ランダム切断されたｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡ又はクローン化遺伝子を含むファージ／ファージミド表現ライブラリー

Info

Publication number: JPH10500014A
Application number: JP7529557A
Authority: JP
Inventors: フリユークバリイ，ラツシユ; ヤコブソン，カーリン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-05-11
Filing date: 1995-05-10
Publication date: 1998-01-06
Also published as: AU2541595A; SE9401650D0; EP0760100A1; WO1995031723A1

Abstract

(57)【要約】所定構造に対して生物特異的親和性を有する１個以上のペプチドを同定する方法であって、該方法は、（ａ）クローン化遺伝子、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ断片をヘルパーファージの表面タンパク質の遺伝子と融合するように連結させてファージ／ファージミドライブラリーを作成する段階、及び（ｂ）所定構造に結合するファージ粒子を選択する段階を含む。該ファージ／ファージミドライブラリーは、ファージに対して異種であり且つクローン化遺伝子、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ断片に融合した表面タンパク質の遺伝子を有する個々のメンバーを有し、該断片によりコードされるペプチドは個々のファージ粒子メンバーの表面上の表面タンパク質との融合の際に暴露される。

Description

【発明の詳細な説明】ランダム切断されたｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡ又はクローン化遺伝子を含むファージ／ファージミド表現ライブラリー技術分野本発明は、所定の標的構造に結合するペプチドの新規な同定法に関する。さらに本発明は、新規なウイルスライブラリー、同定されたペプチドの産生法及び該ペプチドをコードするＤＮＡ断片に関する。本発明のライブラリーの個々のメンバー間に認められる変異は、クローン化ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから得られたＤＮＡ断片に由来し得る。原則として本発明はウイルスライブラリー全般に適用し得る。細菌系には重要な実用的利点が存在するので、本発明の技術分野におけるこれまでの研究はＥ．ｃｏｌｉのバクテリオファージに向けられてきた。本発明は、宿主細胞としてＥ．ｃｏｌｉを用いたファージ／ファージミドライブラリーにより例示される。これは、本発明のファージ／ファージミドという概念が、特に断りのない限り、ウイルス全般に対応する単位と解釈されることを意味する。本発明に用いられているファージミドは、ファージ／ウイルスの表面上で発現され得るファージ／ウイルス表面タンパク質の遺伝子又はその修飾形を有している。「ペプチド」という用語は、３個以上、好ましくは５個以上のアミノ酸残基を有するオリゴペプチド及びポリペプチドを意味する。従って、本発明は主として、３個以上、好ましくは５個以上のアミノ酸残基を有するペプチドのマッピング及び選択に関する。「核酸断片」及び「ヌクレオチド配列」（ＤＮＡ断片）という用語は、５個以上、好ましくは１０個以上又は１５個以上の塩基対／塩基を有するオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを意味する。「ファージライブラリー」という用語は、特に断りのない限り、ファージ粒子並びにファージミド粒子のライブラリーを意味する。従来の技術及び該技術に係わる問題点短いランダムペプチドのライブラリーはかなり前から所定結合特異性を有するペプチドを選択するストックとして用いられている。これに関連して、個々のペプチドメンバーをウイルス／ファージ粒子の表面タンパク質との融合タンパク質として発現させることが一般的になっている。従って、構築されたファージライブラリーは、ファージ粒子の表面（ファージ表現）及びＤＮＡレベルの点で変異を有していた。該技術の第１の変異形では、各ペプチドをコードする個々のオリゴヌクレオチドメンバーを天然のファージＤＮＡと融合させた。このような方法は本質的に限界を有することを意味する。というのは、ファージのＥ．ｃｏｌｉ感染能を破壊しないようにするためには、オリゴヌクレオチド（挿入体）が比較的短くなければならないからである。後にファージベクターを、ヘルパーファージと組み合わせたファージミドベクターに取り換えたが、該系において、ファージミドベクターは、ファージの遺伝子間領域及びファージ表面タンパク質遺伝子の担体であった。ヘルパーファージ、ファージミド及び表面タンパク質は主として、好ましい表面タンパク質（タンパク質III）としてノーズ（ｎｏｓｅ）タンパク質（受容タンパク質）を含むいわゆる線状ファージ由来であった。一般にこれまで用いられてきた表面タンパク質は同一ファージ粒子上に数個のコピーとして存在するが、これは、ファージミドベクターを用いてファージ粒子上に融合表面タンパク質を暴露させると、同一ファージ粒子上に１個以上のコピーが出現することを意味する。本発明の技術分野におけるさらなる詳細については、例えば：Ｓｍｉｔｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８（１９８５）１３１５−１７；Ｃｗｉｒｌａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７（１９９０）６３７８ −８２；Ｄｅｖｌｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９（１９９０）４０４−４０６；Ｓｔｅｐｈｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２５（１９９２）５７７−５８３；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２５（１９９３）５７７ −５８３；Ｐａｒｍｌｅｙら，７３（１９８８）３０５−３０８を参照されたい。タンパク質III以外の潜在的に有用な表面タンパク質の例は、タンパク質IIIと同じ様なファージの表面上に数個のコピーを出現するタンパク質であるタンパク質VIIIである。タンパク質VIIIは、ファージの感染力に関して確認された受容体機能を全く有していない〔Ｋａｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８（１９９１）４３６３−６６〕。用いられている他のタンパク質はタンパク質VIである〔Ｊｅｓｐｅｒｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３（１９９５）３７８−３８２〕。ファージ表現（ｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙ）法は、完全抗体の可変ドメインを発現するファージからなる一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）ライブラリー〔ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ３４８（１９９０）５５２− ５５４；及びＣｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ３５２（１９９１）６２４− ６２８〕並びに組合わせ抗体断片（Ｆａｂ）ライブラリー〔Ｂａｒｂａｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８（１９９１）７９７８−７９８２；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９（１９９１）４１３３−４１３７；及びＨｏｇｒｅｆｅら，Ｇｅｎｅ１２８（１９９３）１１９−１２６〕の構築にも用いられている。該方法は、ＩｇＦａｂ領域に特異的な特定のＰＣＲプライマーを用いてＦａｂ領域をコードするヌクレオチド配列を作製することを含む。ファージライブラリーで該配列を発現させることにより、研究者が異なる抗原に特異的に結合する抗体の一部を表現するファージを選択することが可能になった。このような方法は、ＰＣＲを実施するためにはＤＮＡ配列がわかっていなければならず、そのためには、ｍＲＮＡのＦａｂ領域に特異的なＰＣＲプライマーにアクセスする必要があるという欠点を有している。従来技術の方法は、所定構造に結合するペプチドの選択にファージ／ファージミドライブラリーを用いる方法であると要約し得る。