JPH10501687A

JPH10501687A - ｇｐ３５０／２２０の非スプライシング変異体

Info

Publication number: JPH10501687A
Application number: JP7527109A
Authority: JP
Inventors: スペイト，リチャード; ティー．ジャックマン，ウィンスロップ
Original assignee: Aviron Inc
Current assignee: MedImmune Vaccines Inc
Priority date: 1994-04-18
Filing date: 1995-04-13
Publication date: 1998-02-17
Anticipated expiration: 2018-09-16
Also published as: DE69524415D1; NO319382B1; LV11803B; RU2178807C2; JP4317786B2; UA47403C2; MY114769A; HUT75831A; PL316941A1; SK134396A3; CN1118573C; JP3447743B2; PT769056E; US6458364B1; US5824508A; FI118224B; FI20075338A7; CZ292283B6; CN1152940A; JP2003230396A

Abstract

(57)【要約】 gp350変異体ＤＮＡおよびアミノ酸配列を含んで成る組成物、そのような配列を含有するベクター並びに宿主細胞が提供される。組換えにより且つgp220タンパク質生産の非存在下で均一gp350タンパク質を生産する方法、そのようなタンパク質を含有する医薬組成物、および予防的使用も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 gp350/220 の非スプライシング変異体ヘルペスウイルス属の一種であるエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）はヒトにおいて感染性単核球症を引き起こす。この病気は集団の90％以上に感染する。健康分析者は米国におけるこの病気の費用が年100万ドルであると見積もる。このウイルスは主にウイルスを放出する個体から唾液の交換によって蔓延する。ＥＢＶに感染した子供はほとんど無症状であるかまたはごく弱い症状を有するが、感染した若者と成人は、発熱、咽頭炎およびアデノパシーにより特徴付けられる典型的な感染性単核球症を発病する。感染した人はその後の生涯ずっと抗ＥＢＶ抗体を維持するので、次の感染に対して免疫がある。現在のところ商業的に利用可能なＥＢＶワクチンはない。その感染性に加えて、ＥＢＶはリンパ球を急速に分裂する細胞に形質転換させることが証明されており、従って、バーキットリンパ腫や口腔毛髪状白斑をはじめとする幾つかの異なるリンパ腫に関係があるとされている。世界的に見て、80 ,000の鼻咽頭癌症例が存在すると推定され、中国民族に流行している。ＥＢＶの弱毒化生ワクチンの開発は行われているがまだ問題がある。ＥＢＶに関連する潜在的な腫瘍形成性質のため、研究者らは生ワクチン法を使うのを嫌がっていた。本発明は、潜在的に腫瘍形成性の生存ウイルスの使用を必要としないサブユニットワクチンのための方法および組成物を考案することにより、生ワクチンの開発に関連する問題を回避する。サブユニットワクチンは、免疫応答を惹起しそして免疫を付与するであろうウイルスからの１または複数の抗原性タンパク質を使用する。より重要な２つの抗原性ＥＢＶタンパク質は、ウイルス膜のエンベロープの部分を構成しており、細胞膜タンパク質CD21と相互作用することによりウイルス粒子がヒト標的細胞に結合しそしてその中に入るのを可能にする、糖タンパク質gp 350/300とgp220/200である。Nemerow，J ．Virology 61:1416(1987)を参照のこと。それらはサブユニットワクチン候補として選ばれてから久しいが、本来の源から精製された抗原的に活性なタンパク質を得ることの難しさと、組換え生産された源からの収率が低いことが、研究者やワクチン開発者の努力を妨害していた。文献中には様々な分子量範囲（一方のタンパク質には350または300キロダルトン（kD）、他方のタンパク質には220または200kD）を使ってそれらのタンパク質が呼称されている。本明細書中ではgp350または300タンパク質をgp350タンパク質と呼び、gp220または200タンパク質をgp220タンパク質と呼ぶ。集合的に、両タンパク質を本明細書中ではgp350/220タンパク質と呼称する。択一的にスプライスされる単一の遺伝子がgp350/220タンパク質をコードし、g p350mRNA転写物とgp220mRNA転写物の生成をもたらす。天然に存在するgp350/220 遺伝子スプライス部位変異体は１つも知られていない。該遺伝子は２つの発現産物、即ちgp350タンパク質とgp220タンパク質を産生する。gp350/220ＤＮＡ配列の転写解読枠（ＯＲＦ）は2721塩基対（bp）である。全読み枠は907アミノ酸のg p350をコードする。Kieffに発行された米国特許第4,707,358号（1987）を参照のこと。転写解読枠のスプライス形は2130塩基を含み、710アミノ酸配列のgp220タンパク質に翻訳される。gp350タンパク質とgp220タンパク質の理論分子量はそれぞれ95kDと70kDである。発現されたgp350タンパク質とgp220タンパク質の測定分子量は異なるけれどもそれぞれ約350キロダルトンと220キロダルトン（ kD）である。推定分子量と実分子量の差の理由は両タンパク質の多大なグリコシル化である。どの細胞でも、gp350タンパク質とgp220タンパク質は約6:1〜1:1の範囲のモル比で生産される。例えば、ＥＢＶが持続的に感染したB95-8細胞では、その比は異なるように見えるが時々6:1の範囲に近づく。Miller，Proc ．Natl ．Acad．Sci．69 :383（1972）を参照のこと。同様に、それらの糖タンパク質の組換え生産は、今までは一般に生産させる予定のgp350タンパク質とgp220タンパク質の混合物をもたらした。従来、gp350/22 0タンパク質はラット下垂体、チャイニーズハムスター卵巣、VERO（アフリカミドリザル腎臓）細胞、並びに酵母細胞中で発現されている。Whang，J ．Virol．6 1 :1796(1982)，Motz，Gene 44:353(1986)およびEmini，Virology 166:387(1988) を参照のこと。マウス繊維芽細胞中でgp350/220タンパク質を生産させるのにウシ乳頭腫ウイルスのウイルス発現系も使われている。Madej，Vaccine 10:777（1 992）を参照のこと。gp350/220タンパク質を発現させるのにワクシニアウイルスの実験株とワクチン株も使われている。ＥＢＶのgp350/220 ＤＮＡおよびタンパク質の変異組換え形は当業界で既知である。詳しくは、膜貫通配列を欠いている先端が切り取られたgp350/220遺伝子の組換え構成物が作製された。そのような構成物はgp350とgp220の２つの混合物をまだ生産するが、膜貫通領域の欠如が該タンパク質の分泌を可能にする。Finerty，J ．Gen．Virology 73:449(1992)およびMadej，Vaccine 10:777（1992）を参照のこと。また、様々なgp350/220配列を含んで成る組換え生産された様々な制限断片および融合タンパク質が作製されＥ．コリ中で発現されている。1991年７月24日に公開されたＥＰ特許公開0 173 25 4を参照のこと。従って、gp350/220に関するＥＢＶ研究は、今まで生来のgp350/220配列の効率的な発現を得ることか、生来のタンパク質または膜貫通領域欠失タンパク質の２つの択一的スプライス形の混合物を生じる膜貫通領域を欠く変異配列に集中し、あるいはβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質としてのエピトープ断片配列の生産に集中していた。 gp350/220の部分精製調製物は既知である。Finerty，J ．Gen．Virology 73:44 9(1992)を参照のこと（組換え生産され、部分精製されたもの）。生来のgp350/2 20タンパク質については、ほとんどの場合、精製作業が該タンパク質の抗原性を不活性化してしまい、そのためサブユニットワクチンでの使用が認められなくなる。しかし、生来の（即ち、非組換え）源からの抗原的に活性なgp350タンパク質の高度精製調製物が科学文献中に報告されている。David，J ．Immunol．Metho ds 108: 231(1988)を参照のこと。ＥＢＶ誘発リンパ腫に対してコットントップタマリン（cottontop tamarin）を予防接種するのにgp350/220タンパク質を発現する組換えウイルスワクチンが使われた。Morgan，J ．Med．Virology 25:189(1988 )，Mackett, EMBO J ．4:3229(1985)およびMackett，VACCINES ’86，pp293(Lerne r RA，Chanock RM，Brown F 編，1986，Cold Spring Harbor Laboratory)を参照のこと。しかしながら、該遺伝子の択一的スプライス形態のうちのいずれか１つだけの発現を可能にし、それによって純粋なgp350またはgp220タンパク質の生産を可能にし且つ保証するようにウイルスgp350/220 ＤＮＡ配列が操作されたことはない。また、gp350またはgp220タンパク質の一方または他方を発現する組換えまたは変異ウイルスも作製されていない。