JPH10501410A

JPH10501410A - バシラス・チュリンジエンシスからの殺虫性蛋白質の同定、定量及び精製

Info

Publication number: JPH10501410A
Application number: JP8501412A
Authority: JP
Inventors: プツタイ−カーレイ，マリアンヌ; カーレイ，ポール，リチャード; ヤグチ，マコト; レッサード，ティモシー
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 1990-03-14
Filing date: 1994-06-22
Publication date: 1998-02-10
Also published as: DK0804474T3; EP0804474B1; WO1995035317A1; DE69416879D1; EP0804474A1; ES2127930T3; DE69416879T2; GR3030216T3; AU7066294A; AU688335B2

Abstract

(57)【要約】バシラス・チュリンジエンシス遺伝子により発現された蛋白質のプロトキシンを同定するための方法が開示される。本方法によれば、娘毒素は、バシラス・チュリンジエンシスの副芽胞結晶体のようなプロトキシン含有材料を9.5超のpHを有する水性懸濁液中での蛋白質分解酵素での制限された蛋白質分解にさらすことにより最初に生成される。その後、娘毒素は塩、好ましくは塩化ナトリウムの増加的勾配において10を超える一定のpHにおける高性能陰イオン交換液体クロマトグラフィーにより分離される。用いられるカラムに特異的である勾配条件は、塩の増加的濃度を有し、予め決定された時間及び流速において導入される一連の緩衝液を用いることにより達成される。本手順は、毒素の明白に同定可能なピークを示すクロマトグラムを供し、それゆえもとの混合物の質的及び量的キャラクタリゼーション及び個々の毒素の単離を許容する。これにより、それは単一及び重複遺伝子の両方の新しいバシラス・チュリンジエンシスをスクリーニング及びテストする、並びに周知の株からの周知の遺伝子の発現のレベルを監視する手段を提供する。この消化及び単離条件は生物学的に十分な活性状態における毒素の製造を許容する。

Description

【発明の詳細な説明】バシラス・チュリンジエンシスからの殺虫性蛋白質の同定、定量及び精製発明の背景本発明は、バシラス・チュリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）、特にバシラス・チュリンジエンシスの多重遺伝子株からの殺虫性蛋白質の同定、定量及び精製に関する。バシラス・チュリンジエンシス（本明細書でBtと略記する）は、胞子形成の間に大量の細晶性副芽胞封入体を産生する能力を特徴とするグラム陽性土壌バクテリアである。これらの封入体は極めて特異的な殺虫活性を示す蛋白質（プロトキシン）からなる。異なる昆虫宿主毒性範囲を有する多くのBt株が同定されている。多数の株が鱗翅目昆虫(Lepidoptera)の特定のメンバーの幼虫に対して活性がある（100種を超える鱗翅目昆虫に対して活性のあるBt株が今日まで同定されている）が、双翅目又は鞘翅目種に対して毒性を示す株も知られている。 Bt副芽胞封入体は、慣用的殺虫剤の価値ある代用物であることが証明されている。それらは標的昆虫に対して高い毒性があり、それらの特異性のため環境に害がない。他の昆虫目、動物及び植物は毒性結晶性蛋白質により影響を受けないようである。Btの種々の製剤が、農業及び林業において害虫を制御するために、更に最近になって種々のヒト及び動物の病気の昆虫媒介体を制御するために、生物殺虫剤として20年超、用いられている。 Btは種々のタイプの毒素を産生し、その生化学的特徴は株間で種々であり得る。それらのいくつか、特にα−及びβ−エキソトキシンは種々の昆虫目又は多くの細胞型に毒性である。蛋白質である副芽胞結晶性封入体毒素（δ−エンドトキシンとも呼ばれる）はより制限された特異的な宿主範囲を有する。幼虫に使われた場合、Bt結晶性封入体は幼虫の中腸において溶解し、昆虫の中腸において（23〜80kD分子量の範囲の）より小さな毒性ポリペプチドへの蛋白質分解的変換を迅速に行う。作られた毒素種は宿主昆虫の中腸上皮細胞と相互作用して、細胞膜内に孔を形成し、浸透バランスを破壊する。上皮細胞は膨潤して溶解する。幼虫は食物摂取を停止して最終的に死ぬ。いくつかのBt毒素のための特異的高アフィニティー結合部位が、これらの毒素が極めて特異的であることを説明することができる感受性のある昆虫の中腸上皮上に存在することが証明されている。 Btは驚くほど大量かつ変異性のファミリーの殺虫性蛋白質が供されていることが近年、明らかになってきている。いくつかの実験方法を用いて得られたデータは、鱗翅目昆虫に毒性であるBtの多くの副次種における結晶性蛋白質が１以上の大きなプラスミド上に位置することを示す：いくつかの副次種において、その遺伝子は染色体上に位置し得る。