該方法は、（ｉ）比較的短い合成オリゴヌクレオチド又は免疫グロブリンのＦａｂ領域をコードするｍＲＮＡをＰＣＲ増幅して得られたｃＤＮＡ断片からなるオリゴヌクレオチド又はポリヌタレオチドライブラリーを作成する段階；（ii）段階（ｉ）で作成されたライブラリーの個々のメンバーをファージ粒子の表面タンパク質をコードする遺伝子と連結して、各ファージ粒子の表面上で、それぞれ表面タンパク質との融合タンパク質として、挿入オリゴヌクレオチド又は挿入ｃＤＮＡ断片によってコードされるペプチドを暴露させる段階；（iii）段階（ii）で得られたライブラリーから所定構造に結合する能力に関してファージを選択する段階；その後で、（ｉｖ）所望なら、選択されたファージを選択圧力下に増幅して融合遺伝子を形成し、ファージ表面上で融合タンパク質を発現させる段階；及び（ｖ）所望なら、選択されたファージ上に存在し且つ挿入されたヌクレオチド配列（それぞれ、オリゴヌクレオチド配列及びｃＤＮＡ断片）によりコードされるペプチドのアミノ酸配列、及び／又は前記アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を決定する段階を含む。段階（ii）で実施される連結は、段階（ｉ）で作成されたライブラリーの全てのメンバーを、同じように制限酵素で消化した１組のファージミド分子（ファージミドベクター）と接触させることを意味する。連結は、ファージミド分子に挿入されるどのＤＮＡ断片に関してもランダムとなる。本発明本発明の特徴は、ファージの表面タンパク質をコードする遺伝子に連結されるＤＮＡ断片が、クローン化遺伝子、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡに対応する核酸（ＤＮＡ）由来であるということにある。ＤＮＡ断片の起源の核酸は、オリゴ／ポリペプチドをコードする領域を含んでいなければならないが、真核細胞起源のものであっても原核細胞起源のものであってもよい。原則として、選択される遺伝子又はペプチドの配列についてはそれ以上知る必要はない。ｃＤＮＡは、それ自体公知の方法によりｍＲＮＡから例えば真核細胞ペプチドをコードする逆転写酵素を用いて作製し得る。真核細胞ｍＲＮＡの逆転写により、個々のメンバーが異なるｃＤＮＡ断片を含む種及び組織特異的ファージ／ファージミドライブラリーを作成し得る。その例としては、ヒト特異的ライブラリーや、選択されたヒト組織、細胞及び器官特異的ライブラリー、例えば腎臓特異的ライブラリーがある。核酸のランダム断片は多くの方法で得ることができる。ＤＮＡを非特異的に断片化する方法を用いるのが好ましいが、最も好ましいのは、完全にランダムであるか、ランダムに近い方法である。適切な方法の例としては、超音波による音波処理、及びＤＮＡ配列の如何に拘わらず、種々の位置でＤＮＡを非特異的に切断するＤＮアーゼＩ又は他の酵素での消化が挙げられる。ｍＲＮＡからｃＤＮＡのランダム断片を作製するために標準化法に従って逆転写酵素及びランダムプライマー（市販）を用いることも潜在的に可能である。ランダムプライマー及び逆転写酵素により得られるｃＤＮＡ断片は、本発明の場合、ｃＤＮＡのランダム切断により形成されるｃＤＮＡ断片と同等であり得る。ファージＤＮＡに挿入されるＤＮＡ断片の適当な大きさは２０〜１０，０００塩基対の範囲である。より狭い範囲が好ましい場合が多いが、該範囲は適切な断片化法を選択することにより得られる。幅広の範囲は、分別例えば電気泳動により狭め得る。通常、ファージミドは抗生物質耐性をコードする遺伝子を有しており、該遺伝子により本発明のファージ／ファージミドライブラリーを増幅し、それ自体公知の方法を用い、適切な宿主細胞中で当該抗生物質の存在下に該ファージ／ファージミドを培養して個々のメンバーをクローン化し得る。ファージミドベクターライブラリーの増幅は、用いられる宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）が上記のＤＮＡ断片に連結されたファージミドで初期に形質転換されている場合には、該宿主細胞を培養・溶菌した後で実施し得る。ファージミドを移入した宿主細胞にヘルパーファージを感染させると、該細胞は完全なファージ粒子を形成する。その結果、一部のファージ粒子が融合遺伝子を含むファージミドベクターを有し、他のファージ粒子が天然のファージＤＮＡ（融合遺伝子を欠く）を有するファージライブラリーが得られる。該ファージの表面上で、天然表面タンパク質は０又は１個以上の分子と融合した表面タンパク質と結合する。各ライブラリーのファージミドベクターメンバーは、挿入されたＤＮＡ断片の大きさがそれぞれ異なっており、例えば、２０〜１０，０００塩基対の範囲の大きさを有し得る。さらに、各ライブラリーのファージ粒子は、挿入されたＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列（ペプチド）の点で異なっている。通常、アミノ酸配列は６〜３，３００アミノ酸残基を含んでいる。ＤＮＡ断片をファージミドベクターに連結する前に、その末端をベタターの利用切断部位に適合させる。該断片が音波処理又は他の方法により種々のタイプの末端（種々の粘着性末端及び平滑末端）を形成している場合、該末端は、ファージミドの挿入位置にもマッチする全く同一タイプのものに形質転換する必要がある。本出願人は、該末端を平滑末端としてから、これも末端を平滑化したファージミドベクターに連結することを選択した。優先日の時点では、好ましいファージミドベクターは挿入断片に対する融合パートナーとしてのノーズタンパク質（ｎｏｓｅｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子（例えば、遺伝子III）であった（実施例１〜３）。優先年の終わりの時点では、好ましい融合パートナーは、タンパク質VIIIのような多重コピー表面タンパク質遺伝子に変っていた（実施例４）。本出願人が用いたファージミドベクターは、ＤＮＡ断片の挿入位置の前又は後に（及び常に表面タンパク質をコードするヌクレオチド配列の前に）いわゆる滑り配列（ｓｌｉｐｐｅｒｙｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有している。滑り配列とは、リボソームが滑って、読み取りフレームを変化させ得ることを意味する。優先日の時点では、本出願人は、挿入体のヌクレオチド配列が同様にシフトしても、挿入されたＤＮＡ及び表面タンパク質をコードするヌクレオチド配列への正しい読み取りフレームを確保するためにはこの滑り配列が必須であると考えた。「ヌクレオチド配列の分析」の結果については実施例１及び４を参照されたい。滑り配列は既に記載されている。考察には、Ａｔｋｉｎｓら，Ｃｅｌｌ６２（１９９０）４１３−４２３を参照されたい。滑り配列の例としては、微量ｔＲＮＡによって認識されるいわゆるハングリーコドン、特にタンデムハングリーコドン〔Ｐａｒｋｅｒ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５３（１９８９）２７３− ２９８及びＳｐａｎｊａｒｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，１９８８）７９６７−７９７１）〕又は逐次配置された３個、４個又はそれ以上の同一塩基（例えばアデニン）即ちタンデムコドンを含むｍＲＮＡ中でループを形成する配列である。さらに、本出願人が用いたファージミドベクターは、断片の挿入部位と表面タンパク質をコードするヌクレオチド配列との間にいわゆるアンバー終止コドンをも有していた。挿入されたＤＮＡ断片によりコードされるペプチド（非融合形態で得られる）がアンバー抑制能を欠く宿主細胞中でファージミドベクターから直接発現され得るので、アンバー終止コドンの存在は有用であり得る。実施例１の「ペプチドの精製」を参照されたい。ファージミドベクター中にアンバー終止配列が存在するということは、本発明のファージ粒子ライブラリーの形成及び増幅にアンバー抑制性の宿主細胞を用いる必要があることを意味する。ライブラリーからの関連ファージの選択はそれ自体公知の方法（将来の方法も含む）で実施され、本発明のファージライブラリーを、ファージ粒子が所定構造に結合（通常、生物特異的親和性により）するのにマッチしたアミノ酸配列を暴露させ得る条件下に、所定構造と接触させるように企図されている。その後で、結合していないファージ粒子を混合物から除去し、結合したファージ粒子を選択的に所定構造から遊離（解離）させ得る。結合構造は、高次又は低次複合体、例えば、単一のタンパク質、単一のエピトープ、全細胞、ウイルス、組織、炭水化物構造、脂質、抗体（例えばポリクローナル又はモノクローナル抗体）などであってよい。本出願人は、パンニングを用いたが、パンニングとは、選択したい結合構造が既に固定されている表面と、ファージライブラリーとを接触させることを意味する。他の代替え法は、溶解形態及び／又は天然形態（例えば、細胞表面受容体が細胞として存在し得る）の結合構造をとるものである。特に、パンニングにより選択すると、しばしば比較的高いバックグラウンド（所定構造又は該構造を固定し得る表面へのファージの非特異的結合）が生じる。より精選された選択を必要とする場合、おおざっぱな選択の後で又は該選択に代えて、例えば、選択されたファージミドをクローン化し、各クローンを溶解形態の所定構造に結合する能力を有するペプチド含量について調べてもよい。所定構造に対する特異的結合により選択されたファージ粒子の場合、挿入断片（連結されたＤＮＡ断片）及び対応ペプチドの配列は、それ自体公知の方法で決定し得る。本発明の１つの態様は、所定構造に結合するペプチドの産生法である。該態様は、本発明に従って結合ペプチドを選択することから出発し、次いで該ペプチドのアミノ酸配列及び／又は対応ヌクレオチド配列についての知識を用い、それ自体公知の方法で該ペプチド又はその修飾形態（融合形態及び化学誘導体並びに将来開発されるであろう方法を含む）を産生させることである。