一般に、スプライス部位はプレmRNA分子からmRNAへのプロセシングを促進する。ポリオーマウイルスでは、後期mRNAの効率的蓄積のためにスプライス部位が必要とされる。ポリオーマウイルス転写物中の３′および５′スプライス部位の変更はmRNA蓄積を減少させるかまたは完全に妨げる。Tr eisman，Nature 292:595（1981）を参照のこと。SV40ウイルスでは、切除可能な介在配列が核外へのmRNAの輸送と核中でのmRNAの安定化を促進し、それらのイントロン／エキソン接合配列が小さな核ＲＮＰ粒子の結合を促進するため、事前にスプライスされたmRNAはプロセシング経路と正しく連携することができないだろうと考えられる。エキソン／イントロンスプライス部位のところの点変異は、エキソン／イントロン開裂を低下させ、そしてプレmRNAプロセシング、核輸送および安定性を破壊する可能性がある。Ryu，J ．Virology 63:4386(1989)およびGros s，Nature 286:634(1980)を参照のこと。従って、本発明までは、ＥＢＶのgp350/220配列によりコードされるタンパク質の機能的発現と抗原活性に対するスプライス部位変更の影響は最善の状態では未知であり、且つ予測できなかった。追加の背景文献としては次のものが挙げられる。ＥＢＶの生物学と病気はStra us，Annal of Int ．Med．118:45(1993)中に大体概説されている。ＥＢＶのBLLFI 転写解読枠の記載はBaer，Nature 310:207(1984)中に見つかる。エプスタイン− バーウイルスのgp350/220ＤＮＡおよびアミノ酸配列の記載はBeisel，J ．Virolo gy 54 :665(1985)とBiggin，EMBO J ．3:1083(1984)による文献中並びにKieff他に発行された米国特許第4,707,358号（1987）中に見つかる。エプスタイン−バーウイルスＡ型とＢ型中のgp350/220をコードするＤＮＡ配列の比較はLees，Virol ogy 195 :578（1993）中に開示されている。ＥＢＶのgp350/220糖タンパク質に対して中和活性を示すモノクローナル抗体はThorley-Lawson，Proc ．Natl．Acad． Sci.77 :5307(1980)中に開示されている。最後に、供与体および受容体スプライス部位についてのスプライス部位共通配列はMount，Nucl.Acids Res ．1 0: 459(1982)中に開示されている。一観点によれば、本発明はＥＢＶのgp350/220 ＤＮＡ配列の非スプライシング変異体を提供する。本発明のＤＮＡ配列は、均一gp350タンパク質の発現をコードする単離されたＤＮＡ配列を含むことができる。gp350タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、供与体および受容体スプライス部位のところの生来のヌクレオチドが生来でないヌクレオチドにより置換されている図１の配列と同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を含んで成るもの、およびその断片として特徴づけられる。このＤＮＡ配列はコード配列に隣接する５′および３′非コード配列を含むことができ、更にアミノ末端シグナル配列を含むことができる。図１は非コード配列を表し、推定上のシグナル配列の終わりを星印（＊）で示す。しかしながら、本発明のＤＮＡ配列は、それらの隣接配列またはシグナル配列のうちの幾らかまたは全部を除外することもあると解釈される。本発明の非スプライシング変異体ＤＮＡ配列は、図１のＤＮＡ配列のgp350/220をコードする遺伝子の供与体および受容体スプライス部位に変異を導入することにより製造される。これは gp220タンパク質の生産を排除し、その結果gp350タンパク質だけが生産される。従って、別の観点では、本発明は、均一gp350タンパク質、および適当な原核または真核宿主細胞中で適当な発現調節配列の支配下でのＥＢＶのgp350/220 ＤＮＡ配列の非スプライシング変異体の発現により該タンパク質を生産する方法を含んで成る。本明細書中でgp350タンパク質について用語を使う時、均一とは、g p220タンパク質を全く含まないかまたは実質的に含まないことを意味する。哺乳類または昆虫細胞において組換え生産された均一gp350タンパク質は確かに今まで文献中に報告されたことがないと本発明者らは認める。更に別の観点によれば、分泌生成物をもたらす欠失を更に有する均一gp350タンパク質が提供される。そのような欠失は、gp350の膜貫通領域の除去か、膜貫通領域と残りのＣ末端の除去のいずれかを含んで成る。そのような更に変更されたＤＮＡ配列およびそれによりコードされるタンパク質は、本発明のまた別の観点である。ベクターＤＮＡと均一gp350タンパク質をコードするＤＮＡ配列とを含んで成る組換えＤＮＡ分子も提供される。該ＤＮＡ分子は、選ばれた宿主細胞中での均一gp350の複製と発現を指令することができる適当な調節配列と作用可能に連結したgp350配列を提供する。組換え均一gp350タンパク質を発現させる際に使われるそのようなＤＮＡ分子により形質転換された宿主細胞も、本発明により提供される。本発明のＤＮＡ分子および形質転換された宿主細胞は、本発明の別の観点である組換え均一gp350タンパク質またはその断片の新規生産方法において使われる。この方法では、均一gp350タンパク質の発現を調節することができる適当な調節配列または発現調節配列と作用可能に連結した均一gp350タンパク質またはその断片をコードするＤＮＡ配列によって形質転換された細胞系を、組換えＤＮＡの発現を可能にする適当な条件下で培養する。次いで発現されたタンパク質を適当な常用手段により宿主細胞からまたは培地から収得する。この方法は宿主細胞として多数の既知の細胞を使うことができるが、現在のところ好ましいのは哺乳類細胞と昆虫細胞である。本発明のＤＮＡ配列およびタンパク質は、ＥＢＶ抗原決定基を有する治療化合物および免疫原性化合物の製造に有用である。そのような化合物はＥＢＶ関連疾患、例えば単核球症、バーキットリンパ腫および鼻咽頭癌の予防処置のためのサブユニットワクチンに利用される。従って、別の観点によれば、本発明は、感染性単核球症、バーキットリンパ腫および鼻咽頭癌のようなヒトのＥＢＶ関連状態や疾患を予防または治療するための治療および／または免疫原性医薬組成物を含んで成る。そのような治療および／または免疫原性医薬組成物は、医薬上許容される担体、例えば当業界で知られるような水酸化アルミニウム、塩溶液およびリン酸塩緩衝化塩溶液と共に、免疫原的誘発有効量の本発明の１または複数の均一gp350タンパク質を含んで成る。「免疫原的誘発」量とは、哺乳類においてＥＢＶに対する抗体の産生を刺激するのに十分な量を意味する。あるいは、活性成分はリポソーム含有凝集物の形で投与してもよい。予防用途には、そのような医薬組成物はヒトの患者への投与のためのサブユニットワクチンとして処方することができる。患者の抗体形成を刺激するのに十分な用量で患者に予防接種し；そして６か月〜１年後に再接種することができる。従って、本発明の更なる観点は、適当な医薬担体中の免疫原的誘発治療有効量の均一gp350タンパク質を患者に（特にヒト患者に）投与することにより、ＥＢＶ関連疾患および状態を治療する方法である。本発明の更に別の観点は、適当な医薬賦形剤中の免疫原的誘発有効量の均一gp350タンパク質を患者に投与することにより、ＥＢＶに対する免疫応答を刺激する方法である。図１はgp350/220のＤＮＡおよびアミノ酸配列を表す〔Beisel，J ．Virology 5 4 :665（1985）より〕。供与体および受容体スプライス部位が指示される。膜貫通領域は横の矢印で輪郭が描かれ、そして星印（＊）は推定上のシグナル配列の終わりを表す。ヌクレオチドの番号は左側に示され；アミノ酸の番号は右側に示される。図２は、gp350の欠失および部位特異的変異体の作製を表す。pMDTMおよびpMST OPと表示されたプラスミド地図は本発明の非スプライシングgp350/220変異体を例示する。セクション（Ａ）には、およそ一定のスケールで下のコードクローンBLLF1と共にgp350タンパク質の直鎖状モデルが示される。タンパク質上にはＮ末端シグナル配列（ＳＳ）と膜貫通領域（ＴＭ）が示され、遺伝子地図上には重要な制限部位が示されている。gp350遺伝子はHindI II／BfaＩBLSH1断片とBanＩ／HindIII BLSH2断片の２部分においてクローニングした。SCYTは指摘されたBLLF1の領域からポリメラーゼ連鎖反応を使って作製した。セクシコン（Ｂ）には、pDTM，pSTOP，pMDTMおよびpMSTOPのクローニングスキームが描写されている（プラスミドは一定のスケールではない）。クローニングの詳細は実施例１と２に記載される。プラスミド地図には、関連する制限部位、使用したクローニングベクター、およびgp350遺伝子断片が標示されている。p MDTMとpMSTOP中のスプライス部位の変異は星印により示される。図３は、SDS-PAGEにより分析した時のpMDTMクローンからの均一gp350タンパク質の免疫沈澱の結果を表す。gp350/220タンパク質の端が切り取られた形を分泌する陽性対照（GH3Δ19）細胞、陰性対照（pEE14）細胞および幾つかのpMDTMクローンを、5.5時間³⁵Ｓ−メチオニンで代謝的に標識し；得られた組織培養上清から均一gp350タンパク質を免疫沈澱させた。各細胞型について、標識された組織培養上清（Ｓ）とgp350/220沈澱物（Ｉｐ）の試料を５％SDS-PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）上で電気泳動した。