JPH10501130A - Ｃ型肝炎ウイルスアシアロ糖タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ２つのＣ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質(Ｅ１およびＥ２)は、シアル化されることなく発現される。末端グリコシル化がブロックされる下等真核生物または哺乳動物細胞におけるこれらのタンパク質の組換え発現により、天然のHCV糖タンパク質により類似する組換えタンパク質か得られる。GNAレクチン親和性により単離される場合、Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質はウイルス様粒子に凝集する。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ型肝炎ウイルスアシアロ糖タンパク質技術分野 本発明は、組換えタンパク質の発現およびウイルス学の一般的分野に関する。 さらに詳細には、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染の診断、処置、お よび予防に有用な糖タンパク質、ならびにこのような糖タンパク質の生産方法に 関する。背景技術 非Ａ型、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）は、ウイルスによって誘発されると考えら れている伝染性疾患（あるいは疾患のファミリー）であり、Ａ型肝炎ウイルス（ ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、サイ トメガロウイルス（ＣＭＶ）、あるいはエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に 起因する肝疾患などの、他の形態のウイルス関連肝疾患とは区別される。伝染病 学的証拠によりＮＡＮＢＨには３つの型があり得ることが示されている。すなわ ち、水に起因する伝染型；血液あるいは針に関連する型；および、散発的に発生 する集団獲得型。多くの原因因子は未知である。しかし最近、新種ウイルスであ るＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が、血液に起因するＮＡＮＢＨ（ＢＢ−ＮＡＮＢ Ｈ）の主要原因（もし原因がこれだけでなければ）として同定された。例えば、 PCT WO89/046699および米国特許出願第07/355,002号（1989年5月18日出願）を参 照のこと。Ｃ型肝炎は、アメリカ合衆国、ヨーロッパおよび日本を含む多くの国 あるいは地域で、輸血関連肝炎の主要形態であるようだ。さらに、ＨＣＶに関連 する肝細胞癌の誘発の証拠も存在する。従って、ＨＣＶ感染の効果的な予防法お よび処置方法の必要性が存在する。 ＨＣＶキャリア、およびＨＣＶに汚染された血液あるいは血液製剤をスクリー ニングおよび同定するための感度の高い特異的な方法の要求が高まっている。輸 血後肝炎（ＰＴＨ）が、輸血患者の約１０％に発生し、この場合の９０％までは ＨＣＶに起因する。この疾患の主要な問題は、慢性肝障害への常習的な進行であ る（２５−５５％）。 患者の世話、ならびに血液および血液製剤による、あるいは患者との密接な接 触によるＨＣＶの伝染の予防には、ＨＣＶに関連する核酸、抗原および抗体の検 出のための信頼し得る診断ならびに予後手段が必要とされる。さらに、この疾患 を予防および／あるいは処置するための有効なワクチンおよび免疫治療的治療剤 の必要性もまた存在する。 ＨＣＶは、他の感染性ウイルスに比較して非常に低率で感染個体の血液中に存 在し、このことはこのウイルスの検出を非常に困難にしている。このウイルスが 低率で存在することが、おそらく、長い間ＮＡＮＢ型肝炎の原因因子が検出され なかった主な理由である。現在ではクローン化されてはいるが、ＨＣＶはいまだ に培養および増殖は困難である。従って、診断／治療／予防用のＨＣＶタンパク 質を生産する組換え法の必要性が強い。発明の開示 ２種のＨＣＶタンパク質、Ｅ１およびＥ２は、組換え系において発現されると きには、膜結合のアシアロ糖タンパク質であるようであることが発見された。糖 タンパク質は通常、哺乳類中ではマンノース末端形態ではなく、さらに他の炭水 化物で修飾されていて、マンノース末端化形態は、一般的には単に一過的なもの であるので、このことは予想外のことである。Ｅ１およびＥ２の場合（本発明者 らの系において発現されるとき）には、アシアロ糖タンパク質は、最終形態であ るようだ。Ｅ１（エンベロープタンパク質１）は、ＨＣＶゲノムの推定Ｅ１領域 から翻訳される分子量約３５ｋＤの糖タンパク質である。Ｅ２（エンベロープタ ンパク質２）は、ＨＣＶフラビウイルスモデルに基づく、ＨＣＶゲノムの推定Ｎ Ｓ１（非構造タンパク質１）領域から翻訳される、分子量約７２ｋＤの糖タンパ ク質である。ウイルス性糖タンパク質は、しばしば高免疫原性であるので、Ｅ１ およびＥ２は、イムノアッセイおよび治療／予防ワクチンに使用されるのにまさ に適したものである。 Ｅ１およびＥ２がシアル化されていないことの発見は重要である。タンパク質 の特定の形態は、多くの場合、細胞が組換え発現用の適当な宿主として働き得る ように指令する。E．coliなどの原核生物は、タンパク質をグリコシル化せず、 そして一般的には、抗原としての使用のために糖タンパク質を産生するのには適 していない。その理由は、グリコシル化はしばしば、タンパク質の完全な抗原性 、可溶性、ならびに安定性に対して重要であるからである。酵母ならびに真菌の などの下等真核生物は、タンパク質をグリコシル化するが、一般には、炭水化物 複合体には末端シアル酸残基を付加できない。従って、酵母由来のタンパク質は 、それらの天然（組換え体ではない）のタンパク質とは抗原としては区別され得 る。組換えタンパク質のグリコシル化は野生ウイルスタンパク質のグリコシル化 に非常に類似しているので、哺乳動物細胞での発現は、産生物の抗原性が重要で ある応用に好ましい。 ＨＣＶウイルスが、肝細胞上に見い出されるアシアロ糖タンパク質レセプター 、あるいは肝内皮細胞およびマクロファージ（特に、クッペル（Kupffer）細胞 ）上に見い出されるマンノースレセプターを介して感染の際に宿主細胞への入口 を得ることができるという新たな証拠が示された。驚くべきことに、天然のＥ１ およびＥ２塊は、末端シアル酸残基を有さず、コアグリコシル化のみなされるこ とが発見された。小画分は末端Ｎ−アセチルグルコサミンをさらに含む。従って 、本発明の目的は、全末端シアル酸残基あるいは実質的に全ての末端シアル酸残 基を欠く、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質を提供することである。 本発明の他の局面は、例えば、分泌または放出を促進する抗生物質を使用して の酵母での発現、あるいは哺乳動物細胞における発現による、末端シアル酸付加 を阻害する条件下でアシアロＥ１あるいはＥ２を産生する方法である。 本発明のもう一つの局面は、末端マンノース残基あるいは末端Ｎ−アセチルグ ルコサミン残基に結合する、レクチンに対する親和性によるＥ１あるいはＥ２の 精製方法である。 本発明のもう一つの局面は、免疫原性組成物であり、これは、薬学的に受容可 能な賦形剤と組み合わせた、ＨＣＶ Ｅ１およびＥ２からなる群より選択される 組換えアシアロ糖タンパク質を含む。所望で有れば、必要に応じて、免疫学的ア ジュバントが含まれ得る。 本発明のもう一つの局面は、イムノアッセイ試薬であり、これは適切な支持体 と組み合わせた、ＨＣＶ Ｅ１およびＥ２からなる群より選択される組換えアシ アロ糖タンパク質を含む。本発明の他のイムノアッセイ試薬は、適切な検出標識 と組み合わせた、ＨＣＶ Ｅ１およびＥ２からなる群より選択される組換えアシ アロ糖タンパク質を含む。 本発明のもう一つの局面は、Ｅ１および／あるいはＥ２のダイマーおよび高次 凝集体（higher-order aggregates）に関する。本発明の１種はＥ２複合体であ る。本発明の他の種は、Ｅ１：Ｅ２ヘテロダイマーである。 本発明のもう一つの局面は、Ｅ１：Ｅ２凝集体および薬学的に受容可能なキャ リアを含むＨＣＶワクチン組成物である。 本発明のもう一つの局面は、Ｅ１：Ｅ２複合体の精製方法である。発明の実施の態様 Ａ．定義 用語「アシアロ糖タンパク質」とは、実質的にシアル酸成分を含まないグリコ シル化タンパク質のことである。アシアロ糖タンパク質は、組換え、あるいは、 細胞培養または天然源からの精製により調製され得る。現在好ましいアシアロ糖 タンパク質は、ＨＣＶ、好ましくは糖タンパク質Ｅ１およびＥ２、最も好ましく は組換えＥ１およびＥ２（ｒＥ１およびｒＥ２）由来である。シアル酸残基の量 が、実質的に糖タンパク質の、ＧＮＡのなどのマンノース結合タンパク質への結 合を阻害しない量であれば、この定義範囲内では、タンパク質は、シアル酸を「 実質的に含まない」。シアル化の程度は一般的には、全Ｎ末端結合炭水化物の約 ４０％未満がシアル酸であり、より好ましくは約３０％未満であり、より好まし くは約２０％未満であり、より好ましくは約１０％未満であり、より好ましくは 約５％未満であり、最も好ましくは約２％未満である場合に得られる。 