JPH10501986A

JPH10501986A - レチノイン酸受容体エプシロン

Info

Publication number: JPH10501986A
Application number: JP8503085A
Authority: JP
Inventors: ツァオ，リャン; ニー，チーアン; フレイシュマン，ロバート・ディ
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1994-06-24
Filing date: 1994-06-24
Publication date: 1998-02-24
Also published as: EP0769023A1; EP0769023A4; AU7471294A

Abstract

(57)【要約】ＲＡＲεポリヌクレオチド、およびそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ(ＲＮＡ)を開示する。そのようなポリペプチドを組換え技術により製造する方法、そのようなポリペプチドを治療目的、例えば、組織再生、並びに免疫および造血系の刺激に利用する方法もまた提供する。ＲＡＲεを刺激するリガンドを同定する方法もまた開示する。

Description

【発明の詳細な説明】レチノイン酸受容体エプシロン本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関する。とりわけ、本発明のポリペプチドは、レチノイン酸受容体エプシロン(ＲＡＲε)である。本発明はまた、そのようなポリペプチドの作用を阻害することにも関する。レチノイド(ビタミンＡ誘導体)は、多数の組織の正常な成長、外観(vision)、維持、生殖(reproduction)および全体の生存に重要である(Ｗolbach,Ｓ.Ｂ.、Ｊ .Ｅxp.Ｍed. 、４２：７５３−７７７（１９２５）)。加えて、ビタミンＡ欠乏( ＶＡＤ)雌親の子孫は、多くの発生欠陥を示し、胚形成の間、レチノイドもまた重要であることを示す(Ｗilson,Ｊ.Ｇ.ら、Ａm.Ｊ.Ａnat.、９２：１８９−２１７（１９５３）)。レチノイン酸(ＲＡ)投与により、胎児並びに若年および成年の動物におけるビタミンＡ欠乏の作用を阻止する、および／または逆転させることができる(Ｗilson,Ｊ.Ｇ．ら、Ａm.Ｊ.Ａnat.、９２：１８９−２１７（１９５３）)。哺乳動物の胚に対する母性ＲＡ投与の劇的な催奇作用並びに脊椎動物の胚発生および両生動物におけるリム再生に対するレチノイドの局所投与の目覚ましい作用は、ＲＡが実際はモルフォゲン(発生の間、位置情報を与える)であり得、また器官形成の間、重要な役割もまた果し得るという考えに著しく寄与している(Ｔabin,Ｃ．Ｊ.、Ｃell、６６：１９９−２１７（１９９１）)。レチノイドはまた、多数の組織の正常な成長、外観、維持、生殖および全体の生存にも重要である(Ｗolbach,Ｓ.Ｂ.およびＨowe,Ｐ.Ｒ.、Ｊ.Ｅxp.Ｍed.、４２：７５３−７７７（１９２５）)。ＲＡシグナルの作用は、リガンド誘導性転写調節因子のスーパーファミリーに属する受容体の２つのファミリーによって媒介されると考えられ、これらには、ステロイド甲状腺ホルモンおよびビタミンＤ３受容体が含まれる(Ｅvans,Ｒ.Ｍ. 、Ｓcience、２４０：８８９−８９５（１９８８）)。レチノイン酸受容体遺伝子は、ステロイドホルモン受容体ファミリーとして知られている遺伝子のスーパーファミリーに属する。このファミリーにおける遺伝子は全て、別々の領域またはドメインに分けることができ、これらは時に、領域Ａ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦと呼ばれる。Ｃ領域はＤＮＡ結合ドメインをコードし、Ｅ領域はリガンド結合ドメインをコードし、またＦ領域はカルボキシ末端ドメインをコードする。Ｄ領域は「ヒンジ」として機能すると考えられる。Ａ／Ｂ(またはＮ末端)領域の機能は完全に明らかとなっているわけではないが、受容体転写活性の向上および抑制と関係し得る(Ｈollenbergら、Ｃell、５５：８９９−９０６（１９８８）)。ＲＡ受容体(ＲＡＲ)ファミリー(ＲＡＲα、βおよびγ並びにそれらのアイソフォーム)は、オールトランス(all-trans)およびノンシス(non-cis)の両方のＲＡにより活性化される。ＲＡＲδもまたクローン化されている(Ｍech,Ｄev.、４０：９９−１１２（１９９３）)。ある一定の種内では、３つのＲＡＲ型のＤＮＡ結合領域およびリガンド結合領域ドメインは非常に似ているが、Ｃ末端領域および中間領域は、類似性を全く、またはほとんど示さない。３つのＲＡＲ型のアミノ酸配列もまた、それらのＢ領域において顕著に異なっており、またそれらの主要なアイソフォーム(α１およびα２、β１〜β４、γ１およびγ２、並びに δ１およびδ２)はさらに、それらのＮ末端Ａ領域において異なる(Ｌeid,Ｍ.ら、Ｔrends Ｂiochem.Ｓci.、１７：４２７−４３３（１９９２）)。ＲＡＲγ変異体マウスは、精嚢および前立腺の扁平上皮化生が原因となって、成長障害、初期の致死、および雄の生殖不能(sterility)を示す(Ｌohnes,Ｄ.ら、Ｃell、７３：６４３−６５８（１９９３）)。ＲＡＲγ転写物は、それらの胚由来に関係なく、前軟骨性圧縮物中に見い出され、軟骨への制限、および扁平角質化上皮の分化が続いて起こる(Ｄolle,Ｐ.ら、Ｎature、３４２：７０２−７０５（１９８９）)。これらの観察結果は、形態形成および軟骨形成におけるＲＡＲγの役割を示唆する(Ｄolleら、Ｄevelopmen t 、１００：１１３３−１１５１（１９９０）)。本発明のＤＮＡ配列およびそのようなＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドは、レチノイン酸受容体ファミリーに属し、またレチノイン酸受容体ガンマに対して最も相同性である。モジュレーターおよびＤＮＡ結合ドメインは両方とも、ショウジョウバエのエクジソン受容体の対応する部分で最も高い相同性を共有する。発生の間、エクジソン受容体が重要な役割を果す。本発明の一態様により、ＲＡＲεである新規成熟ポリペプチド、さらにはまた、そのフラグメント、アナログおよび誘導体を提供する。本発明のポリペプチドは、ヒト起源である。本発明の別の態様により、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)を提供する。本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチドを組換え技術により製造する方法を提供する。本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを治療目的、例えば、その新規ホルモン、ＤＮＡ結合部位、遺伝子標的および組織特異性を同定するのに利用する方法を提供し、これは、発生、分化、組織再生、生殖、並びに免疫および造血系の刺激を促進するための治療標的を提供する。本発明のまたさらなる態様により、そのようなポリペプチドに対する抗体を提供する。本発明のこれらの態様および他の態様は、本明細書中の教示から当業者に明らかであろう。以下の図面は、本発明の態様を説明するものであって、請求の範囲により包含される本発明の範囲を限定しようとするものではない。第１図は、推定される成熟ＲＡＲεポリペプチドのポリヌクレオチド配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸に関する標準的な１文字略号を使用する。第２図は、ＤＮＡ結合領域およびリガンド結合領域でのＲＡＲεとＲＡＲγとの間の高い相同性を説明する。第３図は、成人の組織におけるＲＡＲεのノーザンブロット分析の結果を示す。第４図は、インビトロにおいて転写／翻訳した後、ＲＡＲεをゲル上で電気泳動した結果を示す。