JPH10504640A - ヘモグロビン前進性グルコシル化終末産物の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、糖尿病及び老化の過程のような前進性グリコシル化終末産物（ＡＧＥ）形成と関連のある疾患及び障害を診断及び監視する方法に関する。特に、本発明は、そのためのＡＧＥ修飾ヘモグロビン（Ｈｂ−ＡＧＥ）の検出及び改良された分析に関する。本方法は、試料を、試薬とヘモグロビン−ＡＧＥとの結合に妨害することなくヘモグロビン−ＡＧＥを変性するのに十分な濃度でアニオンタンパク質変性剤を含む希釈バッファーで希釈することを含む。該希釈バッファーは、ヘモグロビン−ＡＧＥの検出を容易にするのに十分な濃度の非イオン界面活性剤；及び試薬のヘモグロビン−ＡＧＥへの結合を変性することなくヘモグロビン−ＡＧＥを変性しかつ分析感受性を高めるのに十分な濃度の変性剤を含めることもできる。試料を該希釈バッファーで希釈した後、試料を試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出するための手段と接触させ、試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの存在をその検出手段で検出する。本発明を実施するための希釈バッファー及びキットも提供される。個々の例においては、ヒト及びラット正常被検者及び糖尿病被検者からの試料中のヘモグロビン中のＡＧＥレベルが検出される。ヒト試料から得られた結果から、試料中のヘモグロビン−ＡＧＥのレベルと試料中のヘモグロビン−Ａ_1Cのレベル間に高い程度の相関が示される。最も重要なことには、本発明は、ＡＧＥ−阻害剤のアミノグアニジンで治療を行っている被検者からの試料中のヘモグロビン−ＡＧＥのレベルが低下する“アミノグアニジン効果”を検出するために用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘモグロビン前進性グルコシル化終末産物の検出方法 発明の分野 本発明は、前進性グルコシル化終末産物（ＡＧＥ）形成と関連のある疾患及び 障害の診断及び監視方法に関する。従って、本発明は、糖尿病及び老化現象過程 の診断及び監視に関する。特に、本発明は、そのためのＡＧＥ修飾ヘモグロビン （Ｈｂ−ＡＧＥ）の検出及び改良された分析に関する。 発明の背景 グルコースとタンパク質間の反応は、以前から既知であった。その初期の発現 は、食品の調理中の褐色色素の外観であった。1912年に、Maillardは、グルコー ス又は他の還元糖がアミノ酸と反応して付加物を形成し、これが一連の脱水と転 位を行って安定な褐色色素を形成することを見出した(Maillard，1912，C.R．Ac ad．Sci．154:66-68)。 従って、アマドリ産物として既知の安定なアミノ,1−デオキシケトシル付加物 を形成するグルコースとタンパク質の遊離アミノ基との間の非酵素的反応は、ヘ モグロビンと起こることが示されており、グルコースとヘモグロビンのβ鎖のア ミノ末端との反応がヘモグロビンＡ_1cとして既知の付加物を形成する。この反応 は、また、水晶体クリスタリン、コラーゲン及び神経タンパク質のような他の種 々の体内タンパク質と起こることも見出された（Bunnら，1975，Biochem．Bioph ys．Res．Commun．67:103-109; Koenigら，1975，J．Biol．Chem．252:2992-299 7; Monnier & Cerami,食物及び栄養物におけるメイラード反応，ed．Waller，G. A.，American Chemical Society 1983，pp．431-448; Monnier & Cerami，1982 ，内分泌と代謝の臨床 11:431-452参照）。 更に、後期段階のメイラード産物と同様のスペクトル及び蛍光特性を有する褐 色色素もまた老齢個体からの水晶体タンパク質及びコラーゲンのようないくつか の長命のタンパク質に付随して生体内に見出された。色素の加齢と関係した直線 的な増加は、２０〜９０歳の年齢の間のヒト硬膜コラーゲンに見出された （Monnier & Cerami，1981，Science 211:491-493; Monnier & Cerami，1983，B iochem．Biophys．Acta 760:97-103; Monnierら，1984，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 81:583-587 参照）。 グルコースと他の還元糖は、濃度依存方式でタンパク質のアミノ基に非酵素的 に結合する。時間が経つにつれて、これらの初期のアマドリ付加物は、他のタン パク質と更に転位、脱水及び架橋することができ、前進性グリコシル化終末産物 （ＡＧＥ）と呼ばれる複合構造ファミリーを蓄積する。前進性グリコシル化終末 産物の役割と臨床上の意味の解明に対してかなり進歩したので、これまでは老化 の過程や糖尿病のような疾患の病理学的作用によった症状の多くがいまでは生体 内でのＡＧＥの形成に少なくとも部分的に起因することが認められている。 ＡＧＥ蓄積は、タンパク質半減期、糖濃度又はその双方を示すことができる。 これらの因子は、重要な結果を有する。多数の実験により、ＡＧＥが老化現象及 び慢性疾患中に生じる構造上及び機能上の変化に重要な役割を果たすことが示さ れた。更に、前進性グリコシル化終末産物は、正常組織より糖尿病及び他の疾患 組織において急速に形成することが指摘されている。 Ｈｂ−ＡＧＥは、老化現象又は長期にわたる疾病の進行を予測することが判明 した(Bucalaによる1993年７月８日に公開された国際特許第WO93/13421号公報；M akitaら，1992，Science 258:651-653)。Ｈｂ−ＡＧＥ測定は、ＡＧＥによる長 期組織修飾の適切な指数を与えかつ種々の糖尿病及び加齢と関係した合併症に対 する前進性グリコシル化の寄与を評価するのに有効である。ヘモグロビンＡ_1c（ ＨｂＡ_1c）はヘモグロビンβ鎖のグリケーションの程度を予測するとして報告さ れたが、ＨｂＡ_1cは単に前進性グリコシル化経路の可逆的中間体であり、他の多 くの中間体も存在すると思われる。Ｈｂ−ＡＧＥは、不可逆的付加物として、疾 病の進行、薬剤の有効性等の優れた尺度である。 Ｈｂ−ＡＧＥは、疾病の進行と血糖レベルの長期制御の相互関係を容易に示す ために用いられる。ＨｂＡ_1cは、可逆的中間体であり、３〜４週間かかってグル コースと平衡に達する。従って、ＨｂＡ_1cのレベルは、この短期間中でのみ血液 グルコースを反映するだけである。対照的に、Ｈｂ−ＡＧＥは、不可逆的付加物 であり、ヘモグロビンの寿命にわたって血糖を反映する。即ち、ＡＧＥ関連疾患 又は障害の治療の有効性も試料中のＨｂ−ＡＧＥのレベルから求められる。従っ て、アミノグアニジン治療の結果としてのＨｂ−ＡＧＥレベルの低下は、ヒト被 検者において成功した前進性グリコシル化の薬理学的抑制の主な例である。 本発明の以前には、Ｈｂ−ＡＧＥの検出には複雑な分析方式が必要であり、ヘ モグロビンを溶血物からＴＣＡ沈殿し、次いで遠心分離して沈殿したタンパク質 を上清液画分から分離することが含まれた。沈殿の溶解は、高ｐＨ（ｐＨ＞１１ ）の水酸化ナトリウムを加え、次いで０.３M ＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７.