本明細書に使用されている用語「Ｅ１」は、ＨＣＶポリタンパク質の最初の４ ００アミノ酸以内に発現されるタンパク質あるいはポリペプチドのことであり、 ときにはＥあるいはＳタンパク質と呼ばれる。これは、その天然形態において、 膜に強く結合されていることが見いだされる、３５ｋＤの糖タンパク質である。 ほとんどの天然のＨＣＶ株では、Ｅ１タンパク質は、ウイルスポリタンパク質中 でＣ（コア）タンパク質の後にコードされる。Ｅ１タンパク質は、全長ポリタン パク質の約１９２アミノ酸から約３８３アミノ酸に広がる。本明細書に使用され ている用語「Ｅ１」には、天然Ｅ１と免疫学的に交差反応性であるアナログおよ び先端切断型変異体もまた含まれる。 本明細書に使用されている用語「Ｅ２」は、ＨＣＶポリタンパク質の最初の９ ００アミノ酸以内に発現されるタンパク質あるいはポリペプチドのことであり、 ときにはＮＳ１タンパク質と呼ばれる。これは、その天然形態において、膜に強 く結合されていることが見いだされる、７２ｋＤの糖タンパク質である。ほとん どの天然のＨＣＶ株では、Ｅ２タンパク質はＥ１タンパク質に続く。Ｅ２タンパ ク質は、約３８４アミノ酸から約８２０アミノ酸に広がる。本明細書に使用され ている用語「Ｅ２」には、天然Ｅ２と免疫学的に交差反応性であるアナログおよ び先端切断型変異体もまた含まれる。 本明細書に使用されている用語「凝集体」とは、１つより多いＥ１あるいはＥ ２モノマーを含む、Ｅ１および／またはＥ２の複合体のことである。Ｅ１：Ｅ１ ダイマー、Ｅ２：Ｅ２ダイマーならびにＥ１：Ｅ２ヘテロダイマーは、すべてこ の定義の範囲内の「凝集体」である。本発明の組成物はまた、より大きな凝集体 を含み得、８００ｋＤを越える分子量を有し得る。 本明細書に使用されている用語「粒子」とは、電子顕微鏡により見える、少な くとも２０ｎｍの直径を有する、Ｅ１、Ｅ２、あるいはＥ１／Ｅ２凝集体のこと である。好ましい粒子は、電子顕微鏡によって認められ、ほぼ円形形状で約４０ ｎｍの直径を有する。 本明細書中でタンパク質に適用されている用語「精製された」とは、所望のタ ンパク質が、組成物中の総タンパク質成分の少なくとも３５％を含む組成物のこ とである。所望のタンパク質は、総タンパク質成分の好ましくは少なくとも４０ ％、さらに好ましくは少なくとも約５０％、さらに好ましくは約６０％、さらに 好ましくは少なくとも約７０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、さらに 好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％を構 成する。この組成物は、本明細書に使用される純度の決定に影響しない、炭水化 物、塩、脂質、溶媒などの他の化合物を含み得る。「単離された」ＨＣＶアシア ロ糖タンパク質とは、純度が少なくとも３５％のＨＣＶアシアロ糖タンパク質組 成物を意味する。 本明細書に使用されている「マンノース結合タンパク質」とは、レクチンある いはマンノース末端グリコシル化タンパク質（例えば、アシアロ糖タンパク質） に特異的に結合する他のタンパク質のことを意味し、これらの例には、マンノー ス結合レクチン、マンノース末端グリコシル化に特異的な抗体、マンノースレセ プタータンパク質（R．A．B．Ezekowitzら、J Exp Med（1990）176:1785-94）、 アシアロ糖タンパク質レセプタータンパク質（H．Kurataら、J Biol Chem（1990 ）265:11295-98）、血清マンノース結合タンパク質（I．Schuffeneckerら、Cyto genet Cell Genet （1991）56:99-102; K.Sastryら、J Immunol(1991)147:692-97 ）、血清アシアロ糖タンパク質結合タンパク質などが含まれる。マンノース結合 レクチンには、例えば、ＧＮＡ、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）ならびに同様の 結合性を有する他のレクチンが含まれる。 用語「ＧＮＡレクチン」とは、マンノース末端糖タンパク質に結合する市販の レクチン、Galanthus nivalusアグルチニンのことである。 本明細書に使用されている「組換え」糖タンパク質は、組換えポリヌクレオチ ドから発現される糖タンパク質であり、糖タンパク質をコードする構造遺伝子は 、天然ではこの構造遺伝子に隣接していない調節配列の制御下に発現されるか、 あるいはその構造遺伝子は改変されている。例えば、Ｅ１構造遺伝子が、酵母グ リセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモー ターの機能性フラグメントの制御下に配置されたベクターを形成し得る。酵母で の使用に好ましい現在のプロモーターは、米国特許第4,880,734号（本明細書中 で参考として援用される）に記載のハイブリッドＡＤＨ２／ＧＡＰプロモーター であり、これは、アルコールデヒドロゲナーゼ２由来の上流の活性化配列と組み 合わせてＧＡＰＤＨプロモーターのフラグメントを利用する。構造遺伝子の改変 には、縮重コドンでの別のコドンの置換（例えば、宿主に好ましいコドンの使用 、制限酵素切断部位の削除あるいは形成、ヘアピン形成の制御など）、ならびに 異なるアミノ酸をコードする限定数のコドンの置換、挿入あるいは欠失（天然ア ミノ酸配列の数の、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満が変え られるべきである）などが含まれる。同様に、「組換え」レセプターとは、組換 えポリヌクレオチドから発現されたレセプタータンパク質のことであり、レセプ ターをコードする構造遺伝子は、天然では構造遺伝子に隣接しない調節配列の制 御 下に発現されるか、あるいはその構造遺伝子は改変されている。 用語「単離されたポリペプチド」とは、他のＨＣＶウイルス成分、特にポリヌ クレオチドを実質的に含まないポリペプチドのことてある。組成物中のポリペプ チドの重量が、そのポリペプチドと他の成分と合わせた重量の少なくとも７０％ 、より好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは約９０％、そして最も 好ましくは９５％あるいはそれ以上である場合には、ポリペプチド組成物は、他 の成分を「実質的に含まない」。例えば、１００μｇ／ｍｌのＥ１および３μｇ ／ｍｌのみの他のＨＣＶ成分（例えば、ＤＮＡ、脂質など）を含む組成物は、「 他のＨＣＶウイルス成分」を実質的に含まず、従って、この定義の範囲内の単離 ポリペプチドの組成物である。 用語「分泌リーダー」とは、タンパク質のＮ末端でコードされるときに、翻訳 後に宿主細胞培養培地中にそのタンパク質を分泌されるようにするポリペプチド のことである。分泌リーダーは、一般的に使用される宿主細胞に由来する。例え ば、酵母での使用に適した分泌リーダーには、Saccharomyces cerevisiae α因 子リーダー（米国特許第4,870,008号（本明細書中で参考として援用される）を 参照のこと）が含まれる。 用語「下等真核生物」とは、酵母、真菌などの宿主細胞のことである。下等真 核生物は、一般的に（必ずというわけではないが）単細胞である。好ましい下等 真核生物は酵母であり、特に、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Kluverom yces 、Pichia、Hansenulaなどの種である。Saccharomyces cerevisiae、 S ．car lsbergensis およびK ．lactisは、最も一般的に使用される酵母宿主ならびに便利 な真菌宿主である。 用語「高等真核生物」とは、哺乳類、ハ虫類、昆虫類などの高等動物由来の宿 主細胞のことである。現在好ましい高等真核宿主細胞は、チャイニーズハムスタ ー（例えば、ＣＨＯ）、サル（例えば、ＣＯＳ細胞）、ヒトおよび昆虫（例えば 、Spodoptera frugiperda）由来である。宿主細胞は、懸濁あるいはフラスコ培 養、組織培養、器官培養などで供給され得る。 用語「カルシウムモジュレーター」とは、小胞体内にカルシウムイオンを隠ぺ いあるいは結合し得るか、あるいはカルシウム調節タンパク質（例えば、カルシ ウムチャンネルタンパク質、カルシウムポンプなど）に作用することによりＥＲ 内のカルシウムイオン濃度に影響する化合物のことである。適切なカルシウムモ ジュレーターには、例えば、サプシガルジン（thapsigargin）、ＥＧＴＡ（エチ レングリコールビス［β−アミノエチルエーテル］Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ アセティックアシド）が含まれる。現在好ましいモジュレーターは、サプシガル ジンである（例えば、O．Thastrupら、Proc Nat Acad Sci USA（1990）87:2466- 70を参照のこと）。 