第５図は、ＲＡＲεの発現に使用したバキュロウイルス伝達プラスミドpＡ２を説明する。本発明の一態様により、第１図の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチド、または１９９４年３月１８日にＡＴＣＣ寄託番号第７５７５４号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする、単離された核酸(ポリヌクレオチド)を提供する。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、精巣、脾臓および胸腺から得ることができる。本発明のポリヌクレオチドは、成人の肺から得られた cＤＮＡライブラリー中で発見された。それは、構造的には、レチノイン酸受容体ファミリーに関係する。それは、約４３３アミノ酸残基のタンパク質をコードする開放読み枠(オープンリーディングフレーム)を含む。そのタンパク質は、レチノイン酸受容体ガンマに対し、モジュレーター領域の７０アミノ酸長さ以上で４８％の同一性および５８％の類似性をもって、最も高い相同性の度合を示す。同様に、ＤＮＡ結合領域およびリガンド結合領域もまた、レチノイン酸受容体ガンマに対して非常に相同性である(第５図)。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形で、またはＤＮＡの形であり得、このＤＮＡには、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。該ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得、また一本鎖であるなら、コード鎖または非コード(アンチ−センス)鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、第１図に示すコード配列または寄託されたクローンのコード配列と同じであってよく、あるいは遺伝コードの重複または縮重の結果として、第１図のＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なったコード配列であってもよい。第１図の成熟ポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、以下のものが含まれ得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列、およびリーダーもしくは分泌配列といったような付加的コード配列；成熟ポリペプチドのコード配列(また場合により、付加的コード配列)、および成熟ポリペプチドのコード配列のイントロンまたは非コード配列５'および／または３'といったような非コード配列。従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配列のみが含まれるポリヌクレオチド、さらにはまた、付加的コードおよび／または非コード配列が含まれるポリヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、第１図の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異体またはポリヌクレオチドの天然には存在しない変異体であり得る。従って、本発明には、第１図に示すのと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、さらにはまた、そのようなポリヌクレオチドの変異体が含まれ、これらの変異体は、第１図のポリペプチドまたは寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。そのようなヌクレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体並びに付加および挿入変異体が含まれる先に示したように、該ポリヌクレオチドは、第１図に示すコード配列の天然に存在するアレル変異体または寄託されたクローンのコード配列の天然に存在するアレル変異体であるコード配列を有し得る。当業界で知られているように、アレル変異体は、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得る別の形のポリヌクレオチド配列であり、これは、コードされるポリペプチドの機能を実質的には変えない。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能とするマーカー配列に枠内で融合したコード配列も有し得る。細胞宿主の場合には、そのマーカー配列は、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供するための、pＱＥ−９(Ｑiagen)ベクターにより与えられるヘキサ−ヒスチジンタグ(tag )であってよく、または、例えば、哺乳動物宿主、例えば、ＣＯＳ−７細胞を使用する場合には、そのマーカー配列は、赤血球凝集素(ＨＡ)タグであってよい。ＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から得られるエピトープに対応する(Ｗilson,Ｉ.ら、Ｃell、３７：７６７（１９８４）)。本発明はさらに、配列間に少なくとも５０％、また好ましくは７０％の同一性がある場合に、上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェント条件下、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、また好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろうことを意味する。好ましい態様では、上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、第１図のcＤＮＡまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を実質的には保有するポリペプチドをコードする。本明細書中で言う寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件の下に保持されるであろう。これらの寄託は、単に当業者への便宜として与えられるものであって、寄託が３５Ｕ.Ｓ.Ｃ．§１１２下に要求されることを承認するものではない。寄託された物質中に含まれるポリヌクレオチドの配列、さらにはまた、それによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の一部を構成して、本明細書中の配列のいずれかの記載と矛盾する際はいつでも照合している。寄託された物質を製造し、使用し、または販売するには、実施許諾が要求され得、またそのような実施許諾は、ここでは付与されない。本発明はさらに、第１図の推定アミノ酸配列を有する、または寄託されたcＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＲＡＲεポリペプチド、さらにはまた、そのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。第１図のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドを示す場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」という用語は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保有するポリペプチドを意味する。従って、アナログには、プロプロテイン部分を切断することにより活性化して、活性な成熟ポリペプチドを製造することができるプロプロテインが含まれる。