４バッファー でｐＨを調整することにより達成された(Makitaら，1991，Diabetorogia 34:40- 45)。ｐＨを約７.８に調整した後に、ヘモグロビンが溶液から沈殿することがあ るので、液体画分の分析前に分離工程が必要である。要するに、現在のプロトコ ール複合体は、扱いにくく、時間を要し、臨床実験の設定を受けやすく、たいて いは適用できない。 従って、当該技術において、臨床実験の設定でのＨｂ−ＡＧＥの試験を容易に するために簡便で高速で緩和な試料処理プロトコールが求められている。 更に、当該技術において、かかる分析を行うのに必要な試薬を含むキットが求 められている。 本明細書における文献の引用は、本発明に対して従来の技術であることを認め るものとして解釈されるべきではない。 発明の要約 本発明は、一般的には、試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出する方法 に関する。本方法は、該試料を、試薬とヘモグロビン−ＡＧＥとの結合に妨害す ることなくヘモグロビン−ＡＧＥを変性するのに十分な濃度のアニオンタンパク 質変性清浄剤を含む希釈バッファーで希釈することを含む。好ましくは、該希釈 バッファーは、更に、ヘモグロビン−ＡＧＥの検出を容易にするのに十分な濃度 の非イオン界面活性剤；及び試薬のヘモグロビン−ＡＧＥへの結合を変性するこ となくヘモグロビン−ＡＧＥを変性しかつ分析感受性を高めるのに十分な濃度の 極性変性剤を含む。該試料を該希釈バッファーで希釈した後、該試料を該試料中 のヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出するための手段と接触させ、該試料中のヘ モグロビン−ＡＧＥの存在をその検出手段で検出する。該試料は、希釈後直接分 析される。 個々の態様においては、希釈バッファー中のアニオンタンパク質変性清浄剤の 濃度は、約０.０４〜約０.１６％(w/v)の範囲である。非イオン界面活性剤が存 在する場合には、その濃度は約０.００５〜約０.１％(w/v)の範囲であり、変性 剤が存在する場合には、その濃度は約０.５〜約３M である。 個々の好適実施態様においては、アニオンタンパク質変性清浄剤はドデシル硫 酸ナトリウムである。更に個々の好適実施態様においては、非イオン界面活性剤 はポリオキシエチレンエステル、特に、トリトン X-100ポリオキシエチレンエス テルであり、変性剤は尿素である。 本発明を実施するために本発明者によって企図された最良の方法は、希釈バッ ファーを用い、ドデシル硫酸ナトリウムの濃度は約０.０８％であり、トリトン X-100ポリオキシエチレンエステルの濃度は約０.０１％及び約０.０４％からな る群より選ばれ、尿素の濃度は約２M である。 好ましくは、希釈バッファーは、ｐＨ約７〜約８に緩衝され、生理的イオン強 度に近似する濃度で塩を含有する。 更に実施態様においては、本発明は、試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの量を定 量する方法を提供する。定量は、上記のように試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの 存在を検出することにより達成される。結合パートナーのヘモグロビン−ＡＧＥ への結合の程度又はヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出する他の手段が定量され る。検出の程度は、試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの量に相当する。 本発明は、更に、試料中の検出されたヘモグロビン−ＡＧＥの量又はレベルを 哺乳動物被検者に正常に存在するヘモグロビン−ＡＧＥのレベルと比較すること により、哺乳動物被検者において高ヘモグロビン−ＡＧＥレベルと関連のある疾 患の存在を検出又は診断する方法を提供する。正常レベルと比べたヘモグロビン −ＡＧＥのレベルの上昇は、高レベルのヘモグロビン−ＡＧＥと関連のある疾患 を示す。 他の態様においては、本発明は、哺乳動物被検者において高ヘモグロビン−Ａ ＧＥレベルと関係のある疾患の過程を監視する方法を提供する。哺乳動物被検者 から異なる時点に得られた一連の試料中のヘモグロビン−ＡＧＥのレベル又は 量を上記のように求める。ヘモグロビン−ＡＧＥのレベルの経時上昇は疾患の進 行を示し、ヘモグロビン−ＡＧＥのレベルの経時低下は疾患の退行を示す。 また、別の態様においては、本発明は、哺乳動物被検者において高ヘモグロビ ン−ＡＧＥレベルと関連のある疾患の治療法を監視する方法を提供する。高ヘモ グロビン−ＡＧＥレベルと関連のある疾患の治療法を行っている哺乳動物被検者 から異なる時点に得られた試料中のヘモグロビン−ＡＧＥのレベル又は量が求め られる。ＡＧＥのレベルの経時低下は、効果的な治療成果を示す。 特に、本発明は、最適量を求めるためにＡＧＥ形成阻害剤の用量を力価測定す る好ましい方法を提供する。時間が経つにつれてＡＧＥ形成阻害剤の漸増量を投 与している哺乳動物被検者から異なる時点に得られた一連の試料中のヘモグロビ ン−ＡＧＥのレベル又は量が評価される。該阻害剤の最適量は、ヘモグロビン− ＡＧＥのレベルの低下が更に認められない量より多い量である。 また、別の態様においては、本発明は、哺乳動物被検者において長期グルコー スレベルを監視する方法を提供する。哺乳動物被検者からの試料中のヘモグロビ ン−ＡＧＥのレベル又は量が求められる。ヘモグロビン−ＡＧＥのレベル又は量 は、被検者における長期グルコースレベルを示す。 本発明の方法は、試料を本発明の希釈バッファーで希釈することにより達成さ れる。従って、本発明は、更に、希釈バッファーを提供する。本発明の希釈バッ ファーは、アニオンタンパク質変性清浄剤；非イオン界面活性剤；及び極性変性 剤を含む。これらの試薬は、アニオンタンパク質変性清浄剤が試薬とヘモグロビ ン−ＡＧＥとの結合に妨害することなくヘモグロビン−ＡＧＥを変性するのに十 分な濃度で存在し；非イオン界面活性剤がヘモグロビン−ＡＧＥの検出を容易に するのに十分な濃度で存在し；変性剤が試薬のヘモグロビン−ＡＧＥへの結合を 変性することなくヘモグロビン−ＡＧＥを変性しかつ分析感受性を高めるのに十 分な濃度で存在するように希釈するための濃縮物で提供される。好ましくは、希 釈バッファーは、希釈バッファー中のアニオンタンパク質変性清浄剤の濃度が約 ０.０４〜０.１６％(w/v)の範囲であり；非イオン界面活性剤の濃度が約０.００ ５〜約０.１％(w/v)の範囲であり；変性剤の濃度が約０.５〜３M であるように 調製される。別の好適態様においては、アニオンタンパク質変性清浄剤はドデシ ル硫 酸ナトリウムであり、非イオン界面活性剤はトリトン X-100ポリオキシエチレン エステルであり、変性剤は尿素である。本発明を実施するのに本発明者らによっ て企図された最良の方法である本発明の最適態様においては、ドデシル硫酸ナト リウムの濃度は約０.０８％であり、トリトン X-100ポリオキシエチレンエステ ルの濃度は約０.０１％及び約０.０４％からなる群より選ばれ、尿素の濃度は約 ２M である。 別の実施態様においては、希釈バッファーはｐＨ約７〜約８に緩衝され、生理 的イオン強度に近似する濃度で塩を含有する。 別の態様においては、本発明は、試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出 するキットに関する。