用語「免疫原性」とは、アジュバントの存在下あるいは非存在下で、単独ある いはキャリアと結合して、体液性および／または細胞性免疫応答を生じる基質の 能力のことである。「中和」とは、感染性因子の感染性を部分的に、あるいは完 全に抑制する免疫応答のことである。「ワクチン」とは、ＨＣＶに対する、部分 的あるいは完全な防御を誘起し得る、個体の処置に有用な免疫原性組成物のこと である。 用語「生物学的液体」とは、血清、血漿、唾液、胃分泌物、粘液などの、生物 から得られる液体のことである。一般的には、生物学的液体は、ＨＣＶ粒子の存 在についてスクリーニングされる。ある種の生物学的液体は、血液凝固因子（例 えば、因子VIII：Ｃ）、血清アルブミン、成長ホルモンなどの他の産生物供給源 として使用される。このような場合には、元の生物学的液体がＨＣＶなどのウイ ルスに汚染されていないことが重要である。 Ｂ．一般的な方法 ＨＣＶゲノムのＥ１領域は、欧州特許第388,232号に「Ｅ」領域として、そし て一方Ｅ２は「ＮＳ１」として記載されている。Ｅ１領域は、全長ウイルスポリ タンパク質中の約１９２−３８３アミノ酸を有する。Ｅ２領域は、約３８４−８ ２０アミノ酸を有する。これらのタンパク質の原型の全配列（ＨＣＶ−１株）は 、タンパク質の一般的なクローニングおよび発現法と同様に、当該分野では入手 可能である（欧州特許第388,232号を参照のこと）。Ｅ１およびＥ２の両方は、 ＨＣＶポリタンパク質の最初の８５０−９００アミノ酸をコードするポリヌクレ オチドから発現され得る。ほとんどの真核宿主細胞中では翻訳後のプロセッシン グ で、最初のポリタンパク質が、Ｃ、Ｅ１およびＥ２に切断される。コード領域の ５’末端を切断して、産生されるＣタンパク質量を減少し得る。 アシアロ糖タンパク質の発現は、多くの方法によりなされ得える。例えば、通 常はグリコシル化タンパク質にシアル酸残基を付加しない下等真核生物（酵母な ど）中での発現が得れ得る。酵母発現系においては、タンパク質が翻訳後に培養 培地中に発現されるように、S．cerevisiae α因子リーダーなどの分泌リーダー を使用することが好ましい。さらに、ｐｍｒ１などのグリコシル化欠損変異体を 使用することが好ましい。なぜなら、これらの変異体は、コアグリコシル化のみ 行い、かなり高効率に異種タンパク質を分泌することが多いからである（H．K． Rudolphら、Cell（1989）58:133-45）。あるいは、Pichia pastorisなどの他の 種の酵母を使用し得る。これは、哺乳類およびS．cerevisiaeに見られるコアグ リコシル化様式に類似すると考えられている様式で、８〜９マンノース残基を有 する糖タンパク質を発現する。 あるいは、哺乳類細胞中の発現を調整して末端グリコシル化（シアル酸付加） をブロックし得る。組換え構築物は、タンパク質が小胞体へ方向づけられること を確実にするために、好ましくは分泌シグナルを含む。ゴルジ体への移送は、Ｅ １およびＥ２自身でブロックされるようである。哺乳類細胞でのＥ１あるいはＥ ２の高レベルの発現は、小胞体あるいはｃｉｓゴルジ体での全ての細胞タンパク 質の分泌を妨げるようである。さらに、グリコシル化欠損変異体を使用し得る。 例えば、P．Stanley，Ann Rev Genet（1984）18:525-52を参照のこと。グリコシ ル化あるいは移送変異体が、シアル化を伴ってＥ１あるいはＥ２を発現する場合 には、ノイラミニダーゼによる処理によって末端シアル酸残基を除去し得る。 収量は、小胞体内からのタンパク質の放出を得るためのカルシウムモジュレー ターの使用により増加されるべきである。適切なモジュレーターには、タプシガ ルギン（thapsigargin）、ＥＧＴＡ、ならびにＡ２３８１７（例えば、O．Thast rupら、Proc Nat Acad Sic USA（1990）87:2466-70を参照のこと）が含まれる。 例えば、組換えワクシニアウイルスベクターによるトランスフェクションにより 、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳならびにＨｅＬａ細胞など）の細胞内に 多量のＥ１あるいはＥ２を発現させ得る。タンパク質の発現および小胞体内への 蓄 積のための時間を置いた後、ＥＲ内容物の放出を起こすのに十分な濃度のカルシ ウムモジュレーターに細胞を曝す。次に、培養培地からタンパク質を回収し、培 地は次のサイクル用に取り替える。 さらに、先端切断型のエンペロープタンパク質を発現させるのが好都合であり 得る。Ｅ１およびＥ２の両方は、高疎水性ドメインを有するようであり、これは 明らかにタンパク質を小胞体内に固定し、そして効率よい放出を妨げる。従って 、Ｅ１の１７０−１９０アミノ酸、２６０−２９０アミノ酸あるいは３３０−３ ８０アミノ酸（ポリタンパク質のはじめからの番号）の１つ以上の領域、ならび にＥ２の６６０−８３０アミノ酸（例えば、欧州特許第388、232号の図２０−１ を参照）の配列の部分を欠失することが望まれ得る。これらの疎水性ドメインの 少なくとも１つは、そのタンパク質の抗原性に必須ではなく、それゆえ不利な影 響もなく欠失し得る、トランスメンブラン領域を形成する。欠失に最も適した領 域は、当業者の技術範囲内で少数の欠失実験の実施により決定し得る。Ｅ２の疎 水性３’末端の欠失により、発現されたＥ２部分の分泌される。このとき、分泌 されたタンパク質のシアル化をともなう。 発現を得るために種々の任意のベクターが使用され得る。酵母などの下等真核 生物は、典型的には、カルシウムリン酸沈澱法を用いてプラスミドにより形質転 換されるか、あるいは組換えウイルスにより形質転換される。ベクターは、独立 して宿主細胞内で複製され得るか、あるいは宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。 より高等な真核生物は、プラスミドにより形質転換され得るが、典型的には組換 えウイルス、例えば、組換えワクシニアウイルスに感染される。ワクシニアによ る感染は、宿主細胞タンパク質の発現を停止させ得るので、ワクシニアが特に好 ましい。まさに好ましい宿主細胞には、ＨｅＬａならびに形質細胞腫（plasmacy toma）細胞株が含まれる。この系では、宿主ＥＲ中に主要なグリコシル化種とし てＥ１およびＥ２が蓄積することを意味する。ｒＥ１およびｒＥ２は、マンノー ス末端化されている主要な糖タンパク質であるので、末端マンノース残基に結合 するGalanthus nivalusアグルチニン（ＧＮＡ）などのレクチンを使用して細胞 から容易に精製され得る。 マンノース末端化糖タンパク質として天然に発現されるタンパク質は、哺乳動 物生理学上比較的まれである。ほとんどの場合において、哺乳動物の糖タンパク 質は、グリコシル化経路ての一過的な中間産物としてのみマンノース末端化され ている。組換え的に発現されたＨＣＶエンベロープタンパク質がマンノース末端 グリコシル化、あるいは（より低い程度の）Ｎ−アセチルグルコサミンを有する 事実は、ＨＣＶタンパク質および全ビリオンが分離され、そして末端マンノース あるいはＮ−アセチルグルコサミンに特異的なレクチンを用いて、内因性タンパ ク質から部分的に精製され得ることを意味する。組換えタンパク質は真正であり 、成熱遊離ビリオンに見いだされるエンベロープタンパク質、あるいは細胞結合 エンベロープタンパク質の形態と本質的に同じであると考えられている。従って 、ＧＮＡなどのレクチンを、マンノース末端タンパク質、ならびにＷＧＡ（コム ギ胚芽アグルチニン）およびそのＮ−アセチルグルコサミン末端タンパク質の等 価物に対して使用し得る。例えばワクチンあるいはイムノアッセイに使用するた めに抗原を生成するときの精製のために、Ｅ１およびＥ２を、細胞培養上清およ び 結合させたレクチンを使用し得る。 あるいは、ＨＣＶ感染が疑われる被験体からの液体あるいは組織サンプルから 、Ｅ１、Ｅ２あるいはＨＣＶビリオンを単離するために適切なレクチンを供給し 得る。マンノース末端糖タンパク質は比較的まれであるので、このような手順は 、実質的にバックグラウンドを減少させて、試料中に存在するタンパク質を精製 するのに役立つ。レクチンに結合後、ＨＣＶタンパク質は抗ＨＣＶ抗体を用いて 検出され得る。あるいは、全ビリオンが存在する場合には、ＨＣＶゲノムの保存 領域（例えば、５’非コード領域）についてＰＣＲ技術または他の核酸増幅法を 用いてＨＣＶ核酸を検出し得る。この方法で、例えば、新しい株が抗体の調製に 使用される株と免疫学的交差反応性でない場合には、抗原の変動あるいは変化に 関わらずＨＣＶの異なる株の分離および特徴づけができる。特定のレクチンによ る、マンノース末端化糖タンパク質特有の認識を都合よく利用する多くの他の方 法がある。例えば、ＨＣＶビリオンあるいはタンパク質の含有が疑われる試料を 、ビオチンあるいはアビジン標識レクチンとインキュベートし、アビジンまたは ビオチンを用いてタンパク質−レクチン複合体を沈澱させ得る。さらに、治療上 の使 用のために、例えば、ＧＮＡに抗ウイルス化合物を結合することにより、化合物 をビリオンに標的づけるために、レクチンのＨＣＶタンパク質に対する親和性を 使用し得る。