Btプロトキシンのための遺伝子は通常、運ばれたプラスミドであるという事実は、Btを遺伝子操作のための好ましい候補にする。これにより、現在他のものにまじってBt結晶性蛋白質を発現することができる昆虫耐性形質転換作物を製造することができる。多くのBt株がプロトキシンをコードするいくつかの密接に関連した遺伝子を含むことも近年、明らかになっている。例えばBt var．kurstaki NRD-12株は３− 遺伝子株である。いくつかのこのような遺伝子の存在は、それらのアミノ酸配列に密接に関連したいくつかのプロトキシンの単一のBt株による産生を引きおこす。試験管内又は昆虫中腸内のいずれかにおけるこのようなプロトキシンに対する蛋白質分解酵素の酵素作用は、いくつかのアミノ酸残基のみ異なり得、分離するのが難しい毒素の得られた混合物を作る数種の毒素を産生する。しかしながら、これらの小さな差異は毒素配列の要所の領域において頻繁に発生するので、それらは、選択された昆虫標的に対して大きく異なる毒性を生じ得る。Btの多重遺伝子により産生された毒素の混合物の組成物又は個々の毒素の発現レベルは発酵条件により種々であり得るので、種々の昆虫に対するその相対的毒性も種々であり、結果として多重遺伝子Bt株の宿主の範囲も様々である。それゆえ、多重遺伝子製造体からの最も要求される毒性の産生を最適化するために、エンドトキシン結晶体中に存在する異なる毒素を監視及び定量することが重要となる。 Btの種々の株のδ−エンドトキシンからの殺昆虫毒素を精製する種々の試みが当該技術において知られている。提案される方法は、トリプシンのような蛋白質分解酵素又は昆虫消化ジュースでのBtの結晶性封入体の消化の後の電気泳動、ゲルろ過及びイオン交換クロマトグラフィーのような種々の分析手順による加水分解の産物の分離を典型的に含む。しかしながら、Btの多重遺伝子株から得られた密接に関連した毒素を分離、精製する能力を証明するこれらの方法はない。同様に、Bt株の定性的及び定量的キャラクタリゼーションの多数の方法が提唱されている。それらは、例えば鞭毛抗体の使用、DNAプローブでの遺伝子のプロービング又はRNA産物のレベルの測定を含む。これらの方法はキャラクタリゼーション及びクラシフィケーションの目的のために役立つが、遺伝子発現の定量及び与えられた株の生存能を監視すること又は殺虫活性、相助作用、膜研究もしくは昆虫耐性を分析するための個々の毒性標準を作ることに満足いくものではない。更に詳しくは、Fullmer，C.S．and Wasserman，R.H.Analytical Peptide Mapp ing by High Performance Liquid Chromatography．腸のカルシウム結合蛋白質への適用においてJ.Biol.Chem．254，7208〜7212（1979）においてペプチドの混合物を提供するための排他的酵素消化に関連するペプチドマッピング技術が記載される。ペプチド混合物の分析は、酸及び有機溶媒と関連した逆相HPLCにより行われる。他の引用、Yamamoto，T．Identification of Entomocidal Toxins of Bacillu s thuringiensis by High Performance Liquid Chromatography，J.Gen.Microbi ol．129，2595〜2603（1983）において、同じFullmer et alの方法を用いるペプチドマッピングが記載される。例えば、図４下のページ2601、５行の“A peak r epresenting the proteinase resistant core could not be located”との記載を参照のこと。有機溶媒の使用が毒素の生物活性を永久的に減少させるか又は完全に破壊するかのいずれかであることが強調される。更なる引用、Yamamoto，T.，Ehmann，A.，Gonzalez，J.M.Jr．and Carlton，B .C.Expression of Three Genes Coding for 135-kilodalton Entomocidal Prote ins in Bacillus thuringiensis kurstaki Current Microbiol．17，5-12（198 8）において、同じペプチドマッピング方法が行われる。この引用において、プロトキシンは、トリプシン加水分解の前に予め精製される。加水分解の後、毒素混合物は尿素で変性され、逆相HPLCを用いるペプチドマッピングのためにトリプシンにより再消化される（ペプチドは酸に溶かされ、酸／アセトニトリル混合物において溶出される）。先に記載のように、これは毒素の生物活性を破壊する。不運なことに、多重遺伝子株からの結果物を解釈するために単一遺伝子標準を用いるこの結果として生ずるペプチドマッピングは、株kurstaki HD-1においてcryIA(c)〔6.6〕遺伝子産物の存在を認識するのに失敗した。この遺伝子及びその蛋白質毒素は、他の研究者により存在することを示される重要な構成物である。