JPH10501616A - 漸減励起された発光を検出するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、励起光の入力結合のための回折格子が具備されており、前記基材（ａ）の屈折率が導波層（ｂ）の屈折率よりも低い、薄く透明な導波層（ｂ）が施された透明な基材（ａ）からなる平面の誘電体光センサー載台を用い、液体試料を該層（ｂ）と接触させ、試料中の発光特性を有する物質によるか又は該層（ｂ）上に固定された発光特性を有する物質により生成された発光を、電気光学的に測定する方法である。本発明は、同様に、定量的親和性検知におけるこの方法の使用、及び、光学的に濁った溶液中の発光成分の定量的測定のためのこの方法の使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 漸減励起された発光を検出するための方法 本発明は、導波路に基づく平面の誘電体光センサー載台を用いて、漸減的に励 起された発光を測定するための方法に関する。本発明は、同様に、定性的親和性 検出のためのこの方法の使用、及び光学的に濁った溶液中の発光成分の選択的定 量測定のためのその使用にも関する。 光学的により薄い媒質によってとり囲まれている平面型導波路内に光波が結合 すると、この光波は、全反射率により導波層の界面に導かれる。平面型導波路は 最も簡単な場合には３層システム：基板、波伝導層、及び上層（例えば、検定用 試料）からなり、波伝導層は最も高い屈折率を有している。付加的な中間層が、 平面型導波路の活性を更に一層増強させることができる。 光エネルギーの一部分は光学的により薄い媒質に進入する。この部分は、漸減 （減衰）場（evanescent(=fading)field）と呼ばれている。漸減場の強度は、導 波層自体の厚み、及び導波層の屈折率ととり囲む媒質の屈折率の比により非常に 大きく左右される。薄い導波路、すなわち導くべき波長よりも小さな層厚の場合 、伝導される光の離散的モードを識別することが可能である。漸減場を用いると 、例えば光学的により薄い媒質の中で被伝搬光波に直接隣接してのみ、発光を励 起することができる。この原理は、漸減発光励起と呼ばれている。 漸減発光励起は、励起が導波層の直接的環境に制限されているので、分析の分 野において非常に興味があるものである。 発光染料で標識付けされた抗体又は抗原の漸減励起発光を検出するための方法 及び装置は、知られており、とりわけＵＳ−Ａ−４５８２８０９号に記載されて いる。この出願明細書中に請求されている集成装置は、漸減 発光励起のための光ファイバーが使用されている。このような光ファイバーは、 典型的には１ミリメートルまでの直径を有し、レーザー光がそれに結合されたと き多数のモードを処理する。漸減励起発光は、ファイバーの中を通り抜けて戻っ た部分(traction tunnelled back)によってのみ簡単な方法で測定することがで きる。装置の寸法がきわめて大きいこと及び比較的大きい試料体積が必要とされ ることが更なる欠点である。この装置は大きさを実質的に縮小すること、又は集 積型光センサーにまで小型化することができない。通常、感度の増強には、装置 寸法の増大が伴う。 平面型光学導波路を用いた漸減励起条件下でのバイオセンサーの発光を検出す るための測光計器も、同様に知られており、とりわけＷＯ９０／０６５０３に開 示されている。そこで使用されている導波層は、１６０〜１，０００nmの厚みを 有し、励起波への光の結合(coupling of light)は、結合格子なしで行われる。 漸減励起発光の感度を増強するためと集積型光センサーを製造するためのさま ざまな試みが行われてきた。かくして、例えば、Biosensors & Bioelectronics 6(1991)，595-607は、励起波への光の結合がプリズムを用いて行われ、２工程式 イオン交換プロセスで製造される平面型単モード又は低モード導波路について報 告している。使用される親和性系は、ヒト免疫グロブリンＧ／フルオレセインで 標識付けされたプロテインＡであり、ここで抗体は導波路上に固定され、リン酸 緩衝液中で検出されるべききフルオレセインで標識付けされたプロテインＡは、 導波路の測定領域を覆うポリビニルアルコールのフィルムに添加される。この方 法のかなりな欠点は、導波層と基板層の間の屈折率のわずかな差しか達成できず 、その結果、感度は比較的低いものとなる、ということである。 プロテインＡに結合されたイソチオシアン酸フルオレセインにおいて、 感度は２０nmであると言われている。これは、微細な痕跡を検出できるにはまだ 不充分であり、感度の更なる増強が必要である。更に、プリズムによる励起波へ の光の結合の再現可能性及び実行可能性は、プリズムと導波路の間の接触領域の 品質及び大きさに結合効率が著しく依存していることからみて、むずかしいよう に思われる。 もう１つの原理は、ＵＳ−Ａ−５０８１０１２号で提案されている。平面の導 波層は２００nm〜１，０００nmの厚みを有し、２つの格子構造を含み、そのうち の１方の格子構造は反射格子として設計され、そのために、導波路に結合された 光波は少なくとも２回格子構造の間のセンサー領域を横断しなければならない。 この方法により、感度の増強が達成されると言われている。１つの欠点は、反射 された放射線が、バックグラウンド放射線強度の望ましくない増大を導くことが できるという点にある。 平面型導波路の製造法は、基材の平面構造、導波層の一定の厚み及び均質性並 びに使用される材料の屈折率が非常に重要である方法である。これについては、 とりわけＥＰ−Ａ−０５３３０７４号に記載されており、そこではプラスチック 基材に対して無機導波路を適用することが提案されている。この方法は、例えば 、プラスチック材料内に、構造をエッチングすることによって結合用回折格子の 経済的に有用な構造化が実施できるという利点を有する。しかしながら、他方で は、プラスチック基材の光学的品質に対する要求度が高くなる。 平面型導波路は、光ファイバーに基づく導波路に比べ、大規模生産において著 しい利点を提供する。特に、通常、ファイバーの切断された端部に最終研磨をほ どこして完全な光学的品質を得ることが必要である。しかしながら、平面型導波 路は、大きな寸法で製造し、その後で望ましい大きさに押し抜いたり、破断又は 切断することができる。