あるいは、血清または血漿からマンノース末端化糖タンパク質を除 去するために適切なレクチンを使用して、ＨＣＶ汚染の危険性を軽減あるいは解 消し得る。 固定化マンノース結合タンパク質、特にＣｏｎＡあるいはＧＮＡなどのレクチ ンとのインキュベーションにより、粗細胞溶解物からＥ１および／またはＥ２ア シアロ糖タンパク質を単離するのが現在好ましい。例えば、低張緩衝液中で機械 的に破砕して細胞を溶解し、その後遠心分離して核工程後の溶解物（post-nucle ar lysate）を調製し、さらに遠心分離して粗ミクロソーム膜画分を得る。次に 、粗膜画分をＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＮＰ４０などの界面活性剤を含む緩衝液 に可溶化する。この界面活性剤抽出物をさらに遠心分離により澄明化して不溶性 粒子を除き、得られた透明溶解物を、固定化マンノース結合タンパク質、好まし く るクラマトグラフィーカラム中で、結合に十分な時間の間、典型的には１６〜２ ０時間インキュベートする。次に、この懸濁物を、Ｅ１／Ｅ２が溶出液中に現れ るまでカラムにかけ、次に、結合に十分な時間の間、典型的には約１２〜２４時 間の間カラム中でインキュベートする。次に、結合された物質を界面活性剤（例 えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＮＰ４０など）を含む別の緩衝液で洗浄し、マ ンノースで溶出して、精製アシアロ糖タンパク質を供給する。溶出に際しては、 タンパク質が溶出物中に現れはじめるまでの間にのみ溶出するこが好ましく、そ の時点で溶出を停止し、そしてタンパク質の溶出を進める前にカラムを２〜３時 間平衡化させる。このことで、大きなタンパク質凝集体が徐々に離脱する速度に 対して十分な時間を与えると考えられる。Ｅ１およびＥ２が天然の形態（すなわ ち、膜結合ドメインの末端切断なしに）で共に発現される場合には、アシアロ糖 タンパク質の実質的な画分は、Ｅ１：Ｅ２凝集体として現れる。電子顕微鏡での 試験では、この凝集体の主要部分は、直径約４０ｎｍのだいたい球状の粒子であ り、これは完全なウイルスと予測される大きさである。これらの粒子は、自己構 築サブウイルス粒子（self-assemmbling subviral particles）であるようであ る。これらの凝集体は、真正ＨＣＶビリオン粒子に非常に類似した四次構造を示 すことが予測され、従って、高免疫原性ワクチンとして作用することが予測され る。 Ｅ１／Ｅ２複合体はさらに、例えば、Fractogel-DEAEあるいはDEAE-Sepharose DEAEゲルクロマドグラフィーを使用して、純度約６０〜８０％のＥ１／Ｅ２複合 体が得られる。さらに、Ｅ１は０〜１のＬｙｓ残基を有するので、リシンプロテ アーゼ処理により精製され得る。複合体のリシンプロテアーゼ処理は、Ｅ２を破 壊してＥ１を容易に分離する。 ＨＣＶの組織特異性は、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質がマンノース末端化 されていることの観察と組み合わせて、そのウイルスが宿主細胞への入口を得る ために、マンノースレセプターあるいはアシアロ糖タンパク質レセプター（ＡＳ ＧＲ）を使用することを示唆する。マンノースレセプターは、マクロファージお よび肝ジヌソイド細胞（sinusoidal cells）上に、一方、ＡＳＧＲは実質肝細胞 （parenchymal hepatocytes）上に見られる。従って、これらのレセプターの１ つあるいは両方を発現する宿主細胞の使用により、ＨＣＶを培養することが可能 である。レセプターが維持される条件を用いて、天然にレセプターを発現する一 次細胞培養物を使用するか、あるいは、レセプター発現用のベクターで、ＨｅＬ ａ、ＣＨＯ、ＣＯＳなどの他の細胞株をトランスフェクトし得る。マンノースレ セプターのクローニングならびにそのトランスフェクション、および線維芽細胞 での発現は、M．E．Taylorら、J Biol Chem（1990）265:12156-62に実証されて いる。ＡＳＧＲのクローニングおよび配列決定は、K．Driclkamerら、 J Biol C hem （1984）259:770-78ならびにM．Spiessら、Proc Nat Acad Sci USA（1985）8 2:6465-69に、ラットＨＴＣ細胞での、機能性ＡＳＧＲのトランスフェクション および発現は、M．McPhaulおよびP．Berg，Proc Nat Acad Sci USA（1986）83:8 863-67ならびにM．McPhaulおよびP．Berg，Mol Cell Biol（1987）7:1841-47に 記載されている。したがって、１つあるいは両方のレセプターを適切な細胞株（ 例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａなど）にトランスフェクトすることは可能で あり、得られた細胞をＨＣＶの培養での増殖のために宿主として使用すること が可能である。このような培養でのＨＣＶの継代により、生ワクチンとしての使 用に適した弱毒化株の開発がなされるべきである。１つあるいは両方の組換えレ セプターでトランスフェクトされた固定化細胞株を使用するのが好ましい。 免疫原性組成物は、当該分野に公知の方法に従って調製され得る。この組成物 は、ポリペプチド、例えば、Ｅ１、Ｅ２、あるいはＥ１／Ｅ２粒子組成物の免疫 原量を、通常は薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含有し、好ましくは さらにアジュバントを含有する。「カクテル（cooktail）」が所望である場合に は、例えば、Ｅ１にＥ２を加えた抗原など、ＨＣＶポリペプチドの組み合わせ物 を、効果を高めるためにともに混合し得る。Ｅ１／Ｅ２凝集体のウイルス様粒子 は、ことに有用なワクチン抗原を提供すると考えられる。免疫原性組成物は、抗 体の産生を誘発するために、抗体の供給源を提供するかあるいは動物内に防御免 疫性を誘導するために、動物に投与され得る。 薬学的に受容可能なキャリアには、組成物を受け入れる個体に対して、それ自 身が有害な抗体産生を誘発しない任意のキャリアが含まれる。適切なキャリアは 、典型的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーア ミノ酸、アミノ酸コポリマーなどの、大きな、徐々に代謝される高分子および不 活性ウイルス粒子である。このようなキャリアは、当業者には周知である。 組成物の効果を促進する好ましいアジュバントには、限定はされないが、水酸 化アルミニウム（alum）、米国特許第4,606,918号に記載されているＮ−アセチ ル‐ムラミル−Ｌ‐スレオニル−Ｄ‐イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ− アセチル−ノルムラミル‐Ｌ‐アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イングルタミニル−Ｌ−アラニ ン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホス ホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）およびＲＩＢＩが含まれ、こ モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジマイコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰ Ｌ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）が含まれる。さらに、Stimulon(Cambridge Bioscience,Wo rcester,MA)などのアジュバントが使用され得る。そのうえに、完全フロイント アジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（IFA）が、ヒト 以外の適用ならびに研究用に使用され得る。 免疫原性組成物は、典型的には、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール などの薬学的に受容可能なベヒクルを含有する。さらに、加湿剤あるいは乳化剤 、ｐＨ緩衝剤などの補助物質がこのようなベヒクル中に含有され得る。 典型的には、免疫原性組成物は、注射可能なように液体溶液あるいは懸濁液の いずれかに調製され得る；注射前に、液体ベヒクルの溶液または懸濁液に適した 固体形態もまた調製され得る。これらの調製物はさらに、アジュバントの効果を 促進するために乳化されるか、あるいはリポソーム中にカプセル化され得る。 ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫原学的に有効な量のＨＣＶ ポリペプチド、および必要に応じて上記の任意の成分を含有する。「免疫原学的 に有効な量」とは、単回投与量あるいは一連の投与量の一部において、個体に投 与される量が、上記定義のように、治療に有効であることを意味する。