更に、Hernstadt，C．and Wilcox E.Cloning and Expression of Bacillus th uringiensis Toxin gene Toxic to Beetle of the Order Coleoptera．米国特許 4,853,331(1989)において、単一遺伝子のクローニング及び大腸菌宿主細胞による単一Bt蛋白質の製造が記載される。この毒素はアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。それと反対に、毒素の生物活性を維持しながらBt遺伝子により発現されたプロトキシンの同定、定量及び精製を供する先に記載の技術はないであろう。実際、これらの引用は、考え、即ち毒素の生物活性の破壊が無関係であるペプチドマッピングにおける異なる目的を有する。しかしながら、我々の発明において、毒素の生物活性は実質的に完全なままでなければならない。従って、我々はこれらの先行技術において用いられる逆相HPLC技術を用いることができない。発明の概要本発明は、バシラス・チュリンジエンシス遺伝子により発現されたプロトキシンを同定するための方法であって、該方法が、 − 10〜12の範囲のpHにおける水性懸濁液中で蛋白質分解酵素でバシラス・チュリンジエンシスプロトキシン含有材料を加水分解して可溶化娘毒素を形成するステップと、 − 10〜12の範囲の実質的に一定のpHにおいて、並びに緩衝液のみを含む第１の溶離液の使用及び該緩衝液及び適切な塩を含む少くとも１の他の溶離液の予め決定された期間にわたる段階的導入に相当する水性条件下において前記娘毒素を高性能陰イオン交換液体クロマトグラフィーにかけるステップであって、前記溶離液中の前記塩の濃度の時間における変化が、生物学的に活性な状態における娘毒素が加水分解の他の産物から分離される程度であるステップと、 − 前記娘毒素により作られたクロマトグラフィーシグナルからプロトキシンを同定及び必要に応じて定量するステップと、を含むことを特徴とする方法を提供する。 “娘毒素”という言葉は、開始材料によるプロトキシンの混合物又は個々のプロトキシンを含み得ると理解されよう。これにより、Btの多重遺伝子株が含まれる場合、プロトキシンの混合物が含まれ、Btの単一遺伝子株が用いられる場合、単一のプロトキシンが含まれる。これにより、その方法に従ってBtの多重遺伝子株からの密接に関連した毒素が、それらの生物学的活性状態において分離、同定及び精製される方法が見い出された。本方法に従って、例えばBtの多重遺伝子株からの精製された蛋白質結晶体又は粗発酵混合物は、約10〜約12のpH、好ましくは10.5のpHにおいて蛋白質分解酵素の作用に直接供される。この蛋白質分解消化は、毒素を遊離させ、その後この毒素は陰イオン交換カラムを用いて10〜12のpH範囲、好ましくは10.5〜11.5の範囲において陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）にかけられる。塩、好ましくは塩化ナトリウムの増加的勾配において適切なpHの緩衝溶液で毒素の溶出が行われる。本手順は、毒素の明白に同定可能なピークの特徴を示すクロマトグラムを供するので、もとの混合物の定性的及び定量的キャラクタリゼーションを許容する。分離過程は半調製用又調製用カラムを用いてスケール・アップされ得、これにより大量の純粋な活性毒素の単離を許容する。本発明の最も用いられる適用はBtの多重遺伝子株から得られた毒素の混合物からの個々の毒素の分離又は同定であり得るが、本発明は、Btの単一遺伝子から得られた単一の毒素をキャラクタライズするのに用いられ得る。Btの単一遺伝子又は多重遺伝子各々からの毒素がキャラクタライズされる時、Btの株もキャラクタライズされる。本方法に従って、周知のBt株からの周知の毒素の発現のレベルも測定され得、株の生存能が監視され得る。図面の簡単な記載図１は、Protein PAK DEAE 5 PW半調製用カラムを用いる本発明の１つの好ましい実施形態に従うクロマトグラフィー分離の勾配条件を示す。図２は、Bt kurstaki NRD-12株の副芽胞結晶体のトリプシン消化の図１の勾配条件下においてProtein PAK DEAE 5 PW半調製用カラムで得られたクロマトグラムを示す。図３，４，５は、単離後再注入された各々図２の構成物Ｂ，Ｃ及びＤの図１の勾配条件下で得られたクロマトグラムを示す。図６は、Mono Qカラムを用いる本発明の他の好ましい実施形態に従うクロマトグラフィー分離の勾配条件を示す。図７は、Bt kurstaki NRD-12株の副芽胞結晶体のトリプシン消化の図６の勾配条件下におけるMono Qカラムで得られたクロマトグラムを示す。図８は、図９に示されるクロマトグラフィー分離の勾配条件を示す。図９は、図２に示されるものに類似し、図８の勾配条件下においてProtein PA K DEAEカラムで得られたクロマトグラムを示す（トキシンピークは解明されない）。