端部に最終的研磨を施 す作業はほとんどの場合、不要とすることができ、それにより大規模生産はより 経済的なものとなる。 結合回折格子を伴う平面型導波路が有する更なる利点は、測定装置又は測定用 装備における簡単な較正と、例えば分析対象物を固定するための簡単な被覆を施 す、といった点にある。この目的のためには、再現可能な一定の層厚を調製する ことのできる被覆技術の標準的方法を使用することが可能である。このような方 法の典型的な例としては、噴霧、ナイフ被覆、スピン被覆又は浸漬塗装である。 品質制御も同様に、既知の非常に正確な方法により実施することができる。適当 な方法は、顕微鏡又はインターフェロメトリー法、楕円偏光法又は接触角測定法 である。光ファイバーに基づく導波路内に発生する湾曲した表面については、こ れらの方法は適用できないか、又は適用が困難である。 実際の導波層の他に、導波層への光波の結合の性質が主な問題点を構成してい る。集積型光センサーのためのテーパー付き導波路への光の結合のために回折格 子に課せられる必要条件は、とりわけ、Chemical，Biochemical and Environmen tal Fiber Sensors V，Proc．SPIE，Vol 2068，1-13，1994 で議論されている。 導波路の層厚及び回折格子の深さ変調は、この参考文献において重要な要点とし て記載されている。その中で提案されているシステムは、典型的には、集積型光 学光ポインタとして使用できるが、検出すべき発光については全く言及されてい ない。 発光測定のために集積型結合回折格子と共にこのような平面型導波路を使用す ることが望ましい場合には、それらの有用性及び高感度の達成のため不可欠な要 点は、充分に大きな入力結合効率、できるかぎり強い漸減場、及び被伝搬波の低 い減衰である。これらの要点は、導波層の屈折率及び基材材料の組み合わせ、並 びに存在する全ての中間層、導波路の層厚、 結合回折格子の構造、深さ変調及び回折格子周期によって決定的に左右される。 更に、表面及びそれらの平面構造又は粗密度が必須の光学的品質として存在して いる。 現在、簡単な方法、かつ付加的な反射回折格子なしで、屈折率、層厚及び深さ 変調といった上述の重要な要点を組合せることによって高感度で発光の漸減励起 と検出のための方法を実施することが可能であることがわかっている。典型的に は、被伝搬光波の減衰は、このとき３dB/cm 未満であり、それにより結果として 、被伝搬ビームの長い距離と、とり囲む媒質内への被伝搬波の低い散乱をもたら す。特に、これらの条件下では、ＴＥＯ及びＴＭＯモードを導くことが好ましい 。発光を測定することに加えて、吸収性試料の存在下で励起光の吸収を高い精度 で測定することができるためには、この伝搬距離で充分である。 １つのモードのみか又は少数のモードが導かれるこれらの平面型導波路は、特 に高い感度及び小型化された構成によって特徴づけられている。通常、この感度 は、平面構成又は繊維質構成の多モード導波路によっては達成できず、また達成 されたとしても、はるかに大きな幾何的寸法を伴ってのみ可能である。 結合回折格子の入力結合（input-coupling）効率は高く、そのために導波路に 結合される光波の強度は同様に高くなり、その結果低い減衰と合わさって優れた 感度がもたらされることになる。 この感度は、漸減場が驚くほど強いこと、かつかくして生成された高い電磁場 が感度の更なる増強に寄与することによって、一層高められる。それにより、導 波層の表面で最少量の発光材料さえも検出する可能性が提供される。 したがって、本発明は、その１つの形態において、励起光の入力結合 のための回折格子が具備されており、かつ基材（ａ）の屈折率が導波層（ｂ）の 屈折率よりも低い、薄く透明な導波層（ｂ）が施された透明な基材（ａ）からな る平面の誘電体光センサー載台を用い、液体試料を該層（ｂ）と接触させ、試料 中の発光特性を有する物質によるか又は該層（ｂ）上に固定された発光特性を有 する物質により生成された発光を、電気光学的に測定することにより検出するた めの方法であって、 （Ａ）該励起光が平面型導波路の中に結合(coupled)し、かつ導波層を横断し 、それにより発光特性を有する物質が導波層の漸減場で発光まで励起され、 （Ｂ）該回折格子は３〜６０nmの深さ変調を有し、 （Ｃ）該層（ｂ）の厚みが４０〜１６０nmであり、そして （Ｄ）該層（ｂ）厚みに対する該深さ変調の比が０．５より小さい、 ことを特徴とする方法に関する。 本発明の範囲内では、平面の誘電体光センサー載台というのは、この載台が、 裸眼で見て平面に見えることを条件として、細片、平板、円板又はその他のあら ゆる幾何形状をしているということを意味する。選ばれた幾何形状は、本質的に 重要ではなく、センサー載台が組み込まれる装置全体の構成によって左右され得 る。しかしながら、これは、励起光源及び電気光学的検出システムから空間的に 分離された、独立した素子として使用することもできる。好ましい配置は、実質 的な小型化を可能にするような配置である。 適切な基材は、典型的には、あらゆる種類のガラス又は石英である。できるか ぎり低い光学屈折率及びできるかぎり低い固有発光を有し、しかも、例えばエッ チング、カッティング及び研磨といったようなできるかぎり簡単な方法で光学的 に処理することのできるガラスを使用することが好 ましい。基材は、少なくとも励起及び発光波長において透明でなくてはならない 。 基材は、また、例えばＥＰ−Ａ−０５３３０７４号に記載されているようにプ ラスチック材料であってもよい。 基材は、また、基材のそれより低いか又は同一の屈折率を有し、かつ１０μm 未満の厚みを有する薄い層が具備されていてもよい。この層は基材の表面粗密度 を低減するのに役立つことができ、熱可塑性、熱硬化性又は構造的に架橋された プラスチック、又はＳｉＯ₂といったような無機材料で構成されていてもよい。 発光励起のためには、実質的に平行な光のみが適している。本発明の範囲内で は、「実質的に平行な」という表現は、５°未満の相違を意味するものとして理 解される。このことはすなわち光が弱い発散性又は収斂性を有していてよいとい うことを意味する。 