分子量マーカーの位置が左側に示されている。図４は、実施例3.4に記載されるような、ＣＨＯ細胞中で発現されたpMDTMクローンからのタンパク質のノーザンブロット分析の結果を表す。 gp350タンパク質の非スプライシング変異体をコードするクローン化されたＥＢＶのＤＮＡ配列を含んで成る組成物および方法が開示される。既に指摘した通り、そのような非スプライシング変異体は本明細書中では均一gp35 0タンパク質と呼称される。通常、gp350/220遺伝子が哺乳類細胞中で発現されると、該遺伝子のＲＮＡスプライシングのためにgp350とgp220という２つの遺伝子産物が生じる。本発明は１つの遺伝子産物gp350だけが生産されるようにする。本発明はgp350遺伝子中のＲＮＡスプライス部位シグナルの一部または全部を除去し、そして適当な宿主細胞中で該遺伝子を発現させることを含む。哺乳類細胞中でgp350/220遺伝子が発現される時に該タンパク質の220kD形態の生産を防止するためにgp350/220遺伝子中に変異が導入された。結果として、gp350のみをコードするmRNA転写物が生産される。gp350/220遺伝子の非スプライシング変異体を使うことによるgp220発現の除去は、gp220に比較して増加したgp350の生産を引き起こすだろう。gp350はgp220上に見られる潜在的な抗原部位を全て含むので、 gp220の生産は効果的な抗ＥＢＶワクチンの製造にとって不可欠なものではない。従って、本発明の一観点は、アミノ酸501をコードする供与体スプライス部位コドンとアミノ酸698をコードする受容体スプライス部位コドンが、生来でないヌクレオチドによる生来のヌクレオチドの置換によって変更されていること以外、gp350と実質的に同じポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を提供する。好ましくは、アミノ酸配列が同じままであるように、生来のヌクレオチドが生来でないヌクレオチドにより置換される。詳しくは、一例として、供与体スプライス部位のところの生来のヌクレオチドＡＡＧＴ（ヌクレオチド1500〜1504）と、ＧＧ受容体スプライス部位に隣接する生来のヌクレオチドＡ＆Ｔ（ヌクレオチド 2091〜2094）が、それぞれＧＴＣＡとＴ＆Ａにより置換された。従って、供与部位におけるこの置換の結果として、アミノ酸500位のグルタミンと501位のセリンは同じままであった。同様に、受容部位におけるこの置換の結果として、アミノ酸697位のスレオニンと698位のグリシンは同じままであった。同様にして、下記に更に詳述するように、当業者はそれらの明確に例示したもの以外の置換も容易に実施することができよう。従って、本発明は一観点によれば、均一gp350タンパク質に関する。均一gp350 タンパク質は、アミノ酸１から907まで、アミノ酸１から862まで、またはアミノ酸１から907までで且つアミノ酸863から881までを欠く図１に示されるのと実質的に同じアミノ酸配列を有し、各々Ｎ末端の18アミノ酸のシグナル配列を持つかまたは持たないことにより更に特徴づけられる。加えて、均一gp350タンパク質の類似体が提供される。それらとしては、抗原活性を保持しており、且つ均一gp 350タンパク質の対応領域と好ましくは少なくとも80％、より好ましくは90％、最も好ましくは95％の相同性を有する、アミノ酸配列中に変更がある変異体が挙げられる。例としては、図１のアミノ酸配列からの少数のアミノ酸変更、特に保存的アミノ酸置換、を有するタンパク質およびポリペプチドが挙げられる。保存的置換は、それらの側鎖が類似している（同族の）アミノ酸ファミリー内で起こるものである。遺伝的にコードされるアミノ酸は一般に４つのファミリーに分類される：(1)酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；(2)塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；(3)無極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン：および(4)非荷電で極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは時々芳香族アミノ酸として一緒に分類される。例えば、ロイシンの孤立置換または構造的に同族のアミノ酸によるアミノ酸の保存的置換が抗原活性または機能性に対して重大な影響がないだろうと予想することは筋が通っている。本発明はgp350の簡単な精製という利点を提供する。gp350とgp220は同様な生化学的性質を有するため、gp220はしばしばgp350の調製物中に一緒に精製される。gp350/220遺伝子の非スプライシング変異体のみを発現する細胞はタンパク質精製を平易にする。これはgp350の生産費用を減少させるであろう。本発明はまた、gp350精製のための出発材料の生化学的特徴づけを一層容易にする。１つの種だけが存在するため、第二の種の存在理由を説明することなく、タンパク質含量分析とアミノ酸配列分析を行うことができる。本発明はその上、増加されたgp350生産という利点を提供する。gp350遺伝子のスプライシングの防止は、細胞をgp350とgp220の二元生産からgp350の単独生産に移し変えるだろう。ある細胞では、gp220の濃度はgp350濃度の30％〜100％であると推定されている。遺伝子スプライシングが除去されると、gp220生産の欠如によってgp350生産が増加されるだろう。 gp350/220遺伝子のＤＮＡ配列はBeisel，J ．Virology 54:665(1985)およびBig gin，EMBO J ．3:1083（1984）により記載されており、それは図１に描写される。該遺伝子は907アミノ酸をコードしそして約95kDの一次翻訳産物を指定する272 1塩基の転写解読枠（ＯＲＦ）である。推定値と実測値の間の差は、該タンパク質の多大なグリコシル化を表している。591塩基（197アミノ酸をコードする）がスプライシングにより除去されるとgp220を生じる。gp350/220遺伝子産物の見かけ分子量は、使用する測定方法の種類、異なる細胞系中のグリコシル化部位の利用状態、翻訳後プロセシングの差または選択的な遺伝子変異によって異なり得る。gp350/220遺伝子スプライス部位変異体の生産物についての測定値は異なるが、「均一gp350タンパク質」という語は、場合により追加の欠失または変異、例えば本明細書中で開示されるＣ末端欠失および／または膜貫通領域変更を有することがある、非スプライシング変異体の遺伝子産物を包含する。「gp220タンパク質」という語は、約220kDの分子量を有する択一的にスプライスされたgp350/220遺伝子産物を指す。gp350/220遺伝子中のスプライス部位は、他の遺伝子（主に真核生物からのもの）を基にした共通の供与体および受容体スプライス配列とgp350/220遺伝子との比較により同定された。他の遺伝子中のスプライス部位を調べることからMo unt，Nucleic Acids Res ．10:459(1982)により発見された共通配列は、下記のものである：右肩に星印を付けた塩基は全スプライス部位の100％に現れる塩基を表す（高度に保存された塩基）。２塩基または１塩基を有する位置は保存された位置を表す（強調してない位置）。スラッシュ（／）は実際のスプライシング部位を示す。 gp350/220遺伝子中では、gp350/220遺伝子のＤＮＡ配列決定〔Biggin，EMBO J ．3: 1083（1984）〕により示されたように、供与体スプライス部位はヌクレオチド1501の後ろにあり、そして受容体スプライス部位はヌクレオチド2092の後にある。（ここと図１中で使用した番号付け法はBigginの番号付け法に従う）。スプライス部位はＥＢＶのＢ型株の対応する遺伝子領域中に存在する（供与体スプライス部位はＡ₁₅₀₁の後、そして受容体スプライス部位はＧ₂₀₂₉の後）。本発明は、gp350/220遺伝子から単一種のmRNAを生産させるのにＡもしくはＢ株または別のＥＢＶ株のスプライス部位のいずれかを使って製造した組成物を包含する。B95-8株からのウイルスＡ型のＤＮＡ配列を実施例で使ったが、Ｂ型株のＤＮＡ配列も同様に使うことができただろう。何故なら、Ａ型株とＢ型株の遺伝子翻訳産物は98％同じであるからである。Ｂ株はアミノ酸507〜520と570〜576を欠いている。Ａ型株はgp350抗原部位を全て含むため、Ａ型株を使った。あるいは、本明細書の教示に従って株特異的配列を有するＥＢＶ gp350/220を使って、特定株に特異的な免疫原性を有し、従って株特異的ＥＢＶ関連疾患の予防または治療用の免疫原性および／または治療組成物において有用である、ＥＢＶ株特異的均一gp350タンパク質を生産させることができる。表１は、供与体および受容体スプライス部位の野性型ヌクレオチド配列とアミノ酸配列を示す。 gp350/220遺伝子のＲＮＡスプライシングを防止するために、gp350/220遺伝子中に核酸配列を導入してＲＮＡスプライス部位の関連塩基対を置換した。スプライス部位を非機能的にするためには、好ましくは供与部位または受容部位を構成する２つの高度に保存された塩基群の中から少なくとも１個の塩基を非保存的塩基で置換すべきであり、より好ましくは少なくとも２個の高度に保存された塩基を非保存的塩基に変異させるべきである。別の保存的塩基であるスプライス部位から離れた２個以上の塩基を非保存的スプライス部位塩基により置換して、スプライス部位の認識を更に弱くすることもできる。供与部位と受容部位の両方を変更してスプライシング機構を傷つけることができる。