本発明の別の態様は、所定構造に結合するペプチドをコードするＤＮＡ断片を作製する方法である。該方法は、上記のようにファージ／ファージミドを選択し、それ自体公知の方法で、選択されたファージ／ファージミド粒子からその断片を得ることである。本発明のさらに別の態様は、ファージに対して異種の種々のＤＮＡ断片に融合した表面タンパタ質の遺伝子が様々に異なる個々のメンバーを有するファージ／ファージミドライブラリーである。企図されているＤＮＡ断片は、クローン化遺伝子、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ由来である。挿入されたＤＮＡ断片によりコードされるペプチドを該ライブラリーのファージ粒子上の表面タンパク質と融合させる際に暴露させる。「ファージ／ファージミドライブラリー」という用語は、ファージ粒子及び／又はファージミドベクターからなるライブラリーを意味する。本願出願日の時点では、本発明は主として新規且つこれまで知られていなかった結合ペプチドの選択及びタンパク質の結合領域のマッピングに有用であると考えられていた。極めて重要な価値を有すると思われる副次態様は、結合構造の高次又は低次複合混合物中の免疫原性エピトープ、特に免疫優性エピトープを決定するために、タンパク質、ウイルス、細菌などに対するポリクローナル抗体をマッピングすることである。実施例３を参照されたい。本発明は、本明細書の一部である添付特許請求の範囲においてより厳密に限定される。実施例実施例１．遺伝子IIIとの融合．所定結合特異性を有するタンパク質についての生物ゲノムのスクリーニング．発現したタンパク質のマッピング．序説：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌａｕｒｅｕｓ８３２５−４が、プロテインＡ（ＩｇＧ結合タンパク質）及びフィブロネクチン結合タンパク質（該タンパク質はどちらも早期にクローン化されている）を発現させることは知られてｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６（１９８９）ｏｃｈｅｍ．２９２（１９９１）１０４１−４８〕。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びこれら２種のタンパク質の結合能を本発明のテストモデルとして用いた。材料及び方法細菌株及びヘルパーファージ：Ｅ．ｃｏｌｉ株ＴＧＩ（アンバー抑制性）をライブラリーの構築及びファージストックの産生に用いた。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１をヌクレオチド配列決定用ＤＮＡの作製及び精製用組換えタンパク質の調製に用いた。ファージＲ４０８（Ｐｒｏｍｅｇａ）をヘルパーファージとして用いた。ライブラリーの構築：全てのＤＮＡ操作は標準条件を用いて行った。制限酵素及び修飾酵素はＡｍｅｒｓｈａｍ(イギリス)及びＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ(ドイツ)から得た。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ８３２５−４から染色体ＤＮＡを分離した。該ＤＮＡを音波処理して断片化し、ゲル電気泳動により約１００〜７００ｂｐの大きさの断片を分離した。得られた断片の末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化した。ファージミドベクターｐＨＥＮ１〔Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９（１９９１）４１３３−３７〕をＰｓｔ１で消化し、末端を平滑化し且つウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。処理したベクターＤＮＡ１０μｇを、２００μｌ容量中１５μｇの染色体断片と連結させた。エタノールで沈殿させた後、連結したＤＮＡを２０ μｌの水に溶解し、１００ｍｌのルリアブイヨン（ＬＢ）培地中で１時間非選択的に増殖させた後、それぞれ１μｌのＤＮＡを用いて１０回のＥ.ｃｏｌｉＴＧ１電気形質転換を行い、９．２×１０⁶個の形質転換細胞を得た。形質転換細胞を１００ｍｌＬＢ、１％グルコース及び５０μｇアンピシリン／ｍｌ中で一晩増殖させた。該細胞を、１０ｍｌのＬＢ中で１時間ＭＯＩ２０のヘルパーファージＲ４０８に感染させ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌＬＢ中で５時間増殖させた。これによって、最終力価が２．６×１０¹⁰ファージミド粒子／ｍｌのライブラリーを得た。パンニング手順：０．０５ＭＮａＨＣＯ₃、ｐＨ９．７中のヒトＩｇＧ（５００ μｇ／ｍｌ）又は５００ｍＭＮａＣｌを加えた同一緩衝液中のウシフィブロネクチン（１００μｇ／ｍｌ）２００μｌを用いて４℃で一晩マイクロタイタープレートをコートした。次いで、１％ＢＳＡを補っでウエルをブロックした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した後、２００μｌのファージミドライブラリーを３個のウエルそれぞれに加え、２０℃で４時間インキュベートし後、結合ファージを、１５０ｍＭＮａＣｌを加えた５０ｍＭクエン酸ナトリウム（３×２００μｌ）を用い、減少ｐＨ（５．５、４．５、３．３、２．３及び１．８）で段階的に溶離した。３つのウエルからの溶離物をプールし、６０μｌの２ＭＴｒｉｓｐＨ８．６を加えて中和した。５０μｌの新鮮なＥ.ｃｏｌｉＴＧ１−細胞及び１００μｌのＬＢに、５〜５０μｌの溶離物を加えた。室温で３０分間非選択的にインキュベーションした後、懸濁液を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％グルコースを含むＬＡプレート上にまき、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。再パンニング：一次パンニングの後で溶離されたファージをＴＧ１細胞の感染に用いた。ＬＡプレート上でのアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）選択の後、耐性コロニーを、２％グルコース及びアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を補った１０ｍｌＬＢ培地に移し、４時間増殖させた後、細胞を遠心して捕集した。細胞を１ｍｌのＬＢ培地に懸濁し、Ｒ４０８ファージ（ＭＯＩ２０）に１時間感染させ、次いで、１０ｍｌのＬＢ培地中で５時間増殖させた。この手順を日常的に行って１０⁸〜１０¹⁰ＣＦＵのファージミド力価を得た。ＩｇＧ及びフィブロネクチン結合クローンの同定：アンピシリン／グルコースプレートからのコロニーをニトロセルロースフィルターに移し、ＬＡ−アンピシリンプレート上で４時間インキュベートした。その後、コロニーをクロロホルム蒸気中で溶菌した。細胞破片をＰＢＳ−Ｔｗｅｅキュベートした。次いでフィルターを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中のビオチニル化ＩｇＧ又はフィブロネクチン（約５μｇ／１０ｍｌ）を含む溶液に移した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１：１０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレパビジン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共にインキュベートした。基質として４−クロロ−１−ナフトール及び過酸化水素を補ったＰＢＳを用いて酵素活性を測定した。ウシフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）及びヒトＩｇＧをＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｓｉｇｍａ）でビオチニル化した〔Ｂａｙｅｒら，１５４（１９８６）３６７−７０〕。６ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ及び３×Ｄｅｎａｒｃｈの溶液中のオリゴヌクレオチドプローブＣＢ及びＤを用い３７℃でハイブリダイゼーションを実施した。６×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中６０℃で洗浄した。オリゴヌクレオチドをＳｃａｎｄｉｎａｖｉａｎＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓＡＢ（スウェーデン）により合成し、配列：ＣＢ：５′−ＡＣＣＡＣＣＴＧＧＧＴＴＴＧＴＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＴＡＴＴＣＡＡＣＡＡＣＡＴＣＡＧＣ−３′及びＤ：５′−ＧＴＧＴＧＣＴＴＡＴＴＧＡＡＴＣＣＧＴＧＡＡＴＡＴＧＴＧＧＣＡＣＡＣＴＧＴＣＧ− ３′を得た。表現された挿入断片の配列決定：二本鎖ＤＮＡを分離するためにファージミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１に移した。ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ製のＳｅｑｕｅｎａｓｅ２．０バージョンＤＮＡ配列決定キットを用い、ジデオキシ鎖成長終結法により挿入断片の配列を両末端から決定した。プライマーとして用いたオリゴヌクレオチドＰｅ及びＭｙをＳｃａｎｄｉｎａｖｉａｎＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓＡＢ（スウェーデン）を用いて合成し、以下の配列：Ｐｅ：５′ −ＴＴＧＣＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＣＧＣＴＧＡＡ−３′及びＭｙ：５′− ＴＧＣＧＧＣＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣ−３′を得た。得られた配列の操作にはＰＣ−遺伝子プログラムＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓを用いた。ペプチドの精製：アンバー抑制機能を欠き、従って、ペプチドを産生するがタンパク質IIIには融合しないＥ．ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１をＩｇＧ結合ペプチドの産生に用いた。ファージミドを含む細胞を、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）及びグルコース（２％）を補った２００ｍｌのＬＢ培地中ＯＤ₅₅₀＝０．５〜０．７に増殖させた。細胞をペレット化し、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）及び１ｍｍイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドを補った２００ｍｌのＬＢに再懸濁し、一晩増殖させた。細胞をペレット化し、リゾチームで溶菌して、ペプチドをＩｇＧセファローｏｇｙ，スウェーデン）上のアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ＩｇＧのＳ．ａｕｒｅｕｓ株Ｃｏｗａｎ１への結合の阻害：ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＣｏｗａｎ１細胞を１０ｍｌＴｒｙｐｔｉｃＳｏｙａＢｒｏｔｈ中３７℃で一晩増殖させた。細菌を遠心して捕集し、Ａ（０．１％）を補ったＰＢＳ〕中で３回洗浄し、１０ｍｌのＰＢＳ−ＴＢに再懸濁した。精製ペプチドを最終容量１００μｌのＰＢＳ−ＴＢ中の（１８，０００ｃｐｍ）¹²⁵Ｉ−ＩｇＧと混合した。混合物を室温で３０分間インキュベートした後、２０μｌの細菌を加え、さらに１０分間インキュベーションを継続した。ＰＢＳ−ＴＢで２回洗浄して遊離ＩｇＧを除去した。残留ペレットの放射能をγ 計数器（Ｓｅａｒｌｅ，ＵＳＡ）で測定した。製造業者の指示に従い、ＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳヨウ素化試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）を用いてヒトＩｇＧをヨウ素化した。結果ファージライブラリーの構築及びパンニング：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ８３２５−４由来のＤＮＡを音波処理して断片とし、約１００〜７００ｂｐの大きさの断片をファージミドベクターｐＨＥＮ１に連結した。連結したＤＮＡを電気泳動によりＥ．ｃｏｌｉＴＧ１に導入し、次いでＬＢ培地中でアンピシリン耐性菌の選択及び強化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を行った。一晩増殖させた後、耐性菌を遠心し、ＬＢ培地に再懸濁し、Ｒ４０８ヘルパーファージ（ＭＯＩ２０）に感染させた。得られたライブラリーは、９．２×１０⁶個のクローンを含んでおり、その力価は、２．６×１０¹⁰ファージミド粒子／ｍｌであった。ライブラリーからの０．６ｍｌ部分を、マイクロタイタープレートのウエルに固定されたリガンド、ＩｇＧ又はフィブロネクチンに対する親和パンニングに用いた。ファージを２〜４時間結合させ、次いでＰＢＳ −ＴＢで慎重に洗浄した。クエン酸緩衝液を用いてｐＨを低下させながら段階的に溶離した後、溶離ファージを、アンピシリンプレート上にまいたＥ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞に感染させた。アンピシリン耐性クローンをＩｇＧ又はフィブロネクチン結合についてスクリーニングした。ｐＨ５．５、４．５及び３．３で溶離した後では、約１〜５％のクローンがＩｇＧに結合したのに対し、ｐＨ２．３又は１．８で溶離すると、わずか数個の陽性クローンが放出されたに過ぎなかった（表１）。標識フィブロネクチンに対する親和性がクローン毎に明らかに異なるために、一次パンニング後のフィブロネクチン結合クローンの頻度の測定はより困難であった。このために、フィブロネクチン結合クローンの検出に、２つの既知のフィブロネクチン結合ドメインをカバーする、ビオチン標識したフィブロネクチン及びＤＮＡプローブであるオリゴヌタレオチドＣＢ及びＤの両方を用いた。ＩｇＧ結合ファージの場合とは反対に、「陽性」ファージの頻度は高ｐＨで溶離した場合には低かったのに対し、ｐＨ２．３及び１．８で溶離した場合には約１０％のフィブロネクチン結合クローンを得た（表１）。ＩｇＧに対する二次パンニングの場合、ｐＨ５．５、４．５及び３．３で溶離したファージに感染させて得た細菌コロニーを捕集して、ファージストックの調製に用いた。フィブロネクチンに対する再パンニングに用いたファージストックをｐＨ３．３、２．３及び１．８での溶離物から捕集した。「結合ファージ」という用語は、リガンドに結合するペプチドをコードするファージミドを有するファージを指す。＊ｆｎｂＡ遺伝子によりコードされる２つの結合ドメインの一部をカバーする２つのオリゴヌクレオチドプローブ（ＣＢ及びＤと称する）を用いて結合クローンを検出した。再パンニング：一次ＩｇＧ及びフィブロネクチンパンニングからの増幅ファージミドストックをリガンドに対する二次パンニングに用いた。（異なる一次パンニングからの）数種の異なるファージミドストックを用いても、同一ではないが類似の結果を得た。ＩｇＧに対する２回の再パンニング実験の結果を表１に示す。殆どの実験において、二次パンニング後には陽性クローンは約１０％に増大したが、結果は実験毎に（約５〜２０％陽性クローンの範囲にわたり）様々であった。フィブロネクチンに対する再パンニングにより、低ｐＨで高頻度の「陽性ファージ」が得られ、得られたコロニーの２０〜４０％がフィブロネクチンに結合していた（表１）。ヌクレオチド配列の分析：さらなる実験のために７個のＩｇＧ結合クローンを選択し、挿入断片のＤＮＡ配列を決定した。６個のクローンの中同一挿入断片を有する２個は、ｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０（１９８３）６９７−７０１〕の一部を含んでいた。挿入断片はその大きさが１６９〜６４８ｂｐにわたって異なｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９（１９８４）１６９５−１７０２〕を構成するプロテインＡの結合領域をコードする全配列を表す。残りのＩｇＧ結合クローン（Ｔｇ４）は、第２のＳ．ａｕｒｅｕｓＩｇＧ結合タンパク質をコードする今まで知られていなかった遺伝子からなる挿入断片を含んでいた。この挿入断片は８４個のアミノ酸からなるペプチドをコードし、その配列は異なるが、ブドウ球菌のプロテインＡとの見かけ相同性を有していた。プローブとしてクローンＩｇ４中の挿入断片を用いたサザーンブロットハイブリダイゼーションにより、該挿入断片のヌクレオチド配列がＳ．ａｕｒｅｕｓ株８３２５−４並びに実験した他のＳ.ａｕｒｅｕｓ株にも存在することが示された（データ示さず）。５個のフィブロネクチン結合クローンを配列決定すると、いずれのクローンもフィブロネクチン結合タンパク質をコｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６（１９８９）６９９−７０３〕を起源とする挿入断片を有していることが示された。該クローンは、それぞれ、２つの公知フィブロネクチン結合ドメインであるＣＢドメイン及び反を含んでいた。ｆｎｂＢに対応するクローンは全く認められなかった。表２参照。クローン化断片によりコードされるアミノ酸の位置（各タンパク質についての欄の右側）。ナンバリングは、〔Ｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６（１９８９）６９９ −７０３（ＦｎｂＡ）〕により決定されたシグナル配列中の最初のアミノ酸から始める。クローンの配列分析により、全てのクローンで挿入断片への読み取りフレームは正しかったが、驚くべきことには、挿入断片からタンパク質IIIの遺伝子への読み取りフレームはいずれの場合も正しくなかったことが示された。むしろ、これまでに分析したクローンは１つを除いて全て（合計４５個以上の種々のクローン及び他のファージミドライブラリーからのクローンも含む）、挿入断片からの読み取りフレーム中に＋１又は−１のシフトを有している。このシフトは挿入断片中のヌクレオチドの数に依存していた。