発光励起のためにはコヒーレント光、より特定的に言うと、波長３００〜１， １００nm、更に特定的には４５０〜８５０nm、最も好ましくは４８０〜７００nm のレーザー光を使用することが好ましい。 適切に使用できるレーザーは、色素レーザー、ガスレーザー、固体レーザー及 び半導体レーザーである。必要な場合には、発光波長は、非線形光学的結晶によ り２倍化させることもできる。ビームは、更に光学素子により集束させたり、偏 光させたり、又はグレーフィルターによって減衰させたりすることもできる。特 に適切なレーザーは、それぞれ４５７nm〜５１４nm及び５４３nm〜６３３nmの波 長で発光する、アルゴン、イオンレーザー及びヘリウム−ネオンレーザーである 。特に優れて適切なレーザーは、６３０nm〜１，１００nmの基本波長で発光する 半導体材料のダイオードレーザー又は周波数２倍化ダイオードレーザーである。 これは、こ れらのレーザーが、寸法が小さく電力消費量が低いことからセンサーシステム全 体の実質的な小形化を可能にするからである。 本発明の範囲内では、「試料」という語は、測定されるべき物質、すなわち分 析対象物を含有する可能性のある、検定されるべき溶液全体を意味するものとし てとられるものとする。測定は単一工程又は多工程方式の検定の中で行うことが でき、その間、センサー載台の表面は１つ又は２つ以上の溶液と接触させられて いる。利用される溶液のうち少なくとも１つは、本発明の実施において検出され 得る発光特性を有する物質を含有することができる。 発光特性を有する物質がすでに導波層（ｂ）上に吸着されている場合には、試 料は、発光成分を含まなくてもよい。この試料は、更なる成分、すなわち典型的 にはpH緩衝液、塩、酸、塩基、表面活性物質、粘度に影響を及ぼす改質剤又は染 料を含むことができる。特に、溶媒として生理食塩水を使用することができる。 発光成分自体が液体である場合、溶媒を添加せずにすませることができる。この 場合、試料は、発光特性を有する成分を１００％まで含むことができる。 試料は、更に生物学的媒質、例えば卵黄、体液又はその構成成分、特に血液、 血清、血漿又は尿を含有してもよい。更に、試料は、地表水、土壌又は植物の一 部分といったような天然の又は合成の媒質の抽出物溶液、生物加工ブロス又は合 成ブロスで構成されていてもよい。 試料は、未希釈であっても、付加的に溶媒と共に用いられてもよい。 適切な溶媒は、水、水性緩衝液及びタンパク質溶液並びに有機溶剤である。適 切な有機溶剤は、アルコール、ケトン、エステル、及び脂肪族炭化水素である。 水、水性緩衝液、又は水と水混和性有機溶剤を使用することが好ましい。 しかしながら、試料には、例えば顔料粒子、分散剤、天然又は合成のオリゴマ ー又は重合体といった、溶媒中に不溶な構成成分を含むことができる。 適切な発光化合物は、典型的にはローダミン、フルオレセイン誘導体、クマリ ン誘導体、ジスチリルビフェニル、スチルベン誘導体、フタロシアニン、ナフタ ロシアニン、ポリピリジル−ルテニウム錯体、例えばトリス（２，２′−ビピリ ジル）−ルテニウム塩化物、トリス（１，１０−フェナントロリン）ルテニウム 塩化物、トリス（４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン）ルテニウ ム塩化物及びポリピリジル−フェアジン−ルテニウム錯体、白金−ポルフィリン 錯体例えばオクタエチル−白金−ポルフィリン、長寿命ユーロピウム及びテルピ ウム錯体又はシアニン染料をも含む、３３０nm〜１，０００nmの波長範囲の発光 を有する発光染料である。血液又は血清中での分析のために特に適しているのは 、６００〜９００nmの範囲の吸収及び発光波長を有する染料である。 特に適した発光性化合物は、例えばイソチオシアン酸フルオレセインといった 、共有結合することができる官能基を含有するフルオレセイン誘導体などの染料 である。 同様に非常に適しているのは、とりわけClinical Chemistry 40(9)：1819-182 2，1944に同様に記載されている単一及び二官能性Ｃｙ５．５^TM染料といったBio logical Detection Systems Inc.,から入手可能な機能性蛍光染料である。 好ましい発光は、蛍光である。 使用に好適な発光染料は、同様に、例えば抗体又は抗体フラグメント、抗原、 タンパク質、ペプチド、レセプター又はそのリガンド、ホルモン又はホルモンレ セプター、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖、 ＤＮＡ又はＲＮＡ類似体、プロテインＡ及びＧ、アビジン又はビオチンのような 結合タンパク質、酵素、酵素補助因子又は阻害物質、レクチン又は炭水化物のよ うな生化学親和性系の中の結合パートナーの１つ又は重合体に対して化学的に結 合されていてもよい。最後に言及した電子対共有発光標識付けは、可逆的又は不 可逆的（生）化学親和性検定に好ましく利用されるものである。また、発光標識 付けされたステロイド、脂質及びキレータを使用することもできる。特に、さま ざまなルーテニウム錯体のように、挿入において発光の増強を示す場合には、Ｄ ＮＡ鎖又はオリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーション検定のために、挿入 発光染料もまた特に興味がある。これらの発光標識付けされた化合物をセンサー 載台の表面上に固定されたその親和性パートナーと接触させた場合、測定された 発光強度から定量的に結合を測定することができる。例えば、酵素での発光消光 又はタンパク質の立体配座修飾による発光の増強の形で、試料が発光団と相互作 用した時点で発光の変化を測定することによっても分析対象物の定量的測定が可 能である。 導波層の屈折率は、用いられる基材及びあらゆる中間層の屈折率よりも大きく なくてはならない。好ましくは、平面の透明な導波層は、２より大きい屈折率を 有する材料で構成されている。 適切な材料は、典型的には無機材料、好ましくは、ＴｉＯ₂、ＺｎＯ、Ｎｂ₅Ｏ₅ 、Ｔａ₂Ｏ₅、ＨｆＯ₂又はＺｒＯ₂といった無機金属酸化物である。 Ｔａ₂Ｏ₅及びＴｉＯ₂が好ましい。 透明な導波層の厚みは、好ましくは８０〜１６０nmである。 励起光を導波層に結合するための回折格子の深さ変調は、好ましくは５〜３０ nmである。 回折格子は好ましくは、０．５−２の線対空間の比を有する。