好ましくは、供与体と受容体が両方とも、４箇所の高度に保存されたスプライス部位塩基位置のうちの１箇所に各々少なくとも１個の変更を含み、より好ましくは４箇所の高度に保存されたスプライス部位塩基位置のうちの２箇所に少なくとも２個の変化を含む。一方のスプライス部位が野性型アミノ酸配列を維持するために変異できないならば、他方のスプライス部位に少なくとも２つの変異を導入することが好ましい。 gp350/220スプライス部位のところの変異が、その後発現されるgp350タンパク質のアミノ酸配列中に変化を導入してもよい。好ましくは、そのような変化は保存的アミノ酸置換であるべきである。アミノ酸配列中の保存的置換は、アミノ酸配列中の非保存的変化とは反対に、抗原部位の保存を助けるだろう。保存的アミノ酸変化は、塩基変化（または複数塩基変化）が不変の供与体／受容体塩基中に適当な変化を引き起こす限りにおいて行うことができる。例えば、供与体スプライス部位では、ＧＧＵ以外のどのGly特異的コドンを使ってもSer₅₀₁をGlyに置換することができる（ＧＧＵの使用はＧヌクレオチドを保存し、スプライスシグナル中に所望のＧＴ置換を引き起こさないだろう）。同様に、受容体スプライス部位では、Gly₆₉₈からAlaへの変化は保存的置換であろうが、全てのAlaコドンは高度に保存されるＧヌクレオチドで始まるので、これは所望の置換を引き起こさないだろう。プロリンも保存的アミノ酸変化であるかもしれないが、プロリンはタンパク質の三次構造の変更を引き起こし、それによって１または複数のgp350抗原部位を隠蔽してしまうので、プロリンは野性型アミノ酸を置換するのに使われないだろう。表１は、野性型配列中の許容される保存的アミノ酸置換を示す。表１の一番下は、保存的アミノ酸置換を伴う変異の例である。本発明の一観点はgp350/220の非スプライシング変異体を含んで成るけれども、gp350/220コード配列の追加の変異も望ましいかもしれない。可溶性均一gp350 タンパク質（「可溶性タンパク質」は溶液中で遊離形態であるか、または膜会合形態であるが膜統合形態でない）を生産するために、例えば、統合型膜タンパク質としての全長gp350の発現によって生じる細胞毒性問題を回避するために、gp3 50をコードするＤＮＡ配列の全部または部分の削除によりgp350の膜貫通領域（経膜領域としても知られる）が変更される。gp350/220の膜貫通領域はアミノ酸8 61（メチオニン）から881（アラニン）までを含んで成る。Beisel，J ．Virology 54 :665（1985）を参照のこと。好ましくは、膜貫通領域の少なくとも８アミノ酸が削除され、より好ましくは少なくとも12アミノ酸が削除され、最も好ましくは18〜21アミノ酸が削除される。従って、別の観点では、本発明は、可溶性均一 gp350タンパク質の発現をもたらすgp350/220ＤＮＡおよび／またはgp350均一タンパク質の膜貫通領域中に少なくとも一つの削除を更に含んで成るgp350/220 ＤＮＡおよび／またはgp350均一タンパク質の非スプライシング変異体を提供する。非スプライシングgp350/220変異体の膜貫通領域の全部または一部分を削除することに加えて、本発明に従って、本明細書に記載の通り、膜貫通領域の後ろのアミノ酸881〜907を含んで成るＣ末端配列を完全にまたは部分的に削除することもできる。よって、別の観点では、本発明は、gp350/220の膜貫通領域をコードするＤＮＡおよび／または該膜貫通領域を含んで成るアミノ酸配列の全部もしくは一部分の削除により更に変更されており、その上gp350/220の残りのＣ末端ＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列の削除により更に変更されている、gp350/220 ＤＮＡおよび／または均一タンパク質の非スプライシング変異体に関する。従って、別の観点では、本発明は、本発明の均一gp350タンパク質をコードする非スプライシング変異体ＤＮＡ配列に関する。そのようなＤＮＡ配列は、アミノ酸１〜907をコードする図１のＤＮＡ配列を含んで成り、そして供与体および受容体スプライス部位を除去するように本明細書中に教示したヌクレオチド置換を更に含んで成る。そのようなＤＮＡ配列は、所望により、アミノ酸861〜907を含んで成る膜貫通領域とＣ末端の全部または一部分をコードするヌクレオチドが削除されている端が切り取られたＤＮＡ配列、およびアミノ酸861〜881を含んで成る膜貫通領域の全部または一部分をコードするヌクレオチドが削除されている欠失変異体を含んで成る。均一gp350タンパク質をコードする本発明のＤＮＡ配列は、適当な緊縮条件下で図１の単離ＤＮＡ配列にハイブリダイスすることができるＤＮＡを含んでもよく、または遺伝暗号の縮重がなければそのような条件下で図１の単離ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができるだろうＤＮＡを含んでもよい。従って、本発明のＤＮＡ配列は、対立遺伝子変異、種変異または計画的変更に基づいて、非コード配列、シグナル配列またはコード配列中に変更を含むことができる。本明細書中で開示されるそれらの非スプライシング変異体gp350/220 ＤＮＡ配列は、当業界で公知の方法を使って作製することができる。本発明の変異ＤＮＡ配列を、同様に既知の方法を使って組換え的に発現させ、本発明の均一gp350タンパク質を製造することができる。そのような組換えタンパク質を精製し、ＥＢＶ関連疾患の予防処置と防止のための医薬組成物中に配合することができる。本発明のgp350/220ＤＮＡの非スプライシング変異体は、当業界で既知であるようにして適当な発現調節配列を使って様々な種類の細胞中で組換え発現させることができる。当業界で既知であり且つ入手可能である適当な細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のような酵母細胞、Ｅ．コリ（E. coli）やバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）のような細菌細胞、並びにGH3，CHO，NSO，MDCKおよびC-127細胞のような哺乳類細胞が挙げられる。細胞型と共に使われるベクターは、細胞型との適合性および使用する発現調節系に基づいて選択される。gp350/220遺伝子の分泌産物の発現を考慮に入れた細胞とベクターが好ましい。典型的には、例えば、Ｃ末端および／または膜貫通領域をコードする配列と共にまたは伴わずに、所望のタンパク質（この場合ＥＢＶ gp350の非スプライシング変異体配列）の発現のためのDNA配列を含むように常用技術を使って変更されているpBR322の誘導体を使ってＥ．コリが形質転換される。pBR322はアンピシリンとテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、これをマーカーとして使うことができる。Bolivar，Gene 2:95(1977)を参照のこと。常用される発現調節配列、即ち転写開始のためのプロモーターおよび場合によりオペレーターまたはエンハンサーとしては、β−ラクタマーゼおよびlacプロモーター系〔Chang，Nature 198:1056(1977)を参照のこと〕、トリプトファンプロモーター系〔Goeddel，Nucleic Acids Res ．8:4057 (1980)を参照のこと〕、およびラムダ由来ＰＬプロモーターとＮ遺伝子リボソーム結合部位〔Shimatake，Nature 292:128(1981)を参照のこと〕が挙げられる。しかしながら、原核宿主細胞と適合できるいずれの入手可能なプロモーター系または発現調節系も使うことができる。他の典型的な宿主細胞、プラスミドおよび発現ビヒクルは、Itakura(1982)に発行された米国特許第4,356,270号、Riggsに発行された同第4,431,739号およびRutter1984)に発行された同第4,440,859号に開示されている。昆虫細胞発現系を使用する宿主細胞として昆虫細胞を使ってもよい。昆虫細胞での発現の場合、発現系の構成要素としては一般に、バキュロウイルスゲノムの断片と発現させようとする１または複数の異種遺伝子の挿入のための便利な制限部位の両方を含有する伝達ベクター、通常は細菌プラスミド；前記伝達ベクター中のバキュロウイルス特異的断片と相同の配列を有する野性型バキュロウイルス（これはバキュロウイルスゲノム中への異種遺伝子の相同組換えを考慮に入れる）；並びに適当な昆虫宿主細胞および増殖培地が挙げられる。現在、AcNPV中に外来遺伝子を導入するために最もよく使われる伝達ベクターはpAc373である。当業者が知るところの多数の他のベクターもデザインされている。それらとしては、例えばpVL985が挙げられる（これはポリヘドリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴへ変更し、そして該ＡＴＴから32塩基対下流にBamHIクローニング部位を導入する；LuckowおよびSummers，Virology（1989）17:31を参照のこと）。該プラスミドは普通、ポリヘドリンポリアデニル化シグナル〔Miller他（1988 ）Ann ．Rev．Microbiol.，42:177〕並びにＥ．コリの選択と繁殖のための原核生物のアンピシリン耐性（amp ）遺伝子および複製開始点も含有する。バキュロウイルス伝達ベクターは通常バキュロウイルスプロモーターを含有する。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼを結合することができ且つコード配列（例えば構造遺伝子）からｍＲＮＡへの下流（５′→３′）転写を開始することができる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは通常コード配列の５′末端の近位に置かれる転写開始領域を有するだろう。