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチド、好ましくは組換ポリペプチドであってよい。第１図のポリペプチドまたは寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が同型または非同型アミノ酸残基(好ましくは、同型アミノ酸残基)で置換されており、またそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるものであってもよく、またはコードされたものでなくてもよいもの、（ii）１つまたはそれ以上のアミノ酸残基に置換基が含まれるもの、または（iii）成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような、他の化合物と融合しているもの、または（iv）リーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に使用される配列、またはプロプロテイン配列といったような、付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離された形で提供されるのが好ましく、好ましくは、均一となるまで精製される。「単離された」という用語は、物質がその元の環境(例えば、それが天然に存在するなら、天然の環境)から除去されていることを意味する。例えば、生きている動物にある天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系における共存物質のいくつかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分となり得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分となり得、またそのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の部分ではないという点で、なお単離されている。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが含まれるベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術による製造にも関する。宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで遺伝的に操作される(トランスデュースされ、またはトランスフォームされ、またはトランスフェクトされる)。該ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、またはＲＡＲε遺伝子を増幅するのに適するよう改変された従来の栄養培地で培養することができる。温度、pＨ等といったような培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で先に使用した培養条件であって、当業者に明らかであろう。本発明のポリヌクレオチドは、ペプチドを組換え技術により製造するのに使用することができる。従って、例えば、該ポリヌクレオチドを、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか１つに含ませることができる。そのようなベクターには、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡとの組合せから得られるベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病といったようなウイルスＤＮＡが含まれる。しかし、他のいずれのベクターも、それが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクターに挿入することができる。一般には、ＤＮＡ配列を当業界で既知の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。そのような方法および他の方法は、当業者の範囲内であると思われる。発現ベクターのＤＮＡ配列を、適当な発現制御配列(プロモーター)に作動可能に結合し、mＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として、以下のものが挙げられる：ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ.coli. lacまたはtrp、ファージラムダＰ_Lプロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルスでの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終結区も含む。該ベクターはまた、発現を増幅するのに適当な配列も含み得る。さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合にはジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマイシン耐性といったような、またはＥ.coliではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性といったような、トランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特性を与えるために、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むのが好ましい。上記のような適当なＤＮＡ配列、さらにはまた、適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを、適当な宿主をトランスフォームするために使用して、その宿主がタンパク質を発現するのを可能にすることができる。適当な宿主の代表例として、以下のものが挙げられる：Ｅ.coli、Ｓtreptomyc es 、Ｓalmonella typhimuriumといったような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；ＤrosophilaおよびＳf９といったような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢow esメラノーマといったような動物細胞；植物細胞等。適当な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると思われる。とりわけ、本発明にはまた、先に広く記載した配列を１つまたはそれ以上含んでなる組換え構築物も含まれる。その構築物は、本発明の配列が順または逆方向で挿入されている、プラスミドまたはウイルスベクターといったようなベクターを含んでなる。この実施態様の好ましい態様では、該構築物はさらに、例えば、該配列に作動可能に結合したプロモーターを含め、制御配列を含んでなる。適当なベクターおよびプロモーターが多数、当業者に知られていて、市販されている。以下のベクターを例として挙ける。細菌用：pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ− ９(Ｑiagen)、pbs、pＤ１０、ファージスクリプト(phagescript)、psiＸ１７４、pbluescript ＳＫ、pbsks、pＮＨ８Ａ、pＮＨ１６a、pＮＨ１８Ａ、pＮＨ４６Ａ(Ｓt ratagene)；ptrc９９a、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４、pＲＩＴ５(Ｐharmacia)、pＲＳおよびpＧＥＭ。真核生物用：pＷＬＮＥＯ、pＳＶ２ＣＡＴ、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagene)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(Ｐharmacia)。