この結果は予期せぬものであった。というのは、１回目のパンニングで、ファージタンパク質IIIとの融合を必要とする、表面上で結合ペプチドを表現するファージに対する確かな選択が得られたからである。次いで、遺伝子IIIと共に正しい読み取りフレーム中に挿入断片を有するファージしか予想していなかった。この現象から２つの事柄が示唆される。先ず、遺伝子IIIと共に正しい読み取りフレーム中に挿入断片を有するファージに対する強力な選択が存在する筈である。第２に、これらのファージは莫大な他のファージから親和精製されたものであるから、挿入されたＤＮＡはファージ表面で表現されるペプチドをコードする筈である。この現象には２つの説明が考えられる。挿入断片は元々正しい読み取りフレームを有していたが、後続段階で突然変異したか、あるいは、タンパタ質IIIとの融合タンパク質を産生するリボソームの滑り（ｓｌｉｐｐａｇｅ）が存在するかである。いくつかの理由から、第１の説明はとてもありそうもないと思われる。例えば、読み取りフレームを破壊する突然変異が常に同一位置、即ち、挿入断片の３′末端で生ずるとは考えられない。そうではなくて、リボソームの滑りが最もありそうな説明である。これをテストするために、正しくない読み取りフレームを有する本発明のファージミドクローン２つからファージストックを調製し、次いで該ストックをパンニング実験に用いた。次いで、本発明のファージミドクローンを含むファージストックを親和パンニングにより富化した。これは、ベクター中の挿入断片がかなり高頻度でタンパク質IIIとの融合体として発現されることを強力に示唆している。読み取りフレームの＋１及び−１シフトの頻度に著しい偏りは見られなかった。挿入断片と遺伝子IIIの出発部位又は出発部位の直ぐ後との間に、＋１及び−１読み取りフレームのどちらにも存在するＴＧＡ終止コドンが存在し、これは、リボソームの滑りがこの位置の前で発生することを示唆している。＋１及び−１フレームシフトはどちらも、いわゆる滑り配列、即ち、例えばバクテリオファージＴ７中の４個以上の単一塩基リピート列で発生することは公知となっている〔Ｃｏｎｄｒｏｎら，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７３（１９９１）６９９８−７００３〕。考察には、Ａｔｋｉｎｓら，Ｃｅｌｌ６２（１９９０）４１３−２３を参照されたい。そのような滑り配列の１つが、挿入断片と遺伝子IIIとの間に位置するｃ−ｍｙｇ標識中に存在し、少なくともリボソームの滑りの一部を構成し得る。滑りはｍＲＮＡの高次構造のループを形成する配列にも係わっている。分離されたファージミドクローンを用いたパンニング：正しくない読み取りフレームを有する本発明のファージミドクローンが親和選択され得る粒子を生成したかどうかを調べるために、表２に示されているＩｇＧ結合クローン中の２個のクローンからファージストックを捕集した。これらのファージストックを逐次希釈し、非関連ファージストック（同様な方法によるが、別の細菌種から調製したファージライブラリー）からの一定数のファージと混合し、次いで、ＩｇＧに対してパンニングし、Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞を溶離ファージに感染させた。得られたコロニーをＩｇＧ結合についてスクリーニングすると、極めて高富化のＩｇＧ結合ファージが示された（表３）。阻害アッセイ：Ｅ．ｃｏｌｉＭＣ１０６１中で産生されたファージミドクローンＩｇ２，Ｉｇ４及びＩｇ６によりた（データは示さず）。精製ペプチドを¹²⁵Ｉ−標識ＩｇＧと種々の濃度で混合し、標識ＩｇＧとＳ．ａｕｒｅｕｓＣｏｗａｎ１細胞との結合を測定した。該ペプチドはＩｇＧとＣｏｗａｎ１細胞との結合を濃度依存的に阻害したのに対し、１０ｍｌのＥ．ｃｏｌｉＭＣ１０６１細胞由来の粗溶解物は結合に影響を与えなかった（データは示さードされるペプチドの結合も、該ペプチドによるＩｇＧとＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞との結合の阻害も、同定されたクローンが新規なＩｇＧ結合ペプチドをコードすることを実証した。実施例２：遺伝子IIIとの融合．クローン化遺伝子の断片形成により得られたＤＮＡライブラリーに基づく単一タンパク質のマッピング序説：タンパク質ＭＡＧ及びＺＡＧは、それぞれ、動物のブドウ球菌種である、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ及びＳ．ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ由来の細胞表面タンパク質である。この２種のタンパク質はヒトＣ群及びＤ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ由来の周知のＩｇＧ結合プロテインＧと密接な関係を有する〔Ｇｕｓｓら,ＥＭＢＯＪ（１９８６）Ｃｈｅｍ．２６６（１９９１）３９−４０５〕。プロテインＧによっても示されるＩｇＧと血清アルブミンとの結合のほかに、タンパク質ＭＡＧ及びＺＡＧは血漿プロテイナーゼ阻害剤α₂−マクログロブリン（α₂Ｍ）に対する親和性を有している。タンパク質ＭＡＧ及びＺＡＧの遺伝子のクローン化及び配列決定は最近記載された〔Ｊｏｎｓｓｏｎら，Ｇｅｎｅ１４３（１９９４）８５−８９及びＪｏｎｓｓｏｎら，前掲〕。タンパク質ＭＡＧ及びＺＡＧのα₂−Ｍ結合活性はどちらのタンパク質においてもＮ末端部分に局在化していた。しかし、配列全体を比較すると、２つのドメイン間の配列相同性は極く限られたものであることが示された。材料及び方法細菌株及びヘルパーファージ：これらは実施例１の場合と同様であった。ファージミドライブラリーの構築：それぞれ、タンパク質ＭＡＧのα₂Ｍ−結合ドメイン及びタンパク質ＺＡＧ全体をコードするクローンｐＭＡＧ２及びｐＳＺＧ４０〔Ｊｏｎｓｓｏｎら，Ｇｅｎｅ１４３（１９９４）８５−８９及びＪｏｎｓｓｏｎら，前掲〕からのプラスミドＤＮＡを標準法〔Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ〕に従って精製した。精製プラスミドＤＮＡを音波処理して断片化し、分取アガロースゲル電気泳動により約５０〜３００ｂｐの範囲の断片を分離した。分離した断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を得、次いで、ファージミドベクターｐＨＥＮ１〔Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９（１９９１）４１３３−３７〕の本発明修飾形ｐＨＥＮＨ５にクローン化した。該修飾ベタターは、配列［５′ −ＣＣＣＧＧＧ（ＧＴＧ）₆ＣＡ−３′及び５′−ＧＣＡ（ＣＣＡ）₅ＣＣＣＣＧＧＧＴＧＣＡ−３′］を有する２つのオリゴヌクレオチドをＰｓｔＩ部位に連結して作製した挿入断片を含んでいた。５μｇの精製ベクターＤＮＡをＳｍａＩで切断し、ウシ腸ホスファターゼで処理し、それぞれｐＭＡＧ２及びｐＳＺＧ４０からのプラスミドＤＮＡのゲル精製断片５μｇと連結した。連結及びエタノール沈殿の後、連結した物質を２０μｌのｄＨ₂Ｏに溶解し、１μｌアリコートを２回のＥ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞の電気形質転換に用いた。形質転換混合物をプールし、ＬＢ培地＋２％グルコースで１００ｍｌに希釈し、抗生物質を選択せずに、１時間増殖させた。アンピシリン耐性クローン数を測定するために試料を採取した後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌの最終濃度になるまで加え、培養を３７℃で一晩増殖させた。翌日、細胞をペレット化し、１０ｍｌのＬＢ培地に再懸濁し、ＭＯＩ２０でヘルパーファージＲ４０８に感染させた。１時間後、細胞をＬＢ培地で１００ｍｌに希釈し、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌの最終濃度になるまで加え、培養物をさらに５時間インキュベートした。最後に、細菌をペレット化し、ファージを含む増殖培地を滅菌濾過し、４℃で保存した。ｚａｇ遺伝子由来のライブラリーは、１．２×１０⁵タローンからなり、伝播後のファージミド力価は９×１０⁸ＣＦＵであった。ｍａｇ遺伝子由来のライブラリーは、０．９×１０⁴クローンからなり、そのファージミド力価は７×１０⁸ＣＦＵであった。ファージライブラリーのパンニング:マイクロタイタープレート（ＭａｘｉｓｏｒｐＮｕｎｃ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、２００μｌのウシα₂Ｍ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ,Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、０．０５ＭＮａＨＣＯ₃，ｐＨ９．７中１００μｇ／ｍｌの濃度で一晩４℃でコートした。次いで、ウエルを、２００μｌのファージミドライブラリーを加え、室温で４時間インキュベートした。パンニングした後、ウエルをＰ下させならが（５．５，３．３及び１．８）１５０ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭクエン酸ナトリウム２００μｌで段階的に溶離した。