この転写開始領域は典型的にはＲＮΛポリメラーゼ結合部位と転写開始部位を含む。バキュロウイルス伝達ベクターは、存在するなら普通は構造遺伝子に対して遠位である、エンハンサーと呼ばれる第二の領域を有することもできる。発現は調節的か構成的のいずれであってもよい。昆虫細胞発現技術については、ＥＰ特許公開155 476を参照のこと。酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を宿主細胞として使ってもよい。様々な株が入手可能でありそして利用可能である。同様に、酵母発現に適当なプラスミドベクターは既知であり、プロモーターや発現調節系も知られている。例えば、Myanohara，Proc ．Natl．Acad．Sci．80:1（ 1983）（PHO5プロモーター）、ＥＰ特許公開012 873（リーダー配列）、Kurtz，Mol ．Cell Biol．6: 142(1986)、Ito，J ．Bacteriol．153:163(1983)およびHinne n，Proc ．Natl．Acad．Sci．75:1929(1979)（形質転換方法および適当なベクター）を参照のこと。多細胞生物からの真核細胞ももちろん、着目のタンパク質およびポリペプチドをコードする遺伝子の発現のための宿主細胞として使うことができる。有用な宿主細胞系としてはVEROおよびHeLa細胞、並びにチャイニーズハムスター卵巣(CHO )細胞が挙げられる。そのような細胞と適合する発現ベクターも入手可能であり、それらは典型的にはプロモーターおよび発現調節配列、例えばSV40からの初期および後期プロモーター〔 Fiers，Nature 273:113（1978）参照〕、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、ウシ乳頭腫ウイルスまたはトリ肉腫ウイルスからのプロモーターを含む。典型的な宿主細胞、プロモーター、選択マーカーおよび技術は、Mather(1992)に発行された米国特許第5,122,469号、Axel(1983)に発行された同第4,399,216号、Ax el(1987)に発行された同第4,634,665号、Levinson(1987)に発行された同第4,713 ,339号、Ringold(1987)に発行された同第4,656,134号、Kellems(1989)に発行された同第4,822,736号およびFiers(1989)に発行された同第4,874,702号を参照のこと。適当な宿主細胞の形質転換は、そのような細胞に適当な標準技術、例えばCohe n，Proc ．Natl．Acad．Sci．69:2110（1972）に開示されたような原核生物用のC aCl₂処理や、Graham，Virology 52:546(1978)中に開示されたような哺乳類細胞用のCaPO₄処理を使って達成される。酵母形質転換は、Hsiao，Proc ．Natl．Acad ．Sci．76: 3829（1979）中に記載されたようにまたはKlebe，Gene 25:333(1983) 中に記載されたように行うことができる。非スプライシング変異体gp350配列（Ｃ末端領域および／または膜貫通領域の削除を引き起こすような本明細書中に開示された追加の変異を有するかまたは有さない）を含有する適当なベクターの作製は、当業界で現在周知である常用の連結および制限技術を使って行われる。部位特異的ＤＮＡ開裂は標準条件下で１または複数の適当な制限酵素で処理することにより行われ、その詳細は典型的には制限酵素製造業者により明記されている。標準技術を使って開裂された断片をサイズ分離するためにポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動を実施することができ、そして４種のデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下でＥ．コリのポリメラーゼＩクレノウ断片での処理により該断片を平滑末端にすることができる。Ｓ１ヌクレアーゼでの処理はいずれの一本鎖部分も加水分解する。例えば当業界で既知のジエチルホスホアミダイト法を使って、合成オリゴヌクレオチドを製造することができる。米国特許第4,415,732号（1983）を参照のこと。標準条件および温度の下でT4 DNAリガーゼを使って連結を実施し、そして連結混合物を用いてＥ．コリまたはＣＯＳ細胞を形質転換させることにより正しい連結を確認することができる。好結果の形質転換体はアンピシリン、テトラサイクリンもしくは他の抗生物質耐性により、または当業界で既知であるような別のマーカーを使って選択される。そのような組換えＤＮＡ技術は文献中に詳しく説明されている。例えば、Samb rook，MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL，2DED.（1989）；DNA CLONING ，I & II巻（DN Glover編 1985）；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS（MJ Gait編 198 4）；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION（BD Hames編 1984）；TRANSCRIPTION AND TR ANSLATION（BD Hames編 1984）；ANIMAL CELL CULTURE（RI Freshney編 1986）；B．Perbal，A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING(1984)；GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS（JH Miller編 1987 Cold Spring Harbor Labora tory）；Scopes，PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE,第２版（19 87 Springer-Verlag NY）；およびHANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY Ｉ〜I V巻（DM Weired 1986）を参照のこと。本明細書中に言及される全ての刊行物はそれらが開示するものの内容についての参照のため組み込まれる。従って別の観点では、本発明はgp350/220 ＤＮＡ配列の非スプライシング変異体を含有するベクターと宿主細胞を含んで成り、また均一gp350タンパク質の発現を可能にする培養条件下で、発現調節配列に作用可能に連結されたgp350/220 ＤＮＡ配列の非スプライシング変異体を担持しているベクターを含む前記宿主細胞を培養することによりgp350/220タンパク質の非スプライシング変異体を生産する方法を更に含んで成る。従来の糖タンパク質精製技術を使って、例えば非限定的に、当業界で既知である限外濾過、フリーフロー電気泳動、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、SDS-PAGE、分別NH₄SO₄沈澱、レクチンカラム、イオン交換カラムおよび疎水性カラムを使って、細胞および培地成分から、発現された均一gp350が精製される。gp350の小規模分析用調製物はSDS-PAGEまたはレクチンアフィニティーカラムを使って最も容易に精製され、そして予防接種または免疫応答実験用のそのような小規模調製物は液体クロマトグラフィーを使って最も容易に精製される。ワクチン組成物に使われる商業的に有意な量のgp350の大規模生産には、限外濾過、ゲル濾過、イオン交換および疎水的相互作用クロマトグラフィーの組合せが好ましい。本発明の精製された均一のgp350タンパク質は、感染性単核球症、バーキットリンパ腫および鼻咽頭癌のようなＥＢＶ関連状態および疾患を予防または治療するための治療および／または免疫原性組成物に使うことができる。そのような医薬組成物は、医薬上許容される担体、例えばアジュバント／抗原提示系、例えばミョウバンと共に、免疫原的誘発有効量の１または複数の本発明の均一gp350タンパク質を含んで成る。他のアジュバント／抗原提示系、例えばMF59(Chiron Co rp.)，QS-21(Cambridge Biotech Corp.)，3-DMPL（3 −デアシルモノホスホリルリピドＡ）（RibiImmunoChem Research，Inc.），臨床用不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ），フゾゲニックリポソーム，水溶性ポリマーまたはIscoms（免疫刺激複合体）を使ってもよい。他の典型的な医薬上許容される担体または溶液は水酸化アルミニウム、食塩水およびリン酸塩緩衝化食塩水である。該組成物は全身投与することができ、好ましくは許容される皮下または筋内溶液の形で皮下または筋内に投与することができる。また表面乱切によりまたは体腔の接種により接種を行うことができる。ｐＨ、等張性、安定性などに十分な注意をしたそのような溶液の調製は、当業者の技術の範囲内である。投薬法は、薬の作用を変えることが知られている様々な要因、例えば健康状態、体重、性別、食事、症状の重さ、投与の期間および他の臨床的要因を考慮して担当医により決定されるだろう。典型的な用量範囲は約１μｇから約1000μgのタンパク質を含んで成る。本発明の処置方法を実施する場合、免疫学的誘発有効量の均一gp350タンパク質が治療または予防処置の必要なヒト患者に投与される。