この量は 、治療される個体の健康および身体的条件、治療される個体の分類学上の群（例 えば、ヒト以外の霊長類、霊長類など）、抗体を合成するための個体免疫系の能 力、所望の防御の程度、ワクチンの調剤、治療医の医学上の評価、感染させるＨ ＣＶの株、ならびに他の関連要因に依存して変化する。この量は、比較的に広範 囲にあるので、所定の治験により決定されることが期待される。 自己構築Ｅ１／Ｅ２凝集体はまた、ワクチンキャリアとして働き、Ｂ型肝炎表 面抗原と同様の様式で、異種（非ＨＣＶ）ハプテンを提供し得る（欧州特許第17 4,444号を参照のこと）。この使用においては、Ｅ１／Ｅ２凝集体は、その凝集 体に結合されたハプテンあるいは抗原に対して免疫応答を刺激し得る免疫原性キ ャリアを提供する。抗原は、従来の化学的方法により結合されるか、あるいはＥ １および／またはＥ２をコードする遺伝子へ、そのタンパク質の親水性領域に相 当する配置に、クローン化され得る。 免疫原性組成物は、典型的には皮下注射あるいは筋肉内注射などによって、従 来通り非経口的に投与される。さらに、他の投与形態に適した処方剤には、経口 処方剤あるいは坐薬が含まれる。投薬処置は、単回投与計画あるいは複数回投与 計画であり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤と組み合わせて投与され得る。 Ｃ．実施例 以下に示されている実施例は、当該分野の専門家にさらに説明するために提供 されていて、いかなる方法においても本発明を限定することを意味していない。 実施例１ （クローニングおよび発現） （Ａ）ベクターを、欧州特許第318,216号および欧州特許第388,232号に記載さ れているように、ＨＣＶゲノムの５’部分を有するプラスミドから構築した。カ セットＨＣＶ（Ｓ／Ｂ）は、Ｍｅｔ₁からＬｅｕ₉₀₆までのポリタンパク質の５’ 末端をコードするStuI-BgIII DNAフラグメント(Ｍｅｔ₁に対して−６３ヌクレオ チドから始まる)を有する。これには、コアタンパク質（Ｃ）、Ｅ１タンパク質 （また、ときにはＳと言う）、Ｅ２タンパク質（また、ときにはＮＳ１と言う） 、ならびにＮＳ２ａ領域の５’部分が含まれる。構築物の発現に際して、個々の Ｃ、Ｅ１およびＥ２タンパク質がタンパク質分解プロセッシングにより産生され る。 カセットＨＣＶ（Ａ／Ｂ）はＭｅｔ₁からＬｅｕ₉₀₆までのポリタンパク質の５ ’末端をコードするApaLI‐BgIII DNAフラグメント(Ｍｅｔ₁に対して−６ヌクレ オチドから始まる)を有する。これには、コアタンパク質（Ｃ）、Ｅ１タンパク 質（また、ときにはＳと言う）、Ｅ２タンパク質（また、ときにはＮＳ１と言う ）、ならびにＮＳ２ａ領域の５’部分が含まれる。構築物の発現に際して、個々 のＣ、Ｅ１およびＥ２タンパク質がタンパク貿分解プロセッシングにより産生さ れる。 カセットＣ−Ｅ１（Ｓ／Ｂ）（StuI-BamHI部分）は、Ｍｅｔ₁からＩｌｅ₃₄₀ま での５’末端（遺伝子中のBamHI部位）を有する。このカセットの発現で、Ｃお よび多少の先端切断型のＥ１（Ｅ１’）が発現される。３’末端から切りだされ た部分は、トランスロケーションシグナルとして作用すると考えられている疎水 性領域である。 カセットＮＳ１（Ｂ／Ｂ）（BamHI-BgIII部分）は、Ｅ１の小さな３’部分（ Ｍｅｔ₃₆₄から）、全Ｅ２、ならびにＮＳ２ａ部分（Ｌｅｕ₉₀₆まで）を有する。 この構築では、Ｅ１フラグメントはトランスロケーションシグナルとして作用す る。 カセットＴＰＡ−ＮＳ１は、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰ Ａ）リーダーを、Ｅ１の３’部分のかわりにトランスロケーションシグナルとし て使用する。このカセットは、Ｇｌｙ₄₀₆からＧｌｕ₆₆₁までのＥ２の先端切断型 を有し、ここでは疎水性３’末端は欠失されている。 各カセットを、Ｔ７およびインビトロにおけるウサギ網状赤血球発現による転 写および翻訳のための、合成β−グロビン５’非コード配列をともなったベクタ ーｐＧＥＭ３Ｚ(Promega)と、この配列を伴わないベクターとに挿入した。組換 えワクシニアウイルス（ｒＶＶ）ベクターを、Charkrabartyら、Mol Cell Biol( 1985)5:3403-09に記載されているように、そのカセットをプラスミドｐＳＣ１１ （Dr．B．Moss、NIHから得た）に挿入し、その後ワクシニアウイルスと組換えて 調製した。 （Ｂ）かわりの発現ベクターを、Charkrabartyら、Mol Cell Biol（1985）5:3 403-09に記載されているように、ｐＳＣ５９（Dr．B．Moss、NIHから得た）のSt uI部位とSpeI部位との間にＨＣＶ（Ａ／Ｂ）を挿入し、その後ワクシニアウイル スと組換えて構築した。 （Ｃ）ＨｅＬａＳ３細胞を、５００ｍＬの滅菌遠心ボトル（ＪＡ−１０ロータ ー）中で、室温にて、２０００ｒｐｍ、７分間遠心分離して回収した。ペレット を、別の培養培地（Joklik 改変ＭＥＭ撹拌培地（Spinner medium）＋５％ウマ 血清およびゲンタマイシン）（「撹拌培地」）中に最終濃度２×１０⁷細胞／ｍ ｌに再懸濁した。音波処理した粗ｖｖ／ＳＣ５９‐ＨＣＶウイルスのストックを 、細胞あたり８ｐｆｕ／細胞の感染多重度で加え、そして混合物を３７℃で３０ 分間撹拌した。次に、感染細胞を８Ｌの撹拌培地を入れた撹拌フラスコに移し、 ３７℃で３日間インキュベートした。 次に、培養細胞を遠心分離して回収し、ペレットを緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣｌ、ｐＨ９．０、１５ｍｌ）に再懸濁させた。次に、細胞を４０ｍｌのDo unce Homogenizer（５０ストローク）によりホモジナイズし、核を遠心分離（５ 分間、１６００ｒｐｍ、４℃、ＪＡ‐２０ローター）してペレットにした。核ペ レットをＴｒｉs緩衝液（４ｍｌ）に再懸濁し、再度ホモジナイズしてペレット にし、全上清を集めた。 集めた溶解物を、１０ｍｌのアリコートにわけ、カップホルンソニケーター（ cuphorn sonicator）で、中程度の出力で、３×３０分音波処理した。音波処理 された溶解物（１５ｍｌ）を、ＳＷ２８遠心チューブ中で、１７ｍｌのスクロー スクッション（３６％）に重ねて、そして４℃で８０分間、１３，５００ｒｐｍ で遠心分離してウイルスをペレットにした。そのウイルスペレットを１ｍｌのＴ ｒｉｓ緩衝液（１ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ９．０）に再懸濁し、そして−８０ ℃で凍結した。 実施例２ （インビトロ産生物とインビボ産生物との比較） （Ａ）Ｅ１およびＥ２を、上記実施例１に記載のベクターを用いて、インビト ロおよびインビボの両方で発現させ、³⁵Ｓ−Ｍｅｔ標識した。ＢＳＣ−４０およ びＨｅＬａ細胞を、インビボ発現用にｒＶＶベクターに感染させた。培地および 細胞溶解物の両方を組換えタンパク質について試験した。産生物は、ヒトＨＣＶ 免疫血清により免疫沈降させ、一方、インビトロタンパク質は直接分析した。得 られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。 網状赤血球発現系（ＨＣＶ（Ｓ／Ｂ）あるいはＨＣＶ（Ａ／Ｂ）を有するｐＧ ＥＭ３Ｚ）は、それぞれ分子量約１８ｋＤ、約３５ｋＤおよび約７２ｋＤを有す るＣ、Ｅ１およびＥ２タンパク質を産生した。ＨＣＶ（Ｓ／Ｂ）、ＨＣＶ（Ａ／ Ｂ）あるいはＣ−Ｅ１（Ｓ／Ｂ）を有するｒＶＶでトランスフェクトしたＢＳＣ −４０およびＨｅＬａ細胞の溶解物は、同じタンパク質を提示した。網状赤血球 系は効率のよいゴルジプロセッシングを供給せず、従ってシアル酸を供給しない ので、インビトロおよびインビボ産生物の両方が等しい移動度を示す事実は、タ ンパク質がインビボにおいてシアル化されていないことを示唆する。ＴＰＡ‐Ｎ Ｓ１を有するｒＶＶベクターのみが、Ｅ２の細胞外分泌を促し、これはシアル化 に一致する移動度の変化を示した。 （Ｂ）ＨＣＶ（Ｓ／Ｂ）を、インビトロで発現させ、ビオチン化レクチン（Ｇ ＮＡ、ＳＮＡ、ＰＮＡ、ＷＧＡおよびＣｏｎＡ）のパネルとインキュベートした 。インキュベーションの後、複合体をアビジン−アクリルビーズ上に集めて、洗 浄 し、Laemmli試料緩衝液で溶出し、ＳＤＳ一ＰＡＧＥで分析した。結果は、Ｅ１ およびＥ２がＧＮＡおよびＣｏｎＡに結合したことを示した。このことはマンノ ースの存在を示している。ＧＮＡは末端マンノース基に結合し、一方、ＣｏｎＡ は任意のα結合マンノースに結合する。ＳＮＡ、ＰＮＡおよびＷＧＡに結合しな いことは、タンパク質がシアル酸、ガラクトース−Ｎ−アセテルガラクトサミン 、あるいはＮ‐アセチルグルコサミンを含んでいなかったことを示す。 （Ｃ）放射標識Ｅ１およびＥ２を、ＨＣＶ（Ｓ／Ｂ）（ｖｖ／ＳＣ１１−ＨＣ Ｖ）を有するｒＶＶに感染させることによりＢＳＣ−４０細胞中に産生し、そし てヒトＨＣＶ⁺免疫血清で免疫沈降させた。免疫沈降させた物質の半分をノイラ ミニダーゼで一晩処理して、すべてのシアル酸を除去した。