しかし、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可能であって、生存可能である限り、使用することができる。プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、いずれかの所望の遺伝子から選択することができる。２つの適当なベクターは、ＰＫＫ２３２−８およびＰＣＭ７である。個々に名付けられた細菌プロモーターには、lac I、lacＺ、Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびrpが含まれる。真核プロモーターには、ＣＭＶ即時初期(immediate early)、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン− Ｉが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分、当業者のレベルの範囲内である。さらなる態様では、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する。その宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核細胞、酵母細胞のような低等真核細胞であり得、または該宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより行うことができる。(Ｄavis,Ｌ.、Ｄibner,Ｍ.、Ｂattey,Ｌ.、Ｂasic Ｍethods in Ｍolecular Biology（１９８６）)。宿主細胞中の構築物を通常の方法で使用して、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成装置により合成的に製造することができる。成熟タンパク質は、適当なプロモーターの制御下、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現させることができる。そのようなタンパク質を、本発明のＤＮＡ構築物から得られるＲＮＡを用いて製造するために、無細胞翻訳系もまた使用することができる。原核および真核宿主で使用するのに適当なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓambrookら、Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanual，第２版、Ｃold Ｓpring Ｈarbor、ニューヨーク、(１９８９)により記載されており、この開示は、本明細書の一部を構成する。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常、約１０〜３００bpの、ＤＮＡのシス作用性要素である。例には、bp１００〜２７０の、複製開始点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。通例、組換え発現ベクターには、複製開始点、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能にする選択可能なマーカー、例えば、Ｅ.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ.cerevisiae ＴＲＰ１遺伝子、並びに下流の構造配列の転写を行わせるために高度に発現される遺伝子から得られるプロモーターが含まれるであろう。そのようなプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)のような解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンから得ることができる。ヘテロロガス構造配列は、翻訳開始および終結配列、また好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を行わせることができるリーダー配列と共に、適当な相(phase)で構築される。場合により、そのヘテロロガス配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易化を与えるＮ−末端同定ペプチドが含まれる融合タンパク質をコードすることができる。細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能的なプロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入することにより構築される。そのベクターは、ベクターの維持を確実なものとするために、また所望により、宿主内での増幅を与えるために、１つまたはそれ以上の表現型の選択可能なマーカーおよび複製開始点を含んでなるであろう。トランスフォーメーションに適当な原核宿主には、Ｅ.coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typhimurium、並びにＰseudomonas属、Ｓtreptomyces属、およびＳtaphylococcus属の範囲内の様々な種が含まれるが、他のものもまた、選択物質として使用することができる。代表的であるが、非限定的な例として、細菌で使用するのに有用なベクターは、周知のクローニングベクター pＢＲ３２２(ＡＴＣＣ３７０１７)の遺伝要素を含んでなる市販のプラスミドから得られる、選択可能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んでなり得る。そのような市販のベクターには、例えば、pＫＫ２２３−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、スウェーデン)およびＧＥＭ１(Ｐromega Ｂiotec、Ｍadison、ＷＩ、米国)が含まれる。これらのpＢＲ３２２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。適当な宿主株をトランスフォーメーションして、その宿主株を適当な細胞密度までの増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な方法(例えば、温度シフトまたは化学誘導)により誘導して、細胞をさらなる期間培養する。細胞を、一般的には、遠心分離により収集し、物理的または化学的方法により破壊して、その結果得られた粗製の抽出物を更なる精製のために保有する。タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含め、いずれの従来法によっても破壊でき、そのような方法は、当業者に周知である。組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系もまた使用することができる。哺乳動物発現系の例には、Ｇluzman、Ｃell、２３：１７５（１９８１）により記載されている、サルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合可能なベクターを発現させることができる他の細胞系、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨeＬaおよびＢＨＫ細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、またいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５'に隣接する非転写配列もまた含んでなるであろう。ＳＶ４０のスプライシングから得られるＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非転写遺伝要素を与えることができる。ＲＡＲεポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれる方法により、組換え細胞培養物から回収して、精製することができる。精製の間、低濃度(約０．１５−５mＭ)のカルシウムイオンの存在を有するのが好ましい(Ｐriceら、Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.、２４４：９１７（１９６９） )。必要に応じて、タンパク質の再生工程を、成熟タンパク質の立体配置を完成するのに使用することができる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終精製工程に使用することができる。本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、もしくは化学合成法の産物であり得るか、または原核もしくは真核宿主から(例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞によって)組換え技術により製造することができる。組換え製造方法で使用する宿主により、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、またはグルコシル化され得ない。本発明のポリペプチドにはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基が含まれ得る。ＲＡＲεホルモン受容体は、その新規ホルモン、ＤＮＡ結合部位、遺伝子標的および組織特異性の同定に使用することができる。ＲＡＲεポリペプチドはまた、免疫および造血系の組織再生、生殖、刺激に対する治療標的として、また雄の生殖不能の治療に使用することもできる。このことは、ＲＡＲ変異体マウスが前述の異常を示したことから特に重要である。従って、ＲＡＲε受容体は、これらの障害を治療するのに使用することができる。ＲＡＲεポリペプチドはまた、この受容体によって媒介されるホルモン応答をモジュレートすることができるステロイドアゴニストのような、推定されるホルモン分子のスクリーニングに使用することもできる。ＲＡＲεに対するこれらのリガンドおよび他のリガンドをアッセイするために、ＲＡＲε結合部位をコードする遺伝子をpＲＳ真核発現ベクター中にクローン化して(Ｇiguereら、Ｃell、４６：６４５（１９８６）)、pＲＳhＲＡＲεを産生する。次いで、そのプラスミドをリポータープラスミドＤＥＬＴＡＭＴＶ−ＴＲＥ sub p−ＣＡＴと一緒にリン酸カルシウムトランスフェクションによってサル腎臓ＣＶ−１細胞中に導入する。ＴＲＥは、甲状腺受容体応答因子を意味し、またＴＲＥ sub pは、この因子のパリンドローム性を最大とするよう操作されたＴＲＥである。対照として、pＲＳerbＡ sup−１(いずれのタンパク質もコードしない、負の対照である)もまた試験する。トランスフェクトされた細胞を、１００nＭレチノイン酸または他の可能性のあるリガンドの存在下または不存在下に３６時間インキュベートして、誘発されたＣＡＴ活性をクロマトグラフィーにより分析した。その結果は、リガンドがＲＡＲεに結合することを示すであろう。本発明はさらに、リガンドのＲＡＲεに対する相互作用を高める薬物(アゴニスト)を同定するために、薬物をスクリーニングする方法を提供する。例として、先に論じたように、リポータープラスミドおよびpＲＳhＲＡＲεをサル細胞中に導入する。次いで、トランスフェクトされた細胞を薬物の存在下に標識化レチノイン酸とインキュベートする。次いで、薬物がこの相互作用を高める能力を測定することができるであろう。リポーター遺伝子は、ＣＡＴまたはルシフェラーゼ遺伝子であり得、リガンドおよび受容体の相互作用に関するその活性が可能であり、または測定することができる(Ｐromega Ｔechnical Ｂulletin 第１２６号、１９９３年７月)。トランスフェクションシステムは、受容体に結合して、放射性、分光または他の試薬により標識化される、既知の、または候補の薬物とリガンドの間の競合結合アッセイのための生物細胞培養として有用である。トランスフェクションシステムは、ヒトＲＡＲεの天然機能を活性化する、または阻害するための治療化合物として、さらに改変するか、または直接使用することができる薬物の開発に対する可能性を有する、天然または合成化合物の同定に有用な「薬物発見システム」を構成する。該トランスフェクションシステムはまた、ヒトＲＡＲε部位での既知の薬物の親和性および効能を測定するのにも有用である。ポリペプチドであるアゴニストおよび薬物は、「遺伝子治療」と呼ばれることが多い、そのようなポリペプチドのインビボにおける発現により、本発明に従って使用することができる。従って、例えば、患者由来の細胞を、エクスビボにおいてポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で操作した後、操作した細胞を該ペプチドで処置すべき患者に与える。そのような方法は、当業界で周知である。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用によって、細胞を当業界で既知の方法により操作することができる。同様に、例えば、当業界で既知の方法により、ポリペプチドのインビボにおける発現のために、細胞をインビボにおいて操作することができる。当業界で知られているように、細胞をインビボにおいて処理して、ポリペプチドをインビボにおいて発現させるために、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するための産生細胞を患者に投与することができる。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであろう。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの、例えば、適当な運搬ビヒクルと組み合わせた後、細胞をインビボにおいて操作するために使用することができるアデノウイルスであってもよい。本発明のＲＡＲεポリペプチドはまた、同様の生物学的活性を有する他の分子を同定するのにも有用である。このことに関するスクリーニングの例は、既知のＤＮＡ配列を使用してオリゴヌクレオチドプローブを合成することにより、ＲＡＲε遺伝子のコード領域を単離することである。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドを、ヒトのcＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはmＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするために使用して、ライブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを決定する。ＲＡＲεのアベイラビリティーから、様々な組織および体液中に存在するレチノイン酸のレベルを測定するための診断アッセイにおいて、その使用が可能である。これらのレベルの測定から、低レベルのレチノイン酸に関係する疾患の診断および治療が可能である。本発明の配列はまた、染色体同定にも有益である。その配列を個々のヒト染色体上の特定の位置に対して具体的に標的化して、ハイブリダイズさせることができる。そのうえ、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要がある。実際の配列データ(反復多型性)に基づいた染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置をマークするのにはほとんど利用できない。本発明によるＤＮＡの染色体へのマッピングは、それらの配列を病気と関連する遺伝子と関係づける重要な第一段階である。