線対空間の比と いうのは、典型的には、矩形回折格子において線幅対空間幅の比率である。 励起光を結合するための回折格子は、光学回折回折格子、好ましくはレリーフ 回折格子の形態を有する。レリーフ構造は、異なる形のものであってよい。例え ば、正弦、矩形又はのこぎり歯構造が適切である。このような回折格子の製造方 法は知られている。これらを製造するためには、主として、例えばChemical，Bi ochemical and Environmental Fiber Sensors V．Proc．SPIE Vol 2068，1-13， 1944で記載されている方法のような写真製版又はホログラフィ方法及びエッチン グ技術が使用される。 回折格子構造は、基材上で製造し、その後導波層に移送することができ、この 導波層の中で回折格子構造はその後結像されるか、又は回折格子は導波層自体の 中で製造することができる。 回折格子周期は２００〜１，０００nmであることができ、回折格子は、好都合 にはただ１つの周期性しか示さない、すなわち単回折である。 本発明の方法において、試料は、固定状態で導波層と接触させ、かつその上に 連続的に導くことができ、サイクルは、まばら又は密のいずれであってもよい。 この方法の１つの特定の実施形態は、導波層（ｂ）の表面で直接分析対象物を 検出するために用いられる発光特性を有する物質を固定することからなる。発光 特性を有する物質は、例えば、タンパク質に結合され、それにより導波層の表面 でこの方法で発光まで励起されることができる発光団であることができる。この タンパク質に対する親和性を有するパートナーがこの固定層上に導かれる場合、 発光は改変することができ、該パート ナーの量はこの方法で測定することができる。特に、親和性錯体の両方のパート ナーは、例えば発光消光の形でのこの２つの間のエネルギー移動から濃度の測定 を行うことができるように、発光団で標識付けすることもできる。 化学的又は生化学的親和性検定を実施するための方法のもう１つの好ましい形 態は、分析対象物自体のための又は結合パートナーの１つのための化学的又は生 化学的検出物質として、特定の結合パートナーをセンサー載台の表面上に固定す ることからなる。検定は単工程方式又は多工程方式検定であることができ、その 連続する工程において、センサー載台の表面上に固定された検出物質のための結 合パートナーを含有する１つ又は２つ以上の溶液が導かれ、分析対象物は、部分 的工程のうちの１つにおいて結合状態となる。分析対象物の検出は、親和性検定 での発光標識付けされた関与物質を結合させることによって行われる。使用され る発光標識付けされた物質は、親和性検定の１つ又は２つ以上の結合パートナー 、又は発光団を有する分析対象物の類似体で構成されていてもよい。ただ一つの 判定基準は、分析対象物の存在が、選択的に発光信号を導くか又は選択的に発光 信号の変更を導くかである。 検出物質の固定は、典型的には、導波層上の直接的な疎水性吸収又は共有結合 によってか、又は、表面の化学的改質の後に例えばシラン化又は重合体層を施す ことによって実施される。更に、導波路上での直接的な検出物質の固定を容易に するため、導波層に対して直接接着促進層として例えばＳｉＯ₂からなる薄い中 間層を施すことができる。この中間層の厚みは、５０nm好ましくは２０nmを超え るべきではない。 適当な検出物質は、典型的には、抗原に対する抗体、免疫グロブリンに対する プロテインＡ及びＧといった結合タンパク質、リガンドに対する レセプター、その相補鎖に対するＲＮＡ及びＤＮＡの１本鎖及びオリゴヌクレオ チド、ビオチンに対するアビジン、酵素基質に対する酵素、酵素補助因子又は阻 害物質、炭水化物に対するレクチンである。それぞれの親和性パートナーのいず れがセンサー載台の表面上に固定されているかは、検定の構成によって左右され ることになる。 検定自体は、単一工程の複合化方法（complexing process）、例えば競合検定 、又は多工程方法、例えばサンドイッチ検定であることができる。 競合検定の最も簡単な場合においては、未知濃度の分析対象物と発光標識付け 以外は類似している既知量の化合物を含有する試料を、センサー載台の表面と接 触させ、ここで発光標識付けされた分子と標識付けされていない分子は、それら の固定された検出物質の結合部位について競合する。この検定形態においては、 試料が全く分析対象物を含有しない場合に、最大の発光信号が達成される。検出 すべき物質の濃度が増大するにつれて、観察中の発光信号は低くなる。 競合免疫検定においては、固定されるのは必ずしも抗体である必要はない。抗 原もまた検出物質としてセンサー載台の表面上に固定することができる。通常、 化学的又は生化学的親和性検定において、パートナーのいずれが固定されるかは 重要でない。これは、導波層の漸減場内の吸着された質量の変化に基づいている 、表面プラズマ共鳴又はインターフェロメトリーといった方法に比べて、発光に 基づく検定が有する基本的な利点である。 更に、競合検定の場合、競合は、センサー載台の表面の結合部位に制限される 必要はない。例えば、既知量の抗原をセンサー載台の表面上で固定し、次に発光 標識付けされた抗体及び分析対象物としての同じ抗原の検出 すべき未知量のみを含有している試料と接触させる。この場合、表面上に固定さ れている抗原と溶液状態で存在する抗原間の競合が、抗体の結合に関して起こる 。 多工程方式検定の最も簡単な場合は、一次抗体がセンサー載台の表面上に固定 されているサンドイッチ免疫検定である。検出すべき抗原の結合及び抗原の第２ のエピトープに対する検出を実施するために用いられる発光標識付けされた二次 抗体の結合は、抗原を含有する溶液及び発光標識付けされた抗体を含有する第２ の溶液との連続的接触によるか、又は上述のこれら２つの溶液の組合せにより実 施することができ、これにより最終的に抗原及び発光標識付けされた抗体からな る部分複合体が結合されることになる。親和性検定は、同様に、更なる付加的な 結合工程を含むこともできる。例えば、サンドイッチ免疫検定法の場合、いわゆ るＦｃ部分において前述のとおり実施される連続サンドイッチ検定において、一 次抗体として作用することになる免疫グロブリンを特異的に結合させるプロテイ ンＡは、第１工程においてセンサー載台の表面上に固定することができる。 