処理後、処理タンパ ク質および未処理タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。移動度には有意な 差は観察されなかった。このことはインビボではシアル化はされていないことを 示す。 （Ｄ）放射標識Ｅ１およびＥ２を、ＨＣＶ（Ａ／Ｂ）（ｖｖ／ＳＣ５９−ＨＣ Ｖ）を有するｒＶＶに感染させることによりＢＳＣ−４０細胞中に産生し、コン トロールとしてＨＣＶ配列を含まないｖｖ／ＳＣ１１を用いて、ヒトＨＣＶ⁺血 清で免疫沈降さるか、あるいはアクリルビーズに結合されたビオチン化ＧＮＡレ クチンにより沈澱させた。沈澱物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。データは、Ｅ １およびＥ２が、ｖｖ／ＳＣ５９−ＨＣＶ感染細胞中の主要なマンノース末端タ ンパク質種であることを実証した。ＧＮＡは、Ｅ１およびＥ２を細胞培養培地か ら沈澱させるのに、ヒト抗血清と同程度に有効である。２５ｋＤの成分が観察さ れたが、これはワクシニア感染細胞に特異的であるようだ。 実施例３ （レクチンを用いた精製） （Ａ）ＨｅＬａＳ３細胞に、精製高力価ｖｖ／ＳＣ５９‐ＨＣＶウイルスのス トックを、５ｐｆｕ／細胞の感染多重度で接種し、そして混合物を３７℃で３０ 分間撹拌した。次に、感染細胞を８Ｌの撹拌培地を入れた撹拌フラスクコに移し 、３７℃で３日間インキュベートした。再度、細胞を遠心分離により集めて、氷 上 で低張緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１２０ｍｌ）に再懸濁させた。次に、細胞をDounce Homogenizer（５０スト ローク）でボモジナイズし、核を遠心分離（５分問、１６００ｒｐｍ、４℃、Ｊ Ａ−２０ローター）してペレットにした。ペレットを集めて、４８ｍｌの低張緩 衝液に再懸濁し、再度ホモジナイズし、再度遠心分離し、再度集めて、−８０℃ で凍結した。 次に、凍結上清を解凍して、核溶解後のミクロソーム膜画分を、ＪＡ‐２０ロ ーターにおいて１３，５００ｒｐｍで、４℃における２０分間の遠心分離により 単離した。上清を吸引して除去した。 ペレットを、９６ｍｌの界面活性剤緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ ０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＤＴ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ７．５）中に取り出し、ホモジナイズ（５０ストローク）し た。生成物を、１３,５００ｒｐｍ、４℃における２０分間の遠心分離により透 明にし、上清を集めた。 ＧＮＡ−アガロースカラム（１ｃｍ×３ｃｍ、３ｍｇ ＧＮＡ／ｍｌビーズ、 ６ｍｌベッド容量、Vector Labs，Burlingame，CA）を界面活性剤緩衝液で予め 平衡化した。上清試料を４℃で１６−２０時間、流速１ｍｌ／分で繰り返し循環 （recirculation）によりカラムにかけた。次に、カラムを界面活性剤緩衝液で 洗浄した。 精製Ｅ１／Ｅ２タンパク質を、流速０．５ｍｌ／分でα−Ｄ−マンノシド（界 面活性剤緩衝液中０．９Ｍ）により溶出した。Ｅ１／Ｅ２が溶出液中に出現した 時点で溶出を停止し、そしてカラムを２〜３時間再度平衡化した。画分をウェス タンブロットおよび銀染色により分析した。ピーク画分を集め、ＵＶ照射して残 存するワクシニアウイルスを不活性化した。 （Ｂ）ＧＮＡ−アガロース精製したＥ１およびＥ２アシアロ糖タンパク質を２ ０〜６０％グリセロールグラジエントで沈澱させた。グラジエントにかけたもの を分画し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによ り分析した。ブロットをＧＮＡでプローブしてＥ１およびＥ２を同定した。得ら れた結果により、Ｅ１：Ｅ２ヘテロダイマーの存在が示され、これは予測された 速度で沈澱する（すなわち、１１０ｋＤタンパク質の特徴的な位置）。ＨＣＶエ ンベロープタンパク質のより大きな凝集体もまた出現する。Ｅ２：Ｅ２ホモダイ マーもまた出現した。分離したＥ１：Ｅ２種もまた検出されたか、Ｅ１に比較し て、Ｅ２が、より大きな種でより多く出現したようであった。より大きな凝集体 は、チログロブリンマーカーよりも有意に速く沈澱した。 （Ｃ）ＧＮＡ−アガロース精製したＥ１およびＥ２を、１ｍＭ ＥＤＴＡを含 有する２０〜６０％グリセロールグラジエントにより沈澱させた。画分を、β− メルカプトエタノール（βＭＥ）の存在下および非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに より分析した。βＭＥの存在下および非存在下のＥ１およびＥ２のみかけの量に は、ほとんどあるいは全く相違は観察されなかった。このことは、ヘテロダイマ ー間のジスルフィド結合が存在しないことを示す。 （Ｄ）Ｅ１／Ｅ２複合体（純度約４０％）を、Coulter DM-4 サブミクロン粒 子分析機で分析した。２０〜６０ｎｍレンジで物質を検出した。 （Ｅ）Ｅ１／Ｅ２複合体（純度約４０％）を、リンタングステン酸によるネガ ティブ染色で電子顕微鏡により分析した。電子顕微鏡写真は、直径約４０ｎｍの 球状形の粒子の存在を示した。Ｅ１／Ｅ２複合体をＨＣＶ⁺ヒト免疫血清とイン キュベートし、次に、ネガティブ染色してＥＭにより分析をした。大きな凝集体 を有する抗体複合体および小さな粒子を観察した。 実施例４ （クロマトグラフフィーによる精製） （Ａ）実施例３に記載のように調製したＧＮＡレクチン精製物質（０．５〜０ ．８ｍｌ）を緩衝液Ａ（２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で１０倍希釈し、緩衝液Ａで平衡化した、１．８×１．５ｃｍのFrac togel EMD DEAE-650(EM Separations，Gibbstown，New Jersey，カタログ番号16 883)にかけた。Ｅ１／Ｅ２を含むタンパク質画分を、同じ緩衝液で流速０．２ｍ ｌ／分で溶出し、１ｍｌずつの画分を集めた。Ｅ１およびＥ２を含む画分（ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥで決定した）を集めて、−８０℃で保存した。 （Ｂ）上記パート（Ａ）で精製した物質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる評価で、 ６０〜８０％の純度を有する。推定Ｅ１およびＥ２のそれぞれのバンドの同定は 、転移法（transfer technique）を用いた後のＮ‐末端配列分析により確認した 。この目的のために、fractogel-DEAE精製したＥ１／Ｅ２物質を、Laemmli緩衝 液（ｐＨ６．８、０．０６ＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、２．３％ＳＤＳ、１０％グリセロ ール、０．７２Ｍ β−メルカプトエタノール）を加えて還元し、３分間煮沸し た。次に、試料を１０％ポリアクリルアミトゲルにのせた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後 、タンパク質を、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）０．２μｍ膜（Bi o-Rad Laboratories，Richmond，CA）に移した。予測される推定Ｅ１およびＥ２ タンパク質のそれぞれのバンドをブロットから切り出し、Ｎ−末端アミノ酸分析 を行った。物質の調製の間のアミノ末端のブロックを妨げることは特別にはしな かった。最初の１５サイクルで、Ｅ１試料は、Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ −Ｘ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｘ−Ａｓｎ−Ａ ｓｐの配列を有し、一方、Ｅ２の配列は、Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇ ｌｙ−Ｘ−Ｘ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｘ−Ｖａｌ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅであ ることを示した。このアミノ酸配列のデーターは、対応するＤＮＡ配列から予測 された配列と一致する。 fractolgel−DEAEクロマトグラフィーによる上記の精製Ｅ１／Ｅ２産物は、ゲ ル透過クロマトグラフィーＢｉｏ−Ｓｉｌ ＴＳＫ−４０００ＳＷカラムの排除 領域に、多量のＥ１およびＥ２がともに溶出する事実によって明確にされるよう に、凝集していると考えられる。このことは、自然条件下では、有意な量のＥ１ ／Ｅ２複合体は、少なくとも８００ｋＤの分子量を有することを示す。分子量約 ６５０ｋＤのＥ１／Ｅ２物質もまた観察された。 