図10ａ及び10ｂは、Bt kurstaki NRD-12株の３の毒素のアミノ酸配列及びその単離された単一蛋白質毒素から同定されたペプチドフラグメントを示す。好ましい実施形態の記載本発明に従う１つの実施形態は、次のステップ：ａ）発酵混合物からのBtエンドトキシン結晶体の精製ｂ）前記結晶体の直接的蛋白質分解酵素消化；及びｃ）その加水分解の産物の陰イオン交換HPLC分離を典型的に含む。蛋白質分解酵素により消化された材料は通常、粗発酵混合物から精製された結晶性エンドトキシンであるが、このような精製は好ましいが本質的でない。陰イオン交換HPLC溶出パターンにおける毒素の認識可能ピークの特徴は、酵素消化の前の発酵ブイヨンから分離された粗Bt材料を用いても得られうる。その後、精製された結晶体又は洗浄された粗材料はトリプシン、キモトリプシン又はエラスターゼのような蛋白質分解酵素で直接加水分解される。トリプシンが好ましい酵素である。また、かいこ(Bombyx mori)からの腸汁のような昆虫の腸汁が有効である。各々の特定の酵素は、各々がエンドトキシン蛋白質に関して特有の特異性を有するので、少し異なる組の毒素を与える。市販の酵素の調製物を用いることができる。酵素の濃度範囲は0.1〜２mg／mL、好ましくは１mg／mL である。蛋白質分解酵素でのエンドトキシンの消化の温度は重大でなく、 20〜40℃で種々であり、好ましくは37℃である。加水分解の持続期間も重大でないが、与えられたpH、温度及び酵素濃度条件下でほぼ完全な毒素の遊離を確かにするのに十分に長いべきである。トリプシン消化のために、消化の時間は約10分〜12時間である。加水分解は、特定の範囲におけるpHを有する未緩衝又は緩衝溶液において行われ得る。適した溶液の例は、３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸／NaOH緩衝液（CAPS）ホウ酸緩衝液又はNaOHの未緩衝液である。全ての溶液が等しく効果的であるわけではない。加水分解中に遊離された毒素は明らかに疎水的で水にほとんど溶けないので、この溶液が毒素蛋白質分子の可溶化を補助する構成物を含むことが好ましい。このような構成物の１つの例は、３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸（CAPS）である。加水分解の後、反応混合物の固体構成物は、例えば遠心又はろ過により除去される。ろ過物（上清）のサンプルはHPLC分析のために用いられる。このペレットは（完全な消化のしるしとして）位相差顕微鏡によりいずれの認識可能な封入体も含まない。蛋白質加水分解の産物のHPLC分離は、それにより毒素が同定され、定量され得るフィンガープリントを供する。毒素の適切な可溶性を達成するために、分離は、約10以上、好ましくは10.5〜11.5のpHにおいて行われなければならない。他方、pHは毒素の変性を避けるため、及びカラムの適切な動作を確かにするために約 12以下であるべきである。特定の範囲のpHにおいて、毒素の分子は負電荷であり、分離は液体−固体陰イオン交換クロマトグラフィーとして行われる。HPLC技術の使用は、短い期間における分離の達成を許容する。本発明に従う毒素の分離は示された広範囲におけるpHのいずれかの値で行われ得るが、10.5〜11.5の好ましいpH範囲より上のpHに増加されることは、分離された蛋白質の変性の危険を不必要に増加させ、カラムに不可逆的損害を与える。他方、pHを10.5未満に減少させることは、毒素がHPLCカラムにおいて沈殿し、少くとも部分的に定量的分析の信頼性に逆の影響を与える危険を増加させる。これらの理由のため、約10.5〜11.5のpH範囲が最適だと考えられる。陰イオン交換体が充填されたカラムが分離のために用いられる。弱い及び強い陰イオン交換樹脂が用いられ得る。弱陰イオン交換体が好ましい。ジエチルアミノエチルポリ（メチルメタクリレート）が特に好ましい。カラムからの毒素の溶出は塩化ナトリウムのような塩の増加的勾配において適切な緩衝液を用いて室温で行われる。用いられる緩衝液は第１に溶離液の要求されるpHの維持を行うことである。しかしながら、pHばかりでなく緩衝液の組成が分離の成功のために重要であるようである。１つの好ましい実施形態において、0.05ＭのCAPS／NAOH緩衝液（pH ＝10.5）が用いられる。しかしながら、新しい組の溶出条件での代わりの緩衝システムが見い出され得ることも歓迎されよう。塩勾配の条件は、塩の増加的濃度を有し、予め決定された順番で及び予め決められた時間において、導入される一連の緩衝液を用いることにより通常達成される。分離において用いられる塩はカラムにむしろ強く結合するべきであるが、分離される蛋白質に結合しない又はさもなければそれに逆の影響を与えないべきである。適した塩の例は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム及び酢酸ナトリウムを含む。臭化物及びヨウ化物も用いられ得る。塩化ナトリウムが好ましい。いくつかの塩、例えばカルシウム塩はいくつかの蛋白質に結合して蛋白質の特性に影響を与える。