３つのウエルからの溶離物をプールし、６０μｌの２ＭＴｒｉｓｐＨ８．６を加えて中和した。プールした溶離物５０μｌを５０μｌのＥ.ｃｏｌｉＴＧ１細胞に感染させた。ＬＢ培地を添加して全容量を２００μｌに調整した。室温で３０分インキュベートした後、該細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％グルコースを含むＬＡプレートにまき、３７℃で一晩インキュベートした。 α₂Ｍ−結合クローンの同定：α₂Ｍに対してパンニングして得られたファージミド粒子に感染させたＥ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞からのコロニーを、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＡプレート上に置いたニトロセルロースフィルターに移した。４時間後、フィルターを取り出し、クロロホルム蒸気中に１０分間置き、コロニーを溶菌した。除去し、次いで、同一緩衝液中３７℃で３０分間飽和した。飽和後、フィルターを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識α₂Ｍを５μｇ／ｍｌの濃度で含むＰＢＳ−Ｔ洗浄した後、ＨＲＰ基質４−クロロ−１−ナフトールを添加して結合α₂Ｍを検出した。ファージミドクローンの配列決定：α₂Ｍ結合アッセイで陽性であったクローンをマスタープレート上で同定し、二本鎖プラスミドＤＮＡを作製するために、小規模で増殖させた。配列決定用ＤＮＡを作製するために、得られたＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉＭＣ１０６１に電気形質転換した。Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ２.０バージョンＤＮＡ配列決定キット（ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用い、ジデオキシ法により挿入断片の配列を決定した。配列の分析には、ＰＣＧＥＮＥタンパク質及びＤＮＡ操作プログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いた。 α₂ＭのＳ.ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ細胞への結合の阻害：凍結乾燥したＳ．ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ細胞Ｚ５株（該細胞株からｚａｇ遺伝子をクローン化した）をマイｒｙＲｅｓ．５９（１９９２）２７３−８５〕にコートした。ウエルを飽和した後、ウエルに、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ／ｍｌ）と共に４つの結合ドメインそれぞれを表すペプチドを発現するＥ.ｃｏｌｉＭＣ１０６１細胞から作製した漸増量の溶解物を加えた。該アッセイにはベクターのみを含むクローンからの対照溶解物を含めた。室温で１時間イり返し洗浄し、酵素用の基質として１００μｌの３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えた。５分後、１００μｌの１ＭＨＣｌを添加して反応を停止し、４５０ｎｍのＥＬＩＳＡ読み取り装置でプレートの読み取りを行った。結果：挿入断片のヌクレオチド配列：ｍａｇ遺伝子ライブラリー由来の７個の配列決定クローンのうち６個はユニークであった。ｚａｇ遺伝子由来のクローンの対応数は１１個のユニークなクローンであった。全ての挿入断片は、初期にα₂Ｍ−結合活性をコードすると定義された遺伝子〔Ｊｏｎｓｓｏｎら，Ｇｅｎｅ１４３（１９９４）８５−８９及びＪｏｎｓｓｏｎら，前掲〕のドメイン由来であった。種々のクローンの局在部位を表１に示す。ｚａｇ遺伝子ライブラリー由来のクローンは、初期に同定された結合領域を２つの部位に分割する２個のリピート、Ｒ１及びＲ２のいずれかをカバーする。しかし、それぞれＲ１及びＲ２リピートをカバーするクローンの間には最短でも１８ヌクレオチド長のオーバーラップが存在する。ｚａｇ遺伝子由来のコロニーから推定されるアミノ酸配列は、９１〜６６アミノ酸長の差がある。ｍａｇ遺伝子由来の６個のコロニー中５個は、ドメインの最初のα₂Ｍ結合部位をカバーしており、ｚａｇ遺伝子によりコードされるリピートとは殆ど相同ではない。ｍａｇ遺伝子由来のクローン中１個は、さらに下流に位置し、タンパク質ＭＡＧのα₂Ｍ結合ドメインを２つの別個のα₂Ｍ結合部位に分割している。表４参照。 α₂ＭのＳ．ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓへの結合の阻害：ヌクレオチド配列決定により定義された種々のα₂Ｍ結合部位を表す４個のクローンを阻害実験用に選択した（２個はタンパク質ＭＡＧ由来の結合部位を表し、２個はタンパク質ＺＡＧ由来の２つの異なる部位を表していた）。挿入断片の無いベクターを含むクローン１個を対照として用いた。α₂Ｍ−結合モチーフをコードするクローンは全て、マイクロタイターウエルに固定されたＳ．ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ株Ｚ５細胞へのα₂Ｍの結合を効率的に阻害した。対照溶解物もわずかではあるが、高濃度でα₂Ｍへの結合を阻害した。阻害アッセイに用いる前に、溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ウエスターンブロット法でテストした。溶解物のタンパク質含量は同一範囲内にあり、ＨＲＰ標識α₂Ｍを用いたウエスターンブロット法では、ｍａｇ及びｚａｇ遺伝子の一部を発現するクローンのみが検出された（データは示さず）。実施例３．遺伝子IIIとの融合．ヒトフィブロネクチンに対するポリクローナル抗体のマッピング。ｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片のスクリーニング。予備実験及び結果：出発ＤＮＡは、ヒトフィブロネクチンタンパク質〔Ｄｕｆｏｕｒら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１１３（１９９１）３３１−３８〕をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドクローンであった。このｃＤＮＡを用いて本発明のファージ発現ライブラリーを作製した。該ライブラリーを、ヤギ（Ｎｉｎｏｌａｂ）又はウサギ（Ｓｉｇｍａ）中で発育させたヒトフィブロネクチンに対する親和精製抗体に対してパンニングした。該ファージをｐＨを低下させながら溶離し、Ｅ.ｃｏｌｉＴＧ１細胞への感染に用いた。抗体結合エピトープを発現する細菌コロニーを分離し、ファージミドの挿入断片を配列決定した。ヤキ抗体に対してパンニングして得られたファージミドクローンの挿入断片は、ｃＤＮＡ中の約２９００〜３２００ヌクレオチドの１つの大きな部位（１０個中６個のクローン）としてフィブロネクチン中に結合していた。１方がｃＤＮＡ中約２６００〜２８００ヌクレオチド（１０個中３個のクローン）に位置し、他方が１８２０〜２１００ヌクレオチド（１個のクローン）に位置する、他の２つのエピトープも検出された。ウサギ抗体もフィブロネクチンタンパク質上の１つの大きなエピトープとして認識された。というのは、２４個中２２個のクローンが約２９６０〜３１４０ヌクレオチドの挿入断片を有していたからである。ウサギ抗体には他の２つのエピトープも検出され、ｃＤＮＡ中の約２５００〜２７００及び２７７０〜２９００ヌクレオチドの挿入断片として同定された。この実験は最近始めたものであり、結果は未だ完全ではない。実施例４：遺伝子VIIIとの融合．所定結合特異性を有するタンパク質についての生物ゲノムのスクリーニング。材料及び方法細菌株及びヘルパーファージ：これらは実施例１の場合と同様であった。ファージミドベクターの構築：全てのＤＮＡ操作は標準法を用いて実施したが、但し、連結には、製造業者の指示に従い、ＲｅａｄｙｔｏＧｏＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＰｈａｒａｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた。制限酵素はＡｍｅｒｓｈａｍ及びＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍから得た。オリゴヌクレオチドは、ＳｃａｎｄｉｎａｖｉａｎＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓＡＢ（Ｆａｌｋｅｎｂｅｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）により合成した。ベクターは、ｐＨＥＮ１〔Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９（１９９１）４１３３−４１３７〕から構築したが、但し、２段階で修飾を行った。先ず、６個のヒスチジン残基をコードするテールを導入してポリペプチドの精製を可能にした。