本発明のキットは、濃縮した形又はすぐに使用できる形の 上記のような希釈バッファー；ヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出するための手 段；他の試薬；及び前記キットの使用説明書を含む。 下記の実施例においては、本発明は、正常な被検者及び糖尿病被検者からの試 料中のヘモグロビン中のＡＧＥのレベルの検出を提供する。ヒト及びラット両者 からの試料が、本発明の方法を用いて成功して試験された。更に、ヒト試料から 得られた結果から、試料中のヘモグロビン−ＡＧＥのレベルと試料中のヘモグロ ビン−Ａ_1Cのレベル間に高い程度の相関が示される。最も重要なことには、本発 明の分析は、ＡＧＥ−阻害剤のアミノグアニジンを用いて治療を行っている被検 者からの試料中のヘモグロビン−ＡＧＥのレベルが低下する“アミノグアニジン 効果”を検出するために用いられる。この効果は、アミノグアニジン又は他のＡ ＧＥの阻害剤がヘモグロビン−Ａ_1Cレベルに影響しないので、ヘモグロビン−Ａ_1C レベルを測定することにより検出することができない。いわゆる“アミノグア ニジン効果”は、他のＡＧＥ−阻害剤にも同様にあてはまる。 従って、本発明は、有利には、前進性グリコシル化終末産物形成を防止する治 療の効能及びＡＧＥ関連疾患又は障害の診断に感受性のある試験を監視すること を提供する。 従って、本発明の目的は、ヘモグロビン−ＡＧＥの改良された分析を提供する ことである。 更に、本発明の目的は、ヘモグロビン−ＡＧＥの分析の速度、容易さ及び簡便 さを高める希釈バッファーを提供することである。 本発明の他の目的は、ヘモグロビン−ＡＧＥの免疫検出を高めるバッファーを 提供することである。 本発明の別の目的は、試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出するための キットを提供することである。 本発明のこれらの及び他の目的は、本発明の下記の図面及び詳細な説明によっ て取り組まれ、更によく理解されるであろう。 図面の簡単な説明 図１は、ヘモグロビンのＡＧＥ修飾のレベルを示すグラフである。試料を、試 料希釈液中０.０８％ＳＤＳ、０.０４％又は０.０１％トリトン X-100及び２M 尿素で前処理した後、抗体ＥＬＩＳＡ分析でＡＧＥ修飾のレベルを試験した。デ ータは、糖尿病及び正常被検者からの試料中のヘモグロビン１mgあたりのＡＧＥ の単位±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として報告される。ＡＧＥの量は以前に開 発されたＥＬＩＳＡ分析を用いて求め(Makitaら，1992，J．Biol．Chem．267:51 33-38; 国際特許第WO93/13421号公報);タンパク質の濃度（大部分ヘモグロビン からなる）は標準として精製ウシ血清アルブミンを用いるローリー試薬で求めた (Lowryら，1951，J．Biol．Chem．193:265)。（Ａ）試料を、１１の正常ヒト及 び１１の糖尿病ヒトから得た。正常試料のヘモグロビンＡ_1Cレベルは４.９±０. ５２であり、糖尿病試料は８.３±１.４９であった。０.０４％トリトン濃度を 用いてヒト試料を前処理した。（Ｂ）試料を、１０の正常ラット及び１０の糖尿 病ラットから得た。ラットにおいてストレプトゾシンで処理することにより糖尿 病を誘導し、血液グルコースを分析することにより高血糖症を確認した。 図２は、ヘモグロビンＡ_1Cのレベル（全ヘモグロビン％）に対する本発明のヘ モグロビン−ＡＧＥ（ヘモグロビン１mgあたりのＡＧＥの単位）の測定間の相関 を証明するデータを示すグラフである。相関は、２２のヒト試料で行った（図１ Ａに示したものと同じ試料）。 図３は、ヘモグロビン作用を検出する本分析の感受性を証明するデータを示す グラフである。ＡＧＥ−ヘモグロビンのレベル（ヘモグロビン１mgあたりのＡＧ Ｅの単位）は、本発明の試料を前処理した後に測定した。試料を、正常ラッ ト、誘導糖尿病ラット及び５０ mg/kgのアミノグアニジンを投与した糖尿病ラッ トから得た。各試料グループは１０匹で構成された。Ｈｂ−ＡＧＥのレベルの統 計的に有意な差が、正常ラットと糖尿病ラット間（ｐ＜０.０１）及びアミノグ アニジン処理ラットと糖尿病ラット間（ｐ＜０.０５）に認められた。 発明の詳細な説明 本発明は、ヘモグロビン−ＡＧＥの改良された分析に関する。特に、本発明は 、ドデシル硫酸ナトリウムのようなアニオンタンパク質変性清浄剤を含む希釈バ ッファーを開示する。好ましくは、該希釈バッファーは、更に、トリトン X-100 のようなポリオキシエチレンエステルのような非イオン界面活性剤及び尿素のよ うな極性変性剤を含む。その希釈バッファーで溶血物を希釈すると、ヘモグロビ ン−ＡＧＥの分析の簡便さ及び速度が著しく高められる。 本明細書で用いられる“ＡＧＥ−”という語は、前進性グリコシル化終末産物 或いはＡＧＥを形成する化合物とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなそのよ うに修飾される化合物の反応生成物として修飾する化合物を意味する。即ち、Ａ ＧＥとしては、ＡＧＥ−タンパク質（ＢＳＡ−ＡＧＥのような）、ＡＧＥ−脂質 、ＡＧＥ−ペプチド及びＡＧＥ−ＤＮＡが挙げられるがこれらに限定されない。 ＡＧＥポリペプチド又はＡＧＥタンパク質は、ポリペプチド又はタンパク質とＡ ＧＥ−ペプチドのようなＡＧＥと又は還元糖のような化合物、例えば、グルコー スとをそのポリペプチド又はタンパク質が修飾されてＡＧＥ−ポリペプチド又は タンパク質を形成するまで反応させることにより試験管内又は生体内で形成され る。 本明細書で用いられる“グルコシル化”という語は、ＡＧＥの形成をもたらす 還元糖とヘモグロビン、脂質又はＤＮＡのようなポリペプチド又はタンパク質の 求核基、特にアミン基との非酵素的反応を意味する。これらのプロセスは、上記 のように当該技術において周知である。最近、好まれてきた“グリケーション” という語は、非酵素的グリコシル化プロセスを意味する。即ち、本明細書で特に 定義された“グルコシル化”という語と“グリケーション”は等価である。 上述したように、本発明によれば、被検者からの赤血球又はヘモグロビンを含 む試料は、希釈バッファー、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、トリトン X-100 及び尿素を含むバッファーで希釈することにより処理される。試料は、赤血球を 溶血するために処理された血液又は血液から単離された赤血球とすることができ る。また、試料は、赤血球から単離されたヘモグロビンとすることができる。 特定の理論又は仮説によって制限されるものではないが、ヘモグロビンの適度 の変性は更に抗体結合に対するＡＧＥエピトープを露出するので、非処理試料に 比べてＨｂ−ＡＧＥの免疫分析の感受性を著しく高めると考えられる。 本発明によれば、試料は、試験管内又は生体内原料を含む原料から得られる。 特に、本発明は、動物、好ましくはヒトを含む哺乳動物及びイヌ、ウマ、ウシ、 ブタ、モルモット、マウス及びラットのような哺乳動物からの試料についての分 析を企図する。即ち、本発明は、ヒト及び動物薬における老化レベルを監視する ことを提供する。 希釈バッファー中ＳＤＳのようなアニオンタンパク質変性清浄剤の濃度は、免 疫学的結合に妨害することなく又は固相免疫分析において固相試薬の脱離又は溶 離をひき起こすことなくヘモグロビン−ＡＧＥを変性するのに十分な濃度である 。