それゆえこれらの塩は適さない。適切な塩の選択は当業者に問題のないものであろう。本発明の最も好ましい実施形態に従って、クロマトグラフィーカラムは、２つの段階において、加水分解後直ちに行われる。最初の溶離液は0.05Ｍ CAPS／Na OH緩衝液、pH11.5で、次に0.05Ｍ CAPS／NaOH緩衝液及び0.5ＭNaCl、pH11.5の第２の溶離液である。第２の溶離液は、第２の溶離液の量がサンプルの性質によって25〜40分間にわたり０から33％に直線的に増加するようにカラムに同時に導入される。このステップは、毒素が溶離する20〜50分の無勾配期間が次に行われる。候補のピークに相当する部分が収集され、濃縮され、分離された毒素の同定及び精製を確立するように再注入される。半調製用又は調製用カラムを用いて分離を行う場合、活性型ネイティブ毒素が単離され、収集され得る。エンドトキシン結晶体のプロトキシンの蛋白質加水分解から生ずる毒素の迅速な同定、定量及び精製の方法は、当該技術において相当な関心のものである。それは、周知の株に対する迅速な比較により新しいBt単離物をスクリーニング及びテストする手段を提供する。それは、多重遺伝子株からの最も必要とされる毒素の産出を最適化するための発酵条件の操作における実験を許容する。それは、製造者が競争者の株により製造されたBt毒素を特徴づけることを可能にする。分離された毒素は純粋かつ活性形態において収集され得るので、本方法は、特定の及び制御された様式において調製された個々の精製された毒素及び個々の毒素の混合物をテストすることを許容するであろう。Btの多重遺伝子株に特に関心があるが、本方法はBtの単一遺伝子株のために及び例えば大腸菌においてクローニングされたBt遺伝子からの封入体の分析のために明らかに同様の適用を有する。実験実施例１バシラス・チュリンジエンシスvar．kurstaki NRD-12多重遺伝子株からの毒素の分離及び単離 1986年７月25日にアクセス番号NRRL-HD-945下においてNorthern Regional Res earch Laboratory(NRRL)，1815 North University Avenue，Peoria，Illinois， USA 61604に寄託。１．副芽胞結晶体の精製精製された結晶体を次の文献の手順に従って調製した（例えば、Carey et al ．Biochim Biophys.Acta，872 ，169(1986)）。２．トリプシン消化 0.1Ｍ CAPS／NaOH、pH10.5緩衝液中20mg／mL NRD-12結晶体懸濁液を１mg／mL の市販の膵臓のトリプシンで処理した。この反応混合物を一晩室温で撹拌して15 分間、10,000rpmで遠心した。デカントした上清を0.22μｍカットオフ膜を通してろ過した。３．弱陰イオン交換体を用いるHPLC分離自動インジェクター及びホトダイオードアレーディテクターを備えたWaters 9 90溶媒輸送システムを用いて分離を行った。Protein PAK DEAE 5 PW陰イオン交換カラム(7.5×75mm分析用又は21.5×150mm半調製用、Waters)を用いた；注入量 −１〜20,000μＬ；流速−４mL／分。複合溶出勾配に３の緩衝液を用いた：用いられた勾配条件を図１に示す。図２は、分離された毒素のピークがＢ，Ｃ及びＤとして示される、これらの勾配条件下におけるトリプシン消化のクロマトグラムを示す。ピークＢはcryIA(a)〔4.5〕遺伝子毒素に相当し、ピークＣはcry IA(b)〔5.3〕遺伝子産物に相当し、そしてピークＤはcryIA(c)〔6.6〕遺伝子産物を表す。カラムの条件又はpHもしくは塩濃度の極めて小さな変化は、数分間の特定の蛋白質の保持時間のシフトをおこし得る。図２に見られ得るように、おおよそ溶出の最初の60分の間に分離がおこる。次の溶出は後の分離のためのカラムのクリーニング及び再生のためである。比較テストにおいて、図８に示されるように、30分間０から0.5Ｍへ増加する塩濃度の直線的勾配がProtein PAK DEAE 5PW分析用カラムのために用いられる場合、毒素の分離が観察されない。これらの勾配条件下でのトリプシン消化のクロマトグラムを図９に示す。ピーク７の周りの領域が毒素を含む。４．毒素単離及び精製Ｂ，Ｃ及びＤの候補のピークに相当する部分をHPLC溶出液から収集し、８kDa ポリエチレングリコール／3.5kDaカットオフ透析チューブを用いて濃縮し、そして精製を確立するためにHPLCカラムに再注入する。各々のクロマトグラムを図３，４及び５に示す。繰り返しの注入−単離手順により、単離された毒素の100％純度が達成され得る。５．毒素同定の確立先に記載のように単離、精製された毒素をCNBrを用いて切断し、結果として生ずるフラグメントをSDS−ポリアクリルアミド、ゲル電気泳動（SDS-PAGE）にかけた。このゲルをポリビニリデンジフルオライド膜上にエレクトロブロットした。