実施例５ （さらなるクローニングおよび発現） （Ａ）ＨＣＶポリタンパク質の５’部分を含有する以下のカセットを、合成黄熱 ウイルス５'非コード配列を伴って、または伴わないでベクターｐＧＥＭ４Ｚ（P romega）に挿入し、そしてまた、組換えワクシニアウイルス（rVV）ベクターに も挿入した（実施例１Ａに記載のように）。カセットＣ５ｐ−１は、ポリタンパ ク質の５'末端のＭｅｔ₁〜Ｔｒｐ₁₀₇₉をコードするフラグメント（ＭＥＴ₁に対 して-２７５ヌクレオチドで始まる）を含み、５'および３'末端にＥｃｏＲＩリ ンカーを有する。カセットＣ５ｐ−３は、５'末端のＭｅｔ₁〜Ｔｒｐ₁₀₇₉のポリ タンパク質をコードするフラグメントを含み、５'および３'末端にＥｃｏＲＩリ ンカーを有する。両方のカセットは、Ｃ、Ｅ１およびＥ２タンパク質およびＮＳ ２タンパク質の５'部分をコードする。 （Ｂ）ＨＣＶポリタンパク質の５'部分を含有する以下のカセットを、ベクター ｐＳＣ５９に挿入した後、ワクシニアウイルスで組換えた（実施例１Ｂに記載） 。カセットＨＣＶ（ポリ）は、ポリタンパク質の５'末端のＭｅｔ₁〜Ａｓｐ₉₆₆ をコードする平滑化StuI-BglIIフラグメント（Ｍｅｔ₁に対して-６５ヌクレオチ ドで始まる）を含む。この構築物は、Ｃ、Ｅ１およびＥ２タンパク質、およびＮ Ｓ２タンパク質の５'部分を発現する。 カセットＨＣＶ（５C/SB）は、ポリタンパク質の５'末端のＭｅｔ₁〜Ｉｌｅ_{34 0} をコードする平滑末端化されたStuI-BamHIフラグメント（Ｍｅｔ₁に対して-６ ５ヌクレオチドで始まる）を含む。この構築物は、Ｃタンパク質、先端欠失Ｅ１ タンパク質を発現する。 カセットＨＣＶ（６Ｃ／ＳＳ）は、ポリタンパク質の５'末端のＭｅｔ₁〜Ａｓ Ｐ₃₈₂をコードするSalI（平滑化）-EcoRIフラグメントを含む。ここでｓｅｒ₂は Ｇｌｙ₂で置換される。この構築物は、Ｃタンパク質、先端欠失Ｅ１タンパク質 を発現する。 カセットＨＣＶ（Ｅ１２Ｃ／Ｂ）は、ポリタンパク質部分のＭｅｔ₁₃₄〜Ａｓ Ｐ₉₆₆をコードする平滑末端化されたClaI-BglIIフラグメントを含み、EcoRIで平 滑化されたＳＣ５９ベクターに挿入された。 カセットＨＣＶ（Ｅ１/S）は、ポリタンパク質部分のＭｅｔ₁₃₄〜Ｖａｌ₃₈₁を コードする平滑末端化されたClaI/SalIフラグメントを含み、EcoRIで平滑化され たＳＣ５９ベクターに挿入された。 （Ｃ）ＨｅＬａＳ３細胞を、２５０ｍｌの滅菌遠心分離ボトル中で、４℃にて、 ７分間、２000rpmで遠心分離することにより回収した。ペレットを、Gey's平衡 化塩溶液（ＧＢＳＳ）中、５×１０⁶細胞/ｍｌの最終濃度で再懸濁した。超音波 処理したvｖ／ＳＣ５９-ＨＣＶウイルス粗ストックを、0.5ｐｆｕ/細胞の感染多 重度で添加し、そして混合物を３７℃で１〜２時間、撹拌した。次いで、感染細 胞を、１リットルの培養培地（Joklik MEM＋１0% ウシ胎児血清＋非必須アミノ 酸、ビタミン、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）を含有する撹拌フラスコに、１０⁶細胞／ ｍｌの最終濃度で移し、そして３日間、３７℃でインキュベートした。 次いで、培養細胞を遠心分離により回収し、そしてペレットを緩衝液（10ｍＭ Ｔｒｉｓ-HCl、ｐＨ9.0、１５ｍｌ）中に再懸濁した。次いで、細胞を、４0ｍｌ のDounce Homogenizer（５0ストローク）を用いてホモジナイズし、そして核を 遠心分離（５分間、１６00ｒｐｍ、４℃、JA-２0ローター）によりペレット化し た。核ペレットをＴｒｉs緩衝液（４ｍｌ）中に再懸濁し、再びホモジナイズし 、そして再度ペレット化させ、全ての上清を集めた。 集めた溶物を５ｍｌのアリコートに分け、そして0.1容量のトリプシン（２.５ mg/ｍｌ）を添加し、そして３７℃で３0分間インキュベートした。次いで、アリ コートを３×３0秒間カップホーンソニケーターにおいて、中程度の出力で超音 波処理した。超音波処理した溶解物を粗ストックとして使用した。 実施例６ （インビトロ産物とインビボ産物とのさらなる比較） （Ａ）Ｅ１およびＥ２をインビトロおよびインビボの両方で発現させ、上記実施 例５に記載のベクターおよび上記実施例２に記載の手順を用いて、³⁵Ｓ-Ｍｅｔ 標識した。ＢＳＣ-４0およびＨｅＬａ細胞をインビボでの発現のためにｒＶＶベ クターで感染させた。培地および細胞溶解物の両方を、組換えタンパク質につい て試験した。産物をヒトＨＣＶ免疫血清、あるいはウサギまたはヤギ抗ＨＣＶ抗 血清を用いて免疫沈降させ、一方インビトロタンパク質は直接分析した。得られ るタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥｎｄｏＨ消化により分析した。 実施例７ （さらなるレクチンの精製） ＨｅＬａＳ３細胞を、１ｐｆｕ／細胞の感染多重度で、精製された高力価vv/S C５９-ＨＣＶウイルスストック（上記実施例５において記載のようにＨＣＶ（ポ リ）またはＨＣＶ（Ｅ１２C/B）で接種し、そして混合物を３７℃で１〜２時間 撹拌した。次いで、感染細胞を１リットルの培養培地（実施例５、上述を参照の こと）を含有する撹拌フラスコに移し、そして２日間３７℃でインキュベートし た。合計１０リットルの細胞を遠心分離により回収し、そして氷上で、プロテア ーゼインヒビター（PMSFおよびペプスタチンＡ）を含有する低張緩衝液（２0ｍ Ｍ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１２０ｍｌ）中、再懸 濁させた。次いで、細胞を４０ｍｌのホモジナイザーで、２つのバッチに分けて ホモジナイズし、そして核を遠心分離（２０分間、１２，０００ｒｐｍ）により ペレット化させ、再懸濁し、再度ホモジナイズした。各ペレットをホモジナイザ ー中で約１０ｍｌの２５ｍＭ ＮａＰＯ₄（ｐＨ６.８）中に再建濁し、等容量の １００ｍＭ ＮａＰＯ₄（ｐＨ６.８）中の４% Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００を添加し た。ペレット化された細胞を２０ストロークでホモジナイズし、１２,０００ｒ ｐｍで１５分間スピンし（１ペレット当たり４チューブ）、そして上清を保存し た。再懸濁、Triton添加、および遠心分離工程を繰り返し、そして保存した上清 を合わせ、そして-８０℃で凍結した。 凍結上清を解凍し、そして１２,０００ｒｐｍで１５分間スピンして、混合し 、そして４℃に維持した。ＧＮＡ-アガロースカラム（１cm×３cm、３mg ＧＮＡ /ｍｌビーズ、６ｍｌベッド容量、Vector Labs，Burlingame，CA）を予め界面活 性剤緩衝液（５０ｍＭ ＮａＰＯ₄中２% ＴｒｉｔｏｎＸ-１００、ｐＨ６.８）で 平衡化した。上清サンプルをカラムにのせ、１ｍｌ／分の流速で、１６〜２０時 間、４℃にて再循環させた。次いで、カラムを界面活性剤緩衝液で洗浄した後、 各３０ｍｌの以下の洗浄液で洗浄した： 精製Ｅ１/Ｅ２タンパク質を、緩衝液ＤおよびＥ中の溶出物質として得、それ らを別々に回収してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。 実施例８ （さらなるクロマトグラフィー精製） （Ａ）実施例７に記載のように調製したＧＮＡレクチン精製物質を、緩衝液Ｂ（ 実施例７を参照のこと）で平衡化したS-Sepharose Fast Flow（Pharmacia）のカ ラムに載せた。カラムを緩衝液Ｂで洗浄し、次いで緩衝液１（０.５M ＮａＣｌ, ２０ｍＭ ＮａＰＯ₄（ｐＨ６.０）、０.１% ＴｒｉｔｏｎＸ-１００）および緩 衝液２（１M ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ₄（ｐＨ６.０）、０.１% Ｔｒｉｔｏ ｎＸ-１００）で溶出した。Ｅ１およびＥ２を含有する画分（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ により決定した）をプールし、-８０℃で保存した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/19 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｚ 5/10 9735−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/576 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＳ // Ｃ１２Ｎ 15/09 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＬＴ ，ＬＶ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ， ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 サディウム， ケント ビー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94602, オークランド，ハンペル ストリート 1220 (72)発明者 ホール， ジョン エイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94928, ローナート パーク，ラケット クラブ サークル 725 (72)発明者 バーガー， キム エム. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94549, ラファイエッテ，ジョンソン ロード 3364 (72)発明者 チョー， キ−リム アメリカ合衆国 カリフォルニア 94530, エル セリート，フェーン ストリート 7500 (72)発明者 ホートン， マイケル アメリカ合衆国 カリフォルニア 94526, ダンビル，ローズメッド コート 53 (72)発明者 クオ， ジョージ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94122, サンフランシスコ，シックスス アベニ ュー 1370 (72)発明者 ガーベイス， バーバラ エイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94589, バレホ， シマロン コート 1001