ヒスチジンテールをコードするオリゴヌクレオチド、５′−ＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＧＧＣＴＧＣＡ−３′及び５′−ＣＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＣＡ−３′並びにＳｍａ１部位を、ｐＨＥＮ１ベクターのＰｓｔ１制限部位に挿入した。さらに、このリンカーに、遺伝子IIIの発現を減少させるためにフレームシフト突然変異を導入した。この修飾ｐＨＥＮ１ベクターをｐＨＥＮＨ６と称した。第２に、遺伝子IIIを遺伝子VIIIに取り換えてｐＧ８Ｈ６を形成した。遺伝子VIIIは、プライマー、５′−ＧＧＣＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＧＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＣＣＧＣＡＡＡＡー３′及び５′−ＴＴＴＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧＧＴＴＴＡＴＣＡＧＣＴＴＧＣＴＴＴＣＧ−３′を用いてＰＣＲ増幅によりファージＲ４０８から得た。該断片を分取ケル電気泳動により精製し、ＥｃｏＲ１及びＨｉｎｄIIIで消化した。同様に、ポリリンカー、ヒスチジンテール及びｃ−ｍｙｃ標識を含むｐＨＥＮＨ６の断片を、プライマー、５′−ＴＴＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＧＣＧＧＣＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＴＣＣ−３′及び５′−ＴＴＧＣＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＣＧＣＴＧＡＡ−３′を用いて増幅し、次いで、ゲル精製し、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄIIIで消化した。これら２つの断片を、前もってＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩで消化し、ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化しておいたｐＨＥＮＨ６ベクターに連結した。Ｅ．ｃｏｌｉＭＣ１０６１に形質転換した後、プラスミドＤＮＡを作製し、その配列を、ｐＵＣ／Ｍ１３前進及び逆進プライマーを用いて両挿入断片の配列を制限分析並びにＤＮＡ配列決定により確認した。ライブラリーの構築：実施例１と実質的に同じ様にしてライブラリーを構築した。ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ株８３２５−４由来の短い染色体ＤＮＡを音波処理によりランダムに断片化して、分取ゲル電気泳動により約３００〜８００ｂｐの大きさの断片を分離した。該断片の末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化し、前もってＳｍａＩで消化し、ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化しておいたｐＧ８Ｈ６ベクターに連結した。連結は、５つの管に５μｇの断片を装入したＲｅａｄｙｔｏＧｏ連結キット（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて行った。連結した物質をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＥｔＯＨで２回沈降させ、１０μｌのＨ₂Ｏに溶解した。１０回のＥ．ｃｏｌｉＴＧ１（各１μｌ）への電気形質転換により、１×１０⁷個のアンピシリン耐性形質転換細胞を得た。３７℃で一晩増殖させた後、形質転換細胞のアリコート（２ｍｌ）をＭＯ１５０でヘルパーファージＲ４０８に感染させ、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、感染細胞を１００ｍｌの０．５％軟質寒天と混合し、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む２０個のＬＡプレート上に注いだ。一晩インキュベートした後、１００ｍｌのＬＢ中の軟質寒天を３時間激しく振盪して、ファージ粒子を溶離した。懸濁液を４０，０００ｇで１０分間遠心し、上清を滅菌濾過し、ストックをアリコートに分けて凍結し、これらアリコートをパンニングに用いた。遠心及び滅菌濾過後、Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞に感染させ、次いで、アンピシリンを含むＬＡプレート上で平板培養してライブラリーの力価を測定した。パンニング手順：マイクロタイターウエル（Ｍａｘｉｓｏｒｐ．Ｎｕｎｃ）を、ヒトＩｇＧ（１００μｇ／ｍｌ、ＰｈａｒｍａｃｉａＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ヒト血清アルブミン（１００μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｕｉｓ．ＵＳＡ）、フィブロネクチン（１００μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ又はＢｉｏｎａｌＬｔｄ，Ｅｓｔｏｎｉａ）又はフィブリノーゲン（１００μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）でコートでブロックした。３つのウエルそれぞれに２００μｌのライブラリーを加え、室温で４時問インキュベートした。そ５０ｍＭクエン酸ナトリウム／１４０ｍＭＮａＣｌｐＨ５．５で２回徹底的に洗浄し、最後に結合したファージを同一緩衝液中でｐＨを低下させながら（３．７及び２．１）で段階的に溶離した。３つのウエルからの溶離物をプールし、２ＭＴｒｉｓｐＨ８．７で中和した。溶離物のアリコートにＥ.ｃｏｌｉＴＧ１細胞を感染させ、次いで、これを、２％グルコース及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを補ったＬＡプレート（１．５％寒天を含むＬＢ培地）上で一晩増殖させた。ＴＧ１細胞に一次パンニングでｐＨ３．７及び２．１で溶離したファージを感染させた後で得られたコロニーを捕集し、富化ストックを調製するために、ヘルパーファージＲ４０８（１０¹⁰ｐｆｕ）に感染させた。その後、感染細菌を５ｍｌの０．５％軟質寒天と混合し、アンピシリンを含むＬＡプレート上にまいた。一晩インキュベートした後、５ｍｌ中の軟質寒天を３時間激しく振盪して、ファージ粒子を溶離した。懸濁液を４０，０００ｇで１０分遠心し、上清を滅菌濾過し、上記のパンニング用のストックとして用いた。この手順を日常的に行って、１ｍｌ当たり１０⁹ 〜１０¹⁰コロニー形成単位（ｃｆｕ）のファージミド力価を得た。発現装入物のヌクレオチド配列決定：Ｗｉｚａｒｄｓ（商標）Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、プラスミドＤＮＡを作製し、その配列を実施例１に記載のようにして決定した。ＩｇＧ結合の同定：これは、実質的に実施例１と同じように行ったが、但し、検出には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識したＩｇＧを用いた。結果及び説明遺伝子VIIIベクター及びファージライブラリーの構築：実施例１に示されているデータは、機能性ｐIII融合ペプチドを発現させるにはリボソームの滑りが必要であることを示した。予想融合ペプチドの前にＨｉｓ標識を挿入するのが、Ｈｉｓ標識を含む融合ペプチドを確実に得るための安全な方法である。ｐＧ８Ｈ６ベクターを用い、約３００〜８００ｂｐの範囲の大きさの断片を有するＳ.ａｕｒｅｕｓ８３２５−４由来の染色体ＤＮＡからライブラリーを構築した。得られたライブラリーは、１０⁷個のクローンからなり、ヘルパーファージに感染させた後では、２×１０¹⁰ｃｆｕの力価を有していた。種々のリガンドに対するライブラリーのパンニング：パンニングを数回繰り返したが、１つの典型的な実験から得られた結果を表５に示す。１００〜１０００ｃｆｕに対応する、ｐＨ２．１及び３．７で溶離したファージの画分をＥ．ｃｏｌｉＴＧ１細胞の感染に用い、特定のリガンドに特異的なファージストックを得、これを、２回目のパンニングに用いた。パンニングでの富化がリガンドに対する親和選択によるものであり、ファージとプラスチックとの非特異的相互作用によるものではないことを確認するために、各ストックを特異的リガンド及び２つの独立リガンドに対して再パンニングした。表５の結果は、一次パンニングと同じリガンドに対して再パンニングすると、多大な集積が得られ得ることを示している（ＩｇＧ及びフィブリノーゲン、溶離されたファージミド粒子数が１０⁴〜１０⁵倍に増大）。これは特異的な富化である。というのは、非関連リガンドに対してパンニングした同じファージストックでは結合ファージミド粒子の数が１０００倍以上も少なかったからである。しかし、フィブロネクチンに対する種々のパンニング及びその後の再パンニングにより、結合ファージミド粒子の数は著しく増大した。フィブロネクチンに対して再パンニングした後では、結合ファージミド粒子の数は、約５倍と極くわずかしか増大しなかったが、非関連リガンドに対してパンニングした同じファージストックでは、結合ファージミド粒子の数は著しく少なく、これは結合が特異的であることを示唆している。