簡単に言えば、cＤＮＡ由来のＰＣＲプライマー(好ましくは、１５−２５bp) を調製することにより、配列を染色体にマップすることができる。cＤＮＡのコンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮＡ中の１つ以上のエクソンをスパン(s pan)しないプライマーを迅速に選択することから、増幅過程を複雑なものとする。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含む、それらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを与えるであろう。体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させるための迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いての本発明を利用して、サブローカリゼーションは、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプール由来のフラグメントのパネルを用いる類似の方法で達成することができる。その染色体へマップするのに同様に利用することができる他のマッピング方法には、in situ ハイブリダイゼーション、標識化フロー−ソーティッド(flow−sorted)染色体を用いてのプレスクリーニング、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセレクションが含まれる。 cＤＮＡクローンの、中期染色体スプレッドへの蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)を利用して、正確な染色体位置を一工程で与えることができる。この技術は、５００または６００塩基という短いcＤＮＡで利用することができる；しかし、２,０００bpより大きいクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度を有する独自の染色体位置へ結合する可能性が高い。ＦＩＳＨは、ＥＳＴが得られるクローンの使用を必要とし、また長ければ長いほどよい。例えば、２,０００bpが良好であり、４,０００はより良好であって、４,０００以上は、恐らく、良好な結果を妥当な時間割合で得るのに必要ない。この技術の復習には、Ｖermaら、Ｈuman Ｃhromosomes：a Ｍanual of Ｂasic Ｔechniques、Ｐerga mon Ｐress、ニューヨーク（１９８８）を参照。ある配列が正確な染色体位置に一度マップされると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝マップデータと関連付けることができる。そのようなデータは、例えば、Ｖ.ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in Ｍan(Ｊohns Ｈopkins Ｕniv ersity Ｗelch Ｍedical Ｌibraryを介してオンラインで利用できる)に見い出される。次いで、同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係を結合分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))によって確認する。次に、病気に冒された個体と冒されていない個体との間のcＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定する必要がある。変異が、冒された個体のいくつかまたは全てにおいて認められるが、いずれの正常な個体においても認められないなら、その変異は疾患の原因となるものであるらしい。現在、物理的マッピングおよび遺伝的マッピングの分析から、疾患と関連する染色体領域に正確に局在化したcＤＮＡは、５０〜５００の可能な原因となる遺伝子の１つとなり得るであろう。(これは、１メガベースのマッピング分析および２０kb当り１つの遺伝子を仮定する)。冒された個体と冒されていない個体との比較は、通例、染色体スプレッドから見ることができるか、またはそのcＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲを利用して検出することができる、欠失またはトランスロケーションといったような、染色体における構造変化を先ず探す。最後には、変異の存在を確認するために、また変異を多型性から区別するために、幾つかの個体由来の遺伝子の完全な配列決定が必要とされる。ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは他の誘導体、もしくはそれらのアナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫源として使用して、それらに対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明にはまた、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、さらにはまた、Ｆabフラグメント、またはＦab発現ライブラリーの生成物も含まれる。当業界で既知の様々な方法を、そのような抗体およびフラグメントの製造に使用することができる。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入することにより、またはポリペプチドを動物、好ましくはヒトでない動物に投与することにより得ることができる。次いで、そのようにして得られた抗体は、そのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、完全な天然のポリペプチドを結合する抗体を製造するのに使用することができる。次いで、そのような抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離することができる。モノクローナル抗体を調製するには、連続的な細胞系培養により産生される抗体を与える技術を全て使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術(Ｋo hlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５６：４９５−４９７)、トリオーマ(trioma)技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozborら、１９８３、Ｉmm unology Ｔoday ４：７２)、およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃoleら、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer Ｔherapy、Ａlan Ｒ.Ｌiss，Ｉnc.、７７−９６頁において)が含まれる。単鎖抗体の産生に関して記載されている技術(米国特許第４,９４６,７７８号) は、本発明の免疫原性ポリペプチド産生物に対する単鎖抗体を製造するのに適合し得る。本発明はさらに、ＲＡＲεポリペプチドの発現不足と関連のある障害に対する素質を診断する方法を提供し、その方法は、該障害を患っている被験者のＤＮＡを得、ＤＮＡの制限消化を一団の制限酵素で行い、その結果得られたＤＮＡフラグメントをサイジングゲルでの電気泳動により分離し、その結果得られたゲルを、ＲＡＲεポリペプチドをコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができ、また検出可能なマーカーで標識化された核酸プローブと接触させ、ＲＡＲ εポリペプチドをコードするＤＮＡにハイブリダイズしている標識化バンドを検出可能なマーカーで検出して、該障害を患っている被験者のＤＮＡに特異的な独自のバンドパターンを作成し、先の工程により得られたＤＮＡを診断用に調製して、該障害を患っている被験者のＤＮＡおよび診断過程から得られたＤＮＡに特異的な独自のバンドパターンを比較して、該障害に対する素質を診断することからなる。