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｅ１およびＥ２からなる群から選択される、単離されたＣ型肝炎ウイルス( ＨＣＶ)のアシアロ糖タンパク質。 ２．前記アシアロ糖タンパク質がＥ１である、請求項１に記載のアシアロ糖タン パク質。 ３．前記アシアロ糖タンパク質がＥ２である、請求項１に記載のアシアロ糖タン パク質。 ４．前記Ｅ１アシアロ糖タンパク質が組換えＥ１である、請求項２に記載のアシ アロ糖タンパク質。 ５．前記Ｅ１アシアロ糖タンパク質が組換えＥ２タンパク質である、請求項２に 記載のアシアロ糖タンパク質。 ６．ワクチンまたはイムノアッセイにおける使用に適したＣ型肝炎ウイルス(Ｈ ＣＶ)アシアロ糖タンパク質を生産するための方法であって、以下の工程： Ｅ１およびＥ２からなる群から選択されるＨＣＶアシアロ糖タンパク質をコー ドする構造遺伝子で形質転換された下等真核生物を、適切な培養培地で増殖させ る工程； 該構造遺伝子を発現させる工程；および 該細胞培養物から該ＨＣＶアシアロ糖タンパク質を回収する工程、 を包含する、方法。 ７．前記下等真核生物が酵母である、請求項６に記載の方法。 ８．前記酵母がSaccharomycesである、請求項７に記載の方法。 ９．前記酵母の表現型がpmr１である、請求項７に記載の方法。 １０．前記ＨＣＶアシアロ糖タンパク質構造遺伝子が、前記下等真核生物におい て機能的な分泌リーダーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項６ に記載の方法。 １１．前記分泌リーダーがα因子分泌リーダーを含む、請求項１０に記載の方法 。 １２．ワクチンまたはイムノアッセイにおける使用に適するＣ型肝炎ウイルス( ＨＣＶ)アシアロ糖タンパク質を生産するための方法であって、以下の工程： Ｅ１およびＥ２からなる群から選択されるＨＣＶアシアロ糖タンパク質をコ ードする構造遺伝子で形質転換された哺乳動物宿主細胞を、適切な培養培地で増 殖させる工程； シアル化を阻害する条件下で、該構造遺伝子を発現させる工程；および 該細胞培養物から該HCVアシアロ糖タンパク質を回収する工程、 を包含する、方法。 １３．前記シアル化を阻害する条件が、小胞体からゴルジ体への糖タンパク質の 輸送を阻害するのに十分な速度でのＥ１またはＥ２の発現を含む、請求項１２に 記載の方法。 １４．前記シアル化を阻害する条件が： 前記宿主の小胞体中でのタンパク質の放出を引き起こすのに十分な量のカルシ ウムモジュレーターの存在、 を含む、請求項１２に記載の方法。 １５．前記カルシウムモジュレーターがタプシガルギンである、請求項１４に記 載の方法。 １６．Ｃ型肝炎(ＨＣＶ)アシアロ糖タンパク質を精製するための方法であって、 以下の工程： ＨＣＶアシアロ糖タンパク質を含有する組成物とマンノース結合タンパク質と を接触させる工程；および 該マンノース結合タンパク質に結合する該組成物の部分を単離する工程、 を包含する、方法。 １７．前記マンノース結合タンパク質が、ＣｏｎＡおよびＧＮＡからなる群から 選択されるレクチンである、請求項１６に記載の方法。 １８．前記マンノース結合タンパク質が支持体上に固定される、請求項１６に記 載の方法。 １９．前記接触工程が、前記ＨＣＶアシアロ糖タンパク質を含有する組成物を、 支持体上に固定したマンノース結合レクチンを含むカラム中で、少なくとも１時 間の間インキュベートする工程を包含し；そして 前記単離工程が、マンノースを用いて前記ＨＣＶアシアロ糖タンパク質を溶出 する工程を包含する、請求項１８に記載の方法。 ２０．Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)アシアロ糖タンパク質の存在を検出するためのア ッセイキットであって、 固体支持体； マンノース結合タンパク質；および 該HCVアシアロ糖タンパク質に特異的な抗体； を含み、ここで、該抗体および該マンノース結合タンパク質のうちの１つが該 固体支持体に結合している、アッセイキット。 ２１．前記マンノース結合タンパク質がＧＮＡである、請求項２０に記載のアッ セイキット。 ２２．前記抗体が前記支持体に結合し、そして前記マンノース結合タンパク質が 検出可能な標識に結合している、請求項２０に記載のアッセイキット。 ２３．前記マンノース結合タンパク質が前記支持体に結合し、そして前記抗体が 検出可能な標識に結合している、請求項２０に記載のアッセイキット。 ２４．Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)への曝露またはＣ型肝炎ウイルスによる感染を 決定する方法であって、体液のサンプル中の任意のHCVがアッセイの前にマンノ ース結合タンパク質との接触により濃縮される、方法。 ２５．前記マンノース結合タンパク質がGNAである、請求項２４に記載の方法。 ２６．Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)アシアロ糖タンパク質の組換え発現のためのベク ターで形質転換された細胞であって、該ベクターがグリコシル化シグナル、HCV アシアロ糖タンパク質、該宿主細胞中で作動可能でありそして該HCVアシアロ糖 タンパク質の発現を調節し得る調節配列、および選択マーカーをコードする構造 遺伝子を含むベクターであり、該細胞が糖タンパク質をシアル化しない、細胞。 ２７．前記細胞がグリコシル化欠損酵母株である、請求項２６に記載の細胞。 ２８．前記ベクターがワクシニアウイルスベクターを包含する、請求項２６に記 載の細胞。 ２９．血漿、血清、または他の生物学的液体中のＣ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)の存 在を減少させるかまたは排除するための方法であって、以下の工程： 該生物学的液体をマンノース末端糖タンパク質に特異的なマンノース結合タン パク質と接触させる工程；および 該生物学的液体を該マンノース結合タンパク質から分離する工程、 を包含する、工程。 ３０．前記マンノース結合タンパク質がGNAである、請求項２９に記載の方法。 ３１．動物において免疫応答を誘導する方法であって、以下の工程： 薬学的に受容可能なベヒクル中に効果的な量のＣ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)アシ アロ糖タンパク質を含有するワクチン組成物を提供する工程； 該ワクチン組成物を該動物に投与する工程、 を包含する、方法。 ３２．前記ＨＣＶアシアロ糖タンパク質がＥ１である、請求項３１に記載の方法 。 ３３．前記ＨＣＶアシアロ糖タンパク質がＥ２である、請求項３１に記載の方法 。 ３４．前記ＨＣＶアシアロ糖タンパク質が精製Ｅ１/Ｅ２凝集体である、請求項 ３１に記載の方法。 ３５．前記動物が霊長類である、請求項３１に記載の方法。 ３６．精製ＨＣＶ Ｅ１/ Ｅ２アシアロ糖タンパク質凝集体を含有する、Ｃ型肝 炎ウイルス(ＨＣＶ)アシアロ糖タンパク質組成物。 ３７．前記ＨＣＶ Ｅ１/Ｅ２アシアロ糖タンパク質凝集体が少なくとも純度40％ である、請求項３６に記載の組成物。 ３８．前記ＨＣＶ Ｅ１/Ｅ２アシアロ糖タンパク質凝集体が少なくとも純度50％ である、請求項３７に記載の組成物。 ３９．前記ＨＣＶ Ｅ１/Ｅ２アシアロ糖タンパク質凝集体が少なくとも純度60％ である、請求項３８に記載の組成物。 ４０．前記ＨＣＶ Ｅ１/Ｅ２アシアロ糖タンパク質凝集体が実質的に他のＨＣＶ タンパク質を含まない、請求項３６に記載の組成物。 ４１．前記凝集体が約１０７ｋＤの分子量を有する、請求項３６に記載の組成物 。 ４２．前記凝集体が約８００ｋＤの分子量を有する、請求項３６に記載の組成物 。 ４３．前記凝集体が約４０ｎｍの直径を有する粒子を形成する、請求項３６に記 載の組成物。