従って、アニオンタンパク質変性清浄剤の濃度は、約０.０４〜約０.１６％(w /v)の範囲とすることができるが、検出分析、例えば、抗体結合の安定性に左右 される。アニオンタンパク質変性清浄剤はＳＤＳであり、ＳＤＳの濃度は約０. ０８％であることが好ましい。 ＳＤＳのほかに、本発明は、更に、タンパク質と相互作用し効果的に変性する 類似の清浄剤の使用を企図する。ＳＤＳは、最も有効なタンパク質変性清浄剤で あることが判明したが、他のかかる清浄剤もタンパク質を変性するのにＳＤＳよ り効果が小さいが本発明に従って用いられる。明らかな選択としては、Ｃ₈〜Ｃ_{2 0} 炭化水素アシル硫酸塩、即ち、ＳＤＳ類縁体が含まれる。異なるアニオンタン パク質変性の置換には、端的な実験だけを必要とする最適濃度を求める再試験が 必要である。 トリトン X-100のような非イオン界面活性剤が存在する場合には希釈バッファ ー中の濃度は、試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの検出を容易にするのに十分な濃 度である。非イオン清浄剤は、部分的にはアニオン清浄剤の苛酷な作用を緩衝す るために作用するものである。個々の実施態様においては、非イオン界面活性剤 は、ポリオキシエチレンエステルトリトン X-100であり、トリトン X-100の濃度 は、約０.００５〜約０.１％(w/v)の範囲である。本発明の好適態様においては 、トリトン X-100の濃度は、ラットからの試料に対して約０.０１％、ヒトから の試料に対して０.０４％である。他の動物からの試料、種々のＡＧＥ特異抗体 及びアニオン清浄剤の種類に対する最適濃度は、標準実験法を用いて容易に求め ることができる。 本発明は、更に、トリトン X-100の代わりに類似の非イオン界面活性剤の使用 を企図する。トリトン X-100が置換されるべき非イオン界面活性剤は、最適濃度 を求めるために試験される。かかる試験は、端的な実験を必要とする。 極性変性剤の希釈バッファー中の濃度は、Ｈｂ−ＡＧＥを変性するか又は変性 した状態の清浄剤変性Ｈｂ−ＡＧＥを安定化及び維持しかつ試料中のＨｂ−ＡＧ Ｅの存在を検出するために用いた免疫学的試薬を変性することなく分析感受性を 高めるのに十分な濃度である。個々の態様においては、変性剤は約０.５〜約３M の濃度の尿素である。尿素の濃度は、２M であることが好ましい。更に、本発 明は、尿素の代わりに適切な濃度のグアニジン−ＨＣｌのような他の極性変性試 薬の使用を企図する。 好ましくは、希釈バッファーはｐＨ緩衝され、イオン強度は制御される。例え ば、希釈バッファーは、生理的濃度の塩化ナトリウム又は他の塩及びｐＨ約５〜 約９の希釈溶液のｐＨを維持する緩衝液を含むことができる。緩衝液のｐＨは、 好ましくはｐＨ約７〜約８、更に好ましくはｐＨ約７.４である。下記の個々の 実施態様においては、希釈バッファーは、塩化ナトリウムを含むリン酸ナトリウ ム緩衝化溶液である。カリウムイオンはＳＤＳの沈殿を誘起することができるの で、希釈バッファー中にカリウム塩を使用することは好ましくない。他の適切な 緩衝塩は、トリス−ＨＣｌである。 ヘモグロビンを含む試料は、希釈バッファーで約１０〜１００倍に希釈された 後にＨｂ−ＡＧＥを検出するために免疫分析が行われる。また、該試料は、タン パク質濃度（タンパク質のほとんどがヘモグロビンである）が約０.１〜約１０m g/ml の範囲とするように希釈される。下記の個々の実施態様においては、溶血 物試料は、本発明の希釈バッファーで４０倍に希釈された後に免疫分析が行われ る。下記の実施態様においては、タンパク質の試料中の濃度は、タンパク質標準 としてＢＳＡを用いてローリー分析で求めたように約１〜２ mg/mlである(Lowry ら，1951，J．Biol．Chem．193:265)。 本発明は、ヘモグロビン−ＡＧＥに存在するＡＧＥ−エピトープの接触性を高 めることにより、ヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出しその量を測定するために 用いられる免疫分析又は免疫分析型方式の多くを増強することができる。本明細 書で用いられるヘモグロビン−ＡＧＥを“検出するための手段”及び“定量する ための手段”という語は、かかる免疫分析型方式におけるヘモグロビン−ＡＧＥ の検出又は定量を意味する。一般に、かかる手段は、試料と１種以上のヘモグロ ビン−ＡＧＥの結合パートナーとを接触させる工程、次いでその１種以上の結合 パートナーの該試料中のヘモグロビン−ＡＧＥへの結合を検出する工程、及び所 望される場合には存在する結合を定量する（量を測定する）工程を含む。結合パ ートナーとしては、ヘモグロビンに対する抗体、ＡＧＥに対する抗体、ＡＧＥの レセプター、ヘモグロビン或いはＡＧＥを結合する小分子等が含まれるがこれら に限定されない。少なくとも１種のかかる結合パートナーは、ＡＧＥに特異的で なければならない。ヘモグロビン−ＡＧＥの結合パートナーと試料中のＨｂ−Ａ ＧＥとの特異結合の検出は、試料中のＨｂ−ＡＧＥの存在を示す。 従って、ヘモグロビンを含む試料が本発明の希釈バッファーで希釈されると、 Ｈｂ−ＡＧＥの存在は、免疫学的分析手段の多くの方式を用いて、例えば、放射 線免疫検定法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、“サンドイッチ”免疫 検定法（特にＥＬＩＳＡ分析）、競合アッセイ（競合的ＥＬＩＳＡ分析）、免疫 放射線検定法、沈降反応、免疫蛍光分析、プロテインＡ分析等のこれらに限定さ れない周知の手法を用いて求められる。１実施態様においては、一次抗体につい ての標識を検出することにより、抗体結合が検出される。他の実施態様において は、二次抗体又は試薬の一次抗体への結合を検出することにより、一次抗体が検 出される。別の実施態様においては、二次抗体が標識される。 個々の実施態様においては、サンドイッチ分析方式が用いられ、抗ＡＧＥ抗体 が固相に結合され、抗ヘモグロビン抗体（直接標識されるか或いは二次標識抗体 で検出される）がＨｂ−ＡＧＥと抗ＡＧＥ抗体の結合を検出するために用いられ る。他の実施態様においては、抗ヘモグロビン抗体が固相に結合され、抗ＡＧＥ 抗体が抗ヘモグロビン抗体に結合したヘモグロビン分子に存在するＡＧＥエピト ープを結合するために用いられる。 本明細書で用いられる“抗体”という語は、ポリクローナル抗体、モノクロー ナル抗体、キメラ抗体及び単鎖抗体並びにＦａｂフラグメント（Ｆ(ａｂ′)₂、 Ｆ（ａｂ）、Ｆｖ等）及びＦａｂ発現ライブラリーを意味する。 試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの量は、定量的に求められる。例えば、結合の 程度が定量され、Ｈｂ−ＡＧＥの量が標準曲線から外挿して求められる。個々の 態様においては、ヘモグロビン−ＡＧＥの標準量は、標準として使用するために 本発明のキット中に供給される。他の実施態様においては、ＡＧＥの量（例えば 、ＡＧＥの単位）は、下記の実施例に記載されるようにＢＳＡ−ＡＧＥ試料のよ うな標準量と比較することにより求められる。 個々の実施態様においては、Makitaら(1992，J．Biol．Chem．267:5133-38;国 際特許第WO93/13421号公報も参照)に記載された分析が、本発明に従って調製さ れた試料中のＨｂ−ＡＧＥの存在を検出するために用いられる。 