典型的には既知のアビジン−ビオチン親和性系を用いた更なるタイプの親和性 検定が数多く存在する。 親和性検定タイプの例は、J.H．Rittenburg，Fundamentals of Immunoassay; in Dvelopment and Application of Immunoassay for Food Analysis，J.H．Rit tenburg(Ed.)，Elsevier，Essex 1990，又はin P.Tijssen，Practice and Theor y of Enzyme Immunoassays，R.H．Burdon，P.H．Van Knippenberg(Eds)，Elsevi er，Amsterdam 1985に見い出すことができるだろう。 更に、ただ一回の使用だけでなく再生してセンサー載台の表面を使 用することが可能である。適当な条件下、例えば低いｐＨ、高い温度の下で、有 機溶剤又はいわゆるカオトロピック試薬（塩）（chaotropic reagents(salts)） を用いて、固定された検出物質の結合能力を実質的に損なうことなく選択的に親 和性複合体を解離させることが可能である。厳密な条件は、特定の親和性系によ り強く左右される。 この方法のもう１つの基本的実施形態は、一方では、戻り結合(back-coupling )の場合に信号測定にまた適用されるが、導波路の漸減場に対する信号の生成を 制限し、他方では、平衡プロセスとしての親和性複合体形成の可逆性からなる。 連続流系内で適切な流量を用いることによって、漸減場内の結合された発光標識 付けされた親和性パートナーの、結合又は脱着又は解離を実時間で監視すること が可能である。したがって、この方法は、異なる会合定数又は解離定数を測定す るための動力学研究又は変位検定のためにも適している。 漸減励起発光の検出は、既知の方法で行うことができる。フォトダイオード、 フォトセル、光電子増倍管、ＣＣＤカメラ及び検出器セット、例えばＣＣＤセル などを適切に用いてもよい。発光は、その上のミラー、プリズム、レンズ、フレ ネルレンズ及び屈折率変化形レンズなどといった光学素子で結像することができ る。発光波長を選択するためには、フィルター、プリズム、単色フィルター、二 色フィルター及び回折回折格子といった既知の素子を用いることが可能である。 本発明の方法の１つの実施形態は、等方的に発光された漸減励起発光を測定す ることからなる。 本発明の方法のもう１つの実施形態には、センサー載台の端部において、この センサー載台で戻り結合された（coupled back）漸減励起発光を検出することが 含まれる。この戻り結合された蛍光の強度は驚くほど高 く、そのためこの方法を用いて同様に非常に優れた感度も達成できる。 本発明の方法のもう１つの実施態様は、等方的に放出された漸減励起発光並び に導波路に戻り結合された発光を、互いに独立して、ただし同時に測定すること からなる。導波層からの発光団の距離によって左右される２つの発光検出方法の 異なる選択性のため、この実施形態では、発光団の空間的分布についての付加的 な情報を得ることができる。したがって、これは、発光団の光化学減衰と発光団 を有する親和性複合体の解離を識別する可能性を提供する。 本発明の方法の１つの利点は、発光の検出の他に、照射された励起光の吸収も 同様に測定できるという点にある。光ファイバー又は平面構成の多モード導管路 と比べて、この場合、かなり優れた信号対雑音比が達成される。発光及び吸収の 同時測定により、高感度で発光抑制効果を測定することが可能となる。 この方法は、連続波（ＣＷ）モードで照射することによって実施することがで き、すなわち励起は、経時的に一定である光強度で行うことができる。 しかしながら、この方法は、例えば１ピコ秒から１００秒までのパルス長を有 する調時パルスの形での励起光の照射によるか、及び発光の時間分解された検出 （短いパルス長の場合）によるか又は秒〜分単位の間隔で実施することもできる 。この方法は、例えば分析的に結合形成の速度を監視するか又は短い露出時間を 用いた光化学減衰による発光信号の減少を防ぐことが望ましい場合にはつねに特 に有利である。適当な短いパルス長及び検出の適切な時間分解を用いることによ り、更に、短寿命放射線が減衰した後にのみ分析対象物の発光を検出することに よって、この場合好ましくは長寿命である標識付け用分子の発光から、センサー 材料及び試料の望ま しくないあらゆる発光構成成分の拡散光、ラマン及び短寿命発光を区別すること が可能である。更に、時間分解された発光検出は、パルス励起（変調された励起 及び検出とちょうど同じように）の後、分子発光の減衰に対する分析対象物の結 合の影響を研究することを可能にする。固定された検出物質による分析対象物の 特異的認識及び導波路の漸減場への信号生成の空間的制限に加えて、分子発光減 衰時間を、選択性の更なる判定基準として利用することができる。 この方法は、同様に、変調された強度を有する１つ又は２つ以上の周波数での 励起光を入力結合し、結果として得られる試料発光の移相及び変調を検出するこ とによっても実施することができる。 本発明は、更に、発光する能力のある標識付けされた結合パートナーの発光を 検出することによるか又は分析対象物との相互作用により固定された発光標識付 けされた親和性パートナーの発光特性の変化を測定することにより、既知の親和 性パートナー及び検定構成を伴う化学的又は生化学的親和性検定において、分析 対象物を定量的に測定するために本発明の方法を使用することにも関する。 信号生成及び検出は導波路上の化学的又は生化学的検出表面に制限されており 、媒質からの干渉信号は弁別されていることから、固定された検出素子に対する 物質の結合は、実時間で監視できる。したがって、適当な流量を有する連続流系 内の会合及び解離率を直接検出することにより、親和性スクリーニング、又は変 位検定のため、又は特に薬品の開発のために本発明の方法を使用することも可能 である。 本発明は、そのもう１つの形態において、抗体又は抗原の定量的測定を目的と する本発明の方法の使用に関する。 本発明の方法の更にもう１つの有用性は、レセプター又はリガンド、オ リゴヌクレオチド、ＤＮＡ又はＲＮＡ鎖、ＤＮＡ又はＲＮＡ類似体、酵素、酵素 基質、酵素補助因子又は阻害物質、レクチン及び炭水化物の定量的測定にある。 