この膜内のペプチド結合を染色して、可視化されたペプチド結合を切除して、候補のフラグメントを、900Ａコントロール／データ分析モジュールと共にオン −ライン120APTHアナライザーを備えた470Ａ気相シーケンサーを含むApplied Bi osystems 475A蛋白質シーケンシングシステムにより配列決定した。 Bt var．kurstaki NRD-12の３遺伝子株のために３つの候補の蛋白質をHPLC溶出液（各々図２及び図３，４及び５におけるピークＢ，Ｃ，Ｄ）から単離した。これらの蛋白質のために、SDS-PAGEは３つの異なる切断のパターンを示した。各々の切断パターン内の個々のバンドのシークエンシングは、３つの毒素の各々のための特有の配列に相当するアミノ酸配列を示した。これらの配列は各々の遺伝子の実験的に決定されたDNA配列から知られている。図10はトリプシンにより活性化され、cryIA(a)〔4.5〕，cryIA(b)〔5.3〕及び cryIA(c)〔6.6〕として各々同定された同一の配列断片に従ってアラインされた３つの毒素の配列を示す。図10において下線の配列は、単離、配列決定されており、そのほとんどが１の蛋白質に特有のアミノ酸配列を含むペプチドに相当する。６．検査されたBt株先に記載のように、次のBtの株の毒素成分を検査した： Bt var．kurstaki HD-1 (３蛋白質)(NRRL B-3792 16／６／70) Bt var．kurstaki NRD-12(３蛋白質)(NRRL HD-945 25／７／86) Bt var．kurstaki HD-73 (１蛋白質)(NRRL B-4488 11／４／79) Bt var．entomocidus (２蛋白質)(NRRL B-4046 10／１／72) Bt var．aizawai HD-133(２蛋白質) Bt var．kurstaki A20 (３蛋白質) 及び３の大腸菌クローン。各々は単一のBt遺伝子を含み、単一の毒素産物を与える。これらの遺伝子の各々は天然のHD-1株における３つの遺伝子の１つに相当する。大腸菌毒素及び相当するHD-1毒素のためのHPLC保持時間は同一であった。７．強陰イオン交換体を用いる代わりのHPLC分離この分離は、−CH₂−N(CH₃)₃電荷基を有するMono Q HR 5／5(Pharmacia)陰イオン交換カラムを用いて行った；注入量１−20,000Ｌ；流速−１mL／分。溶出勾配に２つの緩衝液を用いた：用いられた勾配条件を図６に示す。図７はこれらの勾配条件下でのトリプシン消化のクロマトグラムを示す。ここで、分離された毒素に相当する溶出のおおよそ22〜28分に現れるピーク10，11及び12は、cryIA(a)〔4.5〕，cryIA(b)〔5.3〕及びcryIA(c)〔6.6〕遺伝子産物である。図６に見られ得るように、35分間に０から0.5Ｍに増加する塩化ナトリウムの直線的勾配下で分離がおこる。実施例２次の勾配表に従う２つの緩衝液を用いて溶出を行った他は、実施例１と同じ方法を用いて次のBt株を分析して遺伝子産物を同定した。弱陰イオン交換体も用いた。マイクロシーケンシング及びバイオアッセイにより結果を確認した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年５月２１日【補正内容】明細書更なる引用、Yamamoto，T.，Ehmann，A.，Gonzalez，J.M.Jr．and Carlton，B .C.Expression of Three Genes Coding for 135-kilodalton Entomocidal Prote ins in Bacillus thuringiensis kurstaki Current Microbiol．17，5-12（198 8）において、同じペプチドマッピング方法が行われる。この引用において、プロトキシンは、トリプシン加水分解の前に予め精製される。加水分解の後、毒素混合物は尿素で変性され、逆相HPLCを用いるペプチドマッピングのためにトリプシンにより再消化される（ペプチドは酸に溶かされ、酸／アセトニトリル混合物において溶出される）。先に記載のように、これは毒素の生物活性を破壊する。不運なことに、多重遺伝子株からの結果物を解釈するために単一遺伝子標準を用いるこの結果として生ずるペプチドマッピングは、株kurstaki HD-1においてcry IA(c)〔6.6〕遺伝子産物の存在を認識するのに失敗した。この遺伝子及びその蛋白質毒素は、他の研究者により存在することを示される重要な構成物である。更に、Hernstadt，C．and Wilcox E.Cloning and Expression of Bacillus th uringiensis Toxin gene Toxic to Beetle of the Order Coleoptera．米国特許 4,853,331(1989)において、単一遺伝子のクローニング及び大腸菌宿主細胞による単一Bt蛋白質の製造が記載される。この毒素はアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。