キット 本発明の別の実施態様においては、診療又は臨床検査技師又は医師によって使 用するのに適切な市販の試験キットがヘモグロビン−ＡＧＥの存在又は不在を求 めるために調製される。かかるキットは、少なくとも本発明の希釈バッファー及 び前記のようにヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出するための手段が含まれる。 希釈バッファーは、濃縮した形で供給され、バッファーの成分を適切な濃度にす るために水又はバッファーの添加が必要である。希釈バッファーを濃縮した形で 供給すると、有利には、キットの重量及び大きさが減じられ、効果的なコストに なる。 キットの内容物は、キットの成分全部を保持するような寸法の厚紙又はプラス チック包装材料のような包装に組込まれることが好ましい。各成分は、使用する ための又は使用前に希釈するためのガラス又はプラスチックバイアルのような別 個の容器に保持される。 上述した試験法によれば、かかるキットの１種類は、少なくともＡＧＥエピト ープの結合パートナー及び上記のようにアニオンタンパク質変性清浄剤、非イオ ン清浄剤及び変性剤を含む本発明の希釈バッファー並びにＡＧＥエピトープの結 合パートナーの本発明の希釈バッファーで希釈した試料中に存在するＡＧＥエピ トープへの結合を検出するための手段を含む。 本キットは、また、使用方法、例えば、“競合的”、“サンドイッチ”、“Ｄ ＡＳＰ”等に従って分析を行うための説明書が含まれる。本キットは、また、バ ッファー、安定剤等の周辺的試薬が含まれる。 従って、下記の成分を含む試験キットは、ＡＧＥの存在、量又は活性を証明す るために調製される。 （ａ）ＡＧＥエピトープの結合パートナー又はその特異結合パートナーを検出 可能な標識に直接又は間接に結合することによって得られた標識した特異的反応 性成分； （ｂ）アニオンタンパク質変性清浄剤、非イオン清浄剤及び極性清浄剤を含む 濃縮した形又はすぐに使用できる形の希釈バッファー； （ｃ）他の試薬；及び （ｄ）前記キットの使用説明書。 更に詳細には、診断用キットは下記の成分を含むものである。 （ａ）通常は固相に結合して免疫吸収剤を形成する上記のようにＡＧＥエピト ープに対する第１結合パートナーの既知量； （ｂ）ＡＧＥエピトープ又はヘモグロビンに対する標識した第２結合パートナ ー； （ｃ）アニオンタンパク質変性清浄剤、非イオン界面活性剤及び極性変性剤を 含む濃縮した形又はすぐに使用できる形の希釈バッファー； （ｄ）場合によっては他の試薬；及び （ｅ）前記試験キットの使用説明書。 他の実施態様においては、診断用試験キットは下記の成分を含むものである。 （ａ）通常は固相に結合して免疫吸収剤を形成する上記のようにヘモグロビン に対する第１結合パートナーの既知量； （ｂ）ＡＧＥエピトープに対する標識した第２結合パートナー； （ｃ）アニオンタンパク質変性清浄剤、非イオン界面活性剤及び極性変性剤を 含む濃縮した形又はすぐに使用できる形の希釈バッファー； （ｄ）場合によっては他の試薬；及び （ｅ）前記試験キットの使用説明書。 別の実施態様においては、診断用試験キットは下記の成分を含むものである。 （ａ）通常は固相に結合して免疫吸収剤を形成するＡＧＥエピトープの結合パ ートナー； （ｂ）ＡＧＥエピトープの該結合パートナーに結合することができる標識した ＡＧＥの既知量； （ｃ）アニオンタンパク質変性清浄剤、非イオン界面活性剤及び極性変性剤を 含む濃縮した形又はすぐに使用できる形の希釈バッファー； （ｄ）場合によっては他の試薬；及び （ｅ）前記試験キットの使用説明書。 別の実施態様においては、診断用試験キットは下記の成分を含むものである。 （ａ）通常は固相に結合して免疫吸収剤を形成するＡＧＥ； （ｂ）該ＡＧＥ免疫吸着剤に結合することができるＡＧＥエピトープの標識し た結合パートナーの既知量； （ｃ）アニオンタンパク質変性清浄剤、非イオン界面活性剤及び極性変性剤を 含む濃縮した形又はすぐに使用できる形の希釈バッファー； （ｄ）場合によっては他の試薬；及び （ｅ）前記試験キットの使用説明書。 本発明の試験キットは、試料中のＡＧＥの量を定量するためのＡＧＥ標準を含 むことができる。個々の実施態様においては、ＢＳＡ−ＡＧＥがＡＧＥ標準とし て用いられる。 好ましくは、本発明の試験キットでは、ＡＧＥエピトープの結合パートナーは 、例えば、上記のようなＡＧＥに対する抗体である（上記Makitaら，1992; 国際 特許第WO93/13421号公報参照）。 好ましくは、ＡＧＥを含む本発明の試験キットでは、ＡＧＥは、上記及び下記 実施例ではＢＳＡ−ＡＧＥである。 好適実施態様においては、希釈バッファーは、ＳＤＳ、トリトン X-100及び尿 素を前記で示されている濃度で含む。 ＡＧＥ形成を防止する監視法 本発明のヘモグロビン−ＡＧＥ分析は、アミノグアニジン又は他のＡＧＥ−阻 害剤を監視するのに、その分析が高速で簡便であるので大規模な実験又は試験で 行うのに特に適している。同様に、本発明の分析は、ＡＧＥ形成を阻害すること が期待される生成物の治療過程を監視することを提供する。特に、ヘモグロビン −ＡＧＥを検出する本方法は、ＡＧＥ−阻害剤の治療量を注意深く力価測定する ことを提供する。 個々の実施態様においては、本発明は、ＡＧＥ形成を阻害する薬剤の最適量を 力価測定することを提供する。最適量の力価測定で、医師は副作用の危険を最小 にしつつ患者に最大利益を有する投薬量を選ぶことができる。代謝経路及びクリ アランス速度は個体によって異なるので、治療剤の最適量は人によって変動させ ることができる。“投与量”を変えるために用いられる場合の“最適量”という 語は、“有効量”という語と混同すべきでなく、治療剤の用量は、最適量である ことなく有効であることができる。 従って、本発明は、後グリコシル化工程、即ち、存在がグリコシル化の不利な 続発症と関係がありそれをまねく蛍光又は架橋発色団の形成を阻止する薬剤の投 与効果を監視することを提供する。理想的な薬剤は、発色団の形成及びにタンパ ク質に対するタンパク質のその関連の架橋並びに他のタンパク質についてのタン パク質の捕捉を防止する。理想的な薬剤は、ＡＧＥ関連病変の直接原因である最 後の前進性グリコシル化終末産物の形成をまねく長期後グリコシル化工程を防止 又は抑制する。 ＡＧＥの形成の阻害剤は、早期グリコシル化産物のカルボニル部分と反応する 化合物が含まれる。代表的なかかる前進性グリコシル化阻害剤は、アミノグアニ ジン、リシン及びα−ヒドラジノヒスチジンである。個々の実施態様においては 、阻害剤は、アミノグアニジン（ＡＧ）及びその誘導体である。ＡＧ及びその誘 導体を含む医薬組成物及び方法は、下記の特許に記載されるように周知である。 1988年７月19日発行の米国特許第 4,758,583号; 1990年３月13日発行の同第 4,908,446 号; 1991年１月８日発行の同第 4,983,604号; 1992年３月31日発行の 同第 5,100,919号; 1992年４月21日発行の同第 5,106,877号; 1992年５月19日発 行の同第 5,114,943号; 1992年７月７日発行の同第 5,128,360号; 1992年７月14 日発行の同第 5,130,324号; 1992年７月14日発行の同第 5,130,337号; 1992年８ 月11日発行の同第 5,137,916号; 1992年８月18日発行の同第 5,140,048号; 1992 年12月29日発行の同第 5,175,192号; 1993年６月８日発行の同第 5,218,001号; 1993年６月22日発行の同第 5,221,683号; 1993年８月24日発行の同第 5,238,963 号; 1993年９月７日発行の同第 5,243,071号及び1993年10月19日発行の同第5,25 4,593 号。