更なる１形態においては、本発明は、光学的に濁った流体内の発光構成成分の 選択的な定量的測定を目的とする、本発明の方法の使用に関する。 光学的に濁った流体は、典型的には、地表水、溶解土壌抽出物及び溶解植物抽 出物を含む環境分析からの試料を含み、卵黄などの生物学的流体、血液、血清又 は血漿のような流体であってよい。適切な流体としては、化学薬品製造において 得られる反応溶液、染料溶液又は蛍光白色化剤の製造に由来する反応溶液である 。同様に適しているのは、１つ又は２つ以上の発光性成分を含有していることを 条件として、典型的に織物産業において用いられる全てのタイプの分散剤及び配 合物である。かくして、この方法は、品質保障のためにも使用することができる 。 図１は、本発明の方法を実施するための装置の配置の断面図を概略的に示して いる。 図２は、光導波路の拡大断面図を概略的に示している。 本発明のこれらの実施形態は詳しくは、以下のとおりである： 励起光学部品及び導波路： １ 励起用レーザービーム １ａ 被伝搬モード ２ 結合角度 ３ 格子（深さ４〜５nm、周期７５０nm、矩形） ４ ４ａ及び４ｂからなる光センサー載台 ４ａ 導波層（Ｔａ₂Ｏ₅、４８８nmでｎ＝２．３１７） ４ｂ 基材（Corning ガラス、４８８nmでｎ＝１．５３８） 等方的に放出された発光についての検出用光学部品： ５ 適当な焦点距離の集束レンズ ６ 例えば、３０nmの半強度幅を有する最大の発光に適した干渉フィルター ７ 適当な焦点距離の集束レンズ ８ 検出器（フォトダイオード） センサー、載台で戻り結合された発光についての検出用光学部品： ９ 矩形断面を有するグラスファイバー束 １０ 例えば、３０nmの半強度幅を有する最大の発光に適した干渉フィルター １１ フォトダイオード 透過光の検出： １２ 矩形断面を有するグラスファイバー束 １３ 例えば、３０nmの半強度幅を有する最大の発光に適した干渉フィルター １４ フォトダイオード 試料セル（回転可能）： １５ （センサー載台に対し押しつけられた状態で）これと共にフローセルを 形成する上部部分 １６ 密封用Ｏリング １７ 流体用入口ポート １８ 流体用出口ポート １９ サーモスタット制御のための入口ポート ２０ サーモスタット制御のための出口ポート 配置のために使用されている個々の要素は既知のものであり、市販されている 。 以下の例は、本発明を例示するものである。全ての例中の濃度M は、モル/lを 表す。 例１ １．１ 光学的構成 アルゴン−イオンレーザー（励起波長４８８nm）の励起光を、基材の背面から 回転ミラーを用いて導波層の格子上へ導く。Ｏリングによって密封された自動温 度調節制御のフローセルを、導波層の面に対し上から押しつける。このセルの体 積は約０．０７mlである。漸減場内で励起された試料の発光及び励起光の透過を 、空間的に差をつけて配置された３つの検出器によって同時に記録する。この配 置は、図１に概略的に例示されている。検出器８はフォトダイオード(UDT UV-50 ，United Detector Technology，Hawthorne，CA．USA)からなり、その上に干渉 フィルター及び集束レンズを通して等方的に発光した発光が集束されている。検 出器１４は、フォトダイオード（SR 1133，Hamamatsu）からなり、これに対して は、導波層で背面結合され連続モードの伝播方向について９０°の下で観察され た発光が、光学グラスファイバーを用いて導かれ、干渉フィルターの中に通され ている。信号は、トランスインピーダンス増幅器を用いて増強される。透過光は 、干渉フィルターを通過しながらフォトダイオード(UDT UV-50，United Detecto r Technology，Hawthorne，CA．USA)上へと、モードの伝播方向で検出器１１に より類似の方法で導かれ、増強される。 １．２． センサー材料及び結合結果の特徴づけ １．２．１ 光センサー載台 幾何形状：１６mm×４８mm×０．５mm。 導波層：Ｔａ₂Ｏ₅、４８８nmでｎ＝２．３１７、厚み１００±５mm。 基材：Corning ガラスＣ７０５９、４８８nmでｎ＝１．５３８。 格子：深さ変調４〜５nm、格子周期７５０nmの矩形格子。 １．２．２ ６３３nmでの励起での結合結果 結合角度：４〜５（第２の屈折率） 結合効率：格子部位で７％ 減衰：２．５dB/cm １．３． 固定されたプロテインＡ上のフルオレセインで標識付けされた免疫 グロブリンの測定 試料溶液： １×１０−８M のフルオレセインで標識付けされた免疫グロブリン（Sigma Ch emicals，F-IgG）；０．０４１M のＮａ₂ＨＰＯ₄及び０．０２８M のＫＨ₂ＰＯ₄ からなる０．５リットルのリン酸緩衝液；１mlのＰＯＥ−（２０）−モノラウリ ン酸ソルビトール（Tween ２０、ＩＣＩ）：２００mgのアジ化ナトリウム、５０ mlのメタノール、１リットルになるまで精製水で増量されたもの。 プロテインＡの水溶液(Sigma Chemicals,１mg/ml)の中で１０時間、センサー をインキュベートする。なおも遊離した吸着部位を中和するため、センサーを蒸 留水で洗浄し、その後１０g/リットルのウシ血清アルブミン(Sigma Chemicals) を含むリン酸緩衝液中で１時間再度インキュベートする。 試料溶液を、プロテインＡが吸着されているセンサー表面全体にわたり９分間 連続的に流す。 等方的に放出された蛍光、漸減戻り結合の蛍光及び透過を、１．１に与えられ た記述に従ってこれらの９分間にわたり測定する。Ｆ−ＩｇＧに基 づいて約１×１０−１０M の感度が達成される。 以下の応用例全てにおいて、例１中に記述されたセンサー載台及びその中で記 述された光学的装置が使用されている。 例２ 固定されたプロテインＡ上でのフルオレセインで標識付けされた免疫グロブリ ンの測定 使用された溶液： １）緩衝溶液：０．５リットルのリン酸緩衝液（０．０４１M のＮａ₂ＨＰＯ₄ ＋０．０２８M のＫＨ₂ＰＯ₄）、０．１５１M のＮａＣｌ、２５０mg/lのアジ化 ナトリウム、５０mlのメタノール、１g/リットルのウシ血清アルブミン(ＢＳＡ ：Sigma Chemicals)；０．５mlのＰＯＥ−（２０）−モノラウリン酸ソルビトー ル（Tween ２０、ＩＣＩ）からなり、１リットルになるまで蒸留水で増量された もの。 ２）プロテインＡ(Sigma Chemicals)を固定するための溶液：１mg/mlの蒸留水 ； ３）中和溶液：緩衝溶液１）＋１０mg/ml のウシ血清アルブミン(ＢＳＡ、Sig ma Chemicals)； ４）洗浄溶液：緩衝溶液１）； ５）試料溶液：緩衝溶液１中のフルオレセインで標識付けされた免疫グロブリ ン； ６）再生溶液：グリシン緩衝液、pH２。 方法； プロテインＡを固定化するための溶液２）で光センサー載台を１０時間インキ ュベートする。なおも遊離した吸着部位を中和させるべく、センサー載台を蒸留 水で洗浄し、次に、１０g/リットルのＢＳＡを含有する中 和溶液中で１時間、再度インキュベートする。 この方法は、フローセル（流量１ml／分）内で実施される以下の個々の工程か らなる： ・緩衝溶液１）で５分間の洗浄及びそれに続くバックグラウンド信号の記録； ・９分間にわたる試料溶液５）の添加； ・緩衝溶液１）での５分間の洗浄； ・再生溶液６）の５分間の添加； ・緩衝溶液１）での５分間の洗浄。 等方的に放出された蛍光及びセンサー載台で戻り結合の蛍光並びに透過を、例 １に従って、この方法の工程全てにわたり測定する。 等方的に放出された蛍光の強い信号に加えて、戻り結合の蛍光からの強い信号 、並びに、分析対象物の存在下での著しく減少した透過が測定される。蛍光信号 は、蛍光分析対象物の添加中に増大し、吸着曲線の典型的な形状を示す。戻り結 合の蛍光についての信号は、同じ増強において、等方的に放出された蛍光に比べ てわずか２分の１だけ低いものである。透過信号は、事実上蛍光信号のミラー反 転である形状を有する。最大蛍光に達するまでに、透過信号は２５％だけ減少す る。透過信号は、再生工程の後、蛍光が減少する同じ量だけ再び増大する。 例３ 固定されたプロテインＡ上でのフルオレセインで標識付けされた免疫グロブリ ンの検出 使用された溶液： １）緩衝溶液：１／３のリン酸緩衝液(０．０４１M のＮａ₂ＨＰＯ₄＋０．０ ２８M のＫＨ₂ＰＯ₄)、０．１５１M のＮａＣｌ、２００mg/lの アジ化ナトリウム、５０mlのメタノールからなり、１リットルになるまで蒸留水 で増量されたもの； ２）プロテインＡ(Sigma Chemicals)を固定するための溶液：１mg/mlの緩衝溶 液１）； ３）中和溶液：緩衝溶液１）＋１０mg/ml のウシ血清アルブミン(ＢＳＡ、Sig ma Chemicals)； ４）洗浄溶液：これは、バックグラウンド信号を検出するためにも使用される 、緩衝溶液１＋１mg/ml のＢＳＡ； ５）試料溶液：１mg/ml のＢＳＡを伴う、緩衝液１）中の異なる濃度（１０− ８M、１０−９M、１０−１０M、１０−１１M）のフルオレセインで標識付けされ た免疫グロブリンＭ； ６）再生溶液：グリシン緩衝液pH２．５。 方法： プロテインＡを固定化するための溶液を用いて光センサー載台を２時間インキ ュベートする。なおも遊離した部位を全て中和するため、センサーを蒸留水で洗 浄し、次に１０g/リットルのＢＳＡを含有するリン酸緩衝溶液中で再び１時間イ ンキュベートする。 この方法は、以下の個々の工程からなる： − 洗浄溶液４）（０．１ml／分）で２分間の洗浄しバックグラウンド信号を記 録する工程； − 自動試料採取器を介してループ内へ試料（１ml）の同時吸引する工程； − 次に、ループ（０．１ml／分、開始及び終了パルスの間）をはずすことによ りセンサー載台全体にわたり約７分間試料を通過させる工程； − その後、溶液４）で洗浄する工程； − 再生溶液の適用後、再び溶液４）で洗浄する工程。 等方的に発光された蛍光及び透過を、例１に従って、この方法の工程全てに わたり測定する。 １０-¹⁰Mの濃度のフルオレセインで標識付けされた免疫グロブリンＡで、更に 明確な蛍光信号が観察される。透過の変化を、最高１０^-8M の濃度で決定する。 データを平均した後（９点平均）、なおも１０^-11Mという分析対象物濃度が見 られる。 異なる濃度で、初期バックグラウンド信号（信号／雑音比１〜４mV）と比べて 、試料添加の終了時点で以下の信号変化が記録される： （平均後） 検出限界は１０^-11M未満で、これはフルオレセイン標識付けされたＩｇＧ１０^-14 モルの分析対象物濃度に対応する。 例４ ハイブリダイゼーション検定における固定された相補鎖でのフルオレセインで 標識付けされたオリゴヌクレオチドの測定 使用された溶液： １）０．０６９M のリン酸緩衝液(０．０４１M のＮａＨ₂ＰＯ₄＋０．０２８M のＮａＨ₂ＰＯ₄)、０．１７６M のＫＣｌ、１mlのＰＯＥ− （２０）モノラウリン酸ソルビトール（Tween ２０、ＩＣＩ）、１ｇのポリアク リル酸ＰＡＡ５，１００、５００mg/リットルのアジ化ナトリウムからなり、１ リットルになるまで蒸留水で増量された、ハイブリダイゼーション緩衝液（pH７ ．７５）。 ２）試料溶液：１６の塩基対からなりセンサー載台上に固定されたオリゴマに 相補的なフルオレセインで標識付けされたオリゴマー(ハイブリダイゼーション 緩衝液１中のフルオレセイン−５′−ＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧ−３′ (１０−１２M/リットル))； ３） 再生溶液：水溶液中の尿素５０％(G/G)。 方法： 粒子上でオリゴヌクレオチド合成のために使用されるような標準的方法（例え ばM.J．Gait，Oligonucleotide Synthesis，A practical approach，Oxford Uni versity Press，NY 1990）により３−グリシジルオキシプロピルトリメトキシシ ランでシラン化されたセンサー載台上で直接オリゴヌクレオチド合成装置(Appli ed Biosystems 394B)を用いて、３′ＣＡＡＣＡＣＡＣＣＴＴＡＡＣＡＣ−５′ 捕獲プローブを合成する。ただし、標準的合成とは異なり、センサー表面からの その後の剥離を防ぐべく３′末端で表面上に定着させるための安定した連鎖基と して、４−（４，４−ジメトキシトリチル）ヒドロキシブチル酸を使用する。水 での洗浄後、センサー載台を、検出方法で固定検出鎖と共に使用する。 この方法は、以下の個々の工程からなる。 − ハイブリダイゼーション緩衝液１）（０．５ml／分）で８分間洗浄しバック グラウンド信号を記録する工程； − ２６分にわたり（５ml／分の５秒の流水の後）試料溶液２） （０．