本発明の組成物の免疫学的誘発有効量は、投与１回分あたり約１μｇ〜約１mgの範囲内であると予想される。投与量の数字は上述した要因によって異なるだろう。本発明を次の実施例において更に説明するが、本発明の範囲を限定するのではなく本発明を例証することを意図したものである。実施例１ pDTMおよびpSTOPを作製するための gp350/220の膜貫通領域および膜貫通領域からＣ末端までの削除ＥＢＶ B95-8株（Miller他，1972）からのgp350/220遺伝子は、BLLF1と呼ばれる転写解読枠としてBamHIライブラリーにおいて入手可能である（Baer，Nature 310 :207，1984）。所望の構成物（図２Ｂに略図として示される）を作製するため、gp350/220遺伝子を２部分においてクローニングした：(1)2.3kb HindIII／Bfa Ｉ３′断片であるBL SH1および(2)337 bp BanＩ／HindIII５′断片であるBLSH2（図２Ａ）。Ｃ末端の細胞質および／または膜貫通コード領域の削除を行えるようにそれらの断片を足場（staging）ベクター中にクローニングした。BfaＩ部位はgp350膜貫通（ＴＭ）領域をコードする領域の５′末端に存在するので、それを使ってＴＭ領域欠失体および近隣のＣ末端欠失を含むＴＭ領域欠失体を作製した。BfaＩを使って、ＴＭ領域の２アミノ酸だけを保持している欠失体を作製することができた。 1. pSTG1 とpSTG3 からのpDTMの作製プラスミドpDTMは、完全なＴＭコード領域を欠くgp350/220核酸配列から構成される。この構成物は２つの足場ベクターpSTG1とpSTG3を使って作製した。BLLF 1クローン標的配列を使って、ＴＭ領域の３′末端のところにBfaＩ部位を導入する450 bpのＰＣＲ生成物SYCTを作製した（図２）。使用したＰＣＲプライマーは次の通りである：プライマー１のBfaＩ部位を使ってSCYTのBfaI／XmaI断片をpSTG1中にクローニングした。プライマー１の残部はクローンBLLF1によりコードされるアミノ酸配列に相当する。プライマー２は、gp350/220転写解読枠の外側の該遺伝子の３′側の領域に相当する。SCYT ＰＣＲ断片をBfaIとXmaI で切断して136塩基対の断片を得、それを第二の断片であるBLSH1 HindIII／BfaI 断片と一緒にpMT11ベクター（SpaeteおよびMocarski，1985）中にクローニングしてpSTG1を作製した。BfaI部位を横切る配列分析は、アミノ酸MetとLeuを除くＴＭアミノ酸コード領域の全てが削除されたことを示した（表２を参照のこと）。第三のBLLF1断片であるBLSH2をpMT11中にクローニングしてpSTG3を作製した。 gp350/220遺伝子コード配列の外側の16塩基対のBanI／XbaIオリゴヌクレオチドリンカーを使って、BLSH2 BanI／HindIII断片をpSTG3中にクローニングした。2. 4kbのHindIII／XmaI pSTG1断片を0.3kbのXbaI／HindIII pSTG3断片と一緒にpEE1 4ベクター（Celltech，英国）中にクローニングし、pDTM構成物を完成させた。 2. ベクターpSTG2 とpSTG3 を使ったpSTOP の作製プラスミドpSTOPは、ＴＭ領域とＴＭ領域に隣接したＣ末端細胞質領域を欠くg p350/220遺伝子を含んで成る。この構成物を作製するために、下記に示すように EfaI粘着末端の後の３フレームに終止コドン（下線を引いた部分）を有する16塩基対のBfaI//EcoRIオリゴヌクレオチドリンカーを作った。上側の配列の５′突出部（TA）はBfaI制限部位のための粘着末端であり、そして下側の配列の５′突出部（TTAA）はEcoRI粘着末端である。この16塩基対リンカーを使って、BLSH1 HindIII／BfaI断片をpMT11中にクローニングしてpSTG2を作製した。pSTG2の2.3kbHindIII／EcoRI断片とpSTG3の0.3kb XbaI／HindIII断片をpEE14 中にクローニングしてpSTOPを作製した。 3. 野性型、pDTMおよびpSTOP 配列のＴＭ領域のところの比較野性型、pSTOPおよびpDTMのgp350 ＤＮＡ配列とアミノ酸配列の３′末端のオリゴヌクレオチド配列と翻訳されるアミノ酸配列を下の表２に示す。矢印は野性型の膜貫通領域（ＴＭ）の始まりと終わりを示す。膜貫通領域からの２つのアミノ酸、Met₈₆₁とLeu₈₆₂だけがpDTMとpSTOP中に保持される（図１も参照のこと）。pSTOP中ではLeu₈₆₂の直後に終止コドンがあることに注目されたい。pDTM中では、削除された膜貫通領域より先の位置が「ΔＴＭ」と記されている。（この表では、生来のアミノ酸が示される。）実施例２ pMDTMおよびpMSTOPを作製するための gp350/220遺伝子の供与体および受容体スプライス部位の除去 gp350タンパク質の均一生産を得るために、gp350/220遺伝子スプライス部位の高度に保存された塩基と保存された塩基を変更した。全スプライス部位の100％に存在する高度に保存されたＧＴ対を含む、供与体スプライス部位中の４塩基を変更した。２つの保存された供与体部位塩基ＡＡをＧＴで置き換えた。２つの高度に保存された（不変の）供与体スプライス部位塩基をＧＴからＣＡに変更した。受容体スプライス部位では、アミノ酸配列を維持するために高度に保存された受容体スプライス部位塩基のうちの１つだけを変更した。第二の保存された受容体スプライス部位塩基は表３に指摘されるように変更した。表３はgp350/220遺伝子の供与体および受容体スプライス部位の中の変更された塩基を要約する。オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発により変更された塩基は変異体配列中に星印が付けられている。スプライシングの実際部位は矢印により示され、コードされるアミノ酸が記載されている。ヌクレオチド置換の結果としてアミノ酸配列が変わらないことに注目のこと。野性型gp350/220供与体スプライス部位と受容体スプライス部位ＤＮＡ配列に対するそれらのヌクレオチド置換は、オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発を使って達成された。変異ファージベクターM13TACを使ってZoller，M.E.およびSmit h，M．（1983）Methods of Enzymol ．100:468に記載のようにして変異を導入した。Asp718とXhoI粘着末端を含む19 bpオリゴヌクレオチドリンカーと組み合わせて、ポリリンカー上のAsp718制限部位とBamHI制限部位を使ってプラスミドM13 TACのポリリンカー中にgp350/220ヌクレオチド配列のBamHI／XhoI断片をクローニングした。実施例１のプラスミドM13DTMとM13STOP（図２Ｂ）を突然変異誘発に使った。突然変異誘発に使用するために２つの42マーオリゴヌクレオチドPrDonor1とPr Acceptor1を作製した。各々、供与体または受容体スプライス部位のいずれかの中心を占めるgp350/220遺伝子配列に相補的であるようにデザインした。gp350/2 20遺伝子に相補的でない該オリゴヌクレオチドの唯一の領域は所望の変異を示す塩基であった。突然変異誘発オリゴヌクレオチドは次のものから成った：突然変異誘発オリゴヌクレオチドの配列は「プライマー」と標示され、一方で gp350/220遺伝子スプライス部位を含むＤＮＡ配列は「ＥＢＶ」と標示されている。突然変異誘発の結果として変更された塩基は星印が付けられている。点線はスプライスの位置を示している。オリゴヌクレオチドPrDonor1とPrAcceptor1をM13-DTMとM13-STOPの一本鎖クローンにハイブリダイズさせた。T4 DNAポリメラーゼホロ酵素を使って二本鎖のM1 3 ＤＮＡを製造し、その二本鎖ＤＮＡを使ってＥ．コリを形質転換せしめた。ベクターM13TACを使って、所望の変異を含まないいずれのクローンも、X-galとイソチオプロピルガラクテートの存在下で白から青への色の変化により同定することができた。青色プラークを取り、増殖させ、そしてスプライス接合部にまたがるＤＮＡ配列決定を使って、M13-MDTMおよびM13-MSTOPと命名された変異体クローンを最終同定した。所望の変異を含むクローンを同定した後、M13-MDTMとM13-MSTOPからBamHI／Xh oI断片を切り取り、それらをpDTMまたはpSTOP骨格中に連結し直してそれぞれpMD TMとpMSTOPを作製した。それらの構成物をCHO細胞中にトランスフェクションし、実施例３に記載のように非スプライシング変異体gp350/220 ＤＮＡ配列を発現させた。実施例３ CHO細胞中でのgp350の発現 1. gp350/220 遺伝子構成物のトランスフェクション哺乳類細胞からの本発明の均一gp350タンパク質を高レベルで生産する１つの方法は、多重コピーの異種gp350 ＤＮＡ配列を含む細胞の作製を必要とする。異種ＤＮＡ配列は増幅可能なマーカー（この実施例では、細胞をメチオニンスルホキシミンを使って増幅させることができるグルタミンシンセターゼ遺伝子）に作用可能に連結される。実施例２において作製したpMDTMおよびpMSTOPベクターを、Crockett，Bio/Tec hnology 8 :662（1990）の手順に従って且つグルタミンシンセターゼ遺伝子増幅系についてのCelltech Instruction Manual（199 2）に記載の通りに、後述のごとくCHO細胞中にトランスフェクションせしめた。 