ＡＧＥ形成の他の阻害剤は、1991年２月８日出願の米国出願第07/652 ,575号; 1992年５月27日出願の同第07/889,141号; 1992年５月15日出願の同第07 /896,854号; 1992年12月８日出願の同第07/986,661号; 1992年12月８日出願の同 第07/986,662号; 1993年３月５日出願の同第08/027,086号; 及び1993年７月20日 出願の同第08/095,095号に記載されている。特に、前記特許及び特許出願の各々 を参考として本明細書に全て引用する。 本発明は、本発明の個々の実施態様の例としてのみ示される下記の限定されな い実施例によって更に完全に理解される。 実施例：ヘモグロビンＡＧＥ分析 材料及び方法 前処理バッファー ＳＤＳ／トリトン／尿素溶血物前処理バッファー（１リットル）を下記のよう に調製した。 ０.９１ｇの一塩基性ナトリウム(１水和物);１.９０２ｇの二塩基性ナトリウ ム(無水物);８ｇの塩化ナトリウム及び０.２ｇのアジ化ナトリウムを８００mlの 蒸留水に加えることにより、リン酸ナトリウム(０.０２M)バッファー溶液を調製 した。このバッファー（８００ml）に１２０.１２ｇの尿素（最終濃度２M）；０ .８ｇのＳＤＳ（０.０８％）試料及び０.４ｇ又は０.１ｇのトリトン X-100（ヒ ト試料に対して０.０４％又はラット試料に対して０.０１％の濃度を得る）を加 えた。この溶液のｐＨを７.４に調整し、容量を蒸留水で１リットルにした。 リン酸ナトリウムバッファーは、また、尿素、ＳＤＳ及びトリトン X-100を含 めずに上記のように調製した。溶血物の調製 赤血球を、蒸留水／トルエン抽出法を用いて調製した。簡単に 述べると、ヘパリン添加した試験管に採血した全血から２〜３０００ rpmで１０ 分間遠心することにより赤血球（ＲＢＣ）を分離した。ＲＢＣを滅菌等張食塩水 （０.８５％）に血漿とほぼ同量で再懸濁することにより洗浄し、上記のように 遠心することにより再充填した。ＲＢＣを、洗浄バッファーに３０分間浸漬する ことを含む２回の洗浄した工程後に緩衝化食塩水中に４℃で１週間までの間貯蔵 した。ＲＢＣは、沈降物を４℃で一晩等張食塩水にインキュベートして細胞に含 有したグルコースを透析した後に−２０℃まで凍結することにより、分析に使用 する前に１週間を超える間貯蔵することができる。 ねじ蓋のついた試験管に新鮮な細胞を十分に沈降させて１mlの充填ＲＢＣを得 ることにより、溶血物を調製した。（しかしながら、凍結が細胞を溶血させるの で凍結したＲＢＣについてはこの工程を省いた。代わりに、解凍した充填細胞を 直接次の工程に用いる。）１mlの充填ＲＢＣに３mlの蒸留水を加えて細胞を溶解 した。水を加えた後、２mlのトルエンを加えて懸濁液を脱脂した。細胞を数分間 激しく振盪するか又は断続的に６回攪拌して完全に脂質抽出を行った。次に、Ｒ ＢＣ標品を３０００ rpmで１０分間遠心して２相を分離しかつ細胞片を沈降させ た。白色の不溶物質の境界面がトルエン（上）相と水（下）相の間に見られた。 水性溶血物の上にある不溶物質層の上のトルエン層を、吸引フラスコと共にパス ツールガラスピペットを用いて除去した。トルエンを除去した後、試験管を傾け て不溶物質の層の下にある赤色水相を露出させた。水相をパスツールピペットで 除去し、不溶物質の層或いは試験管の底の沈降物を妨害しないように注意した。 すぐに分析を行わない場合には、溶血物（水相）を４℃で１晩貯蔵した。溶血物 の長期貯蔵には、防腐剤の使用又は滅菌ろ過が必要である。コーティング抗原 アジドを含む０.１M 重炭酸塩バッファー、ｐＨ９.６中３ ０μg/mlのＢＳＡ−ＡＧＥを調製した。１００μl のコーティング溶液をマイク ロタイターウェル中３７℃で１時間又は４℃で１晩インキュベートした。コーテ ィング溶液を洗浄し、０.１ｇＢＳＡ、１mlヤギ血清及びアジドと共にＰＢＳを 含む阻止バッファーを加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。 プレ ートをＰＢＳ、トゥイーン溶液で洗浄した後に試料を加えた。マイクロタイタープレートＡＧＥ分析 溶血物をＳＤＳ／トリトン／尿素バッ ファーで希釈して約１〜２ mg/ml濃度のタンパク質を得た。通常は、溶血物を１ ：４０〜１：６０に希釈して所望のタンパク質濃度範囲を得た。溶血物のタンパ ク質濃度を変更したローリー法を用いて求めた(Lowryら，1951，J．Biol．Chem ．193:265)。 簡単に述べると、３〜１０μl の溶血標品をエッペンドルフ正置換ピペット( ０.５〜１０μl)を用いて２〜５mlのガラス試験管（１２×７５mm）に加えた。 この試験管に１mlのローリー試薬を加えた。試料を十分に混合し、室温（ＲＴ） で１５〜３０分間インキュベートした。各試験管に１００μlのフォリン−シオ カルトーフェノール試薬を加え、混合液を２回の短い間隔で直ちに攪拌した。異 常な結果を除去又は減少させるために、攻撃的又は過度の攪拌を回避した。試料 をＲＴで３０分間インキュベートし、光学濃度を二光線分光光度計で７５０nmに おいて１mlのローリー試薬と１００μlのフォリン試薬の混合液からなるブラン クに対して読み取った。 ３mMアジ化ナトリウムを含む３００mMＫＨ₂ＰＯ₄中１ mg/mlＢＳＡ（シグマＲ ＩＡグレード A7888又はA7030)をタンパク質定量分析の標準として用いた。３. １２μl 、６.２５μl 、１２μl 及び２５μl の標準液をピペットで試験管に 入れ上記のように分析を行うことにより標準試料を調製した。 ０.５mlの２％酒石酸ナトリウムカリウム（ＫＮａＣ₄Ｈ₄Ｏ₆・Ｈ₂Ｏ）及び０. ５mlの１％ＣｕＳＯ₄を０.１N ＮａＯＨ中５０mlの２％Ｎａ₂ＣＯ₃に加えること によりローリー試薬、ｐＨ１２.８を調製した。ローリー試薬はＲＴで安定であ り、冷蔵庫に貯蔵してはならない。各分析に対して新たに溶液を調製した。 フォリン−シオカルトーフェノール試薬は、原液(Sigma F9252)を蒸留水で１ ：１に黄色のガラスびん中で希釈して１N 溶液を得ることによりつくった。この 溶液をＲＴで貯蔵した。 試料を全て同量で希釈し濃度をタンパク質濃度から計算するか或いは溶血物を 全てバッファーの溶血物に対する正確な比率を用いて同じタンパク質濃度（約１ mg/ml)に調整した。 分析プレートの各ウェルに５０μl の希釈溶血物溶液を加えた。更に５０μl のＳＤＳ／トリトン／尿素バッファーを各ウェルに加えて試料を標準化した。ＡＧＥ標準の調製 ＢＳＡをグルコースとリン酸塩バッファー、ｐＨ７.４中 ５００：１のグルコース：ＢＳＡモル比で３７℃で６週間インキュベートするこ とにより、標準として使用するためのＢＳＡ−ＡＧＥを調製した。インキュベー ション時間の後、この溶液をＰＢＳ／０.０２％アジドに対して透析し、−８０ ℃で貯蔵した。試料標準の調製 ＢＳＡ−ＡＧＥ標準（０.１〜３.７５μg/ウェル）をＳＤＳ ／トリトン／尿素を欠くリン酸ナトリウムバッファーで調製した。５０μl の各 標準を分析ウェルに加えた。一次抗体の希釈 抗ＡＧＥ抗血清を希釈して１μg ＢＳＡ−ＡＧＥのＢ５０を 得た。ＢＳＡ−ＡＧＥ標準を調製するためにＢＳＡ−ＡＧＥを上記のように調製 した。