ＨＳＡに対して一次パンニングした後では、わずか数個のファージミド粒子が溶離されたに過ぎず、再パンニングしてもその数はさして増加しなかったが、これは、細菌が特異的受容体をコードしないリガンドに対してパンニングを行っても富化が生じないことを示唆している。ＩｇＧに対する一次及び二次パンニングの後、溶離ファージに感染させて得られたアンピシリン耐性菌クローンをペルオキシダーゼ標識ＩｇＧとの結合についてスクリーニングした。結果は解釈が難しく、実施例１と同様なスクリーニングの場合とは明らかに異なっていた。一次パンニングの後で得られた数個のコロニーを標識ＩｇＧの結合についてアッセイすると、明瞭且つ強力なシグナルが得られた。しかし、数個のコロニーは、バックグラウンドから見分けにくい弱い結合能しか有していないようであった。二次パンニング後に得られたコロニーのスクリーニングでは、実施例１に示されている結果とは反対に、殆ど１００％のコロニーから弱いＩｇＧ結合シグナルが得られた（データは示さず）。親和選択されたクローンのヌクレオチド配列分析：それぞれＩｇＧ、フィブリノーゲン及びフィブロネクチンに対して二次パンニングした後で１６個のコロニーをランダムに取り出して、配列分析した。表５を参照されたい。ＩｇＧ結合クローンの場合、１６個の挿入断片中１６個がブドウ球菌のプロテインＡをコードする遺伝子由来であった。フィブリノーゲン結合クローンの場合は、１６個中１３個が公知のフィブリノーゲン結合タンパク質をコードする挿入断片を含んでおり、そのうちの１個はｆｉｂ遺伝子を表し、残りの１２個のクローンはｃｏａ遺伝子を表していた９９４）５９９−６０６及びＭｃＤｅｖｉｔｔら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１（１９９４）２３７−２４８〕。フィブロネクチンの場合、対応数は１６個中１２個であり、ｆｎｂＡ遺伝子は１１個のクローンで表され、ｆｎｂＢ遺伝子は１個のクローンで表されていた。興味深いことには、正しい挿入断片を有する４１個のクローンの中唯一つが実施例１に記載のように挿入断片とベクターとの間の読み取りフレームのシフトを有している。他のクローンは全て挿入断片とｃ−ｍｙｃ標識との間で結合した正しい読み取りフレームを有している。しかし、挿入断片を入れるＰｅｌＢリーダーからの読み取りフレームはこれらのどの場合にもフレーム外にある、即ち、ベクター中のＰｅｌＢ配列と挿入断片との間の読み取りフレームに＋１又は−１のシフトが存在する。この結果は予想外であり、実施例１におけるように、ベクター配列と結合した挿入断片の正しい読み取りフレームを有するクローンに対する強力な選択が存在することを示唆している。パンニングに用いた種々のリガンドに対する結合親和性を有するポリペプチドを発現するクローンを確実に選択するために、挿入断片は、主要コートタンパク質との融合の際に発現し、それによってファージ表面に位置する筈である。恐らく、リボソームの滑りがこの現象に対する説明であり（実施例１参照）、該現象は、出発ベクター中にＨｉｓ標識として挿入された６個の同一タンデムコドンによって引き起こされ得る。さらに、該ベクターの構築により、Ｓｍａｌ部位に一列の４個のシトシンが形成された。なぜ遺伝子IIIを遺伝子VIII と取り換えると、挿入断片の外でなく挿入断片内に正しくない読み取りフレームを有するクローンに対する選択が生ずるかは説明できないが、この結果は、ＩｇＧに対する一次パンニングの後では、結合活性が強いクローンも弱いクローンも検出されるが、二次パンニングの後では、殆ど全てのクローンが極く弱い結合活性しか示さなかったという本出願人の知見とびったり一致する。この弱い結合能は、プロテインＡのいくつかのＩｇＧ結合リピートを含んでいるために低親和性を有するポリペプチドが発現されるからではなく、むしろ、リボソームの滑りが挿入断片によりコードされるポリペプチドの発現に必要だからである。さらに、本出願人は、一次パンニングの後でＨＲＰ標識ＩｇＧに対して強力なシグナルを生成した５個のクローンの配列決定をしたが、これらの場合、挿入断片は、ＰｅｌＢリーダーと結合した正しい読み取りフレームを有しているか、又は発現を調節する挿入断片自身の内在プロモーターを有していた。

Claims

【特許請求の範囲】１．所定構造に対して生物特異的親和性を有する１個以上のペプチドを同定する方法であって、（ｉ）クローン化遺伝子、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ断片をヘルパーファージの表面タンパク質の遺伝子と融合させる際に連結させてファージ／ファージミドライブラリーを作成する段階、及び（ii）所定構造に結合するファージ粒子を選択する段階を含む前記方法。２．断片が、例えば、音波処理によってＤＮＡをランダム切断することにより作製されたことを特徴とする、請求項１に記載の方法。３．ＤＮＡ断片の起源のｃＤＮＡが、単一又は多細胞生物、例えばヒトのような哺乳動物のｍＲＮＡの逆転写により得られ、その場合、該ｍＲＮＡは特に特定の組織から誘導され得ることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。４．ＤＮＡ断片が、２０〜１０，０００塩基対の範囲の大きさを有することを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。５．ＤＮＡ断片が連結されたファージ／ファージミドが、（ａ）ＤＮＡ断片の挿入部位の前又は後に位置し、且つ（ｂ）該ＤＮＡ断片の挿入により読み取りフレームにシフトが生じても該挿入断片及び表面タンパク質をコードするヌクレオチド配列の読み取りフレームを正しく確保する滑り配列を有することを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。６．滑り配列が、縦列の３個、４個又はそれ以上の反復同一塩基、ハングリーコドン、タンデムハングリーコドン及び／又はタンデムコドンを有することを特徴とする、請求項５に記載の方法。７．ファージ／ファージミドが、挿入されたＤＮＡ断片と表面タンパク質をコードする配列との間にアンバー終止配列を有することを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。８．融合遺伝子が、ファージミド又はその修飾形上に位置し、該ファージミドが、Ｅ．ｃｏｌｉ中でファージ粒子を産生させるために天然形態の表面タンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージと組み合わせて用いられ、但し、該ファージ／ファージミドがアンバー終止配列を含む場合には、宿主細胞はアンバー抑制性のＥ．ｃｏｌｉ株であることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。９．生物特異的親和性により所定構造に結合するペプチドを産生させる方法であって、（ｉ）該構造に結合するペプチドを請求項１から８のいずれか一項に記載の方法により同定し、その後で、 (ii)所定構造に結合する能力を有する同定ペプチド又はその修飾形を産生させることを特徴とする前記方法。１０．選択されたペプチドをコードするヌクレオチド配列又はその変性変異体を適切な宿主細胞中で発現させることを特徴とする、請求項９に記載のポリペプチドを産生させる方法。１１．各メンバーが、ファージに対して異種であり且つクローン化遺伝子、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ由来であるＤＮＡ断片に融合した表面タンパク質の遺伝子を有し、該断片によりコードされるペプチドが個々のファージ粒子メンバーの表面上で表面タンパク質との融合の際に暴露されることを特徴とするファージ／ファージミドライブラリー。１２．ファージミドライブラリーであることを特徴とする、請求項１１に記載のライブラリー。１３．ファージ粒子ライブラリーであることを特徴とする、請求項１２に記載のライブラリー。１４．ＤＮＡ断片が、例えば音波処理により、クローン化遺伝子、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを切断することにより得られ、該ｃＤＮＡが、例えば、ヒトを含む哺乳動物のような単一又は多細胞生物の特定の組織由来のｍＲＮＡの逆転写により得られたことを特徴とする、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のライブラリー。１５．ＤＮＡ断片の大きさが、２０〜１０，０００塩基対の範囲内で選択されることを特徴とする、請求項１１から１４のいずれか一項に記載のライブラリー。１６．融合遺伝子が、（ａ）ＤＮＡ断片の挿入位置の前又は後に位置し、且つ（ｂ）該ＤＮＡ断片の挿入により読み取りフレームにシフトが生じても該挿入断片及び表面タンパク質をコードするヌクレオチド配列の読み取りフレームを正しく確保する滑り配列を含むことを特徴とする、請求項１１から１５のいずれか一項に記載のライブラリー。１７．滑り配列が、３個、４個又はそれ以上の逐次反復される同一塩基、又は縦列の数個の同一コドン若しくはハングリーコドンを有することを特徴とする、請求項１５に記載のライブラリー。１８．融合遺伝子が、挿入されたヌクレオチド配列と表面タンパク質をコードする配列との間にアンバー終止配列を有することを特徴とする、請求項１１から１５のいずれか一項に記載のライブラリー。