０５ml／分）を添加する工程； − ハイブリダイゼーション緩衝液１）（０．５ml／分）で４分間洗浄する工程 ； − ４分間にわたり再生溶液３）を添加する工程（０．５ml／分）； − ハイブリダイゼーション緩衝液１）（０．５ml／分）で４分間洗浄する工程 。 この方法の工程中、例１に従って、等方的に発光された蛍光及び透過を測定す る。試料を１０分間にわたり添加した後、フルオレセイン標識付けされたトレー サーＤＮＡの５００アトモル(attomol)に対応して、約１mVの信号／雑音で２０m Vの蛍光信号が観察される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 エーラート，マルクス スイス国 ツェーハー−4312 マグデン アム ブリュエル ６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．励起光の入力結合のための格子が具備されており、かつ基材（ａ）の屈折率 が導波層（ｂ）の屈折率よりも低い、薄く透明な導波層（ｂ）が施された透明な 基材（ａ）からなる平面の誘電体光センサー載台を用い、液体試料を該層（ｂ） と接触させ、試料中の発光特性を有する物質によるか又は該層（ｂ）上に固定さ れた発光特性を有する物質により生成された発光を、電気光学的に測定すること により検出するための方法であって、 （Ａ）該励起光が平面型導波路の中に結合し、かつ導波層を横断し、それによ り発光特性を有する物質が導波層の漸減場中で励起して発光し、 （Ｂ）該回折格子は３〜６０nmの深さ変調を有し、 （Ｃ）該層（ｂ）の厚みが４０〜１６０nmであり、そして （Ｄ）該層（ｂ）の厚みに対する該深さ変調の比が０．５より小さい、 ことを特徴とする方法。 ２．該基材が、水晶、無機ガラス又はプラスチック材料で構成されている、請求 項１記載の方法。 ３．該基材が、無機ガラスからなる、請求項１記載の方法。 ４．該基材が、ポリカーボネート又はポリメタクリル酸メチルからなる、請求項 １記載の方法。 ５．ＳｉＯ₂又は熱可塑性、熱硬化性若しくは構造的に架橋されたプラスチック からなる中間層が基材と導波層の間に具備され、この中間層が基材のものより小 さいか又は等しい屈折率を有する、請求項１記載の方法。 ６．該中間層が、１０μm 未満の厚みを有する、請求項５記載の方法。 ７．発光を励起するために実質的に平行な光が、使用される、請求項１記 載の方法。 ８．発光を励起するために、波長３００〜１，１００nmのレーザー光が、使用さ れる、請求項１記載の方法。 ９．発光を励起させるために、波長４５０〜８５０nmのレーザー光が、使用され る、請求項１記載の方法。 １０．発光を励起させるために、波長４８０〜７００nmのレーザー光が、使用さ れる、請求項１記載の方法。 １１．該平面の透明な導波層が、２より大きい屈折率を有する材料からなる、請 求項１記載の方法。 １２．該平面の透明な導波層が、Ｔａ₂Ｏ₅又はＴｉＯ₂からなる、請求項１記載 の方法。 １３．該平面の透明な導波層が、８０nm〜１６０nmの厚みを有する、請求項１記 載の方法。 １４．励起光の入力結合のための該回折格子が、光学屈折回折格子である、請求 項１記載の方法。 １５．該光学屈折回折格子が、レリーフ回折格子である、請求項１４記載の方法 。 １６．該回折格子が、正弦、のこぎり波形又は矩形曲線の形状を有する、請求項 １４記載の方法。 １７．該回折格子が、２００〜１，０００nmの回折格子周期を有する、請求項１ ４記載の方法。 １８．該回折格子が、５〜３０nmの深さ変調を有する、請求項１４記載の方法。 １９．該回折格子が、０．５〜２の線対空間の比を有する、請求項１４記載の方 法。 ２０．接着促進層が、導波層と試料の間に存在する、請求項１記載の方法。 ２１．該接着促進層が、５０nm未満の厚みを有する、請求項２０記載の方法。 ２２．分析対象物を検出するために用いられる発光しうる物質が、導波層の表面 上に直接固定されている、請求項１項記載の方法。 ２３．部分的工程の１つにおいて分析対象物が結合状態になる過程での多工程方 式測定において、センサー載台の表面上に結合パートナーの１つのためか又は分 析対象物自体のための、化学的又は生化学的検出物質としての特定の結合パート ナーを固定する工程を含む、請求項１に記載の方法。 ２４．センサー載台が再生可能であり、繰り返し使用ができる、請求項１記載の 方法。 ２５．等方的に放出された漸減励起発光を測定する工程を含む、請求項１記載の 方法。 ２６．センサー載台の端部において、該センサー載台中で戻り結合された漸減励 起発光を測定する工程を含む、請求項１記載の方法。 ２７．等方的に放出された発光及び戻り結合された漸減励起光を、互いに独立し て、しかし同時に測定する工程を含む、請求項１記載の方法。 ２８．導波路中に結合された励起光の吸収を同時に測定する工程を含む、請求項 １記載の方法。 ２９．該励起光が、連続波（ＣＷ）モードで導波路内に結合される、請求項１記 載の方法。 ３０．調時パルスの形で励起光を入力結合し、次いで時間分解された発光を測定 する工程を含む、請求項１記載の方法。 ３１．パルス長さが、１ピコ秒から１００秒までに調整される、請求項３０記載 の方法。 ３２．１つ又は２つ以上の周波数において変調された強度を有する励起光を入力 結合する工程、次いで試料発光の結果として得られた相移動及び変調を測定する 工程を含む、請求項１記載の方法。 ３３．検出されるべき試料が、卵黄、血液、血清、血漿又は尿である、請求項１ 記載の方法。 ３４．検出されるべき試料が、表面水、土壌又は植物エキス、生物加工ブロス又 は合成ブロスである、請求項１記載の方法。 ３５．親和性検知における生化学物質の定量的測定ための、請求項１記載の方法 の使用。 ３６．抗体又は抗原の定量的測定のための、請求項１記載の方法の使用。 ３７．レセプタ又はリガンド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ又はＲＮＡ鎖、ＤＮ Ａ又はＲＮＡの類似体、酵素、酵素基質、酵素補助因子又は阻害物質、レクチン 及び炭水化物の定量的測定のための、請求項１記載の方法の使用。 ３８．光学的に濁った流体の中の発光成分の定量的測定のための、請求項１項記 載の方法の使用。