大規模な生物学的に活性なBt毒素の単離は以前に記載されている。J.Bacterio l.，Vol 171，No.6，1989，pp.3060-3067，Drobniewski et alは、蚊に対する生物活性についてテストされるＢ．チュリンジエンシスのδ−エンドトキシン結晶体毒素からの23kDaポリペプチドの精製の方法も記載するが、本適用におけるような大規模において適用されない。更に、異なる単離プロトコルを用いて、この文献は、その生物活性状態におけるBt多重遺伝子株から密接に関連した毒素を単離する問題を解決しない。それと反対に、毒素の生物活性を維持しながらBt遺伝子により発現されたプロトキシンの同定、定量及び精製を供する先に記載の技術はないであろう。実際、これらの引用は、考え、即ち毒素の生物活性の破壊が無関係であるペプチドマッピングにおける異なる目的を有する。しかしながら、我々の発明において、毒素の生物活性は実質的に完全なままでなければならない。従って、我々はこれらの先行技術において用いられる逆相HPLC技術を用いることができない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 30/88 0275−2ＪＧ０１Ｎ 30/88 Ｊ // Ｃ１２Ｐ 21/00 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/00 Ｃ (72)発明者カーレイ，ポール，リチャードカナダ国，オンタリオケー１ケー４ジェイ３，オタワ，ヒルサイドドライブ 37−100 (72)発明者ヤグチ，マコトカナダ国，オンタリオ，オタワ，プリンスオブウェールズドライブ 2206− 1380 (72)発明者レッサード，ティモシーカナダ国，オンタリオケー０エー２ゼット０，リッチモンド，ピー．オー．ボックス 1057，キングストリート 72

Claims

【特許請求の範囲】１．バシラス・チュリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）遺伝子により発現されたプロトキシンを同定するための方法であって、該方法が、 10〜12の範囲のpHにおいて水性懸濁液中でバシラス・チュリンジエンシスプロトキシン含有材料を蛋白質分解酵素で加水分解して可溶化された娘毒素を作るステップと、 10〜12の範囲の実質的に一定のpHにおいて、並びに緩衝液のみを含む第１の溶離液の使用並びに該緩衝液及び適切な塩を含む少くとも１の他の溶離液の予め決定された期間にわたる段階的導入に相当する水性条件下において前記娘毒素を高性能陰イオン交換液体クロマトグラフィーにかけるステップであって、前記溶離液中の塩の濃度の時間における変化が、生物学的に活性な状態における前記娘毒素が加水分解の他の産物から分離されることを引きおこすステップと、前記娘毒素により生じた前記クロマトグラフィーのシグナルから前記プロトキシンを同定及び必要に応じて定量するステップと、を含むことを特徴とする方法。２．前記遺伝子がバシラス・チュリンジエンシスの株により発現され、前記方法が該株をキャラクタライズするのに用いられることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．前記バシラス・チュリンジエンシスの株が多重遺伝子株であり、前記方法が、各々の遺伝子により発現されたプロトキシンから得られた個々の娘毒素を分離することにより、前記株をキャラクタライズするのに用いられることを特徴とする請求項２に記載の方法。４．前記株が周知の株であり、前記方法が、前記遺伝子の発現のレベル及び前記株の生存度を決定するのに用いられることを特徴とする請求項３に記載の方法。５．前記蛋白質のプロトキシンが、クローン化されたバシラス・チュリンジエンシス遺伝子により発現されることを特徴とする請求項１に記載の方法。６．生物学的に活性な状態において個々の毒素を単離及び精製するステップを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。７．前記プロトキシン含有材料がバシラス・チュリンジエンシスの副芽胞結晶体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。８．前記プロトキシン含有材料が発酵ブイヨンから分離されたバシラス・チュリンジエンシスの粗発酵混合物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。９．前記蛋白質分解酵素が、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ及び昆虫腸汁からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 10．前記蛋白質分解酵素がトリプシンであることを特徴とする請求項９に記載の方法。 11．前記加水分解が約10.5のpHにおいて直接行われることを特徴とする請求項 10に記載の方法。 12．