本発明をさらに、以下の実施例に関して記載する；しかし、本発明は、そのような実施例に限定されないことを理解すべきである。部または量は全て、特にことわらない限り、重量単位である。以下の実施例の理解を容易にするために、幾つかの頻繁に出てくる方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は、前置きする小文字のpおよび／または続けて大文字および／または数字により示す。本明細書中の出発プラスミドは、市販されていて、限定されない基盤の下に公に入手可能であるか、または公開された方法により入手可能なプラスミドから構築できる。さらに、記載したプラスミドと同等のプラスミドは、当業界で既知であって、当業者に明らかであろう。ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡのある配列にのみ作用する制限酵素でＤＮＡを触媒切断することを示す。本明細書中で使用する様々な制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、当業者に知られているように使用した。分析目的には、一般的に、緩衝溶液約２０μl中、１μgのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的には、一般的に、より多量の体積中、ＤＮＡ５〜５０μgを２０〜２５０単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適当な緩衝液および基質量は、製造者により指定されている。３７℃で約１時間のインキュベーション時間が通常利用されるが、供給者の指示に従って変えることができる。消化後、その反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して、所望のフラグメントを単離する。切断したフラグメントのサイズ分離は、Ｇoeddel,Ｄら、Ｎucleic Ａcids Ｒe s.、８：４０５７（１９８０）により記載されている８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成することができる、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、または２つの相補的ポリヌクレオチド鎖を示す。そのような合成オリゴヌクレオチドは５'ホスフェートを有さないことから、キナーゼの存在下、ＡＴＰでホスフェートを加えることなしには、別のオリゴヌクレオチドにライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントにライゲートするであろう。「ライゲーション」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する過程をいう(Ｍaniatis,Ｔ.ら、同上、１４６頁)。特にことわらない限り、ライゲーションは、ライゲートさせるべきＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量の０.５μg当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に、既知の緩衝液および条件を用いて成し遂げることができる。特にことわらない限り、トランスフォーメーションは、Ｇraham,Ｆ.およびＶa n der Ｅb,Ａ.、Ｖirology、５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載されているようにして行った。実施例１インビトロにおける転写および翻訳によるＲＡＲεの発現ＴＮＴＣoupled Ｒeticulocyte Ｌysate Ｓystem(Ｐromega、２８００Ｗood s Ｈollow Ｒoad、Ｍadison、ＷＩ５３７７１−５３９９)を用いて、ＲＡＲε のインビトロにおける転写および翻訳を行った。ＲＡＲεをコードするcＤＮＡ、ＡＴＣＣ第７５７５４号をＥcoＲＩ〜ＸhoＩ方向にクローン化した。ＥcoＲＩ部位は遺伝子の５'末端を規定し、またＸhoＩ部位は遺伝子の３'末端を規定する。遺伝子をＴ３の方向で挿入した。Ｔ３は、特異的プロモーターを認識して、ＤＮＡをmＲＮＡに転写する、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼを定義する。ウサギの網状赤血球ライゼートにＴ３ＲＮＡポリメラーゼを補い、メッセージを転写するためにＴ３ＲＮＡポリメラーゼを、また新生ＲＮＡを翻訳するために網状赤血球ライゼートを利用して、Ｔ３プロモーターによりタンパク質の発現を行わせる。ＲＡＲε ＤＮＡを含む環状(または直鎖状)プラスミド１μgをＴＮＴ^TMライゼートに直接加えて、反応容積５０μl中、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼおよび[³⁵Ｓ]−メチオニンと共に、３０℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、翻訳生成物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により分離した。そのゲルを１０％酢酸、１５％メタノール中に３０分間固定した後、Ｂio−Ｒadゲル乾燥装置で１時間乾燥した。Ｋodak ＸＡＲフィルムを用いて、オートラジオグラフィーを行った。そのフィルムを増感紙に−８０℃でさらした。主要な翻訳生成物は、４９Ｋdに見ることができる(第４図)。実施例２バキュロウイルス−昆虫細胞システムにおけるＲＡＲεの発現および精製１０％ＦＢＳを補ったグレイスの昆虫培地(Ｇrace's Ｉnsect medium)(Ｇibc o)を用いての培養において、Ｓf９昆虫細胞を２７℃で維持する。バキュロウイルス伝達プラスミドpＡ２はＧentzらにより構築された(未公開結果)(第５図)。ＰＣＲを利用して、ＢamＨＩ部位が５'末端に、またＡsp ７１８部位が３'末端に含まれる完全なヒトＲＡＲε cＤＮＡを増幅した。ヒトＲＡＲεの増幅に使用したＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは：である。ヒトＲＡＲε cＤＮＡを含む増幅されたフラグメント、およびプラスミドpＡ２をＢamＨＩおよびＡsp ７１８により消化して、Ｇenecleanキットにより精製した。ヒトＲＡＲε cＤＮＡを含む増幅されたフラグメントをベクターpＡ２中に挿入して、組換え伝達ベクターpＡ２ＲＡＲεを生成した。制限エンドヌクレアーゼ、ＰＣＲおよびＤＮＡシークエンシングを利用して、その構築物の正確さを確かめた。pＡ２ＲＡＲからＡcＮＰＶゲノムへのヒトＲＡＲε cＤＮＡの伝達は、リポフェクチン(Ｇibco)を用いての同時トランスフェクションにより成し遂げることができる。ＡcＮＰＶは、Ｐharmagene(Ｓan Ｄiego、ＣＡ)から入手できる野生型ウイルスである。推定される組換えプラークの培養、同時トランスフェクション、ウイルス感染、単離、スクリーニングおよび精製、並びにウイルスタイター測定といったような、バキュロウイルスおよび昆虫細胞培養の操作に関する技術は、Ｏ'Ｒeilly Ｄ.Ｒ．ら［バキュロウイルス発現ベクター：ＡＬaboratory Ｍanual（１９９２）、Ｗ.Ｈ.Ｆreeman and Ｃompany］により記載された。プラークは、青色−白色選択を利用することにより、組換えバキュロウイルスに関してスクリーニングされるであろう。目視によりスクリーニングされたプラークは、ＰＣＲスクリーニングにより分析して確認しなくてはならない。