CHO-K1細胞（ATCC CCR61）を、10％ウシ胎児血清、100単位／mlのペニシリン、100mg／mlのストレプトマイシン、ＭＥＭ（改良イーグル培地）非必須アミノ酸および１mMピルビン酸ナトリウム（全てJRH Biosciencesから）が補足されたグルタミン不含有ＥＭＥＭ（イーグル最少必須培地）中に維持した。該培地に60 mg／mlのグルタミン酸、60mg／mlのアスパラギン、７mg／mlのアデノシン、７mg ／mlのグアノシン、７mg／mlのシチジン、７mg／mlのウリジンおよび2.4mg／ml のチミジン（全てSigmaから）も補足した。この培地調製物をトランスフェクションの間終始使用するが、指摘されるようなこの処方箋からの変化を伴う。トランスフェクションの１日前に、10cm皿に３×10⁶個のCHO-K1細胞を接種した。トランスフェクションの当日、細胞を皿あたり10mlの無血清培地で洗った。常用技術を使ったCaPO₄沈澱により、プラスミドＤＮＡ（pMDTM，pMSTOP プラスミドから）を適用した。10μgの各プラスミドＤＮＡ沈澱物をCHO-K1細胞と２ml の無血清培地と共に37℃で4.5時間インキュベートした。４回のプラスミドＤＮＡトランスフェクションの各々に３つの複製物を作った。次いでHEPES緩衝化食塩水中の15％グリセロールを使って細胞を1.5分間刺激した。無血清培地で洗浄した後、細胞に血清含有培地を再び与えて24時間インキュベートした。翌日、10％透析済ウシ胎児血清（JRH Biosciences）を含むように培地を交換し、25μＭメチオニンスルホキシミン（Sigma）の添加により増幅させた。増幅したクローンが採集に十分な位大きくなるまで（約13〜14日後）３〜５日毎に細胞にメチオニンスルホキシミン含有培地を再供給した。無菌の200μｌピペットマンチップを使って皿からコロニーを掻き取ることによりクローンを採集し、メチオニンスルホキシミン不含有培地の入った96ウエルプレートの１つのウエルに移した。１〜２日後、その培地を培地＋25μＭメチオニンスルホキシミンと交換した。４日後、培養上清を取り、後述するようなELISAアッセイにおいてタンパク質産物についてアッセイした。 CHO細胞をpEE14対照ベクターだけ（ＥＢＶ配列を全く含まない）でトランスフェクションし、同様にCHO-pEE14の24クローンを採集し、プレートに移して対照とした。（対照クローンはメチオニンスルホキシミン中での生存に基づいて同定された。） 2. ELISA アッセイトランスフェクション後、241クローンのCHO-pMDTMと158クローンのCHO-pMSTO Pを採取し、増殖させた。それらのクローンからの上清をgp350タンパク質生産について試験した。96ウエルプレートを、50mMホウ酸ナトリウム緩衝液，pH 9中に 1:2000希釈されたアフィニティー精製済ウサギ抗gp350/220抗体（抗体MDP1：And rew Morgan氏より）でコーティングした。プレートを37℃で３〜４時間インキュベートし、そしてNunc Immuno Washerを使ってＰＢＳ＋0.05％Tween 20で３回洗浄した。ブロッティング乾燥後、ＰＢＳ＋0.01％Thimerosal中の２％ＢＳＡと共に37℃で0.5時間インキュベートすることによりプレートをブロックし、次いで再び洗浄した。トランスフェクションされた細胞と対照細胞からの上清を該ウエルに添加し、37℃で２時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳ洗浄緩衝液中に希釈された１mg／mlの一次検出抗体、即ちgp350/220に対するマウスモノクローナル抗体（抗体#C65221M；Biodesign International）と共にプレートを37℃で１時間インキュベートした。洗浄後、該プレートをＰＢＳ＋0.05％ＢＳＡ＋0.01％Thimerosal中0.7mg／m lの二次抗体、即ちマウス免疫グロブリンに対して向けられた西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギＦ(ab)₂断片（ヒトIg吸着精製済；Biosource International ）と共に37℃で１時間インキュベートした。プレート洗浄後、Stable Peroxide Substrate Buffer（Pierce Chemicals）中に溶かしたABTS（Pierce Chemicals）を使って室温で0.5時間発色させた。１％ＳＤＳを使って反応を停止させ、Molec ular Devices ELISAプレートリーダーを使って405nmと650nmの波長でプレートを読んだ。24個のpMDTMクローンと18個のpMSTOPクローンが分泌型gp350について陽性であった。最大のELISAシグナルを示すクローンをスケールアップのため24ウエルプレートに移し、ウエスタンブロットと放射線免疫沈澱アッセイにおいて更に試験した。 3. ウエスタンブロットおよび放射線免疫沈澱アッセイ最初のスクリーニングでは、ウエスタンブロットを使ってpMDTMトランスフェクションからの組織培養上清を活性についてアッセイした。CHO細胞上清を５％S DS-PAGEゲル上で精製し、ニトロセルロースに一晩移行させ、そして抗gp350抗体を使って探査した。このウエスタンブロット分析において７個のpMDTMクローンがgp350陽性であるとわかった。ウエスタンブロットで陽性であったpMDTMクローンを更にgp220の存在について放射線免疫沈澱法により試験した。選択された形質転換されたpMDTM細胞、pEE14 対照細胞およびGH3Δ19対照細胞（後述）を、実験の日に約3/4周密的であるように６ウエルプレート上で一晩増殖させた。各ウエルは５×10⁶細胞を含んだ。標識のため、各ウエルから培地を取り除き、0.7mlのメチオニン不含有ＭＥＭ（10 ％ウシ胎児血清）＋100μCiの³⁵Ｓ−メチオニンで置き換えた。細胞を37℃で5.5時間インキュベートし、次いで4000rpmで５分間遠心した。5096スラリーでの10μｌのセファロース−プロテインＡ（Sigma）と20μｌのモノクローナル抗gp350/220抗体（抗体#C65221M，100mg／ml；Biodesign Inte rnational）の添加により、４℃で一晩揺り動かしながら、上清中の均一gp350タンパク質を免疫沈澱せしめた。次いで超遠心機中で2000rpm，室温で２分間混合物をペレットにし、数倍容のリン酸塩緩衝化食塩水で４回洗浄した。最終洗浄後、ペレットから全ての液体を除去し、50μｌのタンパク質ゲル試料緩衝液で置換した。沈澱した免疫複合体を含む試料を５分間煮沸し、５％SDS-PAGE上で泳動した。免疫沈澱物を、タンパク質試料緩衝液と１：１で混合した組織培養上清のゲル試料と比較した。ゲルを乾燥し、次いでHyperfilm β-Max（Amersham）を使ってオートラジオグラフィーを行った。図３は、放射線免疫沈澱のSDS-PAGE分析のオートラジオグラフ結果を示す。陽性対照として使った細胞系はGH3Δ19（Elliot Keiffより提供：Whang 他，1987 ）であった。GH3Δ19細胞は、膜貫通領域とＣ末端細胞質領域を欠いている端が切り取られた形のgp350/220タンパク質を分泌する。陰性対照として使用するために、pMDTMトランスフェクションと並行して、CHO細胞をpEE14ベクターのみでトランスフェクションしそしてメチオニンスルホキシミンにより選択した。図３には、偶数のレーンに示された免疫沈澱物（「Ｉｐ」）と互い違いに、奇数のレーンに上清（「Ｓ」）が示される。対照レーン２において、GH3Δ19対照細胞からの沈澱物は約220kDと350kDのところに２本の強いタンパク質バンドを生じ、端が切り取られたスプライス変異体gp350およびgp220タンパク質の約１：１の比での生産を証明する。予想通り、免疫沈澱させたそれらのバンドはレーン１の放射能標識した組織培養上清（免疫沈澱させてない試料）に関して濃縮される。また、予想通り、pEE14ベクターはgp350/220構成物のいずれも含まないので、陰性対照（レーン４）には全くバンドが観察されない。レーン６，８および10におけるpMDTMクローンの上清からの免疫沈澱のSDS-PAG E分析は、約350kDのところに一本の強いバンドを生じる。この分子量はGH3Δ19 対照レーン２の大きい方の分子量の種と同じである。しかしながら、GH3Δ19対照レーンとは異なり、レーン６，８および10には約220kDのところに追加の強いバンドが見られない。ただし、レーン８には、わずかに小さい分子量で移動するごく弱いバンドが観察される。これは、欠失した供与体および受容体スプライス部位を生来のヌクレオチドもしくはアミノ酸配列に戻す変異現象または誤翻訳から生じる少量のgp220タンパク質、分解産物、または共沈した細胞産物を表す可能性がある。約350kDのところの強い一本のバンドは試験した他の５つのMDTM複製物にも観察された（データは示してない）。レーン６とレーン10における220kDのバンドの完全な欠失は、MDTM上清からの不完全な沈澱のためではないようである。何故なら、³⁵Ｓ−標識GH3Δ19対照レーン２には220kDのバンドが容易に認められるからである。また、野性型スプライス部位を含む実施例１のpDTM構成物を使った追加の分析は、350kDと220kDのところに２つの強いバンドを生じた。従って、それらの結果は、スプライス部位の欠失がgp220タンパク質生産の不在下でのgp350タンパク質生産を引き起こすことを証明する。 CHO細胞系、または他の哺乳類もしくは非哺乳類細胞系中で発現されたこの均一gp350タンパク質を更にスケールアップすることができ、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、逆相HPLC、FPLC、ゲル濾過等といった技術をはじめとする当業者によく知られた方法を使って、該細胞系からの順化培地より精製することができる。