JPH10502862A - 耐アルカリ性タンパク質吸着剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 担体周りの重合体網状組織に共有結合した親水性配位子を有し、また一般構造： −Ｘ−Ｓ−(CH₂)_n−Ｒ式中、Ｘはスペーサーアームであり、ｎは１または２の整数であり、Ｒは環構造中に少なくとも１個の窒素原子を有するπ電子に富んだ環系である、を有する、なるべくはタンパク質およびペプチドに対する、そしてまた例えばある種の金属用としても使用できる吸着剤。細菌、ウィルスおよび発熱物質を除去する濃度である１Ｍ苛性アルカリに耐えるため、本吸着剤は大規模作業で医用に再使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】 耐アルカリ性タンパク質吸着剤 本発明は、共有結合した配位子をもつ担体材料を包含する、タンパク質の分離 および固定化に供するための吸着剤、該吸着剤の製造法、および使用法に関する 。更に詳しく言えば、本発明吸着剤は耐アルカリ性であるため、ある処理工程の 間にアルカリ性溶液に曝露されることがありうるタンパク質との使用法に適して いる。 クロマトグラフ法においては、異なる塩濃度で種々な型の塩を添加することに よりタンパク質の吸着を増大させ、溶離用緩衝液から塩を除去した後でタンパク 質を吸着剤から脱着させる方法でタンパク質を精製することができ、あるいは種 種な画分に分割することができる。先行技術 現在、タンパク質の精製に対しては、タンパク質の溶離時に大きいタンパク質 損失を起こす配位子をもつタンパク質吸着剤が使われている。 １Ｍ苛性アルカリ溶液で吸着剤を洗浄した後でも、タンパク質が吸着剤上に残 留し、その特性を変化させてしまう。従って、吸着剤を再使用すると、吸着剤上 に残留するタンパク質によって他の試料混合物が汚染される危険が起こりうる。 これら吸着剤の代替品として、ＩｇＧなどの単離に対し一層特異的な吸着剤が開 発された。これら吸着剤の特徴は、タンパク質が吸着剤に共有結合されていてＩ ｇＧに特異的に結びつくことである。その欠点は共有結合されたタンパク質が遊 離しかつ漏出し、そのため医学的な問題を起こしうることである。 このような生物特異的吸着剤（それぞれタンパク質Ａおよびタンパク質Ｇ）の 代替品として、いわゆるチオフィリック(tiophilic)な吸着剤が開発された（Por ath，Belew−ＳＥ−ＰＳ ８４０５４３１−１号）。しかし、これまでに開発さ れた種類のチオフィリックな吸着剤はアルカリに安定でなく、そのため吸着剤を 大規模処理工程で再使用する場合、細菌およびウィルス感染を防止しまた発熱物 質による危険を防止する条件としての１Ｍ苛性アルカリ溶液による精製お よび洗浄を行なうと必ず望ましくない影響を受ける危険を伴う。 構造： を有する吸着剤が以前にＥＰ−Ａ−Ｏ １８０ ５６３号およびＳＥ−Ｂ−４６ ２ １６５号(Porath および Oscarsson)明細書に記載されている。この吸着剤 のもつ欠点は、これが硫黄および窒素の位置により決まる分子内の不都合な電子 密度分布のためアルカリに対して安定でないことである。 式Ｉ中のピリジルスルフィド分子内の電子密度分布を下記の式IIに示す： 分子内の電子密度分布を計算すると、炭素原子Ｃ₁がその位置に電子欠乏を有 することが示され、このことは求核的ヒドロキシル基がＣ₁位のところで反応し 、ヒドロキシピリジンの脱離を起こすことを意味する。硫黄とピリジン環との間 にメチレン基を導入することによって上記分子内のピリジン環から硫黄を移動さ せる場合には、Ｃ₁に及ぼす電子欠乏の望ましくない影響が起こらない。このこ とは実験的にも証明された。それによって吸着剤はアルカリに対して安定となり 、吸着剤と接触したタンパク質に対して高い吸着効力をもち、更にタンパク質残 渣が非常に低くなる。 本発明の目的は、１Ｍアルカリに長時間さらしても破壊されず、従って細菌、 ウイルスおよび発熱物質を効果的に除去できる吸着剤を提供することにある。 本発明の更に一つの目的は、顕著な損失を伴なわずに溶離することのできる吸 着剤を提供することである。 