前記加水分解が0.1Ｍの３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸／NaOH緩衝液において行われることを特徴とする請求項11に記載の方法。 13．前記加水分解が約20〜約40℃の温度において行われることを特徴とする請求項11に記載の方法。 14．前記クロマトグラフィーが10.5〜11.5のpHにおいて行われることを特徴とする請求項12に記載の方法。 15．前記クロマトグラフィーが0.05Ｍの３−シクロヘキシルアミノ−Ｉ−プロパンスルホン酸／NaOH緩衝液において行われることを特徴とする請求項14に記載の方法。 16．前記塩が塩化ナトリウムであることを特徴とする請求項13に記載の方法。 17．前記陰イオン交換体が弱陰イオン交換体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 18．前記陰イオン交換体がジエチルアミノエチルポリ（メチルメタクリレート）であることを特徴とする請求項17に記載の方法。 19．前記陰イオン交換体が強陰イオン交換体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 20．前記陰イオン交換体がトリメチルアンモニウムメチル基を含むことを特徴とする請求項19に記載の方法。 21．前記クロマトグラフィーが前記加水分解が行われるpHと実質的に同じpHで行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。 22．加水分解後の前記溶液がクロマトグラフィーに直接かけられることを特徴とする請求項21に記載の方法。 23．前記高性能液体クロマトグラフィーのシグナルが、周知のバシラス・チュリンジエンシスにより発現されたプロトキシンに同じ条件下での同じ蛋白質分解酵素での加水分解を行い、次に同じ条件下での陰イオン交換高性能液体クロマトグラフィーを行うことにより得られるクロマトグラフィーのシグナルと比較することにより同定されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 24．前記プロトキシン含有材料が10.5のpHを有する0.1Ｍの３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸／NaOH緩衝液においてトリプシンで加水分解され、加水分解後の前記溶液がジエチルアミノエチルポリ（メチルメタクリレート）に基づくクロマトグラフィーに直接かけられ、第１の溶離液が10.5のpHを有する0.05Ｍの３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸／NaOH緩衝液であり、第２の溶離液が0. 17Ｍの塩化ナトリウムを含む同じ緩衝液であり、前記２つの溶離液が、前記第２の溶離液の量が約20分間にわたり０から100％に直線的に増加するように同時に導入され、第３の溶離液が0.5Ｍの塩化ナトリウムを含む同じ緩衝液であり、前記第３の溶離液が、前記第２の溶離液の量が100％に達した後約15分に始まるように導入され、そして前記第３の溶離液の量が約15分間にわたり０から10％に直線的に増加することを特徴とする請求項１に記載の方法。 25．前記プロトキシン含有材料が10.5のpHを有する0.1Ｍの３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸／NaOH緩衝液においてトリプシンで加水分解され、加水分解後の前記溶液がトリメチルアンモニウムメチル基を含む樹脂に基づくクロマトグラフィーに直接かけられ、第１の溶離液が10.5のpHを有する0.05 Ｍの３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸／NaOH緩衝液であり、第２の溶離液が0.5Ｍの塩化ナトリウムを含む同じ緩衝液であり、前記２つの溶離液が、前記第２の溶離液の量が約35分間にわたり０から100％に直線的に増加するように同時に導入されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 26．前記第２の溶離液が約30分間超にわたり導入されることを特徴とする請求項25に記載の方法。 27．前記プロトキシン含有材料が10.5のpHを有する0.1Ｍの３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸／NaOH緩衝液においてトリプシンで加水分解され、加水分解後の前記溶液がトリメチルアンモニウムメチル基を含む樹脂に基づくクロマトグラフィーに直接かけられ、第１の溶離液が11.5のpHを有する0.05 Ｍの３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸／NaOH緩衝液であり、第２の溶離液が0.5Ｍの塩化ナトリウムを含む同じ緩衝液であり、前記２つの溶離液が、前記第２の溶離液の量が約40分間にわたり０から33％に直線的に増加するように同時に導入されることを特徴とする請求項１に記載の方法。