David，J ．Immunol．Methods 108: 231(1988)およびMadej，Vaccine 10:777（1992）を参照のこと。 4. pMDTM タンパク質のノーザンブロット分析この実験では、MDTM-1細胞がgp350RNAを生産しgp220RNAを生産してないことをノーザンブロットにより証明し、スプライス部位の変異がgp220生産を防ぐという別の段階での確証を提供する。 gp350に相補的なＤＮＡプローブをpDTMから作製した。実施例１を参照のこと。464 bPのXhoI／PstI pDTM断片としてgp350/220プローブ鋳型XP464を単離した。XP464はgp350とgp220の両方を認識する。gp350特異的プローブAN537を作製するために、pDTMをNcoIとNdeIで切断し、２つの重複する580 b.p.断片を単離し、そして１つの混入断片を除去するためにXmnIと、gp350/220スプライス部位の内部の537 b.p．AluI／NdeI断片を得るためにAluIで該混合物を切断した。AN537は gp220からスプライシングで除去される領域に特異的であり、従ってgp350情報に特異的である。ＤＮＡ断片XP464とAN537を使ってＤＮＡプローブを³²P-dCTPニックトランスレーション（Amersham）により標識した。全細胞ＲＮＡは、ChomczyunskiおよびSacchi，Anal ．Biochem.，162:156-59（ 1987）の方法に本質的に従って調製した。CHO-pEE14（陰性対照細胞系、実施例１参照）、CHO-MDTM-1およびCHO-DTM-7細胞（90％集密的）の各々２本ずつのT-2 50フラスコから培地を吸引し、細胞を溶解させ、そして変性緩衝液（10mlの４Ｍグアニジンチオシアネート，25mMクエン酸ナトリウム，pH7.0，0.5％サルコシル，100mM ２−メルカプトエタノール）中で削り落とした。各10mlの溶解物に１ml の２Ｍ酢酸ナトリウム（pH 4）、10mlの飽和フェノール（pH4.5）および２mlのクロロホルム／イソアミルアルコールを補足し；該溶解物を氷上で15分間インキュベートし、４℃にて10000×gで20 分間遠心し、そして上側の水相を取り出した。この水相から１容のイソプロパノールの添加により20℃で１時間ＲＮＡを沈澱させ、４℃でペレット化し、変性緩衝液中に再懸濁し、そして再沈澱させた。ＲＮＡペレットを70％エタノール中で１回洗浄し、Speed-Vac中で乾燥し、そしてDEPC処理した水に再懸濁した。 DTM-7およびMDTM-1全細胞ＲＮＡを15％ホルムアミドと６％ホルムアルデヒド中で65℃にて15分間変性させ、１％アガロース／6.6％ホルムアルデヒドゲル上で泳動し、次いで毛管作用によりニトロセルロースに移行させ、そして標識した XP464とAN537を使って探査した。５分間煮沸することによってこれらのＤＮＡプローブを変性させ、５×ＳＳＰＥ中で65℃にて一晩ハイブリダイズさせ、そしてニトロセルロースを高緊縮条件下で洗浄した。Bio-Rad Phosphorimagerを使ってオートラジオグラフィーを行った。 CHO-MDTM細胞からの全細胞ＲＮＡのノーザンブロットは、gp220特異的ＲＮＡ生産を抑制することに対するスプライス変異の有効性を示す。gp350特異的プローブであるAN537は、gp350特異的プローブに予想される通り、MDTM-1細胞とDMT- 7細胞中の１種類のＲＮＡだけに結合した（図４，レーン１と２）。スプライス変異がMDTM-1中でgp220情報の生産を抑制しているとすれば予想通り、gp350ＲＮＡとgp220 ＲＮＡの両方に特異的であるXP464プローブはDTM-7では２つの種を認識し、MDTM-1では一本の大きい方の分子量バンドを認識した（図４，レーン４と３）。MDTM-1レーンはgp350特異的ＲＮＡに対して過負荷であるにもかかわらず、明瞭なgp220 ＲＮＡは全く検出不可能であった。MDTM-1とDTM-7 レーンにおいてgp350情報の見かけ移動度に差がある理由は明らかでない。MDTM-1種はDTM-7に比較して過負荷であるので、それがゲル上での移動に影響したのかもしれない。また、gp350情報はゲル上で大きなリボソームＲＮＡバンドに接近して移動するため、それが見かけ分子量をゆがめるのかもしれない。いずれにせよ、gp350 ＤＮＡ配列に相補的な単一種の存在は、このシグナルがgp35 0 mRNAを表すことを示唆する。よって、ノーザンブロットから判断すると、供与体および受容体スプライス部位における突然変異はgp220情報の生産を抑制するのに有効である。この結果は、gp350/220に特異的なモノクローナル抗体を使った放射線免疫沈澱により並びにMDTM-1上清とDTM-7上清のウエスタンブロットにより更に確証される。実施例４免疫原性活性についての均一gp350タンパク質の試験精製した均一gp350タンパク質を次のようにして投与に適当な賦形剤中に配合しそしてマウスに投与する。 David，J ．Immunol．Methods 108:213(1988)およびAllison，J ．Immunol．Met hods 95 :157（1986）の手順に従って、Pluronic L121とスクアランを（Thr¹）MD Pと共にリン酸塩緩衝化食塩水中の0.4％(v/v)Tween 80中で混合することにより、２×アジュバント−賦形剤濃縮物を調製する。投与用組成物は、同容量のタンパク質とアジュバント−賦形剤の添加により投与日に調製する。タンパク質含量は用量あたり５μｇ〜50μｇの範囲内であるべきである。０，21および42日目の３回の0.1ml筋肉内注射によりBALB/cマウスを免疫する。後眼窩洞から免疫前の血液と各注射の10日後に採血した血液を得る。実施例３に記載の手順に従ったELISAにより血清抗体価を測定する。血清中のＥＢＶ中和抗体は、Moss，J ．Gen．Viol．17:233 (1972)およびDe Schryver，Int ．J．Cancer 13:353(1974)の方法に従って、試験管内でＥＢＶによる胎児臍帯血リンパ球の形質転換を阻害するそれらの能力により定量する。あるいは、前述のアジュバント中に乳化させたタンパク質の０，21，42，63および84日目の５回の筋肉内投与によりニュージーランド白ウサギに接種する。用量は接種１回あたり約５μｇ〜50μｇの範囲内である。最後の投与の二週間後に血清を得、抗原に対する抗体価について、B95-8細胞からのウイルスgp350/220に対する交差反応性抗体について、およびEmini，Virology 166:387（1988）の方法に従った試験管内ＥＢＶ中和活性について試験する。ＥＢＶのgp350/220タンパク質は既に確立されているＥＢＶ感染の動物モデル〔Epstein，Clin ．Exp．Immunol．63:485（1986）を参照のこと〕において防御免疫を誘導することができるので、均一gp350タンパク質組成物の投与からも同様な良性結果が期待される。本明細書中に指定した全ての刊行物の開示は本明細書中に組み込まれる。本発明の範囲内での変更は当業者にとって明白であろうから、上述の詳細な説明は理解の明確化のために与えられるのであって、そこから無用な制限が解釈されたり推測されたりしてはならない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 9735−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．均一gp350タンパク質の発現をコードする単離されたＤＮＡ配列。２．図１の501位のセリンをコードする少なくとも１つの生来のヌクレオチドが生来でないヌクレオチドにより置換されており且つ698位のグリシンをコードする少なくとも１つの生来のヌクレオチドが生来でないヌクレオチドにより置換されているヌクレオチド配列を有することにより更に特徴づけられる、請求項１のＤＮＡ配列。３．前記均一gp350タンパク質が (a) 図１のアミノ酸19からアミノ酸862まで (b) 図１のアミノ酸１からアミノ酸862まで (c) 図１のアミノ酸19からアミノ酸862までとアミノ酸882からアミノ酸907まで (d) 図１のアミノ酸１からアミノ酸862までとアミノ酸882からアミノ酸907まで (e) 膜貫通領域中の少なくとも８アミノ酸をコードするヌクレオチドが欠失しているアミノ酸１からアミノ酸907までから成る群より選択されたアミノ酸配列をコードすることにより更に特徴づけられる、請求項１のＤＮＡ配列。４．請求項１、請求項２または請求項３のＤＮＡ配列を含んで成るベクター。５．前記ＤＮＡ配列の複製および発現を指令することができる調節配列に作用可能に連結された請求項１、請求項２または請求項３のＤＮＡ配列により形質転換された宿主細胞。６．均一gp350タンパク質の生産方法であって、適当な培地中で請求項５の宿主細胞を培養し、そして前記細胞から前記均一gp350 タンパク質を単離することを含んで成る方法。７．請求項６の方法に従って生産された均一gp350タンパク質。８．均一gp350タンパク質であって、供与体スプライス部位および受容体スプライス部位をコードする１または複数の生来のヌクレオチドが、前記受容体および供与体部位のアミノ酸配列を保持する前記生来のヌクレオチドと異なる１または複数の代用ヌクレオチドにより置換されている前記均一gp350タンパク質。９．医薬上許容される担体と共に請求項７または請求項８の均一gp350タンパク質を含んで成る医薬組成物。 10．ＥＢＶ関連疾患または状態の予防処置に適当な医薬組成物の調製のための均一gp350タンパク質の使用。