分析手順 ＢＳＡ−ＡＧＥでマイクロタイターウェルをコーティングした後、 ５０μl の試料又は標準、希釈バッファー及び５０μl の一次抗体を各ウェルに 加えた。マイクロタイタープレートを室温で２時間インキュベートした。マイク ロタイタープレートをトリス緩衝化食塩水(ＴＢＳ)/トゥイーンで３回洗浄した 。各ウェルに適切な力価の１００μl のアルカリ性ホスファターゼ標識二次抗体 を加え、ウェルを３７℃で１時間インキュベートした。マイクロタイタープレー トをＴＢＳ／トゥイーンで３回洗浄した。リン酸パラニトロフェニル（ＰＮＰＰ ）基質を各ウェルに加え、Ｂ₀のO.D.が1.7O.D.に達するまで１〜２時間インキュ ベートした。 Ｂは、拮抗剤を含む試料の存在下の標識抗体の結合のO.D.である。Ｂ₀は、拮 抗剤を存在させない対照試料からのシグナル(O.D.)である。数値の標準化 免疫分析結果（試料ウェルのO.D.）をＢ／Ｂ₀の％として表し た。ＡＧＥ濃度を標準曲線から外挿することによりO.D.から求めた（Makitaら， 1992，J．Biol．Chem．267:5133-38; 国際特許第WO93/13421号公報参照）。 試料の読み取りは全てローリー分析で求めたタンパク質濃度に標準化した。即 ち、最終データをヘモグロビン１mgあたりのＡＧＥの単位として示される。 結果及び検討 ＡＧＥエピトープの露出が最大であると考えられことによって高い感受性を有 する非常に簡便で再現性のあるＨｂ−ＡＧＥＥＬＩＳＡ分析が開発された。新規 な分析は、ヘモグロビンとＳＤＳ、トリトン X-100及び尿素を含む試料のインキ ュベーションが含まれる。 予備的実験において、ＳＤＳのみとのインキュベーションがヘモグロビン−Ａ ＧＥの検出を高めることが判明した。しかしながら、ＳＤＳ単独は、標準分析条 件を変え、ＳＤＳの存在しないときの結合と比べてＡＧＥ−モデルジペプチドに 対する抗ＡＧＥ抗体の結合に影響し、Gly-Lysがリボースで褐色になった。 更に実験後、ＳＤＳとのみ前処理した試料の分析が希釈バッファー中トリトン X-100及び尿素の最適組合わせを含むことにより改良されることが判明した。Ｓ ＤＳ／トリトン／尿素の最適濃度は、経験的に各々ラット試料では０.０８％／ ０.０１％／２M 及びヒト試料では０.０８％／０.０４％／２M であることが判 明した。上記試料希釈液、ラット試料に用いた０.０８％ＳＤＳ／０.０１％トリ トン／２M 尿素或いはヒト試料に用いた０.０８％ＳＤＳ／０.０４％トリトン／ ２M 尿素のいずれもウェルからの被覆ＢＳＡ−ＡＧＥ抗原の脱離又は溶離を誘導 しなかった。 新規に開発された分析前処理法を用いて、正常な患者と糖尿病患者との間のヘ モグロビン−ＡＧＥレベルに顕著な差が認められた（図１Ａ）。同様のデータが 、正常なラットと糖尿病を誘導したラットからの試料でも認められた（図１Ｂ） 。 Ｈｂ−ＡＧＥに対する本分析法は、正常なヒト及び糖尿病のヒトにおいてＨｂ −Ａ１ｃと良好な相関を示している（図２）。即ち、Ｈｂ−ＡＧＥは、糖尿病の ようなＡＧＥ関連疾患の診断にＨｂ−Ａ_1Cと同程度の有効なマーカーである。 新規に改良された方法から、ラット分析において試料からの生体内Ｈｂ−ＡＧ Ｅ含量についてアミノグアニジンの阻害作用が明らかに示された（図３）。ヘモ グロビン−ＡＧＥは、Ｈｂ−Ａ_1Cが薬学的に適切な濃度でアミノグアニジン又は 他のＡＧＥ−阻害剤の存在下に影響されないのでＨｂ−Ａ_1Cよりアミノグアニジ ン効果の非常に適切なマーカーである。 本発明の方法を用いて、ほとんどヘモグロビンからなる脱脂溶血物は、約１〜 ２ mg/mlに希釈される。例えば、図１、２及び３に示される試料は４０倍に希釈 された後に分析に加えられる。この高感受性に対する１つの可能な説明は、ＳＤ Ｓ／トリトン／尿素前処理がＥＬＩＳＡ又は他の免疫分析では抗体結合に接触し がたいＨｂ−ＡＧＥエピトープを露出するということである。 本発明は、その精神又は本質的な特徴から逸脱することなく他の形態で具体化 されるか又は他の方法で実施される。従って、本開示は、全ての点で例示として みなされ限定としてみなされるべきでなく、本発明の範囲は下記の請求の範囲に よって示され、等価物の意味及び範囲内に入る全ての変化がこの中に包含される ことを意味する。 本明細書の中に種々の文献が引用されており、各々を参考として全て本明細書 に引用する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブカラ リチャード ジェイ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10021 ニューヨーク イースト シックスティ サード ストリート 504 アパートメン ト 33−０ (72)発明者 セラミ アントニー アメリカ合衆国 ニューヨーク州 11964 シェルター アイランド ラム アイラ ンド ドライヴ （番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出する方法であって、 ａ）該試料を、ヘモグロビン−ＡＧＥを変性するのに十分な濃度のアニオン タンパク質変性清浄剤を含む希釈バッファーで希釈する工程； ｂ）その希釈した試料を該試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出する ための手段と接触させる工程；及び ｃ）該試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの存在をその検出手段で検出する工程 ： を含む方法。 ２．該希釈バッファーが、 ｉ）ヘモグロビン−ＡＧＥの検出を容易にするのに十分な濃度の非イオン 界面活性剤；及び ii）試薬のヘモグロビン−ＡＧＥへの結合を変性することなく、ヘモグロ ビン−ＡＧＥを変性しかつ分析感受性を高めるのに十分な濃度の変性剤： を更に含む請求項１記載の方法。 ３．アニオンタンパク質清浄剤の濃度が約０.０４〜約０.１６％(w/v)の範囲で ある請求項１記載の方法。 ４．該アニオンタンパク質変性清浄剤がドデシル硫酸ナトリウムである請求項３ 記載の方法。 ５．該非イオン界面活性剤の濃度が約０.００５〜約０.１％(w/v)の範囲である 請求項２記載の方法。 ６．該非イオン界面活性剤がポリオキシエチレンエステルである請求項５記載の 方法。 ７．該非イオン界面活性剤がトリトン X-100である請求項６記載の方法。 ８．該変性剤の濃度が約０.５〜約３M である請求項２記載の方法。 ９．該変性剤が尿素である請求項８記載の方法。 10．該希釈バッファーが、ｐＨ約７〜約８に緩衝され、生理的イオン強度に近似 する濃度の塩を含む請求項１記載の方法。 11．試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出する方法であって、 ａ）該試料を、 ｉ）約０.０４〜約０.１６％(w/v)の濃度のドデシル硫酸ナトリウム； ii）約０.００５〜約０.１％(w/v)の濃度のトリトン X-100ポリオキシエ チレンエステル；及び iii)約０.５〜約３M の濃度の尿素； を含む希釈バッファーで希釈する工程； ｂ）その希釈した試料を該試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出する 手段と接触させる工程；及び ｃ）該試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの存在をその検出手段で検出する工程 ： を含む方法。 