更に本発明は感染を見過ごす危険を起こすことなく１Ｍ苛性アルカリ溶液によ る溶離後に再使用できる吸着剤の提供を目的とする。 本発明に係る吸着剤は、１mm未満の直径をもつ微粉砕粒子あるいは１mmを越え ない厚さをもつ隔膜の形をした重合体網状組織を包含する。 本重合体網状構造は多糖類のような親水性重合体、例えば橋かけ結合したセル ロースまたはアガロース、橋かけ結合した多価（polyhydric）重合体、例えばポ リビニルアルコール、からなり、あるいは橋かけ結合したポリアクリルアミドの こともありうる。この重合体網状構造へ、一般構造： −Ｘ−Ｓ−(CH₂)_n−Ｒ 式中、Ｘはスペーサーアームであり、ｎは１または２の整数であり、Ｒは環構 造中に少なくとも１個の窒素原子（例えば、ニトロ基またはシアノ基）を有する π原子に富む環系である、 をもつ配位子を共有結合させる。 本発明に係る吸着剤は特別な吸着特性を示す。これは特にタンパク質溶液との 接触で、とりわけ高濃度のリオトロピックな塩類、例えばアルカリ金属、マグネ シウムおよびアンモニウムの硫酸塩およびリン酸塩の存在下で示され、この場合 タンパク質は吸着剤に対するそれらの優先的な親和性の比率によって異なる吸着 力をもつ種類に分類される。本発明に係る吸着剤はまた幾つかの軟金属イオン、 例えばＡｇ⁺，Ｈｇ²⁺，Ｐｄ²⁺およびＰｔ²⁺の吸着にも使用できる。 ここで本発明を吸着剤製造の例と共に更に詳細に説明することにする。例 １ ピリジル−２−メチル チオエーテル アガロース 最初に、５０ｇの洗浄６％アガロースゲル（Sepharose ６Ｂ）を蒸留水で更に 洗浄し、その後 NaBH₄ ０．３４ｇと２Ｍ NaOH ３５mlを加え、またエピクロ ロヒドリン２５mlを１滴ずつ加えることによりエポキシ活性ゲルを製造する。次 に反応を室温で約２０時間続ける。 このゲル５０ｇへ２Ｍ Na₂S₂O₃ １０mlを加え、反応を室温で１０時間続ける 。 ０．１Ｍ NaHCO₃ １００ml中ジチオ−トレイトール（ＤＴＴ）１．５ｇをゲ ル２５ｇへ加え、室温で３０分反応させることにより活性化を行なう。 活性化されたゲルをガラスフィルター上で蒸留水で洗浄してから、０．１Ｍ NaHCO₃中ピコリルクロリド（２−クロロメチル−ピリジン）２．５ｇを加え、pH を８．０に調節する。反応を室温で３時間行なう。ゲルを１Ｍ NaOH中に４０℃ で１３日間保つ前と後で窒素含量を元素分析することによりゲルの安定度試験を 行なう。 このように本発明に係るゲルは１Ｍ苛性アルカリで洗浄しても何等質低下の危 険は無いが、例えばＩｇＧの精製に以前から使われているゲルは、室温で１Ｍ苛 性アルカリによる洗浄時に既に破壊される。 洗浄の前後で本発明に係るゲルを用いるＩｇＧの精製（分別(fractionation) ）は、精製能力および特異性に関して何等有意な変化を示さなかった。 ＩｇＧの分別にゲルを再使用した際、差が認められなかった。 とりわけ下記の配位子： を有するゲルについても相応して好結果が得られた。例 ２ ピリジル−４−メチル チオエーテル アガロース 例１と同じ方法でピリジル−４−メチル チオエーテル アガロースを製造す るが、ただし２−ピコリルクロリドの代りに同量の４−ピコリルクロリド（４− クロロメチルピリジン）を使用する。例 ３ キノリン−２−メチル チオエーテル シリカ 丸底フラスコに１００mlの乾燥トルエンと２４ｇのシリカとを加え、次に乾燥 トリエチルアミン３mlを加え、続いてｇ−グリシドキシプロピル−トリメトキシ シラン３０mlを加えた。混合物を３時間還流した後、ガラスフィルター上でトル エンにより洗浄し、１０mlの２Ｍ Na₂S₂O₃で室温において１０時間活性化する 。この洗浄したゲルへ、０．１Ｍ NaHCO₃に溶解したジチオエリトリトール１ｇ を加え、pHを７．５に調節する。３０分反応後、ゲルをガラスフィルター上蒸留 水で、続いてトルエンで洗浄する。トルエン洗浄したこのシリケートゲルへトル エンに溶解した２ｇのキノリン−２−メチルクロリドを加え、６０℃で６時間反 応させた後、ゲルをガラスフィルター上でトルエンにより洗浄する。