組換えウイルスが得られたら、Ｓf９細胞(２×１０⁶細胞／ml)を、組換えＲＡＲウイルス(１０⁸プラーク形成単位／ml)を用いて、室温で２時間感染させることができる。トランスフェクション後、そのウイルス播種材料(inoculum)を新たな培地で置き換える。上清および細胞を６０−７２時間後に収集する。次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、細胞外および細胞内画分をＲＡＲεの発現に関して分析する。受容体は、連続陰イオン交換、ゲル濾過およびＤＮＡアフィニティークロマトグラフィーにより、部分的に精製することができる。実施例３ヒト組織におけるＲＡＲεの発現パターンノーザンブロット分析を行って、ヒト組織におけるＲＡＲεの発現レベルを調べた。全体の細胞ＲＮＡ試料をＲＮＡzol^TM Ｂシステム(Ｂiotecx Ｌaboratori es,Ｉnc．６０２３Ｓouth Ｌoop Ｅast、Ｈouston、ＴＸ７７０３３)で単離した。指定された各々のヒト組織から単離された総ＲＮＡ約１０μgを１％アガロースゲルで分離して、ナイロンフィルター上にブロットした(Ｓambrook、Ｆrits ch、およびＭaniatis、Ｍolecular Ｃloning、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress、（１９８９）)。Ｓtratagene Ｐrime−Ｉt キットにより、標識化反応をＤＮＡフラグメント５０ngで行った。標識化ＤＮＡをＳelect−Ｇ−５０カラム(５Ｐr ime−３Ｐrime,Ｉnc．５６０３Ａrapahoe Ｒoad、Ｂoulder、ＣＯ８０３０３ )で精製した。次いで、０.５ＭＮaＰＯ₄(pＨ７.４)および７％ＳＤＳ中、フィルターを、１,０００,０００cpm／mlの、完全な長さの放射能標識化ＲＡＲε 遺伝子と、６５℃で一晩ハイブリダイズした。０.５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて、室温で２回および６０℃で２回洗浄した後、そのフィルターを増感紙に−７０℃で一晩さらした。ＲＡＲεのメッセージＲＮＡは、精巣、胎盤、脾臓、胸腺および肺に豊富である（第３図）。先の教示から見て、本発明の多数の変更および変化が可能であることから、後記する請求の範囲内で、特に記載した以外の方法で、本発明を行うことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｈ 21/04 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 ＺＣ０７Ｋ 14/705 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/566 16/28 9358−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 9735−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＡＣ１２Ｑ 1/68 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＣＶＧ０１Ｎ 33/566 9051−4ＣＡＢＤ // Ｃ１２Ｐ 21/08 9051−4ＣＡＢＹ (72)発明者ニー，チーアンアメリカ合衆国20853メリーランド州ロックビル、マノンフィールド・ロード 5502番 (72)発明者フレイシュマン，ロバート・ディアメリカ合衆国20878メリーランド州ゲイザーズバーグ、チフリー・スクエア・ロード 470番

Claims

【特許請求の範囲】１．ＲＡＲεをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、（ａ）第１図の推定アミノ酸配列を有するＲＡＲεポリペプチド、または該ポリペプチドのフラグメント、アナログもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチド；（ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号第７５７５４号に含まれるcＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するＲＡＲεポリペプチド、または該ポリペプチドのフラグメント、アナログもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチド；よりなる群から選択されるポリヌクレオチド。２．ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。５．該ポリヌクレオチドが、第１図の推定アミノ酸配列を有するＲＡＲεをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。６．該ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ寄託番号第７５７５４号のcＤＮＡによりコードされるＲＡＲεポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。７．第１図に示すＲＡＲεのコード配列を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。８．ＡＴＣＣ寄託番号第７５７５４号として寄託されたＲＡＲεのコード配列を有する、請求項２に記載のポリヌクレオチド。９．請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。１０．請求項９に記載のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞。１１．ポリペプチドを製造するための方法であって、該ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを請求項１０に記載の宿主細胞から発現させることを含んでなる方法。１２．ポリペプチドを発現させることができる細胞を製造するための方法であって、細胞を請求項９に記載のベクターで遺伝的に操作することを含んでなる方法。１３．請求項２に記載のＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であって、ＲＡＲε活性を有するポリペプチドをコードする、単離されたＤＮＡ。１４．（ｉ）第１図の推定アミノ酸配列を有するＲＡＲεポリペプチド、並びにそのフラグメント、アナログおよび誘導体；および（ii）ＡＴＣＣ寄託番号第７５７５４号のcＤＮＡによりコードされるＲＡＲε ポリペプチド、並びに該ポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体；よりなる群から選択されるポリペプチド。１５．ポリペプチドが、第１図の推定アミノ酸配列を有するＲＡＲεである、請求項１４に記載のポリペプチド。１６．請求項１４に記載のポリペプチドに対する抗体。１７．請求項１４に記載のポリペプチドのアゴニスト。１８．請求項１４に記載のポリペプチドおよび薬学上許容され得る担体を含んでなる医薬組成物。１９．ＲＡＲε受容体の刺激が必要である患者を処置するための方法であって、治療上有効な量の、請求項１７に記載のアゴニストを患者に投与することからなる方法。２０．該アゴニストをコードするＤＮＡを患者に与えて、該アゴニストをインビボにおいて発現させることにより、治療上有効な量の該アゴニストを投与する、請求項１９に記載の方法。２１．ＲＡＲεと相互作用する化合物を同定する方法であって、ＲＡＲε遺伝子および受容体遺伝子を真核細胞中に導入し；その細胞を化合物と接触させ；およびその化合物がＲＡＲεと相互作用するかどうかを決定する；ことからなる方法。