12．該ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が約０.０８％であり、該トリトン X-100 ポリオキシエチレンエステルの濃度が約０.０１％及び約０.０４％からなる群よ り選ばれ、該尿素の濃度が約２M である請求項11記載の方法。 13．該希釈バッファーが、ｐＨ約７〜約８に緩衝され、生理的イオン強度に近似 する濃度の塩を含む請求項11記載の方法。 14．試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの量又はレベルを定量する方法であって、 ａ）請求項１、２又は11記載の方法に従って該試料中のヘモグロビン−ＡＧ Ｅの存在を検出する工程；及び ｂ）該試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの検出の程度を定量する工程： を含み、検出の程度が該試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの量に相当する方法。 15．哺乳動物被検者において高ヘモグロビン−ＡＧＥレベルと関連のある疾患の 存在を検出又は診断する方法であって、 （ａ）請求項14に従って哺乳動物被検者からの試料中のヘモグロビン−ＡＧ Ｅの量を定量する工程；及び （ｂ）工程（ａ）で検出したレベルを該哺乳動物被検者に正常に存在するヘ モグロビン−ＡＧＥレベルと比較する工程： を含み、正常レベルと比較したヘモグロビン−ＡＧＥのレベルの上昇が高レベ ルのヘモグロビン−ＡＧＥと関連のある疾患を示す方法。 16．哺乳動物被検者において高ヘモグロビン−ＡＧＥレベルと関連のある疾患の 過程を監視する方法であって、哺乳動物被検者から異なった時点に得られた一 連の試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの量を評価することを特徴とし、該ヘモグロ ビン−ＡＧＥの量が請求項14記載の方法に従って定量され、該ヘモグロビン−Ａ ＧＥのレベルの経時上昇が該疾患の進行を示し、該ヘモグロビン−ＡＧＥのレベ ルの経時低下が該疾患の退行を示す方法。 17．哺乳動物被検者における高ヘモグロビン−ＡＧＥレベルと関連のある疾患の 治療法を監視する方法であって、高ヘモグロビン−ＡＧＥレベルと関連のある疾 患の治療を行っている哺乳動物被検者から異なった時点に得られた一連の試料中 のヘモグロビン−ＡＧＥのレベルを評価することを特徴とし、該ヘモグロビン− ＡＧＥのレベルが請求項14記載の方法に従って定量され、該ＡＧＥのレベルの経 時低下が効果的な治療成果を示す方法。 18．ヘモグロビン−ＡＧＥのレベルの高い哺乳動物被検者において前進性グリコ シル化終末産物形成の阻害剤の最適量を求める方法であって、経時点でＡＧＥ形 成阻害剤の漸増量を投与している哺乳動物被検者から異なった時点に得られた一 連の試料中の該ヘモグロビン−ＡＧＥのレベルを評価することを特徴とし、該ヘ モグロビン−ＡＧＥのレベルが請求項14記載の方法に従って定量され、該阻害剤 の最適量が該ヘモグロビン−ＡＧＥのレベルの低下が更に認められない量よりも 多い量である方法。 19．哺乳動物被検者における長期グルコースレベルを監視する方法であって、哺 乳動物被検者からの試料中のヘモグロビン−ＡＧＥのレベルを評価することを特 徴とし、該ヘモグロビン−ＡＧＥのレベルが請求項14記載の方法に従って定量さ れ、該ヘモグロビン−ＡＧＥのレベルが長期グルコースレベルを示す方法。 20．下記の成分を含む希釈バッファー： ａ）試薬とヘモグロビン−ＡＧＥとの結合に妨害することなくヘモグロビン −ＡＧＥを変性するのに十分な濃度のアニオンタンパク質変性清浄剤； ｂ）ヘモグロビン−ＡＧＥの検出を容易にするのに十分な濃度の非イオン界 面活性剤；及び ｃ）試薬のヘモグロビン−ＡＧＥへの結合を変性することなくヘモグロビン −ＡＧＥを変性しかつ分析感受性を高めるのに十分な濃度の変性剤。 21．該希釈バッファー中の該アニオンタンパク質変性清浄剤の濃度が約０.０４ 〜 約０.１６％(w/v)の範囲であり；該非イオン界面活性剤の濃度が約０.００５〜 約０.１％(w/v)の範囲であり；該変性剤の濃度が約０.５〜約３M である請求項2 0記載の希釈バッファー。 22．該アニオンタンパク質変性清浄剤がドデシル硫酸ナトリウムであり、該非イ オン界面活性剤がトリトン X-100ポリオキシエチレンエステルであり、該変性剤 が尿素である請求項10記載の希釈バッファー。 23．該アニオンタンパク質変性清浄剤がドデシル硫酸ナトリウムであり、該非イ オン界面活性剤がトリトン X-100ポリオキシエチレンエステルであり、該変性剤 が尿素である請求項21記載の希釈バッファー。 24．該ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が約０.０８％であり、該トリトン X-100 ポリオキシエチレンエステルの濃度が約０.０１％及び約０.０４％からなる群よ り選ばれ、該尿素の濃度が約２M である請求項22記載の希釈バッファー。 25．ｐＨ約７〜約８に緩衝され、生理的イオン強度に近似する濃度の塩を含む請 求項24記載の希釈バッファー。 26．下記の成分を含む試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出するためのキ ット： ａ）濃縮の形又はすぐに使用できる形の請求項20記載の希釈バッファー； ｂ）該ヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出するための手段； ｃ）他の試薬；及び ｄ）前記キットの使用説明書。 27．下記の成分を含む試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出するためのキ ット： ａ）濃縮の形又はすぐに使用できる形の請求項21記載の希釈バッファー； ｂ）該ヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出するための手段； ｃ）他の試薬；及び ｄ）前記キットの使用説明書。 28．下記の成分を含む試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出するためのキ ット： ａ）濃縮の形又はすぐに使用できる形の請求項22記載の希釈バッファー； ｂ）該ヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出するための手段； ｃ）他の試薬；及び ｄ）前記キットの使用説明書。 29．下記の成分を倉む試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出するためのキ ット： ａ）濃縮の形又はすぐに使用できる形の請求項23記載の希釈バッファー； ｂ）該ヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出するための手段； ｃ）他の試薬；及び ｄ）前記キットの使用説明書。 30．下記の成分を含む試料中のヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出するためのキ ット： ａ）濃縮の形又はすぐに使用できる形の請求項24記載の希釈バッファー； ｂ）該ヘモグロビン−ＡＧＥの存在を検出するための手段； ｃ）他の試薬；及び ｄ）前記キットの使用説明書。