例 ４ イミダゾリルエチル チオエーテル アガロース 例１と同じ方法で調製するが、ただし２−ピコリルクロリドの代りに同量のビ ニルイミダゾールを使用する。例 ５ ウラシリル−６−メチル チオエーテル アガロース 例１と同じ方法で調製するが、ただし２−ピコリルクロリドの代りに６−クロ ロメチルウラシルを使用する。本発明に係るゲルの使用法 クロマトグラフ法においては、種々なタイプの塩を異なる塩濃度で添加するこ とにより、タンパク質の吸着が増強される。溶離緩衝液から塩を除くとタンパク 質が脱着される。 最適条件下で本発明吸着剤は、塩を含まない緩衝液による脱着後に、適用され た全タンパク質の２．７％の残留を示した。 相当するコマーシャル製剤、オクチル−セファロースおよびフェニル−セファ ロースは、塩を含まない緩衝液による脱着後で、最適条件下で、適用された全タ ンパク質のそれぞれ２９．３および８．１重量％の残留を示した。残留タンパク 質の全パーセントが相応に大きい損失となるので、残留量を全く減少させること が経済的に非常に重要である。 上記のように、残留タンパク質および吸着剤の両者共、感染源、例えばウィル ス、細菌、発熱物質、をもつことがあるが、それらは１Ｍ苛性アルカリでの洗浄 により効果的に無害化される。１Ｍ苛性ソーダを用いた洗浄後に吸着剤上に残留 するタンパク質の全量をアミノ酸分析により定量し、相当に温和な処理、即ち安 全な再使用には不十分な処理、の後の現在使用されている吸着剤の値と比較した 。前記の表から明白なように、４０℃で１３昼夜処理したとき、本発明に係る吸 着剤についての窒素値が１．４重量％に保たれたのに対し、硫黄がピリジン核に 直接結合したピリジンチオエーテル型吸着剤においては、冷苛性アルカリによる 短時間の洗浄後で既に窒素値が１．４重量％から０．５重量％に減少した。 本発明に係るゲルの特性の高揚した理由は、配位子内の電子分布に及ぼす窒素 原子および硫黄の効果によるものと想定される。配位子内のこれら原子の配置が 不都合であると、とりわけ炭素原子上の電子欠乏が、電子の欠乏した炭素原子に 対するヒドロキシル基（アルカリ溶液からの）の求核攻撃を可能ならしめる。こ のことは配位子の不安定化を意味する。本発明に係る吸着剤について、また現在 使用されている相応のコマーシャル製剤についての電子分布の研究を行なってこ の想定を確証した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年７月１６日 【補正内容】 請求の範囲 １．共有結合した配位子をもつ担体材料を包含し、生物重合体、例えばタンパ ク質、ペプチドなどの分離および固定化に供される耐アルカリ水溶液性吸着剤に おいて、担体材料が重合体網状組織で完全にあるいは部分的に浸透されているか または表面被覆されている固体相からなり、そして配位子は構造： Ｘ−Ｓ−(CH₂)_n−Ｒ 式中、Ｘはスペーサーアームであり、ｎは１または２であり、Ｒは環構造中に 少なくとも１個の窒素原子をもつπ電子に富んだ環系である、を有し、この構造 によって、Ｓ−原子と環系中で結合したＣ−原子との間の少なくとも１個のCH₂ 基の導入が該Ｃ−原子の結合位置におけるアルカリに敏感な電子欠乏を取り除く ようにした上記吸着剤。 ２．固体相は１mm未満の直径をもつ粒子あるいは１mmを越えない厚さをもつ隔 膜からなる、請求項１記載の吸着剤。 ３．重合体網状組織はポリヒドロキシ重合体である、請求項１または請求項２ のいずれか１項に記載の吸着剤。 ４．ポリヒドロキシ重合体は、ポリガラクタン、例えば寒天またはアガロース である、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の吸着剤。 ５．重合体網状組織は、ポリアミド、例えば橋かけ結合したポリアクリルアミ ドまたはその誘導体からなる、請求項１または請求項２記載の吸着剤。 ６．固体相は、親水性重合体成分を結合させるか、含有するか、あるいは表面 被覆した無機重合体、例えばシリカあるいは誘導体からなる、請求項１から請求 項５のいずれか１項に記載の吸着剤。 ７．固体相は、親水性重合体成分を結合させるか、含有するか、あるいは表面 被覆した疎水性有機重合体からなる、請求項１から請求項５のいずれか１項に記 載の吸着剤。 ８．Ｒは 式中、ＺはＮまたはCHである、 からなる、請求項１ら請求項７のいずれか１項に記載の吸着剤。 ９．配位子は、ピコリルチオエーテル基を含む、あるいは該基からなる、請求 項１から請求項８のいずれか１項に記載の吸着剤。 10．スペーサーアームは、構造−CH₂−CHOH−CH₂−を含む、請求項１から請求 項９のいずれか１項に記載の吸着剤。 11．吸着剤は、４０℃の１Ｍ NaOHに対して少なくとも１３日間耐える、請求 項１から請求項１０のいずれか１項に記載の吸着剤。 12．最初に重合体網状組織中にチオール基を導入し、次に求電子性の側鎖をも つ複素芳香族基を導入する、前記請求項１から１１に記載の吸着剤の製造法。 13．複素芳香族基は、構造−(CH₂)_n−Ｙ、 式中、Ｙはハロゲン、例えばクロロ、であり、ｎは１または２である、をもつ 側鎖置換基を有する、請求項１１記載の吸着剤の製造法。 14．複素芳香族基に付く求電子性側鎖は、ビニル置換基からなる、請求項１１ 記載の方法。 15．請求項１から請求項１１に記載の吸着剤を生物重合体、例えばタンパク質 、ペプチドおよび核酸、の分別に使用する方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．共有結合した配位子を有する担体材料を包含し、生物重合体、例えばタン パク質、ペプチド、などの分離および固定化に供される吸着剤において、担体材 料が、重合体網状組織で完全にあるいは部分的に浸透されているかまたは表面被 覆されている固体相からなり、そして配位子は構造： Ｘ−Ｓ−(CH₂)_n−Ｒ 式中、Ｘはスペーサーアームであり、ｎは１または２であり、Ｒは環構造中に 少なくとも１個の窒素原子を含むπ電子に富んだ環系である、 を有する上記吸着剤。 ２．固体相は、１mm未満の直径をもつ粒子あるいは１mmを越えない厚さをもつ 隔膜からなる、請求項１記載の吸着剤。 ３．重合体網状組織は、ポリヒドロキシ重合体である、請求項１または請求項 ２のいずれか１項に記載の吸着剤。 ４．ポリヒドロキシ重合体は、ポリガラクタン、例えば寒天あるいはアガロー スである、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の吸着剤。 ５．重合体網状組織は、ポリアミド、例えば橋かけ結合したポリアクリルアミ ドまたはその誘導体からなる、請求項１または請求項２記載の吸着剤。 ６．固体相は、親水性重合体成分を結合させるか、含有するか、あるいは表面 被覆した無機重合体、例えばシリカあるいは誘導体からなる、請求項１から請求 項５のいずれか１項に記載の吸着剤。 ７．固体相は、親水性重合体成分を結合させるか、含有するかあるいは表面被 覆した疎水性有機重合体、例えばポリスチレン、からなる、請求項１から請求項 ５のいずれか１項に記載の吸着剤。 ８．Ｒは 式中、ＺはＮまたはCHである、 からなる、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の吸着剤。 ９．配位子は、ピコリルチオエーテル基を含む、あるいは該基からなる、請求 項１から請求項８のいずれか１項に記載の吸着剤。 10．スペーサーアームは、構造−CH₂−CHOH−CH₂−を含む、請求項１から請求 項９のいずれか１項に記載の吸着剤。 11．最初チオール基を重合体網状組織中に導入し、次に求電子性側鎖をもつ複 素芳香族基を導入する、前記請求項１から１０に記載の吸着剤の製造法。 12．複素芳香族基は、構造−(CH₂)_n−Ｙ、 式中、Ｙはハロゲン、例えばクロロであり、ｎは１または２である、をもつ側 鎖置換基を有する、請求項１１記載の吸着剤の製造法。 13．複素芳香族基に付いた求電子性側鎖はビニル置換基からなる、請求項１１ 記載の方法。 14．生物重合体、例えばタンパク質、ペプチドおよび核酸、の分別に請求項１ から請求項１１に記載の吸着剤を使用する方法。